一种检测乳腺癌中cyclin G1蛋白表达并进行预后评估的
方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，特别提供了一种检测乳腺癌中cyclin G1蛋白表达并进行预后评估的方法，为乳腺癌的预后判断提供了一种新的分子标记。
背景技术
[0002] 乳腺癌是一种严重危害人类的
疾病。在我国发病率位居女性
恶性肿瘤之首，且发病率逐年升高，每年用于乳腺癌
治疗的支出大大增加，乳腺癌已严重危害我国人民生命财产安全，制约社会经济发展。乳腺癌发生发展是一个多因素参与并相互作用的复杂过程。涉及癌细胞本身、癌细胞与癌周微环境及宿主免疫状态的多因素异常参与了乳腺癌的不良预后。国内外研究发现不少的癌基因、生长因子等与乳腺癌细胞复发转移密切相关，可能成为乳腺癌的
预后指标。但由于传统的临床预后指标有其自身的局限性，尚不能完全反映乳腺癌的生物学特性，也难以满足临床上对乳腺癌预测的要求。随着分子生物学技术的发展，为了进一步指导乳腺癌的治疗和预后的判断，阐明乳腺癌发生发展的分子机制，寻找相关标志物和干预靶点一直以来都是乳腺癌研究领域的热点。
[0003] 因此，加大对乳腺癌
肿瘤标记物和预后因子的研究势在必行，本领域迫切需要寻找能预测乳腺癌病情及预后的相关基因和/或蛋白，这将对临床治疗具有重要意义和价值。
[0004] 细胞周期素G1(Cyclin G1)基因是1993年Tamura等在鼠
成纤维细胞中寻找新的Src家族成员过程中发现的，
定位于
染色体5q32-q34 区域。有6个外显子，其cDNA长约3.17kb。作为一种新的细胞周期素，cyclin G1通过与MDM2、PP2A等分子相互作用，参与了细胞多种生物学过程，如细胞周期和增殖、DNA损伤修复、细胞凋亡等。更为重要的是，cyclin G1与抑癌基因p53关系密切，cyclin G1与p53相互结合，形成交互
负反馈调节，提示该分子的异常表达可能在肿瘤发生发展中起到了重要作用。近年来研究证实，cyclin G1高表达对成骨肉瘤细胞、结肠癌细胞、伯基特淋巴瘤等肿瘤细胞的生长有促进作用，并且与急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病等恶性血液病密切相关。最新的研究表明，cyclin G1还参与调控肝癌细胞的上皮间质转化和复发转移的过程，并对肝癌起始细胞起到了促进和维持作用。但是作为重要的癌基因，cyclin G1在乳腺癌中的作用在国内外尚无任何报道，因此本研究主要分析了乳腺癌中cyclinG1的表达及其临床意义，同时我们在此
基础上也初步评价了cyclin G1作为乳腺癌预后指标和干预靶点的价值，对乳腺癌的个体化治疗和预后判断具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。
[0005] 乳腺癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生发展的分子机制仍不十分清楚，对其的预后评估仍缺少特异性的分子标志物，尽管cyclin G1已被证明是重要的肿瘤调节蛋白，但是其在乳腺癌中的表达及和对乳腺癌患者预后评估的作用国内外尚无任何报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的是采用免疫组化方法检测cyclin G1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量，能够判断乳腺癌患者术后出现复发转移的
风险及生存状况，基于cyclin G1蛋白的相对表达量与乳腺癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于指导乳腺癌 的预后判断，特提供了一种检测乳腺癌中cyclin G1蛋白表达并进行预后评估的方法。
[0007] 本发明提供了一种检测乳腺癌中cyclin G1蛋白表达并进行预后评估的方法，其特征在于：将cyclin G1蛋白作为分子标记，利用cyclin G1单克隆
抗体，结合免疫组化
试剂盒，检测cyclin G1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量；所述的cyclinG1单克隆抗体购自Santa Cruz 公司（sc-8016）；相应的，特异性抗cyclin G1蛋白的抗体用于制备确定乳腺癌手术预后的制剂或试剂盒；
[0008] 包括以下内容：
[0009] （a）利用本试剂盒中的二
甲苯，
乙醇，3%H2O2甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过
氧化物酶标记羊抗兔IgG将乳腺癌
组织切片进行免疫组化染色； [0010] （b）每张病理切片利用
显微镜和成像装置在癌及癌旁组织多点拍摄，每张切片拍摄癌及癌旁各3张数码照片；
[0011] （c）两名以上病理科医生分析肿瘤和瘤旁组织中阳性
信号强度及阳性细胞百分率，给出评分；
[0012] （d）根据评分计算肿瘤组织中cyclin G1蛋白分子表达量。
[0013] 所述的体外检测cyclin G1蛋白在乳腺癌组织中的表达量的方法，具体步骤如下：
[0014] (1)制备乳腺癌组织
石蜡切片，50～70℃
烤箱过夜；
[0016] 二甲苯8min→二甲苯8min→二甲苯12min→100%乙醇5min→ 95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→双蒸水5min
[0017] (3)3%H2O2甲醇液，室温放置20～30min；
[0018] (4)双蒸水洗三次，每次5min；
[0019] (5)
抗原修复：切片放入0.01M
柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸5min,停火10min,再煮沸5min；
[0020] (6)自然冷却至室温，双蒸水洗三次，每次5min；
[0021] (7)1%BSA封闭30min，37℃；
[0022] (8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗，所述的一抗为鼠cyclin G1单克隆抗体，可识别人组织中cyclin G1蛋白，购自美国Santa Cruz公司，稀释比例1：25；置入湿盒中30min，37℃，然后4℃
冰箱过夜16小时；
[0023] (9)4℃取出，室温复温10～20min，然后0.01M PBS洗四次，每次5min； [0024] (10)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释，45min，37℃；
[0025] (11)0.01M PBS洗四次，每次5min，DAB显色2-10min，镜下观察； [0026] (12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0027] (13)分化后
自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0029] (15)显微镜下观察阳性染色，分别于乳腺癌组织和癌旁组织各随机选取3个
视野，拍照；
[0030] (16)采用结果判定：细胞胞浆或细胞膜呈清晰黄褐色颗粒为阳性表达；高倍镜(×400)下在乳腺癌及癌旁组织各随机观察3个视野并拍照,根据阳性细胞百分率和染色强度进行半定量分析；
[0031] 染色强度：无染色0分，染色弱但强于阴性对照记1分，染色清晰记2分；阳性细胞数<10%记0分，10%～25%记1分，25%～50%记2分，>50%记3分；
[0032] 两项指标乘积之和0～1分为阴性病例(-)，≥2分为阳性病例(+)，≥4分为强阳性病例（++）；由两位病理科医师双盲法计数，差异超过10％需重新计数；cyclin G1高低表达标准以119例乳腺癌组织中cyclinG1表达评分的中位数（2.5）为界。 [0033] 本发明的cyclin G1蛋白与乳腺癌相关性的发现为预测乳腺癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡提供一条全新的途径，对判断乳腺癌患者预后具有重要作用，对于乳腺癌病人术后监控和
辅助治疗也具有重要的指导意义。当癌组织cyclinG1免疫组化评分高于2.5时，乳腺癌患者易出现复发或远处转移，术后易死亡。
[0034] 由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测cyclin G1蛋白分子相对表达量能预测乳腺癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织cyclin G1免疫组化评分高于2.5时，乳腺癌易出现远处转移，乳腺癌患者术后总体生存期较短。显然，cyclin G1蛋白的表达与乳腺癌的预后负向相关，因此，以cyclin G1蛋白作为分子标记物，对其表达量进行检测并合理分析能较准确的预测乳腺癌患者手术后复发转移及存活死亡等事件，是乳腺癌预后评估的新靶 点。
[0035] 本发明的优点：
[0036] 本发明所述的检测乳腺癌中cyclin G1蛋白表达并进行预后评估的方法，利用免疫组化技术、病理评分测定肿瘤组织及其相对的瘤旁组织中cyclin G1蛋白相对表达量，并结合术后随访信息，确定cyclin G1蛋白相对表达量与手术后乳腺癌患者预后存在的相关性，明确了cyclin G1蛋白能够用于制备判断乳腺癌患者预后的蛋白分子标记，操作简便易行，对于乳腺癌病人术后监控和序贯治疗具有重要的临床指导意义。
附图说明
[0037] 下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0038] 图1为cyclin G1在乳腺癌和癌旁组织中的高表达和低表达的免疫组化染色图片；
[0039] 图2为cyclin G1在119例的乳腺癌样本中，癌组织较癌旁组织中呈现高表达（p<0.05）；
[0040] 图3为cyclin G1高表达病例乳腺癌组织切片免疫组化染色结果，肿瘤组织中可见cyclin G1强阳性着色；
[0041] 图4为cyclin G1高表达病例乳腺癌组织切片免疫组化染色结果，肿瘤组织中可见cyclin G1阳性着色；
[0042] 图5为依据cyclin G1表达高低将乳腺癌患者分组的总体生存曲线图； [0043] 图6为依据cyclin G1表达高低将乳腺癌患者分组的无瘤生存 曲线图。 具体实施方式
[0045] 本发明采用免疫组化方法检测cyclin G1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量，具体步骤为：
[0046] (1)制备乳腺癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜；
[0047] (2)切片脱腊至水；
[0048] （二甲苯10min→二甲苯10min→二甲苯10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→双蒸水5min）
[0049] (3)3%H2O2甲醇液，室温放置20min；
[0050] (4)双蒸水洗三次，每次5min；
[0051] (5)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸5min,停火10min,再煮沸5min；
[0052] (6)自然冷却至室温，双蒸水洗三次，每次5min；
[0053] (7)1%BSA封闭30min，37℃；
[0054] (8)甩去封闭液，不洗，直接加cyclin G1一抗（1：25）。置入湿盒中30min，37℃，然后4℃冰箱过夜16小时；
[0055] (9)4℃取出，室温复温15min，然后0.01M PBS洗四次，每次5min； [0056] (10)滴加鼠二抗，45min，37℃；
[0057] (11)0.01M PBS洗洗四次，每次5min，DAB显色2-10min，镜 下观察； [0058] (12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0059] (13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0060] (14)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0061] (15)显微镜下观察阳性染色，分别于乳腺癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野，拍照；
[0062] (16)2名病理科医生给出评分；具体方法为，细胞胞浆或细胞膜呈清晰黄褐色颗粒为阳性表达。高倍镜(×400)下随机观察5个视野,根据阳性细胞百分率和染色强度进[16]行半定量分析 ,染色强度：无染色0分，染色弱但强于阴性对照记1分，染色清晰记2分；
阳性细胞数<10%记0分，10%～25%记1分，25%～50%记2分，>50%记3分。两项指标积分之和0～1分为阴性病例(2)，≥2分为阳性病例(+)，≥4分为强阳性病例（++）。由两[18]
位病理科医师双盲法计数，差异超过10％需重新计数 。cyclin G1高低表达标准以119例肝癌组织中cyclin G1表达评分的中位数（2.5）为界；
[0063] 如图1所示，分别为cyclin G1在乳腺癌和癌旁组织中的高表达和低表达的免疫组化染色图片，经多组实验验证，如图2所示，cyclin G1在119例的乳腺癌样本中，癌组织较癌旁组织中呈现高表达（p<0.05）。
[0064] 实施例2：
[0065] 本发明提供了一种检测乳腺癌中cyclin G1蛋白表达并进行预后 评估的方法，其特征在于：将cyclin G1蛋白作为分子标记，利用cyclin G1单克隆抗体，结合免疫组化试剂盒，检测cyclin G1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量；所述的cyclinG1单克隆抗体购自Santa Cruz公司（sc-8016）；相应的，特异性抗cyclin G1蛋白的抗体用于制备确定乳腺癌手术预后的制剂或试剂盒；
[0066] 包括以下内容：
[0067] （a）利用本试剂盒中的二甲苯，乙醇，3%H2O2甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG将乳腺癌组织切片进行免疫组化染色； [0068] （b）每张病理切片利用显微镜和成像装置在癌及癌旁组织多点拍摄，每张切片拍摄癌及癌旁各3张数码照片；
[0069] （c）两名以上病理科医生分析肿瘤和瘤旁组织中阳性信号强度及阳性细胞百分率，给出评分；
[0070] （d）根据评分计算肿瘤组织中cyclin G1蛋白分子表达量。
[0071] 所述的体外检测cyclin G1蛋白在乳腺癌组织中的表达量的方法，具体步骤如下：
[0072] (1)制备乳腺癌组织石蜡切片，50～70℃烤箱过夜；
[0073] (2)切片脱腊至水；
[0074] 二甲苯8min→二甲苯8min→二甲苯12min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→双蒸水5min
[0075] (3)3%H2O2甲醇液，室温放置20～30min；
[0076] (4)双蒸水洗三次，每次5min；
[0077] (5)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸5min,停火10min,再煮沸5min；
[0078] (6)自然冷却至室温，双蒸水洗三次，每次5min；
[0079] (7)1%BSA封闭30min，37℃；
[0080] (8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗，所述的一抗为鼠cyclin G1单克隆抗体，可识别人组织中cyclin G1蛋白，购自美国Santa Cruz公司，稀释比例1：25；置入湿盒中30min，37℃，然后4℃冰箱过夜16小时；
[0081] (9)4℃取出，室温复温10～20min，然后0.01M PBS洗四次，每次5min； [0082] (10)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释，45min，37℃；
[0083] (11)0.01M PBS洗四次，每次5min，DAB显色2-10min，镜下观察； [0084] (12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0085] (13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0086] (14)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0087] (15)显微镜下观察阳性染色，分别于乳腺癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野，拍照；
[0088] (16)采用结果判定：细胞胞浆或细胞膜呈清晰黄褐色颗粒为阳性表达；高倍镜(×400)下在乳腺癌及癌旁组织各随机观察3个视野并拍照,根据阳性细胞百分率和染色强度进行半定量分析；
[0089] 染色强度：无染色0分，染色弱但强于阴性对照记1分，染色清晰记2分；阳性细胞数<10%记0分，10%～25%记1分，25%～50%记2分，>50%记3分；
[0090] 两项指标乘积之和0～1分为阴性病例(-)，≥2分为阳性病例(+)，≥4分为强阳性病例（++）；由两位病理科医师双盲法计数，差异超过10％需重新计数；cyclin G1高低表达标准以119例乳腺癌组织中cyclinG1表达评分的中位数（2.5）为界。 [0091] 本发明的cyclin G1蛋白与乳腺癌相关性的发现为预测乳腺癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡提供一条全新的途径，对判断乳腺癌患者预后具有重要作用，对于乳腺癌病人术后监控和辅助治疗也具有重要的指导意义。当癌组织cyclinG1免疫组化评分高于2.5时，乳腺癌患者易出现复发或远处转移，术后易死亡。
[0092] 由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测cyclin G1蛋白分子相对表达量能预测乳腺癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织cyclin G1免疫组化评分高于2.5时，乳腺癌易出现远处转移，乳腺癌患者术后总体生存期较短。显然，cyclin G1蛋白的表达与乳腺癌的预后负向相关，因此，以cyclin G1蛋白作为分子标记物，对其表达量进行检测并合理分析能较准确的预测乳腺癌患者手术后复发转移及存活死亡等事件，是乳腺癌预后评估的新靶点。
[0093] 样本：某乳腺癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测cyclinG1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量。 乳腺癌组织的显微图片如图3所示。经计算，其癌组织cyclinG1免疫组化评分为3.5。
[0094] 经术后随访知，该患者术后6个月死亡，无瘤生存期仅3个月。
[0095] 由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测cyclin G1蛋白分子相对表达量能预测乳腺癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织cyclinG1免疫组化评分高于2.5时，乳腺癌易出现远处转移，乳腺癌患者术后易死亡。显然，cyclinG1蛋白与乳腺癌具有相关性，因此，以cyclinG1蛋白作为
蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测乳腺癌手术后复发转移等事件，并判断预后。总之，特异性抗cyclinG1蛋白的单克隆抗体能用于制备确定乳腺癌手术预后的制剂或试剂盒，操作简便易行，有临床应用的可行性。
[0096] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和
说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的
权利要求书及其等同物界定。
