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一种肝癌起始细胞及其分离方法与应用

阅读：452发布：2020-08-31

专利汇可以提供一种肝癌起始细胞及其分离方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及细胞生物学技术领域。肿瘤起始细胞不仅与肿瘤的起始和进展相关，在肿瘤的侵袭和转移中，肿瘤起始细胞同样发挥着至关重要的作用。本发明的目的在于提供一种肝癌起始细胞，及其分离方法与应用。本发明是用特异性的OV6单克隆抗体和磁珠分选、富集肝癌起始细胞，所分离得到的OV6+肝癌起始细胞具有多种特性，用途广泛。并将所分离得到的肝癌起始细胞用于肝癌预后分析和药物筛选。，下面是一种肝癌起始细胞及其分离方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种从肝癌细胞系和人原代肝癌标本中获得肝癌起始细胞的分离方法，其特征在于它包括以下步骤：
(a)将OV6单克隆抗体与含有肝癌起始细胞的肝癌细胞系混合，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞”复合物；
(b)离心去除未结合的OV6单克隆抗体，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞”复合物沉淀，并与磁珠标记的抗小鼠IgG1第二抗体孵育，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞-肝癌起始细胞”复合物；
(c)通过磁场分离步骤(b)形成的复合物，从而获得肝癌起始细胞。
2.根据权利要求1所述的一种从肝癌细胞系和人原代肝癌标本中获得肝癌起始细胞的分离方法，其特征在于，其中的肝癌细胞系是SMMC7721、Huh7、HepG2或HCC-LM3。
3.根据权利要求1所述的一种从肝癌细胞系和人原代肝癌标本中获得肝癌起始细胞的分离方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(a)将OV6单克隆抗体与从原代肝癌标本中分离的肝癌细胞混合，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞”复合物；
(b)离心去除未结合的OV6单克隆抗体，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞”复合物沉淀，并与磁珠标记的抗小鼠IgG1第二抗体孵育，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞-肝癌起始细胞”复合物；
(c)通过磁场分离步骤(b)形成的复合物，从而获得肝癌起始细胞。
4.根据权利要求1至3任一分离方法获得的肝癌起始细胞。
5.根据权利要求4所述的肝癌起始细胞，其特征在于，该肝癌起始细胞在体外具有更强的自我更新能力，在体内具有更强的成瘤能力，具有更强的迁移和侵袭、转移能力。
6.一种如权利要求4所述的肝癌起始细胞在制备肝癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用。
7.一种如权利要求4所述的肝癌起始细胞在筛选抗肝癌药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的肝癌起始细胞在筛选抗肝癌药物中的应用，其特别征在于，其中的抗肝癌药物是肝癌起始细胞抑制剂，筛选方法包括以下步骤：
(a)将候选的肝癌起始细胞抑制剂加入肝癌起始细胞培养体系中，并检测肝癌起始细胞功能特性；
(b)将步骤(a)中测试组中肝癌起始细胞功能特性与对照组比较，如果测试组功能特性指标在统计学上低于对照组，则表明该候选物为抑制肝癌起始细胞的化合物。

说明书全文

一种肝癌起始细胞及其分离方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种从肝癌细胞系和原代肝癌标本中获得肝癌起始细胞的方法，及其该肝癌起始细胞的应用。

背景技术

[0002] 在干细胞和肿瘤生物学的众多进展中，肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells)理论逐渐引起越来越多的重视。越来越多的研究证据表明，在许多实体肿瘤的发生和进展中存在具有自我更新能力的肿瘤起始细胞(参见文献：Jordan CT，Guzman ML，Noble M.Cancer stem cells.N Engl J Med.Sep 212006；355(12)：1253-1261.)。这些细胞具有自我更新能力，与肿瘤的维持和肿瘤对常规抗肿瘤疗法耐受有着密切的联系。近年来的研究还发现，肿瘤起始细胞不仅与肿瘤的起始和进展相关，在肿瘤的侵袭和转移中，肿瘤起始细胞同样发挥着至关重要的作用(参见文献：Diehn M，Majeti R.Metastatic cancer stem cells：an opportunity for improving cancer treatment？Cell Stem Cell.Jun4 2010；6(6)：502-503.)。

[0003] 大多数肝细胞癌都是由慢性病毒性肝炎或其他肝脏疾病引起的肝硬化或硬化前疾病发展而来，长期以来，成熟肝细胞中基因异常突变的累计被认为是肿瘤发生中的关键事件。但随着肝干细胞生物学的进展，人们认为在肝细胞癌中也存在着肿瘤起始细胞，并且他们与肝癌的发生密切相关(参见文献：Yin S，Li J，Hu C，et al.CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity.Int J Cancer.Apr 12007；120(7)：1444-1450.；Chiba T，Zheng YW，Kita K，et al.Enhanced self-renewal capability in hepatic stem/progenitor cells drives cancer initiation.Gastroenterology.Sep 2007；133(3)：937-950.；Ma S，Tang KH，Chan YP，et al.miR-130b Promotes CD133(+)liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1.Cell Stem Cell.Dec 3 2010；7(6)：694-707.；Yamashita T，Ji J，Budhu A，et al.EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.Gastroenterology.Mar 2009；136(3)：1012-1024)。

[0004] 由于肝癌起始细胞在肝癌的发生、发展中发挥着重要的作用，因此，对肝癌起始细胞标志物和特性的研究具有重要的意义。肝癌起始细胞具有更高的自我更新能力、成瘤性、对化疗药物的耐受性，被认为是肝癌复发和转移的重要来源。因此，通过研究肝癌起始细胞的标志物、分离方法和特性，并将所得到的肝癌起始细胞用于肝癌预后分析和抗肿瘤药物的筛选和制备，有助于进一步理解肝癌发、发展的过程，进而开发出靶向肝癌起始细胞的有效治疗方法。

[0005] 中国专利CN200510030081.0公开了一种肝癌干细胞及其分离方法。

[0006] OV6抗体是肝脏干细胞研究领域中广泛用于检测大鼠或人肝前体细胞的一种抗体(参见文献：AV Kofman，G Morgan，et al.Dose-and time-dependent oval cell reaction in acetaminophen-induced murine liver injury.Hepatology.2005Jun；41(6)：1252-61.Carloni G，Ponzetto A et al.Liver stem cells and possible clinical applications.Curr Stem Cell Res Ther.2010Dec；5(4)：314-25.)，由R&D公司生产(MAB0202)，是一种肝干/前体细胞标志物，但至今未有文献报道将OV6抗体用于检测、分选人肝细胞癌肝癌起始细胞并研究其特性和用途。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种肝癌起始细胞，本发明的另一目的是提供该肝癌起始细胞的分离方法，本发明的另一目的是提供该肝癌起始细胞的应用。

[0008] 本发明的一个方面，提供了一种从肝癌细胞系和人原代肝癌标本中获得肝癌起始细胞的分离方法，它包括步骤：

[0009] (a)将OV6单克隆抗体与含有肝癌起始细胞的肝癌细胞系混合，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞”复合物；

[0010] (b)离心去除未结合的OV6单克隆抗体，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞”复合物沉淀，并与磁珠标记的抗小鼠IgG1第二抗体孵育，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞-肝癌起始细胞”复合物；

[0011] (c)通过磁场分离步骤(b)形成的复合物，从而获得肝癌起始细胞。

[0012] 本发明所称的肝癌细胞系是人肝癌细胞系，包括但不限于SMMC7721、Huh7、HepG2、HCC-LM3。

[0013] 本发明所称的OV6单克隆抗体，购自R&D公司。

[0014] 本发明所称的磁珠分选系统是本领域技术人员所熟知的(参见工具书：《干细胞实验指南》，科学出版社，2006年1月)。

[0015] 在另一优选例中，还提供了一种从人原代肝癌标本中获得肝癌起始细胞的分离方法，它包括步骤：

[0016] (a)将OV6单克隆抗体与从原代肝癌标本中分离的肝癌细胞混合，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞”复合物；

[0017] (b)离心去除未结合的OV6单克隆抗体，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞”复合物沉淀，并与磁珠标记的抗小鼠IgG1第二抗体孵育，形成“OV6单克隆抗体-肝癌起始细胞-肝癌起始细胞”复合物；

[0018] (c)通过磁场分离步骤(b)形成的复合物，从而获得肝癌起始细胞。

[0019] 在本发明的另一方面，提供了一种从上述的分离方法获得的肝癌起始细胞，在体外具有更强的自我更新能力，在体内具有更强的成瘤能力，具有更强的迁移和侵袭、转移能力。

[0020] 在本发明的另一方面，提供了本发明的肝癌起始细胞在制备肝癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用。

[0021] 还提供了本发明的肝癌起始细胞在筛选抗肝癌药物中的应用。

[0022] 所述的抗肝癌药物具体为肝癌起始细胞抑制剂，筛选方法包括以下步骤：

[0023] (a)将候选的肝癌起始细胞抑制剂加入肝癌起始细胞培养体系中，并检测肝癌起始细胞功能特性；

[0024] (b)将步骤(a)中测试组中肝癌起始细胞功能特性与对照组比较，如果测试组功能特性指标在统计学上低于对照组，则表明该候选物为抑制肝癌起始细胞的化合物。

[0025] 本发明分离得到的OV6+肝癌起始细胞既有干细胞特性和自我更新能力，又具有更强的成瘤性。另一方面，本发明分离得到的OV6+肝癌起始细具有很强的迁移、转移能力。根据以上所述显示，本发明分离得到的OV6+肝癌起始细胞既可以用于抗肿瘤药物的筛选和制备，也可以用于肝癌预后分析。
附图说明

[0026] 图1是利用免疫磁珠分选技术，结合OV6抗体从肝癌细胞系中分选出OV6+肝癌干细胞后，用流式细胞仪检测的OV6+细胞的纯度；其中A为分选前SMMC7721细胞，OV6阳性细胞比例为1.63％，B为分选后获得的SMMC7721OV6+细胞，阳性率为97.65％。

[0027] 图2是在体外培养的肝癌细胞系中，OV6抗体所识别的OV6+肝癌干细胞具有更强的自我更新能力(在低粘附培养板中形成微球是干细胞自我更新能力的体现)；其中A为代表性的肿瘤球照片，B为每1000个OV6+或OV6-细胞形成的肿瘤球数量。

[0028] 图3是在体外培养的肝癌细胞系中，OV6抗体所识别的OV6+肝癌干细胞具有更强的体外侵袭能力；其中A为Transwell迁移实验(左侧为显微镜下代表图片，右侧为计数结果)，B为Matrigel侵袭实验(左侧为显微镜下代表图片，右侧为计数结果)。

[0029] 图4是从在体外培养的肝癌细胞系中分选的OV6+肝癌干细胞具有更强的体内转移能力，经过免疫磁珠分选出的OV6+和OV6-细胞经尾静脉注射于NOD-SCID鼠体内，八周后观察小鼠肺内转移情况，发现无论是肉眼可见癌结节，还是镜下观察到的微转移灶，OV6+细胞注射组均高于OV6-细胞组。

[0030] 图5是OV6抗体可通过免疫组织化学的方法检测人肝细胞癌标本中OV6+肝癌干细胞表达情况，根据阳性细胞比例，肝癌标本可分为阴性，弱阳性，中等强度阳性，强阳性四组。

[0031] 图6是OV6抗体所识别的OV6+肝癌干细胞的数量越多，肝癌患者的无病生存时间(左图)和总生存时间(右图)越短。

[0032] 图7是AMD3100对OV6+肝癌起始细胞具有抑制作用。

[0033] 图8是从人原代肝癌标本中分选出的OV6+肝癌起始细胞具有更高的干细胞相关基因表达水平。

具体实施方式

[0034] 下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

[0035] 实施例1.肝癌细胞系SMMC7721中OV6+肝癌起始细胞的分离、鉴定[0036] 1、制备单细胞悬液；

[0037] 2、按1∶100的稀释比例加入小鼠抗人OV6IgG1抗体(购自R&D公司)，使总体积为500μl，4℃孵育10min；

[0038] 3、用2ml MACS缓冲液洗涤细胞两次离心，去除多余的抗体；

[0039] 4、用80μl MACS缓冲液重悬细胞，加入包被大鼠抗小鼠IgG1抗体的免疫磁珠7
20μl(每10 细胞)，4℃放置15min；

[0040] 5、加入MACS缓冲液洗涤离心，弃上清，重新用500μl缓冲液重悬细胞；

[0041] 6、500μl缓冲液预洗MS柱后，将500μl细胞悬液过柱；

[0042] 7、500μl缓冲液洗柱三次，去除非标记阴性细胞；

[0043] 8、移柱出磁场，用缓冲液洗柱，收集洗液即为阳性细胞。

[0044] 9、通过流式细胞仪检测证实(如图1所示)，分选后OV6+细胞比例大大提高。

[0045] 实施例2.肝癌细胞系中OV6+肝癌起始细胞的体内成瘤能力

[0046] 从SMMC7721和Huh7(均购自中科院上海细胞库)中分离获得OV6+肝癌起始细胞，分离方法如实施例1，按不同数量级接种于NOD/SCID鼠皮下，如表1所示，OV6+肝癌起始细胞具有更强的体内成瘤能力。

[0047] 由表1可知，是从在体外培养的肝癌细胞系中分选的OV6+肝癌干细胞具有更强的成瘤能力；一定数量的经过免疫磁珠分选的细胞皮下注射于NOD-SCID鼠皮下，观察成瘤情况，发现OV6+肝癌干细胞具有更强的成瘤能力。

[0048] 实施例3.肝癌细胞系中OV6+肝癌起始细胞的干细胞特性和自我更新能力[0049] 将分选获得的OV6+肝癌起始细胞接种于6孔低粘附培养板中，在细胞培养箱中静置培养10天后可以获得肿瘤球。

[0050] 如图2所示，OV6+肝癌起始细胞所形成的第一代和第二代肿瘤球数量均明显高于非肝癌起始细胞组。

[0051] 实施例4.OV6+肝癌起始细胞具有更强的迁移和侵袭能力

[0052] 将分选获得的OV6+肝癌起始细胞或OV6-肝癌细胞分别通过Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验(具体方法参见《细胞生物学实验手册》，科学出版社，2008年1月)的方法比较其迁移和侵袭能力。将OV6+肝癌起始细胞或OV6-肝癌细胞接种于Transwell(孔径8um)小室或包被Matrigel的Transwell(孔径8um)小室上室，下室中加入10％胎牛血清。24小时后观察穿过小孔的细胞数量。

[0053] 如图3所示，OV6+肝癌起始细胞具有更强的迁移和侵袭能力。

[0054] 实施例5.OV6+肝癌起始细胞在小鼠体内具有更强的转移能力

[0055] 将分选获得的OV6+肝癌起始细胞通过尾静脉注射入NOD/SCID鼠体内。8周后处死小鼠，解剖肺部后观察。

[0056] 结果如图4所示，八周后观察小鼠肺内转移情况，发现无论是肉眼可见癌结节，还是镜下观察到的微转移灶，OV6+细胞注射组均高于OV6-细胞组。可见，本发明分离得到的OV6+肝癌起始细胞具有更强体内转移能力。

[0057] 实施例6.人肝癌标本中OV6+肝癌起始细胞检测

[0058] 对石蜡包埋的人肝癌标本行OV6抗体(抗体稀释比例为1∶50)的免疫组织化学检测(具体方法参见《组织化学与免疫组织化学》，人民卫生出版社，2008年9月)，发现人肝癌组织中有不同数量的OV6+肝癌起始细胞(图5)。

[0059] 实施例7.OV6+肝癌起始细胞数量可以判断肝癌患者预后

[0060] 根据肝癌患者癌组织中OV6+肝癌起始细胞的数量将患者分为OV6+肝癌起始细胞数量较高组和较低组。如表2和图6所示，OV6+肝癌起始细胞数量较高组患者临床病理资料侵袭性特征(高甲胎蛋白水平，多发肿瘤，肿瘤无包膜，较晚TNM分期，伴有门静脉癌栓，发生远处转移)更强，无病存活率和总生存率均较低。接下来，通过对影响肝癌患者预后的因素进行分析，发现甲胎蛋白水平、肿瘤数目、TNM分期、门静脉癌栓、远处转移、OV6+肝癌起始细胞数量等因素与肝癌患者预后相关，进一步分析发现OV6+肝癌起始细胞数量可作为判断肝癌患者总生存率的独立预后因子，详见表3。

[0061] 由表2可知，OV6抗体所识别的OV6+肝癌干细胞的数量越多，肝癌患者的肿瘤病理指标越差(根据OV6+肝癌干细胞的数量分组，低表达组(阴性，较少，中等)，高表达组(较多))；

[0062] 由表3可知，OV6+肝癌干细胞的数量可以作为肝癌患者总生存率的独立预后因子。

[0063] 实施例8.AMD3100对肝癌起始细胞的抑制作用

[0064] 选获得的OV6+肝癌起始细胞接种于6孔低粘附培养板中，分别设对照、AMD3100处理组(购自Tocris公司，使用浓度为10ng/ml)。在细胞培养箱中静置培养10天后可以获得肿瘤球。如图7所示，AMD3100不仅能抑制OV6+肝癌起始细胞自身的肿瘤球形成，而且可以抑制SDF-1对OV6+肝癌起始细胞肿瘤球形成的促进作用。提示，AMD3100对肝癌起始细胞具有抑制作用。

[0065] 实施例9.人原代肝癌标本中获得OV6+肝癌起始细胞的分离方法及特性鉴定[0066] 分离人原代肝细胞癌标本(行肝癌根治性切除术的患者签署知情同意后，于手术过程中获取)获得原代人肝癌细胞。具体分离方法为：在严格无菌状况下，将获取的肝癌3
手术标本，用无血清DMEM液(购自Gibco公司)漂洗两次；用眼科剪剪成约1mm 小块，然后加入浓度为0.1％的IV型胶原酶(购自Sigma公司)，于37摄氏度细胞培养箱中作用
20-30分钟后取出，轻柔吹打成单细胞悬液，细胞悬液经200目尼龙网过滤后获得单细胞悬液，1000转/分钟离心3分钟后，弃上清。然后按照实施例1中所述方式分选获得OV6+肝癌细胞。如图8所示，分选获得的OV6+肝癌起始细胞干性相关的基因(CD133，Nanog，Oct4，Sox2)表达水平明显高于OV6-肝癌细胞。

[0067] 表1是SMMC 7721和Huh7细胞行有限稀释法和系列移植实验结果

[0068] (发生肿瘤的小鼠只数/总注射小鼠只数)

[0069]

[0070] 表2是OV6+肿瘤细胞数量与肝癌患者临床病理资料之间的联系

[0071]

[0072] 表3是肝癌患者总生存期的单因素和多因素分析

[0073]

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一种肝癌起始细胞及其分离方法与应用

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