肿瘤的放射治疗和化疗并不能完全清除肿瘤细胞，同时还损伤了 免疫系统。残存的肿瘤细胞(包括转移肿瘤)往往最终夺取了患者的生 命。免疫治疗提供了最理想的完全清除残存肿瘤的方法，但是肿瘤往 往因免疫系统的激活不足而逃脱免疫系统的攻击。免疫系统的激活不 足原因在于浸入免疫组织的肿瘤细胞不足，或缺乏足够强的对浸潤肿 瘤的淋巴细胞的活化信号。增加T淋巴细胞对肿瘤的浸润常常带来良 好的预后。如何增加对肿瘤的免疫力成为清除肿瘤而又不损伤免疫系 统的关键。
CD4+CD25+T细胞亚群是被证明在器官特异性自身免疫和慢性感染 中T细胞应答的一种有效调节物(Sakaguchi，2004；Shevach，2002； Maloy和Powrie，2001；Casares等人，2003；Golgher等人，2002)。 近来的研究支持了这样的观点，即疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答的效用 受到CD4+CD25+T细胞的限制(Machiels等人，2001；Sutmuller等 人，2001；Steitz等人，2001；Yu等人，2003；Houghton等人，2001； Toes等人，1999)。
因此，存在着对于更好地了解癌症中涉及的免疫应答组分和机制 的需要，和对于基于这种了解的其他癌症疗法的需要。
发明内容
本发明人已经观察到CD4+CD25+T细胞在人和鼠科动物的肿瘤内的 选择性聚集。这些细胞在肿瘤发展的后期阶段构成了肿瘤浸润淋巴细 胞的大部分。在此，本发明人显示出，在肿瘤内发现了与CD8+T细胞 紧密接触的CD4+CD25+T细胞，这些T细胞于体内在局部的肿瘤部位抑 制了CD8+T细胞的增殖和干扰素-γ产生。阻断IL-10和TGF-β的作用 可以部分地逆转由CD4+细胞引起的抑制。此外，肿瘤内的CD4+细胞的 局部耗损(depletion)导致根除完全形成的高攻击性肿瘤，和导致形 成长期的抗肿瘤记忆。因此，CD4+CD25+T细胞在肿瘤中保持了这样的 环境，即该环境隐藏了肿瘤细胞的免疫原性。该研究举例说明了，由 T调节细胞引起的抗肿瘤免疫性的抑制主要出现在肿瘤部位，抑制的 局部逆转甚至在肿瘤形成晚期阶段也可以是对于完全形成的癌症的有 效治疗。
本发明的一个方面涉及这样的方法，其包括通过向受试者施用至 少一种耗损调节性T细胞(特别是CD4+T细胞)的第一化合物来耗损 患有癌症的受试者中的调节性T细胞(特别是CD4+T细胞)。在大多 数的实施方案中，该耗损导致受试者的抗癌症免疫性的激活，和引起 导向抗癌症的免疫应答。在本发明的一些实施方案中，受试者可以具 有肿瘤，例如但不限于固体肿瘤。耗损的CD4+T细胞可以位于癌症和 /或肿瘤的部位。在一些实施方案中，耗损的CD4+T细胞在肿瘤内。 在一些实施方案中，耗损的CD4+T细胞在肿瘤的外部。在其他实施方 案中，发现耗损的CD4+T细胞位于肿瘤的内部和外部。耗损可以仅仅 局限于接近肿瘤和/或在肿瘤中的CD4+T细胞，或者耗损可以是全身 性的。“耗损(depletion)”表示在调节性T细胞(特别是CD4+T 细胞)的局部化或全身性群体中的任何减少。“耗损”不要求没有CD4+ T细胞保留在受试者中或者在受试者内的一些局部化区域中。此外， “耗损”不要求消灭在受试者的癌症部位内部或接近癌症部位的所有 或基本上所有的CD4+T细胞。在本发明的大多数实施方案中，“耗损” 要求CD4+T细胞群体的足够数量的减少，以引起治疗效果。
在某些实施方案中，受试者中的CD8+T细胞相对于CD4+T细胞没 有被耗损。在某些实施方案中，CD8+T细胞参与了导向抗癌症的免疫 应答。要注意，“受试者中的CD8+T细胞相对于CD4+T细胞没有被耗 损”表示，相对于CD4+T细胞群体来说，CD8+T细胞群体的大小相对 于受试者中的CD8+T细胞没有耗损的情况没有减少。本发明的一些优 选的实施方案将会涉及受试者中的CD8+T细胞群体相对于受试者中的 CD4+T细胞群体的富集。
第一化合物可以是任何目前已知或稍后测定用于耗损CD4+T细胞 的化合物。在一些实施方案中，第一化合物是抗CD4抗体。抗体可以 是抗人CD4的抗体。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是人源化抗体。 在另一些实施方案中，第一化合物是抗CD25抗体或者CD4+CD25+ 的IL-2毒素。IL-2毒素能够优先耗损CD4+CD25+细胞。
在某些实施方案中，该方法进一步定义为向受试者施用至少一种 第二化合物。第二组合物可以是CD8+T细胞的激活剂。CD8+T细胞的 激活剂可以是抗体，包括但不局限于单克隆抗体和/或人源化抗体。 CD8+T细胞的激活剂可以是编码激活CD8+T细胞的肽或蛋白质的核酸。 例如，激活剂可以是编码LIGHT的核酸。在某些实施方案中，第二化 合物为化疗药物。化疗药物可以是对CD8+T细胞基本上无毒的化疗药 物。化疗药物可以是对于CD8+T细胞比对于CD4+T细胞具有更小毒性 的化疗药物。第二化合物可以是抗癌疫苗。抗癌疫苗可以是基因疫苗 或肽疫苗。第二化合物可以是编码治疗性肽的核酸。在某些实施方案 中，第一化合物和第二化合物同时进行递送。在某些实施方案中，第 一化合物和第二化合物在不同的时候进行递送。第一化合物根据肿瘤 的大小可以60μg-600μg抗CD4抗体的剂量进行施用。这样不会对 于全身的CD4细胞产生明显的影响。
受试者可以是哺乳动物，包括但不局限于人。癌症可以是任何形 式的癌症。例如，在一些情况下，癌症是固体癌症，例如但不局限于 乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头和颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、 胃癌、脑癌、黑色素瘤、鼻咽癌、皮肤癌或肾癌。癌症可以是转移的 癌症，例如转移的乳腺癌。癌症可以是生血细胞的癌症，例如淋巴瘤 或白血病。当然，熟练技术人员会理解根据本发明可以治疗任何数目 的癌症。
本发明的另一个方面涉及癌症的诊断或预后方法，其包括分析受 试者中的CD4+T细胞群体。CD4+T细胞可以位于受试者中的肿瘤内。 在某些实施方案中，肿瘤内CD4+T调节细胞的升高的水平表明对于受 试者的不良预后。在某些实施方案中，该方法进一步包括分析患有癌 症的受试者中的CD8+T细胞群体。相对于正常的CD8+T细胞水平，受 试者中CD8+T细胞的升高或正常的水平可以是积极的预后指标和/或 癌症的诊断。
本发明的另一个方面涉及调节性T细胞耗损剂在制备药物中的 用途，其中所述药物通过耗损患者(包括动物，哺乳动物，特别是人 类)的调节性T细胞而治疗或者预防肿瘤(特别是癌症，例如实体癌)。
本发明在另一方面涉及药物组合物，它包含调节性T细胞耗损剂 作为活性成分，所述药物组合物通过耗损患者(包括动物，哺乳动物， 特别是人类)的调节性T细胞而治疗或者预防肿瘤(特别是癌症，例 如实体癌)。
调节性T细胞耗损剂是任何一种或多种耗损调节性T细胞的化合 物、组合物、混合物或者联合制剂。“耗损”一词在上文有说明。调 节性T细胞耗损剂包括，但不限于，抗调节性T细胞抗体，如人源化 的抗-CD4抗体；或者此处公开的、现有技术已知的或将要被发现的耗 损调节性T细胞(特别是CD4+T细胞)的任何其它化合物或者一个或 者多个这种化合物的组合。
在这些方面，所述调节性T细胞优选是CD4+T细胞，特别是 CD4+CD25+T细胞。所述调节性T细胞可以在肿瘤部位处，和/或在肿 瘤内，和/或在肿瘤外。所述耗损可以是肿瘤局部的，和/或是全身性 的。
在一个实施方案中，所述调节性T细胞耗损剂是调节性T细胞的 抗体，特别是抗CD4+抗体，如抗CD4+CD25+抗体；或者，所述调节性 T细胞耗损剂是IL2-毒素。所述抗体优选是抗人CD4+抗体。所述抗体 可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。优选地，抗体是人源化抗体。
在一个实施方案中，所述患者的CD8+T细胞不被耗损。优选地， CD8+T细胞参与对肿瘤的免疫应答。
在另一实施方案中，所述药物还包括其它活性成分，并且所述药 物被配制成适于所述调节性T细胞耗损剂和所述其它活性成分同时给 药或者分开给药的形式。所述其它活性成分可以是CD8+T细胞的激活 剂。所述激活剂的例子是抗体，尤其是单克隆抗体，人源化抗体等。 在一个具体实施方案中，所述激活剂是编码激活CD8+T细胞的多肽的 核酸。特别地，所述激活剂是编码LIGHT的核酸，尤其是编码突变LIGHT 的核酸。
在一个实施方案中，所述其它活性成分是包含并表达编码突变 LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤(优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还 包含并表达肿瘤抗原)或者包含肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特 别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。在另一个实施方案中，所述其它活 性成分是包含并表达编码突变LIGHT的核酸的重组病毒(优选重组腺 病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组病毒的药用组合物。优选地， 所述突变LIGHT包含阻止蛋白酶对其降解的突变，例如，所述突变 LIGHT是不含蛋白酶裂解位点的LIGHT，特别是不含LIGHT蛋白第79 -82位的蛋白酶解位点EKLI(人类中的EQLI)的突变LIGHT。或者， 所述突变LIGHT优选是具有细胞外域氨基酸序列和标签序列(例如便 于纯化的标签)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag 序列。
在一个实施方案中，所述其它活性成分是化学治疗药物，尤其是 对CD8+T细胞没有实质性毒性的化疗药物，或者对CD8+T细胞的毒 性比对CD4+T细胞的毒性小的化疗药物。例如，所述其它活性成分是 放疗药物。
在一个实施方案中，所述其它活性成分是抗癌疫苗，例如基因疫 苗或者肽疫苗。
在一个实施方案中，所述其它活性成分是治疗性多肽或者编码治 疗性多肽的核酸。
在一个实施方案中，所述肿瘤是实体癌，例如乳腺癌、卵巢癌、 肺癌、头颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌、脑癌、黑素瘤、 食道癌、皮肤癌或者肾癌，特别是乳腺癌，转移性乳腺癌；或者所述 肿瘤是血液癌，例如淋巴瘤或者白血病。
本发明在另一方面还涉及可用于分析患者体内调节性T细胞(特 别是CD4+T细胞，特别是CD4+CD25+T细胞)群体的试剂在制备用于 癌症诊断或者预后的药剂或者药剂盒中的用途。优选地，所述调节性 T细胞在患者肿瘤内。此时，特别地，肿瘤内调节性T细胞水平升高 表明患者预后不佳。
在一个实施方案中，所述药剂或者药剂盒还包含用于分析癌症患 者体内CD8+T细胞群体的试剂。在该实施方案中，特别地，相对于 CD8+T细胞的正常水平，所述患者体内CD8+T细胞水平升高或者正 常水平是癌症的正预后指标和/或诊断。
在另一方面本发明还涉及包含并表达编码突变LIGHT的核酸 cDNA的重组病毒，优选地，该重组病毒是重组腺病毒或者禽痘病毒。 优选地，所述突变LIGHT包含阻止蛋白酶对其降解的突变，例如，所 述突变LIGHT是不含蛋白酶裂解位点的LIGHT，特别是不含LIGHT蛋 白第79-82位的蛋白酶解位点EKLI(人类中的EQLI)的突变LIGHT。 在另一个实施方案中，所述突变LI GHT具有细胞外域氨基酸序列和标 签序列(例如便于纯化的标签)，如具有LIGHT第85-239位的氨基 酸序列和flag序列。
在另一方面本发明还涉及包含本发明重组病毒的药用组合物，特 别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
在另一方面本发明还涉及本发明病毒或者组合物在制备用于治 疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明还涉及治疗癌症或者破坏肿瘤的方法，包括： 向癌症患者给予包含并表达编码突变LIGHT的核酸的重组病毒(优选 重组腺病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组病毒的药用组合物；或 者向癌症患者给予包含并表达编码突变LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者 肿瘤(优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原)或者包 含这种肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防 性疫苗。在一个优选实施方案中，所述给予是向肿瘤内给予。
在另一方面，本发明还涉及包含并表达编码突变LIGHT的核酸的 肿瘤细胞或者肿瘤，优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤 抗原；还涉及包含本发明肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治 疗性疫苗或者预防性疫苗。
在另一方面，本发明还涉及用于筛选或者测试癌症治疗剂的方 法，包括通过体内或者体外实验测试候选物质是否能够耗损调节性T 细胞。
当在权利要求和/或说明书中与术语“含有”结合使用时，使用词 “a”或“an”可以表示“一个”，但是其也是与“一个或多个”、“至 少一个”和“一个或多于一个”的含义是一致的。在此处使用的“另 一个”可以表示至少第二个或更多个。
可考虑到，在该说明书中所讨论的任何实施方案可以就本发明的 任何方法或组合物进行实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以 用于获得本发明的方法。
在整个该申请中，术语“大约”用于表明，值包含用于测定该值 的设备、方法的固有误差变化，或者包含在研究受试者中存在的变化。
在权利要求中使用术语“或”是用于表示“和/或”，除非明确地 表明只涉及一种选择，或者两种选择是相互排斥的。
在该说明书和权利要求中使用时，词“含有”、“具有”、“包 括”或“包含”是宽泛的或无限制的，它们不排出另外的、未描述的 成分或方法步骤。
本发明的其他目标、特征和优点将会从下面的详述中清楚地了解 到。可是，应当理解，详述和特殊的实施例虽然指出了本发明的特殊 实施方案，但只是为了举例说明，因为从该详述中，在本发明的精神 和范围内的各种变化和修饰对于本领域熟练技术人员来说都会是显而 易见的。
附图说明
下面的附图形成了本说明书的一部分，包括这些附图是为了进一 步证明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并联合 此处给出的特殊实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1.T细胞浸润乳腺癌组织。检查来自20位患者的乳腺癌样品， 并显示出具有代表性的图片。原位(a和b)或侵入的(c和d)乳腺 癌组织用苏木精和伊红(H&E)(a和c)或者抗CD4(褐色)和抗CD8 (蓝色)(b和d)染色。在图版b和d中的箭头指明以更高放大倍率 显示的位于右下角的区域。在随机挑选的高倍视野(×40)中，在10 个原位的和10个侵入的乳腺癌组织中计数CD8+细胞和CD4+细胞的数 量，并对于每个癌症组织计算CD4+细胞与CD8+细胞的比例。
图2.CD4+CD25+T细胞在肿瘤内部聚集从而抑制肿瘤的排异。a， 强抗原Ld不阻止肿瘤生长。将5×105 Ag104和Ag104Ld肿瘤细胞皮下 接种至C3B6F1小鼠。检测肿瘤的生长，并如下计算体积：体积＝长× 宽×高/2。(b-c)，将106Ag104Ld肿瘤细胞在尾的基部皮下接种至 C3B6F1小鼠，并在肿瘤接种之后的7或16天从小鼠中分离出腹股沟 LN、脾和肿瘤组织。通过FACS来测定CD4+CD25+T细胞在淋巴细胞中 的百分数(b)和CD45RB在CD4+CD25+或CD4+CD25-T细胞上的表达(c)。 (d-e)，在肿瘤接种之后的16天，从这些具有肿瘤的小鼠中收集脾和 肿瘤组织。通过使用磁性系统的负选择性小珠法而从脾中富集CD4+T 细胞。用磁性系统进一步将来自脾的CD4+CD25-T细胞与CD4+CD25+T 细胞分离开。肿瘤浸润T细胞用生物素化的抗Thy1.2抗体并随后用抗 生物素磁性小珠进行富集。浸润肿瘤的CD4+T细胞进一步用FACS进 行分离，这是在使用PE缀合的抗CD4抗体进行染色之后进行分类。d， 从这些纯化的CD4+T细胞群体中分离得到总RNA，并对源自RNA的cDNA 施行关于foxp-3的实时PCR。e，将96孔平板中每孔5×104个来自未 经过试验的原初小鼠的经纯化的CD4+CD25-T细胞用最佳剂量(2 μg/ml)的经包被的抗CD3抗体刺激72小时。或者加入5×104个来自 具有肿瘤的小鼠的肿瘤组织或脾的CD4+T细胞，以便与纯化的 CD4+CD25-T细胞共培养，和在培养的最后24小时加入3H，并测量其 的掺入。(f)，在肿瘤接种之后14天给予小鼠抗CD25抗体，2天之后 收集脾和肿瘤组织，将在CD4或CD8细胞中的CD25+或CD25-细胞的百 分数与未经过处理的进行比较。当在体内用抗体耗损CD4+(g)或CD25+ (h)细胞时，监测肿瘤的生长。
图3.CD4+细胞抑制肿瘤浸润CD8+T细胞的增殖和IFN-γ产生。 将106Ag104Ld肿瘤细胞皮下接种至C3B6F1小鼠，并在肿瘤接种之后 14天腹膜内(i.p.)注射抗CD4抗体(GK1.5)。在CD4耗损之后1 星期从小鼠中分离出脾以及肿瘤组织。通过FACS测定肿瘤组织中CD8+ T细胞的百分数(a)。用抗Thy1.2磁性小珠系统富集肿瘤浸润T细胞 (TIL)。脾细胞和纯化的TIL在体外用PMA和离子霉素于布雷菲尔德 菌素A的存在下刺激4小时。通过FACS测定肿瘤中总CD8+T细胞之 中的产生IFN-γ的CD8+T细胞百分数。将106MC57-SIY肿瘤细胞在多 个位点皮下注射至处于Rag-1-/-背景的2C TCR转基因小鼠，以激活2C T细胞。在激活之后96小时分离2CT细胞，其具有CD62Llo CD44high表 型。将CFSE标记的激活的2C T细胞以寄养的方式转移至这些具有 Ag104Ld肿瘤的经过或未经过CD4耗损的小鼠中。在转移2C T细胞之 后2天从小鼠中收集肿瘤组织。通过FACS监测CFSE标记的2C T细胞 的增殖。
图4.CD4+细胞保持肿瘤内部的抗炎环境。(a-b)，在肿瘤接种之 间1天，通过用抗CD4抗体腹膜内(i.p.)处理小鼠来耗损CD4+细胞。 将106Ag104Ld肿瘤细胞皮下接种至C3B6F1小鼠，在肿瘤接种之后2 星期从小鼠中收集脾(a)以及肿瘤组织(b)并匀浆。将碎片旋转沉淀， 收集上清液并对其施用细胞计量小珠阵列试剂盒(CBA)。c，将105 Ag104Ld肿瘤细胞皮下接种至C3B6F1小鼠，并在肿瘤接种之前1天和 之后7天将100μg阻断性抗IL-10受体(IL-10R)抗体注射给小鼠。 联合抗IL-10R处理，在肿瘤接种之后7天，将100μgLPS或100μg 对抗性抗CD40抗体以腹膜内(i.p.)方式给予小鼠。d，将105Ag104Ld 肿瘤细胞皮下接种至C3B6F1小鼠，并在肿瘤接种之前1天和之后7 天将抗CD4抗体或250μg抗TGF-β抗体注射给小鼠。监测肿瘤的生 长。
图5.CD4+细胞的肿瘤内耗损导致形成的肿瘤的排异。将105 Ag104Ld肿瘤细胞皮下接种至C3B6F1小鼠，并在肿瘤接种之后14天 以肿瘤内的方式注射1 2.5μg抗CD4抗体(GK1.5)。在CD4耗损之 后2天，从小鼠中分离出脾以及肿瘤组织。通过FACS测定脾或肿瘤组 织中淋巴细胞之中的CD4+T细胞的百分数(a)。监测肿瘤的生长(b)。

本发明在某些实施方案中提供了包括耗损CD4+T细胞在内的对于 癌症的治疗。某些实施方案中，抗CD4抗体如人源化抗CD4抗体可以 用于在肿瘤的部位耗损CD4+T细胞，因此使得CD8+T细胞能够更有效 地识别和破坏肿瘤。
人源化抗体
本发明的某些实施方案旨在抗体的使用，包括抗CD4抗体。涉及 制备单克隆和多克隆抗体，包括制备人源化抗体的方法在本领域中是 众所周知的(Smith等人，2004；Hinoda等人，2004)。用于制备人 源化抗体的方法包括涉及免疫由于基因改变(例如转基因整合入至少 一个导致产生人源化抗体的基因)而产生人源化抗体的动物的方法。
此处使用的“人源化”定义为这样的化合物，即当注射入人体中 时，不会产生导向抗该化合物的治疗上显著的免疫应答。例如，当注 射入人体中时，人源化抗CD4抗体可以产生抗CD4+T细胞的显著的免 疫应答；可是，在人体中没有产生抗该人源化抗CD4抗体的治疗上显 著的免疫应答。
用于产生多克隆抗体的方法在本领域中是众所周知的。多克隆抗 体可以通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射希望对于其产生抗体 的目标和佐剂而在动物中形成。在一些情况下，将目标或目标氨基酸 序列的片段与在该待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如，使 用双官能或衍生化试剂如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯、 N-羟基琥珀酰亚胺、glytaraldehyde或琥珀酸酐的匙孔血蓝蛋白、血 清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合是有用的。 然后，可以将动物产生的导向抗目标的抗体随后进行纯化，并用于治 疗。
用于产生单克隆抗体的方法在本领域中也是众所周知的。从基本 上均一的抗体的群体中获得单克隆抗体，即包含该群体的抗体是同一 的，除了可以较小数量存在的可能天然出现的突变。因此，修饰语“单 克隆”表明了抗体的特征不是无联系的抗体的混合物。用于制备单克 隆抗体的方法通常包括使用杂交瘤细胞。
其他类型的抗体也可以用于本发明。例如，可以在本发明的某些 实施方案中使用双特异性抗体，其对于至少两种不同的抗原具有结合 特异性，和/或杂缀合抗体，其由两个共价结合的抗体组成。
药物组合物
本发明药物组合物含有有效量的一种或多种耗损CD4+T细胞的 化合物(例如，人源化的抗-CD4抗体；或者此处公开的、现有技术已 知的或将要被发现的耗损CD4+细胞的任何其它化合物)或溶解或分 散于药物可接受的载体中的额外物质。术语“药物或药理可接受的” 是指当施用于动物(如果合适，例如为人类)时，不产生不利的、过 敏的或其它不想要的反应的分子实体和组合物。根据本发明的公开内 容以及Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990(此处引用作为参考)的说明，本领域普通 技术人员知道如何制备含有至少一种耗损CD4+T细胞的化合物或额 外活性成分的药物组合物。而且，对于动物(例如人类)施用来说， 应理解该制剂应该满足FDA的生物学标准所要求的无菌性、热原性、 总体安全性和纯度标准。
如此处所用，″药物可接受的载体″是指本领域普通技术人员所 知的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、 防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓试剂、盐、防 腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、 甜味剂、调味剂、染料、类似物质及其组合(参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990， pp.1289-1329，此处引用作为参考)。除非传统载体与活性组分不相 容，否则它们都可以用于所述药物组合物中。
耗损CD4+T细胞的化合物可以含有不同类型的载体，这取决于 它是以固体、液体还是气雾剂的形式施用以及它是否需要灭菌以适用 于注射之类的施用途径。本发明组合物可以如本领域普通技术人员所 知的经静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠内、 表皮(topical)、肌内、皮下、粘膜地、口服、表皮地、局部地、吸 入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注等方式施用，或直接、 经导管、经灌洗器而局部灌注扩散于靶细胞，或以霜剂、液体组合物 (例如脂质体)或其它方式或上述的任何组合来施用。参见，例如 Remington′s Pha rmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990，此处引用作为参考)。
用于癌症的组合疗法
为了增强耗损CD4+T细胞的化合物(例如人源化的抗-CD4抗体) 的效能，理想的是将本发明的这些组合物和方法与有效治疗过度增生 性疾病的物质(例如抗癌试剂)联用。“抗癌”试剂能对受试者中的 癌产生负影响，例如，通过杀死一种或多种癌细胞、在一种或多种癌 细胞中诱导细胞凋亡、降低一种或多种癌细胞的生长速率、降低转移 的发生率或数目、减少肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或一种 或多种癌细胞的血液供应、提高对一种或多种癌细胞或肿瘤的免疫应 答、防止或抑制肿瘤的发展、或者增加癌症患者的寿命。抗癌试剂包 括，例如，化疗试剂(化学疗法)、放疗试剂(放射疗法)、手术方 法(手术)、免疫治疗试剂(免疫疗法)、遗传治疗试剂(基因疗法)、激 素疗法、其它生物试剂(生物疗法)和/或替代性疗法。
更一般地说，这样的试剂将与耗损CD4+T细胞的化合物一起以 有效杀死癌细胞或抑制其增殖的组合量提供。这样的方法可以包括： 将细胞与试剂和耗损CD4+T细胞的化合物同时接触，或者在一个时间 段内接触，其中将耗损CD4+T细胞的化合物与试剂分开施用给细胞、 组织或生物产生了所需的治疗效果。这也可以通过下述方式实现：将 细胞、组织或生物与同时含有耗损CD4+T细胞的化合物和一种或多种 试剂的单一组合物或药物制剂接触，或者将细胞与两种或多种不同的 组合物或制剂接触，其中一种组合物包含耗损CD4+T细胞的化合物， 而另一种组合物包含一种或多种试剂。
当用于细胞、组织或生物时，术语“接触”和“暴露”在此处是 指这样一种过程，借助于该过程，耗损CD4+T细胞的化合物和/或其 它试剂(例如化疗试剂或放疗试剂)的治疗构建物被递送于靶细胞， 或被直接并列置于所述靶细胞、组织或生物中。为了杀死细胞或使细 胞静息，耗损CD4+T细胞的化合物和/或额外试剂以有效杀死所述细 胞或防止它们分裂的组合量递送给一种或多种细胞。
耗损CD4+T细胞的化合物可以在其它试剂之前、与其同时和/ 或在其之后施用，其间的时间间隔为数分钟至数星期。在一些实施方 案中，耗损CD4+T细胞的化合物与其它试剂分开施用于细胞、组织或 生物，在这样的实施方案中，通常应该保证每次递送之间的时间间隔 不应太长，从而使得耗损CD4+T细胞的化合物和试剂仍能对所述细 胞、组织或生物施加有利的组合效果。例如，在这样的情况下，设 想可以将两个、三个、四个或更多特征(modality)和耗损CD4+T细 胞的化合物几乎同时(即少于大约1分钟)与所述细胞、组织或生物 接触。在其它方面，一种或多种试剂可以和耗损CD4+T细胞的化合物 几乎同时施用，或在施用耗损CD4+T细胞的化合物之前和/或之后大 约1分钟、大约5分钟、大约10分钟、大约20分钟、大约30分 钟、大约45分钟、大约60分钟、大约2小时、大约3小时、大 约4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小 时、大约9小时、大约10小时、大约11小时、大约12小时、 大约13小时、大约14小时、大约15小时、大约16小时、大约 17小时、大约18小时、大约19小时、大约20小时、大约21小 时、大约22小时、大约22小时、大约23小时、大约24小时、 大约25小时、大约26小时、大约27小时、大约28小时、大约 29小时、大约30小时、大约31小时、大约32小时、大约33小 时、大约34小时、大约35小时、大约36小时、大约37小时、 大约38小时、大约39小时、大约40小时、大约41小时、大约 42小时、大约43小时、大约44小时、大约45小时、大约46小 时、大约47小时、大约48小时、大约1天、大约2天、大约3 天、大约4天、大约5天、大约6天、大约7天、大约8天、 大约9天、大约10天、大约11天、大约12天、大约13天、 大约14天、大约15天、大约16天、大约17天、大约18天、 大约19天、大约20天、大约21天、大约1周、大约2周、大 约3周、大约4周、大约5周、大约6周、大约7周or大约8周 或更多周之内施用，或在由这些时间所导出的任何时间范围内施用。
可以使用耗损CD4+T细胞的化合物和一种或多种试剂的不同组 合方案。此种组合的非限制性例子如下所示，其中含有耗损CD4+T细 胞的化合物的组合物为“A”，试剂为“B”：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
含有耗损CD4+T细胞的化合物的组合物向细胞、组织或生物的 施用可以遵循施用化疗剂的一般方案进行，同时考虑毒性(如果有毒 性的话)。预期，如果必要的话，应该重复治疗周期。在特定的实施 方案中，设想多种额外试剂可以以与本发明的任何组合应用。
LIGHT治疗以及LIGHT治疗与调节性T细胞耗损剂治疗的联合
LIGHT是一个新发现的作用于免疫调节的基因。我们所进行的突 变能够提高其在细胞表面表达的稳定性从而更好地刺激免疫反应。对 LIGHT的四个氨基酸的突变阻止了该蛋白质的降解。我们关于采用 LIGHT将肿瘤组织转化为淋巴组织的发明包括了一个新的基因免疫治 疗的思想和一个新的突变基因。
我们已经明确一种新的对肿瘤的免疫治疗方法：  通过在肿瘤组 织中诱发淋巴组织使淋巴细胞能够直接接触肿瘤细胞，在肿瘤内部诱 导适当的免疫反应从而根除肿瘤。LIGHT是作为基质细胞表达的淋巴 毒受体和T细胞表达的HVEM的配合体。通过将突变的LIGHT引入肿瘤 组织之中，将诱发出高水平的化学因子和粘附分子，并且伴随大量的 未活化T淋巴细胞的津润。LIGHT的突变体阻止了蛋白酶对其的降解， 使得LIGH能够在肿瘤细胞的表面完整表达。LIGHT对免疫反应的协同 激活活性将对肿瘤特异的T淋巴细胞反应的选择性激活有极大的帮 助，从而有益于清除现存的高进行性的原发肿瘤和其他衍生部位的肿 瘤。表达LIGHT的肿瘤细胞可以作为临床相关的治疗性疫苗，可用于 根除已存的原发肿瘤。表达LIGHT的肿瘤细胞作为临床相关的治疗性 疫苗将在肿瘤内部吸引并活化原始淋巴细胞，从而产生更多的抗肿瘤 淋巴细胞用于清除肿瘤。我们的研究已经证明肿瘤坏死因子超家族 (TNFSF14)和LIGHT能够在肿瘤内部的基质细胞和淋巴细胞表面形成 受体信号并吸引肿瘤特异性的T细胞。我们发现LIGHT转化的肿瘤细 胞能够通过协同其两类受体的新的作用而增强对已存原发肿瘤的免疫 清除反应。我们的研究数据表明肿瘤组织表达的LIGHT具有更强的激 发对原发进行性肿瘤的清除作用，强于其他细胞因子和协同刺激分子 的激发作用(Nature Immunology，Vol.5，No.2，2004年2月， p.141-149)。到目前为止，象LIGHT这样，有如此双重的征召和激活 T细胞的效能的分子尚未见有任何其他的报道。这样的特性使我们能 够开发出一种全新的对肿瘤的免疫治疗方法。
在一个优选实施方案中，所述LIGHT是人类LIGHT。在另一个优 选实施方案中，LIGHT是突变LIGHT。特别优选的是，所述突变LIGHT 包含阻止蛋白酶对其降解的突变，例如，所述突变LIGHT是不含蛋白 酶裂解位点的LIGHT，特别是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解 位点EQLI(对于人而言)的突变LIGHT。在另一个实施方案中，所述突 变LIGHT具有细胞外域氨基酸序列和标签序列(例如便于纯化的标 签)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。LIGHT 氨基酸序列以及氨基酸残基编号参见Nature Immunology，Vol.5， No.2，2004年2月，p.141-149。
LIGHT或者突变体LIGHT的给药优选是通过各种病毒投送系统或 表达LI GHT的肿瘤细胞来进行的。具体地，包括：向癌症患者给予包 含并表达编码突变LIGHT的核酸的重组病毒(优选重组腺病毒或者禽 痘病毒)或者包含这种重组病毒的药用组合物；或者向癌症患者给予 包含并表达编码突变LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤(优选地，该 肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原)或者包含这种肿瘤细胞或 者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。在一个优 选实施方案中，所述给予是向肿瘤内给予。特别是，将上述重组病毒 或者肿瘤细胞注射到肿瘤原发部位
优选的病毒投送系统包括，但不限于，重组的腺病毒和禽痘病毒 (fowlpox virus)等其他病毒。在特别优选的实施方案中，突变体 LIGHT通过重组的腺病毒和禽痘病毒来给药。如果原发肿瘤细胞在1-2 月内未能被清除，肿瘤将被手术切除或放射照射。我们的前期实验发 现经过LIGHT的治疗处理，动物体建立了强烈的肿瘤免疫记忆，能够 清除末梢部位的肿瘤。因而我们预计应该对扩散转移部位的肿瘤有同 样的清除作用。
使用重组的腺病毒和禽痘病毒来给药具有特别的优点，例如，效 率更高和更安全。由于易于生产而且产量高，重组腺病毒已经广泛用 于人和动物实验，但是大多数患者可能会有抗腺病毒抗体，它们可能 会迅速中和注入的腺病毒。还不清楚肿瘤内注射腺病毒是否会避免这 种快速清除。很少有患者在血清中有抗禽痘病毒抗体。因此，这种重 组病毒的持续是一个潜在优点。但是，产生高滴度禽痘病毒是困难的。 有可能能够初始使用重组腺病毒、然后用禽痘病毒治疗患者，以降低 宿主对清除病毒的反应。我们的初步结果显示，使用带有重组LIGHT 的5×1010病毒颗粒在肿瘤内注射到已建立的Ag104Ld肿瘤中，导致 局部和远处肿瘤的排斥(5/5)，而对照病毒(没有LIGHT)没有明显保 护(5只小鼠中0只被排斥)。
CD4+CD25+T细胞是调节性T细胞，它们能够抑制效应T细胞杀 灭肿瘤细胞的能力。耗损调节性T细胞特别是CD4+CD25+细胞能够增 强抗肿瘤活性。将在肿瘤内给予LIGHT和耗损调节性T细胞相结合， 是一种新的免疫治疗的有效治疗方法。
升高的CD4+调控性T细胞水平是诊断和预后的指示剂
本发明可以用作癌症的诊断和/或预后指示剂，以及癌症预后的指 示剂。例如，肿瘤中升高的CD4+T细胞可能表明某些癌症患者的较差 的预后。此外，本发明也可以用于确定潜在新治疗剂对癌症的功效， 并且本发明也可以用于药物开发。例如，导致癌变肿瘤中CD4+T细胞 减少的化合物可能表明该化合物具有作为癌症治疗剂的显著潜力。在 其它情况下，使用细胞系的体外测试法可以用于确定化合物对CD4+T 细胞的作用。在某些实施方案中，测试化合物对动物或人类肿瘤中CD4+ T细胞的减少可能表明改善的功效。此外，本发明也提供了用于确定 受试者是否应该接受导致CD4+T细胞减少的治疗有效量的药物的方 法。例如，CD4+T细胞数量增加的患者尤其能从导致受试者肿瘤位点 CD4+T减少的疗法中得到益处。
一旦患者被诊断患有癌症，我们将检查肿瘤样品的活体解剖中的 调控性CD4+T细胞。如果CD4占据统治地位，患者将用抗-CD4抗体 局部治疗。如果非常难以局部注射肿瘤，则可以进行全身性注射。如 果渗透性淋巴细胞是有限的，则50ul至100ul ad-LIGHT(1-5×10 10vp)将被注射入肿瘤组织，并在3天后使用抗-CD4抗体，以允许 在其后的两周中产生强免疫应答(进行或不进行组合治疗)。或者， 抗-CD4与抗-CD137或其它CD8刺激物联合使用。
耗损CD4+T细胞和/或治疗癌症的化合物和组合的体外证实
本领域普通技术人员得到和体外测试大量化合物或化合物组合， 它们能耗损CD4+T细胞、刺激对抗癌症的免疫应答、和/或产生在本 发明中有用的任何其它效果。此类测试可以用如以下实施例所述和/ 或本领域普通技术人员熟知的那些方法来进行。
简言之，通过用人类CD4肽或蛋白质免疫小鼠可以得到和测试候 选化合物体外耗损CD4+T细胞和/或治疗癌症的能力。可选择地，我 们从非盈利性机构American Tissue Culture Center获得了含有抗 人类CD4抗体地小鼠杂交瘤。如早前所述，通过用人类免疫球蛋白基 因来替换CD4基因可以得到人源化的CD4。另一种选择是，人源化的 抗-CD4抗体可以从一些私人公司获得。
一旦确定了候选化合物或组合在体外显示可用于本发明，则通常 用下述的体内方法来测试它们。
耗损CD4+T细胞的化合物的体内证实
可以获得并体内测试大量具有如下特征的化合物或化合物组合： 耗损CD4+T细胞；刺激对抗癌症的免疫应答；和/或导致任何可用于 本发明的其它效果。通常，只有在用如上所述的体外方法显示某一特 定候选物或组合具有希望时，才进行此类体内测试。可以用描述于下 面实施例中的和/或本领域普通技术人员已知的那些方法来进行此类 测试。
简而言之，将获得候选物质，并测试其体内耗损CD4+T细胞和/ 或治疗癌症的能力。
一旦候选化合物或组合在体内显示可用于本发明，其通常作为下 述临床试验的主题。
因此，本发明还涉及用于筛选或者测试癌症治疗剂的方法，包括 通过体内或者体外实验测试候选物质是否能够耗损调节性T细胞。
临床试验
使用体外和体内方法，例如那些此处所述的和/或本领域已知的 方法，鉴定有前途的化合物或组合后，此类化合物和组合可以称为下 面所一般描述的临床试验的主题。
一旦患者被诊断患有癌症和潜在的转移，我们将检查肿瘤样品的 活体解剖中的调控性CD4+T细胞。如果CD4占据统治地位，患者将用 抗CD4抗体局部治疗。如果非常难以局部注射肿瘤，甚至难以用放射 干预(指导)，则可以进行全身性注射。如果渗透性淋巴细胞是有限 的，则50ul至100ul ad-LIGHT(1-5×1010vp)将被注射入肿瘤 组织，并在3天后使用抗CD4抗体，以允许在其后的两周中产生强免 疫应答(进行或不进行组合治疗)。或者，抗-CD4与抗-CD137或其 它CD8刺激物联合使用。
发明的有益效果
在发明人的实验中，用突变LIGHT治疗导致对肿瘤的免疫力提高 500倍。耗损调节性T细胞提供另外的增强效果，这种治疗已经显示 对已确立肿瘤非常有效(增加100-500倍)。将在肿瘤内给予LIGHT 和耗损调节性T细胞相结合，提供了更好的效果。
实施例
引入下面实施例来证明本发明的优选实施方案。本领域普通技术 人员将意识到，下面实施例所公开的技术代表本发明人所发现的用于 很好实施本发明的技术，因此可以认为它们构成了实施本发明的优选 方式。但是，在阅读本发明公开内容后，本领域普通技术人员也应认 识到，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变而仍能得到相似的 结果，但又不背离本发明的精神和范围。
实施例1
材料和方法
小鼠和细胞系。5-8周大小的雌性C3HxB6F1(C3B6F1)和C3H 小鼠购自US National Cancer Institute的Frederick Cancer Research Facility，并被饲养于芝加哥大学的不含病原体的特定设备 中。根据学院和National Institutes of Health(NIH)的规定对动 物进行照料和研究，并经芝加哥大学的动物使用委员会的批准。已经 描述了表达鼠H-2Ld(AG104-Ld)的Ag104细胞系(Wang，2001)和 Ag104纤维肉瘤(Wick等人，1997)。
组织学和免疫学。用于组织学检查的人类肿瘤组织于10％缓冲 的中性福尔马林中固定，石蜡包埋，并使用标准方法用苏木精和曙红 (H&E)染色，或根据制造商的说明用特异于CD4(Novocastra Laboratories，UK)和CD8(DAKO，CA)的单克隆抗体染色。分别通过 使用DAB(Sigma-Aldrich，MO)的过氧化物酶技术或使用Vector Blue (Vector，CA)的APAAP技术来揭示抗-CD4或抗-CD8抗体的结合。对于 乳腺癌样本，在一个随机选取的40倍高被视野中对CD4+和CD8+细 胞进行手工计数。
测量脾和肿瘤中的细胞因子。根据描述(Janssen等人，2003)， 本发明人制备了肿瘤和脾的匀浆。简而言之，收集相当数量的肿瘤或 脾组织，称重，并在含有蛋白酶抑制剂的PBS中进行匀浆，通过离心 收集上清液。根据制造商的说明，在配有细胞QuestPro和CBA软件的 FACSCaliber血细胞计数器(BD Pharmingen)中使用细胞计数珠阵列 试剂盒(CBA)来定量上清液中的细胞因子数量。
流式细胞分析。使用异硫氰酸荧光素(FITc)缀合的、藻红蛋白 (PE)缀合的、Cy-铬缀合的或生物缀合的针对小鼠CD45RB、CD4、CD8、 CD25和IFN的抗体(均来自BDPharmingen)进行FACS分析。链霉 亲合素-Cy-铬缀合物来自BD Pharmingen；针对2C TCR的生物素缀合 的克隆型抗体(1B2)细胞染色按照所描述的进行(Sun和Bevan， 2003)。对于细胞内细胞因子染色，在Brefeldin A(Sigma-Aldrich) 的存在下，用PMA(50ng/ml，Sigma-Aldrich)和离子霉素(500ng/ml， Sigma-Aldrich)对纯化自肿瘤组织的T细胞再刺激4小时。对于 CFSE-标记的2CT细胞的分析，用生物素化的1B2抗体对分离的肿瘤 或脾单细胞悬浮液进行染色，  洗涤，并用PE偶联的抗-CD8和CyC偶 联的链霉亲合素的混合物染色。用FlowJo软件(BD Pharmingen)分 析FACS数据。
细胞分离和体外检测。为了从肿瘤组织中分离CD4+T细胞，先 使小鼠放血以减少血液对肿瘤组织的污染。收集肿瘤组织，再PBS中 洗涤，切成片，并在37℃摇床中重悬于Dulbecco′s改良Eagle′s 培养基25分钟，所述培养基添加了2％胎牛血清和1.5mg/ml胶原 酶D(胶原酶D溶液)。25分钟后收集细胞悬浮液，在胶原酶D溶 液中对细胞块再消化25分钟直到所有的肿瘤组织分解成单细胞悬浮 液。使用AutoMACS系统(Miltenyi Biotech，CA)，用生物素缀合 的Thy-1.2抗体接着用抗生物素磁珠从所述单细胞悬浮液中富集肿瘤 浸润型T细胞。用PE缀合的抗-CD4对富集的肿瘤浸润型T细胞进行 染色，并在MoFlo上用FACS分选为CD4+群体。通过AutoMACS系统 (Miltenyi Biotech)，使用CD4+T细胞或CD4+CD25+调控性T细胞分 离磁珠系统(Miltenyi Biotech)分别从脾单细胞悬浮液中纯化CD4+ 或CD4+CD25-以及CD4+CD25-细胞。对于所有的细胞分离，通常能得 到超过90％纯度的所需群体。对于T细胞共刺激检测，发明人用50μl 2μg/ml的抗-CD3抗体包被96孔板过夜。接着用PBS洗涤所述板，将 6×104个纯化的CD4+CD25-T细胞培养于每孔中，其中添加或不添 加分离自带有肿瘤的小鼠的脾或肿瘤组织的6×104个CD4+T细胞。 在所有检测中，于3天培养期的最后24小时向每孔加入1μCi的[3H] 胸苷，从而估算T细胞增殖。在TopCount微量板闪烁计数器(Packard， MA)中测量[3H]胸苷的整合。
2C T细胞的适应性转移。本发明人首先通过将106MC57-SIY个 肿瘤细胞皮下接种于B6/Rag-1-/-背景的2C小鼠(2C小鼠)的多个位 点来激活2C T细胞(Sun和Bevan，2003)。发明人接着从这些被攻 击的2C小鼠中分离淋巴结细胞和脾细胞，并在肿瘤接种后5天用CD8+ T细胞富集试剂盒(Miltenyi Biotec)对CD8+T细胞进行负选择。当 分析时，大部分2C细胞表达CD44高CD62L低表型。按照所描述的(Sun 和Bevan，2003)，接着用CFSE对这些2C T细胞进行标记。发明人 将3×106个CFSE-标记的T细胞(体积0.2-ml)静脉内注射于带有 肿瘤的小鼠的眼窝后血管丛(retro-orbital plexus)。转移后48 小时从脾和肿瘤中分离细胞，并进行FACS分析。
体内细胞耗损和细胞因子阻断。按照标准程序(Sun和Bevan， 2003)，使用针对CD4+细胞的mAb GK1.5、针对CD8+细胞的mAb 2.34 和针对CD25+细胞的PC61系统性耗损小鼠中的淋巴细胞亚类。用流式 细胞术对脾细胞和淋巴结细胞的检查显示耗损的CD4+或CD8+亚类占 总淋巴细胞的不到0.5％，其它亚类的水平正常。用溶于50μl PBS的 12.5-50μg GK1.5进行了肿瘤内CD4+细胞耗损。为了阻断IL-10或 TGF-β，在肿瘤攻击前1天以及肿瘤攻击后7天将100μg抗-IL-10受 体或250μg抗-TGF-β抗体经腹膜内(i.p.)注射入小鼠。肿瘤攻击后 7天，将100μg脂多糖(LPS)或/和拮抗性抗-CD40抗体经腹膜内给 予小鼠。
实时定量性RT-PCR检测。按照描述(Shedlock和Shen，2003)， 对foxp-3进行实时定量性反转录PCR(RT-PCR)检测。简而言之，从 肿瘤中分离总RNA，使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Pharmacia，NJ)将5μg总RNA反转录成互补。在Cepheid SmartCycler实时热循环仪(Cepheid，CA)上进行实时定量性PCR分 析。根据制造商的说明(PE Applied Biosystems，MA)，用含有AmpliTaq Gold DNA Polymerase的TaqMan Universal PCR master混合物扩增 每一cDNA样品中的foxp-3和GAPDH。发明人利用比较型CT(扩增曲 线和阈值的交点处的阈值循环数目)方法确定了目标基因的浓度，并 将数值对内部GAPDH对照进行标准化。用于foxp-3的引物序列为 5′-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3′(正向引物)和 5′-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3′(反向引物)，用于FOXP-3的探针为 5′-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-3′。
实施例2
耗损CD4+T细胞导致癌肿瘤的破坏
在人患者中CD4+T细胞浸润侵袭性乳腺癌。人类癌症常常具有 抗原性，但令人费解的是大多数人类癌症不能诱导排斥，甚至在淋巴 细胞显著浸润肿瘤组织时也是如此(Rosenberg，1999；Beck-Engeser 等，2001)。为了研究浸润肿瘤的淋巴细胞的状态和性质，本发明人 检查了几种人类癌症组织，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和黑素瘤，并 观察到常常存在显著的浸润肿瘤的淋巴细胞。为了进一步分析何种类 型的T淋巴细胞浸润肿瘤组织，本发明人用抗-CD4和抗-CD8抗体染色 乳腺癌样本并发现不同程度的CD8+和CD4+T细胞浸润(图1a-d)。 令人感兴趣的是，在本发明人检查的乳腺癌样本中，本发明人观察到 在肿瘤进展的早期非常少的CD4+T细胞浸润乳腺癌组织。然而，随着 肿瘤发展，肿瘤内部的CD4+T细胞群体急剧增加。为了验证这一观 察结果，本发明人计数了十个早期乳腺癌组织、原位乳腺癌相对于十 个晚期侵袭性乳腺癌组织中存在的CD4+和CD8+T细胞的数量，发现 CD4+/CD8+T细胞比例急剧增加(图1e).本发明人还观察到CD4+T 细胞常常与CD8+T细胞紧密接触(图1b和d)。考虑到这些癌症的 渐进性质，本发明人推测缺少对癌症的免疫排斥可能并非由弱免疫识 别引起而是由异常免疫应答引起。
强抗原不阻碍肿瘤生长。由于在研究肿瘤浸润性CD4+T细胞体 内对于人类癌症的基本作用方面存在的局限性，本发明人开发了一种 小鼠肿瘤模型，该模型与具有一定CD4+及CD8+T细胞浸润的人类癌 症极为相似。Ag104是一种在C3H小鼠中自发形成的低分化实体瘤， 其具有高度的进行性、差的免疫原性并对免疫治疗具有抗性(Belkaid 等，2002；Wang，2001；Dudley等，2002)。当接种少至104个细胞 时，Ag104在C3H和C3B6F1小鼠中均100％生长。导致在免疫活性同 基因野生型小鼠体内快速生长的该肿瘤的低免疫原性，可能由肿瘤抗 原的弱表达或者不表达所致。为了排除这种解释，本发明人用编码Ld 抗原(一种强抗原)的基因转染Ag104肿瘤细胞系。转染的肿瘤细胞系 体外表达高水平的Ld。出乎意料地，表达Ld的Ag104肿瘤(Ag104Ld) 在104低剂量时与亲本肿瘤以相似的动力学方式生长(图2a)。据报道， 可以选择抗原丢失的变体来避免免疫识别(Pardoll，2003)。然而，本发 明人发现，分离自带有肿瘤的小鼠的Ag104Ld肿瘤细胞与注射前的细胞表 达相当水平的Ld(数据未显示)。从该研究，本发明人得出这样的结论： 抗原性肿瘤可以在不丧失其肿瘤抗原的情况下进展。因此，由Ag104Ld 肿瘤在免疫活性同基因野生型小鼠体内的快速生长指示的该肿瘤的弱免 疫原性，不可能由I型MHC的低表达或者抗原的丢失引起。
抗原Ld不阻碍肿瘤生长的一个原因可能是该抗原被免疫系统所 忽视并且从未被免疫系统发现。为了检测此可能性，本发明人在接种 Ag104Ld肿瘤后20天通过手术除去该肿瘤，然后在手术后3周用更高 剂量的肿瘤细胞再次攻击小鼠。令人惊奇的是，所有这些小鼠均排斥 第二次肿瘤攻击，而幼稚小鼠却死于肿瘤负载(表1)。该结果说明，T 细胞被Ld抗原致敏，并且在手术除去肿瘤后，这些T细胞能够发展成 记忆细胞并赋予抗第二次肿瘤攻击的保护作用。本发明人能够证明， 这些记忆T细胞主要是Ld特异性的，因为这些小鼠不能排斥亲本肿瘤 Ag104(表1)。这些结果提示我们，抗原特异性T细胞确实存在，但 是其在带有肿瘤的小鼠中不能适当地发挥功能。这提出了一种可能性： Ag104Ld肿瘤的弱免疫原性可能不是由弱免疫识别引起而是由肿瘤存 在时，尤其是肿瘤微环境中的异常免疫应答引起的。
CD4+CD25+T细胞在肿瘤内部聚积。为了研究甚至在免疫原性 抗原存在的情况下肿瘤排斥仍然受损的原因，本发明人首先在动物模 型中检查了浸润肿瘤的淋巴细胞(TIL)。免疫组织化学染色揭示， Ag104Ld肿瘤组织被CD4+和CD8+细胞浸润，这些细胞以在人类肿瘤组 织中看到的相似方式共同定位。观察到非常少的浸润肿瘤的DX5+NK 或NK T细胞(数据未显示)。令人惊奇的是，聚积在肿瘤中的淋巴细胞 主要由CD4+CD2 5+T细胞亚群组成(图2b)。本发明人然后在肿瘤攻 击后第0、7或16天比较了脾、引流淋巴结(draining lymph node，DLN) 和肿瘤中CD4+CD25+T细胞占淋巴细胞的百分数。本发明人发现，随 着时间推移，肿瘤内部的CD4+CD25+T细胞百分数急剧增加，而在脾 和DLN中其保持恒定(图2b)。这些数据表明，在效应部位而不是在淋 巴器官中存在增加百分数的CD4+CD25+T细胞。这些CD4+CD2 5+T细胞 是CD4 5RBlow表型的(FIG.2c)，这与对CD4+CD25+调节性T细胞的观 察结果一致(Golgher等，2002)。FOXP3是对小鼠CD4+CD25+调节性T 细胞分化和功能关键的forkhead/winged螺旋转录因子基因(Wang等， 2002；van Elsas等，2001；Dieckmann等，2001)。实时聚合酶链式 反应(PCR)证明，与从带有肿瘤的小鼠的脾脏分离的CD4+T细胞或 者从幼稚小鼠的脾脏分离的CD4+CD25-T细胞相比，从该肿瘤分离的 CD4+T细胞中FOXP3 mRNA的表达强得多(FIG.2d)。这些观察结果提 出了这种可能性，即：在肿瘤发展过程中，积累构成效应部位70％CD4+ T细胞的CD4+CD25+细胞抑制局部免疫应当。本发明人推测，癌症免 疫原性差可能是由于在肿瘤环境中积累的CD4+CD25+T细胞产生的免 疫调节机制引起的。
CD4+CD25+T细胞 抑制抗癌免疫。为了检查肿瘤浸润CD4+CD25+T 细胞是否抑制体外T细胞应答，本发明人从已经在C3B6F1小鼠中建立 20天的肿瘤组织分离CD4+T细胞，并在最佳剂量平板结合的刺激性 抗CD3抗体(2μg/ml)存在的情况下将它们与从幼稚C3B6F1小鼠获得 的纯化CD4+CD25-T细胞共培养。发明人发现，这些肿瘤浸润CD4+T细 胞的确显著抑制通过3H掺入测量的CD4+CD25-T细胞的增殖，而从带 有肿瘤的小鼠的脾脏分离的CD4+T细胞不产生这种抑制(FIG.2e)。 因为CD4+和CD8+细胞能够在T细胞活化的早期表达CD25，所以产 生了在体内耗损CD25+细胞是否会消除将被激活的CD8+T细胞的疑 问。但是，发明人观察到，在肿瘤攻击后的2周，在脾脏和肿瘤中大 部分CD8+T细胞是CD25-(FIG.2f)。耗损CD25+细胞没有减小CD8+ 群体，因为仅仅很少的CD8+细胞表达CD25(FIG.2f)。在肿瘤环 境内部，优先积累的CD4+CD25+细胞和CD8+细胞都没有表达CD25。为 了直接研究CD4+T细胞在体内肿瘤免疫中的根本作用，发明人耗损了 CD4+细胞，然后观察肿瘤生长。惊奇地发现，当CD4+细胞被耗损时， 高度血管化和低免疫原性的Ag104Ld肿瘤被迅速排斥(FIG.2g and Table 2)。CD4+细胞耗损产生的肿瘤排斥是CD8+细胞依赖性的，因 为肿瘤在没有CD4+细胞、也没有CD8+细胞时不受控制地生长(Table 2)。NK1.1+NK and NKT细胞的耗损不引起肿瘤排斥(Table 2)。为了 证实表达CD25的CD4+T细胞亚群导致了体内抗肿瘤免疫的抑制，发 明人用抗CD25抗体处理带肿瘤的小鼠两周。在肿瘤攻击后14天用该 抗体耗损CD25+细胞显著地抑制肿瘤的生长(FIG.2h)。这些数据表 明，在抗肿瘤免疫应答的后期，主要是CD25+T细胞起抑制作用。
即使在不存在抗原Ld的情况下，耗损CD4+细胞也允许50％小鼠 完全排斥亲本Ag104肿瘤(表1)，而且剩下的50％小鼠延迟了肿瘤生 长动力学(数据未显示)。这些观察结果提示，一旦解除CD4介导的 抑制，其它肿瘤抗原也可能诱导抗肿瘤免疫。为了测试排斥是否导致 针对其它肿瘤抗原的保护性免疫，首先接种Ag104Ld tumor细胞，14 天后耗损CD4+细胞。耗损CD4+细胞引起的肿瘤排斥不仅针对Ag104Ld tumor细胞的后来攻击产生保护作用，而且针对Ag104 tumor细胞的 后来攻击产生保护作用(表1)。这些数据表明，抑制性CD4+细胞的去 除使得扩大的CD8+细胞群体参与保护性免疫。
调节性T细胞在效应期抑制CD8+T细胞。为了测试CD4+细胞是 否在致敏期或效应期抑制CD8+T细胞应答，本发明人在肿瘤攻击前3 天或肿瘤攻击后20天耗损CD4+细胞。对外周血的FACS分析证实，每 一处理均在头20天或肿瘤攻击后20-40天消除CD4+细胞。将CD4耗 损限制在头20天，或者换言之，在肿瘤生长的致敏期，导致延迟的但 进行性的肿瘤发育(表2)。在效应期，即肿瘤攻击后20天——建立 的肿瘤达到500mm3以上平均大小时进行CD4耗损，导致完全的肿瘤 排斥(表2)。在肿瘤进展的整个持续期耗损CD4+细胞时，也观察到 排斥(表2)。在肿瘤攻击前3天和肿瘤攻击后10天注射抗-CD4抗体。 本发明人必需看到可能导致此类大体积、充分血管化的高度进行性肿 瘤完全被破坏的任何其它处理。这些数据提示，在免疫应答晚期而不 是在早期缺少CD4+细胞对于增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫更为 关键。
如上述，CD4耗损介导的肿瘤排斥依赖于CD8+T细胞，这提示 在肿瘤内部CD4+细胞可能抑制CD8+细胞。本发明仍接着检查了 CD4+细胞如何抑制CD8+T细胞的功能。首先，发明人在CD4+耗损后 检测到肿瘤内CD8+T细胞急剧增加(图3a)并且检测到CD8+T细胞产 生增加的IFN-γ(图3b)。这提示，CD4+细胞可以抑制应答肿瘤的CD8+ 细胞的扩增。为了检测这一假说，本发明人将CFSE标记的2C T细胞 过继转移至带有Ag104Ld的C3B6F1小鼠中，其中所述2C T细胞在 2C/Rag-1-/-小鼠中通过MC57-SIY肿瘤细胞(Sun和Bevasn，2003)激 活。2C T细胞来源于T细胞受体(TCR)转基因2C小鼠，其可以直接识 别Ag104Ld上的Ld抗原。这些转移的效应2C T细胞表达高水平的CD44 并下调CD62L的表达(数据未显示)。在CD4+T细胞耗损前，仅有少 数的CFSE标记的效应2C细胞存在于肿瘤中，但在耗损后，观察到该 效应细胞的数量和百分比急剧增加(图3c)。更重要的是，这些2C T 细胞主要在CD4+T细胞耗损后于效应部位发生增殖，这提示抑制作用 主要存在于局部肿瘤部位(图3c)。因此，这些CD4+细胞在肿瘤部位 抑制了CD8+T细胞增殖、成熟和扩张。
IL-10和TGF-β参与体内的抑制机制。为了研究CD4+细胞抑制抗 肿瘤免疫的机制，本发明人比较了CD4+细胞耗损前后脾和肿瘤中的细 胞因子水平。在脾中，在存在CD4+细胞时或不存在CD4+细胞时进行 检测，细胞因子水平没有显著差异(图4a)。Th2细胞因子，IL-4和IL-5， 在存在或缺少CD4+T细胞时于肿瘤部位没有表现出显著差异(图4b)。 然后，缺少CD4+T细胞时，肿瘤组织中的炎性细胞因子(包括IFN-γ， TNF，IL-6和MCP-1)相较于存在CD4+细胞时的水平急剧增加。在耗损 CD4+细胞后，抗炎性细胞因子IL-10的水平也低的多(图4b)。这些 结果提示，CD4+细胞维持了抑制抗肿瘤免疫的抗炎性环境。
本发明人推测如果阻断抗炎性细胞因子的作用可能促进抗肿瘤 免疫。事实上，在本发明人用抗-IL-10受体(IL-10R)抗体处理小鼠后， 肿瘤生长被急剧抑制(图4c)。用抗IL-10R抗体联合炎性信号(如LPS) 或抗-CD40抗体激动剂处理小鼠时，肿瘤生长进一步收到抑制(图 4c)。TGF-β是可以抑制炎性反应的另一种细胞因子。为了在模型中研 究TGF-β在介导抗肿瘤免疫方面的作用，本发明人在用Ag104Ld肿瘤细 胞进行攻击时阻断了TGF-β。TGF-β阻断后肿瘤被完全排斥(图4d)。 这些结果说明，肿瘤内的抗炎性环境在防止肿瘤排斥方面是关键的。 CD4+细胞表现出可以活跃地维持此抗炎性环境以抑制抗肿瘤免疫，由 此促进抗原性肿瘤生长。
在效应部位耗损CD4+ CD25+T 细胞 可以根除已经建立的肿瘤。 由于CD4+CD25+T细胞是肿瘤发展期间肿瘤内的主要CD4+T细胞群 体，故本发明人提出在肿瘤部位耗损CD4+细胞将足以实现肿瘤排斥。 在带有肿瘤的宿主中在肿瘤部分使用少量的抗CD4抗体选择性地耗损 CD4+细胞，可以有效地逆转CD8+细胞对肿瘤的免疫耐受，并同时保 持淋巴组织中有正常数量的CD4+细胞。为了确保在肿瘤建立后于效应 部位耗损CD4+抑制性细胞可以促进抗肿瘤免疫，本发明人使用了低剂 量的抗CD4抗体(10-15μg)进行肿瘤内注射以保证在肿瘤内而不是系 统性地耗损CD4+T细胞(图5a)。本发明人发现，接种肿瘤后14天 于肿瘤内耗损CD4+细胞快速地导致对充分建立的肿瘤的完全排斥作用 (图5b)。此结果证实，肿瘤内CD4+抑制性细胞的耗损足以导致对已经 建立的肿瘤的排斥作用，并提示抗肿瘤CD8+T细胞的有效抑制作用主 要发生在效应部位并且是可以逆转的。重要的是，局部处理可以成为 可负担的有效肿瘤免疫治疗处理方法。
对弱肿瘤抗原的不良免疫应答常常被认为是免疫活性宿主中肿 瘤进行性生长的基础，并被推测为成功免疫治疗的主要障碍。在本研 究中，本发明人将强Ld同种抗原引入小鼠Ag104纤维肉瘤细胞系中， 该细胞系是一种可以在数周内杀死宿主的、高度进行性、侵袭性和血 管化的肿瘤。然而，存在强抗原未能引起抗肿瘤免疫应答以阻止或延 迟肿瘤生长。在人和动物癌症中一般可以观察到淋巴细胞浸润(Gilboa， 1999；Clark等，1989；Clemente等，1996)，但是很少观察到对癌 症的免疫排斥。在具有明显T细胞浸润的情况下，宿主不能根除肿瘤 是一个一直未得以充分理解的令人困惑的现象。在动物模型中对TIL 的更近观察揭示，CD4+亚群CD4+CD25+T细胞选择性地聚积在肿瘤内 并包括了所有TIL的大多数。本发明人还证实，在肿瘤进展过程中， CD4+CD25+T细胞主要在肿瘤内介导抑制性环境并废除CD8+T细胞的 效应功能。局部肿瘤内耗损这些调节性T细胞使得肿瘤的免疫原性被 暴露出来并逆转CTL耐受性，导致对已经充分建立的肿瘤的快速排斥 作用。更重要的是，在本研究中，本发明人阐明了，T调节性细胞可 以是一种重要的局部因子，其可以抑制针对强肿瘤抗原的免疫应答， 导致癌症在免疫活性宿主中进行性生长。
对CD4+T细胞在肿瘤免疫中的作用已经进行广泛研究(Liyanage 等，2002)。研究表明CD4+T细胞在促进CD8+T细胞应答(Woo等，2001； Woo等，2002；Wang等，2004)和发展CD8 T细胞记忆(Yu等，2004； Ward等，1989；Shedlock and Shen，2003)中具有重要作用。在抗肿 瘤免疫中，CD4+T细胞被证明对于维持过继转移CD8+T细胞的功能 是重要的(Sun and Bevan，2003；Dudley等，2002；Wang等，2002)。 在小鼠中耗损CD4+细胞显著削弱粒细胞/巨嗜细胞集落刺激因子 (GM-CSF)疫苗/抗-CTLA4处理保护动物不被后续肿瘤攻击的能力(van Elsas等，2001)。另一方面。最近的研究强烈支持这样的观点，即， CD4+细胞中的群体，CD4+CD25+T细胞，显著限制疫苗诱导的抗肿瘤免 疫应答，并且在肿瘤攻击之前抑制或者消除它们能够显著增强肿瘤免 疫治疗(Machiel s等，2001；Sutmuller等，2001；Steitz等，2001； Yu等，2003；Houghton等，2001)。例如，在一项研究中，当动物在 肿瘤攻击之前用anti-CD25抗体处理时，GM-CSF转导的肿瘤疫苗与 anti-CTLA4的结合更有效地消除已经建立的肿瘤。(Yu等，2003)。尽 管这些研究表明调节性T细胞能够抑制CD8+T细胞的初始致敏，但仍 然普遍关注的是，在带有肿瘤的宿主中耗损CD4+CD25+T细胞可能会 无意中消除了CD4+T细胞的辅助功能，CD4+T细胞在被肿瘤或者免 疫接种活化之后也能表达CD25+标志。本发明人提出，CD4+细胞在初 始阶段主要起到增强性辅助细胞作用，但是一旦肿瘤变为长期持久和 确立的肿瘤，CD4+T调节细胞积累增加，抑制CD8+细胞的功能并遮 蔽肿瘤的免疫原性。的确，该研究已经证明，调节性T细胞可更大程 度地参与效应期(effector phase)，主要在局部肿瘤位点，通过直 接抑制肿瘤浸润性CD8+效应细胞(effector细胞)来实现。在肿瘤 部位耗损这些调节性T细胞高效地逆转了CTL耐受化(tolerization)， 导致已确立肿瘤的快速排斥。因此，该研究证明，CD4+CD25+T细胞 对于抗肿瘤免疫(主要是CD8+T细胞应答)的抑制主要在肿瘤部位在 效应期发生，在肿瘤发展后期耗损T调节性细胞不会减弱可能的T辅 助细胞功能。事实上，耗损T调节性细胞揭露了肿瘤细胞的免疫原性， 并且，对于甚至缺乏强抗原Ld的亲本肿瘤细胞的再次攻击提供长期保 护。该结果提示，免疫的诱导不是仅仅针对Ld，相反，调节性T细胞 的耗损揭露了对以前没有免疫原性的肿瘤抗原的免疫，扩充了具有肿 瘤反应性的CD8+T细胞集合(repertoire)。亲本Ag104(无Ld)肿 瘤系(高度进行性的，没有免疫原性抗原)不能对传统免疫治疗产生 反应，却在耗损调节性T细胞后显示了增强的免疫原性，导致肿瘤排 斥或者延迟的肿瘤发展。可以想到，通过耗损CD4+细胞局部诱导的这 种强抗肿瘤免疫可能会导致远处肿瘤的排斥。
肿瘤微环境可能允许在肿瘤发展以后激活或者扩增调节性T细 胞。本发明人推测，在肿瘤组织内部的慢性发炎可能与慢性自身免疫 发炎或者持久感染过程中对正常组织的保护性免疫的一些方面类似， 后者允许积累CD4+CD25+T细胞亚群以下调免疫应答，限制局部炎症 和减轻局部组织破坏(Sakaguchi，2004；Shevach，2002；Maloy and Powrie，2001；Casares等，2003；Golgher等，2002)。此外，肿瘤 介导的抑制性因子相对于效应T细胞而言可能有利于调节性T细胞的 生存。结果，设计用来在正常组织中防止失控的炎性应答的同样的调 节机制有可能抑制抗肿瘤免疫。在各种肿瘤组织中找到含有CD4+CD25+ 群体的肿瘤浸润T细胞是不罕见的(Dieckmann等，2001；Liyanage 等，2002；Woo等，2001；Woo等，2002；Wang等，2004)。通过表面 标志和细胞因子谱来更好地表征从肿瘤组织分离的CD4+T细胞的性 质将是有益的。
对于确定肿瘤内部免疫应答的结果，理解T效应细胞与T调节性 细胞的平衡可能更重要。最近的研究证明，在肿瘤内部迅速募集幼稚 淋巴细胞和扩充CD8+T细胞可能是一种建立主要是促炎性环境、导致 排斥当地和远处肿瘤的方法(Janssen等，2003)。现在，本发明人进 一步在本研究中证明，耗损调节性T细胞是另一种将肿瘤内部抗炎环 境转化为促炎环境的有效方法。局部治疗以消除调节性T细胞与全身 性治疗相比具有三个优点：第一，它需要非常低剂量的抗体，因此， 该治疗在临床上的费用是可负担的，即使对于发展中国家；第二，它 避免了全身耗损所有CD4+T细胞所诱导的副作用，而全身耗损所有 CD4+T细胞可能会消除T辅助细胞介导的针对病原体的保护性免疫； 第三，它不会妨碍在淋巴组织中辅助CD4+T细胞对CD8+T细胞的有 效致敏，因为所述耗损是局部的。因此，肿瘤环境中调节性T细胞是 一种引人注目的靶标，它们的耗损可能会导致当前免疫治疗方法的改 进。快速扩充肿瘤部位的效应细胞、同时局部耗损调节性细胞的联合 治疗可能提供一种增强抗肿瘤免疫和对癌症患者产生临床上有利的结 果的有效策略。
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基于本文公开的内容，本文公开和要求保护的所有组合物和方法 都能够不需要过度实验而制备和实施。尽管本发明的组合物和方法已 经通过优选的实施方案进行了说明，但是对本领域技术人员显而易见 的是，本发明组合物和方法以及该方法的步骤和步骤顺序可以进行改 动，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体的是，很明显，可 以用化学和生理学相关的某些试剂替代本文公开的试剂，同时实现相 同或者类似的结果。所有这些本领域技术人员明显的替代和修改都被 认为包括在权利要求书限定的本发明精神、范围和概念之内。
表1 CD4耗损诱导针对Ld以外的抗原的免疫应答。
  第一次肿瘤攻击a   处理   再次攻击a  肿瘤生长的发生  率(％)   肿瘤系 剂量   肿瘤系 剂量   Ag104Ld 5×105 5×105 5×105 5×105   手术去除b   CD4耗损c   Ag104Ld   Ag104   Ag104Ld   Ag104   1×106   1×105   1×106   1×105   0/3   3/3   0/4   0/4     (0)     (100)     (0)     (0)   无   无   Ag104Ld   Ag104   1×106   1×105   3/3   3/3     (100)     (100)
a所示肿瘤细胞数被皮下注射到C3B6F1小鼠中。在手术去除或者经抗CD4抗 体处理排斥第一次肿瘤后30天，进行再次攻击。
b在第一次肿瘤攻击后21天手术去除肿瘤。
c在第一次肿瘤攻击后第14天用抗CD4抗体耗损CD4+细胞。耗损通过用FACS 检查外周血来证实。
表2  通过清除CD4+细胞增加肿瘤排斥
  肿瘤攻击a 处理     肿瘤生长的发生率b(％)   肿瘤系     剂量   Ag104Ld     1×106     1×105     1×106     1×105     1×105     1×106     1×105 无 CD4耗损c CD4和CD8耗损d NK耗损e NK和NKT耗损f     6/6     6/6     0/6     0/6     3/3     3/3     6/6     (100)     (100)     (0)     (0)     (100)     (100)     (100)   Ag104     5×105     5×105 无 CD4耗损c     6/6     2/4     (100)     (50)
a所示肿瘤细胞数被皮下注射到C3B6F1小鼠中。
b从一个独立实验获得的或者从两个独立实验综合的结果。
c在肿瘤攻击之前3天和之后7天用抗CD4抗体耗损CD4+细胞。
d在肿瘤攻击之前3天和之后7天用抗CD4抗体耗损CD4+细胞。在肿瘤攻击 后14天用抗CD8抗体耗损CD8+细胞。
e在肿瘤攻击前3天用anti-asialo GM-1抗体耗损NK细胞。
f在肿瘤攻击之前3天或之后7天用抗NK1.1抗体耗损NK和NKT细胞。 各种细胞群的耗损通过用FACS检查外周血来证实。
表3 CD4+细胞引起的抑制是在效应期(effector phase)而不是在致敏 期(priming phase)
    肿瘤攻击a        抗CD4+处理 [相对于肿瘤攻击(0)的天数] 肿瘤生长的发生率c(％)     Ag104Ld1×105     -3和10     -3     20     0/12(0)     5/6(83)     0/10(0)     5×105     20d     0/8(0)
a所示肿瘤细胞数被皮下注射到C3B6F1小鼠中。
b假定肿瘤攻击是在第0天。
CD4+细胞用抗CD4抗体耗损。CD4+细胞不存在的天通过用FACS检查外周血来 证实。
c结果从多个独立实验总结而来。
d平均肿瘤大小达到500mm3以上。
参考文献
以下参考文献并入本文作为参考，它们补充、解释或者教导了这 里使用的方法、技术和/或组合物，或者提供了为这些方法、技术和/ 或组合物提供了背景。
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