相关申请

本申请要求美国临时专利申请系列号60/451,363、60/520,958和 60/523,534的优先权，上述申请分别于2003年2月27日、2003年 11月17日和2003年11月19日提交。

发明领域

本发明涉及治疗阿尔茨海默氏病和其它淀粉样变性病的方法；更 特别地，本发明涉及在阿尔茨海默氏病和其它淀粉样变性病的治疗性 介入中抑制和减少淀粉样原纤维形成的方法。

相关技术的描述

阿尔茨海默氏病的神经病理学特征是淀粉样蛋白沉积物、神经元 纤维缠结和选择性神经元损失。淀粉样蛋白沉积物的主要成分是淀粉 样蛋白-β(Aβ)，它是一种39-43个残基的肽。由淀粉样蛋白前体蛋 白裂解产生的可溶形式的Aβ是代谢的正常产物。阿尔茨海默氏病中 残基1-42(Aβ42)的重要性突出表现在发现了淀粉样蛋白前体蛋白基 因、早老素1和早老素2基因的密码子717突变导致Aβ42比Aβ1-40 产出增加。这些与成熟斑块和弥散性淀粉样蛋白中存在Aβ42有关的 结果推导出如下假说：这种产生更多淀粉样蛋白的物质在斑块形成中 可能是至关紧要的因素。该假说得到了下述事实的支持：在PS1突变 的唐氏综合征和伴有淀粉样变性的遗传性脑出血中Aβ42沉积超过了 Aβ40沉积。

许多体外研究已经证实，Aβ可以是神经毒性的或者可以增加神 经元受到兴奋毒性、代谢或氧化损伤的易感性。最初，人们仅仅认为 原纤维形式的A对神经元是毒性的，但是更全面的对Aβ结构的表征 证实了Aβ的二聚和小聚集物也是神经毒性的。这些数据提示防止Aβ 寡聚将会是预防与AD有关的神经变性的合适策略。若干研究已经证 实，利用增加神经元抗性的化合物可在体外消除Aβ导致的神经毒性， 该化合物通过靶向与细胞调亡有关的细胞途径，在破坏路径的Aβ诱 导之后阻断下游途径，或者阻断Aβ寡聚和最终的原纤维形成来增加 神经元抗性。虽然还有待于阐明起到诱导神经毒性的Aβ位点，但是 已经能通过各种不同的药剂阻断其毒性作用。

在AD进程中，Aβ-原纤维停靠到神经元和胶质细胞膜上可以是 早期的可干涉步骤。淀粉样蛋白斑、神经毒性和炎症的形成可能是A 与含糖基团的分子相互作用直接或间接导致的结果。早期的研究已经 证实，Aβ与氨基多糖相互作用导致Aβ聚集可能增加其不溶性和斑块 持久性。氨基多糖还与神经元毒性和小神经胶质细胞活化有关。另外， 与糖脂如神经节苷脂的相互作用导致稳定化和防止Ab原纤维形成以 及Aβ产生位点。另一方面，磷脂酰肌醇家族导致加速原纤维的形成。 磷脂酰肌醇的头基是肌醇，它是一种天然存在的简单糖，与脂质生物 合成、信号转导和渗透压的控制有关。

同样值得注意的是，多种其它人类疾病也证实存在淀粉样蛋白沉 积并且通常涉及全身性器官(即位于中枢神经系统外围的器官或组 织)，这些器官伴有导致器官机能障碍或衰竭的淀粉样蛋白积聚。对 于阿尔茨海默氏病和“全身性”淀粉样蛋白病，目前没有治愈或有效的 治疗方法，并且病人通常在发病的3-10年内去世。

美国专利4,847,082号公开了植酸、植酸盐、植酸的异构体或水 解产物用于治疗阿尔茨海默氏病的用途。还公开了植酸或植酸盐的异 构体，其包含六磷酸肌-肌醇酯、六磷酸鲨肌醇酯、六磷酸D-手性-肌 醇酯、六磷酸L-手性-肌醇酯、六磷酸新-肌醇(neo-inositol)酯和六 磷酸粘-肌醇(muco-inositol)酯构型。植酸是肌醇-六磷酸酯(IP6)。

美国专利5,112,814号公开了植酸及其异构用于治疗帕金森氏病 的用途。与美国专利4,847,082号相同，该专利公开的植酸异构体在 六碳肌醇糖上具有六个磷酸酯基。

值得注意的是，在后续的公开文献中，研究了肌醇-单磷酸酯、肌 醇-1，4-二磷酸酯和肌醇-1，4，5-三磷酸酯抑制淀粉样-β肽微纤维生成的 能力并且发现它们是无效的(J.Mol.Biol.278：183-194，1998)。

Barak等人公开了肌醇用于治疗阿尔茨海默氏病(AD)的用途。 (Prog Neuro-psychopamacol & Biol Psychiat.20：729-735，2000)。 但是，该参考文献没有公开肌醇异构体的用途。在肌醇治疗AD病人 和安慰剂(葡萄糖)治疗AD病人之间，在整体认知功能分数(CAMCOG 指数)方面，肌醇治疗的病人没有显示出明显的差异，但是CAMCOG 指数的两个具体亚指标却显示出显著的改善(定向和语言)。

Levine J.综述了上述Barak等人的文章并特别指出肌醇治疗不利 于AD或ECT-诱导的认知缺损(Eur Neuropsychoparm.1997；7， 147-155，1997)。

参考上述Barak等人的文章，Colodny等人进一步研究提出肌醇 对于阿尔茨海默氏病是无用的，因此没有公开或建议肌醇异构体的用 途(Altern Med Rev 3(6)：432-47，1998)。

McLaurin等人公开了肌-肌醇能稳定Aβ42的小微团(J.Mol.Biol. 278，183-194，1998)。此外，McLaurin等人公开了表-肌醇和鲨肌醇 但不是手性-肌醇能诱导Aβ42发生由无规向β-结构的结构转变(J Biol Chem.6月16日；275(24)：18495-502，2000；和J Struct Biol 130： 259-270，2000)。另外，立体异构体均不能诱导Aβ40的结构转变。 电子显微镜显示，肌醇能稳定Aβ42的小积聚物。这些参考文献还公 开了肌醇-Aβ的相互作用产生了一种对神经生长因子分化的PC-12细 胞和原代人神经元培养物无毒性的复合物。

对阿尔茨海默氏病已经完成了许多工作，但是当前已知很少的化 合物或药剂用于治疗方案以阻止或逆转阿尔茨海默氏病或其它淀粉样 变性病中发生的淀粉样蛋白形成、沉积、积聚和/或留存。

因此，非常需要用于治疗方案的新化合物或药剂以阻止或逆转阿 尔茨海默氏病或其它淀粉样变性病中发生的淀粉样蛋白形成、沉积、 积聚和/或留存。

发明概述

本发明提供了一种治疗或预防受试者的与蛋白质折叠或积聚紊 乱、或淀粉样蛋白形成、沉积、积聚或留存有关的中枢或外周神经系 统或全身性器官病症的方法，其包括向所述受试者给药医药有效量的 选自下述结构的化合物：

其中，各个R1、R1′、R2、R2′、R3、R3′、R4、R4′、R5、R5′、R6 和R6′独立地选自以下基团：

(a)氢原子；

(b)NHR7，其中所述R7选自氢；C2-C10酰基和C1-C10烷基；

(c)NR8R9，其中所述R8是C2-C10酰基或C1-C10烷基，并且所述 R9是C2-C10酰基或C1-C10烷基；

(d)OR10，其中所述R10选自无基团、氢、C2-C10酰基、C1-C10烷 基和SO3H；

(e)C5-C7糖基；

(f)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OH、 NH2、SH、OSO3H和OPO3H2；

(g)SR11，其中R11选自氢、C1-C10烷基和O3H；

(h)任选地被选自氢、OR10、NHR7、NR8R9和SR11的取代基取 代的C1-C10烷基；和

(i)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OR10、 NHR7、NR8R9和SR11，

条件是该化合物不是肌-肌醇。

本发明还提供了一种预防受试者异常蛋白质折叠、异常蛋白质积 聚、淀粉样蛋白形成、沉积、积聚或留存、或淀粉样蛋白脂质相互作 用的方法，其包括向所述受试者给药医药有效量的选自下述结构的化 合物：

其中，各个R1、R1′、R2、R2′、R3、R3′、R4、R4′、R5、R5′、R6 和R6′独立地选自以下基团：

(a)氢原子；

(b)NHR7，其中所述R7选自氢；C2-C10酰基和C1-C10烷基；

(c)NR8R9，其中所述R8是C2-C10酰基或C1-C10烷基，并且所述 R9是C2-C10酰基或C1-C10烷基；

(d)OR10，其中所述R10选自无基团、氢、C2-C10酰基、C1-C10烷 基和SO3H；

(e)C5-C7糖基；

(f)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OH、 NH2、SH、OSO3H和OPO3H2；

(g)SR11，其中R11选自氢、C1-C10烷基和O3H；

(h)任选地被选自氢、OR10、NHR7、NR8R9和SR11的取代基取 代的C1-C10烷基；和

(i)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OR10、 NHR7、NR8R9和SR11，

条件是该化合物不是肌-肌醇。

本发明还提供了一种使受试者异常积聚的蛋白质解离和/或使预形 成或预沉积的淀粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白溶解或破裂的方法，其 包括向所述受试者给药医药有效量的选自下述结构的化合物：

其中，各个R1、R1′、R2、R2′、R3、R3′、R4、R4′、R5、R5′、R6 和R6′独立地选自以下基团：

(a)氢原子；

(b)NHR7，其中所述R7选自氢；C2-C10酰基和C1-C10烷基；

(c)NR8R9，其中所述R8是C2-C10酰基或C1-C10烷基，并且所述 R9是C2-C10酰基或C1-C10烷基；

(d)OR10，其中所述R10选自无基团、氢、C2-C10酰基、C1-C10烷 基和SO3H；

(e)C5-C7糖基；

(f)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OH、 NH2、SH、OSO3H和OPO3H2；

(g)SR11，其中R11选自氢、C1-C10烷基和O3H；

(h)任选地被选自氢、OR10、NHR7、NR8R9和SR11的取代基取 代的C1-C10烷基；和

(i)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OR10、 NHR7、NR8R9和SR11，

条件是该化合物不是肌-肌醇。

本发明还提供了一种诊断受试者异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀 粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白存在的方法，其包括：(a)向所述受试 者给药放射性化合物或标记了足够量的在允许所述化合物与异常折叠 或积聚的蛋白质和/或原纤维或淀粉样蛋白结合的条件下发射可检测信 号的物质的化合物，如果异常折叠或积聚的蛋白质和/或原纤维或淀粉 样蛋白存在的话；和(b)检测来自与异常折叠或积聚的蛋白质和/或原 纤维或淀粉样蛋白结合的化合物的放射性或信号，由此诊断所述受试 者异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白的存 在，其中所述化合物具有下述结构：

其中，各个R1、R1′、R2、R2′、R3、R3′、R4、R4′、R5、R5′、R6 和R6′独立地选自以下基团：

(a)氢原子；

(b)NHR7，其中所述R7选自氢；C2-C10酰基和C1-C10烷基；

(c)NR8R9，其中所述R8是C2-C10酰基或C1-C10烷基，并且所述 R9是C2-C10酰基或C1-C10烷基；

(d)OR10，其中所述R10选自无基团、氢、C2-C10酰基、C1-C10烷 基和SO3H；

(e)C5-C7糖基；

(f)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OH、 NH2、SH、OSO3H和OPO3H2；

(g)SR11，其中R11选自氢、C1-C10烷基和O3H；

(h)任选地被选自氢、OR10、NHR7、NR8R9和SR11的取代基取 代的C1-C10烷基；和

(i)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OR10、 NHR7、NR8R9和SR11，

条件是该化合物不是肌-肌醇。

本发明还提供了一种诊断受试者异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀 粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白存在的方法，其包括：(a)收集来自所 述受试者的样品；(b)使所述样品与放射性化合物或标记了在允许所 述化合物与异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀粉样蛋白原纤维或淀粉样 蛋白结合的条件下发射可检测信号的物质的化合物接触，如果异常折 叠或积聚的蛋白质和/或淀粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白存在的话；和 (c)检测来自与异常折叠或积聚的蛋白质和/或原纤维或淀粉样蛋白结 合的化合物的放射性或信号，由此诊断所述受试者异常折叠或积聚的 蛋白质和/或淀粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白的存在，其中所述化合物 具有下述结构：

其中，各个R1、R1′、R2、R2′、R3、R3′、R4、R4′、R5、R5′、R6 和R6′独立地选自以下基团：

(a)氢原子；

(b)NHR7，其中所述R7选自氢；C2-C10酰基和C1-C10烷基；

(c)NR8R9，其中所述R8是C2-C10酰基或C1-C10烷基，并且所述 R9是C2-C10酰基或C1-C10烷基；

(d)OR10，其中所述R10选自无基团、氢、C2-C10酰基、C1-C10烷 基和SO3H；

(e)C5-C7糖基；

(f)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OH、 NH2、SH、OSO3H和OPO3H2；

(g)SR11，其中R11选自氢、C1-C10烷基和O3H；

(h)任选地被选自氢、OR10、NHR7、NR8R9和SR11的取代基取 代的C1-C10烷基；和

(i)C3-C8环烷基，其任选地被选自下述的取代基取代：氢、OR10、 NHR7、NR8R9和SR11，

条件是该化合物不是肌-肌醇。

附图简介

图1A给出了肌-肌醇、表-肌醇和鲨肌醇的结构，同时图1B-1H 显示了针对TgCRND8小鼠进行的莫里斯水迷宫试验的空间参考记忆 模型。肌-肌醇治疗没有改变认知功能(1B)。在6月龄时，未治疗的 TgCRND8(n＝10)相对于非-Tg对照组(1C)和鲨肌醇(1D)治疗 小鼠显示出认知缺损(每组n＝10，未治疗组比治疗组p＜0.02)。表-肌 醇治疗的TgCRND8小鼠的性能与非-Tg同窝小鼠(1E)相比仍然有 所损伤，但是鲨肌醇TgCRND8小鼠的性能与非-Tg同窝小鼠的性能 相近(1F)。非-Tg同窝小鼠的行为不受表-肌醇(1G)或鲨肌醇(1H) 治疗的影响。垂直线条代表标准误差。

图2A-2I显示了6月龄时表-肌醇和鲨肌醇治疗的TgCRND8的斑 块存积和星形神经胶质增生。对照动物在海马状突起(2A)和大脑皮 层(2B)中具有高斑块负荷和星形神经胶质增生。更高的放大图证实 星形神经胶质细胞活化不仅仅与斑块负荷有关(2C)。表-肌醇治疗对 淀粉样蛋白存积有中度的作用，并且减少了星形神经胶质增生(2D、 2E和2F)。鲨肌醇治疗明显地减少了淀粉样蛋白存积和胶质增生(2G、 2H和2I)。更高的放大图显示出鲨肌醇治疗小鼠具有较小的平均斑块 大小(2I)。用抗-GFAP抗体标记星形神经胶质细胞并使用抗-Aβ抗 体鉴定斑块存积。定标线条为450微米(A、B、D、E、G、H)和94 微米(C、F、I)。

图3A-3D显示了对照和治疗的TgCRND8小鼠中Aβ物质1-42、 1-40和1-38与APP进展(3B)的程度难以区分。用治疗和未治疗的 TgCRND8小鼠在系列矢状面切片上将血管淀粉样蛋白存积量化。 TgCRND8小鼠具有显著的血管淀粉样蛋白存积，这与小的和中等大 小的血管有关，鲨肌醇治疗的TgCRND8小鼠的负荷量下降(3A)。 与未治疗和表-肌醇治疗的TgCRND8小鼠相比(3C)，鲨肌醇治疗明 显地降低了总血管负荷量。平均斑块大小的明显减小(3D)说明了鲨 肌醇降低了斑块沉积。

图4显示了使用莫里斯水迷宫的空间参考记忆模型，在3天试验 范例中水对TgCRND8和非Tg小鼠认知功能的作用。

图5显示了使用莫里斯水迷宫的空间参考记忆模型，在3天试验 范例中鲨肌醇对TgCRND8和非Tg小鼠认知功能的作用。

图6显示了使用莫里斯水迷宫的空间参考记忆模型，在3天试验 范例中表-肌醇对TgCRND8和非Tg小鼠认知功能的作用。

图7显示了使用莫里斯水迷宫的空间参考记忆模型，在3天试验 范例中肌-肌醇对TgCRND8和非Tg小鼠认知功能的作用。

图8显示了使用莫里斯水迷宫的空间参考记忆模型，在3天试验 范例中鲨肌醇、表-肌醇和肌-肌醇对TgCRND8认知功能(学习期和 记忆试验)的作用并且与野生型小鼠进行了比较。

图9显示了未治疗的TgCRND8小鼠与鲨肌醇、表-肌醇或肌-肌 醇治疗的小鼠比较被斑块覆盖的大脑面积百分数。

图10A和10B显示了用水治疗的TgCRND8小鼠的存活率与表- 肌醇或肌-肌醇治疗的TgCRND8小鼠的存活率比较(10A)或与鲨肌 醇治疗的TgCRND8小鼠的存活率比较(10B)。

图11A-D显示了6个月龄的TgCRND8小鼠经甘露醇治疗或未 治疗的莫里斯水迷宫试验的空间参考记忆模型的结果(A，B)。甘露 醇治疗的TgCRND8小鼠与未治疗的TgCRND8小鼠没有明显的差别 (p＝0.89；A)。甘露醇治疗的TgCRND8小鼠的性能明显不同于甘露 醇治疗的非-Tg同窝小鼠(p＝0.05；B)。使用定量图像分析法分析蛋 白存积量(C)。当以斑块计数作为总斑块存积量测定时，甘露醇治疗 的TgCRND8小鼠与未治疗的TgCRND8小鼠没有区别(p＝0.87)。 垂直线条代表标准误差。绘制了甘露醇治疗或未治疗的TgCRND8小 鼠的Kaplan-Meier累积存活率(D)。通过Tarone-Ware统计测试得 出在两组动物(每组n＝35)之间没有显著性差异，p＝0.87。

图12A和B显示了进行了3天试验范例的空间参考记忆试验的治 疗研究结果。鲨肌醇治疗的TgCRND8小鼠的性能可比得上鲨肌醇治 疗的非-Tg同窝小鼠(p＝0.38；A)。一致地，治疗2个月后，鲨肌醇 治疗的TgCRND8小鼠仍与非-Tg同窝小鼠没有区别(p＝0.67；B)。

图13A和B显示了向5个月龄的TgCRND8小鼠每天给药一次各 种剂量的鲨肌醇1个月后，CNS中的Aβ含量。在所有剂量下，可溶 的Aβ42含量下降并且与未治疗的对照组明显不同(A)。相反，在所 有条件下，不可溶的Aβ42没有显著的不同(B)。垂直线条代表标准 误差。

图14向TgCRND8小鼠每天给药一次各种剂量的鲨肌醇1个月 后，分析大脑Aβ40的含量。在所有测试剂量下，没有检测到在未治 疗的和鲨肌醇治疗的TgCRND8小鼠的可溶Aβ40含量(A)和不可 溶Aβ40含量(B)之间有所不同。

图15显示了与非-转基因同窝小鼠相比，异-肌醇治疗的6个月龄 的TgCRND8小鼠的认知功能。

图16A-D显示了鲨肌醇治疗的小鼠在2月龄时，TgPS1×APP小 鼠中的斑块存积量有所降低。对照动物在海马状突起(A)和大脑皮 层(B)中具有高斑块负荷。鲨肌醇治疗明显地降低了淀粉样蛋白存 积(C、D)。使用抗-Aβ抗体(褐色)鉴定斑块存积。定标线条为300μm。

图17A-C显示了在鲨肌醇治疗后TgPS1×APP小鼠中斑块存积的 定量。斑块大脑覆盖百分数(A)、平均斑块大小(B)和斑块计数(C) 显著减少。垂直线条代表标准误差。

发明详述

本发明公开了某些肌醇立体异构体所具有的与淀粉样蛋白有关的 疾病如阿尔茨海默氏病的治疗相关的新颖的、不可预见的且出乎意料 的性质。

已经惊奇地发现，肌醇的某些立体异构体及相关的化合物会阻断 Aβ-诱导的进行性认知衰退和大脑淀粉样蛋白斑病变，并且在Aβ沉积 的新生阶段，将其给予人阿尔茨海默氏病的转基因小鼠模型时可提高 存活率。

如上述所公开的，以前的数据提示一些(并非全部)肌醇立体异 构体可能对体外培养的神经元细胞的淀粉样蛋白聚集有所作用 (McLaurin等人，J.Biol.Chem.275(24)：18495-18502(2000))。那 些调查没有提供任何方法来预测哪种所研究的立体异构体(肌-肌醇、 表-肌醇、鲨肌醇和手性-肌醇)将会具有这种作用，也没有预测任何 其它的将会具有这种作用。并且，那些研究不能预测是否任何一种肌 醇异构体会在体内对淀粉样蛋白沉积、认知缺陷或寿命有所作用。本 发明描述了下述不可预测的结果：在与淀粉样蛋白相关的疾病的动物 模型中，仅有某些肌醇立体异构体，特别是鲨肌醇和异-肌醇减少淀粉 样蛋白斑负担，改善认知并增长寿命，而其它的被研究的异构体则不 具有这种作用。

以前的研究还仅仅提示某些肌醇立体异构体(例如表-肌醇和鲨肌 醇)可抑制体外的新生淀粉样蛋白聚集。本发明描述了下述不可预测 的结果：鲨肌醇抑制已形成的大脑淀粉样蛋白沉积，并且在活脑中也 是如此。以前公开的体外数据对此并没有暗示，该数据认为仅仅作用 于培养的某些神经元细胞型，而非活脑的复杂组织，并且仅仅提示肌 醇可抑制新生聚集，从而与已形成的疾病无关。

以前的体外数据还提示给药表-肌醇和鲨肌醇还影响淀粉样蛋白 Aβ40含量和Aβ42含量。本发明的体内剂量研究揭示了下述不可预料 的结果：给药异-肌醇或鲨肌醇尤其减少Aβ42含量，然而对不溶的Aβ42 和可溶或不溶的Aβ40含量没有影响。

本发明的调查显示出神经胶质活性和炎症的变化，这是新颖的且 令人惊讶的，并且不能由以前公开的体内数据预测到。

本发明的调查证实鲨肌醇改善转基因模型动物的寿命，这也是新 颖的且令人惊讶的，因为没有阿尔茨海默氏病的药物以前显示出体内 可增加存活率和延长寿命。

优选地，本发明的化合物是1，2，3，4，5，6-环己六醇，更优选选自顺-、 表-、异-、粘-、新-、鲨-、D-手性-和L-手性-肌醇。

还优选化合物1，2，3，4，5-环己五醇(栎醇)，更优选选自表-、vibo-、 鲨-、异-、塔罗-、gala-、顺-、粘-、新-、原-栎醇及其对映异构体。

还优选那些选自环己四醇、环己三醇、环己四醇的立体异构体、 环己三醇的立体异构体、环己四醇的对映异构体和环己三醇的对映异 构体的化合物。

这些化合物还可以是五羟基环己酮或其立体异构体或对映异构 体。

还优选，这些化合物是选自鲨肌醇单酮、L-手性-肌醇单酮-1和L- 表-肌醇单酮的肌醇单酮。

还优选，这些化合物是三羟基环己酮、或其立体异构体或对映异 构体。更优选(-)-1-脱氧-鲨肌醇单酮。

还优选，这些化合物是五羟基环己酮(肌醇单酮)、或其立体异 构体或对映异构体，更优选选自鲨肌醇单酮、L-手性-肌醇单酮-1和L- 表-肌醇单酮。

任选地，这些化合物是三羟基环己酮或其立体异构体或对映异构 体，如(-)-1-脱氧-鲨肌醇单酮。

还优选，这些化合物是O-单甲基-环己六醇或其立体异构体或对 映异构体，更优选选自D-松醇、L-白坚木醇和D-婆罗醇。

另外，这些化合物可以选自一氨基环己五醇(肌醇胺)、二氨基 环己四醇(肌醇二胺)、二氨基环己三醇、其立体异构体、及其对映 异构体、和其可药用盐，例如L-新-肌醇胺、D，L-表-肌醇胺-2、链霉 胺和脱氧链霉胺。

还优选，这些化合物是单巯基-环己五醇、或其立体异构体或对映 异构体，更优选1L-1-脱氧-1-巯基-8-O-甲基-手性-肌醇。

本发明的最优选化合物是异-肌醇和鲨肌醇，其中最优选鲨肌醇。 如上所示，本发明的肌醇立体异构体不包括肌-肌醇并且还不包括表- 肌醇。

即使在淀粉样蛋白病变已经形成数月之后给药，这些化合物也能 有效地逆转大脑Aβ积聚和淀粉样蛋白病变。

因此，发现这些化合物有用于治疗或预防受试者中与蛋白质折叠 或积聚紊乱、或淀粉样蛋白形成、沉积、积聚或留存有关的中枢或外 周神经系统或全身性器官的病症。还发现这些化合物可用于预防受试 者异常蛋白质折叠、异常蛋白质积聚、淀粉样蛋白形成、沉积、积聚 或留存、或淀粉样蛋白脂质相互作用，以及使受试者异常积聚的蛋白 质解离和/或使预形成或预沉积的淀粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白溶解 或破坏。

优选，所述中枢或外周神经系统或全身性器官的病症导致蛋白 质、蛋白质片断和肽以β-折叠片和/或原纤维和/或聚集体的形式沉淀。 更优选，所述中枢或外周神经系统或全身性器官的病症选自：阿尔茨 海默氏病、早老和衰老形成；淀粉样蛋白血管病；轻度认知减退；与 阿尔茨海默氏病有关的痴呆；tau病；α-突触蛋白病；帕金森病；肌 萎缩性脊髓侧索硬化；运动神经元病；痉挛性截瘫(paraplagia)；亨 延顿病；脊髓小脑性共济失调；弗里德赖希共济失调；与细胞内和/或 神经元内蛋白质与聚谷氨酰胺、聚丙氨酸或由相应基因内的三或四核 苷酸单元的病理扩张而引起的其它重复体的聚集有关的神经变性疾 病；脑血管疾病；唐氏综合征；伴有创伤后淀粉样β肽积聚的头部创 伤；与朊病毒有关的疾病；家族性英国痴呆；家族性丹麦痴呆；伴有 痉挛性共济失调的早老性痴呆；英国型大脑淀粉样血管病；伴有痉挛 性共济失调的早老性痴呆；丹麦型大脑淀粉样血管病；具有神经丝抑 蛋白包涵体的家族性脑病(FENIB)；淀粉样多神经病；由淀粉样β 肽导致的包涵体肌炎；家族性芬兰型淀粉样变性；与多发性骨髓瘤相 关的全身性淀粉样变性；家族性地中海热；慢性感染和发炎；以及与 胰岛淀粉样多肽(IAPP)有关的II型糖尿病。

还优选，与阿尔茨海默氏病有关的痴呆是血管性或阿尔茨海默痴 呆，并且tau病选自嗜银粒性痴呆(argyrophilic grain dementia)、 皮质基质退化、拳击员痴呆、伴有钙化的弥散性神经元纤维缠结、伴 有帕金森综合征的额颞痴呆、与朊病毒有关的疾病、哈勒沃登-施帕茨 病、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克病、具有神经元纤维缠结的非 关岛运动神经元病、皮克病、脑炎后巴金森综合征、朊病毒蛋白大脑 淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性 硬化性全脑炎、和仅缠结型痴呆(tangle only dementia)。

还优选，α-突触蛋白病选自具有向心性多层的圆形小体的痴呆、 具有神经胶质细胞质内含物的多系统萎缩症、夏-德综合征、纹状体黑 质变性、橄榄体脑桥小脑萎缩、具有I型脑铁积聚的神经变性、嗅觉 异常、和肌萎缩性脊髓侧索硬化。

还优选，运动神经元病与丝状或聚集状的神经微丝和/或超氧化物 歧化酶蛋白有关，痉挛性截瘫与侣伴蛋白和/或三联A蛋白的功能缺 损有关，而脊髓小脑性共济失调是DRPLA或马-约病。

还优选，与朊病毒有关的疾病选自克罗伊茨费尔特-雅各布病、 Gerstmann-Strussler-Scheinker病、和变种克罗伊茨费尔特-雅各布 病，和淀粉样多神经病是老年淀粉样多神经病或全身性淀粉样变性。

更优选，所述中枢或外周神经系统或全身性器官的病症是包括家 族性或非家族性的帕金森病。最优选，所述中枢或外周神经系统或全 身性器官的病症是阿尔茨海默氏病。

优选，将本发明化合物以约1mg-约1g/kg受试者体重、优选1mg- 约200mg/kg受试者体重、更优选约10mg-约100mg/kg受试者体重、 最优选约30mg-约70mg/kg受试者体重的剂量向受试者给药。给药可 通过诸如下述的各种方法完成：口服(口服丸剂、口服液或悬浮液)、 静脉内、肌内、腹膜内、皮内、经皮、皮下、鼻内、舌下、直肠栓剂 或吸入，其中最优选口服给药。本发明化合物可间隔多种时间进行给 药，例如每天一次、每天两次、一周一次、一月一次或持续给药。

优选，本发明化合物与其它治疗剂联合给药，这些治疗剂例如是 β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂(APP-特异性或非特异性)、ε-分 泌酶抑制剂(APP-特异性或非特异性)、β-片状聚集/微纤维生成/ADDL 生成(例如Alzhemed)的其它抑制剂、NMDA拮抗剂(例如美金刚)、 非甾体抗炎化合物(例如布洛芬、西乐葆)、抗氧化剂(例如维生素 E)、激素(例如雌激素)、营养剂和食品补充剂(例如银杏)；乙酰 胆碱酯酶抑制剂(例如donezepil)、毒蕈碱激动剂(例如AF102B(西 维美林，EVOXAC)、AF150(S)和AF267B)、抗精神病药(例如氟 派啶醇、氯氮平、奥氮平)；抗抑郁药，包括三环抗抑郁剂和血清素 重摄取抑制剂(例如舍曲林和西酞普兰Hbr)、基于正调节neprilysin (一种降解Aβ的酶)的基因治疗和/或药物；基于正调节胰岛素降解 酶(一种降解Aβ的酶)的基因治疗和/或药物、疫苗、Aβ的免疫治 疗和抗体(例如ELAN AN-1792)、他汀类药物和其它降胆固醇药物 (例如洛伐他汀和辛伐他汀)、干细胞和其它基于细胞的治疗剂、磷 酸化TAU蛋白的激酶(CDK5、GSK3α、GSK3β)抑制剂(例如氯 化锂)、或调节Aβ生成的激酶(GSK3α、GSK3β、Rho/ROCK激 酶)的抑制剂(例如氯化锂和布洛芬)。

我们认为这些其它治疗剂通过不同的机理起作用，并且对本发明 具有相加作用/协同作用。此外，许多其它治疗剂可能具有基于机理的 作用和/或其它副作用，这会限制剂量或耐受性，这时可以将它们单独 给药。

因为本发明化合物具有在下文中更详细讨论的在活体内结合淀粉 样蛋白的能力，所以本发明化合物还有用于使用下述方法来诊断受试 者中异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀粉样原纤维或淀粉样蛋白的存 在，该方法包括：向所述受试者给药放射性化合物或标记了足够量的 在允许所述化合物与异常折叠或积聚的蛋白质和/或原纤维或淀粉样蛋 白结合的条件下发射可检测信号的物质的化合物，如果异常折叠或积 聚的蛋白质和/或原纤维或淀粉样蛋白存在的话；和检测来自与异常折 叠或积聚的蛋白质和/或原纤维或淀粉样蛋白结合的化合物的放射性或 信号，由此诊断异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀粉样蛋白原纤维或淀 粉样蛋白的存在。

另外，从受试者收集怀疑含有异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀粉 样原纤维或淀粉样蛋白的样品，并使所述样品与放射性化合物或标记 了在允许所述化合物与异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀粉样蛋白原纤 维或淀粉样蛋白结合的条件下发射可检测信号的物质的化合物接触， 如果异常折叠或积聚的蛋白质和/或淀粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白存 在的话；并随后检测来自与异常折叠或积聚的蛋白质和/或原纤维或淀 粉样蛋白结合的化合物的放射性或信号，由此诊断所述受试者异常折 叠或积聚的蛋白质和/或淀粉样蛋白原纤维或淀粉样蛋白的存在。

优选，所述可检测信号是荧光信号或酶联免疫吸附测定信号，以 及所述样品是全血(包括所有的细胞成分)或血浆。

如下文所示，在阿尔茨海默氏病的转基因小鼠模型中，在“症状 发生前的晚期”阶段、小鼠出现明显认知缺陷和淀粉样神经病理之前， 给予本发明化合物，可以消除大脑内的Aβ积聚、大脑淀粉样蛋白斑 沉积和认知衰退。此外，即使在出现认知缺陷和淀粉样蛋白斑神经病 理之后给予这些化合物，它们也能有效地逆转淀粉样蛋白沉积和神经 病理。重要的是，根据这些化合物调节Aβ单体集合为神经毒性的寡 聚物和/或原纤维的能力，由这些化合物的作用机制引导出合理的设 计。

本发明化合物的其它优点包括它们通过两种已知的转运体和被动 扩散转运到CNS，从而提供了良好的CNS生物利用度。第二，这些 化合物被代谢为葡萄糖。第三，作为一类物质，这些化合物通常具有 低毒性谱，并且出于不同的目的，以前已经将它们中的一些向人类给 药。

实施例1-构建阿尔茨海默氏小鼠模型和给药本发明化合物的方法

如Janus等人(Nature 408：979-982(2000))所述，TgCRND8 小鼠是阿尔茨海默氏病的强突变模型。它们在C3H/B6远交背景的叙 利亚地鼠与朊病毒启动子的调控下表达人淀粉样蛋白前体蛋白 (APP695)转基因。人APP695转基因具有两个突变点，其导致人类 患上AD(K670N/M671L和V717F)。从约3月龄开始，TgCRND8 小鼠出现进行性空间学习缺陷，并伴随大脑Aβ含量升高和大脑细胞 外淀粉样蛋白斑数量增加，这些均与患有AD的人类大脑中所见到的 情况相似(C.Janus等人，Nature 408：979-982(2000))。

将年龄和性别相配的TgCRND8小鼠组和非转基因的同窝小鼠组 (每组n＝35)要么不进行治疗，要么从约6周龄开始按下述的以30mg/ 天/鼠的量给药本发明化合物。随后在4月龄和6月龄时测定这些小鼠 的认知功能、大脑Aβ含量、大脑病理和存活率。

预防研究方法

小鼠-以30mg/鼠/天的量给试验组TgCRND8小鼠喂食肌-肌醇、 表-肌醇和鲨肌醇。在6周龄时两组进入研究并在4月龄和6月龄时分 析结果。监测体重、皮毛特征和笼子内行为。所有的试验根据加拿大 委员会的动物照料指南进行。

行为测试-在非空间预训练之后，对小鼠进行方位辨别训练5天， 每天进行4次测试。使用药物或基因型和训练期作为重复测定因素的 因素方差分析(ANOVA)的混合模型来分析行为数据。

大脑淀粉样蛋白负担-取出大脑并且一个脑半球固定于4％多聚 甲醛中并沿着中央矢状面(mid saggital plane)埋入石蜡。为了产生 一组系统性均匀的随机切片，横切整个半球收集5μm连续切片。间隔 50mm的切片组用于分析(10-14片/组)。用甲酸进行抗原检索之后 鉴定出斑块，并将其用原发抗Aβ抗体(Dako M-0872)、然后用次 级抗原(Dako StreptABCcomplex/horseradish kit)孵育。终产物经 苏木精进行DAB对染而可以观测到。使用与莱卡显微镜和日立KIP- MU CCD摄像机连接的Leco IA-3001图像分析软件评价淀粉样蛋白 斑负担。类似地分析血管负担，并使用剥离器来测量受侵袭血管的直 径。

血浆和大脑Aβ含量-在蔗糖缓冲液中将脑半球样品匀浆，然后 要么加入0.4％二乙胺/100mM NaCl用于溶解Aβ含量，要么加入冷 甲酸用于分离总Aβ。中和之后，稀释样品并使用商购的试剂盒 (BIOSOURCE International)分析Aβ40和Aβ42。每个半球分析三 次，记载平均值±标准差。在所有的部分上进行使用尿素凝胶进行蛋 白质斑点分析以分析Aβ物质。使用6E10(BIOSOURCE International)和强化的化学发光(Amersham)检测Aβ。

分析大脑中的APP-将小鼠脑半球样品在20mM Tris pH7.4、 0.25M蔗糖、1mM EDTA和1mM EGTA、以及蛋白酶抑制剂混合液 中匀浆，与0.4％DEA(二乙胺)/100mM NaCl混合并以109,000Xg 旋转。通过蛋白质印迹使用mAb 22C11分析上清液中的APPs含量， 使用mAb C1/6.1分析片状沉淀以测定APP全蛋白。

定量神经胶质增生-从治疗和对照小鼠的多聚甲醛固定且冷冻的 半球上随机选择均匀间隔的五片矢状切片。将切片用抗鼠GFAP IgG2a (Dako；1∶50稀释)来免疫标记星形神经胶质细胞并且用抗鼠CD68 IgG2b(Dako；1∶50稀释)来免疫标记小神经胶质细胞。使用安装在 Zeiss Axioscope 2 Plus显微镜上的Coolsnap数码相机(Photometrics， Tuscon，Arizona)收集数字图像。使用Openlab 3.08图像软件 (Improvision，Lexington MA)分析图像。

存活率调查-通过Kaplan-Meier技术评估存活机率，每当出现 死亡时计算分析存活机率，从而使其适合小样本量。每个治疗组使用 35只小鼠用于存活力分析。使用Tarone-Ware检测记载各治疗组之 间的比较。

实施例2-认知缺失的预防

使用莫里斯水迷宫的空间参考记忆模型，使用5天试验范例评估 TgCRND8小鼠的认知功能。以治疗(未治疗的，表-肌醇或鲨肌醇) 和基因型(TgCRND8与非-Tg)作为“受试者间”因子，使用混合的方 差分析(ANOVA)模型来分析由治疗的和未治疗的TgCRND8小鼠 获得的数据以及由治疗的和未治疗的非-Tg同窝小鼠获得的数据(对 于所有的组合，n＝10)。经表-肌醇或鲨肌醇治疗的TgCRND8小鼠的 表现明显地比未治疗的TgCRND8小鼠好(p＜0.02；图1C和D)。 与治疗的和未治疗的非-Tg同窝小鼠相比，在训练的前三天，表-肌醇 治疗的TgCRND8小鼠表现出稍微更缓慢的学习曲线。但是，在训练 4天之后，表-肌醇治疗的TgCRND8小鼠与其非-Tg同窝小鼠之间无 统计上的差异(图2E)。相反，在所有这些天中，在鲨肌醇治疗的 TgCRND8小鼠与非-Tg同窝小鼠之间无差别。因此，这两种立体异 构体均抑制认知缺陷的发展，并且实际上，鲨肌醇预防认知缺失达到 了使鲨肌醇治疗的TgCRND8小鼠与正常小鼠之间无差别这样一种程 度。这种改良的性能不是由于对行为系统、运动系统或知觉系统的非 特异性作用，因为表-肌醇和鲨肌醇治疗对非-Tg小鼠的性能没有作用 (图2G和2H)。这种改良的性能也不是由于营养或热量作用，因为 治疗组和未治疗组之间在体重、活动、和皮毛条件方面没有差异。此 外，用甘露醇(一种相似分子量的糖)治疗对行为没有作用。在任何 治疗组之间性别的影响不显著(p＝0.85)。

实施例3-大脑Aβ负担的减少和淀粉样神经病理

在小鼠4月龄时，未治疗的TgCRND8小鼠表达出大量的Aβ40 和Aβ42(表1)。在4月龄时，如实施例1所述，表-肌醇治疗组的 Aβ40含量(可溶和不可溶库减小了43±2％；p≤0.05)和Aβ42含量(可 溶库减少了69％，p＝0.005；不可溶库减少了28％，p＝0.02)均减少 了。但是，这些改进没有持久，在6月龄时大脑Aβ含量升高到与在 未治疗TgCRND8小鼠中所观测的相似含量(表1)。

相反，在4月龄时，鲨肌醇治疗组的总大脑Aβ40下降了62％ (p＝0.0002)且总大脑Aβ42下降了22％(p＝0.0096；表1)。在6 月龄时，与未治疗的TgCRND8小鼠相比，鲨肌醇治疗导致Aβ40含 量减少了32％(p＝0.04)和Aβ40含量减少了20％(p＝0.02)。

由于在肌醇治疗之后检测到的Aβ浓度下降，可能是由Aβ外溢 流入血浆发生了改变而引起的，因此在4月龄和6月龄时检测了血浆 中的Aβ-β含量(表1)。TgCRND8小鼠在4月龄时具有高的血浆Aβ 浓度并且在6月龄时保持恒定，即使是CNS斑负荷量在6月龄仍然 上升时(表1)。与未治疗TgCRND8小鼠相比，表-肌醇或鲨肌醇治 疗对血浆Aβ含量均没有任何作用(p＝0.89)。对此观测现象最俭省 的解释是肌醇选择性地改变了CNS中的Aβ纤维化，但对β-或γ-分 泌酶活性、或Aβ清除到血浆的正常机制没有影响。但是，出于两个 原因，该观测现象是有重要意义的。首先，在未治疗的AD病人中， 通常检测血浆和CSF中Aβ含量降低作为临床过程进展(Mayeux等 人，Ann.Neurol 46，412，2001)。其次，发生了强抗体反应和明显 临床反应的AN1792免疫研究病人不具有改变的血浆Aβ-β含量(Hock 等人，Neuron 38，547 2003)。因此，这些结果表明为了获得有效的 治疗结果不必要改变血浆Aβ含量。

为了证实肌醇立体异构体对APP的表达或蛋白酶解加工没有影 响，在肌醇治疗和未治疗的TgCRND8小鼠大脑中检测了APP全蛋 白、sAPP-α和各种Aβ物质的含量。与我们以前报道的数据一致 (McLaurin等人，Nat.Med.8，1263，2002)，Aβ42、Aβ40和Aβ38 是TgCRND8小鼠大脑中的主要物质(图3A)，并且无论治疗与否， 未成熟和成熟的糖酵解化APP的CNS含量(图3B)以及sAPP-α的 CNS含量均难以区分。综合起来，这些结果表明表-肌醇和鲨肌醇对 于Aβ寡聚起着直接且选择性的作用，但对APP加工不起作用。

Aβ-β肽负荷量的改变伴随着斑块负担的显著降低(表1；图2A- 2I)。表-肌醇治疗的TgCRND8小鼠与未治疗TgCRND8小鼠相比， 在4月龄而非6月龄时，平均斑块直径出现显著下降(分别为， 95±4.3μm2对比136±15μm2，p＝0.04；370±9μm2对比423±22μm2，p＝ 0.06)。这些结果表明，在适中的Aβ含量时，表-肌醇防止Aβ寡聚， 但是一旦出现较高Aβ浓度，表-肌醇则不能抑制微纤维生成。在4月 龄时，鲨肌醇治疗组的平均斑块直径由136±15μm2减少到103±4μm2 (p＝0.01)。在6月龄时，鲨肌醇治疗TgCRND8小鼠组的Aβ肽含 量降低，并伴随有斑块数量减少20％(p＝0.005)，被斑块覆盖的大 脑面积减少35％(p＝0.015)和平均斑块大小减小(339±10μm2对比 423±21μm2，p＝0.009)。通过各项测试，这些结果证实在鲨肌醇治 疗之后，斑块负担下降了。

                                 表1.肌醇治疗减少了Aβ40和Aβ42含量               Aβ40   (ng/gm湿的大脑±平均标准误差)                Aβ42   (ng/gm湿大脑±平均标准误差)   总的   Aβ   斑块计数   斑块面积     (μm2)   总的斑块面积/   总的大脑面积   (％)   可溶的 不可溶的   可溶的 不可溶的   4个月预防   对照   表-肌醇   鲨肌醇   6个月预防   对照   表-肌醇   鲨肌醇     75±6   43±7*   37±5*     187±29   188±24   105±8*   1163±9 615±32 437±80   3576±172 3668±149 2453±251*     273±18   85±7   206±8*     626±87   665±39   475±26*   5658±248 4059±179* 4409±135*   15802±237 13943±277 12588±82     7169±284   4802±176   5089±173     20191±211   18464±229   15621±151     696±25   678±64   598±19*     960±44   979±32   774±10*     100766±7564   65042±5199   63847±2895     411288±11912   380456±13498   262379±5373     0.026±0.004   0.020±0.001   0.015±0.001*     0.120±0.001   0.096±0.04   0.079±0.013                                  血浆Aβ水平                                    (pg/ml)   4个月预防   6个月预防   对照   表-肌醇   鲨肌醇   1018±27   1082±164   952±49   915±59   952±56   905±55

使用Fisher的PLSD进行方差分析p＜0.001和*p＜0.05

实施例4-神经胶质活性和炎症的减少

星形神经胶质和小神经胶质的反应是人AD和所有的淀粉样蛋白 小鼠模型都具有的神经病理特征(Irizarry等，J Neuropathol Exp Neurol.56，965，1997；K.D.Bornemann等，Ann NY Acad Sci.908， 260，2000)。因此，研究了表-肌醇和鲨肌醇对TgCRND8小鼠大脑的 星形神经胶质增生和小神经胶质增生的治疗作用(图3A-3D)。将一 系列矢状切片用星形神经胶质细胞标记物神经胶原纤维酸性蛋白 (GFAP)染色并以星形神经胶质增生所覆盖的大脑面积的百分数来 定量。TgCRND8小鼠在4月龄时具有高的基础星形神经胶质增生 (0.459±0.048％)，到6月龄时有轻微增长(0.584±0.089％)，并且不 受限于斑块面积(图2A-2C)。在6月龄时，表-肌醇将星形神经胶质 的增生反应降低至0.388±0.039％(p＝0.04；图2D-F)另一方面，鲨 肌醇更有效地将星形神经胶质的增生反应降低至0.269±0.028％ (p＝0.006；图2G-I)。当与年龄和性别相配的未治疗TgCRND8小鼠 (0.31±0.01％；p＜0.001)相比时，鲨肌醇治疗的TgCRND8小鼠还 显著地减弱了小神经胶质的活化(0.20±0.008％大脑面积)。但是，已 证实在6月龄时表-肌醇治疗的小鼠的小神经胶质活化没有明显的减少 (0.248±0.02％；p＝NS)。这些数据结合起来表明，鲨肌醇治疗减少 了CNS中Aβ-诱导的炎症反应。

实施例5-血管淀粉样蛋白负荷量

阿尔茨海默氏病的特征在于存在薄壁组织和血管淀粉样蛋白沉 积。在6月龄的TgCRND8小鼠中，大约有0.03％大脑面积与血管淀 粉样蛋白有关联。在6月龄的表-肌醇治疗组中，观测不到血管淀粉样 蛋白负担的差异(图3C)。相反，鲨肌醇治疗组的血管淀粉样蛋白负 担显著地降低了(p＝0.05)(图3C)，并且淀粉样蛋白沉积主要局限于 较小的血管，直径小于25m2(56±2％比70±8％，在未治疗的TgCRND8 小鼠的小血管中)。与未治疗的小鼠相比，在鲨肌醇治疗的小鼠中的 脑血管斑块的平均尺寸明显减小(154±16比363±34，p＝0.008；图3D)。

实施例6-存活率改善

TgCRND8小鼠在第175天的存活率为50％，经鲨肌醇治疗后提 高到72％(每组n＝35，鲨肌醇比对照组p＜0.02，图10B)。使用肌- 肌醇治疗没有显著地影响总的存活率(图10A)。对照试验证实了鲨 肌醇治疗的小鼠的存活率的增长并非是热量摄入量增加的间接作用。 因而，用鲨肌醇对野生型小鼠进行治疗，其对存活率或其它参数如体 重、皮毛状况或笼子内行为没有作用。此外，在肌醇治疗的TgCRND8 小鼠的体重、皮毛状况或笼子内行为与未治疗的TgCRND8小鼠之间 没有差异。用甘露糖(一种相似分子量的单糖)进行相似的试验，其 对TgCRND8小鼠的存活率也没有作用。

实施例7-淀粉样蛋白沉积的治疗和逆转

综上所述，预防研究证实了，鲨肌醇可抑制薄壁组织和血管两者 的淀粉样蛋白沉积，从而改善了阿尔茨海默氏病的TgCRND8小鼠模 型的存活率和认知功能。但是，大多数阿尔茨海默氏病人很可能仅仅 在出现症状时和Aβ寡聚、沉积、毒性和斑块形成已经在CNS中达到 很高水平时才寻求治疗。因此用5月龄的TgCRND8小鼠开始进行前 导性试验。与患AD的人大脑相比，这些小鼠具有明显的Aβ和斑块 存积。

治疗研究方法

小鼠-以30mg/鼠/天的量给试验组TgCRND8小鼠喂食肌-肌醇、 表-肌醇和鲨肌醇。一组在5月龄时开始进入研究并在6月龄时分析结 果。监测体重、皮毛特征和笼子内行为。所有的试验根据加拿大委员 会的动物照料指南进行。

存活率调查-通过Kaplan-Meier技术评估存活机率，每当出现 死亡时计算分析存活机率，从而使其适合小样本量。每个治疗组使用 35只小鼠用于存活率分析。使用Tarone-Ware检验记载各治疗组之 间的比较。

行为测试-逆转研究-不经过预训练，让小鼠进入带有隐藏的平 台的莫里斯水迷宫试验。小鼠每天接受6次训练达3天。在第四天， 从池中取走平台，并且每只小鼠接受一次30秒游泳探测试验。在最 后一天，对动物进行一次提示试验，以评价游泳能力、视野和普通认 知力。在提示试验中，将平台放置在与测试所用的不同的信号区域并 且标记了旗帜。让动物用60秒找到平台。没找到平台的动物不用于 空间记忆的最终分析。使用药物或基因型和训练期作为重复测定因素 的因素方差分析(ANOVA)的混合模型来分析行为数据。

大脑淀粉样蛋白负担-取出大脑并且将一个脑半球固定于4％多 聚甲醛中并沿着中央矢状面(mid saggital plane)埋入石蜡。为了产 生一组系统性的均匀的随机切片，横切整个半球以收集5μm连续切 片。将间隔50mm的切片组用于分析(10-14片/组)。用甲酸进行抗 原检索之后鉴定出斑块，并将其用原发抗Aβ抗体(Dako M-0872)、 然后用次级抗原(Dako StreptABCcomplex/horseradish kit)孵育。 终产物经苏木精进行DAB对染而可以观测到。使用与莱卡显微镜和 日立KIP-MU CCD摄像机连接的Leco IA-3001图像分析软件评价淀 粉样蛋白斑的负担量。

血浆和大脑Aβ含量-在蔗糖缓冲液中将脑半球样品匀浆，然后 要么加入0.4％二乙胺/100mM NaCl用于溶解Aβ含量，要么加入冷 甲酸用于分离总Aβ。在中和之后，稀释样品并使用商购的试剂盒 (BIOSOURCE International)分析Aβ40和Aβ42。每个半球分析三 次，记载平均值±平均标准误差。

结果和显著性-参加逆转研究的所有动物均存活并且没有显示出 忧虑或中毒的外在迹象。使用莫里斯水迷宫的空间参考记忆模型，使 用3天试验范例评估TgCRND8小鼠的认知功能(图4-8)。以治疗(用 肌-肌醇、表-肌醇或鲨肌醇，未治疗)和基因型(TgCRND8与非-Tg) 作为“受试者间”因子，使用方差分析(ANOVA)的混合模型来分析 由治疗的和未治疗的TgCRND8小鼠获得的数据以及由治疗的和未治 疗的非-Tg同窝小鼠获得的数据(所有的组合n＝10)。与野生型同窝 小鼠相比，TgCRND8小鼠的能力明显减弱(图4)。相反，在所有这 些天中，在鲨肌醇治疗的TgCRND8小鼠与非-Tg同窝小鼠之间无差 别(p＝0.38；图5)。与治疗的非-Tg同窝小鼠相比，表-肌醇治疗的 TgCRND8小鼠几乎明显不同(p＝0.07；图6)。类似地，肌-肌醇治疗 的TgCRND8小鼠与治疗的非-Tg同窝小鼠也明显不同(p＝0.05；图 7)。当比较治疗组之间的里斯水迷宫试验学习期时，所有的小鼠行为 相似(图8)。相反，鲨肌醇组与非-Tg同胞小鼠之间无差别(图8)。 因此，实际上，鲨肌醇逆转认知缺失达到了使鲨肌醇治疗的TgCRND8 小鼠与正常小鼠之间无差别这样一种程度。这种改良的性能不是由于 对行为系统、运动系统或知觉系统的非特异性作用，因为表-肌醇和鲨 肌醇治疗对非-Tg小鼠的性能没有作用。这种改良的性能也不是由于 营养或热量作用，因为在治疗和未治疗组之间的体重、活动、和皮毛 条件方面没有差异。

为了确定改善的认知是否与斑块存积量和Aβ负荷减少有关，对 大脑组织进行了尸体解剖。认知的变化伴随了斑块存积量和Aβ负荷 的相应改变(图9和表2)。肌-肌醇治疗对斑块存积量或Aβ负荷没 有影响(图9和表2)。表-肌醇治疗的TgCRND8小鼠与未治疗的 TgCRND8小鼠相比，平均斑块直径没有显著的减小(图9)，但是Aβ 负荷明显减少(表2)。这些结果表明，在适中Aβ含量时，表-肌醇 防止Aβ寡聚，但是一旦出现较高的Aβ浓度，表-肌醇则不能完全抑 制微纤维生成。鲨肌醇治疗组的斑块存积量和Aβ负荷明显减小。通 过各项测试，这些结果证实在鲨肌醇治疗之后，斑块存积量下降了。 这些结果在作用大小方面比得上6个月的预防性研究作用，并进一步 支持了鲨肌醇的潜力。

由于在肌醇治疗之后检测到的Aβ浓度下降，可能归因于Aβ外 溢流入血浆发生了改变，因此我们检测了血浆中的Aβ含量(表2)。 TgCRND8小鼠在6月龄时具有高的血浆Aβ浓度。与未治疗的 TgCRND8小鼠相比，肌-肌醇、表-肌醇或鲨肌醇治疗对血浆Aβ含量 均没有任何作用(p＝0.89)。对此观测现象最俭省的解释是肌醇选择 性地改变了CNS中的Aβ纤维化，但对β-或γ-分泌酶活性、或Aβ被 清除进入血浆的正常机制没有作用。但是，出于两个原因，该观测现 象是有重要意义的。首先，在未治疗的AD病人中，通常检测血浆和 CSF中Aβ含量降低作为临床过程的进展。其次，在发生强抗体反应 和明显临床反应的AN1792免疫研究病人中不具有改变的血浆Aβ含 量。因此，这些结果进一步表明为了获得有效的治疗结果不必要改变 血浆Aβ含量。

综上所述，这些数据揭示了在阿尔茨海默氏病的转基因小鼠模型 中，在“症状发生前的晚期”阶段、小鼠出现明显的认知缺失和淀粉样 神经病理之前，选择的鲨肌醇可以消除大脑内的Aβ积聚、大脑淀粉 样蛋白斑沉积和认知衰退。此外，即使在出现认知缺失和淀粉样蛋白 斑神经病理之后给予鲨肌醇，这些化合物也能有效地逆转淀粉样蛋白 沉积、神经病理和认知缺失。因此，这些结果表明鲨肌醇在预防疾病 和治疗已诊断患有AD的病人存在的疾病中是有效的。

                                          表2.肌醇处理减小了Aβ40和Aβ42的水平               Aβ40        (ng/gm湿的大脑±平均标准误差)                Aβ42      (ng/gm湿的大脑±平均标准误差)   总的   Aβ   斑块计数   斑块面积   (μm2)   总的斑块面积/   总的大脑面积   (％)   可溶的   不可溶的   可溶的   不可溶的   4个月预防   对照   肌-肌醇   表-肌醇   鲨肌醇   6个月预防   对照   肌-肌醇   表-肌醇   鲨肌醇   1个月治疗   对照   肌-肌醇   表-肌醇   鲨肌醇     75±6   42±6   43±7*   37±5*     187±29   221±19   188±24   105±8*     207±16   194±12   264±11   178±11     1163±9   485±143   615±32   437±80     3576±172   3436±189   3668±149   2453±251*     4965±457   4187±226   3637±113   3527±241     273±18   174±9   85±7   206±8*     626±87   543±71   665±39   475±26*     426±14   487±25   540±14   374±23     5658±248   4268±308   4059±179*   4409±135*     15802±237   13289±535   13943±277   12588±82     14503±1071   15622±675   12830±330   11115±647     7169±284   4969±434   4802±176   5089±173     20191±211   17489±354   18464±229   15621±151     20101±854   20490±526   17271±415   15194±579     696±25   649±50   678±64   598±19*     960±44   927±78   979±32   774±10*     1441±29   1324±69   1342±114   1260±27*     100766±7564   91902±7453   65042±5199   63847±2895     411288±11912   400013±19638   380456±13498   262379±5373     486002±16156   469968±35664   459706±49966   420027±14986*     0.026±0.004   0.023±0.004   0.020±0.001   0.015±0.001*     0.120±0.001   0.100±0.005   0.096±0.04   0.079±0.013     0.159±0.014   0.153±0.088   0.134±0.017   0.119±0.010*                                    血浆Aβ水平(pg/ml)   4个月预防   6个月预防   1个月治疗   对照   肌-肌醇   表-肌醇   鲨肌醇   1018±27   942±30   1082±164   952±49   915±59   969±67   952±56   905±55   2287±151   2110±174   2158±157   1980±146

使用Fisher的PLSD进行方差分析p＜0.001和*p＜0.05；IP＝在进展中。

实施例8-鲨肌醇的两个月治疗研究

为了确定鲨肌醇治疗疾病的更长效范围，向5个月龄的TgCRND8 小鼠喂食鲨肌醇或不进行治疗达2个月(每组n＝10)。用三天的莫里 斯水迷宫试验将7个月大的经鲨肌醇治疗的TgCRND8小鼠与未治疗 的TgCRND8小鼠与治疗的非-Tg同窝小鼠进行比较。使用药物和基 因型作为受试者间变量和训练期作为受试者内变量的因素方差分析 (ANOVA)的混合模型来分析行为数据。由鲨肌醇治疗1个月(图 12A)看出，在经鲨肌醇治疗2个月的TgCRND8小鼠与鲨肌醇治疗 的非-Tg同窝小鼠之间没有差别(图12B)。为了将改善的认知力与病 理学联系起来，分析了大脑中的Aβ40和Aβ42含量(表3)。在鲨肌 醇治疗后，不可溶的Aβ40和Aβ42含量均下降了20％。这些结果证 实鲨肌醇在疾病发展期间作用持续。

                        表3肌醇治疗降低了Aβ40和Aβ42的含量   大脑Aβ40   (ng/gm湿的大脑±   平均标准误差)   大脑Aβ42   (ng/gm湿的大脑±平   均标准误差)   血浆Aβ含量   (pg/ml)   可溶的   不可溶的   可溶的   不可溶的   Aβ40   Aβ42   2个月治疗   对照   鲨肌醇   487±14   395±60   6924±287   5703±612*   764±51   688±28   25827±1238   20818±1404*   5212±219   4507±207   3455±331   3035±236

使用Fisher的PLSD进行方差分析，*p＜0.05.

实施例9-剂量对患有疾病的TgCRND8小鼠病理结果的作用

以10mg/Kg、30mg/Kg和100mg/Kg的剂量将鲨肌醇溶于水中喂 食5个月大的TgCRND8小鼠每天一次或者不进行治疗。治疗一个月 后处死动物并分析病理结果。对所有组的大脑中Aβ含量的分析证实 了与未治疗的TgCRND8小鼠相比，所有的药物剂量均相同程度地 效降低了可溶的Aβ42含量(下降20％，F3，15＝3.1，p＝0.07；图13A)。 单个剂量分析证明了10mg/Kg和30mg/Kg剂量组显著地区别于未治 疗对照组(分别是p＝0.03和p＝0.02)。所选取的剂量彼此之间没有显 著性差异(F2，11＝0.6，p＝0.57；图13A)。喂食剂量对于不可溶的Aβ42 (F3，15＝0.69，p＝0.58；图13B)或者可溶的和不可溶的Aβ40(分别 是F3，15＝0.04，p＝0.99和F3，15＝0.36，p＝0.79；图14A和14B)没有 显著影响。

为了评估异-肌醇是否也可以有效地预防进一步发展和/或部分逆 转已形成的AD-样表型，延迟到5月龄时才开始治疗TgCRND8小鼠。 对TgCRND8小鼠组和非-转基因同窝小鼠组要么用异-肌醇治疗28 天，要么不进行治疗。在这些试验中，化合物的剂量和口服给药、以 及行为和神经化学评估采用与上述治疗试验相同的方式进行。

6个月龄的异-肌醇治疗的TgCRND8小鼠组比未治疗的TgCRND8 小鼠明显地表现得好(F1，13＝0.45，p＝0.05；数据未给出)。6个月龄 的异-肌醇治疗的TgCRND8小鼠的认知性能也明显地不同于非-转基 因同窝小鼠。肌醇治疗的这种有益效果不是由于对行为系统、运动系 统或知觉系统的非特异性作用，因为肌醇治疗对非-Tg小鼠的认知性 能没有作用(F1，12＝0.98；p＝0.49)。将治疗与未治疗的TgCRND8小 鼠的大脑Aβ含量进行了分析，以确定改善的行为是否与Aβ改变有 关联(表4)。异-肌醇治疗减少了可溶的Aβ42(下降20％，p＜0.05)， 该作用与鲨肌醇所观测到的相似。异-肌醇没有明显地改变不可溶的 Aβ42或Aβ40(可溶和不可溶库)。Aβ42减少的一种可能的解释是 外周Aβ42的清除，随后导致血浆Aβ42的增加。异-肌醇治疗后血浆 中Aβ42含量与未治疗的TgCRND8血浆中含量没有差别(表5)。与 其它肌醇立体异构体一致，这些结果证明了血浆Aβ含量不受异-肌醇 治疗的影响。

                           表4.异-肌醇治疗降低了Aβ42含量   大脑Aβ40   (ng/gm湿的大脑±平   均标准误差)   大脑Aβ42   (ng/gm湿的大脑±平均   标准误差)   血浆Aβ含量   (pg/ml)   可溶的   不可溶的   可溶的   不可溶的  1个月治疗  对照  异-肌醇   252±48   281±21   4105±851   3787±342   666±39   547±47*   16448±2120   16336±910   2359±147   2458±95

使用Fisher′s PLSD进行方差分析，*p＜0.05.

                       表5血液生物化学-鲨肌醇剂量研究   未治疗的   n＝4   100mg/Kg   n＝4   30mg/Kg   n＝3   10mg/Kg   n＝5   参考水平   (Vita-Tech &   CCAC)   生物化学   总蛋白质   白蛋白   球蛋白   胆红素   ALP   ALT   葡萄糖   尿素   肌酐   溶血   黄疸   脂血   46±2g/L   35±0g/L   12±1g/L   2.4±1umol/L   81±10U/L   42±4U/L   11±2mmol/L   9±3mmol/L   36±5umol/L   正常   正常   正常   49±2   31±1   19±2   1.9±0   76±11   38±4   11±2   7.4±1   31±4   正常   正常   正常   50±2.6   33±2   17±1   2.0±1   81±10   42±4   12±2   9±3   35±5   正常   正常   正常   50±3   33±4   17±2   1.9±0.6   73±22   51±20   7±2   10±2   40±5   正常   正常   正常   35-72   25-48   18-82   2-15   28-94   28-184   9.7-18.6   12.1-20.6   26-88

实施例11-肌醇治疗不影响血液化学

为了排除肌醇治疗对血液化学和器官功能的任何有害作用，在鲨 肌醇和异-肌醇治疗1个月之后对血液进行了分析(表5和6)。治疗 组之间或与未治疗的TgCRND8小鼠之间，总蛋白质、白蛋白、球蛋 白、胆红素、碱性磷酸酯酶、葡萄糖、尿素和肌酐均没有明显差异。 所有的含量均落在了由非-转基因野生型小鼠测定的正常范围内。除了 溶血外，还有黄疸和脂血也都正常。这些结果提示异-肌醇和鲨肌醇对 血液化学和器官功能没有显示出有害的作用。

              表6血液生物化学-1个月的治疗研究   未治疗的   n＝4   异-肌醇   n＝4   参考水平   (Vita-Tech &   CCAC)   生物化学   总蛋白质   白蛋白   球蛋白   胆红素   ALP   ALT   葡萄糖   尿素   肌酐   溶血   黄疸   脂血   46±2g/L   35±0g/L   12±1g/L   2.4±1umol/L   81±10U/L   42±4U/L   11±2mmol/L   9±3mmol/L   36±5umol/L   正常   正常   正常   48±2   32±2   17±3   2.9±3   95±16   44±4   10±3   18.6±13   69±64   正常   正常   正常     35-72   25-48   18-82   2-15   28-94   28-184   9.7-18.6   12.1-20.6   26-88

实施例12-在鲨肌醇对阿尔茨海默氏病的双转基因小鼠模型 PS1×APP中的预防AD-样病理学的作用

Tg PS1×APP小鼠是阿尔茨海默氏病的强化模型，其表达编码两 个家族型突变(M146L和L286V)的突变人PS1转基因和编码印地 安纳和瑞典家族性突变的人APP转基因。经过30-45天龄，这些动物 发展了强有力的大脑Aβ水平的表达和淀粉样蛋白沉积。在预防性试 验中，从断奶开始用鲨肌醇治疗TgPS1×APP小鼠，并在2月龄时评 价神经病理学作用(图16和17)。与未治疗的TgPS1×APP小鼠相比， 鲨肌醇治疗的TgPS1×APP小鼠在2月龄时在斑块负担的所有测试中 显示出显著的减少(斑块覆盖的大脑面积％＝0.157±0.007比 ＝.065±0.016，p＜0.001；平均斑块大小＝177±8μm2比149±5μm2，p＜0.05； 斑块计数3054±324比1514±510，p＜0.01；图17)。这些结果表明在 两个强有力的阿尔茨海默氏病模型中，鲨肌醇防止了淀粉样蛋白沉 积。

实施例13-增加的热量摄入对TgCRND8小鼠的影响

为了排除增加的热量摄入或非特异性作用的贡献，用相似分子量 的单糖-甘露醇治疗TgCRND8小鼠。在6月龄时，甘露醇治疗的 TgCRND8小鼠与未治疗的TgCRND8小鼠没有差别(图11A)，并且 与甘露醇治疗的非-Tg同窝小鼠之间有明显的不同(图11B)。甘露醇 对非-Tg小鼠的行为没有作用，是因为甘露醇治疗的非-Tg同窝小鼠 与未治疗的非-Tg小鼠没有差别。这些与病理研究有关的结果表明甘 露醇没有改变TgCRND8小鼠的斑块负荷(图11C)。同时对存活率 的检测证明了甘露醇对TgCRND8小鼠的存活率没有作用(图11D)。

虽然已用其具体的实施方式对本发明进行了描述，但是对于本领 域技术人员来说，众多其它改变和改进以及其它用途是显而易见的。 因此，本发明不局限于本文具体公开的内容，仅受限于所附权利要求 书。