通过DNA芯片检测基因的技术已被公开(Beattie et al.，Clin. Chem.39：719-22，Fodor et al.，Science，251，761(1991)，Khrapko et al.， FEBS Lett.，256，118(1989)，和Southern et al.，Nucleic Acids Res.， 22，1368，(1994))。DNA芯片是一种数个平方厘米的玻璃或硅基底， 其上固定有多种序列上不同的多重DNA探针。固定于这类芯片上的 DNA探针与用标记物(诸如荧光染料或放射性同位素(RI))标记了 的测试核酸反应，或与一种含有未标记的测试核酸和标记的寡核苷酸 之混合物反应。当与固定于芯片上的DNA探针互补的序列存在于样品 中时，则可获得来自结合于芯片之特定位点上的标记物的信号。因此， 如果事先已知固定化DNA探针的序列和位置，则测试核酸中存在的碱 基可以鉴别(Pease et al.，PNAS，USA，91，5022(1994)，Parinov et al.， Nucleic Acid Res.，24，2998(1996))。
通过从患者中获得样品(诸如血)，且从样品中提取核酸，则可 获得该患者固有的核酸。如果将该患者固有的核酸进一步经过基因分 析，可得关于该患者体质易感性的信息，诸如该患者对疾病的易感性， 药剂的功效，和/或副作用的产生。结果，可获得患者特异性的信息。 这类根据个体患者设计的治疗被称为“个性化的医疗护理(因人而异 的医疗护理)”。
长久以来一直期望开发基于获自患者的标本，从而提出更准确和 方便的适于疾病的医疗方案的方法。
所有文献及专利出版物在此全文引入作为参考。
发明公开
一种用于获得如下信息的方法：关于患有特定疾病的个体的核酸 之第一种信息，和关于存在于所述个体中的致病性微生物之核酸的第 二种信息，其中致病性微生物与特定疾病相关，包括：
(a)将该个体的核酸提取物与固定了探针的基底反应，其中所述基 底包含第一种探针和第二种探针，其中第一种探针用于检测来自致病 性微生物的特异性核酸序列的存在，其中致病性微生物与所述特定疾 病相关，第二种探针用于检测个体之特异性核酸序列的存在；以及
(b)由(a)所述反应通过检测与第一种探针结合的核酸存在与否 获得第一种信息，且通过检测与第二种探针结合的核酸存在与否以获 得第二种信息。
附图说明
图1.是根据一个实施方案的DNA芯片的示意图；
图2.是根据一个实施方案的PNA芯片的示意图；
图3.是显示根据一个实施方案的方法之流程图。
实施本发明的最佳方案
本发明涉及从患有疾病的个体获得核酸信息的方法。该个体可为 疾病的早期或晚期。个体可为已经患有或将要患有某种疾病的受试者。
本发明涉及获自个体与疾病之核酸信息的相关联。在此处公开的 实施方案中，个体患有与致病性微生物相关的疾病，如病毒、细菌、 酵母或支原体。且本发明涉及获自个体中存在的致病性微生物的核酸 与个体核酸的信息的相关联。
因此，一方面，本发明提供了获得与个体特定疾病相关的核酸信 息的方法，尤其是与治疗个体疾病的应答相关的核酸信息的方法，以 及获得与来自存在于个体中的致病性微生物产生的特定疾病相关的核 酸信息的方法。本发明还涉及用于鉴定来自个体和来自致病性微生物 核酸的特定核酸探针。在一些实施方案中，核酸探针被固定在基底(如 芯片)上。本发明还涉及用于此方法中的固定了探针的基底，如固定 了探针的芯片。其它基底，如DNA毛细管电泳装置，一些种类的珠， 膜基检测、微滴定板、电极、一些种类的基于半导体的装置、一些种 类的波导材料、表面胞质共振(SPR)、石英晶体微平衡(QCM)和 质谱也可用于本发明。此外，等位基因特异性寡核苷酸杂交、限制性 方法(微滴定诊断凝胶电泳)、连接方法(挂锁(padlock)探针、寡核 苷酸连接检测、染料标记的寡核苷酸连接)、核苷酸掺入(微测序、 模板介导的染料末端检测)和介入分析也可用于本发明，其它在溶液 中的普通杂交技术也可用于本发明，诸如扩增方法(聚合酶链反应 (PCR)，连接酶链反应(LCR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)， 链置换扩增(SDA)，环介导的等温扩增(LAMP)，等温及嵌合引 物引发的核酸扩增(ICAN)，分支DNA)等均可用于检测个体和致 病性微生物。
从个体获取的含有核酸的样品包括全血、血液、血清、白细胞、 尿、排泄物、精液、唾液、活检样品、培养的细胞和痰。优选的样品 是血。样品优选地含有来自该个体的与治疗疾病的应答相关的核酸， 以及存在于该个体中的致病性微生物的核酸，其中所述致病性微生物 与疾病相关。如需要，样品可经过诸如匀浆和提取的预处理。预处理 可由本领域技术人员根据样品的类型适当地选定。
在一个示例性实施方案中，首先从人中获得全血样，然后利用市 售的人类基因组提取试剂盒(例如，QIAamp DNA Blood Midi试剂盒 (商品名，由QIAGEN制造，东京，日本))，从该全血样中获得来 自人类基因组的核酸，以及来自存在于人中的病毒基因组的核酸。在 一些实施方案中，将可能含有靶序列的核酸扩增。然后，将如此获得 的扩增产物通过与固定了探针的芯片杂交，随后检测结合到芯片的核 酸来分析。通过这种方法，获得了关于来自个体的与特定疾病相关之 核酸的信息，以及与特定疾病相关的，来自存在于该个体的致病性微 生物之核酸的信息。
在上述方法中，作为个体的例子，可使用人类。但是，个体不限 于人类。根据本发明的一个方面，“个体”可为任何一种脊椎动物， 包括哺乳动物如灵长类，包括人，狗，猫，牛，山羊，猪，绵羊和猴。 其中，人为最适合的个体。根据本发明的一个方面，个体可为健康的 或患有某种疾病。但是，一般地，如果用于患有由致病性微生物和该 个体中某种核酸序列的类型所引起的疾病，本发明的方法可更有效地 使用。此处所用的术语“特定疾病”包括与一种致病性微生物(例如 病毒、细菌、酵母或支原体)相关的疾病以及肿瘤疾病，更优选地， 是指与致病性微生物相关的疾病，更优选这样的疾病，其发生和治疗 效果随存在于患有该疾病的个体中的核酸类型，和/或具有该核酸的基 因表达与否之不同而不同。但是，并不特别限定所述疾病。
术语“靶核酸”如此处所用是指含有待检测和/或分析的序列的核 酸。
根据本发明的一个方面，至于来自待提取的个体的核酸，可使用 任何核酸，只要其来自一种个体。更具体地，核酸可为DNA、RNA 和基因组DNA中的任一种。至于来自待提取的致病性微生物之核酸， 可使用任何核酸，只要它来自靶致病性微生物，且更具体的，DNA或 RNA。
一种用于从样品提取核酸成分的方法不限于前述方法。可使用利 用酚-氯仿的液-液提取法、利用一种载体的固-液提取法，等。或 者，可使用(但不限于)市售的用于核酸提取的试剂盒，称为QIAamp (QIAGEN制造)，基因组DNA纯化试剂盒(Promega制造)，或SMAI 测试(Sumitomo Metal Co.，Ltd制造)。如此提取的核酸可经过或不 经过诸如PCR的扩增。
在当提取的核酸成分为RNA时，RNA可直接用作测试核酸。或 者，利用反转录酶从RNA制备的cDNA可用作测试核酸。在这种情况 中，来自个体的核酸以及来自致病性微生物的核酸可以混合物形式使 用，无需分离。更具体的，这些核酸可利用QIAamp DNA Blood Midi 试剂盒按照前述方法提取，用反转录酶处理，然后经过PCR扩增。
根据本发明的一个方面，扩增可利用任一已知的扩增方法进行， 只要其普遍用于扩增核酸。扩增优选通过聚合酶链反应(以下称为 PCR)的方法进行。如果样品含有足够量的核酸，则扩增步骤可省略。
根据本发明的一个方面，一种固定了探针的基底(如固定了探针 的芯片)包含具有不同碱基序列的且固定于基底上的第一种探针和第 二种探针。第一种探针用于检测来自与特定疾病相关的致病性微生物 之特异性核酸序列的存在。第二种探针用于检测来自个体的特异性核 酸的存在。
这种固定了探针的基底特别有利，因为来自两种不同来源(诸如 个体和致病性微生物)的核酸可利用相同基底同时分析。这种固定了 探针的芯片由本发明人首次公开。根据本发明，这种固定了探针的基 底作为本发明的一个方面来提供。
在本发明的固定了探针的芯片上，第一种探针用于检测来自样品 (如来自人类患者的全血样本)中所含致病性微生物之核酸序列的存 在与否。至于探针，该探针具有相应于来自致病性微生物之染色体 DNA或基因(RNA)的碱基序列，所述致病性微生物可感染靶生物(如， 人类患者)。此外，可使用相应于cDNA，cRNA，各个染色体DNA， RNA，cDNA和cRNA的片段，或每一片段的互补序列作为第一种探 针。
此外，包含于样品中的致病性微生物的量可利用第一种探针测定， 即，一种具有相应于来自于致病性微生物的核酸序列、核酸序列的片 段，或核酸或其片段之互补序列之碱基序列的探针。
预期，第一种探针不仅用于检测包含于样品中的致病性微生物的 存在，而且用于检测致病性微生物的基因突变的存在。
由样品中致病性微生物表达的核酸(RNA)可用第一种探针测量， 即，一种具有相应于来自致病性微生物的核酸序列、核酸序列的片段、 或核酸或其片段之互补序列之碱基序列的探针。在这种情况中，探针 可定性或定量检测RNA，cDNA，或cRNA。
在一个其中致病性微生物为病毒的实施方案中，由于病毒在生长 期表达大量特定基因，如果可测定表达模式(数量，质量)，则可评 估药剂的功效。
根据本发明的一个方面，用在固定了探针的芯片中的第二种探针 是相应于来自个体且关于疾病的染色体DNA或基因(RNA)。此外， 可使用相应于cDNA，cRNA，各个染色体DNA，RNA，cDNA和cRNA 的片段，或每一片段的互补序列作为第二种探针。与“疾病相关的” 个体核酸定义为一种存在于个体细胞之染色体中的核酸序列，且其预 示对治疗的应答。更具体地，核酸序列预示个体对疾病的易感性，药 剂的功效和/或副作用的发生。
由于存在第二种探针，就可能检测特定核酸序列的存在，特定基 因的表达量，以及在个体中基因的表达模式。
期望的是，根据本发明的第一种探针和第二种探针具有至少11个 碱基，优选至少12个碱基，更优选至少13，14，15，16，17，18， 19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29甚至30个碱基的序 列。如果待固定于基底上的碱基序列的长度过长，则难以区分单碱基 的变化。相反，如果待固定于基底上的碱基序列的长度过短，则难以 确定样品中含有的碱基序列。
至于第一种或第二种探针，可使用寡核苷酸，如核糖核酸(RNA)， 脱氧核糖核酸(DNA)，肽核酸(PNA)，甲基磷酸酯核酸，或S-oligo； 或多核苷酸，如cDNA和cRNA。
根据本发明的一个方面，通过将包含前述碱基序列的第一种探针 和第二种探针固定于基底上制备固定了探针的基底，所述基底由基板、 多孔材料(Beattie，et al.，Clin.Chem.，41，700(1995))、微滴定板 (Kawai et al.，Anal.Biochem.，209，63(1993))、珠(Mirkin et al.， Nature，382，607(1996))、球形材料、颗粒材料、磁性材料或磁性珠 (Miller et al.，J.Magnet.Magn Mater 225，138(2001))，DNA毛细血管 电泳芯片(Chou，et al.，PNAS，96，11(1999)，膜基分析(Lemieux et al.， Molecular Breading，4，277(1998))，一些基于半导体的装置(Thewes，et al.，2002 IEEE Internation Solid-State Circuits Conference，350 (2002))，一些波导材料(Piunno，et al.，Anal.Chem.Acta.，288，205 (1994))，SPR(Nelson et al，Anal.Chem.，731，(2001))，QCM(Ito et al.， Anal.Chim.Acta，327，29(1996))，和质谱(Amexis et al，PNAS，98， 12097(2001)形成。用于固定核酸的基底的质量、大小和形状不特别限 定。具有任何质量、大小和形状的材料均可用作基底，只要它可固定 核酸。通过固定了探针的基底的方法检测样品中的核酸序列，例如通 过从获自个体之样品中提取核酸成分，以获得测试核酸，将测试核酸 与固定了探针的基底(如固定了探针的芯片)接触，并检测固定了探针 的基底上的探针与测试核酸之间的杂交反应。
为检测固定了探针的芯片上的探针与样品中的核酸成分之间的杂 交反应，本发明构思了(1)一种利用标记物的方法，和(2)一种利 用电化学手段的方法。
(1)在利用标记物的方法中，测试核酸事先用一种荧光染料(如 FITC，Cy3，Cy5或罗丹明)；一种酶(如生物素、半抗原、氧化酶或 磷酸酶)；或电化学反应性物质(如二茂铁或醌类)标记。或者，另 一种用这类标记物标记的探针用于检测杂交反应。可同时使用多种标 记物。
(2)在使用电化学手段的方法中，固定了探针的芯片用作电极， 方法是利用导电性材料用于形成用来固定探针的固定了探针之芯片的 基底。在这种情况中，除了前述电极，还使用相对电极和参比电极来 检测杂交反应，方式如常规电化学检测方法。至于参比电极，可使用 普通参比电极，诸如由银和氯化银形成的电极或由汞和氯化汞形成的 电极。固定了探针的芯片可如下形成：将具有不同碱基序列的探针固 定在不同导电基底上，并在相同基板(base plate)上排列这些导电 基底。如果使用这种固定了探针的芯片，检测可准确进行。在这种情 况中，可检测哪一个电化学信号是来自哪一个电极。
在一些实施方案中，由样品提取的核酸成分与固定了探针的芯片 上所固定的探针之间的杂交反应可如下进行。杂交反应在具有范围 0.01-5的离子强度和pH范围5-10的缓冲液中进行。杂交反应溶液可 含有添加剂(如硫酸葡聚糖)作为杂交加速剂、鲑精DNA、牛胸腺 DNA、EDTA和表面活性剂。将从样品中提取的核酸成分加入缓冲溶 液，于90℃或更高温度下加热变性。可在变性后立即将固定了探针的 芯片插入，或在迅速冷却到0℃后插入。或者，杂交反应可通过将杂 交反应溶液滴加到基底上进行。反应可伴随搅拌或在振荡反应溶液的 条件下进行以增加反应速度。反应可在范围从10-90℃的温度下进行 约1分钟或过夜。杂交反应结束后，取出电极，用具有范围0.01-5的 离子强度和pH范围从5-10的缓冲液洗涤。
(1)在使用标记物的方法中，杂交反应的存在通过检测标记的碱 基序列或包含在样品中的第二种探针的标记物来检测，方法是利用根 据标记物的类型适当选择的检测装置。更具体地，在使用荧光标记的 情况中，可使用荧光检测仪。
(2)在使用电化学手段的方法中，检测如下进行。在基底洗涤后， 将一种双链识别物质加到电极的表面，所述双链识别物质能选择性结 合一种双链部分。此处所用的双链识别物质不特别限定，可包括例如， 双链嵌入剂，如hoechst 33258，吖啶橙，奎吖因，道诺霉素，金属嵌 入剂，和二吖啶(bisacridine)；三嵌入剂(trisintercalator)；以及多 嵌入剂(polyintercalator)。此外，这类嵌入剂可事先用一种电化学 活泼的金属复合物(如二茂铁或viologen)修饰。这类DNA结合物质 的浓度随嵌入剂的类型之不同而不同，但是，一般在1ng/mL-1 mg/mL范围内。在这种情况中，使用具有范围0.01-5的离子强度和 pH范围5-10的缓冲液。在电极与双链识别物质反应后，洗涤，并经 过电化学测量。
电化学测量这样进行：施加至少一种能使双链识别物质电化学反 应的电势，随后测量由双链识别物质产生的电流。电势可通过以恒定 速率交换或以脉冲方式施加。或者，可施加恒定电势。在利用装置如 稳压器，或数字万用表或振荡器控制电流和电压的同时测量反应电流。 靶核酸的浓度可用标准曲线从基于如此获得的电流计算得出。
利用电极的碱基序列检测装置包括核酸提取部分、核酸反应部分、 双链识别物质反应部分、电化学测量部分和洗涤部分。
电化学方法中另一种用于测量杂交反应的DNA芯片在下面的文 件中公开。Hashimoto et al.报道了用DNA探针和电化学活性染料修 饰的金电极进行序列特异性基因检测。来自染料的阴极电流与靶DNA 浓度相关。Wang et al.报道了不含指示剂的电化学DNA杂交生物传感 器。传感器形式(format)包括将肌苷替换的(无鸟苷)探针固定于碳膏 电极，以及通过靶的鸟苷氧化峰出现对双链形成的直接计时电位滴定 检测。这些文件在此引入作为参考。
在电化学测量中，不必需用标记物标记样品。由于检测可通过测 量电信号进行，不需要用于检测荧光的复杂系统。因此，电化学测量 系统的体积如需要可被减小。
根据本发明的一个方面，在一个简单的过程中，不仅可获得关于 某种疾病的个体患者之核酸序列的信息，还可获得关于感染患者的致 病性微生物之核酸序列的信息，其来自获自该患者的样品(如血)。
根据本发明的一个方面，固定了探针的基底用于评估针对患有某 种疾病的个体之适当的治疗方法。固定了探针的基底包括固定在同一 基底上的第二种探针和第一种探针，第二种探针可用于获得关于与疾 病相关联的核酸序列的信息，所述核酸存在于个体的细胞之染色体上。 第一种探针可用于获得与该疾病相关的致病性微生物之核酸序列的信 息。利用固定了探针的基底，可以一种简单的方法同时获得来自个体 以及来自从该个体获取的样品的致病性微生物之关于特定疾病的信 息，和/或预示对特定疾病治疗的应答的信息。
在一些实施方案中，方法和固定了探针的基底可用于评估丙型肝 炎治疗的功效。另一些实施方案中，方法和固定了探针的基底用于评 估AIDS的治疗(HIV的滴度和突变)。另一种实施方案是方法和固 定了探针的基底用于评估乙型肝炎的治疗(HBV滴度、类型和突变)。
丙型肝炎的治疗功效可利用根据本发明一个方面的方法来评估。 下面以举例的方式描述该实例。
已知丙型肝炎例如会发展为肝硬化，进一步成为肝癌。作为丙型 肝炎的一种治疗方法，已知施用干扰素(此后称为IFN)。干扰素α 和β常用于治疗。但是，IFN的功效变化较大。例如，干扰素仅对约 20-30％的日本来源之人类患者有效。即使IFN对人类患者有效，IFN 还存在对人类患者的强副作用的问题。这种IFN功效的变化据信是由 于感染患者的丙型肝炎病毒(此后称为HCV)的基因型(见，J.Clin. Microbiol.，34，2516(1996))以及病毒的量不同，以及感染该病毒之患 者的核酸序列的不同。基于HCV基因组不同区域之核苷酸与推定的氨 基酸序列的比较，至少已报道了6种主要基因型(Forns et al.，J.Clin. Microbiol.，34，2516(1996)，Andonov et al.，J.Clin.Microbiol.，33， 254(1995)。
根据本发明的一个方面，评估IFN对丙型肝炎的功效。术语“干 扰素(IFN)”如此处所用包括干扰素α，β，γ和/或ω。例如，如果感 染患者的丙型肝炎病毒是Ib型(在日本所见的主要类型)，则IFN不 甚有效。这意味着血清中HCV-RNA、HCV-抗体、GOP和GTP的浓 度不因IFN治疗而降低。但是，如果病毒类型是2a，则IFN的功效很 高。这意味着血清中HCV-RNA、HCV-抗体、GOP和GTP的浓度因 IFN治疗而降低。另一方面，如果病毒的量达到106拷贝/ml或以上， 则IFN的功效低。因此，为在核酸水平上核查感染患者的病毒的基因 型和量，使用根据本发明的第一种探针。
例如，作为一种用于检测样品中丙型肝炎病毒(HCV)之核酸序 列是否存在的探针，使用相应于HCV-RNA、HCV-RNA片段、HCV -RNA互补序列或其片段的碱基序列。期望的，本发明的探针具有至 少11个碱基，优选具有至少12个碱基，更优选至少13，14，15，16， 17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29甚至30个 碱基，用于检测HCV-RNA的基因型或突变。另一方面，长于至少30 个碱基，优选至少约40，50，60，70，80，90，100，200，500，1000 个碱基的探针优选用于检测HCV基因组。11-30的长度为适当的芯片 形式，比30碱基更长的探针可适于一般的杂交形式。例如，具有相应 于如SEQ ID NO：1，2，3，和4及其互补序列的碱基序列之探针可 以使用。这些序列几乎在所有HCV基因型中均保守(Andonov，et al，J. Clin.Microbiol.33，254(1995)。
至于本发明的第一种探针，优选使用不仅能检测样品中致病性微 生物存在与否，而且能检测致病性微生物的基因突变的探针。在丙型 肝炎的例子中，据报道，IFN的功效随HCV病毒的核酸序列之位点特 异性突变的存在与否而变化(Nagayama，et al，Hepatology，31，745 (2000))。作为用于检测包含于样品中HCV病毒的核酸序列之位点特 异性突变之第一种探针的例子，可使用这样的探针，其具有用来确定 HCV多蛋白之位于第434，580，938，962，1176或2774位的氨基酸 的碱基序列(如Hepatology，31，745(2000)所述)。肝细胞癌(HCC) 患者的HCV-1b基因组序列比那些来自无症状携带者(ASC)的更倾 向于具有更多的突变型残基。如果使用这样的探针，在可准确评估IFN 针对丙型肝炎的功效。
如上述，已报道了IFN治疗的功效随着HCV基因型的不同而不 同。因此，第一种探针可以是相应于HCV-RNA、HCV-RNA片段、 HCV-RNA互补序列或其片段的碱基序列。更具体地，第一种探针可 选自用于特异性检测HIV1型(SEQ ID NO：5)、2型(SEQ ID NO： 6)和3型(SEQ ID NO：7)的基因型之探针，这取决于待检测的基 因型。换言之，用于检测HCV的第一种探针可以是一种具有相应于由 SEQ ID NO：5，6，或7及其互补序列中任一个所示序列的序列之核 酸。
当使用能检测基因型的探针时，如果相应于不同基因型的探针被 固定在同一基底上，可准确进行检测。
样品中的致病性微生物之基因型可如下检测。在一种实施方案中， 将致病性微生物的核酸序列首先利用特异于基因型的引物经过PCR， 然后利用一种固定化的通用探针检测基因型。在此使用的通用探针一 般定义为一种能检测所有丙型肝炎病毒而无论其基因型如何的探针 (Andonov et al.，J.Clin.Microbiol.，33，254(1995)。
在丙型肝炎的情况中，利用如SEQ ID NO：8或9所示碱基序列 作为有义链，且利用如SEQ ID NO：10(对于基因型1a)、SEQ ID NO： 11(对于基因型1b)、SEQ ID NO：12(对于基因型2)或SEQ ID NO： 13(对于基因型3a)所示的碱基序列作为反义链。此后，利用如通用 探针和SEQ ID NO：15所示的碱基序列进行检测。
样品中致病性微生物的量可利用第一种探针测量，所述第一种探 针具有相应于来自致病性微生物的核酸序列的碱基序列，或者相应于 核酸的片段的碱基序列，或其互补序列。
据报道，在丙型肝炎中，IFN治疗的功效取决于血液中HCV的量 (J.Clin.Microbiol.，33，254(1995))。对于血清中携带HCV超过106 拷贝/ml的患者，IFN不甚有效(Yeh et al，J.Med.Biol.，66，48(2002))。 作为评估病毒量的探针，可使用相应于HCV-RNA、HCV-RNA片 段或者每个HCV-RNA互补序列或其片段的碱基序列。如果样品中 的核酸被用荧光素标记物标记，病毒的量(即病毒的浓度)是这样测 量的：利用固定了探针的芯片上的探针与核酸杂交，随后测量荧光标 记物的荧光强度。在电化学方法的情况中，病毒的浓度是这样获得的： 将固定了探针的芯片上的探针与核酸杂交，随后测量由该芯片产生的 电流值。
在本发明固定了探针的芯片上，如果前述探针(SEQ ID NO：5，6 和7)用作第一种探针，则可能获得关于致病性微生物(如感染个体 的病毒)的基因型、病毒的量、是否存在定点突变、以及表达的基因 之质量和种类的信息。结果，如果表达病毒是1b基因型(其为在日本 患者中主要所见的)，IFN不甚有效，而当病毒是2a基因型时，IFN 有效。另一方面，如果病毒的量达到106拷贝/ml或以上，则认为IFN 的功效低。因此，其可能用于评估针对个体的IFN治疗的功效。
本发明人已报道了另一种用于确定针对丙型肝炎的IFN功效的方 法，见日本专利申请2001-62371和2001-62372。在该方法中，IFN治 疗的功效是这样确定的：利用了存在于编码MxA蛋白的人类基因的启 动子区域(此后称为MxA启动子区域)的特异性单一核苷酸多形性(以 后称为SNP)。对于在MxA启动子区域带有特定类型的SNF之患者， IFN有效。因此，IFN治疗的有效性可通过检查SNP的存在来评估。 因此，在一个实施方案中，用于检测个体核酸的第二种探针用于在 MxA启动子区域检测SNP。
根据上述发现，在MxA启动子区域之-88位(以下称为 “MxA-88”)为G/G时，IFN治疗的有效性较低，而在为G/T和T/T 的情况中有效性高。另一方面，在MxA启动子区域之-123位(以下 称为“MxA-123”)为C/C时，IFN治疗的有效性较低，而在为C/A 和A/A的情况中有效性高。基于这些事实，评估了IFN治疗的有效性。 术语“-88位”以及“-123位”是当MXA基因的转录起始位点认 为是+1时的相对位置。WO 01/71007图1显示了MxA基因启动子区 域的核苷酸序列。
因此，根据本发明的一个方面，针对丙型肝炎的IFN治疗功效可 如下评估，方法是利用固定了探针的芯片在获自个体的样品中进行关 于HCV的基因分析，以及进行关于来自个体的编码MxA蛋白的基因 之启动子区域的基因分析，所述芯片包含固定于其上的第一种探针和 第二种探针，其中第一种探针用于检测HCV基因的存在与否，并进一 步检测HCV的基因型或基因突变，第二种探针用于检测在来自个体的 编码MxA蛋白之基因的启动子区域中存在的SNP碱基类型。结果， 可容易地预示IFN治疗的功效。
此外，至于一种评估针对丙型肝炎的IFN治疗功效的方法，已知 一种通过核查编码甘露糖结合凝集素(以下称为MBL)的基因之两个 SNP位点用于评估IFN治疗功效的方法(M.Matsushita et al.，J. Hepatology，29；695-700，1998)。MBL是引发免疫系统的关键因子， 且具有遗传多形性。基因型“XB”的一组MBL不应答IFN。Laursen 报道了MBL的序列(Immunology，93，421(1998)。该文件在此引入作 为参考。关于编码甘露糖结合凝集素的基因之基因分析可单独进行， 或与关于编码MxA蛋白之基因的启动子区域之基因诊断一起进行。
影响IFN功效的MBL多形性在如下位置存在：MBL基因的启动 子区域的-221位置(以下称为“MBL-221”)，以及MBL基因的外 显子1之第52，54和57位密码子。术语“-221位置”是当MXA 基因的转录起始位点认为是+1时的相对位置。
C和G是可能占据MBL基因的221位的碱基。当C占据221位 时，MBL基因的基因型称为“X”。当G占据221位时，MBL基因 的基因型称为“Y”。这一命名是根据Madsen et al.(Madsen HO， Garred P，Thiel S，Kurtzhals JAL，Lamm LU，Ryder LP，et al.，″The interaction between promoter and structural gene controls the minimum serum level of a human mannan-binding protein″，J. Immunol.1995；155：3013-20)。该文献在此引入作为参考。
MBL基因外显子1的第52，54，和57位密码子存在于结构基因， 即，胶原样结构域中。密码子52之可能的序列(基因型)是CGT或 TGT。根据Madsen命名法，前者的基因型被归为A型，后者被归为 D型。类似地，密码子54之可能的序列(基因型)是GGC或GAC。 前者的基因型为A型，后者为B型。同样，密码子57之可能的序列 (基因型)是GGA或GAA。前者的基因型为A型，后者为C型。在 所有密码子中，A型是野生型的等位基因，B、C和D型是突变型的 等位基因。在当所有密码子52、54和57的等位基因为A型时，与其 他至少一个密码子52、54和57的等位基因不是A型的情况相比，IFN 的功效较高。
相比于其他类型的患者(即Y非A-YA杂合以及Y非A-Y非 A同型纯合类型，其MBL-221位是Y型，且密码子52、54和57的 等位基因不是A型)而言，IFN对YA-YA同型纯合型患者(所述患 者的MBL-221位为Y型，且密码子52、54和57的等位基因为A型) 的作用更有效。反过来说，IFN对Y非A-YA杂合以及Y非A-Y 非A纯合同型类型患者的作用不如对YA-YA同型纯合型患者的作用 有效。
由上述发现，可确定适当的第二种探针。在其中疾病为丙型肝炎， 药剂为IFN的实施方案中，用于与个体核酸杂交的第二种探针(包括 用在固定了探针的芯片上的)是检测如下述的MxA启动子的SNP之 探针。在其中疾病为丙型肝炎，药剂为IFN的实施方案中，用于与个 体核酸杂交的第二种探针(包括用在固定了探针的芯片上的)是检测 与下述IFN功效相关的MBL多形性的探针。
具有单核苷酸多形性(SNP)(存在于每个这种碱基序列的第455 位和420位)的人MxA基因的启动子区域与IFN治疗的功效相关。 因此，由SEQ ID NO：16，17，18，19，37，38，39和40所示的碱 基序列，各自包括人类MxA基因的启动子区域。
在又一实施方案中，第二种探针可选自如下：
(at455)，如序列表中SEQ ID NO：16所示的碱基序列；
(bt455)，一种通过修饰(at455)所示的序列获得的修饰的碱基序 列，方法是删去或替换数个碱基(除了455位的碱基)或向其上添加 至少一个碱基；用于检测MBL多形性的修饰的探针保留了与编码 MBL之个体核酸杂交的能力。利用修饰了的探针之杂交条件不同于一 般探针。期望地，根据本发明的修饰的探针具有至少11个碱基，优选 至少12个碱基，更优选至少13，14，15，16，17，18，19，20，21， 22，23，24，25，26，27，28，29甚至30个碱基的序列，用于检测 HCV、RNA的基因型或突变。另一方面，长于至少30，优选至少约 40，50，60，70，80，90，100，200，500，1000碱基的探针也优选 用于检测HCV基因组。11-30的长度适于芯片形式，超过30个碱基 的更长探针可适于一般的杂交形式；
(ct455)，一种含有SEQ ID NO：16所示序列的441位-455位碱 基的序列；
(dt455)，一种含有SEQ ID NO：16所示序列的449位-459位 碱基的序列；
(et455)，一种选自(at455)-(dt455)的碱基序列的碱基序列的互补 序列；
(ag455)，一种由序列表中SEQ ID NO：17所示的碱基序列；
(bg455)，一种通过修饰(ag455)所示序列获得的修饰的碱基序列， 方法是删去或替换数个碱基(除了455位碱基)或向其上添加至少一 个碱基；
(cg455)，一种含有SEQ ID NO：17所示序列的441位-455 位碱基的序列；
(dg455)，一种含有SEQ ID NO：17所示序列的449位-459位 碱基的序列；
(eg455)，一种选自(ag455)-(dg455)的碱基序列的碱基序列的互 补序列；
(aa455)，一种由序列表中SEQ ID NO：18所示的碱基序列；
(ba455)，一种通过修饰(aa455)所示序列获得的修饰的碱基序列， 方法是删去或替换数个碱基(除了455位碱基)或向其上添加至少一 个碱基；
(ca455)，一种含有SEQ ID NO：18所示序列的441位-455 位碱基的序列；
(da455)，一种含有SEQ ID NO：18所示序列的449位-459位 碱基的序列；
(ea455)，一种选自(aa455)-(da455)的碱基序列的碱基序列的互 补序列；
(ac455)，一种由序列表中SEQ ID NO：19所示的碱基序列；
(bc455)，一种通过修饰(ac455)所示序列获得的修饰的碱基序列， 方法是删去或替换数个碱基(除了455位碱基)或向其上添加至少一 个碱基；
(cc455)，一种含有SEQ ID NO：19所示序列的441位-455 位碱基的序列；
(dc455)，一种含有SEQ ID NO：19所示序列的449位-459位 碱基的序列；
(ec455)，一种选自(ac455)-(dc455)的碱基序列的碱基序列的互 补序列。
由SEQ ID NO：16，17，18，19，37，38，39和40所示的碱基 序列各自包括一个人MxA基因的启动子区域。在每一这些碱基序列的 455位和420位存在的单一核肽多形性(SNP)与IFN治疗的功效相 关联。
SEQ ID NO：16-19的碱基序列相同，除了455位之外。SEQ ID NO：16的序列之455位为胸腺嘧啶。SEQ ID NO：17的序列之455 位为鸟嘌呤。SEQ ID NO：18的序列之455位为腺嘌呤。SEQ ID NO： 19的序列之455位为胞嘧啶。
具有由SEQ ID NO：16所示核酸序列(其中455位为胸腺嘧啶) 的HCV患者用IFN治疗有效，而缺乏该序列的HCV患者用IFN治 疗无效。为更具体描述，与具有由SEQ ID NO：16的核酸序列(其中 455位为胸腺嘧啶)以及SEQ ID NO：17的核酸(其中455位为鸟嘌 呤)组成的异型杂合的HCV患者(称为“G/T异型”)相比，或与 具有由SEQ ID NO：17的核酸序列(其中455位为胸腺嘧啶)组成的 同型纯合型HCV患者(称为“T/T同型”)相比，具有由SEQ ID NO： 17的核酸序列(其中455位为G)组成的同型纯合型HCV患者(称 为“G/G同型”)用IFN治疗不甚有效，
或者，与T/非T异型或T/T同型的HCV患者相比，具有由MxA 基因启动子区域(其中455位不是胸腺嘧啶)组成的同源纯合型HCV 患者(称为“非T/非T同型”)用IFN治疗不甚有效。非T/非T同 型的组合之例子包括G/G、G/A，G/C，A/A，A/C和C/C。T/非T的组 合之例子包括T/G，T/A，和T/C。
由SEQ ID NO：37-40所示的碱基序列相同，除了425位碱基。 SEQ ID NO：37的425位是腺嘌呤。SEQ ID NO：38的425位是胞嘧 啶。SEQ ID NO：39的425位是胸腺嘧啶。SEQ ID NO：40的425 位是鸟嘌呤。
在本发明的固定了探针的芯片中，如果碱基序列由SEQ ID NO： 16所示，其含有具有胸腺嘧啶的一个SNP位点，则碱基序列片段或任 一互补序列(at455)-(et455)用作第二种探针(用于检测来自个体的核 酸的序列)，从而可在治疗之前知道碱基序列(包括来自个体的人 MxA基因之启动子区域)的SNP位点是否为胸腺嘧啶。这样，可评 估用于个体的IFN治疗的功效。
如果在IFN治疗前确定了一个HCV患者之SNP位点的碱基(所 述SNP位点属于包含人MxA基因之启动子区域的碱基序列)，则可 评估IFN是否对该HCV患者有效。
在本发明的固定了探针的芯片中，如果用如下任一种序列作为第 二种探针：由含有鸟嘌呤SNP位点的SEQ ID NO：17所示的碱基序 列，该碱基序列的片段，或任一互补序列(ag455)-(eg455)，由含有腺 嘌呤SNP位点的SEQ ID NO：18所示的碱基序列，该碱基序列的片 段，或任一互补序列(aa455)-(ee455)，和由含有腺嘌呤SNP位点的 SEQ ID NO：19所示的碱基序列，该碱基序列的片段，或任一互补序 列(ac455)-(ec455)，用于检测来自个体的核酸之序列，则可能鉴定来 自个体包含人MxA基因的启动子区域之碱基序列的SNP位点的碱基。 这样，可评估IFN治疗对个体的功效(见日本专利申请Nos.2001-62371 和2001-62372)。
在其中疾病是丙型肝炎而药剂是IFN的实施方案中，用于与个体 核酸杂交的第二种探针(包括用在固定了探针的芯片上的)是选自如 下的探针：
(aa420)，一种由序列表中SEQ ID NO：37所示的碱基序列；
(ba420)，一种通过修饰(aa420)所示序列获得的修饰的碱基序列， 方法是删去或替换数个碱基(除了420位碱基)或向其上添加至少一 个碱基；
(ca420)，一种含有SEQ ID NO：37所示序列的415位-425 位碱基的碱基序列；
(da420)，一种选自(aa420)-(ca420)的碱基序列的碱基序列的互补 序列。
(ac420)，一种序列表中SEQ ID NO：38所示的碱基序列；
(bc420)，一种通过修饰(ac420)所示序列获得的修饰的碱基序列， 方法是删去或替换数个碱基(除了420位碱基)或向其上添加至少一 个碱基；
(cc420)，一种含有SEQ ID NO：38所示序列的415位-425 位碱基的碱基序列；
(dc420)，一种选自(ac420)-(cc420)的碱基序列的碱基序列的互补 序列；
(at420)，一种由序列表中SEQ ID NO：39所示的碱基序列；
(bt420)，一种通过修饰(at420)所示序列获得的修饰的碱基序列， 方法是删去或替换数个碱基(除了420位碱基)或向其上添加至少一 个碱基；
(ct420)，一种含有SEQ ID NO：39所示序列的415位-425 位碱基的碱基序列；
(dt420)，一种选自(at420)-(ct420)的碱基序列的碱基序列的互补 序列；
(ag420)，一种由序列表中SEQ ID NO：40所示的碱基序列；
(bg420)，一种通过修饰(ag420)所示序列获得的修饰的碱基序列， 方法是删去或替换数个碱基(除了420位碱基)或向其上添加至少一 个碱基；
(cg420)，一种含有SEQ ID NO：40所示序列的415位-425 位碱基的碱基序列；
(dg420)，一种选自(ag420)-(cg420)的碱基序列的碱基序列的互补 序列。
一个带有由SEQ ID NO：37所示核酸序列(其中425位是腺嘌呤) 的HCV患者用IFN治疗有效，而一个不带有SEQ ID NO：37的序列 的HCV患者用IFN治疗则不甚有效。序列与IFN功效的关系几乎与 当SNP位点存在于455位上的情况相同。
此外，在已证实可用IFN有效治疗的疾病是丙型肝炎的情况中， 本发明的第二种探针可选自下述的序列(i)-(t)。这些序列(i) -(t)适于确定MBL-221的类型和密码子52，54和57的多形性的 存在。
含有MBL-221和密码子52，54和57的MBL基因之序列示于 SEQ ID NO：41-56。MBL-221存在于这些序列的425位。
外显子1始于每一这类序列的646位。密码子52存在于868-870 位。密码子54存在于874-876位。密码子57存在于883-885位。 密码子52，54和57的SNP分别存在于868位，875位和884位。
(i)SEQ ID NO：41-44的核酸片段，各自含有MBL-221的 SNP位点，且各自含有相应于418-432位的核酸序列。
(j)SEQ ID NO：41-44的核酸片段，各自含有MBL-221的 SNP位点，且各自含有相应于421-430位的核酸序列。
(k)(i)和(j)片段的互补序列。
(l)SEQ ID NO：45-56的核酸片段，各自含有密码子52，54 和57的SNP位点，且各自含有相应于868-885位的核酸序列，例如 含有如SEQ ID NO：45-56所示核酸的片段。
(m)SEQ ID NO：45-56的核酸片段，各自含有密码子52和 54的SNP位点，且各自含有相应于868-876位的核酸序列，例如含 有如SEQ ID NO：45-56所示核酸的片段。
(n)SEQ ID NO：45-56的核酸片段，各自含有密码子54和57 的SNP位点，且各自含有相应于874-885位的核酸序列，例如含有 如SEQ ID NO：45-56所示核酸的片段。
(o)SEQ ID NO：45-56的核酸片段，各自含有密码子54的SNP 位点，且各自含有相应于874-876位的核酸序列，例如含有如SEQ ID NO：45-56所示核酸的片段，特别是，含有序列869-880位的片段。
(p)SEQ ID NO：45-56的核酸片段，各自含有密码子52的SNP 位点，且各自含有相应于868-870位的核酸序列，例如，含有如SEQ ID NO：45-56所示核酸的片段，特别是，含有序列864-873位的片段。
(q)SEQ ID NO：45-56的核酸片段，各自含有密码子57的SNP 位点，且各自含有相应于883-885位的核酸序列，例如，含有如SEQ ID NO：45-56所示核酸的片段，特别是，含有序列880-890位的片段。
(r)SEQ ID NO：45-56的核酸片段，各自含有密码子54的SNP 位点，且各自含有包含875位的核酸，其中存在密码子54的SNP位 点，例如，含有如SEQ ID NO：45-56所示核酸的片段。
(s)由(i)-(m)所示的且具有长度为11-30个碱基的核酸 片段。
优选地，对于MBL基因，探针序列含有至少420至430位，864-874 位，870-880位和879-889位。对于MxA基因，探针序列含有至少 450-466位。
(t)由(i)-(m)所示的核酸片段，其为(除了SNP位点)经 删去、替换或添加一个或多个核苷酸的修饰的核酸。
在本文所附的序列表中的各个序列中，“N”和“n”代表腺嘌呤、 胸腺嘧啶、鸟嘌呤胞嘧啶中的任一个碱基。
在本发明的固定了探针的芯片中，由个体表达的核酸(RNA)可 通过本发明的第二种探针测量，换言之，通过具有相应于来自个体的 核酸序列、其片段、或核酸序列(或其片段)的互补序列之碱基序列 的探针测量。在这种情况中，可检测或定量核酸序列。(其是RNA， cDNA或cRNA)。例如，由于IFN的功效随个体的体质易感性的不 同而不同，如果基因的表达模式(即表达的基因的质量和数量)可测 量，则可能评估当IFN实际施用时的功效。
根据本发明的一个方面，靶疾病不特别限定。任何疾病均可为靶， 只要其可由致病性微生物诱发。本发明包括与致病性微生物相关的疾 病。本发明也包括癌性疾病。
例如，可预测IFN治疗对于除了丙型肝炎之外的任一疾病的功效， 只要其已知用IFN治疗有效。这类例子包括，但不限于，由病毒感染 引起的感染性疾病，所述病毒包括诸如(甲、乙、丁、戊、己、庚) 丙型肝炎病毒，HIV，流感病毒，疱疹病毒，腺病毒，人多瘤病毒， 人乳头瘤病毒，人细小病毒，流行性腮腺炎病毒，人轮状病毒，肠病 毒，日本乙型脑炎病毒，登革热病毒，风疹病毒，和HTLV；以及由 细菌感染引起的感染性疾病，诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，溶血链球菌，致病性大肠杆菌，小肠炎弧菌，幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)，弯曲杆菌(Campylobacter)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，痢疾杆菌，沙门氏菌(Salmonellae)，耶尔森菌(Yelsinia)， 淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)，李斯特杆菌属(Listeria)，钩 端螺旋体属(Leptospira)，军团菌属(Legionella)，螺旋菌，肺炎支 原体(Mycoplasma pneumoniae)，立克次体，衣原体属，疟原虫，痢 疾阿米巴原虫，和致病性真菌，以及由寄生虫和真菌(Eumycetes)引 起的疾病。
此外，针对癌性疾病的IFN治疗功效可估计。癌性疾病包括遗传 性疾病，视网膜母细胞瘤，肾母细胞瘤，家族性结肠息肉，遗传性非 息肉结肠癌，神经纤维瘤病，家族性乳腺(胸)癌，着色性干皮病， 水泡癌，口腔癌，食管癌，胃癌，结肠癌，肝癌，胰腺癌，肺癌，甲 状腺癌，乳腺肿瘤，尿道肿瘤，男性生殖器肿瘤，女性生殖器肿瘤， 皮肤肿瘤，骨肉瘤，骨软骨肉瘤，白血病，淋巴瘤和实体瘤。
根据本发明待检测的致病性微生物并不特别限定。例如，致病性 微生物(如HCV)可在评估IFN治疗的功效中使用。但是，可以使用 任何致病性微生物，只要其与已证实IFN治疗有效的疾病相关。如果 一种致病性微生物可直接或间接与疾病相关联或与疾病的症状相关 联，则此致病性微生物与该疾病相关。
这类致病性微生物的例子包括病毒，诸如(甲、乙、丁、戊、己、 庚)丙型肝炎病毒，HIV，流感病毒，疱疹病毒，腺病毒，人多瘤病 毒，人乳头瘤病毒，人细小病毒，流行性腮腺炎病毒，人轮状病毒， 肠病毒，日本乙型脑炎病毒，登革热病毒，风疹病毒，和HTLV；以 及细菌，诸如金黄色葡萄球菌，溶血链球菌，致病性大肠杆菌，小肠 炎弧菌，幽门螺杆菌，弯曲杆菌，霍乱弧菌，痢疾杆菌，沙门氏菌，耶尔 森菌，淋病奈瑟球菌，李斯特杆菌属，钩端螺旋体属，军团菌属，螺旋 菌，肺炎支原体，立克次体，衣原体属，疟原虫，痢疾阿米巴原虫，和 致病性真菌，以及寄生虫和真菌。
IFN治疗功效与疾病以及个体固有基因的相关性已用举例的方式 描述。
但是，本发明不限于实施例。
在一些实施方案中，个体对获得性免疫缺损综合征(IDS)的易 感性可从存在于个体中的人免疫缺损病毒(以下称为HIV)以及来自 个体的基因的分析来预测。此外，分析了HIV基因和/或其拷贝(如， cDNA)的基因型和HIV基因的特定多形性。基于这些所得信息，可 预测下列药剂的功效，包括蛋白酶抑制剂(如ritnavil(RTV)或噻喹努 佛(SQV))和反转录抑制剂(如adifothymine(AZT)或双脱氧腺苷 (ddl))。在一些实施方案中，个体对水痘或带状疱疹的易感性可通过 对个体中存在的水痘、带状疱疹病毒和来自个体的基因分析来预测。 或者，可分析抗病毒剂(如无环鸟苷)的功效。另一方面，如果确定了 流感病毒的基因型，拷贝数和个体的基因型，可预测个体对流感的易 感性和诸如Tamifulu的抗病毒剂的功效。当提取的核酸成分是HCV -RNA时，可使用HCV-RNA作为测试核酸。或者，HCV-RNA 被用反转录酶转化为cDNA，然后用作测试核酸。
在使用能检测某种基因型的探针时，如果相应于不同基因型的多 重探针被固定于同一基底上，可进行准确检测。下面的实施例意在阐 明而不是限制本发明。 实施例1描述了用于从人类受试者提取核酸的方法
1.用于从人类患者提取人类基因组核酸以及病毒基因组核酸的方 法
从各个HCV患者中获取大约3ml血，至于含有EDTA2K的空血 液收集管中。然后，利用QIAamp DNA B1ood Midi试剂盒(由QIAGEN GmbH制造并销售)的方法从血液样品中提取核酸。在所得提取物中所 含的HCV基因组RNA经过反转录反应。更具体地，从获得的提取物 中获取等份，向其中加入六脱氧核糖核苷酸混合物(获自Takara K.K.) 和M-MLV反转录酶(得自Life Technologies Inc.)，然后反应在 42℃下进行30分钟。
2.关于HCV基因组RNA用人类基因组核酸提取试剂盒提取的 提取率的研究
当提取HCV基因组RNA时，一般用血清替代全血。在污染物如 蛋白质被最大程度去除后，利用胍缓冲液等提取HCV基因组RNA。 但是，在本发明的方法中，HCV基因组RNA与人类基因组RNA同时 提取。因此，本发明人研究了利用用于全血的人类基因组核酸提取试 剂盒，当与人类基因组RNA同时从全血中提取时，HCV基因组RNA 的提取率。
比较了两种方法。一种是利用SepeGeneRV-R(得自Sanko Junyaku K.K.)，从血清(100μL)中提取HCV基因组RNA的普通 方法。另一种是利用QIAamp DNA Blood Midi试剂盒(QIAGEN GmbH)从全血中提取HCV基因组RNA的方法，简称为“QIAamp方 法”。用QIAamp方法提取的HCV基因组RNA进一步经过反转录酶 反应，然后用乙醇沉淀纯化。用和不用乙醇沉淀的QIAamp方法之 HCV基因组RNA的提取率加以比较。
利用HCV基因组RNA的5’UTR序列通过竞争性PCR(K. Chayama et al.，J.Gastroenterol.Hepatol.8，S40-44，1993)评估提取 率。结果示于表1
表1  HCV基因组核酸的提取方法的比较以及提取率 提取方法 纯化 质量结果(拷贝/ml血) SepeGeneRV-R 进行 1×105.5 QIAamp DNA试剂盒 未进行 6×104.5 QIAamp DNA试剂盒 进行 6×104.5
由上述结果，显然利用QIAamp方法比用普通方法之HCV基因 组RNA提取率低大约10倍。因此推定HCV RNA不能由QIAamp方 法从含有极低病毒浓度的血液样品中提取。因此，认为QIAamp方法 之，建议通过QIAamp方法定性确定病毒。
如上述利用反转录反应获得的样品经过扩增方法以同时扩增人类 基因组核酸和其中所含的HCV基因组RNA。
使用引物MxAF01和MxAR02用于扩增人类基因组。引物nc2(K. Chayama et al.，J.Gastroenterol.Hapatol.8，S40-44，1993，nt27-45) 和引物33(Okamoto et al.，Jpn.J.Exp.Med 60，215-222，1990)用于扩 增HCV基因组RNA。在单一试管中进行扩增。人类基因组核酸和HCV 基因组RNA的扩增通过重复50次如下循环反应进行：94℃30秒，55 ℃30秒以及2℃1秒。在进行PCR之前进行94℃预处理4分钟，在 PCR后72℃下进行7分钟的后处理。 引物序列： MxAF01：5’-ACACACCCGTTTCCACCCTGGAGAGGCCAG-3’ MxAR02：5’-TGCGCAGTGCTGGAGTGCGGCCTCCGCTCT-3’ NC2：5’-CCTGTGAGGAACTACTGTC-3’ 33：5’-GGTGCACGGTCTACGAGACC-3’
结果，扩增了人类基因组DNA(大小：610bp)和HCV基因组RNA (大小：300bp)。由此，证实了从人类基因组DNA和病毒基因组RNA 的提取步骤到基因组核酸的特定区域之扩增步骤以相同方式同时进行。
根据本发明，通过从个体提取的样品可简便、快速地评估该疾病 的治疗。
此外，根据这一实施方案，可从个体中获取的单一样品中得到许 多信息。因此，可防止有时在样品检测过程中发生的样品混杂的问题。 或者，当处理极端危险的样品时，可防止从相比于常规情况而言极端 危险的样品中的污染物扩散。同时，可最大程度降低由危险样品引起 意外的风险。 实施例2描述用于评估IFN治疗功效的DNA芯片
在第一个地方，从人类患者血液样品中获取人染色体DNA和 HCV-RNA。利用SEQ ID NO：20和21所示的引物扩增135bp的人 染色体DNA片段。用反转录酶处理HCV-RNA以制备cDNA。
前述步骤中获得的核酸样品通过由Phamacia Inc.制造并销售的 试剂盒用FITC标记。
图1显示根据实施例2的DNA芯片的示意图。基底2是用聚赖氨 酸包被的盖玻片。基底2上，点样各自为200nL的第二种和第一种探 针，并干燥(图1中，第一种和第二种探针用参考号1-5显示)。在 这种情况中，由SEQ ID NO：22，23，24，25和26所示的序列用作第二 种探针。由SEQ ID NO：5，6和7所示的序列用作第一种探针。然后， 用UV射线照射DNA芯片以将探针固定在基底2上。SEQ ID NO：22 -25的碱基序列分别为SEQ ID NO：16-19的碱基序列的片段，各 自含有455位的SNP位点。SEQ ID NO：5-7的碱基序列是用于检测 HCV病毒基因型(即1，2，3型)的探针。
用FITC标记的核酸溶解在2xSSC-1mmol/L EDTA溶液中。如此 制备的核酸置于体积为20μL的反应室中，用固定了探针的盖玻片覆 盖。在50℃进行反应12小时后，用0.2xSSC-1mmol/L EDTA溶液 洗涤固定了探针的芯片两次。此后，测量从盖玻片发射的荧光强度。
结果，仅有SEQ ID NO：22的探针的点发射明显的荧光。结果， 来自人核酸且包含于血液样品中的MxA-88基因型被确定为T/T同型。 此外，包含于血液样品中的病毒被确定为2型HCV病毒。由所得的荧 光强度，确定病毒浓度为106拷贝/ml或以下。基于这些事实，评估IFN 可有效作用于提供样品的患者。 实施例3描述了用于评估IFN治疗功效的PNA芯片
从患者血液样品中获取人类染色体DNA和HCV-RNA。利用 SEQ ID NO：20和21的引物扩增人类染色体DNA的135bp片段。另 一方面，用反转录酶处理HCV-RNA以制备cDNA。利用如此获得的 cDNA作为模板，以及SEQ ID NO：10，11，12，13和14所示的引物(其 为反义引物)进行PCR。
图2显示了实施例3的PNA芯片。如下制备固定了探针的芯片。 将10个金电极13用接头14固定在玻璃基底12上。芯片上，将第一 种PNA探针和第二种PNA探针(各自为200nl，用图中参考号7-11 表示)点样于基底，静置1个小时。在这种情况中，由SEQ ID NO： 27，28，29，30和31所示的序列用作第二种PNA探针，其N末端已经 用半胱氨酸修饰。由SEQ ID NO：32，33，34，35和36所示的序列用作 第一种PNA探针。SEQ ID NO：27-30的碱基序列为包括由SEQ ID NO：16-19所示序列的片段，各自具有碱基序列的455位SNP位点。 SEQ ID NO：32-36的碱基序列用于检测HCV病毒的基因型，即1a， 1b，2a，2b，和3a。
随后，将样品溶解入2xSSC-1mmol/L EDTA溶液中。所得溶液 置于20μL反应室中，用固定了探针的芯片覆盖。在50℃反应1小 时，用0.2xSSC-1mmol/L EDTA溶液洗涤固定了探针的芯片两次。向 该芯片逐滴加入10μmol/L的Hoechst 33258溶液。金电极13、其相 对电极和参比电极已经被固定在固定了探针的芯片上。通过向金电极 和相对电极之间施加电压，测量由Hoechst 33258的氧化电流。
结果，观察到获自金电极13的电流明显改变，所述电极上固定了 具有SEQ ID NO：27，28和34所示的序列之探针。由此，确定了来 自人核酸且包含于样品中的MxA-88基因型为G/T异型。此外，包含 于样品中的病毒被确定为2a型。因此，估计IFN可有效作用于从中获 取样品的患者。
实施例4
根据本发明，基于感染丙型肝炎患者的HCV病毒类型，以及基 于Mxa-88、Mxa-123、MBL-221的基因型和MBL胶原样结构域的密 码子54，可估计IFN治疗对丙型肝炎患者的有效性。
参考示于图3中的流程解释了一种基于病毒类型以及MBL和 MxA基因型评估IFN治疗功效的方法。
用于评估IFN功效的流程图始于步骤3a，其中将样品(如血液样 品)从待用IFN治疗的个体中获取。如需要，如此获得的样品可通过 提取等方法纯化。随后，确定病毒类型以及MxA-88、MxA-123、 MBL-22的基因型，和MBL胶原样结构域的密码子54。
随后，评估步骤到达3b。如果在步骤3a中存在1型病毒，步骤 到达3c。如果在步骤3b中仅有2型病毒，则步骤到达3d。
在步骤3c中，通过检索数据表2(其中IFN的功效与基因型相关 联)，可确定在步骤3a中确定的相应于MBL和MxA基因型的IFN 功效。结果，评估了IFN治疗的功效。全部评估过程就此完成。
在步骤3d中，通过检索数据表3(其中IFN的功效与基因型相关 联)，可确定在步骤3a中确定的相应于MBL和MxA基因型的IFN 功效。结果，评估了IFN治疗的功效。完整的评估过程就此结束。
此处所用的数据表含有与基因型相关的对IFN的敏感性数据。
数据表2和3的数据分别示于表2和3。此处以举例的方式显示数 据表2，3以及表2，3。可使用任何数据表和表，只要它们显示IFN 与基因型之间的相关性。例如，表2显示IFN功效与患有1型HCV 病毒的患者之基因型之间的关系。另一方面，表3显示了IFN功效与 病毒的基因型之间的关系。待用的表可仅表示数据所需的项目。或者， 表中可与数据所需项目一起包括其他项目。在实施例4的步骤3c和3d 中，表2和3被引用作为数据表，其事先通过选择关于各个步骤之数 据的必需项目而制成。但是，表2和3可结合为一个表。或者，表可 显示除了数据必需项目以外的其他项目。为更具体描述，待示于表中 的项目可如下选择。例如，待在步骤3c中使用的表如果包括了用1型 HCV感染的患者之“基因型”，“有效患者百分率”以及“非有效患 者百分率”就足够了。待在步骤3d中使用的表如果包括了用2型HCV 感染的患者之“基因型”，“有效患者百分率”以及“非有效患者百 分率”就足够了。但是，待列于表中的项目不仅限于此。实施者可任 意选择待列于表中的项目。
示于表2和3中的数据值表示基因型与IFN敏感性或IFN功效的 相应度。但是，基因型与IFN敏感性的相应度不一定必需用数字值表 示。基因型与IFN功效之间的相关性可用任意方法表示，例如诸如○， ×，和△的符号，和诸如1，2，3，4和5的评分(简化数字值)，只 要其可表达相关性。
                       表2 靶基因 基因型 有效的 非有效的 卡方 P MBL   单独  XB     20(24％)     65(76％)     6.985     0.008  YA     32(43％)     42(57％) MxA(-88) 单独  G/G     16(21％)     59(79％)     8.340     0.003  G/T，  T/T     36(43％)     48(57％) MxA(-123)   单独  C/C     21(23％)     70(77％)     8.961     0.002  C/A， A/A     31(46％)     37(54％) MBL和   MxA(-88)  XB-G/G     5(13％)     34(87％)     8.124     0.004  XB-G/T，XB-T/T，  YA-G/G，    YA-G/T，YA-T/T     47(39％)     73(61％)  XB或G/G，(i.e.，XB-G/G，  XB-G/T，XB-T/T，YA-G/G)     31(26％)     90(74％)     11.546     0.0006  YA-G/T，YA-T/T     21(55％)     17(45％) MBL和   MxA(-123)  XB-C/C     5(11％)     39(89％)      11.283     0.0007  XB-C/A，XB-A/A，YA-C/C)，    YA-C/A，YA-A/A     47(41％)     68(59％)  XB或C/C，(i.e.，XB-C/C，    XB-C/A，XB-A/A，YA-C/C)     36(27％)     96(73％)     10.420     0.001  YA-C/A，YA-A/A     16(59％)     11(41％)
                               (续)
                             表2 靶基因 基因型 有效的 非有效的 卡方 P MxA(-88)  和 MxA(-123)  G/G-C/C     16(21％)     59(79％)     8.340     0.003  G/G-C/A，G/G-A/A，  G/T-C/C，T/T-C/C，G/T-C/A，  G/T-A/A，T/T-C/A，T/T-A/A     36(43％)     48(57％)  G/G或C/C     21(23％)     70(77％)     8.961     0.002  G/T-C/A，G/T-A/A，  T/T-C/A，T/T-A/A     31(46％)     37(54％) MBL和 MxA(-88)   和 MxA(-123)  XB-G/G-C/C      5(13％)     34(87％)     8.124     0.004  XB-G/G-C/A，XB-G/G-A/A，  XB-G/T-C/C，XB-T/T-C/C，  XB-G/T-C/A，XB-G/T-A/A，  XB-T/T-C/A，XB-T/T-A/A，  YA-G/G-C/C，YA-G/G-C/A，  YA-G/G-A/A，YA-G/T-C/C，  YA-T/T-C/C，YA-G/T-C/A，  YA-G/T-A/A，YA-T/T-C/A，  YA-T/T-A/A     47(39％)     73(61％)  XB或G/G或C/C     36(27％)     96(73％)     11.283     0.0007  YA-G/T-C/A，YA-G/T-A/A，  YA-T/T-C/A，YA-T/T-A/A     16(59％)     11(41％)
                             表3
             IFN治疗对病毒类型的影响 HCV类型 有效(％) 非有效(％) 总计 类型1(b)    18(17)     85(83)   103 类型2(a/b)    34(62)     21(38)    55 类型1&2     0     1     1 总计     52     107   159
如果根据本发明研究了数据的许多项目，可更准确评估IFN治疗 的功效。此外，如果使用根据本发明一个方面的方法和固定了探针的 芯片，关于靶核酸的信息可从样品中方便、迅速和准确的获得。本发 明前述方面是以举例的方法描述的，因此不限制本发明。
本发明的其他优点和改进对本领域技术人员显而易见。因此，本 发明的较宽的范围不局限于此处显示和表述的具体细节和代表性实施 方案。因此，可进行多种修饰而不偏离本发明所附权利要求书及其等 同物定义的较宽的发明构思之精神和范围。
                     序列表 <110>KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA
 HASHIMOTO，Koji
 HASHIMOTO，Michie
 MISHIRO，Shunji
 OOTA，Yasuhiko <120>与疾病相关的核酸的检测 <130>01S1691P <150>JP 2001-90053 <151>2001-3-27 <150>JP 2001-284112 <151>2001-9-18 <160>72 <210>1 <211>21 <212>DNA <213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus) <400>1 ccctgtgagg aactwctgtc t <210>2 <211>21 <212>DNA <213>丙型肝炎病毒 <400>2 ggtgcacggt ctacgagacc t                                           21 <210>3 <211>26 <212>DNA <213>丙型肝炎病毒 <400>3 tctagccatg gcgttagtry gagtgt                                      26 <210>4 <211>26 <212>DNA <213>丙型肝炎病毒 <400>4 cactcgcaag caccctatca ggcagt                                      26 <210>5 <211>18 <212>DNA <213>丙型肝炎病毒 <400>5 cgctcaatgc ctggagat                                               18 <210>6 <211>18 <212>DNA <213>丙型肝炎病毒 <400>6 cactctatgc ccggccat                                                  18 <210>7 <211>18 <212>PNA <213>丙型肝炎病毒 <400>7 cgctcaatac ccagaaat                                                  18 <210>8 <211>20 <212>DNA <213>丙型肝炎病毒 <400>8 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