本发明涉及抗-血管生成肽与白蛋白的融合蛋白的领域。

血管生成有时也被称作新血管生成，即产生新的毛细血管和血管。
该过程一般发生于多个生物学情形中，包括胎儿发育；月经；排卵； 胎盘发育；以及在患病或局部缺血、神经再生、骨生长和创伤愈合区域产 生侧副血管(collaterall blood vessel)。所有这些事件，特别是胎儿发育，需要 内皮细胞飞速生长、迁移并分化成复杂的血管网络。
然而，在正常成人中，除了上述生物学事件(通常在开始一至二周内开 启和关闭)外，并不需要血管生成，内皮细胞处于静止状态。
通常，内皮细胞很缓慢地再生，大约每三至四年更换一次。当然，内 皮细胞并未丧失分裂能力；它们受内源性刺激物和血管生成抑制剂之间复 杂平衡的控制。
肿瘤生长和转移需要新血管的概念是Folkman于二十世纪七十年代提 出的。在过去的七年里，Folkman的实验室发现了几种能抑制血管生成的肽 和蛋白质，其中有制管张素(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)、胶原的小肽 衍生物和其它基底膜蛋白。
这些治疗剂通过攻击滋养(feed)肿瘤细胞的血管而不是直接攻击肿瘤细 胞，提供了一种攻击癌症的新方法。
在常规抗肿瘤疗法中，化学疗法进攻的目标是癌细胞的高生长速率， 人们经常将其设计成靶向特定的癌基因或靶向由癌症亚型或器官-特异性癌 症所表达的受体。由于肿瘤细胞本来在基因水平上就不稳定，在与化学治 疗剂的对抗中，它们经常通过改变基因组成或变成抗药型而最终胜出。类 似地，能有效抵抗一种特定癌症类型的药剂却不能抵抗不同器官位点的癌 症。
标准化学疗法的第二个显著缺点是：对具有高分裂速率的正常细胞， 如血液和骨髓细胞、胃肠道细胞和毛囊细胞有严重毒性。
因此，化学疗法目前所面临的最大问题是由肿瘤细胞的高突变率所引 起的特异性的缺乏(导致毒副作用)和药物抗性。
靶向内皮细胞可防止这些问题的出现，也可以提供一种减轻转移扩散 的方法。由于内皮细胞一般不增殖，因此，它们尚未进化获得对快速突变 的适应能力，不太可能产生药物抗性。
尽管对于不同器官位点的内皮细胞是否相同尚存在很多不同意见，但 有一点是确定的，即内皮细胞对引发其迁移和增殖的生物化学信号和刺激 物有类似的反应。
因此，研究人员和临床医生通过靶向内皮细胞而不是肿瘤细胞，即可 获得更加通用的癌症疗法，所述疗法能防止出现常常与化学疗法相关的非 特异性毒性。
对基因稳定的内皮细胞有影响的抗血管生成药物也不太可能产生药物 抗性。
最后，抗血管生成疗法被设计成使肿瘤“饥饿(starve)”并消除转移扩 散所需的血管系统。具体地说，与现有的靶向肿瘤的癌症疗法不同，抑制 肿瘤血管生成的药剂-如内皮他丁能靶向肿瘤的生命-支持系统。使用血管 生成抑制剂的有效疗法会导致肿瘤十分“饥饿”以致于无法长得较大，并 且能防止已有的从原发性肿瘤上脱落的微转移长出血管系统，从而长成临 床上显著的肿瘤。另外，这些药剂能使晚期原发性肿瘤和转移消退。由于 它们对肿瘤血管具有高度特异性，因此，使用这些药剂能避免对正常细胞 的损害和相关的副作用。
在不同类型的癌症中，血管生成可能起着不同的作用。
最可能从抗-血管生成疗法中获益的患者是早期局部肿瘤的患者；较理 想地，医生会尽量减轻晚期局部肿瘤患者的肿瘤负担，以尝试治疗性外科 手术或使用攻击性化学疗法。另外，已知在遗传上易患癌症的患者可将血 管生成抑制剂用作预防措施。
绝大多数癌症被确诊时已处于其自然历史的晚期。因而，对大多数患 者而言，肿瘤学家不仅须控制起点的肿瘤(原发性肿瘤)，还须控制远处位点 的肿瘤(转移)。外科手术、放疗和化疗是能用于达到这些目标的主要方法， 但与很多癌症相关的高死亡率凸现了这些疗法的不足。
在每个病例中，这些疗法因下述原因而失败：
·所述疗法的毒性超过了该疗法对疾病的疗效。
·所述疗法不能根除所有癌症细胞，因为恶性细胞对放疗或化疗产生 了抗性，或散布得过于广泛以致于无法通过放疗或手术来治疗。
有细胞毒性的化疗经常需要肿瘤学家平衡治疗效力与其对身体的损 害。尽管药物由其全身性作用获得疗效，细胞毒化学治疗剂-其中大多数 选中的是活跃增殖的细胞-也会破坏快速分裂的正常细胞。
同时破坏正常细胞和癌细胞会产生几个令人不适的副作用：
·由破坏骨髓所引起的贫血和中性粒细胞减少症(免疫细胞损失[血小板 减少症])。
·由胃肠衬料损害引起的恶心和呕吐。
·毛囊坏死。
·神经系统损害。
最新的疗法-外科手术、放疗和细胞毒性的化疗-已将癌症治疗改善 了许多，以致于可以使用这些治疗形式。有一点似乎可以确定：要想获得 进一步的改善，需要利用癌症分子发病机理方面的知识。
J.Folkman于1971年在New England Journal of Medicine上发表的论文(第 285卷，p1182-1186)引出了这样一个思想，即血管生成对癌症的发病机理是 至关重要的，该论文还提出可以将与肿瘤相互作用的正常组织作为抗癌疗 法的靶。
对原发性Lewis肺癌的临床前效力研究和转移的B16异种移植物研究表 明：皮下施用内皮他丁之后，肿瘤停滞(tumor stasis)。免疫组化研究表明： 这一疗效是通过抑制肿瘤血管生成介导的。当继续使用内皮他丁疗法治疗 时，肿瘤保持休眠状态，重要的是，未观察到药物抗性或毒副作用的证据。 实际上，在正式的毒理学研究中，再次显示出毒性的缺乏，由此显示出内 皮他丁优于目前开发的多种抗-血管生成化合物的直接优点。
其他研究小组(包括NCI)得出的数据不能显示出任何抗-肿瘤效果。然 而，已鉴定出结果相互矛盾的原因，目前，NCI对内皮他丁的抗-血管生成 特性是满意的。
1999年7月，FDA批准了内皮他丁治疗实体瘤患者的研究性新药 (Investigational New Drug，IND)申请，使得NCI和EntreMed能用重组蛋白质起 始三项设计好的I期临床研究。
第一项研究于1999年9月在波士顿的Dana-Farber癌症研究所启动，研究 对象为各种实体瘤的患者。NCI发起其它I期临床研究，这些研究在休斯顿 的Anderson癌症中心和威斯康辛大学进行。在28天的周期里，患者每天接受 静脉内剂量的内皮他丁，波士顿和威斯康辛中心的患者每天的药物剂量保 持不变，而休斯顿的患者如果病情稳定，会以8周为间隔接受逐渐增加的药 物剂量。
上述研究报道的初步结果显示：在61名施用内皮他丁的患者中，12名 患者接受了4至12个月的内皮他丁疗法。12人中有5人至少4个月保持病情稳 定，这些患者中有2人接受了12个月以上的疗法。
在Anderson中心进行的试验中，PET扫描显示施用内皮他丁的患者体内 肿瘤血流量显著减少。这一观察结果得到威斯康辛大学研究的确证，所述 研究证实用内皮他丁治疗56天之后，尽管流经心脏的血流量未变，但一些 患者肿瘤中的血流量有所减少。还观察到尿碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 和血管内皮生长因子(VEGF)水平与剂量有关的降低。
重要的是，在任何一项研究中，都未报道明显(major)毒副作用，药物抗 性似乎也不是问题。
所有这三项I期临床试验合起来的数据表明：尽管患者能较好地耐受内 皮他丁，但19名患者中只有两名登记继续接受治疗，而12名患者因疾病有 所发展而退出研究，另有5名患者自动退出研究。
EntreMed正在欧洲进行一项I期临床试验，旨在评估持续灌注和皮下施 用内皮他丁。
EntreMed计划启动针对人的II期临床研究，最终目的可能是肿瘤进展的 时间而不是使肿瘤缩小。
至于已开发的绝大多数抗-血管生成药剂，它们最大的潜在用途可能是 与化疗和放疗联合使用。实际上，一些临床前研究已证实内皮他丁与放疗 有协同作用，EntreMed正在进行几项针对多个组合疗法的临床前研究。同 时进行的是在进行性黄斑变性和类风湿性关节炎(RA)模型中评估内皮他丁 效力的临床前研究。
已证实制管张素治疗与VEGF和bFGF的mRNA表达降低相关。人重组制 管张素能成功抑制B16黑素瘤转移模型中的肺黑素瘤。注射肿瘤细胞3天后， 用制管张素治疗动物11天。该疗法使肺转移减少了60-80％。
EntreMed完成了临床前的毒理学和药理学结果，并于1999年12月递交 了IND申请。FDA于2000年2月接受了该申请，2000年3月在费城的Thomas Jefferson大学医院开始了第一项I期临床研究，旨在研究用作单一疗法的制 管张素。
2000年7月，EntreMed在同一家医院开始了第二项试验，但是，与内皮 他丁有所不同，该项研究是在晚期癌症患者中研究作为与放疗组合的一部 分的产物。在这两项研究中，制管张素被静脉内施用。
欧洲对制管张素的研究开始于2000年11月，其着眼于患者对皮下施用 的制管张素的耐受性。
发明简述
本发明涉及含有与白蛋白或其片段或其变体融合的抗-血管生成肽或其 片段或其变体的蛋白质。本文将这些融合蛋白通称为“本发明的白蛋白融 合蛋白”。本发明的这些融合蛋白表现出延长的体内半衰期和/或延长的或治 疗活性。
本发明包括治疗性的白蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、制剂和 试剂盒。本发明还包括编码本发明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含 有这些核酸的载体，被这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及使用这些核 酸、载体和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。
本发明还涉及可用于以下方面的组合物和方法：抑制内皮细胞增殖和/ 或迁移；抑制肿瘤-诱导的血管生成；抑制原发性肿瘤和转移的生长或促进 其消退；以及治疗癌症、糖尿病性视网膜病、进行性黄斑变性或类风湿性 关节炎和所有与血管生成相关的疾病。
本发明还涉及将抗血管生成肽靶向哺乳动物细胞内部或细胞结构的方 法；将本发明的白蛋白融合蛋白靶向细胞类型、靶器官或特定细胞学或解 剖学位置的方法；诊断哺乳动物与抗-血管生成相关的疾病或失调的方法； 以及改善抗血管生成肽给药剂量安排的方法。
附图说明
图1.N-末端内皮他丁-白蛋白融合开放阅读框的DNA序列。(该DNA序列 编码初级翻译产物，因此，前72个核苷酸编码24个氨基酸长的前导序列， 在本文实施例中，当从酵母中分泌时会除去所述前导序列)。
图2.N-末端内皮他丁-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。(该氨基酸序列表 示图1所示DNA序列的初级翻译产物，因此，包括当从酵母中分泌时会被除 去的24个氨基酸长的前导序列。因此，该蛋白质序列不代表本文肿瘤抑制 实施例中所用蛋白质的序列)。
图3.C-末端白蛋白-内皮他丁融合开放阅读框的DNA序列。(该DNA序列 编码初级翻译产物，因此，前72个核苷酸编码24个氨基酸长的前导序列， 在本文实施例中，当从酵母中分泌时会除去所述前导序列)。
图4.C-末端白蛋白-内皮他丁融合蛋白的氨基酸序列。(该氨基酸序列表 示图3所示DNA序列的初级翻译产物，因此，包括当从酵母中分泌时会被除 去的24个氨基酸长的前导序列。因此，该蛋白质序列不代表本文肿瘤抑制 实施例中所用蛋白质的序列)。
图5.N-末端制管张素(非-糖基化)-白蛋白融合开放阅读框的DNA序列。
图6.N-末端制管张素(非-糖基化)-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。
图7.C-末端白蛋白-制管张素(非-糖基化)-融合开放阅读框的DNA序列。
图8.C-末端白蛋白-制管张素(非-糖基化)-融合蛋白的氨基酸序列。
图9.N-末端Kringle5-(GGS)4GG-白蛋白融合开放阅读框的DNA序列。
图10.N-末端Kringle5-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。
图11.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-Kringle5融合开放阅读框的DNA序列。
图12.C-末端白蛋白-(GGS)4GG-Kringle5融合蛋白的氨基酸序列。
图13.4-12％梯度的SDS凝胶和Western印迹：A.胶体蓝凝胶。B.抗-内皮 他丁Western印迹。C.抗-HSA Western印迹。
图14.皮下给药后平均内皮他丁浓度+/-SD。
图15.静脉内给药后平均内皮他丁浓度+/-SD。
图16.PK数据。治疗＝C末端-内皮他丁72小时，途径＝皮下，负荷剂量＝1.8， 维持剂量＝1.2。
图17.PK数据。治疗＝C末端-内皮他丁24小时，途径＝皮下，负荷剂量＝1.5， 维持剂量＝0.5。
图18.PK数据。治疗＝N末端-内皮他丁72小时，途径＝皮下，负荷剂量＝1， 维持剂量＝0.9。
图19.PK数据。治疗＝N末端-内皮他丁24小时，途径＝皮下，负荷剂量 ＝0.8，维持剂量＝0.25。
图20.与白蛋白融合的内皮他丁和经典内皮他丁在迁移-试验(HUVEC) 中的效力。融合蛋白的所有浓度或剂量与内皮他丁等效物相关。
图21.用与白蛋白融合的C-末端-内皮他丁皮下治疗Bx Pc-3后的肿瘤体 积。对照＝○----○；1.2mg/kg/72h＝□----□；0.5mg/kg/24hr＝●----●。融合蛋白 的所有浓度或剂量与内皮他丁等效物相关。
图22.用与白蛋白融合的C-末端-内皮他丁皮下治疗Bx Pc-3后的肿瘤体 积。对照＝○----○；0.4mg/kg/72h＝◆----◆；1.2mg/kg/72h＝□----□； 3.6mg/kg/72h＝■----■。融合蛋白的所有浓度或剂量与内皮他丁等效物相关。
图23.用与白蛋白融合的N-末端-内皮他丁皮下治疗Bx Pc-3后的肿瘤体 积。对照＝■----■；0.8mg/kg/72h＝□----□；0.75mg/kg/48hr＝○----○； 0.4mg/kg/24h＝●----●。融合蛋白的所有浓度或剂量与内皮他丁等效物相关。
图24.用与白蛋白融合的N-末端-内皮他丁皮下治疗Bx Pc-3后的肿瘤体 积。对照＝○----○；0.25mg/kg/48h＝▲----▲；0.75mg/kg/48h＝■----■； 2.25mg/kg/48h＝△----△。融合蛋白的所有浓度或剂量与内皮他丁等效物相关。
图25.在SP-FF上纯化的C-末端rHA制管张素的SDS PAGE。
图26.C-末端rHA制管张素的Western印迹分析。
图27.表达白蛋白或制管张素-白蛋白融合蛋白的酵母细胞上清液的SDS PAGE。
图28(A-D).成熟形式的人白蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)和编码它 的多核苷酸(SEQ ID NO：17)。
发明详述
本发明涉及含有与血管生成抑制肽结合的白蛋白的融合蛋白。本文所 用术语“蛋白质”和“肽”不局限于但包括蛋白质、多肽以及肽。所述肽 包括但不限于具有抑制血管生成之特性的内皮他丁(包括restin，arresten， canstatin和tumstatin)或其片段或其变体；具有抑制血管生成之特性的制管张 素或其片段或其变体；具有抑制血管生成之特性的alphastatin或其片段或其 变体；具有抑制血管生成之特性的kringle 5或其片段或其变体；以及具有抑 制血管生成之特性的抗-凝血酶III或其片段或其变体。
本发明还涉及双功能(或多功能)融合蛋白，其中白蛋白与两个(或多个) 血管生成抑制肽结合，任选所述肽是不同的血管生成抑制肽，包括但不限 于具有抑制血管生成之特性的内皮他丁/制管张素或内皮他丁/制管张素 /kringle 5融合蛋白或其片段或其变体。与仅含有一种血管生成抑制肽的白蛋 白融合蛋白相比，所述双功能(或多功能)融合蛋白还能表现出协同的抗-血 管生成作用。
本发明还涉及一类融合蛋白，其中一个(或多个)血管生成抑制肽，任选 为不同的血管生成抑制肽与两个相同或不同的白蛋白分子或白蛋白片段或 变体结合。
另外，化学实体(chemical entity)可以与本发明的融合蛋白共价结合，或 与其联合使用以增强生物活性或调制生物活性。
本发明的白蛋白融合蛋白有望延长血管生成抑制肽的体内半衰期。和 未与白蛋白连接的肽相比，所述白蛋白-融合肽的体外或体内半衰期可延长2 倍，5倍或更多倍。另外，至少部分由于所述肽的半衰期延长，预期本发明 的白蛋白融合蛋白能减少治疗性肽的剂量安排频率。和未与白蛋白连接的 治疗性肽的剂量安排频率相比，所述融合蛋白的剂量安排频率可减少至少 1/4，或至少1/2或更高。
本发明的白蛋白融合蛋白能延长肽的货架期，和/或在体外和/或体内稳 定肽和/或其在溶液(或在药物组合物)中的活性。可以是治疗剂的这些白蛋 白-融合蛋白有望降低用大量载体蛋白(如非融合的白蛋白)配制蛋白质溶液 的需求，从而防止因诸如非特异性结合的因素造成的蛋白质损失。
本发明还包括编码白蛋白融合蛋白的核酸分子以及含有这些核酸的载 体，被这些核酸载体转化的宿主细胞，以及使用这些核酸、载体和/或宿主 细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。本发明还包括经修饰后含有本 发明的核酸分子，任选经修饰后可以表达由所述核酸分子编码的白蛋白融 合蛋白的转基因生物体。
本发明还包括药物配制剂，其含有本发明的白蛋白融合蛋白和药物可 接受的稀释剂或载体。所述配制剂可置于试剂盒或容器中。所述试剂盒或 容器的包装中可附有关于延长的蛋白质货架期(shelf-life)的说明书。所述配 制剂可用于预防、治疗或改善患者(如哺乳动物或人)与血管生成有关的疾 病、疾病症状或相关失调的方法，所述方法包括给患者施用药物制剂的步 骤。
本发明还包括使与使用中高浓度的血管生成抑制肽治疗哺乳动物有关 的副作用(如注射位点反应、头疼、恶心、发烧、能量水平提高、皮疹、虚 弱、腹泻、眩晕、过敏反应、异常低的中性粒细胞水平)潜在最小化的方法， 所述方法包括给所述哺乳动物施用与白蛋白融合的血管生成抑制肽。
本发明包括预防、治疗或改善由血管生成引起的血管生成-相关疾病或 失调的方法，所述方法包括给需要所述预防、治疗或改善的哺乳动物施用 含有有效量血管生成抑制肽(或其片段或其变体)的本发明的白蛋白融合蛋 白，以治疗、预防或改善疾病或失调。在本发明中，血管生成抑制肽，如 内皮他丁也被称为“治疗性蛋白质”。
本发明包括白蛋白融合蛋白，其含有与白蛋白或多拷贝的白蛋白(包括 其片段和变体)融合的内皮他丁肽或多拷贝的内皮他丁单体(包括其片段和 变体)。
本发明还包括延长内皮他丁肽在哺乳动物中的半衰期的方法。该方法 必需使内皮他丁肽与白蛋白连接以形成与白蛋白融合的内皮他丁肽，还必 需给哺乳动物施用与白蛋白融合的内皮他丁肽。一般说来，和未与白蛋白 连接的内皮他丁肽的半衰期相比，与白蛋白融合的内皮他丁肽的半衰期可 延长至少2倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍或至少50倍。
本文例举的是含有与表现出抗-肿瘤活性的内皮他丁融合的白蛋白的融 合蛋白。所述抗-肿瘤活性包括但不限于抑制原发性肿瘤或转移的生长。另 外，本发明还涉及含有与内皮他丁融合的白蛋白的融合蛋白在治疗癌症、 糖尿病性视网膜病、进行性黄斑变性或类风湿性关节炎中的用途。
下文将进一步详细讨论本发明的多个方面。
内皮他丁(endostatin)
内皮他丁首次描述于1997年(M.O′Reilly等，Cell 88：277-285)，它是胶原 XVIII的20kDa C-末端片段，1996年首次分离自血管内皮瘤细胞系。描述了 内皮他丁的抗-血管生成作用的初期研究使用了在杆状病毒和大肠杆菌表达 系统中产生的重组鼠内皮他丁。在细胞粘附分子(CAM)试验中，该分子显示 出能在体外选择性抑制内皮细胞增殖。
胶原XVIII是围绕血管内皮细胞(VEC)的基底层的一个组分，并且是内 皮他丁的母体蛋白质，已知锌是其抗-血管生成活性所必需的。在VEC开始 朝血管生成源迁移之前，其必须开始基底层降解。在细胞培养研究中，内 皮他丁的主要功能似乎是抑制VEC增殖，这可能是通过蛋白酶胶原酶防止 内皮细胞基质(ECM)重建模型来做到的。
内皮他丁的分子量约为18,000至约20,000道尔顿(18至20kDa)，它能在经 培养的内皮细胞中抑制内皮细胞增殖。一种蛋白质形式的特征还在于 US5,854,205中鉴定的N-末端氨基酸序列His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser(SEQ ID NO：1)，它对应于鼠 XVIII型胶原的C-末端片段。本文实施例中所用的人XVIII型胶原C-末端片段 的相应N-末端氨基酸序列为：His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser(SEQ ID NO：2)。
本发明所用的内皮他丁肽包括内皮他丁的片段或变体，如任何身为天 然内皮他丁肽的类似物、同系物、片段或衍生物的分子，如列入本文作为 参考的US5,854,205中描述的那些分子。使用本领域已知的方法即可鉴定出 可用于本发明的白蛋白融合蛋白的活性片段及其变体，所述方法包括表1所 列的、列入本文作为参考的专利和参考文献中描述的那些方法。本发明所 用的内皮他丁肽仅需要具有对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的内皮他丁 肽的单个生物活性。
本发明所用的内皮他丁肽表现出抗-血管生成活性，还可进一步具有其 它的优良特征，例如增加的生物可利用度，和/或稳定性，或降低的宿主免 疫识别。
使用本领域已知的方法即可鉴定出可用于本发明的白蛋白融合蛋白的 活性片段及其变体，所述方法包括表1所列的、列入本文作为参考的专利和 参考文献中描述的那些方法。
当在能O-糖基化的酵母中表达内皮他丁(或其片段或变体)时，可修饰任 何丝氨酸或苏氨酸，或者要不然减少其数目以使O-糖基化作用或内皮他丁 (或其片段或变体)的生物活性最小化。可替代地，或另外，可以使用糖基化 不足(即O-糖基化有缺陷)的酵母菌株。
制管张素(angiostatin)
制管张素是1994年首次发现的纤溶酶原片段，已证实它具有抗-血管生 成活性。制管张素结合内皮细胞(EC)表面的ATP合酶，并抑制EC迁移和小 管形成，以及诱导EC和肿瘤细胞的细胞凋亡。
通过“制管张素”在体外制约内源性生长因子，如bFGF的血管生成活 性的能力，以及它与美国专利5,885,795图1A和1B所示的大约开始于纤溶酶 原第98位氨基酸的纤溶酶原内部片段的氨基酸序列同源性和结构相似性来 限定“制管张素”。制管张素含有一种蛋白质，经还原性聚丙烯酰胺凝胶电 泳测定，该蛋白质的分子量约为38kDa至45kDa，其氨基酸序列实质上类似 于从鼠完整纤溶酶原分子的第98位氨基酸开始的鼠纤溶酶原片段的氨基酸 序列。
不同物种之间的制管张素氨基酸序列略有不同。例如，人制管张素的 氨基酸序列实质上类似于上述鼠纤溶酶原片段的序列，但是，有活性的人 制管张素序列可以开始于人完整纤溶酶原氨基酸序列的第97位或第99位氨 基酸。另外，正如小鼠肿瘤模型中所示，人纤溶酶原片段具有类似的抗-血 管生成活性。应懂得活性制管张素分子的氨基酸数目可以不同，本发明欲 包括所有具有内皮抑制活性的氨基酸序列。参见例如美国专利5,885,795。
本发明所用的“制管张素”肽包括其片段或变体，例如任何身为天然 制管张素的类似物、同系物、片段或衍生物的分子，如列入本文作为参考 的US5,885,795中描述的那些分子。
制管张素具有特殊的三维构象，所述构象由纤溶酶原分子的kringle区限 定(Robbins，K.C.，″The plasminogen-plasmin enzyme system″Hemostasis and Thrombosis，Basic Principles and Practice，2nd Edition，ed.by Colman，R.W.et al.J.B.Lippincott Company，pp.340-357，1987)。在纤溶酶原分子的NH2末端 部分有5个这样的kringle区，它们是构象相关的基元，并具有较高的序列同 源性。据信制管张素的三维构象包括纤溶酶原kringle区1至3和部分kringle 区4。纤溶酶原分子的每个kringle区含有约80个氨基酸并含有3个二硫键。已 知该半胱氨酸基元也存在于其它的生物活性蛋白质中。这些蛋白质包括但 不限于凝血酶原(prothrombin)、肝细胞生长因子、分散因子(scater factor)和 巨噬细胞刺激蛋白(Yoshimura，T，et al.″Cloning，sequencing，and expression of human macrophage stimulating protein(MSP，MST1)confirms MSP as a member of the family of kringle proteins and locates the MSP gene on Chromosome 3″J.Biol.Chem.，Vol.268，No.21，pp.15461-15468，1993)。任何 具有三维kringle-样构象或半胱氨酸基元、在体内具有抗-血管生成活性的分 离的蛋白质或肽都是本发明的一部分。
本发明所用的制管张素肽表现出抗-血管生成活性，还可进一步具有其 它的优良特征，例如增加的生物可利用度，和/或稳定性，或降低的宿主免 疫识别。
使用本领域已知的方法即可鉴定出可用于本发明的白蛋白融合蛋白的 活性片段及其变体，所述方法包括表1所列的、列入本文作为参考的专利和 参考文献中描述的那些方法。
Kringle 5
Kringle 5是纤溶酶原中存在的、制管张素结构以外的纤溶酶原内部片 段。Kringle 5显示出与纤溶酶原前4个kringle结构域约50％的序列同一性和 结构相似性(Cao，Y et al，″Kringle domains of human Angiostatin″J.Biol. Chem.Vol.271，No 46，pp 29461-29467，1996；Cao，Y et al，″Kringle 5 of Plasminogen is a novel Inhibitor of Endothelial Cell Growth″J.Biol.Chem.Vol. 272，No 36，pp 22924-22928，1997和Lu，H，et al；″Kringle 5 causes cell cycle arrest and apoptosis of endothelial cells″Biochem.Biophysical Research Communications，Vol.258，pp 668-673，1999)。
本发明所用的Kringle 5肽表现出抗-血管生成活性，还可进一步具有其 它的优良特征，例如增加的生物可利用度，和/或稳定性，或降低的宿主免 疫识别。
使用本领域已知的方法即可鉴定出可用于本发明的白蛋白融合蛋白的 活性片段及其变体，所述方法包括表1所列的、列入本文作为参考的专利和 参考文献中描述的那些方法。
白蛋白(albumin)
在本文中，术语人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)可以互换使用。术 语“白蛋白”和“血清白蛋白”含义较宽，包括人血清白蛋白(及其片段和 变体)以及其它物种的白蛋白(及其片段和变体)。
本文所用的“白蛋白”总体指白蛋白蛋白质或氨基酸序列，或具有白 蛋白的一或多种功能活性(如生物活性)的白蛋白片段或变体。特别地，“白 蛋白”指人白蛋白或其片段(参见EP 201239，EP322094，WO97/24445， W095/23857)，特别是如本文图27和SEQ ID NO：18以及美国临时申请流水号 60/355,547和WO01/79480的图15和SEQ ID NO：18所示的成熟形式的人白蛋 白，或其它脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子或其片段的类似物或 变体。
本发明的白蛋白融合蛋白中所用的人血清白蛋白含有与SEQ ID NO：18 有关的下述点突变套中的一个或两个：Leu-407变为Ala，Leu-408变为Val， Val-409变为Ala和Arg-410变为Ala；或Arg-410变为Ala，Lys-413变为Gln和 Lys-414变为Gln(参见例如WO 95/23857，全文列入本文作为参考)。在其它实 施方案中，含有一套或两套上述点突变的本发明的白蛋白融合蛋白具有改 良的稳定性/对酵母Yap3p蛋白酶解的抗性，从而使酵母宿主细胞中表达的重 组白蛋白融合蛋白的产量增加。
本文所用的足以延长或延伸治疗性蛋白质的体内半衰期、治疗活性或 货架期的白蛋白部分指的是：与非融合状态的治疗性蛋白质的体内半衰期、 治疗活性或货架期相比，长度或结构足以稳定、延长或延伸白蛋白融合蛋 白的治疗性蛋白质部分的体内半衰期、治疗活性或货架期的白蛋白部分。 白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可含有全长的上述HA序列，或者可包括其一 或多种能稳定或延长治疗活性的片段。所述片段的长度可以是10或更多个 氨基酸，或者可包括HA序列的约15，20，25，30，50或更多个邻接的氨基酸， 或者包括HA特定结构域的部分或全部。
本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的变体。本发明 的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分也可以是本文所述治疗性蛋白质的 变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入、缺失和取代，其中所述改 变实质上不会改变白蛋白或其赋予治疗性蛋白质的治疗活性的活性位点或 其活性结构域的一或多种oncotic，有效配体-结合特性和非-致免疫特性。
特别地，本发明的白蛋白融合蛋白可包括人白蛋白及其片段的天然多 态性变体，例如EP 322 094中公开的那些片段(即HA(Pn)，其中n是369至419)。 白蛋白可得自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人、奶牛、绵羊 或猪。非-哺乳动物白蛋白包括但不限于母鸡和鲑鱼的白蛋白。白蛋白融合 蛋白的白蛋白部分可得自与治疗性蛋白质部分来源不同的动物。
一般说来，HA片段或变体的长度至少为100个氨基酸，任选至少为150 个氨基酸。HA变体含有至少一个完整的HA结构域或由其组成，所述结构域 如结构域1(SEQ ID NO：18的氨基酸1-194)，2(SEQ ID NO：18的氨基酸 195-387)，3(氨基酸388-585)，1+2(SEQ ID NO：18的1-387)，2+3(SEQ ID NO：18的195-585)或1+3(SEQ ID NO：18的氨基酸1-194+SEQ ID NO：18的氨 基酸388-585)。每个结构域自身由两个同源的亚结构域，即1-105，120-194， 195-291，316-387，388-491和512-585组成，亚结构域之间有易弯曲的接头区 域，其含有残基Lys106至Glu119，Glu292至Val315和Glu492至Ala511。
本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可含有至少一个HA亚结构域或 结构域或其保守的修饰。如果融合蛋白基于亚结构域，任选使用一些或所 有的相邻接头连接治疗性蛋白质组成成分。
白蛋白融合蛋白
本发明一般涉及治疗、预防或改善疾病或失调的白蛋白融合蛋白和方 法。本文所用“白蛋白融合蛋白”指的是至少一个白蛋白(或其片段或变体) 分子与至少一个治疗性蛋白质(或其片段或变体)分子融合形成的蛋白质。本 发明的白蛋白融合蛋白含有至少一个治疗性蛋白质片段或变体以及至少一 个人血清白蛋白片段或变体，彼此通过例如基因融合(即通过翻译核酸产生 白蛋白融合蛋白，在所述核酸中，编码全部或部分治疗性蛋白质的多核苷 酸与编码全部或部分白蛋白的多核苷酸框内连接)相互连接。可将作为白蛋 白融合蛋白的一部分的治疗性蛋白质和白蛋白称为白蛋白融合蛋白的“部 分(portion)”、“区域”或“组成成分(moiety)”。
在一个实施方案中，本发明提供了白蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋 白质和血清白蛋白，或由它们组成。在其它实施方案中，本发明提供了白 蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋白质的生物活性和/或治疗活性片段和血清 白蛋白，或由它们组成。在其它实施方案中，本发明提供了白蛋白融合蛋 白，其含有治疗性蛋白质的生物活性和/或治疗活性变体和血清白蛋白，或 由它们组成。在其它实施方案中，白蛋白融合蛋白的血清白蛋白组分是成 熟的血清白蛋白部分。
在其它实施方案中，本发明提供了白蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋 白质，以及血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片段，或由它们组成。在 其它实施方案中，本发明提供了白蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋白质， 以及血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性变体，或由它们组成。在一些实 施方案中，白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是成熟的治疗性蛋白质部 分。
在其它实施方案中，本发明提供了白蛋白融合蛋白，其含有治疗性蛋 白质的生物活性和/或治疗活性片段或变体，以及血清白蛋白的生物活性和/ 或治疗活性片段或变体，或由它们组成。在一些实施方案中，本发明提供 了白蛋白融合蛋白，其含有成熟的治疗性蛋白质部分和成熟的血清白蛋白 部分，或由它们组成。
在一个实施方案中，白蛋白融合蛋白含有HA作为N-末端部分，含有治 疗性蛋白质作为C-末端部分。或者，也可使用含有HA作为C-末端部分，含 有治疗性蛋白质作为N-末端部分的白蛋白融合蛋白。
在其它实施方案中，白蛋白融合蛋白具有与白蛋白N-末端和C-末端融 合的治疗性蛋白质。在一个实施方案中，在N-和C-末端融合的治疗性蛋白 质是相同的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，在N-和C-末端融合的治 疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，在N-和C-末端 融合的治疗性蛋白质是可用于治疗或预防相同疾病的、不同的治疗性蛋白 质。在另一个实施方案中，在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是可用于治 疗或预防本领域已知一般同时出现于患者身上的疾病的、不同的治疗性蛋 白质。
除了白蛋白部分与治疗性蛋白质部分的N-末端和/或C-末端融合得到的 白蛋白融合蛋白外，还可通过将所需治疗性蛋白质或肽插入HA的内部区域 来产生本发明的白蛋白融合蛋白。例如，在HA分子的蛋白质序列内，α-螺 旋的末端和起点之间存在多个靠二硫键稳定化的环或转角。从HA的晶体结 构(PDB标识符1A06，1BJ5，1BKE，1BM0，1E7E至1E7I和lUOR)测定出：环的 大部分背离分子体向外伸展。这些环可用于插入或内部融合治疗活性肽， 特别是那些需要二级结构才具有功能的肽，或治疗性蛋白质，从而实质上 产生具有特定生物活性的白蛋白分子。
人白蛋白结构中可插入肽或多肽以产生本发明的白蛋白融合蛋白的环 包括：Val54-Asn61、Thr76-Asp89、Ala92-Glu100、Gln170-Ala176、 His247-Glu252、Glu266-Glu277、Glu280-His288、Ala362-Glu368、 Lys439-Pro447、Val462-Lys475、Thr478-Pro486和Lys560-Thr566。在其它实 施方案中，肽或多肽被插入成熟人白蛋白(SEQ ID NO：18)的Val54-Asn61、 Gln170-Ala176和/或Lys560-Thr566环中。
被插入的肽可得自筛选特定生物活性用的噬菌体展示文库或合成肽文 库，或得自具有所需功能的分子的活性部分。另外，可在特定的环内或通 过将随机肽插入HA分子的特定环中来产生随机肽文库，其中提供了所有可 能的氨基酸组合。
可通过下述方法之一，针对HA或HA的结构域片段产生文库：
(a)随机突变HA或HA结构域片段的一个或多个肽环内的氨基酸。可按照 此方法突变环内的一个、多个或所有残基；
(b)在HA或HA结构域片段的一个或多个环内(即内部融合)取代或插入 长度为Xn的随机肽(其中X是氨基酸，n是残基数目)；
(c)除(a)和/或(b)外的N-、C-或N-和C-末端肽/蛋白质融合。
通过将获自针对不同靶的不同环的不同筛选文库的肽移植到相同HA或 HA结构域片段中，也可以使HA或HA结构域片段成为多功能的。
插入人血清白蛋白环中的肽是治疗性蛋白质肽或其肽片段或肽变体。 更具体地，本发明包括白蛋白融合蛋白，它含有插入人血清白蛋白环中的、 长度至少为7，至少为8，至少为9，至少为10，至少为11，至少为12，至少 为13，至少为14，至少为15，至少为20，至少为25，至少为30，至少为35， 或至少为40个氨基酸的肽片段或肽变体。本发明还包括白蛋白融合蛋白， 它含有与人血清白蛋白的N-末端融合的、长度至少为7，至少为8，至少为9， 至少为10，至少为11，至少为12，至少为13，至少为14，至少为15，至少 为20，至少为25，至少为30，至少为35，或至少为40个氨基酸的肽片段或 肽变体。本发明还包括白蛋白融合蛋白，它含有与人血清白蛋白的C-末端 融合的、长度至少为7，至少为8，至少为9，至少为10，至少为11，至少为 12，至少为13，至少为14，至少为15，至少为20，至少为25，至少为30， 至少为35，或至少为40个氨基酸的肽片段或肽变体。
一般说来，本发明的白蛋白融合蛋白可具有一个得自HA的区域和一个 得自治疗性蛋白质的区域。然而，可使用每个蛋白质的多个区域来制备本 发明的白蛋白融合蛋白。类似地，可以使用一个以上的治疗性蛋白质来制 备本发明的白蛋白融合蛋白。例如，治疗性蛋白质可与HA的N-和C-末端融 合。在这种构型中，治疗性蛋白质部分可以是相同或不同的治疗性蛋白质 分子。双功能白蛋白融合蛋白的结构可表示为：X-HA-Y或Y-HA-X或X-Y-HA 或HA-X-Y或HA-X-Y-HA或HA-Y-X-HA或HA-X-X-HA或HA-Y-Y-HA或 HA-X-HA-Y或X-HA-Y-HA或多重组合或在HA序列的任何位置插入X和/或 Y。
可根据功能、半衰期等，以不同比例制备双-或多-功能白蛋白融合蛋白。
也可以制备双-或多-功能白蛋白融合蛋白，通过位于HA另一端的蛋白 质或肽将融合蛋白的治疗性蛋白质部分靶向靶器官或细胞类型。
作为已知治疗性分子融合蛋白的替代物，通过筛选文库即可获得肽， 其中所述文库被构建成与HA或HA结构域片段的N-，C-或N-和C-末端的融合 物，长度一般为6，8，12，20或25或Xn个(其中X是氨基酸(aa)，n等于残基数目) 随机的氨基酸，所述文库中提供了所有可能的氨基酸组合。该方法特别的 优点是：可以在HA分子上原位选择肽，因此，肽的特性同样可被选择出来， 而不象通过任何其它方法先获得，再与HA结合的肽那样，还需进行潜在地 修饰。
另外，本发明的白蛋白融合蛋白可在融合部分之间包括接头肽，以在 组成成分之间提供较大的物理间距，从而使治疗性蛋白质部分的可靠近性 最大化，例如用于结合其相应的受体。接头肽可由易弯曲或更刚性的氨基 酸组成。
因此，如上所述，本发明的白蛋白融合蛋白可具有下式：R2-R1；R1-R2； R2-R1-R2；R2-L-R1-L-R2；R1-L-R2；R2-L-R1或R1-L-R2-L-R1，其中R1是 至少一个治疗性蛋白质，肽或多肽序列(包括其片段或变体)，但不必是相同 的治疗性蛋白质，L是接头，R2是血清白蛋白序列(包括其片段或变体)。接 头包括例如：(GGGGS)N(SEQ ID NO：3)或(GGGS)N(SEQ ID NO：4)或(GGS)N， 其中N是大于或等于1的整数，G表示甘氨酸，S表示丝氨酸。当R1是两个或 多个治疗性蛋白质、肽或多肽序列时，任选通过接头连接这些序列。
在其它实施方案中，同未与白蛋白融合的治疗性蛋白质的货架期或体 内半衰期或治疗活性相比，含有相同治疗性蛋白质的本发明的白蛋白融合 蛋白具有延长的货架期或体内半衰期或治疗活性。货架期一般是指溶液或 一些其它储存制品中治疗性蛋白质的治疗活性保持稳定，未过度损失治疗 活性的时间。很多治疗性蛋白质在其非融合状态下十分不稳定。如下文所 述，通过掺入到本发明的白蛋白融合蛋白中，这些治疗性蛋白质的典型货 架期显著延长。
相对于处于相同储存和操作条件下的标准品而言，具有“延长的”货 架期的本发明的白蛋白融合蛋白表现出较高的治疗活性。标准品可以是未 融合的全长治疗性蛋白质。当白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是类似 物、变体，或要不然已经改变或不包括完整的蛋白质序列时，治疗活性的 延长可与所述类似物、变体、经改变的肽或不完整序列的未融合等效物相 比较。例如，当在给定时间点比较时，在与标准品处于相同储存和操作条 件下，本发明的白蛋白融合蛋白可保持大于约100％的治疗活性，或大于约 105％，110％，120％，130％，150％或200％的标准品治疗活性。然而，应指出 治疗活性取决于治疗性蛋白质的稳定性，可以低于100％。
也可以根据用储存开始时的治疗活性归一化的储存后保留的治疗活性 来评估货架期。表现为具有延长的治疗活性的、具有延长的货架期的本发 明的白蛋白融合蛋白可以保留大于约50％的治疗活性，约60％，70％，80％ 或90％或更高的处于相同条件下的等价未融合治疗性蛋白质的治疗活性。
治疗性蛋白质
如上所述，本发明的白蛋白融合蛋白含有治疗性蛋白质的至少一个片 段或变体以及人血清白蛋白的至少一个片段或变体，它们彼此通过基因融 合连接在一起。
本文所用“治疗性蛋白质”指的是血管生成抑制肽，例如具有一种或 多种治疗和/或生物活性的内皮他丁(包括restin、amesten、canstatin和 tumstatin)或其片段或变体；具有一种或多种治疗和/或生物活性的制管张素 或其片段或其变体；具有一种或多种治疗和/或生物活性的alphastatin或其片 段或其变体；具有一种或多种治疗和/或生物活性的kringle 5或其片段或其变 体；以及具有一种或多种治疗和/或生物活性的抗-凝血酶III或其片段或其变 体。因此，本发明的白蛋白融合蛋白至少含有治疗性蛋白质的片段或变体。 另外，术语“治疗性蛋白质”可指治疗性蛋白质的内源性或天然关联物。 变体包括突变体、类似物和模拟物以及同系物，包括治疗性蛋白质的内源 性或天然关联物。
显示出“治疗活性”的多肽或具有“治疗活性”的蛋白质指的是：具 有一种或多种与治疗性蛋白质有关的已知生物和/或治疗活性的多肽，例如 本文所述的或本领域已知的一种或多种治疗性蛋白质。作为一个非限制性 的例子，“治疗性蛋白质”是可用于治疗、预防或改善疾病的蛋白质。
本文所用的“治疗活性”或“活性”可指其效果与希望在人或非人哺 乳动物或其它物种或生物体中出现的治疗结果一致的活性。可以在体内或 体外测定治疗活性。例如，可以在细胞培养物中检测所需的效果。对于多 种本领域已知的治疗性蛋白质而言，所述体外或细胞培养试验一般是容易 做到的。
有用试验的例子包括但不限于：表1中列入本文作为参考的参考文献和 出版物中描述的试验，以及本文实施例中描述的试验。可通过容易进行的、 能检测融合蛋白抑制血管生成的能力或其抑制肿瘤生长或增殖的能力的体 外试验，如本文所述的那些试验来测定本发明的融合蛋白表现出的抗-血管 生成或抗-肿瘤活性。使用这些试验，即可测定融合蛋白表现出的针对给定 肿瘤的参数，例如相对抗-血管生成或抗-肿瘤活性。
可通过结合一个或多个寡糖基团来修饰对应于本发明白蛋白融合蛋白 中治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质。被称为糖基化的这种修饰可显著影 响蛋白质的物理特性，对于蛋白质的稳定性、分泌和定位也很重要。所述 修饰详细描述于美国临时申请流水号60/355,547和WO 01/79480(列入本文 作为参考)。
可以修饰对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗 性蛋白质及其类似物和变体，以使作为对其核酸序列进行操作的结果，或 由于其表达的其它条件所致，对其进行表达的宿主细胞改变了一个或多个 位点处的糖基化。例如，通过取消或导入糖基化位点，例如通过取代或缺 失氨基酸残基，如用谷氨酰胺取代天冬酰胺即可产生糖基化异构体，或者， 通过在不会使其糖基化的宿主细胞，如大肠杆菌或糖基化-缺陷酵母中表达 蛋白质，即可产生非糖基化的重组蛋白质。这些方法的例子更详细地描述 于美国临时申请流水号60/355,547和WO 01/79480(列入本文作为参考)中并 且是本领域已知的。
表1提供了对应于本发明白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗 性蛋白质的非穷举例子。“治疗性蛋白质X”一栏描述了治疗性蛋白质分子， 后面紧接着含学名和商标名的圆括号，所述分子含有治疗性蛋白质分子或 其片段或其变体，或由其组成。本文所用的“治疗性蛋白质X”可以指单个 治疗性蛋白质分子(由可得自CAS和Genbank登录号的氨基酸序列限定)，或 指与该栏中公开的给定治疗性蛋白质分子相关的整组治疗性蛋白质。与这 些条目中的每一项相关的信息，特别是与本文所述氨基酸序列有关的信息 皆全文列入本文作为参考。“PCT/专利参考文献”一栏提供了对应于描述治 疗性蛋白质分子的专利和/或已公开的专利申请的美国专利号或PCT国际公 开号。“PCT/专利参考文献”一栏中提及的每个专利和/或已公开的专利申请 皆全文列入本文作为参考。特别应将以下内容列入本文作为参考：每篇被 提及的“PCT/专利参考文献”的序列表中所示的特定多肽的氨基酸序列， 每篇被提及的“PCT/专利参考文献”的详细描述中所示的这些氨基酸序列 的变体(突变，片段等)，每篇被提及的“PCT/专利参考文献”的详细描述中 所示的治疗适应症，以及每篇被提及的“PCT/专利参考文献”的详细描述 中，更特别地为实施例中所示的特定多肽的活性试验。“生物活性”一栏描 述了与治疗性蛋白质分子有关的生物活性。“相关信息”一栏提及的每篇参 考文献皆全文列入本文作为参考，特别是与参考文献中描述的用于检测相 应生物活性的各个活性试验描述有关的内容。“优选适应症Y”一栏描述了 可通过治疗性蛋白质X或含有治疗性蛋白质X部分的本发明的白蛋白融合蛋 白治疗、预防、诊断或改善的疾病。
                                                      表1 治疗性蛋 白质X PCT/专利参 考文献 生物活性 相关出版物 优选适应 症Y 内皮他丁 US5854205， WO9715666 它们是抑制肿瘤生 长的抗血管生成肽 Sim等，(2000)Cancer and Metastasis Reviews 19：181-190，Dhanabal(1999)Cancer Research 59：189-197 实体瘤和 癌症 制管张素 US5885795， US5792845 它们是抑制肿瘤生 长的抗血管生成肽 Sim等，(2000)Cancer and Metastasis Reviews 19：181-190 实体瘤和 癌症 Kringle 5 US5854221 它们是抑制肿瘤生 长的抗血管生成肽 Cao等，(1996)J.Biological Chemistry 271， 46：29461-29467；Cao等，(1997)J.Biological Chemistry 272，36：22924-22928；Lu等，(1999) Biochem.Biophysical Research Communications，258，668-673 实体瘤和 癌症
在多个实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白具有与治疗性蛋白质的 治疗活性和/或生物活性相对应的治疗活性和/或生物活性，所述治疗性蛋白 质对应于表1相应行所列白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分(参见例如表1 “生物活性”和“治疗性蛋白质X”栏)。在其它实施方案中，本发明的白 蛋白融合蛋白的治疗活性蛋白质部分是参照序列的片段或变体，并具有表1 “生物活性”一栏所公开的相应治疗性蛋白质的治疗活性和/或生物活性。
多肽和多核苷酸片段和变体
片段
本发明还涉及表1所述治疗性蛋白质、白蛋白和/或本发明的白蛋白融合 蛋白的片段。
即使从蛋白质的N-末端缺失一个或多个氨基酸会导致治疗性蛋白质、 白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的一或多种生物功能的修饰或损失，但仍会保 留其它的治疗活性和/或功能活性(例如生物活性、多聚化的能力、与配体结 合的能力)。例如，当从完整多肽的N-末端除去少部分残基时，N-末端具有 缺失的多肽一般仍会保留诱导和/或结合抗体的能力，所述抗体能识别完整 或成熟形式的多肽。通过本文所述和本领域已知的常规方法，可以容易地 测定缺乏完整多肽N-末端残基的特定多肽是否能保留所述免疫活性。N-末 端氨基酸残基大量缺失的突变蛋白也有可能保留一些生物活性或免疫原活 性。实际上，由少至6个氨基酸残基组成的肽经常也能引起免疫反应。
因此，对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性 蛋白质片段包括全长蛋白质，以及从参照多肽(如表1所述的治疗性蛋白质) 氨基酸序列的氨基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包括编码 这些多肽的多核苷酸。
另外，对应于本发明白蛋白融合蛋白中白蛋白部分的血清白蛋白多肽 片段包括全长蛋白质，以及从参照多肽(即血清白蛋白)氨基酸序列的氨基末 端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
另外，本发明的白蛋白融合蛋白的片段包括全长白蛋白融合蛋白，以 及从白蛋白融合蛋白的氨基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还 包括编码这些多肽的多核苷酸。
如上所述，即使从参照多肽(如治疗性蛋白质和/或血清白蛋白)的N-末 端或C-末端缺失一个或多个氨基酸会导致蛋白质一或多种生物功能的修饰 或损失，但仍会保留其它的功能活性(例如生物活性、多聚化的能力、与配 体结合的能力)和/或治疗活性。例如，当从完整或成熟多肽的C-末端除去少 部分残基时，C-末端具有缺失的多肽一般仍会保留诱导和/或结合抗体的能 力，所述抗体能识别完整或成熟形式的多肽。通过本文所述和本领域已知 的常规方法，可以容易地测定缺乏参照多肽的N-末端和/或C-末端残基的特 定多肽是否能保留治疗活性。
本发明还提供了从对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部 分的治疗性蛋白质(如表1所述的治疗性蛋白质)氨基酸序列的羧基末端缺失 一个或多个残基所得的多肽。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
另外，本发明还提供了从对应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部 分的白蛋白(如血清白蛋白)氨基酸序列的羧基末端缺失一个或多个残基所 得的多肽。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
另外，本发明还提供了从本发明的白蛋白融合蛋白的羧基末端缺失一 个或多个残基所得的多肽。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
另外，可以组合上述任何N-或C-末端缺失，以产生N-和C-末端缺失的 参照多肽(例如表1所述的治疗性蛋白质，或血清白蛋白(如SEQ ID NO：18)， 或本发明的白蛋白融合蛋白)。本发明还提供了氨基和羧基末端皆缺失了一 个或多个氨基酸的多肽。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
本申请还涉及含有多肽或其片段的蛋白质，所述多肽与本文所述的参 照多肽序列(例如治疗性蛋白质，血清白蛋白或本发明的白蛋白融合蛋白) 至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。在一些实施 方案中，本申请涉及含有多肽的蛋白质，所述多肽与如上所述的N-和C-末 端氨基酸序列有缺失的参照多肽至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98 ％或99％相同。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的其它多肽片段是含有下述氨基酸序列，或由其组成的片段， 所述氨基酸序列显示出治疗性蛋白质或血清白蛋白多肽序列的治疗活性和/ 或功能活性(如生物活性)，所述氨基酸序列是所述多肽序列的片段。
其它多肽片段是生物活性片段。生物活性片段是能表现出与本发明多 肽的活性类似，但不必相同的活性的那些片段。片段的生物活性包括经改 良的所需活性或降低的不必要的活性。
变体
“变体”指的是与参照核酸或多肽不同，但保留了其必需特性的多核 苷酸或核酸。一般说来，变体总体上非常类似，很多区域与参照核酸或多 肽相同。
本文所用“变体”指的是本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部 分，本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分，或白蛋白融合蛋白在序列上 分别与治疗性蛋白质(参见例如表1“治疗性蛋白质X”一栏)，白蛋白和/或 本发明的白蛋白融合蛋白有所不同，但如本文其它地方所述或如本领域所 知，前者仍能保留其至少一种功能和/或治疗特性(如表1“生物活性”一栏 所述的治疗活性和/或生物活性)。一般说来，变体总体上非常类似，很多区 域与对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白 质、对应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白、和/或本发明 的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列相同。本发明还包括编码这些变体的核酸。
本发明还涉及含有下述氨基酸序列或由其组成的蛋白质，所述氨基酸 序列与例如对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性 蛋白质(例如表1参考文献中公开的氨基酸序列，或其片段或变体)、对应于 本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如SEQ ID NO：18或其片 段或变体)、和/或本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列至少60％，80％，85 ％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同。本发明还提供了这些多 肽的片段(例如本文所述的片段)。本发明包括的其它多肽是由下述多核苷酸 编码的多肽，所述多核苷酸能在严紧杂交条件下(例如在约45℃，在6×氯化 钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合于滤膜上的DNA杂交，接着在约50-65℃，在 0.2×SSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤)，高度严紧条件下(例如在约45 ℃，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合于滤膜上的DNA杂交，接着在约68 ℃，在0.1×SSC，0.2％SDS中进行一次或多次洗涤)，或本领域技术人员已 知的其它严紧杂交条件下(参见例如Ausubel，F.M.et al.，eds.，1989 Current protocol in Molecular Biology，Green publishing associates，Inc.，and John Wiley & Sons Inc.，New York，at pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3)与编码本发明 氨基酸序列的核酸分子的互补物杂交。本发明还包括编码这些多肽的多核 苷酸。
具有与本发明的参照(query)氨基酸序列至少例如95％“相同的”氨基酸 序列的多肽指的是：目标多肽(subject polypeptide)的氨基酸序列与参照序列 相同，不同之处在于目标多肽序列可在参照氨基酸序列的每100个氨基酸中 包括多达5个氨基酸改变。换句话说，为了获得具有与参照氨基酸序列至少 95％相同的氨基酸序列的多肽，目标序列中多达5％的氨基酸残基被插入、 缺失或被另一种氨基酸取代。参照序列的这些改变可发生在参照氨基酸序 列的氨基-或羧基-末端位置或末端位置之间的任何位置，可以单个散布于参 照序列的残基中，也可以分布在参照序列的一个或多个邻接基团中。
实践中，使用已知的计算机程序即可常规地测定任何特定的多肽是否 与例如本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列或其片段(例如白蛋白融合蛋 白的治疗性蛋白质部分或白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)至少60％，80％，85 ％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。所述程序及其使用方法描述于 例如美国临时申请流水号60/355,547和WO01/79480(pp.41-43)(列入本文作 为参考)并且是本领域已知的。
本发明的多核苷酸变体可在编码区、非编码区或这两个区域含有改变。 多核苷酸变体包括含有改变的变体，所述改变能产生沉默取代、添加或缺 失，但不会改变所编码多肽的特性或活性。通过遗传密码简并性所致的沉 默取代即可产生所述核苷酸变体。多肽变体包括下述变体，其中少于50， 少于40，少于30，少于20，少于10，或5-50，5-25，5-10，1-5或1-2个氨基 酸以任意组合被取代、缺失或添加。产生多核苷酸变体的原因可以有多种， 例如，针对特定宿主最优化密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为微生 物宿主，如酵母或大肠杆菌优选的密码子)。
在另一个实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的 多核苷酸被最优化，以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在另一个实施方案 中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸被最优 化，以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在另一个实施方案中，编码本发明 的白蛋白融合蛋白的多核苷酸被最优化，以在酵母或哺乳动物细胞中表达。
在另一个实施方案中，在本文所述的严紧杂交条件下，编码本发明白 蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的密码子最优化的多核苷酸不与编码治 疗性蛋白质的野生型多核苷酸杂交。在另一个实施方案中，在本文所述的 严紧杂交条件下，编码本发明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密码子最优 化的多核苷酸不与编码白蛋白的野生型多核苷酸杂交。在另一个实施方案 中，在本文所述的严紧杂交条件下，编码本发明白蛋白融合蛋白的密码子 最优化的多核苷酸不与编码治疗性蛋白质部分或白蛋白部分的野生型多核 苷酸杂交。
在其它实施方案中，编码本发明白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分 的多核苷酸不含有该治疗性蛋白质的天然序列，或不由所述序列组成。在 其它实施方案中，编码本发明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不 含有该白蛋白的天然序列，或不由所述序列组成。在其它实施方案中，编 码本发明白蛋白融合蛋白的多核苷酸不含有治疗性蛋白质部分或白蛋白部 分的天然序列，或不由所述序列组成。
在其它实施方案中，由于没有天然野生型多核苷酸，因此可通过生物 淘选从随机肽文库中选择治疗性蛋白质。
天然变体被称为“等位变体”，它指的是占据生物染色体上的给定基因 座的几种可替换的基因形式之一(GenesII，Lewin，B.，ed.，John Wiley & Sons， New York(1985))。这些等位变体在多核苷酸和/或多肽水平上可以是不同 的，本发明欲包括这些等位变体。或者，可通过诱变技术或直接合成来产 生非-天然变体。
使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可以产生变体以改善或 改变本发明多肽的特性。例如，可以从本发明多肽的N-末端或C-末端缺失 一个或多个氨基酸，却基本上不会损失生物功能。参见例如Ron等，J.Biol. Chem.268：2984-2988(1993)(KGF变体)和Dobeli等，J.Biotechnology 7： 199-216(1988)(γ干扰素变体)。
另外，有足够的证据表明：变体经常保留有与天然蛋白质类似的生物 活性(例如Gayle等，J.Biol.Chem.268：22105-22111(1993)(IL-1a变体))。另 外，即使从多肽的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸会导致一种或多 种生物功能的修饰或损失，但仍会保留其它生物活性。例如，当从N-末端 或C-末端除去分泌形式的少部分残基时，缺失变体可能仍会保留诱导和/或 结合抗体的能力，所述抗体能识别分泌形式。通过本文所述和本领域已知 的常规方法，可以容易地测定缺乏蛋白质N-或C-末端残基的特定多肽是否 能保留所述免疫活性。
因此，本发明还包括具有功能活性(例如生物活性和/或治疗活性)的多肽 变体。在另一个实施方案中，本发明提供了具有功能活性(例如生物活性和/ 或治疗活性，如表1“生物活性”一栏中公开的活性)的白蛋白融合蛋白变体， 所述功能活性与对应于白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白 质的一种或多种生物和/或治疗活性相对应。所述变体包括根据本领域已知 的一般规则进行选择，因而对活性影响不大的缺失、插入、倒位、重复和 取代。
在其它实施方案中，本发明的变体具有保守取代。“保守取代”指组内 交换，例如替代脂肪族或疏水氨基酸Ala，Val，Leu和Ile；替代羟基残基Ser 和Thr；替代酸性残基Asp和Glu；替代酰胺残基Asn和Gln；替代碱性残基Lys， Arg和His；替代芳香族残基Phe，Tyr和Trp和替代小氨基酸Ala，Ser，Thr，Met 和Gly。
与如何制备表型沉默的氨基酸取代有关的教导可参见例如Bowie 等，″Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions.″Science 247：1306-1310(1990)，其中作者指出：有两个主要的 策略可用于研究氨基酸序列对改变的耐受性。
如作者所述，蛋白质对氨基酸取代有着惊人的耐受力。作者还指出： 蛋白质中某些氨基酸位置可能允许氨基酸发生变化。例如，隐藏最深的(位 于蛋白质的三级结构内)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的几个特 征一般是保守的。另外，能被耐受的保守氨基酸取代包括替代脂肪族或疏 水氨基酸Ala，Val，Leu和Ile；替代羟基残基Ser和Thr；替代酸性残基Asp和 Glu；替代酰胺残基Asn和Gln；替代碱性残基Lys，Arg和His；替代芳香族残 基Phe，Tyr和Trp和替代小氨基酸Ala，Ser，Thr，Met和Gly。
除了保守的氨基酸取代外，本发明的变体还包括(i)含有一个或多个非保 守的氨基酸残基取代的多肽，其中取代的氨基酸残基可以是也可以不是由 遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)含有一个或多个氨基酸残基取代的多肽， 所述氨基酸残基具有取代基，或(iii)与另一个化合物融合或化学偶联的多 肽，所述化合物是例如可增加多肽稳定性和/或溶解性的化合物(如聚乙二 醇)，(iv)含有其它氨基酸，例如IgG Fc融合区肽的多肽。可以相信：鉴于本 文的教导，本领域技术人员易于获得所述变体多肽。
例如，含有用其它带电或中性氨基酸对某些带电氨基酸进行的氨基酸 取代的多肽变体可产生具有改良特性，如较不易聚集的蛋白质。药物制品 的聚集因聚集物的免疫原性导致活性降低而清除难度增加。参见Pinckard et al.，Clin.Exp.Immunol.2：331-340(1967)；Robbins et al.，Diabetes 36：838-845 (1987)；Cleland et al.，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10：307-377 (1993)。
在具体实施方案中，本发明的多肽含有本文所述治疗性蛋白质和/或人 血清白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列的片段或变体， 或由其组成，其中当与参照氨基酸序列相比时，所述片段或变体具有1-5、 5-10、5-25、5-50、10-50或50-150个氨基酸残基的添加、取代和/或缺失。在 某些实施方案中，氨基酸取代是保守的。本发明还包括编码这些多肽的核 酸。
本发明的多肽可由通过肽键或经修饰的肽键互相连接的氨基酸，即肽 等排物组成，并可含有除了这20个由基因编码的氨基酸以外的氨基酸。可 以用其它天然的方法，如翻译后加工，或通过本领域众所周知的化学修饰 技术对多肽进行修饰。基础教科书和更详细的专著以及多篇研究文献中详 细描述了所述修饰。修饰可发生在多肽中的任何位置，包括肽主链，氨基 酸侧链和氨基或羧基末端。应懂得给定多肽的几个位点处可存在相同或不 同程度的相同类型的修饰。另外，给定多肽可含有多种类型的修饰。例如， 作为遍在蛋白化的结果，多肽可以是分支的，多肽也可以是具有或不具有 分支的环形。环形、分支、和带分支的环形多肽可以由翻译后的天然过程 产生，也可以通过合成方法制备得到。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖 基化、酰胺化、与黄素(flavin)共价结合、与血红素组成成分(heme moiety) 共价结合、与核苷酸或核苷酸衍生物共价结合、与脂质或脂质衍生物共价 结合、与磷脂酰肌醇共价结合、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形 成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、 形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、PEG化、蛋白酶 解加工、磷酸化、异戊二烯化(prenylation)、外消旋化、硒化、硫酸盐化 (sulfation)、由转运-RNA介导在蛋白质上添加氨基酸(如精氨酰化)，和遍在 蛋白化。
另外，可通过例如Current Opinions in Biotechnology，10：324(1999)中公 开的方法，使化学个体与本发明的白蛋白融合蛋白共价结合，以增强或调 制特定的功能或生物活性。
另外，可使靶向个体与本发明的白蛋白融合蛋白共价结合，从而将特 定的功能或生物活性靶向某些细胞或时期特异性类型、组织类型或解剖学 结构。通过定向使用本发明的白蛋白融合蛋白，药剂的作用即可限于局部。 另外，靶向可以使所需的本发明白蛋白融合蛋白的剂量减少，因为通过在 所需位点积累本发明的白蛋白融合蛋白，即可获得较高的局部浓度。通过 使用交联剂以及通过重组DNA技术，可以使本发明的白蛋白融合蛋白与靶 向部分偶联，其中通过重组DNA技术，将编码本发明的白蛋白融合蛋白的 核苷酸序列或其功能片段克隆到与配体的核苷酸序列(当配体是蛋白质时) 相邻的位置，再将偶联物表达为融合蛋白。靶向剂可以是任何单克隆抗体 或其活性部分，例如Fab或F(ab’)2片段，由内皮细胞表面受体识别的配体(天 然的或合成的)或其功能部分，或任何能与内皮细胞的蛋白质或结构相互作 用的其它试剂。
活性抗体部分，如抗体的Fab或F(ab’)2片段会保留与抗原/靶结合的能 力，但仅具有低水平的非特异性结合。通过蛋白酶消化，例如使用 ImmunoPure Fab和ImmunoPure F(ab′)2制备试剂盒(Pierce)，经固定化的A蛋 白和胃蛋白酶/木瓜蛋白酶消化，即可得到Fab或F(ab’)2片段。通过将抗体或 抗体片段还原成分开的重链和轻链，即可得到其它抗体活性部分。
被本发明的白蛋白融合蛋白/抗体偶联物或基因融合物靶向的分子可以 是内皮细胞表面分子，胞外基质组分，例如胶原、纤连蛋白或层粘连蛋白， 或其它血管壁结构。抗内皮表面抗原的单克隆抗体的例子包括识别CD34(一 种糖基化的内皮细胞表面跨膜蛋白)的Tuk3(Dako)和Qbend10(Serotec)。其 它抗内皮表面抗原的单克隆抗体包括：抗CD31(也已知为PECAM-1)的 9G11、JC70和Byl26(British Bio-technology)以及抗血小板反应蛋白受体 CD36抗原的ESIVC7(Kuzu et al(1992)J.Clin.Pathol.45，143-148)。识别内皮 细胞表面抗原的其它单克隆抗体的例子有QBend20，QBend30和QBend40 (Serotec)。
产生靶向抗体所用的内皮细胞表面分子可以是非-特异性的，并能识别 多种来自不同组织的不同内皮细胞类型，或者也可以特异于某些内皮细胞 类型。抗体A10-33/1(Serotec)识别转移黑素瘤中的内皮细胞，H4-7/33 (Serotec)识别小毛细血管的内皮细胞和多种肿瘤细胞，HM15/3(Serotec)识别 窦状隙内皮细胞，1F/10(Serotec)结合连续内皮上的250kD表面蛋白质。也可 以使用抗与瘀血和炎症有关之抗原的抗体。抗体4D10(Serotec)和BB11 (Benjamin et al(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.171，348-353)识别急 性发炎组织的内皮细胞上存在的ELAM-1。抗体4B9(Carlo，T.and Harlan，J. (1990)Immunol.Rev.114，1-24)识别VCAM粘附蛋白。抗体84H10(Makgabo， M.et al(1988)Nature 331，86-88)识别ICAM1粘附蛋白。抗体EN7/58(Serotec) 识别发炎内皮和粘附于内皮细胞的细胞上存在的抗原。抗体KG7/30识别发 炎组织和肿瘤内皮表面的FVIII相关蛋白。
细胞因子IL-1和TNF在体外能促使经培养的内皮细胞获得对多种外周 血白细胞的粘附能力(Bevilaqua，M.et al(1985)J.Clin.Invest.76，2003； Schleimer，R.et al(1986)J Immunol.136，649；Lamas，A.et al(1988)J. Immunol.140，1500；Bochner，B.et al(1988)J.Clin.Invest.81，1355)。所述粘 附与内皮细胞上多种粘附分子的诱导有关，所述粘附分子包括ICAM-1， ELAM-1，GMP-140(也已知为PADGEM或CD62)和VCAM-1。这些粘附分子 识别靶细胞表面的配对受体。VCAM-1识别已知为VLA-4，也已知为 CD49d/CD29和整联蛋白家族成员的抗原(Elices，M.et al(1990)Cell 60，577； Schwartz，B.et al(1990)J.Clin.Invest.85，2019)。ICAM-1识别已知为LFA-1， 也已知为CD11a/CD18的另一个整联蛋白家族成员的抗原(Martin，S.et al (1987)Cell 51，813-819；Fujita，H.et al(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm. 177，664-672)。ELAM-1和GMP，140(GMP，140也已知为CD62或PADGEM)识 别已知为LewisX，也已知为CD15或唾液酸，LewisX的抗原(Larsen，E.et al (1990)Cell 63，467-474；McEver，R.(1991)J.Cell.Biochem.45，156，161； Shimizu，Y.et al(1991)Nature 349，799；Picker，L.et al(1991)Nature 349， 796-798；Polley，M.et al(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88，6224-6228； Lowe，J.et al(1990)Cell 63，475-484；Tiemeyer，M.et al(1991)Proc.Natl. Acad Sci.USA.88，1138-1142)。
已证实抗内皮细胞表面表达的受体或反应细胞表面的配对受体的单克 隆抗体能阻断所述细胞-细胞识别所需组分之间的相互作用，对建立识别模 式有所帮助(见上文参考文献)。
因此，本发明的一个方面是提供通过给哺乳动物施用本发明的融合蛋 白，将抗血管生成肽靶向哺乳动物细胞内部或细胞结构上的方法。
本发明的另一方面提供了本发明的白蛋白融合蛋白与特异性结合内皮 细胞的组成成分的偶联物。
通过交联或通过重组DNA技术，可以将本发明的白蛋白融合蛋白与天 然或合成配体偶联，所述配体能与内皮细胞表面的受体相互作用。所述配 体包括生长因子，例如血管透性因子(Gitay-Goren，H.et al(1992)J.Biol. Chem.267，6093-6098；Bilcfalin，A.et al(1991)J.Cell.Phys.149，50-59； Tischer，E.et al(1991)266，11947-11954；Conn，G.et al(1990)PNAS 87， 2628-2632；Keck，P.et al(1989)Science 246，1309-1312；Leung，D.W.et al (1989)Science 246，1306-1309)；血小板衍生生长因子(Beitz，J.et al(1991) PNAS 88，2021-2025)；以及其它生物分子，如运铁蛋白和尿激酶(Haddock， R.et al(1991)J.Biol.Chem.266，21466-21473)。偶联物的配体结构域由该配 体的内皮细胞表面受体识别，并且会将本发明的白蛋白融合蛋白靶向内皮。
也可通过使本发明的白蛋白融合蛋白与特定粘附分子的配对受体交 联，而将所述药剂导向所述粘附分子。例如，在ELAM-1介导的粘附中，配 对受体是已知为Lewis-X或唾液酸化Lewis-X的糖类决定簇。可以使用具有该 末端结构的合成糖类(Kameyama，A.et al(1991)Carbohydrate.Res.209， C1-C4)或纯化自天然来源的糖类，例如LNFIII(Calbiochem)。末端的Lewis-X 或唾液酸Lewis-X决定簇可以与本发明的白蛋白融合蛋白内的游离 sulphydryl基团交联。这样就可以使药剂特异性靶向呈递ELAM-1粘附分子的 内皮细胞。
该组成成分可以是抗内皮细胞表面受体，如ICAM-1，ELAM-1， GMP-140或VCAM-1的单克隆抗体。或者，该组成成分可以是其自身的配对 受体或其功能部分。通过下述方法可获得融合：i)如果是单克隆抗体或配对 受体，可通过本领域已知的技术使组成成分化学交联以完成融合，或ii)通过 重组DNA技术使得单多肽链形式的组成成分在适当宿主中被表达成与药剂 的基因融合物，从而完成融合。
多种细胞-或时期-特异性抗体已被描述。它们包括例如抗内皮细胞粘附 分子的抗体，包括抗体BB11(抗-ELAM，Benjamin，C.et al(1990)，Biochem. Biophys.Res.Commun.171，348-353)、抗体4B9(抗-VCAM，Carlo，T.and Harlan，J.(1990)Immunol.Rev.114，1-24)和抗体84H10(抗-ICAM1，Makgobo， M.et al(1988)Nature 331，86-88)。这些抗体或与之类似的抗体可与本发明的 白蛋白融合蛋白共价连接。通过基因融合可达到此目的，其中编码本发明 的白蛋白融合蛋白的核苷酸序列被剪接至编码抗体或scFv重链或轻链的基 因内。或者，可经由多种双-功能交联剂中的一种使药剂与抗体共价交联， 所述交联剂如：二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)；双(硫代琥珀酰亚胺基)辛 二酸酯(BS3)；二甲基己二酰亚胺(dimethyl adipimidate)-2 HCl(DMA)；二甲 基庚二酰亚胺(dimethyl pimelimidate)-2 HCl(DMP)；二甲基辛二酰亚胺 (dimethyl suberimidate)-2 HCl(DMS)；双马来酰亚胺己烷(BMH)；m-马来酰 亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；m-马来酰亚胺-苯甲酰基-N-羟基 硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-MBS)；琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯 (SMPB)；硫代琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(硫代-SMPB)；N- 琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)；硫代琥珀酰亚胺基(4-碘乙 酰基)氨基苯甲酸酯(硫代-SIAB)；琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己 烷-1-羧酸酯(SMCC)；硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸 酯(硫代-SMCC)或1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)，(Pierce)。
也可以使用能识别与恶性转化和血管生成相关之抗原的抗体：例如识 别恶性转化内皮细胞特征性抗原的EN2/3(Serotec；识别处于增殖、迁移和 生长中的内皮细胞上呈递的血管生成相关抗原的EN7/44(Serotec)；和识别 血管母细胞、血管瘤、血管肉瘤、以及牛皮癣和关节炎组织中的血管周细 胞(perivascular cell)中的内皮细胞的H3-5/47。
或者，被靶向部分识别的个体可以是在肿瘤细胞中特异性表达，而在 不希望导入本发明的白蛋白融合蛋白的细胞中不表达，或至少表达频率低 的适当个体。被识别的个体通常是抗原。抗原的例子包括下表2中列出的那 些抗原。与这些抗原中的多种特异性结合的单克隆抗体是已知的，但在任 何情况下，使用目前与单克隆抗体技术相关的技术，可以制备出抗大多数 抗原的抗体。抗原-特异性部分可以是整个抗体(通常为了方便与专一性起 见，为单克隆抗体)或其一个或多个部分(例如Fab片段，F(ab’)2或“最小识 别单位”)或合成抗体或其部分。仅含有抗体的一部分的化合物较为有利， 因为它不太可能因Fc部分而遭遇非-特异性结合。通过已知技术，例如 ″Monoclonal Antibodies：A manual oftechniques″，H.Zola(CRC Press，1988)和 ″Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications″，J.G.R. Hunell(CRC Press，1982)中公开的技术，可以制备抗选定抗原的适当单克隆 抗体。本说明书中提及的所有参考文献皆列入本文作为参考。通过细胞融 合，通过再连接单价片段或通过化学交联整个抗体即可制备出双特异性抗 体，其中所得双特异性抗体的一部分抗细胞-特异性抗原，其余部分抗本发 明的白蛋白融合蛋白。双特异性抗体可以与本发明的白蛋白融合蛋白一起 施用，或者也可以先施用所述抗体，再施用本发明的白蛋白融合蛋白。优 选前一方式。制备双特异性抗体的方法公开于Corvalan et al(1987)Cancer Immunol.Immunother.24，127-132和133-137和138-143。Williams，Tibtech， February 1988，Vol.6，36-42，Neuberger等(8th International Biotechnology Symposium，1988，Part 2，792-799)以及Tan和Morrison(Adv.Drug Delivery Reviews 2，(1988)，129-142)一般性地讨论了双特异性抗体、嵌合抗体和单链 抗体。可以用已知方法，例如通过将小鼠抗体的CDR区插入人抗体的构架 区，来使适当制备的非-人抗体“人源化”。优选IgG类抗体。
                            表2
1.肿瘤相关抗原
抗原                  抗体                 现有用途
癌胚抗原85A12          C46(Amersham)         结肠/直肠肿瘤的成象&治疗
(Unipath)
胎盘碱性磷酸酶         H17E2(ICRF，Travers & 睾丸和卵巢癌的成象&治疗
                       Bodmer)
全癌                   NR-LU-10(NeoRx公司)   包括小细胞肺癌的多种癌的成象
                                             &治疗
多态上皮粘蛋白(人乳    HMFG1(Taylor-         卵巢癌，胸膜渗漏的成象&治疗
脂球蛋白)              Papadimitriou，ICRF)
β-人绒毛膜促性腺素    W14                   将酶(CPG2)靶向至裸鼠中的人异
                                             种移植绒毛膜癌(Searle等(1981)
                                             Br.J.Cancer 44，137-144)
人癌上的糖类           L6(IgG2a)1           靶向碱性磷酸酶(Searle等(1988)
                                             P.N.A.S.85，4842-4846)
B淋巴瘤(正常的和致     1F5(IgG2a)2          靶向碱性磷酸酶(Searle等(1988)
瘤性的)上的CD20抗原                          P.N.A.S.85，4842-4846)
1Hellstrom等(1986)Cancer Res.46，3917-3923
2Clarke等(1985)P.N.A.S.82，1766-1770
其它抗原包括甲胎蛋白、Ca-125和前列腺特异性抗原。
2. 免疫细胞抗原
全T淋巴细胞表   OKT-3(Ortho)                作为肾移植的抗-排斥疗法
面抗原(CD3)
B-淋巴细胞表    RFB4(Janossy，Royal Free    B细胞淋巴瘤的免疫毒素疗法
面抗原(CD22)    Hospital)
全T淋巴细胞表   H65(Bodmer，Knowles ICRF，  急性移植物抗宿主疾病，类风湿性关
面抗原(CD5)     美国Xoma公司得到许可)       节炎的免疫毒素疗法
如果用于治疗CML或ALL，配体结合分子可以是抗白血病-相关抗原的 单克隆抗体。例如：Foon，K.A等，1986 Blood 68(1)，1-31，“Review： Immunologic Classification of Leukemia and Lymphoma”中描述的抗 -CALLA(共有急性淋巴母细胞白血病-相关抗原)、J5、BA-3、RFB-1、BA-2、 SJ-9A4、Du-ALL-1、抗-3-3、抗-3-40、SN1和CALL2。配体结合分子也可以 是鉴定髓样细胞表面抗原的抗体，或分别与B或T淋巴细胞反应的抗体。所 述抗体的例子是如Foon，K.A.(文献同上)所述的鉴定人髓样细胞表面抗原的 抗体，或与人B或T淋巴细胞反应的抗体。其它例子是抗体B43，也可以使用 与B淋巴细胞反应的CD22和CD19。
或者，被识别的个体可以是抗原性的，也可以不是抗原性的，但能以 一些其它方式被识别和选择性结合。例如，所述个体可以是特征性的细胞 表面受体，如黑素瘤细胞中大量表达的促黑激素(MSH)受体。靶向部分可以 是以非-免疫方式，如作为细胞表面酶的底物或其类似物或作为信使与个体 特异性结合的化合物或其部分。对黑素瘤细胞而言，靶向部分可以是MSH 自身或其能与MSH受体结合的部分。所述MSH肽描述于例如Al-Obeidi等 (1980)J.Med.Chem.32，174。特异性可以是间接的：先施用细胞-特异性的 第一抗体，接着施用针对第一抗体的本发明的偶联物。优选被识别的个体 根本不分泌至体液中，否则则无法获得必需的特异性。
可以通过任何常规连接化合物的方法，例如通过二硫键、酰胺键或硫 酯键，如Goodchild，文献同上或Connolly(1985)Nucl.Acids Res.13(12)， 4485-4502或PCT/US85/03312中一般性描述的方法，使本发明该实施方案的 偶联物的靶向部分与本发明的白蛋白融合蛋白连接。
本发明包括的其它翻译后修饰包括例如：N-联或O-联糖链，加工N-末 端或C-末端，使化合物组成成分(chemical moiety)与氨基酸主链结合，对N- 联或O-联糖链进行化学修饰，以及作为原核宿主细胞表达的结果添加或缺 失N-末端甲硫氨酸残基。也可以用例如但不限于如药物的化学治疗剂和/或 如酶、荧光、同位素和/或亲和标记的可测标记来修饰白蛋白融合蛋白，以 检测和分离蛋白质。所述修饰的例子是本领域已知的，参见例如美国临时 申请流水号60/355,547和WO01/79480(pp.105-106)(列入本文作为参考)。
功能活性
“具有功能活性的多肽”指的是能显示出一或多种与全长、前蛋白质 和/或成熟形式的治疗性蛋白质相关的已知功能活性的多肽。所述功能活性 包括但不限于：生物活性、抗原性[结合(或与多肽竞争结合)抗-多肽抗体的 能力]、免疫原性(产生能与本发明的特异性多肽结合的抗体的能力)、与本 发明的多肽形成多聚体的能力以及与多肽的受体或配体结合的能力。
“具有生物活性的多肽”指的是：经特殊生物学试验测定，表现出与 本发明治疗性蛋白质(包括其成熟形式)的依赖或不依赖于剂量的活性类似， 但不必相同之活性的多肽。在依赖于剂量的情况下，不必与本发明多肽的 活性相同，而只需与本发明多肽给定活性的剂量-依赖性基本上类似即可。
在其它实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白具有至少一个与未同白 蛋白融合的治疗性蛋白质(或其片段或变体)相关的生物和/或治疗活性。
可以使用或常规改动本领域已知的试验以及本文所述的试验，来检测 本发明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如生物活性)。具体地说，可以使用 表1“相关出版物”一栏中提及的试验来检测白蛋白融合蛋白的功能活性(例 如生物活性或治疗活性)。另外，本领域技术人员可以使用表1相应行中提及 的试验，常规检测对应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的 治疗性蛋白质片段的活性。另外，本领域技术人员可以使用本领域已知和/ 或美国临时申请流水号60/355,547和WO01/79480实施例部分描述的试验， 常规检测对应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白片段的活 性。
另外，可以使用本文所述(参见实施例和表1)和本领域已知的试验常规 测定本发明的白蛋白融合蛋白及其片段、变体和衍生物引发生物活性和/或 治疗活性(体外或体内)的能力，所述活性与本发明白蛋白融合蛋白的治疗性 蛋白质部分和/或白蛋白部分有关。其它方法是本领域技术人员已知的，也 落入本发明的范围之内。
抗-血管生成活性
在血管生成内源性刺激物和抑制物之间的天然平衡中，抑制影响占据 优势。Rastinejad et al.，Cell 56：345-355(1989)。对于罕见的在正常生理状态下 发生新血管生成的情况，如创伤愈合、器官再生、胚胎发育、和雌性生殖 过程而言，血管生成被严格调节，并且在空间和时间上受到限制。在病理 性血管生成，如成为实体肿瘤生长之特性的血管生成的状态下，这些调节 控制无法起作用。失控的血管生成成为病理性的，并继续发展成多种致瘤 和不致瘤的疾病。多种严重疾病受异常新血管生成的控制，所述疾病包括 实体肿瘤生长和转移、关节炎、一些类型的眼病和牛皮癣。参见例如Moses et al.，Biotech.9：630-634(1991)；Folkman et al.，N Engl.J.Med.，333： 1757-1763(1995)；Auerbach et al.，J.Microvasc.Res.29：401-411(1985)； Folkman，Advances in Cancer Research，eds.Klein and Weinhouse，Academic Press，New York，pp.175-203(1985)；Patz，Am.J.Opthalmol.94：715-743 (1982)；和Folkman et al.，Science 221：719-725(1983)的综述。在多种病理学 状态中，血管生成的进程对疾病状况起重要作用。例如，已积累了重要的 数据，可以表明实体肿瘤的生长依赖于血管生成。Folkman and Klagsbrun， Science 235：442-447(1987)。
本发明提供了通过施用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融 合蛋白的多核苷酸来治疗与新血管生成相关之疾病的方法。可以用本发明 的多核苷酸和多肽或激动剂或拮抗剂治疗的恶性和转移疾病包括但不限于 本文所述和本领域已知的恶性肿瘤、实体肿瘤和癌症(有关所述疾病的评述 可参见Fishman等，Medicine，2d Ed.，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia(1985))。 因此，本发明提供了治疗血管生成-相关疾病的方法，所述方法包括给需要 治疗的个体施用治疗有效量的本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明的 白蛋白融合蛋白的多核苷酸。例如，可以在多种旨在治疗癌症或肿瘤的方 法中使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷 酸。可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸 治疗的癌症包括但不限于实体肿瘤，包括前列腺、肺、乳腺、卵巢、胃、 胰腺、喉、食管、睾丸、肝脏、腮腺、胆道、结肠、直肠、宫颈、子宫、 子宫内膜、肾脏、膀胱、甲状腺癌；原发性肿瘤和转移；黑素瘤；胶质母 细胞瘤；卡波济氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)；平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)；非 -小细胞肺癌；结肠直肠癌；晚期恶性肿瘤；和血液肿瘤，如白血病。例如， 可以局部传递本发明的融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核 苷酸，以治疗诸如皮肤癌、头颈肿瘤、乳腺癌和卡波济氏肉瘤的癌症。
在其它方面，通过例如膀胱内给药，可以使用本发明的融合蛋白和/或 编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗浅表形式的膀胱癌。可以 经由注射或导管，将本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融 合蛋白的多核苷酸直接传递至肿瘤，或接近肿瘤位点。当然，本领域技术 人员应懂得适当的给药方式会随着欲治疗癌症的不同而改变。本文讨论的 是其它传递方式。
本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷 酸可用于治疗除癌症外的其它与血管生成有关的疾病。这些疾病包括但不 限于：良性肿瘤(benign tumor)，例如血管瘤(hemangiomas)、听神经瘤(acoustic neuromas)、神经纤维瘤(neurofibromas)、沙眼(trachomas)和脓性肉芽肿 (pyogenic granulomas)；动脉粥样硬化性斑(artheroscleric plaque)；眼血管生 成病(ocular angiogenic disease)，如糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、 早熟视网膜病(retinopathy of prematurity)、黄斑变性(macular degenerateion)、 角膜移植物排斥(corneal graft rejection)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)；晶体后纤维增生症(retrolental fibroplasia)、发红(rubeosis)、视网 膜母细胞瘤(retinoblastoma)、眼色素层炎(uvietis)和翼状胬肉(Pterygia)(异常 血管生长)；类风湿性关节炎；牛皮癣；创伤愈合延迟(delayed wound healing)； 子宫内膜异位(endometriosis)；血管发生(vasculogenesis)；肉芽发生 (granulateon)；肥大性瘢痕(hepertrophic scar)(瘢痕疙瘩(keloids))；骨不连合 性骨折(nonunion fracture)；硬皮病(scleraoderma)；沙眼；血管粘连(vascular adhesion)；心肌血管生成(myocardial angiogenesis)；冠状侧突(coronary collaterall)；大脑侧突(cerebral collateral)；动静脉畸形(arteriovenous malformation)；局部缺血性肢体血管生成(ischemic limb angiogenesis)；奥斯 勒综合征(Osler-Webber Syndrome)；斑新血管生成(plaque neovascularization)；毛细管扩张(telangiectasia)；血友病关节(hemophiliac joints)；血管纤维瘤(angiofibroma)；纤维肌性发育不良(fibromuscular dysplasia)；伤口肉芽发生(wound granulation)；节段性回肠炎(Crohn’s disease)；和动脉粥样硬化(atherosclerosis)。
例如，一方面，本发明提供了治疗肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩的方法，所 述方法包括给肥大性瘢痕或瘢痕疙瘩施用本发明的白蛋白融合蛋白和/或编 码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸的步骤。
在本发明的一个实施方案中，将本发明的融合蛋白和/或编码本发明的 白蛋白融合蛋白的多核苷酸直接注射至肥大性瘢痕或瘢痕疙瘩以预防这些 损害进一步发展。该疗法对预防性治疗已知可导致肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩 产生的疾病(如烧伤)特别有价值，任选在增殖期发展一段时间之后(最初烧 伤后约14天)，但在肥大性瘢痕或瘢痕疙瘩产生之前启动所述疗法。如上所 述，本发明还提供了治疗眼新血管疾病的方法，所述疾病包括例如角膜新 血管生成、新生血管性青光眼、增殖性糖尿病性视网膜病、晶体后纤维增 生症和黄斑变性。
另外，可以用本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合 蛋白的多核苷酸治疗的、与新血管生成有关的眼病包括但不限于：新生血 管性青光眼、糖尿病性视网膜病、视网膜母细胞瘤、晶体后纤维增生症、 色素层炎、早熟视网膜病、黄斑变性、角膜移植物新血管生成以及其它眼 炎性疾病，眼肿瘤和与脉络膜或虹膜新血管生成有关的疾病。参见例如 Waltman et al.，Am.J.Ophthal.85：704-710(1978)和Gartner et al.，Surv.Ophthal. 22：291-312(1978)的评述。
因此，一方面，本发明提供了治疗眼新血管疾病，如角膜新血管生成(包 括角膜移植物新血管生成)的方法，所述方法包括给患者角膜施用治疗有效 量的化合物(如本发明的融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多 核苷酸)，从而使血管形成受到抑制的步骤。简单地说，角膜通常是缺乏血 管的组织。然而，在某些病理学状态下，毛细血管会从角膜缘的角膜外周 血管丛伸展至角膜内。当角膜被血管化时，就会布满阴影，导致患者视力 下降。如果角膜完全混浊，视力就会完全丧失。多种疾病会导致角膜新血 管生成，包括例如角膜感染(如沙眼、单纯疱疹病毒引起的角膜炎、利什曼 病(leishmaniasis)和河盲症(onchocerciasis))、免疫过程(例如移植物排斥和 Stevens-Johnson综合征)、碱烧伤(alkali burn)、创伤、炎症(任何病因)、中毒 和营养缺乏状态和配戴隐形眼镜的并发症。
在本发明的其它实施方案中，可以在盐水中配药(与常规用于眼制剂的 任何防腐剂和抗菌剂联合使用)以供局部给药，并且以滴眼液的形式给药。 可以制备纯的溶液或悬浮液，每天分几次给药。或者，也可以将按上文所 述方法制备的抗-血管生成组合物直接施用于角膜。在其它实施方案中，使 用与角膜结合的粘膜-粘附聚合物来制备抗-血管生成组合物。在其它实施方 案中，抗-血管生成因子或抗-血管生成组合物可用作常规类固醇疗法的附加 剂。局部疗法也可用于预防角膜损害，已知所述损害很可能会诱发血管生 成反应(如化学烧伤)。在这些情况下，可立即实行可能与类固醇联用的该疗 法，这样有助于防止随后的并发症。
在其它实施方案中，可由眼科专家在显微镜下将上述化合物直接注射 至角膜基质。注射位点可根据各个损害的形态学的不同而改变，但给药的 目标是将组合物放置于脉管系统的前方(即散布于血管和正常角膜之间)。在 大多数情况下，会进行缘周角膜注射以“保护”角膜，使其与前方的血管 分开。也可以在角膜损伤后马上使用该方法以预防性地防止角膜新血管生 成。此时，可将材料注射至散布于角膜损害及其不必要的潜在缘血液供给 之间的缘周角膜。也可以按类似的方式使用该方法以防止毛细血管侵入移 植的角膜。缓释形式的注射每年仅需要2-3次。也可以在注射溶液中添加类 固醇以减少注射本身所导致的炎症。
在本发明的另一方面，提供了治疗新生血管性青光眼的方法，所述方 法包括给患者的眼睛施用治疗有效量的本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码 本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸，从而使血管形成受到抑制的步骤。 在一个实施方案中，可以给眼局部施用化合物以治疗早期形式的新生血管 性青光眼。在其它实施方案中，通过注射至前房角区域来植入化合物。在 其它实施方案中，也可将化合物置于任何位置，从而使化合物连续释放至 水状体。在本发明的另一方面，提供了治疗增殖性糖尿病性视网膜病的方 法，所述方法包括给患者的眼睛施用治疗有效量的本发明的白蛋白融合蛋 白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸，从而使血管形成受到抑 制的步骤。
在本发明的其它实施方案中，通过注射至水状体液(aqueous humor)或玻 璃体(vitreous)以增加视网膜中多核苷酸、多肽、拮抗剂和/或激动剂的局部 浓度，以治疗增殖性糖尿病性视网膜病。在获得需要光凝固法的严重疾病 之前即可开始此疗法。
在本发明的另一方面，提供了治疗晶体后纤维增生症的方法，所述方 法包括给患者的眼睛施用治疗有效量的本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码 本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸，从而使血管形成受到抑制的步骤。 可经由玻璃体内注射和/或眼球内植入局部施用该化合物。
另外，可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多 核苷酸治疗的疾病包括但不限于：血管瘤、关节炎、牛皮癣、血管纤维瘤、 动脉粥样硬化性斑、创伤愈合延迟、肉芽发生、血友病关节、肥大性瘢痕、 骨不连合性骨折、奥斯勒综合征、脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼和血管粘连。
另外，可用本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋 白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预测的疾病包括但不限于：实体肿瘤， 如白血病的血液肿瘤，肿瘤转移，卡波济氏肉瘤，良性肿瘤，例如血管瘤， 听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼和脓性肉芽肿，类风湿性关节炎，牛皮癣， 眼血管生成病，如糖尿病性视网膜病，早熟视网膜病，黄斑变性，角膜移 植物排斥，新生血管性青光眼，晶体后纤维增生症，发红，视网膜母细胞 瘤和眼色素层炎，创伤愈合延迟，子宫内膜异位，血管发生，肉芽发生， 肥大性瘢痕(瘢痕疙瘩)，骨不连合性骨折，硬皮病，沙眼，血管粘连，心肌 血管生成，冠状侧突，大脑侧突，动静脉畸形，局部缺血性肢体血管生成， 奥斯勒综合征，斑新血管生成，毛细管扩张，血友病关节，血管纤维瘤， 纤维肌性发育不良，伤口肉芽发生，节段性回肠炎，动脉粥样硬化，通过 防止胚胎植入所需的血管生成和控制月经来起作用的节育剂，以血管生成 作为病理学结果的疾病，如猫抓病(Rochele minalia quintosa)，溃疡(幽门螺 杆菌(Helicobacter pylori))，巴尔通体病(Bartonellosis)和杆菌性血管瘤病 (bacillary angiomatosis)。
在节育法(birth control method)的一个方面，在性交和受精发生之前或之 后施用其量足以阻断胚胎植入的化合物，从而提供有效的节育法，有可能 是“morning after”法。本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白 融合蛋白的多核苷酸也可用于控制月经，或在治疗子宫内膜异位时作为腹 膜灌洗液或腹膜植入物被施用。
为了防止缝线肉芽肿，可将本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明 的白蛋白融合蛋白的多核苷酸掺入外科缝线。
本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷 酸可用于多种外科方法。例如，在本发明的一个方面，可在切除肿瘤之前 用组合物(以喷雾剂或薄膜的形式)包被或喷射肿瘤区域，以将正常的周围组 织与恶性组织分开和/或防止疾病扩散至周围组织。在本发明的其它方面， 可经由内窥镜方法传递组合物(例如以喷雾剂的形式)以包被肿瘤，或抑制所 需区域的血管生成。在本发明的其它方面，可以在任何可能会用到外科网 的方法中使用已用本发明的抗-血管生成组合物包被的外科网。例如，在本 发明的一个实施方案中，可在腹部癌症切除外科手术中(例如在切除结肠之 后)使用负载了抗-血管生成组合物的外科网，从而为结构提供支撑并释放一 定量的抗-血管生成因子。
在本发明的其它方面，提供了治疗肿瘤切除位点的方法，所述方法包 括在切除之后在肿瘤的切除边缘使用本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本 发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸，从而抑制癌症的局部复发和在该位点 处形成新血管。在本发明的一个实施方案中，将抗-血管生成化合物直接施 用于肿瘤切除位点(如通过用抗-血管生成化合物拭、刷或包被肿瘤的切除边 缘来给药)。或者，在给药前将抗-血管生成化合物掺入已知的外科糊剂。在 本发明的具体实施方案中，在肝脏恶性肿瘤切除之后和神经外科手术之后 使用抗-血管生成化合物。
在本发明的一个方面，可在包括例如乳腺、结肠、脑和肝脏肿瘤的多 种肿瘤的切除边缘施用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋 白的多核苷酸。例如，在本发明的一个实施方案中，可在切除之后将抗-血 管生成化合物施用于神经肿瘤位点，从而抑制该位点处新血管的形成。
本发明的白蛋白融合蛋白和/或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷 酸也可与其它抗-血管生成因子，如美国临时申请流水号60/355,547和 WO01/79480中所述的那些因子一起施用。
融合蛋白的表达
通过从酵母、如细菌的微生物或人或动物细胞系中分泌，可产生重组 分子形式的本发明的白蛋白融合蛋白。任选从宿主细胞中分泌多肽。
为了表达本文例举的白蛋白融合蛋白，成功地联合使用了WO95/33833 中例举的HSP150基因被破坏的酵母菌株，或WO00/44772中例举的PMT1基 因被破坏的酵母菌株[rHA法](用于降低/消除白蛋白融合蛋白的O-连接糖基 化)，或WO95/23857中例举的YAP3基因被破坏的酵母菌株，以及酵母PRB1 启动子，WO90/01063中例举的HSA/MFα-1融合前导序列，酵母ADH1终止 子，LEU2选择标记和US5,637,504中例举的去整合载体pSAC35。
列入本文作为参考的美国临时申请流水号60/355,547和 WO01/74980(pp.94-99)中描述了有望用于本发明的其它酵母菌株、启动子、 前导序列、终止子、标记和载体，它们也是本领域众所周知的。
本发明还包括经转化可表达本发明的白蛋白融合蛋白的细胞，任选为 酵母细胞。除了经转化的宿主细胞本身，本发明还包括这些细胞在营养培 养基中的培养物，任选为单克隆(克隆均一的)培养物，或得自单克隆培养物 的培养物。如果多肽被分泌出来，培养基中会含有多肽和细胞，如果经过 滤或离心就不含细胞。很多表达系统是已知的和可用的，包括细菌(例如大 肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))，酵母(例如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕 赤酵母(Pichia pastoris))，丝状真菌(例如曲霉(Aspergillus))，植物细胞，动物 细胞和昆虫细胞。
可以用常规方法，例如由插入宿主染色体或游离质粒上的编码序列产 生所需的蛋白质。按照任何常规的方法，例如电穿孔，用所需蛋白质的编 码序列转化酵母。通过电穿孔转化酵母的方法公开于Becker & Guarente (1990)Methods Enzymol.194，182。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的 DNA构建体的细胞。例如，可培养导入表达构建体所得的细胞以产生所需 多肽。收集并裂解细胞，使用如Southern(1975)J.Mol.Biol.98，503或Berent et al(1985)Biotech.3，208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。 或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。
有用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416，它们一般可购自 Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037，USA。质粒pRS403，pRS404， pRS405和pRS406是酵母整合质粒(YIp)，它们与酵母选择标记HIS3，TRP1， LEU2和URA3合用。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(YCp)。
在酵母中表达制备白蛋白融合蛋白所用的载体包括于2001年4月11日 保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas， Virginia 20110-2209，并且描述于临时申请流水号60/355,547和 WO01/79480(列入本文作为参考)中的pPPC0005，pScCHSA，pScNHSA和 pC4:HSA。
另一个有望用于在酵母中表达白蛋白融合蛋白的载体是Sleep et al.， BioTechnology 8：42(1990)(全文列入本文作为参考)中描述的pSAC35载体。 质粒pSAC35是US5,637,504中描述的去整合类载体。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使DNA与载体可操作相 连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。 然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分 子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载 体的方法。用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切 核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3’，5’-核酸外切 活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性 的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬 菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保 温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的 限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶 能产生与所述DNA区段相容的末端。
从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
例如，如果欲制备HA变体，修饰本发明DNA的合乎需要的方法是使用 Saiki et al(1988)Science 239，487-491所公开的聚合酶链反应。在此方法中， 被酶促扩增的DNA的侧翼为两个特异性的寡核苷酸引物，所述引物自身掺 入扩增的DNA。特异性引物可含有限制性内切核酸酶识别位点，使用本领 域已知的方法可将所述位点克隆至表达载体。
有望用于本发明实践作为表达白蛋白融合蛋白宿主的酵母属的例子 有：毕赤酵母属(Pichia)(以前被分类为汉逊酵母属(Hansenula))、糖酵母属 (Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、曲霉属、假丝酵母属 (Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖糖酵 母属(Schizosaccharomyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、Pachysolen、接合糖 酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaromyces)、木霉属 (Trichoderma)、头孢属(Cephalosporium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属 (Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、Yarrowia、梅奇酵母属(Metschunikowia)、 红冬孢属(Rhodosporidium)、Leucosporidium、Botryoascus、锁掷酵母属 (Sporidiobolus)、拟内孢霉属(Endomycopsis)等。酵母属包括选自糖酵母属、 裂殖糖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属和有孢圆酵母属的属。糖酵母 属的种的例子为酿酒酵母、意大利糖酵母(S.italicus)和鲁氏糖酵母(S. rouxii)。其它种的例子和转化它们的方法描述于美国临时申请流水号 60/355,547和WO01/79480(pp.97-98)(列入本文作为参考)。
EP251744，EP258067和WO90/01063(列入本文作为参考)中一般性教导 了转化酿酒酵母的方法。
用于酿酒酵母的适当启动子包括那些与下述基因相关的启动子：PGKI 基因、GAL1或GAL10基因、CYCI、PHO5、TRPI、ADHI、ADH2、甘油醛-3- 磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、丙糖磷酸异构酶、 磷酸葡萄糖异构酶、葡糖激酶、α-交配因子信息素(alpha-mating factor pheromone)[一种交配因子信息素]基因，以及PRBI启动子、GUT2启动子、 GPDI启动子和杂合启动子，所述杂合启动子包括部分5’调节区与其它启动 子的部分5’调节区或上游激活位点的杂合体(例如EP-A-258 067的启动子)。
用于粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的适当可调节的启动 子是Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265，10857-10864所述的nmt基因的硫胺 素-阻抑型启动子和Hoffman&Winston(1990)Genetics 124，807-816所述的 葡萄糖阻抑型jbp1基因启动子。
转化毕赤酵母以表达外源基因的方法可参见例如Cregg et al.(1993)和 Philips的多项专利(例如US4857467，列入本文作为参考)，毕赤酵母表达试 剂盒可购自Invitrogen BV，Leek，Netherlands和Invitrogen Corp.，San Diego， California。适当的启动子包括AOXI和AOX2。Gleeson et al.(1986)J.Gen. Microbiol.132，3459-3465包括与汉逊酵母载体和转化有关的信息，适当的启 动子是MOX1和FMD1；而EP361991以及Fleer et al.(1991)和Rhone-Poulenc Rorer的其它出版物教导了如何在克鲁维酵母的种中表达外源蛋白质。
转录终止信号可以是真核基因的3’侧翼序列，其含有适当的转录终止和 聚腺苷酸化信号。适当的3’侧翼序列可以是例如与所用表达控制序列天然相 连的基因的3’侧翼序列，即所述侧翼序列可对应于启动子。或者，当任选使 用酿酒酵母ADHI基因的终止信号时，它们可以是不同的3’侧翼序列。
可以使用在选定酵母中有效的任何分泌前导序列起始表达所需的白蛋 白融合蛋白。可用于酿酒酵母的前导序列包括得自交配因子α多肽(MFα-1) 的前导序列和EP-A-387319中的杂合前导序列。在成熟白蛋白释放至周围培 养基中之前，酵母将所述前导序列(或信号)裂解下来。另外，所述前导序列 包括JP 62-096086(授权号为911036516)中公开的酿酒酵母转化酶(SUC2)、酸 性磷酸酶(PH05)、MFα-1前-序列、O葡聚糖酶(BGL2)和致死毒素；糖化糖酵 母(S.diastaticas)葡糖淀粉酶I1；卡尔斯伯糖酵母(S.Carlsbergensis)α-半乳糖 苷酶(MEL1)；乳克鲁维酵母致死毒素；和假丝酵母葡糖淀粉酶的前导序列。
其它重组和合成生产白蛋白融合蛋白的方法
本发明包括编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸以及含有这些多 核苷酸的载体、宿主细胞和生物体。本发明还包括通过合成和重组技术生 产本发明的白蛋白融合蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯 化多核苷酸、载体、宿主细胞和生物体。
用于本发明的载体可以是例如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病 毒或逆转录病毒载体。
可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表 达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核 苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如 HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓 鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细 胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例 如F.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992)和Sambrook et al.(1989)。然而，需注 意的是：当使用复制缺损的逆转录病毒载体时，病毒增殖一般仅发生在互 补的宿主细胞中。
可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、 诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。通过本领域已知或本文所述的方法可 分离和纯化蛋白质。
编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体 连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带 电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细 胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容 的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些 启动子的例子包括噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac，trp，phoA和tac启动子， SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本 领域技术人员已知的。表达构建体进一步含有转录起始、终止位点，并在 转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。构建体表达的转录物的编码部分 可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终 止密码子(UAA，UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核 细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性； 以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性 基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链 霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德 毕赤酵母(ATCC登录号201178))；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物 细胞，如CHO，COS，NSO，293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主 细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
在一个实施方案中，可将编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸与 信号序列融合，所述信号序列能介导本发明的蛋白质定位于原核或真核细 胞的特定区室，和/或能介导本发明的蛋白质从原核或真核细胞中分泌出来。 例如，对大肠杆菌而言，人们希望信号序列能将蛋白质的表达介导至周质 间隙中。为了将多肽表达介导至细菌的周质间隙中而与本发明的白蛋白融 合蛋白融合的信号序列或蛋白质(或其片段)的例子包括但不限于：pelB信号 序列，麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列，MBP，ompA信号序列，周质大肠 杆菌热-不稳定性肠毒素B-亚单位的信号序列和碱性磷酸酶的信号序列。可 以商购几个载体用于构建可介导蛋白质定位的融合蛋白，如可购自New England Biolabs的pMAL系列载体(特别是pMAL-p系列)。在具体实施方案 中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可与pelB果胶酸裂解酶信号序 列融合，以增加革兰氏阴性细菌表达和纯化所述多肽的效率。参见美国专 利5,576,195和5,846,818(全文列入本文作为参考)。
为了在哺乳动物细胞中介导分泌而与本发明的白蛋白融合蛋白融合的 信号肽的例子包括但不限于：MPIF-1信号序列(如GenBank登录号AAB51134 的氨基酸1-21)，stanniocalcin信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO：5)和共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO：6)。 可与杆状病毒表达系统联合使用的适当信号序列是gp67信号序列(如 GenBank登录号AAA72759的氨基酸1-19)。
分别在药物甲硫氨酸sulphoximine或氨甲蝶呤的存在下扩增使用谷胺酰 胺合酶(GS)或DHFR作为选择标记的载体。基于谷胺酰胺合酶的载体的优点 是可以为谷胺酰胺合酶阴性的细胞系(如鼠骨髓瘤细胞系NSO)所用。通过提 供其它的抑制剂以防止内源性基因起作用，谷胺酰胺合酶表达系统也可在 表达谷胺酰胺合酶的细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷胺酰胺 合酶表达系统及其组分详细描述于PCT公开文本：WO87/04462； WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404和WO91/06657(皆全文列入本文 作为参考)。另外，谷胺酰胺合酶表达载体也可得自Lonza Biologics，Inc. (Portsmouth，NH)。Bebbington et al.，Bio/technology 10：169(1992)和Biblia and Robinson Biotechnol.Prog 11：1(1995)(列入本文作为参考)描述了在鼠骨髓瘤 细胞中使用GS表达系统表达和产生单克隆抗体。
本发明还涉及含有本文所述载体构建体的宿主细胞，另外还包括含有 本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与 一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。宿主细胞可以是 高等真核细胞，如哺乳动物细胞(如得自人的细胞)或低等真核细胞，如酵母 细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可以选择能调节插入 的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主 菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可 以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特 殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适 当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、 电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸构建体导入 宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al.，Basic Methods In Molecular Biology(1986)。特别希望本发明的多肽实际上由缺乏 重组载体的宿主细胞表达。
除了包括含有本文所述载体构建体的宿主细胞外，本发明还包括来源 于脊椎动物，特别是哺乳动物的初级、次级和无限增殖化的宿主细胞，所 述宿主细胞经改造后缺失或取代了内源性的基因物质(如对应于治疗性蛋白 质的编码序列被对应于治疗性蛋白质的白蛋白融合蛋白所取代)，和/或包括 基因物质(例如异源多核苷酸序列，如可包括对应于治疗性蛋白质的本发明 的白蛋白融合蛋白)。与内源性多核苷酸可操作相连的基因物质可激活、改 变和/或扩增内源性的多核苷酸。
另外，可以使用本领域已知的技术，经由同源重组将异源多核苷酸(如 编码白蛋白或其片段或变体的多核苷酸)和/或异源控制区(如启动子和/或增 强子)与编码治疗性蛋白质的内源性多核苷酸序列可操作相连(参见例如 1997年6月24日发布的美国专利5,641,670；国际公开号WO 96/29411；国际 公开号WO94/12650；Koller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935 (1989)；和Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989)，每篇文献皆全文列入本 文作为参考)。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的白蛋白 融合蛋白较为有利，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或 阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰 石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高 效液相层析(“HPLC”)进行纯化。
在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的 白蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯 化本发明的白蛋白融合蛋白，所述层析柱有：Q sepharose FF柱、SP Sepharose FF柱、Q Sepharose High Performance柱、Blue Sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF或Methyl柱。
另外，可使用国际公开号WO00/44772(全文列入本文作为参考)中描述 的方法纯化本发明的白蛋白融合蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其 中所述的方法以用于纯化本发明的白蛋白融合蛋白。
可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核 或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的白蛋白融合蛋白。根据 重组生产方法中所用的宿主，本发明的多肽可被糖基化或非-糖基化。另外， 在一些情况下，因宿主-介导的过程所致，本发明的白蛋白融合蛋白也可包 括起始的经修饰的甲硫氨酸残基。因此，本领域众所周知：在所有真核细 胞中，任何蛋白质上由翻译起始密码子编码的N-末端甲硫氨酸一般会在翻 译后被高效除去。而在大多数原核生物中，大多数蛋白质上的N-末端甲硫 氨酸也会被有效除去，对于有些蛋白质而言，这种原核除去甲硫氨酸的过 程是无效的，这取决于与N-末端甲硫氨酸共价连接的氨基酸的性质。
本发明的白蛋白融合蛋白和能与治疗性蛋白质或其片段或变体结合的 抗体可与标记序列，例如肽融合以便于纯化。在一个实施方案中，标记氨 基酸序列是六-组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue， Chatsworth，CA，91311)中提供的标记等，很多标记序列是可以商购的。例如， 如Gentz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)所述，提供六-组氨 酸便于纯化融合蛋白。其它可用于纯化的肽标记包括但不限于对应于得自 流感病毒血凝素蛋白的表位的“HA”标记(Wilson et al.，Cell 37：767(1984)) 和“FLAG”标记。
另外，本发明的白蛋白融合蛋白可与治疗性组成成分偶联，所述成分 如细胞毒素(如细胞静止剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(如α-发 射体，如213Bi)。美国临时申请流水号60/355,547和WO01/79480(p.107)(列 入本文作为参考)中给出了所述药剂的例子。
白蛋白融合蛋白也可与固体支持物结合，这对与本发明的白蛋白融合 蛋白结合的多肽的免疫测定或纯化特别有用。所述固体支持物包括但不限 于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
本发明还提供了经化学修饰的本发明白蛋白融合蛋白的衍生物，所述 衍生物可提供其它的优点，例如多肽的溶解性、稳定性和循环时间有所增 加，或免疫原性有所降低(参见美国专利4,179,337)。WO01/79480(p.109-111) (列入本文作为参考)中给出了与使用聚乙二醇有关的例子。
使用本领域已知的免疫测定法ELISA，可以测定本发明的白蛋白融合蛋 白的存在和量。
多肽的应用
可用多种方式使用本文鉴定的每种多肽。下列描述应被认为是举例说 明，其中利用了已知技术。
本发明的白蛋白融合蛋白可用于治疗、预防和/或预测哺乳动物，优选 为人的多种疾病。所述疾病包括但不限于表1“生物活性”一栏中所述的那 些疾病。
本发明的白蛋白融合蛋白也可用作内皮细胞增殖和肿瘤-诱导的血管生 成的抑制剂。
另外，本发明的白蛋白融合蛋白可用于治疗或预防疾病。例如，本发 明的白蛋白融合蛋白可用作预防或治疗剂以预防原发性肿瘤和转移的生长 或促使其消退；并可用于治疗癌症、糖尿病性视网膜病、进行性黄斑变性 或类风湿性关节炎。
白蛋白融合蛋白也可用于检测生物样品中的多肽水平，例如用于体内 诊断学中。例如，可以使用经放射性标记的本发明的白蛋白融合蛋白来显 象身体内的多肽。美国临时申请流水号60/355,547和WO01/79480(p.112-122) (列入本文作为参考)中给出了检测法的例子。所述检测法是本领域众所周知 的。体内显象蛋白质的标记包括但不限于通过X-放射显影法、核磁共振 (NMR)、电子自旋弛豫(ESR)、正电子发射断层显象(PET)或计算机断层显象 (CT)可以检测到的标记。对于X-放射显影法而言，适当标记包括能发射出 可测的辐射，但对受试者无明显害处的放射性同位素，例如钡或铯。NMR 和ESR的适当标记包括具有可测的特征性自旋的标记，例如氘，通过对提供 给表达本发明的白蛋白融合蛋白的细胞系的营养物质进行标记，可将所述 标记掺入白蛋白融合蛋白。
将已被适当的可测显象组成成分标记的白蛋白融合蛋白导入(例如通过 非肠道、皮下或腹膜内途径)欲检查免疫系统疾病的哺乳动物，所述显象组 成成分如放射性同位素(例如131I，112In，99mTc，(131I，125I，123I，121I)，碳(14C)，硫 (35S)，氚(3H)，铟(115mIn，113mIn，112In，111In)和锝(99Tc，99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga， 67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La， 175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru)、放射性-不能透过的物质 或通过核磁共振可以检测到的物质。本领域技术人员应懂得：受试者的体 积大小和所用显象系统将决定产生诊断图像所需的显象组成成分的量。就 放射性同位素组成成分而言，给人受试者注射的放射性的量一般约为5至20 毫居里99mTc。然后，经标记的白蛋白融合蛋白将优先在具有一或多种受体、 配体或底物(对应于制备本发明的白蛋白融合蛋白所用的治疗性蛋白质的受 体、配体或底物)的体内位置处(例如器官、细胞、胞外间隙或基质)积累。 或者，当白蛋白融合蛋白至少含有治疗性抗体的片段或变体时，经标记的 白蛋白融合蛋白将优先在具有多肽/表位的体内位置处(例如器官、细胞、胞 外间隙或基质)积累，所述多肽/表位对应于被(制备本发明的白蛋白融合蛋 白所用的)治疗性抗体结合的多肽/表位。体内肿瘤显象描述于S.W.Burchiel et al.，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments″(Chapter 13 in Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982))。 本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以供本发明的白蛋白融合 蛋白使用。
因此，一方面，本发明提供了诊断哺乳动物与抗-血管生成相关之疾病 的方法，所述方法包括给哺乳动物施用本发明的经标记融合蛋白，使得至 少一些经标记的融合蛋白能到达血管生成依赖型疾病位点；并检测血管生 成依赖型疾病位点处的融合蛋白。所述方法可用于例如检测与血管生成相 关的疾病是否对治疗有反应。所述方法包括例如：首先测定哺乳动物体内 肿瘤的数目或大小，然后测定治疗后肿瘤数目是否增加或减少和/或测定治 疗后肿瘤是否生长或活动。
本发明的白蛋白融合蛋白也可用于产生抗体，所述抗体反过来可用于 测定重组细胞(作为评估宿主细胞转化的一种方式)或生物样品中治疗性蛋 白质、白蛋白和/或本发明的白蛋白融合蛋白的蛋白质表达。另外，本发明 的白蛋白融合蛋白可用于检测本文所述的生物活性。
转基因生物
本发明还包括表达本发明的白蛋白融合蛋白的转基因生物。转基因生 物是经遗传修饰的生物，其中转移了重组、外源性的或克隆的遗传物质。 所述遗传物质经常被称为转基因。转基因的核酸序列可包括一或多种转录 调节序列和其它最佳表达和分泌编码蛋白质所需的核酸序列，如内含子。 可将转基因设计成以便于从生物体中或从生物体产生的产物，如生物体的 乳汁、血液、尿、卵、头发或种子中回收编码蛋白质的方式介导所述蛋白 质的表达。转基因可由得自相同物种或与靶动物不同之物种的基因组的核 酸序列组成。转基因可整合至不正常地出现特殊核酸序列的基因组基因座 中，或整合至转基因的正常基因座中。
术语“生殖细胞系转基因生物”指的是已在生殖系细胞中导入遗传改 变或遗传信息，从而赋予转基因生物将遗传信息转移至后代之能力的转基 因生物。如果所述后代实际上具有一些或全部的上述改变或遗传信息，那 么它们也是转基因生物。所述改变或遗传信息可以对于受体所属物种而言 是外源的，可以仅对特定单个受体而言是外源的，或者可以是受体已具有 的遗传信息。在最后一种情况下，可以不同于天然基因的方式表达被改变 或导入的基因。
转基因生物可以是转基因的人、动物或植物。通过多种不同的方法可 以产生转基因生物，所述方法包括转染、电穿孔、微量注射、胚胎干细胞 中的基因靶向以及重组病毒和逆转录病毒感染(参见例如美国专利4,736,866； 美国专利5,602,307；Mullins et al.(1993)Hypertension 22(4)：630-633；Brenin et al.(1997)Surg.Oncol.6(2)99-110；Tuan(ed.)，Recombinant Gene Expression Protocols，Methods in Molecular Biology No.62，Humana Press(1997))。将核 酸片段导入重组感受态哺乳动物细胞的方法可以是任何有利于共-转化多个 核酸分子的方法。产生转基因动物的详细方法是本领域技术人员容易获得 的，包括美国专利5,489,743和美国专利5,602,307中的内容。美国临时申请 流水号60/355,547和WO01/79480(p.151-162)(列入本文作为参考)中给出了其 它信息。
基因治疗
编码本发明的白蛋白融合蛋白的构建体可用作基因治疗方案的一部 分，用于传递治疗有效量的白蛋白融合蛋白。将核酸体内导入细胞的一种 方法是使用含有核酸的病毒载体，所述核酸编码本发明的白蛋白融合蛋白。 用病毒载体感染细胞的好处是大部分靶细胞能接受到核酸。另外，病毒载 体内编码的分子，如病毒载体所含cDNA编码的分子能在接受病毒载体核酸 的细胞中有效表达。所述白蛋白融合蛋白的延长血浆半衰期甚至能补偿有 可能较低的表达水平。
逆转录病毒载体和腺-伴随病毒载体可用作重组基因传递系统，用于在 体内转移编码白蛋白融合蛋白的外源核酸分子。这些载体能有效地将核酸 传递至细胞内，转移的核酸能稳定整合至宿主的染色体DNA中。所述载体、 使用它们的方法和它们的优点以及非-病毒传递方法的例子详细描述于美国 临时申请流水号60/355,547和WO01/79480(p.151-153)(列入本文作为参考)。
可通过多种方法中的任一种将编码本发明的白蛋白融合蛋白之基因的 基因传递系统导入患者。例如，可通过静脉内注射全身性导入基因传递系 统的药物制品，由于基因传递载体提供的转染特异性，控制受体基因表达 的转录调节序列所致的细胞-类型或组织-类型表达或其组合，靶细胞中蛋白 质的特异性转导占优势。在其它实施方案中，重组基因的初始传递更加受 局限，而对动物的导入十分受局限。例如，可通过导管(参见美国专利 5,328,470)或通过趋实体的注射(例如Chen et al.(1994)PNAS 91：3054-3057) 导入基因传递载体。基因治疗构建体的药物制品实质上由溶于可接受的稀 释剂中的基因传递系统组成，或者可含有缓慢释放的基质，所述基质中包 埋有基因传递载体。当从重组细胞，例如逆转录病毒载体中完整产生白蛋 白融合蛋白时，药物制品可含有一或多种能产生白蛋白融合蛋白的细胞。 其它基因治疗方法描述于美国临时申请流水号60/355,547和 WO01/79480(p.153-162)(列入本文作为参考)。
药物组合物或治疗组合物
可通过任何包括非肠道(如皮下或肌内)注射或静脉内输注的常规方法 施用本发明的白蛋白融合蛋白或其制剂。治疗由单个剂量或一段时间内的 多个剂量组成。另外，与不同白蛋白融合的治疗性蛋白质相比，施用单个 剂量或多个剂量的频率较低。
尽管本发明的白蛋白融合蛋白可以单独施用，但与一种或多种可接受 载体一起作为药物制剂的形式被提供也是合乎需要的。在与白蛋白融合蛋 白相容并且对其受体无害的意义上说，载体必须是“可接受的”。一般说来， 载体是无菌和无热原质的水或盐水。本发明的白蛋白融合蛋白特别适于在 含水载体，如无菌无热原的水、盐水或其它等渗溶液中配成制剂，因为它 们在溶液中的货架期更长。例如，在用药前数周或数月或更长时间前，提 前以含水形式配制本发明的药物组合物较好。
考虑到白蛋白融合蛋白在含水配制剂中延长的货架期，来制备含有白 蛋白融合蛋白的配制剂。如上所述，很多治疗性蛋白质在与HA融合之后， 货架期显著增加或延长。
在适于进行气溶胶给药的情况下，可使用标准方法将本发明的白蛋白 融合蛋白配制成气溶胶。术语“气溶胶”包括任何由气体携带的本发明白 蛋白融合蛋白的悬浮相，它能被吸入细支气管或鼻呼吸道。具体地说，气 溶胶包括本发明白蛋白融合蛋白之液滴的由气体携带的悬浮物，规定剂量 的吸入器或喷雾器或薄雾喷雾器中可以产生所述气溶胶。气溶胶还包括悬 浮于空气或其它载体气体中的本发明化合物的干粉组合物，例如，通过从 吸入器中吹入可以传递所述组合物。
可以方便地以单位剂量形式提供配制剂，可通过药学领域众所周知的 任何方法制备所述配制剂。所述方法包括使白蛋白融合蛋白与构成一种或 多种辅助成分的载体联合的步骤。一般说来，通过使活性成分与液体载体 或经细分的固体载体或这两者均匀和密切地混合，然后，必要时使产品成 形即可制备出配制剂。
适用于非肠道给药的配制剂包括含水和不含水的无菌注射溶液，其中 可含有抗-氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂适用于欲治疗受体的溶质；以 及含水和不含水的无菌悬浮液，其中包括悬浮剂和增稠剂。可以单位-剂量 或多-剂量容器，例如密封的安瓿、小管或注射器提供制剂，也可将所述制 剂储存于仅需要在使用前添加无菌液体载体，例如注射用水的冻干条件下。 可由无菌粉末制备临时用的注射溶液和悬浮液。假设本发明的很多白蛋白 融合蛋白表现出延长的血清半衰期，剂量配制剂(dosage formulation)可含有 与非-融合的治疗性蛋白质标准配制剂相比，摩尔浓度较低或剂量较低的治 疗性蛋白质部分。
例如，当本发明的白蛋白融合蛋白含有一或多种治疗性蛋白质区域时， 剂量形式的计算可在相对于治疗性蛋白质之效力的白蛋白融合蛋白效力的 基础上进行，同时应考虑到与天然治疗性蛋白质相比，白蛋白融合蛋白的 血清半衰期和货架期有所延长。例如，在由与全长治疗性蛋白质融合的全 长HA组成的白蛋白融合蛋白中，同等单位剂量表示药剂更重，但剂量频率 减少。
本发明的配制剂或组合物可与提及白蛋白融合蛋白组分延长的货架期 的说明书或包装插页包装在一起，或一起包括在试剂盒中。例如，考虑到 本发明的白蛋白融合蛋白延长的货架期，所述说明书或包装插页可提及推 荐的储存条件，如时间、温度和光线。所述说明书或包装插页还可提及本 发明白蛋白融合蛋白的特别优点，例如易于储存需要在野外、受控医院外、 诊所或办公条件下使用的制剂。如上所述，本发明的制剂可以为含水形式， 并可在不那么理想的环境下储存而不会显著损失治疗活性。
本发明还提供了治疗和/或预防疾病(例如本文所述的一种或多种疾病) 的方法，所述方法为给受试者施用处于药物可接受载体中的、有效量的本 发明的白蛋白融合蛋白或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸(“白蛋 白融合蛋白多核苷酸”)。
通过本领域众所周知的提到如生物半衰期、生物可利用度和毒性的参 数的方法，包括利用使用本领域技术人员众所周知的方法进行的常规体外 和体内研究，如表1参考文献中所述的研究中得出的数据，可以测定欲施用 的本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的有效剂量。
以与良好医学实践相一致的方式配制白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸并 确定其剂量，此时应考虑到各个患者的临床条件(特别是单独用白蛋白融合 蛋白和/或多核苷酸治疗的副作用)、传递位点、给药方法、给药的时间安排 和操作者已知的其它因素。因此，由这些考虑因素来决定用于本文目的的 “有效量”。
例如，决定欲传递之物质的有效量取决于多个因素，包括例如物质的 化学结构和生物活性，患者的年龄和体重，需要治疗的准确病情及其严重 程度和给药的途径。治疗的频率取决于多个因素，如每个剂量施用的白蛋 白融合蛋白或多核苷酸构建体的量，以及受试者的健康状况和病史。护理 的医生或兽医可决定精确的量、剂量数目和剂量的时间安排。
本发明的白蛋白融合蛋白和多核苷酸可施用给任何动物，优选施用给 哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、绵 羊、牛、马和猪，特别优选施用于人。
作为一般性的建议，本发明的白蛋白融合蛋白的配制剂量或给药频率 (在未融合的治疗性蛋白质的摩尔基础上)应低于未融合的治疗性蛋白质。治 疗有效剂量指的是足以导致症状改善或疾病稳定化或患者存活期延长或生 命质量改善的化合物的量。
由于本发明的白蛋白融合蛋白可模拟“经典药物”的连续灌注，即相 同抑制活性需要较少的蛋白质当量，因此较为有利。由于半衰期延长，因 此可每3天皮下施用CT-Endo，每2天皮下施用NT-Endo。
本发明的白蛋白融合蛋白还具有下述的其它优点：(i)肿瘤血管生成表型 基础上的剂量最优化设计，以符合各个肿瘤的特殊生长特性(例如快速和缓 慢生长)；(ii)控制/避免较长用药过程中不必要的药物积累，这会导致较少或 减轻的副反应或改变的效力。另外，当肽具有疏水特性时，它们与白蛋白 的融合会改善其溶解性，这会导致生物可利用度的增加，并能允许有更加 浓缩的制剂。
可通过口服、直肠、非肠道、淋巴间隙内、阴道内、腹膜内、局部(通 过粉末、软膏、凝胶、滴剂或经皮膏药)、口腔、或作为口或鼻喷雾剂施用 白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸。“药物可接受载体”指的是任何无毒的固 体、半固体或液体填充剂、稀释剂、胶囊材料或配制助剂。本文所用术语 “非肠道”指的是包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注 射和灌注的给药模式。
本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸也适于通过缓释系统给药，所 述缓释系统描述于例如美国临时申请流水号60/355,547和WO01/79480 (p.129-130)(列入本文作为参考)。
在一个实施方案中，为了进行非肠道给药，一般通过在单位剂量可注 射形式(溶液、悬浮液或乳剂)中使所需纯度水平的白蛋白融合蛋白和/或多 核苷酸与药物可接受载体混合来配制药品，所述载体就是在所用剂量和浓 度下对受体无毒，并且与制剂中的其它成分相容的载体。例如，制剂任选 不包括氧化剂和其它已知对治疗剂不利的化合物。
本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以单独施用或与其它治疗剂 联合施用。可与本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的白蛋白 融合蛋白和/或多核苷酸药剂包括但不限于：化学治疗剂、抗生素、类固醇 和非-类固醇抗-炎症剂、常规的免疫治疗剂和/或如美国临时申请流水号 60/355,547和WO01/79480(p.132-151)(列入本文作为参考)中所述的治疗。组 合物可相伴使用，例如作为混合物，分开但同时施用；或依次施用。它包 括作为治疗混合物同时施用组合药剂，以及分开但同时(例如通过分开的静 脉内线进入相同的个体)施用组合药剂。“联合”给药还包括分开施用首先使 用的一种化合物或药剂，接着施用第二种。
适用于本发明的药物组合物包括包含有效量的活性成分以达到其想达 到的目的的组合物。
本发明还提供了药物包装或试剂盒，其中含有一个或多个容器，容器 中装有一种或多种含本发明的白蛋白融合蛋白的药物组合物成分。任选与 容器相关的是由调控药物或生物制品的制备、使用或销售的政府机构规定 形式的布告，所述布告反映了人药制备、使用或销售机构的批准。
鉴于上文对本发明的一般性描述，参考下文的实施例将更容易理解本 发明，提供下述实施例只是为了阐明而不是限制本发明。
无需进一步描述，可以相信本领域技术人员可使用上文的描述和下文 说明性的实施例来制备和利用本发明中检测到的改变并且实践所要求的方 法。因此，下述工作实施例具体描述了本发明的某些实施方案，不能将其 看成是对其余内容的限制。
实施例
实施例1  克隆人内皮他丁cDNA
通过酚/氯仿提取，从人胎肾5′-STRETCH Plus cDNA文库(Clonetech)中 提取DNA，用乙醇沉淀，然后用RNaseA消化以除去DNA样品中存在的任何 RNA。将DNA从100ng连续稀释至10pg(以10倍的增值)。设计PCR引物JH005 和JH018，以将BamHI位点克隆至内皮他丁的5’末端，将HindIII位点克隆至 内皮他丁的3’末端。每个引物的DNA序列如下：
JH005
         BamHI
5′-TA GCGGATCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACC-3′
             -------------------------------------→
                       5′内皮他丁
(SEQ ID NO：7)
          JH018
          HindIII
5′-GCTAAAGCTTATTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTGTTCTCAATGCAGAGCACG-3′
                  ←-------------------------------------
                       3′内皮他丁
(SEQ ID NO：8)
按下述制备主混合物：2mM MgCl2 PCR缓冲液，10μM PCR dNTP，0.2μM JH005，0.2HM JH018，2U FastStart Taq.DNA聚合酶。在49μL反应混合物中加 入1μL模板DNA(10pg，100pg，1ng，10ng，100ng)。总反应体积为50μL。按下 述编制Perkin-Elmer热循环仪9600的程序：95℃变性4分钟[HOLD]，然后 [CYLCE]95℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸60秒共40轮循环，接着 [HOLD]72℃600秒，然后[HOLD]4℃。通过凝胶电泳分析PCR扩增的产物， 观察到预期大小(0.57kb)的单个DNA带。使用Gene Clean III Kit(BIO101 Inc.) 从1％(w/v)琼脂糖TAE凝胶中分离经修饰的内皮他丁cDNA片段。
用BamHI/HindIII完全消化内皮他丁cDNA片段，并连接至经 BamHI/HindIII消化的pBST+(描述于WO99/00504)，产生质粒pDB2446。
实施例2  构建C-末端和N-末端白蛋白-内皮他丁表达质粒
构建C-末端白蛋白-内皮他丁表达质粒
构建C-末端rHA-内皮他丁融合蛋白，其中白蛋白的C-末端氨基酸后紧 接着人内皮他丁的第一个N-末端氨基酸。
设计双链寡核苷酸接头以在白蛋白和内皮他丁编码区之间制备接合位 点(junction site)。设计寡核苷酸对JH012/JH013，以从白蛋白cDNA内的 Bsu36I位点延伸至内皮他丁cDNA5’区域内的SexAI位点。在接头的3’末端添 加AccI位点以使接头能被克隆至pDB2243(以前描述于专利申请 WO00/44772中)。含有酵母PRBI启动子和酵母ADHI终止子的质粒pDB2243 提供了适当的转录启动子和转录终止序列。
JH012
         3′白蛋白        5′内皮他丁         SexAl
Bsu36I     ----->------------------------------------->
5-TTAGGCTTACACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCC ACCTGGTGT-3′
     3′-CCGAATGTGTCGGTGGCGCTGAAGGTCGGCCACGAGGTGGACCA CATA-5′
                                                         AccI
                                                           JH013
(分别为SEQ ID NO：9和SEQ ID N0：10)
将寡核苷酸接头JH012/JH013连接至得自pDB2243的6.13kb Bsu36I-AccI片段，产生质粒pDB2442。
将合成的自身-互补寡核苷酸JH011设计为可以将HindIII克隆位点插入 pDB2243(以前描述于专利申请WO00/44772中)的XhoI位点。
          JH011
           HindIIl
5'-TCGAG AAGCTTC-3′
(SEQ lD NO：1i)
在紧接酵母ADH1转录终止子下游的唯一XhoI位点使质粒pDB2243线性 化。使寡核苷酸JH011与其自身退火以产生双链接头。将该接头连接至经 XhoI线性化的pDB2243中，产生质粒pDB2441，该质粒在ADH1终止子的 任一侧具有HindIII位点。用HindlII完全消化质粒pDB2441，纯化0.37kb ADH1终止子片段，将其连接至已用牛小肠磷酸酶处理过的、经HindIII消化 的pDB2446，产生质粒pDB2450。
构建白蛋白-内皮他丁融合蛋白的下一步取决于SexA1限制性内切核酸 酶的使用。SexA1是Dcm-敏感的限制性酶。用质粒pDB2450和pDB2442独立 转化dcm-，dam-大肠杆菌菌株GM2163(New England Biolabs，基因型：F-， ara-14，leuB6，fhuA31，lacY1，tsx78，glnV44，galK2，galT22，mcrA，dcm-6，hisG4， rfbDl，rpsL136，daml3::Tn9，xylA5，mtl-1，rhi-1，mcrB1，hsdR2)。纯化dcm-，dam- pDB2450和pDB2442质粒DNA，用BamHI和SexAI完全消化所述DNA。将得 自pDB2450的SexAl/BamHI片段(0.87kb)与得自pDB2442的SexAl/BamHI片 段(5.88kb)连接，产生质粒pDB2456。
一般性地描述于EP-A-286424和Sleep，D.，et al.(1991)Bio/Technology 9， 183-187的“去整合”质粒pSAC35提供了适当的酵母载体序列。从pDB2456 中分离NotI C-末端白蛋白-内皮他丁表达盒，纯化并连接至已用牛小肠磷酸 酶处理过的、经NotI消化的pSAC35，产生质粒pDB2452，该质粒在与LEU2 选择标记相同的表达方向上含有NotI表达盒。
构建N-末端内皮他丁-白蛋白融合蛋白表达质粒
英国专利申请0217033.0中先前已描述了重组白蛋白表达载体pAYE645 和pAYE646。英国专利申请0217033.0中描述了质粒pAYE645，其含有 HSA/MFα-1融合前导序列以及提供了适当转录启动子和转录终止序列的酵 母PRBI启动子和酵母ADH1终止子。pAYE645用限制性酶AflII进行完全消 化，用限制性酶HindIII进行部分消化，分离含有酵母PRBI启动子3’末端和 白蛋白编码序列的DNA片段。用AflII/HindIII消化专利申请WO00/44772中所 述的质粒pDB2241，分离含有酵母PRBI启动子5’末端和酵母ADH1终止子的 DNA片段。然后将得自pAYE645的AflII/HindIII DNA片段克隆至 AflII/HindIII pDB2241载体DNA片段，产生质粒pDB2302。用PacI/XhoI完全 消化质粒pDB2302，分离6.19kb的片段，用T4 DNA聚合酶和dNTP使凹端成 为平端，再次连接产生质粒pDB2465。用ClaI使质粒pDB2465线性化，用T4 DNA聚合酶和dNTP使凹端成为平端，再次连接产生质粒pDB2533。用BlnI 使质粒pDB2533线性化，用T4 DNA聚合酶和dNTP使凹端成为平端，再次连 接产生质粒pDB2534。用BmgBI/BglII完全消化质粒pDB2534，分离6.96kb DNA片段，将其连接至两个双链寡核苷酸接头VC053/VC054和 VC057/VC058中的一个中，产生质粒pDB2540，或连接至VC055/VC056和 VC057/VC058中的一个中，产生质粒pDB2541。
                         VC053
5’-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCTCACCGGT-3’
(SEQ ID NO：12)
                         VC054
5’-
pCCTTGAACCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTTGAGCGTCTCTCTTATCCAAA-3’
(SEQ ID NO：13)
                         VC055
5 ’-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCTCATCGAT-3’
(SEQ ID NO：14)
                         VC056
5’-pCCTTGAATCGATGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCTCTTATCCAAA-
3’
(SEQ ID NO：15)
                        VC057
5′-
pTCAAGGACCTAGGTGAGGAAAACTTCAAGGCTTTGGTCTTGATCGCTTTCG
CTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGATCAC-3’
(SEQ ID NO：16)
                         VC058
5’-
GTGATCTTCGAATGGACATTGTTGCAAGTATTGAGCGAAAGCGATCAAGACC
AAAGCCTTGAAGTTTTCCTCACCTAGGT-3’
(SEQ ID NO：19)
设计PCR引物JH029和JH030，使得内皮他丁cDNA作为N-末端白蛋白融 合体被克隆至用BglII和AgeI线性化的pDB2540中。
    HSA/MFα-1
    融合前导序列           内皮他丁

————→
GCTCCACCT-3’
(SEQ ID NO：20)
                         JH030
           白蛋白                     内皮他丁

←————————
AAGCTGTTCTCAATGCA-3
(SEQ ID NO：21)
按下述制备主混合物：2mM MgCl2 PCR缓冲液，10μM PCR dNTP，0.2μM JH029，0.2μM JH030，2U FastStart Taq.DNA聚合酶。在49μL反应混合物中加 入1μL pDB2446(10pg，100pg，1ng，10ng，100ng)。总反应体积为50μL。按下 述编制Perkin-Elmer热循环仪9600的程序：95℃变性4分钟[HOLD]，然后 [CYLCE]95℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸60秒共20轮循环，接着 [HOLD]72℃600秒，然后[HOLD]4℃。通过凝胶电泳分析PCR扩增的产物， 观察到预期大小(0.59kb)的带。使用Gene Clean III Kit(BIO101 Inc.)从1％ (w/v)琼脂糖TAE凝胶中分离0.59kb DNA片段。
用限制性内切核酸酶BglII/AgeI完全消化PCR DNA片段，并将0.59kb片 段连接至6.15kb pDB2540 BglII/AgeI载体DNA片段，产生质粒pDB2556。
一般性地描述于EP-A-286424和Sleep，D.，et al.(1991)Bio/Technology 9， 183-187的“去整合”质粒pSAC35提供了适当的酵母载体序列。从pDB2556 中分离3.54kb NotI N-末端内皮他丁-白蛋白表达盒，纯化并连接至已用牛小 肠磷酸酶处理过的、经NotI消化的pSAC35，产生质粒pDB2557，该质粒在 与LEU2选择标记相反的方向上含有NotI表达盒。
实施例3  克隆人制管张素cDNA
由于肝脏是纤溶酶原的主要生产者，因此选择人肝脏5′-STRETCH Plus cDNA文库(Clonetech)作为人制管张素cDNA的来源。通过酚/氯仿抽提提取 DNA，用乙醇沉淀，然后用RNaseA消化以除去DNA样品中存在的任何RNA。 将DNA从100ng连续稀释至10pg(以10倍的增值)。设计两个致突变的PCR引 物JH003和JH004，以将BamHI位点导入制管张素的5’末端(JH004)，将HindIII 位点导入制管张素的3’末端(JH003)。
JH003

                                                 ‘制管张素
(SEQ ID NO：22)
JH004

        BamHJ       制管张素’
(SEQ ID NO：23)
使用引物JH003和JH004，通过PCR扩增制管张素cDNA。按下述制备主 混合物：2mM MgCl2 PCR缓冲液，10μM PCR dNTP，0.2μM JH003，0.2μM JH004，2U FastStart Tag.DNA聚合酶(Roche)。在49μL反应混合物中加入1μL DNA(10pg，100pg，1ng，10ng，100ng)。总反应体积为50μL。按下述编制 Perkin-Elmer热循环仪9600的程序：95℃变性4分钟[HOLD]，然后[CYLCE]95 ℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸60秒共40轮循环，接着[HOLD]72℃ 600秒，然后[HOLD]4℃。通过凝胶电泳分析PCR扩增的产物，观察到预期 大小(0.79kb)的单个DNA带。使用Gene Clcan III Kit(BIO101 Inc.)从1％(w/v) 琼脂糖TAE凝胶中分离经修饰的制管张素cDNA片段。制管张素片段用 BamHI，HindIII进行完全消化(0.790kb)，并连接至经BamHI，HindIII消化的 pBST+(描述于WO99/00504)，产生质粒pDB2447。获得人制管张素cDNA的 DNA序列，将其与得自国立生物技术信息中心(NCBI)的公众可获得的cDNA 序列进行比对。该分析揭示出：此DNA序列与人纤溶酶原(RID：998488083- 23300-12247)具有100％的同一性。
实施例4  构建C-末端和N-末端白蛋白-制管张素表达质粒
构建C-末端白蛋白-制管张素表达质粒
设计寡核苷酸对以在rHA和制管张素cDNA之间制备接合位点。设计寡 核苷酸对JH021和JH022，以便将rHA内的Bsu36I位点与制管张素5’区域内 的BmrI位点连接。
JH021
                                     5’制管张素
  BamHI  Bsu36I    rHA
  ——   ——      ——   ———————————→
5-GATCACCTTAGGCTTAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGG-3′
3’TGGAATCCGAATCACATAGAGAGTCTCACGTTCTGACCCTTACC-5’JH022
(分别为SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25)。
质粒pDB2447用BmrI进行部分消化，然后用BamHI进行完全消化，产生 3.95kb的载体。将双链寡核苷酸接头JH021/22连接至经BamHI BmrI消化的 pDB2447，产生质粒pDB2458。用HindIII使质粒pDB2458线性化，并用牛小 肠磷酸酶进行处理以除去3’磷酸。用HindIII完全消化上述质粒pDB2441，使 用Gene Clean III Kit(BIO101 Inc.)从1％(w/v)琼脂糖TAE凝胶中分离0.37kb 的mADH1终止子片段。将0.37kb HindIII mADH1终止子片段与用HindIII线 性化的pDB2458连接，产生质粒pDB2459。
人制管张素cDNA的DNA序列编码一个潜在的N-连接糖基化位点。通过 PCR诱变消除该N-连接糖基化位点。设计PCR引物JH025和JH026以在核苷 酸序列内导入改变，从而用谷氨酰胺残基(密码子CAA)取代天冬酰胺残基 (密码子AAC)。
JH025        ‘制管张素’
  ———————————→
5’-GAATGTATGCATTGCAGTGG-3’
(SEQ ID NO：26)
JH026                    ‘制管张素’

按下述制备主混合物：2mM MgCl2 PCR缓冲液，10μM PCR dNTP，0.2μM JH025，0.2μM JH026，2U FastStart Taq.DNA聚合酶(Roche)。在49μL反应混合 物中加入1μL pDB2447(10pg，100pg，1ng，10ng，100ng)。总反应体积为50μL。 按下述编制Perkin-Elmer热循环仪9600的程序：95℃变性4分钟[HOLD]，然 后[CYLC到95℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸60秒共20轮循环，接着 [HOLD]72℃600秒，然后[HOLD]4℃。通过凝胶电泳分析PCR扩增的产物， 观察到预期大小(0.46kb)的单个DNA带。使用Gene Clean III Kit(BIO101 Inc.) 从1％(w/v)琼脂糖TAE凝胶中分离经修饰的制管张素cDNA片段。用NsiI， NcoI完全消化非-糖基化的制管张素cDNA片段，分离0.44kb的片段，并连接 至3.93kb NsiI，NcoI pDB2459，产生质粒pDB2480。
以前在专利申请WO00/44772中描述过的、含有酵母PRBI启动子和酵母 ADH1终止子的质粒pDB2243提供了适当转录启动子和转录终止序列。用 BamHI，Bsu36I完全消化质粒pDB2244，分离5.84kb片段，连接至得自 pDB2480的BamHI，Bsu36I制管张素-mADH1终止子片段，产生pDB2501。用 限制性内切核酸酶NotI消化质粒pDB2501，产生非-糖基化的白蛋白-制管张 素表达盒。
一般性地描述于EP-A-286424和Sleep，D.，et al.(1991)Bio/Technology 9， 183-187的“去整合”质粒pSAC35提供了适当的酵母载体序列。从pDB2501 中分离NotI C-末端非-糖基化的白蛋白-制管张素表达盒，纯化并连接至已用 牛小肠磷酸酶处理过的、经NotI消化的pSAC35，产生在与LEU2选择标记相 同的表达方向上含有NotI表达盒的质粒pDB2508，以及在与LEU2选择标记 相反的表达方向上含有NotI表述盒的质粒pDB2509。
构建N-末端制管张素-白蛋白表达质粒
用两个引物CF96和CF97，通过致突变PCR修饰非-糖基化的制管张素 cDNA。
CF96
5’-CGATAGATCTTTGGATAAGAGAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGG
GAATGG-3’
(SEQ ID NO：28)
CF97
5’-
GGCCATCGATGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTACTGGGGAGGAGTCAC
AGGACGG-3’
(SEQ ID NO：29)
按下述制备主混合物：2mM MgCl2 PCR缓冲液，10μM PCR dNTP，0.2μM CF96，0.2μM CF97，2U FastStart Taq.DNA聚合酶(Roche)。在49μL反应混合 物中加入1μL pDB2501(10pg，100pg，1ng，10ng，100ng)。总反应体积为50μL。 按下述编制Perkin-Elmer热循环仪9600的程序：95℃变性4分钟[HOLD]，然 后[CYLCE]95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒共25轮循环，接着 [HOLD]72℃600秒，然后[HOLD]4℃。通过凝胶电泳分析PCR扩增的产物， 观察到预期大小(0.83kb)的单个DNA带。使用Gene Clean III Kit(BIO101 Inc.) 从1％(w/v)琼脂糖TAE凝胶中分离经修饰的制管张素cDNA片段。用BglI， ClaI完全消化非-糖基化的制管张素cDNA片段，分离0.83kb的片段，并连接 至6.15kb BglI，ClaI pDB2541，产生质粒pDB2763。
一般性地描述于EP-A-286424和Sleep，D.，et al.(1991)Bio/Technology 9， 183-187的“去整合”质粒pSAC35提供了适当的酵母载体序列。从pDB2763 中分离NotI N-末端非-糖基化的制管张素-白蛋白表达盒，纯化并连接至已用 牛小肠磷酸酶处理过的、经NotI消化的pSAC35，产生在与LEU2选择标记相 同的表达方向上含有NotI表达盒的质粒pDB2765，以及在与LEU2选择标记 相反的表达方向上含有NotI表达盒的质粒pDB2764。
实施例5  构建N-末端和C-末端白蛋白-Kringle5融合体
构建C-末端白蛋白-(GGS)4GG-Kringle5表达质粒
用于C-末端白蛋白融合蛋白中的纤溶酶原Kringle5的克隆首先是在标 准条件下，使用正向引物5′-TGTATGTTTGGGAATGGGAAAG-3′和反向引物 5′-ACACTGAGGGACATCACAGTAG-3′，对人肝脏cDNA文库(Ambion)进行 PCR扩增。随后，使用正向引物5′-GTGGGATCCGGTGGTTGTATGTTTGGG AATGGGAAAG-3′和反向引物5′-CACAAGCTTATTAACACTGAGGGA CATCACAGTAG-3′进行巢式PCR，所得DNA片段随后根据厂商说明克隆至 pCR4-TA-TOPO(Invitrogen)。将所得质粒称为pCR4-Kringle5-C。通过用 BamHI和HindIII消化，从pCR4-Kringle5-C中分离C-末端Kringle5 DNA片段。 质粒pDB2575用HindIII进行部分消化，然后用BamHI进行完全消化。分离所 需的6.55kb DNA片段，将其与得自质粒pCR4-Kringle5-C的0.26kb BamHI/HindIII片段连接，产生质粒pDB2717。
一般性地描述于EP-A-286424和Sleep，D.，et al.(1991)Bio/Technology 9， 183-187的“去整合”质粒pSAC35提供了适当的酵母载体序列。用NotI完全 消化质粒pDB2717，分离3.27kb C-末端白蛋白-(GGS)4GG-Kringle5表达盒， 随后连接至NotI牛小肠磷酸酶处理过的pSAC35，产生在与LEU2选择标记相 同的表达方向上含有NotI表达盒的质粒pDB2748，以及在与LEU2选择标记 相反的表达方向上含有NotI表达盒的质粒pDB2749。
构建N-末端Kringle5-(GGS)4GG-白蛋白表达质粒
对用于N-末端白蛋白融合蛋白中的纤溶酶原Kringle5进行克隆，具体是 在标准条件下，使用正向引物5′-GTGAGATCTTGTATGTTTGGGAATGG GAAAG-3′和反向引物5′-CACGGATCCACCACACTGAGGGACATCACAG TAG-3′，对pCR4-Kringle5-C克隆中所含Kringle5序列进行PCR扩增。扩增的 DNA片段用限制性内切核酸酶BglII和BamHI消化，并克隆至pLITMUS29 (New England BioLabs)。将所得质粒称为pCR4-Kringle5-N。用BamHI和BglII 完全消化质粒pCR4-Kringle5-N。将0.26kb DNA片段连接至经BamHI，BglII 消化的pDB2573，产生质粒pDB2771。一般性地描述于EP-A-286424和Sleep， D.，et al.(1991)Bio/Technology 9，183-187的“去整合”质粒pSAC35提供了适 当的酵母载体序列。用NotI完全消化质粒pDB2771，分离3.27kb N-末端 Kringle5-(GGS)4GG-白蛋白表达盒，随后连接至NotI牛小肠磷酸酶处理过的 pSAC35，产生在与LEU2选择标记相同的表达方向上含有NotI表达盒的质粒 pDB2773，以及在与LEU2选择标记相反的表达方向上含有NotI表达盒的质 粒pDB2774。
实施例6  酵母转化和培养条件
按Sleep D.，et al.(2001)Yeast 18，403-421所述，将WO95/23857， WO95/33833和WO94/04687中公开的酵母菌株转化成亮氨酸原养型。将转化 子涂布在Buffered Minimal Medium(BMM，描述于Kerry-Williams，S.M.et al. (1998)Yeast 14，161-169)上，30℃保温直至生长得足以供进一步分析。
实施例7  表达白蛋白内皮他丁融合蛋白
在摇瓶中表达rHA融合蛋白，并测定培养物表达水平。对于rHA-内皮他 丁而言，培养上清中的表达水平较高。对于内皮他丁-rHA而言，培养上清 中的表达水平中等。
实施例8  纯化白蛋白内皮他丁融合蛋白
C-末端内皮他丁纯化：
使用如WO00/44772所述的标准rHA SP-FF(Pharmacia)条件纯化C-末端 内皮他丁，所述条件的不同之处仅在于洗脱缓冲液中需要额外的250mM NaCl。然后洗脱物使用如WO00/44772所述的标准rHA DE-FF(Pharmacia)条 件纯化，所述条件的不同之处仅在于洗脱缓冲液中包括额外的200mM NaCl(但该盐浓度并没最佳，因此，可以有变化)。然后将纯化的物质浓缩并对PBS 渗滤。
N-末端内皮他丁纯化：
使用标准的rHA SP-FF条件纯化N-末端内皮他丁，所述条件的不同之处 仅在于洗脱缓冲液中需要额外的250mM NaCl。然后将洗脱物调节至pH8和 2.5mS.cm-1，使用已用15mM四硼酸钾平衡的标准rHA DE-FF进行纯化。使用 标准的rHA洗脱缓冲液洗脱DE-FF。然后将纯化的物质浓缩并对PBS渗滤。
对于C和N末端融合蛋白而言，发酵滴度分别为2.2和0.9mg.mL-1，总体 纯化回收率较高。这可以进一步改善纯化回收率(取决于所需纯度)和增加发 酵滴度，尤其对于N-末端融合蛋白而言更是如此。
实施例9  鉴定白蛋白内皮他丁融合体
纯化后的蛋白质可通过在4-12％梯度的SDS非-还原凝胶上电泳并用抗- 内皮他丁或抗-HSA抗体进行Western印迹来鉴定。结果示于图13。凝胶的样 品加载情况如下：     泳道     样品     加载量     1     -     -     2     Magic Marker     -     3     -     -     4     C末端内皮他丁     1μg     5     N末端内皮他丁     1μg     6     HSA     1μg     7     内皮他丁标准品     1μg
下表中鉴定了蛋白质：
表3.纯化后蛋白质的鉴定 C-末端融合体 N-末端融合体 通过SDS-PAGE和胶体 蓝染色测定的％纯度 95 99 翻译后修饰的ESMS指 示 未检测到校正理论质量 ＝86512的种类。主要种类与 损失CT赖氨酸残基一致。1 检测到一类校正理论质量。存 在一些分子量较高的组分。2 N-末端序列 rHA的校正NT序列 内皮他丁的校正NT序列 内毒素(EU.mL-1) 4.3 5.7 融合体浓度(mg.mL-1) 5 5
注：
1.实质上是单峰。在三个不同制品中观察到的CT赖氨酸残基损失通过tryptic肽的纳 米-MS证实。
2.已校正的未加工一级序列的良好证据。在+78和+165Da处观察到其它种类，可能 分别是磷酸化和糖基化所致。在C-末端制品中未观察到+78。
实施例10
白蛋白内皮他丁融合蛋白的药物动力学
在静脉内或皮下注射内皮他丁、C-末端白蛋白与内皮他丁的融合蛋白 (CT-内皮他丁)或N-末端白蛋白与内皮他丁的融合蛋白(NT-内皮他丁)之后， 测定小鼠血清中的内皮他丁抗原水平。
小鼠接受检测物质的单次注射。在每个样品点，抽取每组5只小鼠的血 液，收集血清供ELISA分析。
PK数据：
与“经典”内皮他丁相比，皮下和静脉内给药后CT-和NT-内皮他丁的 数据显示出类似的结果：
          内皮他丁(经典)：    4.5小时
          CT-内皮他丁：       56小时
          NT-内皮他丁：       29小时
表4显示出皮下给药后的药物动力学结果。图14显示了皮下给药后的平 均内皮他丁浓度+/-S.D.。
            表4 皮下给药后的药物动力学结果                 内皮他丁 CT-内皮他丁 NT-内皮他丁                 10mg/kg 内皮他丁 1.25mg/kg 吸收半衰期(hr)  0.09     1.61        8.84 终末半衰期(hr)  4.5      55.7        28.4 AUC(hr.ng/mL)   3,010    142,183     175,272 Cmax(ng/mL)    229      1,785       2,198 0.05 2.0a 2,682b 44 a由高达24小时的值计算 b区域包括24小时后的增加水平
表5显示出静脉给药后的药物动力学结果。图15显示了静脉给药后的平 均内皮他丁浓度+/-S.D.。
           表5静脉内给药后的药物动力学结果          内皮他丁1.25mg/kg    CT-内皮他丁    NT-内皮他丁 起始半衰期(hr)    - 终末半衰期(hr)    1.9 AUC(hr.ng/mL)     1,723 Cmax(ng/mL)      126       6.39           2.40       50.0           23.7       456,139        658,469       24,252         24,127
使用所得数据模拟21天效力试验中所需的重复剂量安排。积累的研究 表明：有4种剂量时间安排可以保持在150-400ng/ml的有利治疗窗内(within the favourable therapy window)。进行PK研究以便检测AFP-内皮他丁重复用 药时间表，从而澄清该问题。检测如下表6所示的4种剂量时间安排。
表6AFP-内皮他丁重复用药的剂量时间安排
编号    治疗                 加载剂量/维持剂量时间表/途经
1       CT-内皮他丁72小时    1.8mg/kg/1.2mg/kg每72h/皮下
2       CT-内皮他丁24小时    1.5mg/kg/0.5mg/kg每24h/皮下
3       NT-内皮他丁72小时    1.0mg/kg/0.9mg/kg每72h/皮下
4       NT-内皮他丁24小时    0.8mg/kg/0.25mg/kg每24h/皮下
表7和图16至19显示了多次皮下给药后的药物动力学结果。
表7多次皮下给药后的药物动力学结果
                  CT-内皮他丁  CT-内皮他丁  NT-内皮他丁  NT-内皮他丁
                  72h          24h          72h          24h
吸收半衰期(hr)    0.85         1.12         4.69         5.30
终末半衰期(hr)    29.1         25.5         13.7         10.7
Cmax(ng/mL)a    568          481          937          659
Tmax(hr)a        12           12           12           12
a第一剂量之后
实施例11  白蛋白内皮他丁融合蛋白的体外效力
在体外迁移-试验(HUVEC)中，CT-内皮他丁和NT-内皮他丁显示出与经 典内皮他丁类似的效力。这些结果示于图20。
实施例12  白蛋白内皮他丁融合蛋白的体内效力
在小鼠胰腺肿瘤模型中，与经典内皮他丁相比，CT-内皮他丁和NT-内 皮他丁显示出类似的体内效力。
在一个剂量时间安排中，CT-内皮他丁显示出较好的效力：
-7个病例中有2个出现剂量反应和肿瘤收缩
-3.6mg/kg每72小时替代100mg/kg每24小时，获得了迄今为止最佳的经 典数据(Kisker et.al.，Cancer Res.61：7669-7674(2001))
皮下用CT-内皮他丁治疗Bx Pc3(人胰腺癌细胞系)的结果见图21至24。
实施例13  表达白蛋白制管张素融合蛋白
在摇瓶培养物中表达rHA融合蛋白，并测定表达水平。培养上清中rHA- 制管张素；rHA-3xFLAG-制管张素；rHA-制管张素(N211Q)；和rHA-3xFLAG- 制管张素(N211Q)的表达水平低。这些融合蛋白的SDS-PAGE凝胶示于图27。 按下述在泳道中加载样品：
泳道样品
1.rHA-3xFLAG-制管张素(N211Q)
2.rHA-制管张素(N211Q)
3.rHA-制管张素
4.rHA-制管张素
5.rHA
实施例14  纯化白蛋白制管张素融合蛋白
C-末端制管张素纯化
C-末端制管张素含有高水平的发夹物质(clipped material)。使用以正常 洗脱作为洗涤的标准rHA SP-FF条件对其进行纯化，使用含有200mM NaCl的标准缓冲液对其进行洗脱。如图25所示，通过SDS-PAGE分析SP-FF柱洗 脱物。图26显示了使用抗-制管张素或抗-HSA抗体对SP-FF洗脱物进行 Western印迹的结果。然后使用标准的rHA DE-FF条件纯化洗脱物，不同之处 在于洗脱缓冲液中需要额外的10mM NaCl。然后将纯化的物质浓缩并对PBS 渗滤。
对此融合蛋白进行的纯化为生产过程奠定了良好的基础，但仍需要进 一步的工作以分析酵母抗原清除和使回收最优化。最终产生的量低，但这 主要是因为发酵滴度低于0.1mg.mL-1的缘故，而不是低回收率造成的。回收 情况一般较好，但可根据所需的纯度，通过DE-FF加以改善。然而，如果需 要提高整体产率，增加表达水平将会获得最大的收益。
参考文献
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Dhanabal(1999)Cancer Research 59：189-197
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Kerry-Williams，S.M.et al.(1998)Yeast 14，161-169
Kisker et.al.，Cancer Res.61：7669-7674(2001)
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Sim et al.(2000)Cancer and Metastasis Reviews 19：181-190
Sleep，D.，et al.(1991)Bio/Technology 9，183-187
Sleep D.，et al.(2001)Yeast 18，403-421
EP-A-286424
UK 0217033.0
US 5792845
US 5854205
US 5854221
US 5885795
WO 94/04687
WO 95/23857
WO 95/33833
WO 97/15666
WO 00/44772
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为 阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和 组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述 和附图可以容易地掌握对本发明的多种修饰。所述修饰也落入所附权利要 求书的范围之内。
上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。