本发明涉及供释放水溶性不良、与血浆蛋白有牢固的结合亲和力的治疗活性 化合物的新方法、产品和制剂，本发明也涉及这类产品和制剂的制备方法。

更具体的是，本发明的第一个对象是固体或液体形式的、主要供非胃肠道给 药的产品和药物制剂，它包括或由下列物质组成：

a)水溶性低、与血浆蛋白有牢固的结合亲和力的治疗活性物质(在下文中为 “活性物质”)

b)处于控制聚集状态的血浆蛋白组分

其中所述的活性物质和所述的蛋白组分通过非共价键彼此结合，和

c)进一步任选的药学上可接受的、主要是可用于制剂添加剂，如水，稳定剂， 蛋白聚集控制剂。

由所述蛋白和所述物质构成的本发明均相固体状态产品是水溶性的，它们的 水溶液可非胃肠道给药，或可用来制备非胃肠道给药的药品。

本技术领域公知的是，一些生物活性化合物具有潜在的治疗活性，但从不显 示出其益处，因为它们在水介质中溶解度很差。对它们中的一些从没有进行配制， 而一些没有达到临床开发“第一期”状态。它们中的一些由于用于配制的材料引 起的相对毒性高的“几乎没有生物相容性的”制剂。一个典型的例子由紫杉酮 (taxones)组代表，特别是紫杉醇(paclitaxel)为强的细胞生长抑制剂，但其使 用减少，这是由于在Klucel里已知的配方的毒性：吐温80或Klucel的和稀释 剂12，1：1 Cremaphor EL：乙醇的混合物。[癌症化疗和药理学(Cancer Chemotherapy and Pharmacology)(1994)34：465-471；国家癌症机构杂志(1990)1247-1259]。 Cremaphor EL(聚氧乙烷化的蓖麻油)具有内在毒性，会导致血管扩张、无生气、 低血压等。为了降低溶剂和辅剂的毒性副作用，提议使用一系列特殊的方法：在 较长时间里使用极少剂量，在治疗前进行药物预处理等。(USP 5665761；USP 5621001；USP 5670537等)。进一步的建议是使活性物质与包含于蛋白壁的壳里 的分散剂结合(USP 5 560 933)，所述的蛋白壁的壳通过使蛋白质与诸如豆油 的油反应而形成—这类制剂可用于紫杉醇和两性霉素。但即使最近的文献中也警 告注意如紫杉醇的使用疗程(参见，如“实用指南(Gudiance for Industry”， 美国人类健康服务部(CDER)颁布，1997，9，OGD-L-8)，其中—由于反应的过度敏 感性—所有用紫杉醇治疗的病人应当用皮质类固醇、苯海拉明和H2拮抗剂预治 疗。

进一步提议通过使其溶于有机溶剂或有机溶剂与水的混合物里，向所述的溶 液里加入水性的HSP溶液，以使不溶的活性物质析出的结晶最少来制备特定的水 不溶的二氢吡啶的非胃肠道给药制剂(匈牙利专利No.198381；DE申请3702105)。 但是，所得的液体仍然不是澄清的溶液。

进一步已知的是，一些水不溶活性物质与蛋白质或血清蛋白具有相当大的亲 和力。一些文献提及了对紫杉醇的结合[Cancer Chem.  and Pharm. (1994)34：465-471]；对双氯苯咪唑、fluconazole、两性霉素B的结合[感染 (Infection)，23(5)：292-297(1995)9月]；对氨甲酰氮的结合(J.Chromatogr. B Biomed.Appl.669(2)：281-288(1995，7，21)]；硫唑嘌呤的结合[Ann.N.Y.Acad. Sci，685(1993)：175-192]，对普鲁泊福的结合[J.Chromatogr.Sci(1992)：164- 166]。根据新文献[柳叶刀，第352卷(1998)：540-542]，药物Taxol使红细胞发 生卷轴，作为所述药物溶剂的聚环氧乙烷蓖麻油也是这样。一些水不溶药物(环 孢素，鬼臼噻吩甙，紫杉醇，两性霉素B)用毒性的Cremaphor配制。根据我们 的了解，对于，如ritonavit，氨甲酰氮，喜树碱，硫唑嘌呤，双氯苯咪唑， 氟康唑等，目前市场上尚没有活性高但水不溶的药物供非胃肠道、静脉内给药形 式。

因此，需要解决存在的问题，从而使有治疗价值的水不溶物质可以水溶形式， 优选的是非胃肠道对需要以所述活性组分治疗的病人进行给药。

本发明的目的是满足实践上具有对血浆蛋白有牢固结合亲和力的水不溶活性 组分的需要。

本发明基于这样的认知：在给药前活性物质与带有非共价键的合适的蛋白结 合呈现了一种新颖的和高度有效的释放系统，供水溶性差的活性组分给药。根据 本发明，产生均相的固体产品，然后溶于水，从而得到生物相容的、澄清的水溶 液，它适合非胃肠道给药。因此本发明提出了不需引入毒性元素给予所需水不溶 活性组分的手段，在某些情况下，它比以前更为有效。

本申请所用的定义如下，不再重复：

R1代表叔丁基-氧基羧酸酰胺或苯甲酰胺；

R2代表氢或酰基，优选的是乙酰基；

低水溶解度表示，室温下水中的溶解度＜1.10-4M)；

与血浆蛋白质牢固的结合亲和力表示在室温、自发平衡下，水介质中＞90％ 物质与蛋白质结合；

HSA：人体血清白蛋白，

WFI：注射用水。

本发明的一个目的是主要供非胃肠道给药、含水溶解度低、与控制聚集状态 下的人体血浆蛋白组分牢固结合亲和力的水溶性人体药物制剂。

本发明的另一个目的是主要供非胃肠道给药、含水溶解度低、与控制聚集状 态下的动物血浆蛋白组分牢固结合亲和力的水溶性兽药制剂。

可在本发明产品和药物制剂中存在的，因此能用于制备产品和组合物的人体 或动物血浆可为任何天然形成的蛋白质或血浆组分，如血清白蛋白、免疫球蛋白、 糖蛋白、干扰素和/或白介素以及它们的重组类似物。可使用人体和动物蛋白。 在旨在治疗人体的化合物和组合物中，优选的是使用天然的人体血清和重组人体 血清蛋白。

本发明实践上水不溶的活性组分包括很大范围的化合物，唯一的限制是它们 必须对所选择的血浆蛋白有牢固的亲和力。这类活性组分的例子包括下列治疗 剂：诸如紫杉类药物(taxonoide)的细胞生长抑制剂，抗生素，维生素，抗炎剂， 止痛药，抗惊厥药，免疫抑制剂，抗癫痫药，抗焦虑药，催眠药，抗真菌药，抗 凝血药，脂质体过氧化酶抑制剂，冠状动脉扩张剂，抗心率失常药，强心药，促 尿酸尿药，抗血栓形成药，类固醇激素(孕激素，雄激素，睾丸酮)和/或光敏 剂。在仔细考虑治疗剂量和对必须满足这类改变的所选择的蛋白的结合亲和力 后，几个活性组分可同时给药。

本发明的一个实施方案提供了含至少一种下列物质的上述产品和药物制剂： 两性霉素B、阿霉素类似物、炎爽痛、硫唑嘌呤、溴吡二氮、喜树碱、氨甲酰 氮、氯硝安定、环孢素A、安定、双香豆素、洋地黄毒甙、潘生丁、双异丙吡 胺、氟硝安定、二甲苯氧庚酸、ketochlorin、酮康唑、双氯苯咪唑、氮氟灭酸、 去甲羟基安定、苯巴比妥、苯妥英、孕酮、普鲁泊福、ritonavir、苯磺唑酮、 噻丙吩(suprofene)、tacrolimus、三苯氧胺、紫杉类药物、睾丸酮、tirilazad、 三甲补骨脂内酯、丙戊酸和/或华法令。

本发明优选的实施方案由含通式I的紫杉类药物的上述产品或制剂构成。

本发明另一个优选的实施方案包含或由紫杉醇(paclitaxel)和人体血清白 蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干扰素和/或白介素或一些其它的人体血清蛋白组 分构成。

本发明特别重要的代表方案是均相的、固体、水溶产品，所述的产品由至少 一种选自两性霉素B、阿霉素类似物、炎爽痛、硫唑嘌呤、溴吡二氮、喜树碱、 氨甲酰氮、氯硝安定、环孢素A、安定、双香豆素、洋地黄毒甙、潘生丁、双 异丙吡胺、氟硝安定、二甲苯氧庚酸、ketochlorin、酮康唑、双氯苯咪唑、氮 氟灭酸、去甲羟基安定、苯巴比妥、苯妥英、孕酮、普鲁泊福(propofol)、 ritonavir、苯磺唑酮、噻丙吩(suprofene)、tacrolimus、三苯氧胺、紫杉类药 物、睾丸酮、tirilazad、三甲补骨脂内酯、丙戊酸和/或华法令的至少一种活性 物质构成，也由至少一种选自人体血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干扰素和 /或白介素或一些其它天然或重组的人体血浆蛋白组分构成，其中所述的活性物 质和蛋白组分通过非共价键彼此连接，其中所述活性物质与所述蛋白组分的摩尔 比范围是1∶0.05到1∶100，优选的是1∶0.1到1∶50。

上述优选的代表是下列均相的、固体、水溶产品，由下列一对活性物质和蛋 白质构成：

通式I的紫杉类药物—式I中，R1代表叔丁基-氧基-羧酸酰胺或苯甲酰胺，

R2代表氢或任何酰基，优选的是乙酰基-

和血浆蛋白组分；

紫杉醇和人体血清白蛋白，重组人体血浆蛋白和/或γ-球蛋白；

两性霉素B和人体血清白蛋白，重组人体血浆白蛋白和/或γ-球蛋白；

喜树碱和人体血清白蛋白、重组人体血浆白蛋白和/或γ-球蛋白；

氨甲酰氮和人体血清白蛋白、重组人体血浆白蛋白和/或γ-球蛋白；

环孢素A和人体血清白蛋白、重组人体血浆白蛋白和/或γ-球蛋白；

普鲁泊福和人体血清白蛋白、重组人体血浆白蛋白和/或γ-球蛋白。

从上述解释可清楚地了解到，本发明覆盖了上述固体状态和水溶液形式的药 物制剂。

由于它涉及其天然结构，更具体地说，涉及它们的化学组合物，蛋白质分子 趋于通过它们特异性的结合位点进行聚集。聚集程度根据蛋白质存在其中的溶液 参数而定(温度、组成、组分的相对和绝对浓度、pH、离子强度)。

用于本发明的血浆蛋白优选的为稳定或控制的聚集状态。其目的是避免抑制 蛋白质与所用的活性组分作最佳结合的蛋白质聚集。通过存在的其它分子使能占 据参与聚集的大分子上的一些或全部的结合位点，以避免多个蛋白质—蛋白质联 合来控制蛋白质不需要的聚集。一些市售的蛋白质为控制的聚集状态：含稳定剂 以避免聚集。但该状态不总是本发明里进入与活性物质结合的最佳状态。

根据本发明，术语“控制的聚集状态”指蛋白质能与活性物质以所需的方式 结合时的最佳结合状态。当活性物质分子最大量结合于蛋白质时不需要该状态， 但当需要最高结合比例时则需要该状态。

这表示，在一些情况下我们必须从，如市售的血清白蛋白组分里除去其它赋 形剂，如稳定剂、离子组分等。当实施本发明方法时这可能是必须的起始步骤。 建立合适聚集状态的所需条件严格地根据真实的活性物质和相关的蛋白质组分而 定。

下面提供的例子(如紫杉醇和环孢素A)显示，没有其它赋形剂(如稳定剂、 离子组分、盐等)存在下，它们与血浆蛋白组分的结合较高。但是，其它的活性 物质(如两性霉素B和普鲁泊福)对在蛋白质稳定剂存在下的结合没有任何干扰。

因此，对本发明使用的每个和每对活性物质/蛋白质必须建立蛋白质合适的 特定聚集状态。

当使用紫杉醇和HSA对时：重要的是消除市售HSA中所有的稳定剂：如N- 乙酰基-D，L-色氨酸，碱性辛酸盐(在60℃下进行巴斯德杀菌期间用于稳定 蛋白质)。两性霉素B或普鲁泊福也可在这些稳定剂存在下与HSA结合。在某些 场合下，当所需的聚集状态可通过水达到时，必须经如下列实施例之一的方法除 去其它组分。

必须考虑下列因素以使本发明的特定物质与特定血浆蛋白组分的结合最佳：

a)物质在蛋白质上占据的结合位点的特性；

b)会占据相同结合位点，甚至竞争结合的存在于溶液里可能的其它组分；

c)证实真正结合位点和结合顺序的理化条件；

d)已知的治疗方向，如

i)在有单位(unic)运送特性的HSA上的紫杉醇；

ii)在有已证实的载体治疗活性的白介素上的紫杉醇；

iii)在有已证实的载体治疗活性的γ-免疫球蛋白上的环孢素A；

iv)在有已证实的载体治疗活性的γ-免疫球蛋白上的ritonavir；

制剂的稳定性。

最简单的聚集控制剂之一是水。用适当量的水可抑制不需要的聚集，使供本 发明备用的蛋白质—它呈“控制的聚集形式”。

根据本发明的一个实施方案，化合物和组合物可含蛋白质聚集控制剂或稳定 剂和/或溶液稳定的辅助添加剂。这类添加剂的例子如下：水，氯化钠，缓冲剂， 多元醇(如甘油)，水溶性糖衍生物(优选的是甘露醇，山梨醇和/或半乳糖醇和其 它物质)。

本发明的进一步目的包括制备本发明的新的产品和药物制剂的方法。该方法 包括下列步骤：

a)使水溶解度低并与血浆蛋白有牢固结合亲和力的治疗活性化合物(“活性 物质”)溶于可与水混和的药学上可接受的有机溶剂，

b)使所述的溶液与处于聚集状态的血浆蛋白组分的水溶液混合，任选的是

c)另外的药学上可接受的辅助添加剂—如蛋白质聚集控制剂和/或稳定剂—

从而得到含所述活性物质和通过非共价键结合的血浆蛋白组分的的真实溶 液；

d)优选地将溶液或其浓缩物进行超滤、渗析、二次过滤和/或冻干法，或组 合处理来除去有机溶剂

从而得到含活性物质和血浆蛋白组分的均匀的、水溶性液体或固体产品或药 物制剂；

e)任选地用水溶解或稀释固体或液体，从而得到适合于治疗给药的澄清、液 体组合物，和

f)任选地将产品制成非胃肠道给药制剂(剂型)供直接使用。

当按本发明制备由活性物质和通过非共价键与蛋白质连接的蛋白质构成的均 相固体产品时，优选的是使用包括下列步骤的方法：

a)将治疗活性化合物溶于可与水混和的、药学上可接受的有机溶剂，

b)使所述的溶液与处于控制聚集状态的选定的血浆蛋白组分的水溶液混合，

从而得到含所述活性物质和通过非共价键与蛋白质组分结合在一起的所述蛋 白组分的真溶液；

c)除去有机溶剂，冻干该溶液或它的浓缩物。

消除有机溶剂的合适方法依据于所涉及的活性物质和蛋白质。它遵从于活性 产物的性质(包括活性物质和蛋白质的配对物)，以使施加方法的条件保证温和。 冻干得到了均相、固体状态的水溶性产物，它能再溶于水，并可腹腔内给药。有 利地使上述步骤进行组合，如首先制备活性物质/蛋白质配对物，然后使所述浓 缩物冻干可使该方法更为经济。一些活性物质/蛋白质配对物(如两性霉素B/血 清白蛋白对)可通过超滤或渗析成功地进行浓缩。其它配对物(如紫杉醇/HSA) 优选地通过冻干处理。一些配对物可应当首先进行超滤，所得的浓缩物然后进行 冻干。

本技术领域人员很清楚，在用水制备非胃肠道药物稀释的进程中包括用另外 的含诸如氯化钠的非胃肠道上可接受的添加剂的这类水溶液进行稀释。

本发明在上述步骤a)中用来溶解活性组分的合适溶剂应当具有下列性质：

●它与水的混合物应当能完全溶解活性组分，

●其水含量＞50％的混合物应当不会使所用的蛋白质变性。

在开始用活性组分和蛋白质实施例本发明方法前，必须根据上述基础选择合 适的溶剂。适用的溶剂中，混合物含＞50％水仍能溶解活性组分。

可用于上述方法步骤a)的优选溶剂是，如选自脂族C(2-4)一元醇或多元醇， 70-100％乙醇，二甲基甲酰胺，甲基甲酰胺。

制备含蛋白质的溶液时，可存在一种聚集控制剂和/或溶液稳定剂。这类添 加剂包括进一步或优选量的水。它们也包括一些试剂它们能部分占据一些蛋白质 结合位点，以避免下列试剂引起的聚集：氯化钠，缓冲剂，诸如甘油的多元醇和 /或优选的是甘露醇，山梨醇，半乳糖醇的水溶性糖衍生物。

当对于任何活性组分选择最佳条件时，应通过初级测量来测定最佳结合亲和 力和相应的聚集性质。在下列实施例中，我们揭示了这类测定的完整的方法。

根据本发明的一个优选技术方案，用于步骤a)的化合物是紫杉醇和天然血 浆组分，如血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干扰素和/或白介素，或所述物 质的重组体。本发明另一个实施例方案包括使用了水不溶的细胞生长抑制剂，(如 紫杉类药物)、抗生素、维生素、抗炎剂、止痛剂、抗充血剂、免疫抑制剂、抗 癫痫药、抗焦虑药、催眠药、抗真菌剂、抗凝血剂、脂质体过氧化酶抑制剂、冠 状动脉扩张剂、抗心率失常药、强心药、促尿酸尿药、抗血栓形成药类固醇激素 (孕激素、雄性激素、睾丸酮)和/或光敏剂。可用于本发明方法的优选的活性物 质包括下列：两性霉素B、阿霉素类似物、炎爽痛、硫唑嘌呤、溴吡二氮、喜 树碱、氨甲酰氮、氯硝安定、环孢素A、安定、双香豆素、洋地黄毒甙、潘生 丁、双异丙吡胺、氟硝安定、二甲苯氧庚酸、ketochlorin、酮康唑、双氯苯咪 唑、氮氟灭酸、去甲羟基安定、苯巴比妥、苯妥英、孕酮、普鲁泊福、ritonavir、 苯磺唑酮、噻丙吩(suprofene)、tacrolimus、三苯氧胺、紫杉类药物、睾丸酮、 tirilazad、三甲补骨脂内酯、丙戊酸和/或华法令。

本发明优选的实施方案由制备均相、固体、水溶产品构成，所述产品由紫杉 醇和人体血清白蛋白构成，其中活性组分和血浆蛋白组分为非共价结合。本发明 再一个优选的实施方案包括制备由通式I的紫杉类药物e和血浆蛋白组分构成的 均相固体、水溶的产物的方法，其中活性组分和血浆蛋白组分为非共价结合。

从上述解释可以清楚地知道，本发明不限于上述列出的任何活性物质，也不 限于上述列出的蛋白质。

本发明的再一个目的包括使用本发明产品和制剂来治疗人类或兽类的患者 人。该方法包括对需要这类治疗的病人给予活性成分治疗有效量的本发明组合物 或根据本发明方法制备的组合物。给药剂量根据所用的活性组分和蛋白质而定。 当特定的已知活性通过其它给药途径给药时，给药剂量应能保证至少有相同的有 效血药浓度。

用对血浆蛋白有牢固结合亲和力的水不溶性治疗活性物质以非胃肠道途径治 疗人类或兽类患者的优选方法是用有效剂量的下列产物，优选的是用下列剂量范 围(以活性物质为基计算)的活性物质对需要治疗的病人非胃肠道给药：紫杉醇 /白蛋白70-280毫克/治疗；普鲁泊福/白蛋白6-10毫克/kg/小时；喜树碱/白 蛋白，二甲苯氧庚酸/白蛋白，环孢素A/白蛋白3-5毫克/kg/天；两性霉素B/ 白蛋白，最多为1.5毫克/kg/天，从而相同的剂量范围用于含各自重组蛋白的化 合物。

本发明的化合物、组合物和方法的优点如下：

●可以避免使用生物上不相容的赋形剂，以消除或总的避免剂量限制的副

  作用，涉及这类组分的是如毒性溶剂、表面活性剂、乳化剂等。

●使用血浆蛋白组分作为药物赋形剂没有另外的毒性作用，相反的是它们

  改进了病人的耐受力，如在化疗情况下。

●在需要情况下，与市售的药物相比本发明药物可增加使用剂量，因此可

  以改进治疗的全面成果。

本发明在下列非限定性实施例中作更详细的阐述：

实施例

I.制备方法，分析

下列方法用于测定特定活性组分(物质)与蛋白质的结合：

a)超滤

使含控制聚集状态的蛋白质的水溶液和活性组分在合适溶剂里的溶液混合 形成的澄清溶液1毫升样品经超滤膜(截留限定＞30000Da)过滤，测定超滤滤液 组分里的活性组分。测定未过滤溶液里的活性组分浓度时，总量(＞90％)以未 改变形式得到回收。

b)冻干

使1毫升上述溶液冻干。冻干后使固体残留物溶于约1.00毫升蒸馏水，得 到澄清溶液。测定该溶液的活性组分浓度，在水相没有发现活性组分，但从蛋白 组分里可回收100％。

c)分析活性组分

通过HPLC分析测定活性组分，用UV光谱检测。

如在Waters Millennium(Waters，美国马里兰)HPLC系统上进行HPLC分析。 它的组成是：Waters 616泵；Waters 600S控制器；Waters717+自动样品注射器， 温度稳定设置在+5℃；Waters 996二极管排列UV/VIS检测器。启动该系统， 通过在Digital P486/166(Digital Equipments，英国)个人电脑上运行的Waters Millnnium v.2.02.0来获取数据。对每个化合物进行个体最优化条件，下面例 举一些化合物。

d)证实化学结构

LC/MS方法用来证明从连接组分里回收的物质的化学结构不变。LC/MS分析 在用ES或APCI+离子化模式的Finnigan Navigator(Finnigan，英国曼彻斯特) single quandrupole LC/MS质谱仪上进行，它带有MassLab V.2.0数据获取系 统的Digital Venturis FX/166(Digital Equipments，英国)个人电脑。根据参 考文献，应用条件对于每个特定的物质必须个体最优化—下列实施例给出了一些 例子。

e)样品的制备

下面是典型的样品制备方法，通过HPLC和/或LC/MS分析从样品中测定总 浓度/物质含量。

冻干瓶子的固体组分用水重新组成，该溶液与无水乙醇以1∶1(体积)比 混合，沉淀去血浆蛋白，同时物质溶解。迅速离心后，溶液适合进行HPLC或LC/MS 分析。在LC/MS里，通过直接样品导入或经HPLC通过组分彼此分离后进行分析。 两种方法得到了母体化合物和/或可能降解产物的化学结构的有价值的信息，下 面给出了一些产物的更详细的方法。

来自HPLC和LC/MS研究的光谱数据和质谱数据可证实用作起始物质的已知 生物活性物质和根据本发明，与蛋白组分连接后回收的化合物之间的化学等价 性。

f)所用的物质

所用的活性物质为USP XXIII质量。

下列血浆蛋白组分用于实验：  (*＝欧洲药典质量)

人体白蛋白20％溶液*         人类RT.公司，匈牙利

RecombuminTM25％           DELTA Biot.Ltd，英国诺丁汉

人体白蛋白20％              Biotest Ph.，德国

Albumeon USP                Centeon Bio-Services，美国

人体白蛋白20％Behring*      Centeon Ph.GmbH，澳地利

人体γ球蛋白16％*           人类RT.公司，匈牙利

II.制备和化学或物理分析

在下列实施例中，血浆蛋白：基底结合比的平均范围为1∶0.1-100。物质： HSA结合比根据HSA分子量＝＝66500，人体γ球蛋白分子量＝＝150000的推断 来计算。[参见11 Science，244.P.1195-1198，1989；Vox Sang，70：203-209页， 1996]。

实施例II.1

使20％(3.08×10-3M)控制聚集状态下的人体血清白蛋白溶液和 1mg/ml(1.17×10-3M)紫杉醇在无水乙醇里的溶液以4∶1比率混合，搅拌得到澄 清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量水中以保证得到浓度为20％人体血 清白蛋白的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示99％紫杉醇与 人体血清白蛋白结合。这代表人体血清白蛋白∶紫杉醇为1∶0.1。

实施例II.2

使4.44％(6.67×10-4M)处于控制的聚集状态的人体血清白蛋白溶液和 2.0mg/ml(2.34×10-3M)紫杉醇(分子量853.92)在无水乙醇里的溶液以9∶1 的比率混合，搅拌直到得到澄清溶液。如实施例II.1所述进-步处理溶液。

对来自超滤滤液和保留组分进行结合测定，显示紫杉醇与人体血清白蛋白 结合达99％。这代表人体血清白蛋白∶紫杉醇比为1∶0.39。

实施例II.3

使4.44％(6.67×10-4M)处于控制的聚集状态的重组人体血清白蛋白溶液 和2.0mg/ml(1.40×10-3M)紫杉醇在无水乙醇里的溶液以9∶1的比率混合，搅 拌直到得到澄清溶液。冻干溶液；使固体残留物再溶于足量水中以保证得到浓度 为20％重组人体血清白蛋白的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合， 显示99％紫杉醇与人体血清白蛋白结合。这代表重组人体血清白蛋白∶紫杉醇 为1∶0.24。

实施例II.4

使2.25％(1.5×10-4M)处于控制的聚集状态的人体γ球蛋白溶液和 0.1mg/ml(1.171×10-4M)紫杉醇在无水乙醇里的溶液以9∶1的比率混合，搅拌 直到得到澄清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量水中以保证得到浓度为16％人体γ 球蛋白的澄清溶液。

从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示98％紫杉醇与人体血清白蛋白结 合。这代表人体γ球蛋白∶紫杉醇之比为1∶0.71。

在上述实施例II.1到II.3中，用下列方法通过HPLC对紫杉醇定量：

柱    MN Nucleosil C185微米250×2毫米

流动相乙腈∶水＝73∶27

流速  0.30ml/分钟

温度  室温

检测  273纳米下

典型的保留时间  5.9分钟  k’＝2.93

用LC/MS测定物质并发现没有改变[参见质谱分析里的快速信息(Rapid Communications in Mass Spectrometry)第11卷：1025-1032页，1997，和第 9卷495-502页，1995]。图6显示了对比结果：图6A显示标准质谱，图6B显 示再溶解样品的曲线。图6C显示紫杉醇的碎片。

LC/MS参数：离子化：APCI+界面；氮气流速：300升/小时；溶剂：乙腈∶ 缓冲液＝60∶40，其中缓冲液是10mM甲酸铵，用10％甲酸调节到pH5。0；流速： 0.300毫升/分钟。

紫杉醇含量测定：

C-18反相HPLC方法用来定量测定来自实施例II.1到II.27的不同溶液的 紫杉醇。将样品注入HPLC系统，样品在≥50％乙醇溶液里，以防止物质沉淀。

结合

在8±2℃下平衡15分钟后测定物质与血浆蛋白的结合。

在经合适膜(其截留必须大于蛋白质分子量)超滤后可测量物质的分布， 测定超滤滤液组分(代表未结合的组分)里和超滤前溶液里的物质浓度，蛋白质 变性时释放了结合部分(代表总量)。为了使蛋白质变性并释放已结合的组分， 以1∶1的比率使用预冷至8+2℃的无水乙醇。根据稀释的倍数计算真正的浓度 值和含量。

实施例II.5到II.21

浓度范围为20％(3.08×10-3M)到0.02％(3.08×10-6M)与浓度范围为20 毫克/毫升(2.34×10-2M)到0.01mg/ml(1.17×10-5M)的紫杉醇在无水乙醇中的溶 液混合，得到总是澄清的溶液。详细情况如表I所示。所有的测量进行三次，对 计算结果进行平均。

                             表    I 实施例     [T]T     (mM)     [HSA]     (mM)     n(TB)/n     (HSA)   n(TB)/n/TT/×     100％     II.5     0.2342     2.410     0.093     97.4     II.6     0.2342     1.205     0.177     93.2     II.7     0.2342     0.602     0.346     91.0     II.8     0.2342     0.301     0.648     85.2     II.9     0.2342     0.121     1.545     81.2     II.10     0.2342     0.0602     3.215     82.1     II.11     0.2342     0.0241     5.662     59.5     II.12     0.2342     0.0121     4.948     26.0     II.13     0.2342     0.00602     5.823     15.3     II.14     0.2342     0.00241     10.419     11.0     II.15     0.2342     0.00121     14.367     7.6     II.16     0.2342     0.000602     12.370     3.3     II.17     4.6843     0.121     4.135     10.9     II.18     2.3421     0.121     8.401     44.2     II.19     1.1711     0.121     4.585     48.2     II.20     0.4648     0.121     2.864     75.3     II.21     0.1171     0.121     0.765     80.4 图例： [T]T：  加入人体血清白蛋白后总的紫杉醇浓度 [HSA]：  人体血清白蛋白浓度 n(TB)/n(HSA)：  每摩尔人体血清白蛋白结合的紫杉醇摩尔数 n(TB)/n/TT/×100％：结合的紫杉醇百分数

图7显示了紫杉醇浓度变化(具有0.08％HSA，10％乙醇，0.002mg/ml紫杉醇)； 图8显示了白蛋白浓度变化(具有0.004-16.0％HSA，20％乙醇，0.2mg/ml紫杉醇)。 图9显示了与HSA结合的紫杉醇的变化(带有0.8％HSA，10％乙醇，0.1-2.0mg/ml紫 杉醇)在pH4.0到8.5时对pH的函数。图中的符号相应于下列实施例：

实施例II.18-◆-◆-

实施例II.19-○-○-

实施例II.20-×-×-

实施例II.15-◇-◇-

实施例II.21-▲-▲-

实施例II.22

对于动物血清白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、干扰素和白介素用实施例II.2 到实施例.21的相似方法。

实施例II.23

处理市售的人体血清白蛋白或重组人体血清白蛋白(在白蛋白后)以得到 控制聚集状态，具有最好的分子结合条件，包括除去稳定剂，如辛酸钠、N-乙 酰基-D，L-色氨酸和其它离子组分和盐。

a)超滤方法

用盐酸调节含10％白蛋白的溶液pH至3.0，用重蒸水稀释到5％蛋白含量。 用超滤(膜截留限度为30000kD)浓缩溶液，使蛋白质含量为10％。

用1.0mM盐酸再将溶液稀释到5％蛋白质含量。用超滤(膜截留限度 30000kD)浓缩溶液到10％蛋白质含量。

重复过程12×，然后用2.0M氢氧化钠水溶液调节pH到6.9，用重蒸水稀 释溶液到5％浓度蛋白质含量。再用超滤(膜截留限度为30000kD)使溶液浓缩 到10％蛋白质含量。

用重蒸水将溶液再稀释回5％蛋白质含量。用超滤(膜截留限度为30000kD) 使溶液浓缩到10％蛋白质含量、重复过程10×，得到纯净的蛋白质组分，足以 除去其它赋形剂。此时，超滤液的导电性接近于用于稀释的重蒸水的传导电性。 该蛋白质适合用于与诸，如紫杉醇或环孢素结合。

b)不使用超滤而用渗析得到相似的结果。处理需要约48小时。

实施例II.24

使0.8％(1.203×10-4M)HSA溶液和4.0mg/ml(4.33×10-3M)两性霉素B溶液 (分子量＝924.09)在DMF里的溶液以9∶1混合，搅拌得到澄清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量水中以保证得到浓度为20％HSA的 澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示99.7％两性霉素B与HSA 结合。这代表HSA∶两性霉素B之比为1∶4。

实施例II.25

使0.8％(1.203×10-4M)重组人体血清白蛋白溶液和40.0mg/ml(4.33×10-2M) 两性霉素B溶液在DMF+HCl里的溶液以9∶1混合，搅拌得到澄清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量水中以保证得到浓度为20％重组HSA 的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示99.5％两性霉素B与HSA 结合。这代表HSA∶两性霉素B之比为1∶40。

两性霉素B遵照下列方法的HPLC进行测量：

柱  MN Nucleosil C18 5微米250×2mm

流动相  乙腈∶缓冲剂＝1∶1

       (缓冲剂：用三乙胺调节到pH4.0的0.2％甲酸)

流动速率0.30ml/分钟

温度  室温

检测在365纳米下

典型的保留时间  5.3分钟，k’＝1.41

用LC/MS测定物质，发现没有改变，图2显示了对比的结果：图2A显示了 标准的质谱，图2B显示了再溶解样品的曲线。图2C显示了两性霉素B片段。

LC/MS参数：离子化：ESI+界面；

氮气流动速率：300升/小时；溶剂：20mM甲酸铵，用10％甲酸调节为pH4.0； 流动速率：0.300ml/分钟。

实施例II.26

使0.4％(6.015×10-5M)处于控制聚集状态的HSA溶液和0.14mg/ml(4.02 ×10-4M)喜树碱(分子量＝348.36)在无水乙醇里的溶液以4∶1混合，搅拌得 到澄清溶液。冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量的水，以保证得到浓度为20 ％HSA的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示98％喜树碱与HSA 结合。这代表HSA∶喜树碱为1∶5.34。

实施例II.27

使0.4％(6.015×10-5M)处于控制聚集状态的重组HSA溶液和 0.14mg/ml(4.02×10-4M)喜树碱在无水乙醇里的溶液以4∶1混合，搅拌得到澄 清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量的水，以保证得到浓度为20％重组 HSA的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示98％喜树碱与HSA结 合。这代表重组HSA∶喜树碱为1∶5.34。

我们按下列条件的HPLC测定喜树碱：

柱  MN Nucleosil C18 5微米250×2mm

流动相  乙腈∶缓冲剂＝33∶67

流动速率  0.33ml/分钟

温度  室温

检测  在356纳米下

典型的保留时间  6.9分钟，k’＝2.45

用LC/MS测定物质，发现没有改变[癌症研究，第56卷：3689-3694页， 1996]。

实施例II.29

使0.4％(6.015×10-4M)处于控制聚集状态的HSA溶液和8.0mg/ml(3.39× 10-2M)氨甲酰氮(分子量236.27)在无水乙醇里的溶液以19∶1混合，搅拌 得到澄清溶液。冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量的水，以保证得到浓度为 20％HSA的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示98％氨甲酰氮 与HSA结合。这代表HSA∶氨甲酰氮为1∶2.8。

我们按下列条件的HPLC测定氨甲酰氮：

柱  MN Nucleosil C18 5微米250×2mm

流动相  乙腈∶缓冲剂＝1∶1

       (缓冲液：用三乙胺将pH调节到7的0.2％甲酸)

流动速率  0.25ml/分钟

温度  室温

检测  在285纳米下

典型的保留时间  5.3分钟，k’＝1.12

用LC/MS测定物质，发现没有改变[Eur.J.Clin.Chem Clin.Biochem，第 35卷(10)：755-759页，1997]。图3显示了比较结果：图3A显示标准质谱， 图3B显示再溶解样品曲线，图3C显示氨甲酰氮的片段。

LC/MS参数：离子化：ESI+界面；氮气流速：300升/小时；溶剂：2mM甲 酸铵；流速：0.250ml/分钟。

实施例II.30

使4.0％(6.015×10-4M)处于控制聚集状态的HSA溶液和1.0mg/ml(8.33× 10-4M)环孢素A(分子量1202.63)在无水乙醇里的溶液以9∶1混合，搅拌得 到澄清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量的水，以保证得到浓度为20％HSA 的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示97％环孢素A与HSA结 合。这代表HSA∶环孢素A为1∶0.14。

实施例II.31

使2.0％(3.008×10-4M)处于控制聚集状态的重组HSA溶液和1.0mg/ml(8.33 ×10-4M)环孢素A在无水乙醇里的溶液以9∶1混合，搅拌得到澄清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量的水，以保证得到浓度为20％重组 HSA的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示98％环孢素A与重组 HSA结合。这代表重组HSA∶环孢素A为1∶0.29。

实施例II.32

使2.25％(1.50×10-4M)处于控制聚集状态的人体γ球蛋白溶液和 1.0mg/ml(8.33×10-4M)环孢素A在无水乙醇里的溶液以9∶1混合，搅拌得到 澄清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量的水，以保证得到浓度为16％人体 γ球蛋白的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示98％环孢素A 与人体γ球蛋白结合。这代表人体γ球蛋白∶环孢素A为1∶0.56。

我们按下列条件的HPLC测定环孢素A：

柱  MN Nucleosil C18 5微米250×2mm

流动相  乙腈∶水∶甲醇∶磷酸＝700∶260∶40∶0.05

流动速率  0.350ml/分钟

温度  80℃热稳定

检测  在205纳米下

典型的保留时间  7.5分钟，k’＝2.95

如结果显示，用LC/MS测定物质，发现没有改变[1]。图4显示了比较结果： 图4A显示标准质谱，图4B显示再溶解样品曲线，图4C显示环孢素A的片段。

LC/MS参数：离子化：ESI+界面，氮气流速：300升/小时；溶剂∶乙腈/ 水＝60/40；溶剂流速：0.350ml/分钟。

实施例II.33

使0.4％(6.015×10-5M)HSA溶液和2.0mg/ml(1.12×10-2M)普鲁泊福(分 子量178.27)在无水乙醇里的溶液以9∶1混合，搅拌得到澄清溶液。

冻干溶液；使固体残留物再溶于足量的水，以保证得到浓度为20％HSA的 澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示99％普鲁泊福与HSA结合。 这代表HSA∶普鲁泊福为1∶18.3。

实施例II.34

使0.4％(6.015×10-5M)重组HSA溶液和2.0mg/ml(1.12×10-2M)普鲁泊福 在无水乙醇里的溶液以9∶1混合，搅拌得到澄清溶液。

冻干该溶液；使固体残留物再溶于足量的水，以保证得到浓度为20％重组 HSA的澄清溶液。从超滤滤液和保留组分中测定结合，显示99％普鲁泊福与HSA 结合。这代表重组HSA∶普鲁泊福为1∶18.3。

我们按下列条件的HPLC测定普鲁泊福：

柱  MN Nucleosil C18 5微米250×2mm

流动相  乙腈∶水＝73∶27

流动速率  0.30ml/分钟

温度  室温

检测  在273纳米下

典型的保留时间  6.1分钟，k’＝1.77

如结果显示，用LC/MS测定物质，发现没有改变[J.of Chromatography B， 669：358-365页，1995]。图5显示了比较结果：图5A显示标准质谱，图5B显 示再溶解样品曲线，图5C显示普鲁泊福的片段。

LC/MS参数：离子化：APCI+界面，氮气流速：300升/小时；溶剂：乙腈/ 水＝73/23；溶剂流速：0.300ml/分钟。

实施例II.35

使9.0毫升0.8％(1.213×10-4M)HSA溶液和1.0毫升4.0mg/ml(4.33×10-3 M)两性霉素B在二甲基甲酰胺里的溶液混合得到澄清溶液。在4℃下使该溶液 对2.0升水(WFI)避光渗析达20小时。

用实施例II.24的测定方法测得，结合为99.6％，代表HSA∶两性霉素B的 比为1∶3.5。

渗析过程重复5次，使溶液中的DMF浓度降低到检测限度(2×10-9M)下。

III.剂型

实施例III.1到III.6

按照如上所述的冻干制备方法得到合适的药物剂型。将固体再溶于适量体 积的注射用水以使溶液中HSA浓度为20％，下表综述了一些活性物质在适合治 疗使用的该溶液中的浓度：     实施例     名称     浓度mg/ml     III.1     两性霉素B     11.09     III.2     喜树碱     6.8     III.3     氨甲酰氮     1.98     III.4     环孢素A     0.50     III.5     紫杉醇     1.0     III.6     普鲁泊福     10.0 上述剂型可进一步装入安瓿供注射和输液用。 IV.生物实施例 对生物等价的研究

使本发明新制剂与已知用于治疗的含水溶解度差的相同活性物质的制剂进 行比较，测定生物等价。这类已知的制剂制备于聚环氧乙烷化的蓖麻油(Cremophor EL)和无水乙醇里。

使用的物质：

溶于聚环氧乙烷化的蓖麻油(Cremophor EL)∶无水乙醇＝1∶1混合物的紫杉 醇与本发明实施例II.2制备的紫杉醇/HSA水溶液进行比较。

实施例IV.1体外研究

体外进行比较研究以测定对人体肿瘤细胞系的抗增殖和细胞毒性活性。在 K562人体骨髓白血病、MCF-7和MDA-231乳腺和OVCAR-5卵巢癌细胞系上比 较紫杉醇的Cremophor EL/无水乙醇制剂和紫杉醇/HSA制剂[抗癌研究，第16 卷：2469-2478，1996]。

方法：

菌落生长抑制分析：用两个上述制剂里的8个不同浓度的药物加上在DMSO/ 盐水溶液里的作为参照处理细胞系单层培养物。使培养物培养24、48、72、96 和120小时。菌落用结晶紫染色，按由未处理细胞形成的菌落以百分数来计算被 处理细胞的存活率。表IIA到IVB显示不同细胞系得到的结果。在每个研究中显 示了被处理细胞的存活率，按未处理细胞形成的菌落以百分数来计算。所有的数 值是三个实验的平均值。

                      表IIA

              细胞系：MCF7乳腺癌

      制剂：紫杉醇/Cremophor EL和无水乙醇 Pt×cc[μM]t[h] 24小时 48小时 72小时   96小时 120小时     0.005     92*     86     76     42     30     0.01     90     81     72     33     26     0.02     86     71     67     29     23     0.025     84     64     60     24     18     0.05     82     60     52     23     16     0.1     80     57     38     18     15     1.0     68     46     28     15     6.5     10.0     62     33     21     10     4.6

                                 表IIB

                       细胞系：MCF7乳腺癌

                           制剂：紫杉醇/HSA  Pt×cc[μM]t[h] 24小时 48小时 72小时 96小时 120小时     0.005     91     84     75     41     27     0.01     88     81     69     35     23     0.02     84     76     64     31     20     0.025     80     70     59     28     16     0.05     77     66     53     25     12     0.1     75     59     46     20     9.5     1.0     67     42     30     17     6.2     10.0     58     31     21     9.0     3.0

                     表IIIA 

              细胞系：MDA-231乳腺癌

            制剂：紫杉醇/Cremophor EL和无水乙醇   Pt×cc[μM]t[h]   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时     0.005     97     89     80     47     34     0.01     94     87     75     41     30     0.02     89     82     69     37     28     0.025     86     76     65     34     23     0.05     84     72     59     29     21     0.1     83     66     53     26     18     1.0     73     49     34     21     9.5     10.0     65     37     24     14     8.2

                        表IIIB

                  细胞系：MDA-231乳腺癌

                    制剂：紫杉醇/HSA   Pt×cc[μM]t[h]   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时     0.005     92     78     51     30     10     0.01     86     65     38     24     8.3     0.02     75     51     33     22     7.0     0.025     64     47     28     19     6.4     0.05     60     42     26     18     5.3     0.1     55     36     24     16     4.0     1.0     49     33     22     15     3.2     10.0     45     26     20     10     2.6

                         表IVA 

              细胞系：K562人体骨髓白血病

        制剂：紫杉醇/Cremophor EL和无水乙醇   Pt×cc[μM]t[h]   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时     0.005     88     59     30     21     10     0.01     79     40     21     15     8.7     0.02     66     31     19     12     7.2     0.025     62     29     17     10     6.0     0.05     56     25     14     9.4     5.4     0.1     51     23     12     7.7     4.6     1.0     47     20     10.5     6.0     3.0     10.0     39     16     9.5     4.2     2.0

                     表IVB

    细胞系：K562人体骨髓白血病样品：紫杉醇/HSA  Pt×cc[μM]t[h] 24小时 48小时 72小时 96小时 120小时     0.005     89     53     31     18     5.4     0.01     75     40     22     11     4.7     0.02     69     32     18     9.0     4.0     0.025     65     30     14     7.6     3.5     0.05     58     25     11     7.0     3.0     0.1     53     21     9.5     5.6     2.4     1.0     47     18     8.0     5.0     1.7     10.0     41     16     7.1     4.7     1.0

实施例IV.2：体内药代动力学试验 

从治疗角度来看，可考虑生物等价，显示出相等的药代动力学特征，如AUC (曲线下面积)、消除常数、对相同样品给予相同剂量后血浆半衰期。在大鼠上 对如实施例IV.1所述的两个制剂进行这类实验(Semin Oncol，第21卷(5增补 8)：53-62页，1994)。

AUC表示血浆浓度对时间曲线下的面积。在不同时间点处测量给予的化合物 的血药浓度。

在大鼠上的药代动力学研究：

方法：以2.5mg/kg紫杉醇剂量对CR.(Wi)BR大鼠(体重为380-420克) 进行1.0毫升静脉注射成药团，如下面指出的时间点处从三个动物里取出10毫 升血样，放入肝素化的试管里： #  0’ 10’  20’  30’  45’  60’  90’  2h  3h 4h  5h  6h 1  +  +  + 2        +   + 3        +   +   + 4            +   +  + 5                +  +   + 6                   +   +   + 7                       +   +   + 8                           +   +  + 9                               +  +   + 10                                 +   +   + 11 +                                   +   + 12 +  +                                    +

通过5℃下快速离心分离血浆组分，在-70℃下冷冻到进行分析测量为止。

样品制备：使冷冻血浆样品温热到+8℃，在5000转/分钟下离心5分钟。 取出0.300-0.500ml澄清血浆溶液，放置在Oasis HLB 1 cc SPE(固相)萃取柱 上。在血浆样品负载到柱体上前，柱用1毫升甲醇，然后用1毫升水进行淋洗来 预适应环境。紫杉醇吸附在SPE柱上，而样品组分的剩余部分则用1毫升水和1 毫升30％乙腈/水溶液淋洗下来。柱用空气吹干。用1毫升无水乙醇从SPE柱上 洗脱紫杉醇。用氮气蒸干样品，在(-20℃)下放置供分析。残留物溶于0.200 毫升无水乙醇，注入供HPLC分析。

HPLC条件与同一物质鉴定使用的条件相同。

结果：

得到的点是从三个个体动物的三次测量中得到的平均值。结果，从等剂量 的两个不同制剂的药代动力学研究得到的两个曲线之间的差别在个体样品的差异 范围内。相同的曲线由所有的单个数据绘制得到，表明两种之间的药物动力学特 征没有差异或有很小的差异。

实施例IV.3

抗增殖和细胞毒性活性研究的体内评估显示，新制剂对裸鼠里的人体肿瘤 异种移植物CH1和CH1tax有阳性作用。

实施例IV.4

超敏性试验

用紫杉醇治疗的约45％病人有超敏反应。据证明，这些副作用与制剂的一 种赋形剂，Cremophor EL有关，这在含相同组分的其它药物中也可观察到。当 过敏性毒性通过Cremophor EL诱导组胺释放来表达时决定了该超敏反应。

我们的研究在体重为130-150克[14]的CRL(WI)BR雄性大鼠上进行。给 药剂量对于紫杉醇是约7.0mg/kg，静脉注射，其总体积为1毫升。每个时间点和 剂量的组包含5个动物。在处理后2分钟、5分钟和10分钟时血样被收集到含 肝素的试管里。通过快速离心分离血浆。在-70℃下贮存样品。

通过特定的组胺-N-甲基-转移酶使样品中的组胺组分C14-甲基化。测量 样品中C14放射性来测定血浆样品里的组胺水平。

得到的数据表明，Cremophor EL和含该组分的制剂会明显诱导组胺释放， 而HSA、含HSA的制剂和紫杉醇本身没有这类作用。

实施例IV.5

用来自人体血样的体外人体实验，根据对血液淋巴细胞的染色体活化的定 量分析可发现与实施例IV.4相同的现象[方法：分析和定量细胞学和组织学，第 8卷：第1页，1986]。