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具有改善的药代动力学性质的坎普他汀类似物

阅读：2发布：2020-05-31

专利汇可以提供具有改善的药代动力学性质的坎普他汀类似物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了包含能够结合C3蛋白并且抑制补体活化的肽的化合物。所述化合物包括其中N末端包含添加的或取代的组分的坎普他汀类似物，相较于等同条件下的未修饰坎普他汀肽，所述组分改善了(1)所述肽对于C3或其片段的结合亲和力，(2)所述肽在水性液体中的溶解度，(3)所述肽的血浆稳定性，(4)所述肽的体内停留和/或(5)所述肽的生物利用度。还公开了使用所述化合物的药物组合物和方法。，下面是具有改善的药代动力学性质的坎普他汀类似物专利的具体信息内容。

权利要求

1.具有SEQ ID NO：18所示序列的肽。
2.权利要求1的肽，其置于药物组合物中，所述药物组合物包含用于所述肽的药学上可接受的载体。
3.权利要求1的肽，其中还包含延长所述肽的体内保留的另外的组分。
4.权利要求3的肽，其中所述另外的组分选自：
(a)聚乙二醇(PEG)；
(b)白蛋白结合小分子；和
(c)白蛋白结合肽。
5.权利要求4的肽，其中所述结合白蛋白的小分子是ABM2。
6.权利要求4的肽，其中所述结合白蛋白的小分子直接地或通过所述肽和白蛋白结合小分子之间的间隔基连接到该肽的末端。
7.由SEQ ID NO：18组成的肽。
8.权利要求7的肽，其置于药物组合物中，所述药物组合物包含用于所述肽的药学上可接受的载体。
9.一种调节补体激活的方法，包括使需要调节补体激活的培养基与坎普他汀类似物接触，其中所述接触导致培养基中补体激活的调节。
10.权利要求9的方法，其中所述培养基包含培养的细胞或组织。
11.药物组合物，其包含坎普他汀类似物与药学上可接受的载体的组合。

说明书全文

具有改善的药代动力学性质的坎普他汀类似物

[0001] 本申请是申请日为2012年9月7日、发明名称为“具有改善的药代动力学性质的坎普他汀类似物”的中国发明专利申请No. 201280050936.4的分案申请。

[0002] 政府资助

[0003] 依据35U.S.C.§202(c)，承认美国政府可具有本文中描述的发明的某些权利，所述发明是部分利用来自美国国立卫生研究院的基金号GM 62134、AI30040、AI068730、GM097747和EY020633下的资金进行的。发明领域

[0004] 本发明涉及机体内补体级联的活化。具体地，本发明提供了以纳摩尔浓度亲和力结合C3蛋白和抑制补体活化，显示强劲水溶解性、血浆稳定性和体内停留，并且通过多种施用途径可具有生物利用度的肽和肽模拟物(peptidomimetics)。

[0005] 发明背景

[0006] 在整个说明书中引用了各种出版物，包括专利、公开申请、技术论文和学术论文。这些引用的出版物中每一篇通过引用整体并入本文。

[0007] 人补体系统是对抗致病性生物体的防御和免疫反应介导中的有力的参与者。补体可通过3个不同途径活化：经典途径、凝集素途径和旁路途径。3个不同途径共有的主要活化事件是补体系统的中心蛋白C3被 C3转化酶蛋白水解切割成其活化产物C3a和C3b。这些片段的产生导致 C3b和iC3b对致病细胞的调整作用(使它们易受吞噬作用或清除的过程)，以及导致通过与补体受体的相互作用发生的免疫细胞活化 (Markiewski&Lambris,2007,Am J Pathol 171:715-727)。C3b在靶细胞上的沉积还诱导新的转化酶复合物的形成，从而起始自我扩增回路。

[0008] 血浆和细胞表面结合蛋白一起仔细地调节补体激活，防止宿主细胞被补体级联自我攻击。然而，补体的过度活化或不适当的调控可导致许多致病状况，包括自身免疫病到炎性疾病(Holers,2003,Clin Immunol 107:140-51；Markiewski&Lambris,2007,同上；Ricklin&Lambris, 2007,Nat Biotechnol 25:1265-75；Sahu等人,2000,J Immunol 165:
2491-9)。因此非常希望开发治疗性补体抑制剂。在本说明书中，C3和 C3b已显示为有前景的靶，因为它们在级联中的中心作用允许同时抑制补体的起始、放大和下游活化(Ricklin&Lambris,2007,同上)。

[0009] 坎普他汀(compstatin)是首个显示能够阻断所有3个活化途径的非宿主来源的补体抑制剂(Sahu等人,1996,J Immunol 157:884-91； U.S.Patent 6,319,897)。该环状十三肽结合C3和C3b二者，并且阻止 C3转化酶对天然C3的切割。其高抑制效力已通过一系列使用实验模型的研究得以确认，所述研究指出其作为治疗剂的潜能(Fiane等人,1999a, Xenotransplantation 6:52-65；Fiane等人,1999b,Transplant Proc 31:934-935；Nilsson等人,1998Blood 92:1661-1667；Ricklin& Lambris,2008,Adv Exp Med Biol
632:273-292；Schmidt等人,2003, J Biomed Mater Res A 66:491-499；Soulika等人,
2000,Clin Immunol 96:212-221)。坎普他汀的逐渐优化已产生了具有改善活性的类似物 (Ricklin&Lambris,2008,同上；WO2004/026328；WO2007/062249)。这些类似物之一目前正在临床试验中测试用于治疗年龄相关黄斑变性 (AMD)(工业化国家中老年患者失明的首要原因)(Coleman等人,2008, Lancet 372:1835-1845；Ricklin&Lambris,2008,同上)。鉴于其在 AMD和其它疾病中的治疗潜能，对坎普他汀进行进一步优化以获得甚至更大的效力是相当重要的。

[0010] 早期的结构-活性研究已将坎普他汀肽的环状性质以及β-转角和疏水簇的存在鉴定为该分子的主要特征(Morikis等人,1998,Protein Sci 7:619-627；WO99/13899；Morikis等人,2002,J Biol Chem 277:14942-14953；Ricklin&Lambris,2008,同上)。发现位置4和7 上的疏水残基特别重要，利用非天然氨基酸修饰它们产生了活性比原始坎普他汀肽改善24倍的类似物(Katragadda等人,2006,J Med Chem 49: 4616-4622；WO2007/
062249)。

[0011] 虽然先前的优化步骤是基于组合筛选研究、溶液结构和计算机模型 (Chiu等人,2008,Chem Biol Drug Des 72:249-256；Mulakala等人, 2007,Bioorg Med Chem 15:
1638-1644；Ricklin&Lambris,2008,同上),但与补体片段C3c复合的坎普他汀共晶体结构的公布(Janssen等人,2007,J Biol Chem 282:29241-29247；WO2008/153963)代表了起动合理优化的重要里程碑。晶体结构显示了C3c的巨球蛋白(MG)结构域 4和5的界面上的浅结合部位，并且显示13个氨基酸中的9个通过氢键或疏水作用直接参与结合。与溶液中的坎普他汀肽的结构(Morikis等人, 1998,同上)相比较，坎普他汀的结合形式经历构象改变，β-转角的位置从残基5-8移至残基8-11(Janssen等人,2007,同上； WO2008/153963)。

[0012] 本发明人最近开发了一系列基于肽主链(特别地肽的位置8)上的甲基化和侧翼位置13上的取代的具有改善效力的一系列坎普他汀类似物(Qu等人,2011,Molec Immunol 48:481-489,WO2010/127336)。这些修饰据报导产生了结合亲和力优于大多数迄今报导的活性类似物的坎普他汀类似物。

[0013] 坎普他汀及其类似物具有显著的临床应用潜能。最近的实例包括在血液透析过程中减少滤器诱导的不利作用和败血症中器官的保存。重要地，坎普他汀类似物的玻璃体内使用在非人灵长类动物(NHP)研究中和I 期临床试验中都显示了在年龄相关黄斑变性(AMD)治疗中的有前景的结果。坎普他汀及其类似物的低分子量、它们的高特异性和效力以及它们同时抑制所有补体活化和扩增途径的能力促成了一种有益的药物模式。然而，扩展的临床应用(例如，通过多种途径的全身性施用)对坎普他汀衍生物的分子性质提出了额外需要。例如，因从血浆中快速消除而导致的不利药代动力学特征仍然对肽类药物导致了主要限制。此外，虽然口服递送是最方便的和最受欢迎的药物施用途径，但大多数肽药物几乎不显示或不显示口服活性。这据信主要是因为在胃肠道中被酶和极端条件降解以及肠粘膜的较差通透性。因此，大多数基于蛋白质的治疗剂通过频繁注射(经由胃肠外途径，例如通过静脉内、肌内和皮下注射)来施用。这些施用形式非常昂贵，并且可能需要医学专业人员，所有这些可导致较差的患者接受度和顺从性。鉴于上述内容，很明显具有更大活性、体内稳定性、血浆停留时间和生物利用度的经修饰坎普他汀肽或模拟物的开发将构成本领域的重大进步。

[0014] 发明概述

[0015] 本发明提供了补体抑制肽坎普他汀的类似物，其相较于坎普他汀具有改善的补体抑制活性，并且还具有改善的溶解度和稳定性以及药代动力学性质，包括通过多种施用途径的生物利用度。

[0016] 本发明的一个方面是包含经修饰坎普他汀肽(ICVVQDWGHHRCT(环 C2-C12；SEQ ID NO:1)或其类似物的化合物，其中所述修饰包括添加的或取代的N末端组成，该组分相较于等同条件下未修饰的坎普他汀肽，改善了(1)肽的C3、C3b或C3c结合亲和力，(2)肽在含水液体中的溶解度，和/或(3)肽的血浆稳定性和/或血浆停留时间。

[0017] 可被添加至肽的N末端的组分包括除L-Gly外的氨基酸残基或这样的氨基酸的肽或非肽类似物。在某些实施方案中，添加的组分是D-氨基酸，和/或所述组分可包括至少一个芳族环。在一个实施方案中，添加的组分是D-Tyr。在其它实施方案中，添加的组分包括N-甲基化氨基酸。在一个实施方案中，所述N-甲基化氨基酸是N-甲基化L-Gly，在本文中也称为Sar。因此，在不同实施方案中，所添加的组分为D-Tyr、D-Phe、 Tyr(Me)、D-Trp、Tyr、D-Cha、Cha、Phe、Sar、Arg、mPhe、mVal、Trp、 mIle、D-Ala、mAla、Thr或Tyr。

[0018] 在其它实施方案中，被修饰的坎普他汀肽包含取代的N末端组分，其中位置1处的Ile被Ac-Trp或二肽Tyr-Gly替代。

[0019] 所述化合物还可包括其它修饰。例如，位置9(基于坎普他汀的编号) 上的His可被Ala替代。此外，位置4上的Val可被Trp或Trp的类似物替代。位置4上的Trp的特定类似物包括1-甲基Trp或1-甲酰基Trp。位置7上的Trp还可被Trp的类似物(包括但不限于卤代Trp)替代。其它修饰包括位置8上的Gly的修饰，以约束该处置处的主链构象。具体地，可通过用Nα-甲基Gly(Sar)替代位置8上的Gly(Gly8)来约束主链。其它修饰包括用Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile来替代位置13上的Thr。还有其它一些修饰包括利用硫醚键替代C2与C12之间的二硫键来形成胱硫醚或羊毛硫氨酸(lantithionine)。另一个修饰包括利用Orn替代位置11上的Arg，和/或利用Asn替代位置6上的Asp。

[0020] 在具体的实施方案中，坎普他汀类似物包括具有SEQ ID NO:29的序列的肽，其为：

[0021] Xaa1-Xaa2-Cys-Val-Xaa3-Gln-Xaa4-Xaa5-Gly- Xaa6-His-Xaa7-Cys-Xaa8，其中Xaa5与Xaa6之间的Gly(坎普他汀的位置8)任选地被修饰来约束主链构象，并且其中：Xaa1不存在或为Tyr、D-Tyr或Sar；Xaa2为Ile、Gly或Ac-Trp；Xaa3为Trp或Trp 类似物，其中所述Trp的类似物相较于Trp具有增强的疏水特征；Xaa4 为Asp或Asn；Xaa5为Trp或包含对其吲哚环的化学修饰的Trp类似物，其中所述化学修饰增强吲哚环的氢键势能；Xaa6为His、Ala、Phe或Trp； Xaa7为Arg或Orn；以及Xaa8为Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或 N-甲基Ile，其中Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile中任一个的羧基末端-OH任选地被-NH2替代，并且其中所述肽通过Cys-Cys 或硫醚键呈环状。

[0022] 所述类似物的一些具体实施方案包括下列特征：位置8上的Gly是 N-甲基化的；Xaa1为D-Tyr或Sar；Xaa2为Ile；Xaa3为Trp,1-甲基 -Trp或1-甲酰基-Trp；Xaa5为Trp；Xaa6为Ala；以及Xaa8为Thr、 Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile，羧基末端-OH任选地被-NH2替代。更具体地，Xaa8可以为Ile、N-甲基Thr或N-甲基Ile，任选地羧基末端-OH被-NH2替代。
示例性类似物包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:18。本发明的另一个方面涉及抑制补体活化的化合物，其包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18的非肽或部分肽模拟物，其中所述化合物结合C3 并且以比等同测定条件下包含SEQ ID NO:1的肽的活性高至少500倍的活性抑制补体活化。

[0023] 本发明的另一个方面涉及上述化合物，其包括延长所述化合物的体内停留(即，停留时间)的额外组分。在一个实施方案中，所述额外组分是聚乙二醇(PEG)。在其它实施方案中，所述额外组分是白蛋白结合小分子或白蛋白结合肽。在一些特定实施方案中，将白蛋白结合小分子或白蛋白结合肽在N或C末端连接于所述肽。该连接可以是直接的或通过接头或间隔子。

[0024] 本发明的另一个方面涉及包含上述化合物中任一种和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物被配制来用于口服施用。在另一个实施方案中，其被配制来用于局部施用。在另一个实施方案中，其被配制来用于经肺施用。在另一个实施方案中，药物组合物被配制来用于皮下或肌内注射。在另一个实施方案中，其被配制来用于静脉内注射或输注。

[0025] 本发明的另一个方面提供了上述化合物的任一种用于体内、离体、原位或体外抑制补体活化以及用于制备用于抑制补体活化的药剂的用途。

[0026] 通过参考下列详细描述、附图和实施例将理解本发明的各种特征和有利方面。

[0027] 附图概述

[0028] 图1.坎普他汀类似物与C3b的相互作用。(A)坎普他汀前导化合物 4(1MeW)(最低，最窄组的峰)、Cp20(SEQ ID NO:3)(中间组的峰)和肽 14(Cp40(SEQ ID NO:18))(最高最宽组的峰)的动力学特征谱，如通过单循环动力学分析，使用表面等离子共振术测定的。(B)具有等亲和力线 (isoaffinity line)的肽1-20以及参照化合物4(1MeW)和Cp20(SEQ ID NO:3)的速率图(Rate plot)，如虚线显示的。显示了Cp20(SEQ ID NO:3) 的速度常数和亲和力的基准线。

[0029] 图2.从坎普他汀类似物与C3c之间的计算化停靠实验 (computational docking experiment)计算的自由能值(ΔG)(y轴)与从 C3b的相同类似物的实验测定亲和力值计算的自由能值(x轴)之间的关联性。肽编号示于图上每一个标记的旁边。整个数据组上的关联性示为实线，而点线代表了排除肽1、5和7后的关联性。

[0030] 图3.坎普他汀类似物在C3c的结合部位内的停靠。(A)肽 14(Cp40(SEQ ID NO:18)，彩色图中的蓝绿色)和肽4(彩色图中灰色)的停靠构象(注意，在非彩色图中，dY侧链的芳环(CP40(SEQ ID NO:18)) 叠加在Y(肽4)的环之前，并且可以以该方式区分)。其它D-氨基酸在停靠模型中具有与肽14相似的构象。为清楚起见，略去肽4中的其它残基的侧链。(B)肽19的停靠构象。

[0031] 图4.人血浆中肽3(Cp30(SEQ ID NO:7))和肽14(Cp40(SEQ ID NO:18))在37℃的稳定性。将Cp30(SEQ ID NO:7)、Cp40(SEQ ID NO:18) 和阳性对照肽2B掺入人血浆以达到20μM的终浓度。将血浆在37℃温育，在不同的时间点取出100μL的样品。使用固相提取法从血浆提取肽，使用UPLC-MS进行分析。3A：将每一个样品在不同时间点的面积随时间作图(方块：Cp40(SEQ ID NO:18)，圆圈：Cp30(SEQ ID NO:7)，三角形：对照肽2B)。3B：来自时间0(上部)、24h(中间)和120h(下部)的样品的色谱图。

[0032] 图5.坎普他汀类似物在非人灵长类动物中的药代动力学评估。(A) 在于食蟹猴中i.v.单次快速静脉内注射2mg/kg后肽水平随时间的线性图，显示了具有快速初始消除相、随后缓慢的对数线性末期相的双相性模型。Cp20(SEQ ID NO:3)-底下的两条线；Cp30(SEQ ID NO:7)(肽3)- 中间两条线；Cp40(SEQ ID NO:18)(肽14)-上方两条线。(B)从末期相 (1-24h)计算血浆消除半衰期(t1/2)。Cp20(SEQ ID NO:3)-下方的两条线；Cp30(SEQ ID NO:7)(肽3)-中间两条线；Cp40(SEQ ID NO:18)(肽 14)-上方两条线。虚线标记图框A和B中靶蛋白C3的测量血浆水平的范围。(C)类似物Cp20(SEQ ID NO:3)与来自人、狒狒、食蟹猴和猕猴的固定化C3的动力学结合特征谱的叠加，如通过SPR评估的。

[0033] 图6.在食蟹猴中通过两个不同途径单次施用类似物后坎普他汀类似物Cp40(SEQ ID NO:18)的血浆浓度。在皮下注射(顶部的小图)或口服施用(底部的小图)后的各时间点上通过质谱法测量血浆浓度。

[0034] 图7.在狒狒中通过肌内注射单次施用类似物后，坎普他汀类似物 Cp40(SEQ ID NO:18)的血浆浓度和补体抑制活性。在肌内注射(圆圈)后的各时间点上通过质谱法测量血浆浓度。通过红细胞溶血测定(三角形) 测量对经变通途径的补体活化的抑制。

[0035] 举例说明性实施方案的详述

[0036] 定义:

[0037] 在整个说明书和权利要求中使用与本发明的方法和其它方面相关的各种术语。除非另有所指，否则这样的术语将具有它们在本领域中的普通含义。其它明确定义的术语将以与本文中提供的定义一致的方式进行解释。

[0038] 在本文中可使用下列缩写：Ac，乙酰基；DCM，二氯甲烷；DIC，1,3- 二异内基碳化二亚胺；DIPEA，N,N-二异丙基乙胺；DPBS，Dulbecco’s 磷酸缓冲盐溶液；ELISA，酶联免疫吸附测定；ESI，电喷射离子化；Fmoc， 9-芴甲氧羰基；HOAt，1-羟基-7-氮杂苯并三唑；ITC，等温滴定量热法； MALDI，基质辅助激光解吸电离；MBHA,4-甲基二苯甲胺 (4-methylbenzhydrylamine)；NMP，N-甲基吡咯烷酮；Sar，N-甲基甘氨酸；SPR，表面等离子共振术；TIPS，三异丙基硅烷；Trt，三苯甲基； WFI，注射用水。

[0039] 如本文中所用，术语“约”当指可测量值例如量、时间长度等时，意指包括与指定值有±20％或±10％的变化，在某些实施方案有±5％的变化，在一些实施方案中有±1％的变化，在一些实施方案中有±0.1％的变化，因为这样的变化适合于产生和使用公开的化合物和组合物。

[0040] 如本文中所用，术语“坎普他汀”是指包含SEQ ID NO:1的肽 ICVVQDWGHHRCT(通过二硫键形成的环状C2-C12)。术语“坎普他汀类似物”是指包含天然和/或非天然氨基酸或氨基酸类似物的取代以及在不同氨基酸内或之间的修饰(如本文中更详细描述的和如本领域中已知的)的经修饰坎普他汀。当提及特定氨基酸或类似物在坎普他汀或坎普他汀类似物内的位置时，这些位置有时被称为肽内的“位置”，其中位置编号为从1(坎普他汀中的Ile)至13(坎普他汀中的Thr)。例如，Gly残基占据“位置8”。

[0041] 术语“药物活性”和“生物活性”是指本发明的化合物结合C3或其片段并且抑制补体活化的能力。该生物活性可通过一个或多个本领域承认的测定(如在本文中更详细描述的)来测量。

[0042] 如本文中所用，“烷基”是指具有约1至10个碳原子(和其中碳原子的范围和具体数目的所有组合和亚组合)的任选地被取代的直链、支链或环状烃，约1至约7个碳原子是优选的。烷基包括但不限于甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、叔丁基、正-戊基、环戊基、异戊基、新戊基、正-己基、异己基、环己基、环辛基、金刚烷基、3- 甲基戊基、2,2-二甲基丁基和2,3-二甲基丁基。术语“低级烷基”是指具有约1至约5个碳原子(和其中碳原子的范围和具体数目的所有组合和亚组合)的任选地被取代的饱和直链、支链或环状烃。低级烷基包括但不限于甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、叔丁基、正- 戊基、环戊基、异戊基和新戊基。

[0043] 如本文中所用，“卤素”是指F、Cl、Br或I。

[0044] 如本文中所用，“烷酰基”可与“酰基”互换使用，是指具有约1 至约10个碳原子(和其中碳原子的范围和具体数目的所有组合和亚组合) 的任选地被取代的直链或分枝脂肪族非环状残基，约1至约7个碳原子是优选的。烷酰基包括但不限于甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、2-甲基-丁酰基、2,2-二甲基丙酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基等。术语“低级烷酰基”是指具有约1至约5个碳原子(和其中碳原子的范围和具体数目的所有组合和亚组合)的任选地被取代的直链或分枝脂肪族非环状残基。低级烷酰基包括但不限于甲酰基、乙酰基、正-丙酰基、异-丙酰基、丁酰基、异-丁酰基、戊酰基、异-戊酰基等。

[0045] 如本文中所用，“芳基”是指具有约5至约14个碳原子(和其中碳原子的范围和具体数目的所有组合和亚组合)的任选地被取代的单环或双环芳香环系统，约6至约10个碳是优选的。非限定性实例包括例如苯基和萘基。

[0046] 如本文中所用，“芳烷基”是指具有芳基取代基并且具有约6至约 20个碳原子(和其中碳原子的范围和具体数目的所有组合和亚组合)的如上定义的烷基，约6至约12个碳原子是优选的。芳烷基可任选地被取代。非限定性实例包括例如苄基、萘基甲基、二苯甲基、三苯甲基、苯乙基和二苯乙基。

[0047] 如本文中所用，术语“烷氧基”和“烷氧基”是指任选地被取代的烷基-O-基团，其中烷基是如先前定义的。示例性烷氧基和烷氧基团包括甲氧基、乙氧基、正-丙氨基、异-丙氧基、正-丁氧基和庚氧基等。

[0048] 如本文中所用，“羧基”是指-C(＝O)OH基团。

[0049] 如本文中所用，“烷氧羰基”是指-C(＝O)O-烷基，其中烷基是如先前定义的。

[0050] 如本文中所用，“芳酰基”是指-C(＝O)-芳基，其中芳基是如先前定义的。示例性芳酰基包括苯甲酰基和萘甲酰基。

[0051] 通常地，取代的化学部分包括在分子上的选定位置上替代氢的一个或多个取代基。示例性取代基包括例如卤素、烷基、环烷基、芳烷基、芳基、巯基、羟基(-OH)、烷氧基、氰基(-CN)、羧基(-COOH)、酰基(烷酰基:-C(＝O)R)；-C(＝O)O-烷基、氨基羰基(-C(＝O)NH2)、-N取代的氨基羰基(-C(＝O)NHR”)、CF3、CF2CF3等。与上述取代基相关，每一个部分“R”可以独立地是例如H、烷基、环烷基、芳基或芳烷基中任一个。

[0052] 如本文中所用，“L-氨基酸”是指通常存在于蛋白质中的天然左旋α-氨基酸或这些α-氨基酸的烷基酯中任一种。术语D-氨基酸”是指右旋α-氨基酸。除非另外明确指出，否则本文中提及的所有氨基酸是L- 氨基酸。

[0053] “疏水的”或“非极性的”在本文中可同义地使用，是指特征不在于偶极子的任何分子间或分子内相互作用。

[0054] “PEG化作用”是指其中至少一个聚乙二醇(PEG)部分(无论大小) 被化学连接于蛋白质或肽以形成PEG-肽缀合物的反应。“PEG化的”意指至少一个PEG部分(无论大小)被化学连接于肽或蛋白质。术语PEG通常伴随着数字后缀指示PEG聚合物的近似平均分子量；例如，PEG-8,000 是指具有约8,000道尔顿(或g/mol)的平均分子量的聚乙二醇。

[0055] 如本文中所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中通过生成其酸或碱盐而修饰了亲代化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基例如胺的无机酸或有机酸盐；酸性残基例如羧酸的碱性或有机盐；等。因此，术语“酸加成盐”是指已通过酸的加成制备的亲代化合物的对应盐衍生物。药学上可接受的盐包括例如从无机或有机酸形成的亲代化合物的常规盐或季铵盐。例如，这样的常规盐包括但不限于，衍生自无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐；以及从有机酸例如醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、巴莫酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等制备的盐。本发明的某些酸性或碱性化合物可以以两性离子的形式存在。化合物的所有形式(包括游离酸、游离碱和两性离子)包括在本发明的范围内。

[0056] 描述:

[0057] 本发明部分源自本发明人对于抑制效力和药代动力学参数均有改善的坎普他汀类似物的开发。利用非蛋白源性氨基酸和/或其它分子实体对坎普他汀N-末端的选择性修饰导致某些具有亚纳摩尔浓度水平结合亲和力(KD＝0.5nM)的类似物和在临床相关溶剂中具有改善的溶解度的其它相似地强效的衍生物。非人灵长类动物中的药代动力学评价显示超过对于肽类药物的预期的血浆半衰期值。两个非人灵长类动物模型中的生物利用度评价显示某些类似物具有皮下、肌内和口服生物利用度。

[0058] 按照本发明的一种修饰包括将组分添加于坎普他汀 (Ile-[Cys-Val-Val-Gln-Asp-Trp-Gly-His-His-Arg-Cys]-Thr；SEQ ID NO:1)的N末端，其改善肽的溶解度和血浆稳定性，同时维持或改善C3 结合亲和力和补体抑制活性。在具体实施方案中，添加的组分是氨基酸残基，特别地是抗蛋白水解切割的残基，例如N-甲基化氨基酸(例如， N-甲基Gly(Sar)或D-氨基酸((例如，D-Tyr)。同样地，如下文中更详细描述的，N末端残基的D构型可更好地配置游离氨基而与C3极性相互作用。此外，在N末端包含疏水侧链(例如，包括芳环)的氨基酸或类似物有利于与C3结合(可能是通过与坎普他汀-C3结合部位上的疏水性口袋相互作用)。

[0059] 参考下面所示示例性类似物，所述类似物显示优于坎普他汀和甚至高效类似物Ac-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala -His-Arg-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO:2)的显著改善的活性(Katragadda等人,2006,同上,WO 2007/062249；在本文中有时称为“4(1MeW)”)，以及下文中详细描述的几个其它有利特征。

[0060] “坎普他汀30”(Cp30):

[0061] Sar-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle -NH2[0062] (SEQ ID NO:7；在实施例中也称为“肽3”)

[0063] “坎普他汀40”(Cp40):

[0064] dTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIl e-NH2[0065] (SEQ ID NO:18；在实施例中也称为“肽14”)

[0066] 不期望受理论束缚或限制，据信本文中描述的类似物的改善的C3 结合亲和力至少部分归因于由N末端介导的更高亲和相互作用。例如， SPR和ELISA数据显示，D-氨基酸或具有疏水侧链的氨基酸改善了C3结合，同时特征的组合(即具有芳香族侧链的D-氨基酸，例如D-Tyr)是最有利的。总的来说，具有芳香族侧链的D-氨基酸显示优于具有更短侧链的D或L构型的氨基酸。此外，停靠研究表明改善的亲和力源自涉及游离氨基的定位的另外的极性和非极性相互作用，以及N末端残基上的侧链的性质和定位。例如，Cp40(SEQ ID NO:18)的亲和力增加经测定至少部分归因于在该类似物的N末端处与C3的相互作用的组合；(1)N末端 Tyr的D构型更好地提供游离氨基来与C3发生极性相互作用，一种在总体上解释了D构型的有利方面的特性；和(2)庞大的疏水侧链能够拟合C3c上的疏水性口袋并且还提供羟基来与C3c发生氢键合。此外，停靠研究预测在N末端包含Ac-Trp(实施例2)的类似物以高亲和力结合C3。肽1的SPR分析确实显示可与Cp40(SEQ ID NO:18)(肽14)的结合亲和力相当的高结合亲和力。已测定两种肽利用C3、C3b或C3c上靠近坎普他汀的N末端的疏水性结合口袋。

[0067] N-甲基化可以以几种方式影响肽。首先，潜在的氢键供体被甲基替代，所述甲基不能形成氢键。第二，N-甲基是弱电子供体，这意味着其可略微增加相邻羰基的碱性。第三，取决于相邻残基的性质，N-甲基的大小可引起空间约束。最后，N-甲基化可改变酰胺键的反式/顺式群体，从而以与脯氨酸类似的方式改变局部肽构象。在Cp30(SEQ ID NO:7)的情况下，SPR数据表明相较于Cp20(SEQ ID NO:3)略微更快的缔合速率和略微更慢的解离速率，这表明Cp30(SEQ ID NO:7)具有更有利的用于结合C3/C3b/C3c的游离溶液构象并且结合更强。鉴于N末端位置处Ac基团的缺乏和甲基的存在，可以合理地概括修饰允许N末端参与更强的与 C3c的残基S388/S437/D349的极性相互作用。通过将游离N末端定位至有利位置(通过以增强与C3/C3c上的结合部位的极性相互作用的方式进行的N-甲基化)使得这成为可能。

[0068] 除了改善的C3结合亲和力以外，本发明的类似物还具有相较于先前可获得的类似物例如Cp20(SEQ ID NO:3)有所改善的溶解度特征。对于全身性药物施用，在注射用水(WFI)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)中具有高溶解度的类似物宜应使所需注射体积减少至最少。通过比较，在WFI中具有高溶解度并且在PBS中具有更低溶解度的类似物可产生用于局部施用或局部注射例如眼内注射(例如，用于AMD的治疗)的更长效的凝胶、沉淀物或悬浮物。已确定Cp30(SEQ ID NO:7)溶于WFI和PBS，然而 Cp40(SEQ ID NO:18)在PBS中的溶解度小于在WFI中的溶解度。

[0069] 本发明的肽类似物还显示有利的血浆稳定性特征，据认为这至少部分归因于一个或多个抵抗蛋白酶攻击的N末端组分(例如D-氨基酸残基或N-甲基)或白蛋白结合分子的存在。此外，类似物特异和强劲地结合血浆中的C3、C3b和C3c。重要地，由本文中描述的N末端和/或其它修饰提供的稳定性促成了口服、皮下或肌内施用的改善的生物利用度，如在小鼠和两种非人灵长类动物模型系统中显示的，以及改善(即，更慢的) 的类似物体内血浆消除半衰期值，如在灵长类动物模型系统中显示的。

[0070] 可将上述N末端修饰与先前显示改善活性的坎普他汀的其它修饰组合，从而产生具有显著改善的补体抑制活性的肽。例如，N末端的乙酰化通常增强坎普他汀及其类似物的补体抑制活性。因此，酰基在肽的氨基末端的添加(包括但不限于N-乙酰化)是本发明的一个实施方案，尽管如果肽的N末端已是稳定的或如果溶解度成为一个问题，那么可能不需要。

[0071] 作为另一个实例，已知Ala对位置9处His的取代改善了坎普他汀的活性，并且也是本发明的肽的优选修饰。还已确定Tyr对位置4处Val 的取代可导致活性的适度改善(Klepeis等人,2003,J Am Chem Soc 125: 8422-8423)。

[0072] WO2004/026328和WO2007/0622249中公开了位置4处的Trp和某些 Trp类似物以及位置7处的某些Trp类似物(特别地与位置9处的Ala组合的)产生比坎普他汀的活性高许多倍的活性。这些修饰同样地用于在本发明中获得有利方面。

[0073] 具体地，已显示在位置4处包含5-氟-色氨酸或者5-甲氧基-、5- 甲基-或1-甲基-色氨酸或1-甲酰基-色氨酸的肽具有比坎普他汀高 31-264倍的活性。特别优选的是1-甲基和1-甲酰基色氨酸。据信位置4 上的吲哚‘N’-介导的氢键不是坎普他汀的结合和活性所必需的。通过在位置4上用低级烷基、烷酰基或吲哚氮替代氢使该氢键不存在或极性特征减小增强了坎普他汀的结合和活性。不期望受限于任何特定理论或作用机制，据信位置4处的疏水相互作用或效应增强了坎普他汀与C3的相互作用。因此，位置4处的Trp的修饰(例如，按照本领域公知的方法改变侧链的结构)，或者维持或增强上述疏水相互作用的Trp类似物在位置4或位置7处的取代在本发明中被视为有利的修饰，组合上述位置8 和13处的修饰。这样的类似物在本领域中是公知的，包括但不限于本文中举例说明的类似物，以及其未取代的或以其它方式取代的衍生物。通过参考下列出版物和许多其它出版物可找到适当的类似物的实例：Beene, 等人,2002,Biochemistry 41:10262-10269(描述单-和多-卤代Trp类似物等)；Babitzky&Yanofsky,1995,J.Biol.Chem.270: 12452-12456(描述甲基化和卤代Trp以及其它Trp和吲哚类似物等)；和美国专利6,214,790、6,169,057、5,776,970、4,870,097、4,576,750 和4,299,838。如本领域中已知的，通过体外或体内表达，或通过肽合成可将Trp类似物引入坎普他汀肽。

[0074] 在某些实施方案中，用包含1-烷基取代基，更具体地低级烷基(例如，C1-C5)取代基(如上文中定义的)的类似物替代坎普他汀的位置4上的Trp。这些类似物包括但不限于N(α)甲基色氨酸和5-甲基色氨酸。在其它实施方案中，用包含1-烷酰基，更具体地低级烷酰基(例如，C1-C5) 取代基(如下文中定义的)的类似物例如N(α)甲酰基色氨酸、1-乙酰基 -L-色氨酸和L-β-高色氨酸替代坎普他汀的位置4上的Trp。

[0075] WO2007/0622249中公开了坎普他汀的位置7处5-氟-色氨酸的掺入相对于坎普他汀而言增加了所得坎普他汀类似物与C3之间的相互作用的焓，而位置4处5-氟-色氨酸的掺入减小了该相互作用的焓。因此，位置7处Trp的修饰，如WO2007/0622249中描述的，结合上述N末端修饰在本发明中被视为有用修饰。

[0076] 其它修饰描述于WO2010/127336中。在该文献中公开的一个修饰包括在肽的位置8处对肽主链的约束。在一个具体实施方案中，通过用N- 甲基甘氨酸替代位置8上的甘氨酸(Gly8)来约束主链。该文献中公开的另一个修饰包括用Ile、Leu、Nle(正亮氨酸)、N-甲基Thr或N-甲基Ile 替代位置13处的Thr。

[0077] 还有其它修饰描述于共同未决的申请No.61/385,711中。一个这样的修饰包括通过添加CH2来替代C2-C12二硫键以在C2或C12上形成高半胱氨酸，和引入硫醚键以形成胱硫醚例如γ-胱硫醚或δ-胱硫醚。另一个修饰包括用硫醚键而非添加CH2来替代C2-C12二硫键，从而形成羊毛硫氨酸。包含硫醚键的类似物显示与某些二硫键类似物的活性大体相同的活性并且也具有等同的或改善的稳定性特征。

[0078] 其它内部修饰描述于本申请中。例如，用鸟氨酸取代某些坎普他汀类似物(例如Cp20，SEQ ID NO:3，Cp40，SEQ ID NO:18)的位置11上的精氨酸，和/或用天冬酰胺取代其位置6上的天冬氨酸，导致具有与亲代化合物相似的结合和补体抑制活性的类似物。此外，这些取代的一个或两个预期使得类似物不太易被肠道、肝或血浆中发现的某些生理酶代谢。

[0079] 本发明的修饰的坎普他汀肽可按照常规肽合成法，利用各种肽合成的合成法通过一个或多个氨基酸残基的缩合来制备。例如，按照标准固相方法合成肽。通过固相方法或在液相中合成肽或肽模拟物的其它方法对于本领域技术人员来说是公知的。在肽合成的过程中，可使用公知的保护基团根据需要对支链氨基和羧基进行保护/去保护。适当的肽合成法的实例示于实施例1中。利用可选择的保护基团对肽和肽衍生物的修饰对于本领域技术人员来说是显而易见的。

[0080] 或者，可通过在适当的原核或真核系统中表达来产生本发明的某些肽。例如，可将DNA构建体插入适合用于在细菌细胞(例如大肠杆菌(E. coli))或酵母细胞(例如酿酒酵母)中表达的质粒载体，或插入用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体或用于在哺乳动物细胞中表达的病毒载体。这样的载体包含DNA在宿主细胞中表达所必需的调控元件，以定位方式可以允许DNA在宿主细胞中表达。这样的表达所需的调控元件包括启动子序列、转录起始序列和任选地增强子序列。

[0081] 肽还可通过体外或体内表达核酸分子来产生。可将编码肽的多联体的DNA构建体(多联体的上限取决于使用的表达系统)引入体内表达系统。在产生多联体后，通过将多肽暴露于肼来实现C末端Asn与之后N 末端G之间的切割。

[0082] 可按照本领域已知的方法纯化通过基因表达在重组原核或真核系统中产生的肽。基因表达和合成法的组合也可用于产生坎普他汀类似物。例如，可通过基因表达产生类似物，随后使其经历一个或多个翻译后合成过程，例如以修饰N或C末端或者环化分子。

[0083] 有利地，掺入非天然氨基酸，例如甲基化氨基酸的肽可通过在适当的原核或真核系统中体内表达来产生。例如，可利用一些方法、例如由Katragadda&Lambris(2006,Protein Expression and Purification 47: 289-295)描述的通过在大肠杆菌营养缺陷型中表达而将非天然Trp类似物引入坎普他汀的那些方法，在坎普他汀的选定位置处引入N-甲基化氨基酸或其它非天然氨基酸。

[0084] 坎普他汀的结构在本领域是已知的，前述类似物的结构通过类似的方法来测定。在确认了短肽的特别期望的构象后，用于设计拟合该构象的肽或肽模拟物的方法在本领域中是公知的。与本发明特别相关的是，肽类似物的设计可通过考虑氨基酸残基的各侧链的贡献来进一步改善，如上文中论述的(即，关于官能团的作用或关于立体化学的考虑)。

[0085] 本领域技术人员应理解，肽模拟物可同样好地作为肽用于提供结合 C3和抑制补体活化所需的特定主链构象和侧链功能性。因此，将其包括在本发明的范围内，通过使用天然存在的氨基酸、氨基酸衍生物、类似物或能够被连接以形成适当主链构象的非氨基酸分子产生结合C3、抑制补体的化合物。非肽类似物或包含肽和非肽组分的类似物在本文中有时被称为"肽模拟物"或“等构模拟物(isosteric mimetic)”，以表示本发明的肽的取代或衍生化，所述肽具有相同的主链构象特征和/或其它功能性，以便与举例说明的肽充分相似而抑制补体活化。

[0086] 肽模拟物用于高亲和力肽类似物的开发的用途在本领域是公知的 (参见，例如，Vagner等人,2008,Curr.Opin.Chem.Biol.12: 292-296；Robinson等人,2008,Drug Disc.Today 13:944-951)。假定可分析与肽、包含非氨基酸部分的类似物中的氨基酸残基的旋转约束相似的旋转约束，则可利用任一种本领域公知的计算机化技术验证它们的构象基序。

[0087] 本发明的被修饰坎普他汀肽可通过将聚乙二醇(PEG)组分添加至肽来修饰。如本领域中公知的，PEG化可增加治疗性肽和蛋白质的体内半衰期。在一个实施方案中，PEG具有约1,000至约50,000的平均分子量。在另一个实施方案中，PEG具有约1,000至约20,000的平均分子量。在另一个实施方案中，PEG具有约1,000至约10,000的平均分子量。在示例性实施方案中，PEG具有约5,000的平均分子量。聚乙二醇可以是支链或直链，优选为直链。

[0088] 可通过连接基团将本发明的坎普他汀类似物共价键合于PEG。这样的方法在本领域是公知的。(综述于Kozlowski A.等人2001,BioDrugs 15:419-29中；也参见，Harris JM和Zalipsky S,eds.Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications,ACS Symposium Series 680(1997))。可接受的连接基团的非限定性实例包括酯基团、酰胺基团、酰亚胺基团、氨基甲酸酯基团、羧基、羟基、碳水化合物、琥珀酰亚胺基团(包括但不限于琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺羧甲基化物(SCM)、琥珀酰亚胺琥珀酰胺(SSA)和 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧化物基团、氧羰基咪唑基团(包括但不限于羰二咪唑(CDI))、硝基苯基(包括但不限于硝基苯基碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))、甲苯磺酸酯(trysylate)基团、醛基、异氰酸酯基团、乙烯基砜基团、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团或伯胺。在某些实施方案中，连接基团是琥珀酰亚胺基团。在一个实施方案中，连接基团是NHS。

[0089] 或者可将本发明的坎普他汀类似物通过氨基、巯基、羟基或羧基直接偶联于PEG(即，无连接基团)。在一个实施方案中，可将PEG偶联于添加至坎普他汀的C末端的赖氨酸残基。

[0090] 作为PEG化的变通选择，还可通过将肽连接于某些其它分子或肽来减少肽的体内清除。例如，当通过静脉内推注入兔时，某些白蛋白结合肽(ABP)显示2.3h的显著长的半衰期(Dennis等人,2002,J Biol Chem. 277:35035-35043)。融合于D3H44的抗组织因子Fab的该类型肽使得 Fab能够结合白蛋白，同时保留Fab结合组织因子的能力(Nguyen等人, 2006,Protein Eng Des Sel.19:291-297.)。当与野生型D3H44Fab 相比较时，该与白蛋白的相互作用在小鼠和兔中导致显著减少的体内清除和延长的半衰期，可与对于PEG化的Fab分子、免疫粘附素和白蛋白融合物看到的相当。WO2010/127336提出利用ABP以及白蛋白结合小分子(ABM)，和任选地在组分之间利用间隔子或接头的适当合成策略。这些方法导致生成能够抑制补体活化并且还显示延长的体内存活的ABP-和ABM-坎普他汀类似物缀合物。本文中的实施例1描述了这些和其它利用更高亲和力的白蛋白结合小分子ABM2的方法用于利用接头分子产生坎普他汀类似物-ABM2C末端缀合物的用途。实施例1进一步描述了使用直接连接而不使用接头进行的某些坎普他汀类似物与3种不同白蛋白结合小分子ABM、ABM0和ABM2的N末端缀合物的产生。这样的缀合物，无论是通过C末端、N末端直接缀合的还是通过间隔子或接头缀合的，都显示可与未缀合的类似物相当的C3结合和补体抑制活性或超过其的C3 结合和补体抑制活性，以及有利的体内停留。

[0091] 坎普他汀类似物、肽模拟物和缀合物的补体活化抑制活性可通过多种本领域已知的测定来测试。在某些实施方案中，利用实施例中描述的测定。其它测定的非穷尽性列表示于美国专利6,319,897,WO99/13899, WO2004/026328,WO2007/062249和WO2010/127336，包括但不限于(1)C3 和C3片段的肽结合；(2)各种溶血测定；(3)C3转化酶介导的C3切割的测量；和(4)因子D对因子B的切割的测量。

[0092] 本文中描述的肽和肽模拟物对于现有技术中已知的利用坎普他汀本身的任何目的具有实际功用。这样的用途包括但不限于：(1)抑制患者 (人或动物)的血清中和细胞、组织或器官上的补体活化，这可有利于某些疾病或病况的治疗，所述疾病包括但不限于年龄相关黄斑变性、类风湿性关节炎、脊髓损伤、帕金森氏病、阿尔茨海默病、癌症、败血症、阵发性夜间血红蛋白尿、银屑病和呼吸病障碍例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、过敏性炎症、肺气肿、支气管炎、支气管扩张、囊性纤维化、结核病、肺炎、呼吸窘迫综合征(RDS-新生儿和成人)、鼻炎和窦炎； (2)抑制在细胞或器官移植过程中或在人造器官或植入物的使用中发生的补体活化(例如，通过在进行所述方法之前、期间和/或之后限时全身性施用，或通过利用本发明的肽涂覆或另外地处理细胞、器官、人造器官或植入物)；(3)抑制在体外分流生理溶液(血液、尿)的过程中发生的补体活化(例如，通过在进行所述方法之前、期间和/或之后限时全身性施用，或通过用本发明的肽涂覆通过其分流所述流体的管道)；和(4)筛选小分子文库以鉴定坎普他汀活化的其它抑制剂(例如，被设计用来测量测试化合物与坎普他汀类似物竞争对C3或C3片段的结合的能力的液相或固相高通量测定)。

[0093] 为了执行上述功用的一个或多个功用，本发明的另一个方面表征了包含本文中描述的和举例说明的坎普他汀类似物或缀合物的药物组合物。这样的药物组合物可由单独的活性成分(以适合给受试者施用的形式存在)组成，或药物组合物可包含活性成分和一种或多种药学上可接受的载体，一种或多种另外的成分，或这些试剂的某种组合。活性成分可以以生理上可接受的酯或盐(例如与生理上可接受的阳离子或阴离子组合) 的形式存在于药物组合物中，这在本领域是公知的。

[0094] 基于其溶解度特征，本发明的特定坎普他汀类似物可被选择用于特定制剂。如上所述，在水中或缓冲盐溶液中高度可溶的类似物可以特别适合用于全身性注射，因为可使注射体积减小至最小。通过比较，在水中具有高溶解度和在缓冲盐溶液中具有更低溶解度的类似物可产生更长效的凝胶、悬浮物或沉淀物来用于局部施用或局部注射，例如眼内注射。因此，为了举例说明性目的并且无意是限定性的，Cp30(SEQ ID NO:7) 可被选择用于待通过全身性注射施用的药物制剂，而Cp40(SEQ ID NO:18) 可被选择用于玻璃体内注射的制剂。值得注意地，已显示Cp40(SEQ ID NO:18)可通过口服和通过皮下或肌内注射获得，这提供了重要的另外的递送途径，如下文中论述的。

[0095] 药物组合物的制剂可通过制药工艺学领域内已知的或将来开发的任何方法来制备。一般而言，这样的制备性方法包括使活性成分与载体或者一种或多种其它助剂结合，和随后在必要时或需要时将产品成型或包装成期望的单个剂量单位或多个剂量单位的步骤。

[0096] 如本文中所用，术语"药学上可接受的载体"意指可与坎普他汀类似物组合并且在组合后可用于给个体施用坎普他汀类似物的化学成分。

[0097] 如本文中所用，术语"生理上可接受的"酯或盐意指可与药物组合物中的任何其它成分相容，对于将对其施用组合物的受试者是无害的活性成分的酯或盐形式。

[0098] 可以单次快速推注方式或在重复方案中或以可由本领域技术人员容易确定的组合施用可用于实践本发明的药物组合物以递送1ng/kg至 100mg/kg体重的剂量。在某些实施方案中，剂量以每日为基础或者另一种合适的周期性方案包括至少0.1mg/kg，或至少0.2mg/kg，或至少 0.3mg/kg，或至少0.4mg/kg，或至少0.5mg/kg，或至少0.6mg/kg，或至少
0.7mg/kg，或至少0.8mg/kg，或至少0.9mg/kg，或至少1mg/kg，或至少2mg/kg，或至少3mg/kg，或至少4mg/kg，或至少5mg/kg，或至少6mg/kg，或至少7mg/kg，或至少8mg/kg，或至少
9mg/kg，或至少10mg/kg，或至少15mg/kg，或至少20mg/kg，或至少25mg/kg，或至少30mg/kg，或至少35mg/kg，或至少40mg/kg，或至少45mg/kg，或至少50mg/kg，或至少55mg/kg，或至少
60mg/kg，或至少65mg/kg，或至少70mg/kg，或至少75mg/kg，或至少80mg/kg，或至少85mg/kg，或至少90mg/kg，或至少95mg/kg，或至少100mg/kg。在一个具体的实施方案中，剂量为约
0.5mg/kg至约20mg/kg，或约1mg/kg至约10 mg/kg或约2mg/kg至约6mg/kg。

[0099] 在一个实施方案中，本发明包括施用导致个体中坎普他汀类似物的血清浓度在约0.01μM至约30μM范围内的剂量。在某些实施方案中，组合剂量和方案可导致坎普他汀类似物的血清浓度或随时间的平均血清浓度为至少约0.01μM，或至少约0.02μM，或至少约0.03μM，或至少约0.04μM，或至少约0.05μM，或至少约0.06μM，或至少约 0.07μM，或至少约0.08μM，或至少约0.09μM，或至少约0.1μ M,0.11μM，或至少约0.12μM，或至少约0.13μM，或至少约
0.14 μM，或至少约0.15μM，或至少约0.16μM，或至少约0.17μM，或至少约0.18μM，或至少约
0.19μM，或至少约0.2μM，或至少约0.3 μM，或至少约0.4μM，或至少约0.5μM，或至少约0.6μM，或至少约0.7μM，或至少约0.8μM，或至少约0.9μM，或至少约1μM 或至少约1.5μM，或至少约2μM，或至少约2.5μM，或至少约3μ M，或至少约3.5μM，或至少约4μM，或至少约4.5μM，或至少约5 μM，或至少约5.5μM，或至少约6μM，或至少约6.5μM，或至少约7μM，或至少约7.5μM，或至少约8μM，或至少约8.5μM，或至少约9μM，或至少约9.5μM，或至少约10μM，或至少约10.5μ M，或至少约11μM或至少约11.5μM，或至少约12μM，或至少约 12.5μM，或至少约13μM，或至少约13.5μM，或至少约14μM，或至少约14.5μM，或至少约15μM，或至少约15.5μM，或至少约 16μM，或至少约16.5μM，或至少约17μM，或至少约17.5μM，或至少约18μM，或至少约18.5μM，或至少约19μM，或至少约19.5 μM，或至少约20μM，或至少约20.5μM，或至少约21μM或至少约
21.5μM，或至少约22μM，或至少约22.5μM，或至少约23μM，或至少约23.5μM，或至少约24μM，或至少约24.5μM，或至少约 25μM，或至少约25.5μM，或至少约26μM，或至少约26.5μM，或至少约27μM，或至少约27.5μM，或至少约28μM，或至少约28.5 μM，或至少约29μM，或至少约
29.5μM，或至少约30μM。在某些实施方案中，组合剂量和方案可导致坎普他汀类似物的血清浓度或随时间的平均血清浓度为：不超过约0.1μM，或不超过约0.11μM，或不超过约0.12μM，或不超过约0.13μM，或不超过约0.14μM，或不超过约0.15μM，或不超过约0.16μM，或不超过约0.17μM，或不超过约0.18μM，或不超过约0.19μM，或不超过约0.2μM，或不超过约0.3μM，或不超过约0.4μM，或不超过约0.5μM，或不超过约 0.6μM，或不超过约0.7μM，或不超过约0.8μM，或不超过约0.9μ M，或不超过约1μM或不超过约1.5μM，或不超过约2μM，或不超过约2.5μM，或不超过约3μM，或不超过约3.5μM，或不超过约4μ M，或不超过约4.5μM，或不超过约5μM，或不超过约5.5μM，或不超过约6μM，或不超过约6.5μM，或不超过约7μM，或不超过约 7.5μM，或不超过约8μM，或不超过约8.5μM，或不超过约9μM，或不超过约9.5μM，或不超过约10μM，或不超过约10.5μM或不超过约11μM或不超过约11.5μM，或不超过约12μM，或不超过约12.5 μM，或不超过约13μM，或不超过约13.5μM，或不超过约14μM，或不超过约14.5μM，或不超过约
15μM，或不超过约15.5μM，或不超过约16μM，或不超过约16.5μM，或不超过约17μM，或不超过约17.5μM，或不超过约18μM，或不超过约18.5μM，或不超过约19μM，或不超过约19.5μM，或不超过约20μM，或不超过约20.5 μM或不超过约21μM或不超过约21.5μM，或不超过约22μM，或不超过约22.5μM，或不超过约23μM，或不超过约23.5μM，或不超过约24μM，或不超过约24.5μM，或不超过约25μM，或不超过约25.5μM，或不超过约26μM，或不超过约26.5μM，或不超过约
27μM，或不超过约27.5μM，或不超过约28μM，或不超过约28.5μ M，或不超过约29μM，或不超过约29.5μM，或不超过约20μM。

[0100] 适当的范围包括约0.1至约30μM，或约1至约29μM，或约2 至约28μM，或约3至约27μM，或约4至约26μM，或约5至约25μ M，或约6至约24μM，或约7至约23μM，或约8至约22μM，或约 9至约21μM，或约10至约20μM，或约11至约19μM，或约12至约18μM，或约13至约17μM，或约1至约5μM，或约5至约10μ M，或约10至约15μM，或约15至约20μM，或约20至约25μM，或约25至约
30μM。虽然施用的精确剂量取决于许多因素(包括但不限于患者的类型和待治疗的疾病状态的类型、患者的年龄和施用途径)而变化，但这样的剂量可由本领域技术人员来容易地确定。

[0101] 可以频繁至每天数次给患者施用药物组合物，或可以以更低频率例如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更低的频率(例如每数月一次或甚至每年一次或更低的频率)施用。给药频率对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且将取决于许多因素，例如但不限于待治疗的疾病的类型和严重度，患者的类型和年龄，如上文中描述的。

[0102] 可以口服制剂、胃肠外制剂、经眼制剂(包括玻璃体内制剂)、栓剂、气雾剂、局部制剂、经皮制剂或其它相似制剂全身性施用可用于本发明方法的药物组合物。这样的药物组合物可包含药学上可接受的载体和已知增强和促进药物施用的其它成分。其它制剂例如纳米颗粒、脂质体、重新包封的红细胞和基于免疫的系统也可用于按照本发明的方法施用坎普他汀类似物。

[0103] 如本文中所用，药物组合物的“口服施用”或“经肠施用”包括特征在于向胃肠道内引入的任何施用途径。这样的施用包括通过嘴的喂食以及口胃或胃内灌服法。这样的施用还可包括舌下、含服、鼻内、经肺或直肠施用等本领域已知的途径。

[0104] 适合用于口服施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体组合的活性成分，以多种剂型存在，所述剂型包括但不限于(仅举几例)丸剂、片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、分散剂、悬浮剂、溶液、乳液、微乳液、凝胶和薄膜。这样的剂型通常包括载体和赋形剂来促进活性成分的配制和递送。

[0105] 药学上可接受的载体选自蛋白质、碳水化合物、脂质、有机和无机分子及其组合。可将活性成分与载体在适当的稀释剂中组合来形成溶液或悬浮液。这样的液体制剂可以是有粘性的或无粘性的，这取决于使用的量和载体。液体制剂可直接使用或可通过本领域技术人员已知的方法被进一步配制成适当的胶囊、凝胶胶囊或固体。或者，固体制剂可通过组合固体组分来制备。这样的固体制剂可用作粉剂或被配制成颗粒、胶囊、片剂或薄膜，可将其任一种制备为延时释放制剂(time release formulation)。

[0106] 在口服剂型中用作载体的适当蛋白质包括乳蛋白质例如酪蛋白、酪蛋白酸钠、乳清、低乳糖乳清、乳清蛋白浓缩物、明胶、大豆蛋白(分离的)、褐藻蛋白质、红藻蛋白质、面包酵母提取物和白蛋白。适当的碳水化合物包括纤维素例如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、醋酸纤维素和乙基纤维素、淀粉例如玉蜀黍淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、酸性改性淀粉、预明胶化淀粉和非改性淀粉、藻酸盐例如藻酸铵、藻酸钠和藻酸钙、谷蛋白例如玉米谷蛋白(corn gluten)和小麦谷蛋白，树胶例如阿拉伯树胶 (阿拉伯树胶),印度胶,瓜尔胶,刺梧桐树胶(卡接牙胶)和树胶(黄蓍胶),不溶性葡萄糖异构酶制剂，糖例如玉米糖、转化糖、玉米糖浆、高果糖谷物糖浆和葡萄糖酸钠。适当的脂质包括生育酚例如a-维生素E醋酸酯、短链、中链和长链脂肪酸及其酯、脂肪族醇及其醚，油例如椰子油(精炼的)、大豆油(氢化的)和菜籽油、棕榈酸铝、硫代二丙酸双十二酯、酶修饰卵磷脂、硬脂酸钙、酶修饰的脂肪、硬脂酸棕榈酸甘油酯、卵磷脂、甘油一酯和甘油二酯、甘油和蜡例如蜂蜡(黄色和白色)、小烛树蜡和巴西棕榈蜡以及植物油。适当的有机和无机物包括甲基和乙烯基吡咯烷酮例如聚乙烯吡咯烷酮、甲磺酰甲烷、二甲基亚砜和相关化合物、羟酸和多羟酸例如聚乳酸等等。

[0107] 在一些实施方案中，可制备受控释放形式来实现坎普他汀类似物在消化道内的持续或位置特异性释放，以改善吸收和防止某些形式的代谢。例如，片剂的耐酸包衣或耐酸胶囊材料可用于阻止坎普他汀类似物在胃中释放并且保护化合物免受胃酶代谢。实现通过胃后的受控释放的适当材料和包衣主要由脂肪酸、蜡、虫胶、塑料和植物纤维组成，包括但不限于甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(醋酸琥珀羟丙甲纤维素)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、藻酸钠或硬脂酸。胃肠道中的持续释放可以例如通过将坎普他汀类似物包埋在不溶性物质例如各种丙烯酸酯、壳多糖等的基质中来实现。制备这样的制剂的方法对于本领域技术人员来说是已知的。

[0108] 可将坎普他汀配制成用于直肠、阴道或尿道施用的栓剂或灌肠剂。为此目的，可将坎普他汀类似物溶解或悬浮于油脂性基质载体例如可可脂中，所述可可脂在室温下是固体或半固体、但在体温下熔化，或悬浮在水溶性固体基质例如聚乙二醇或甘油(由甘油和明胶制备的)中。可添加其它赋形剂来改善制剂，可将栓剂塑造成有利于施用的形式。在其它实施方案中，可使用由溶解或悬浮在适合用于利用小注射器来施用的直肠递送的液体载体中的坎普他汀类似物组成的液体栓剂。

[0109] 为了治疗其中牵涉补体活化的慢性或急性肺病况，药物组合物的优选施用途径是肺部施用。因此，可将其以适合于通过口腔进行肺部施用的制剂制备、包装或销售本发明的药物组合物。这样的制剂可包括包含活性成分并且具有在约0.5至约7纳米，优选约1至约6纳米的范围内的直径的干燥颗粒。这样的组合物方便地以干粉的形式存在，以使用包含可将一股喷射剂导向其以分散粉剂的干粉贮存器或使用自喷射剂/粉末分配容器的装置(例如包含溶解或悬浮在密闭容器内的低沸点喷射剂中的活性成分的装置)进行施用。优选地，这样的粉剂包括这样的颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5纳米的直径，按数目计至少 95％的颗粒具有小于7纳米的直径。更优选地，按重量计至少95％的颗粒具有大于1纳米的直径，按数目计至少90％的颗粒具有小于6纳米的直径。干粉组合物优选包括固体细粉稀释剂例如糖，并且方便地以单位剂量形式提供。

[0110] 低沸点喷射剂通常包括在大气压下具有低于65°F的沸点的液体喷射剂。一般而言，喷射剂可构成50至99.9％(w/w)的组合物，活性成分可构成0.1至20％(w/w)的组合物。喷射剂还可包含另外的成分例如液体非离子型或固体阴离子型表面活性剂或固体稀释剂(优选具有与包含活性成分的颗粒相同等级的颗粒尺寸)。

[0111] 配制用于肺部递送的本发明的药物组合物还可以以溶液或悬浮液的滴剂形式提供活性成分。可以任选地无菌的，包含活性成分的含水或稀释的醇溶液或悬浮液形式制备、包装这样的制剂，或销售，并且可方便地使用任何雾化或喷雾装置来施用。这样的制剂还可包含一种或多种另外的成分，包括但不限于调味剂例如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂，包括替代肺表面活性剂或防腐剂例如羟苯甲酯。通过该施用途径提供的滴剂优选具有在约0.1至约200纳米范围内的平均直径。

[0112] 在本文中描述为可用于肺部递送的制剂也可用于本发明的药物组合物的鼻内递送。

[0113] 适合用于鼻内施用的另一种制剂是包含活性成分并且具有约0.2至 500微米的平均颗粒的粗粉。以其中采用鼻烟(即通过经由鼻道从保持靠近鼻孔的粉剂容器快速吸入)的方式施用这样的制剂。

[0114] 适合用于经鼻施用的制剂可以例如包含约少至0.1％(w/w)至多至 100％(w/w)的活性成分，并且还可包含一种或多种本文中描述的另外的成分。

[0115] 如本文中所用，药物组合物的"胃肠外施用"包括特征在于受试者的组织的物理损伤的任何施用途径和通过组织的伤口进行的药物组合物的施用。胃肠外施用从而包括但不限于通过注射组合物，通过经由手术切口施用组合物，通过经由组织穿透性非手术伤口施用组合物等进行的药物组合物的施用。具体地，胃肠外施用意欲包括但不限于静脉内、皮下、腹膜内、肌内、关节内、玻璃体内、胸骨内和肾渗析输注技术。

[0116] 适合用于胃肠外施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体例如无菌水或无菌等渗盐溶液组合的活性成分。可以适合用于推注施用或用于连续施用的形式制备、包装或销售这样的制剂。可以单位剂型(例如在安瓿中或在包含防腐剂的多剂量容器中)制备、包装或销售可注射制剂。用于胃肠外施用的制剂包括但不限于油性或含水媒介物中的悬浮液、溶液、乳剂、糊剂和可植入的持续释放或生物可降解制剂。这样的制剂还可包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于胃肠外施用的制剂的一个实施方案中，以干燥(即粉剂或粒剂)形式提供活性成分，以在胃肠外施用重建的组合物之前利用适当的媒介物(例如无菌无热原水)进行重建。

[0117] 可以无菌可注射含水或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售药物组合物。该悬浮液或溶液可按照已知技术进行配制，并且除了活性成分以外还可包含另外的成分例如本文中描述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。这样的无菌可注射制剂可以例如使用无毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如水或1,3-丁二醇)来制备。其它可接受的赋形剂和溶剂包括但不限于林格液、等渗氯化钠溶液和不挥发油例如合成甘油一酯或甘油二酯。有用的其它胃肠外可施用制剂包括将活性成分以微晶纤维素形式，以脂质体制剂形式，以用于超声释放递送的微气泡中或作为生物可降解聚合物系统中组分的那些制剂。用于持续释放或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合材料或疏水性材料，例如乳剂、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。

[0118] 如本文中所用，"另外的成分"包括但不限于下列物质中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂，包括取代肺表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理上可降解组合物例如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散剂或湿润剂；乳化剂、缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合或疏水材料。可包含在本发明的药物组合物中的其它"另外的成分"在本领域中是已知的，并且描述于例如Genaro,ed., 1985,Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co., Easton,PA中。

[0119] 方法:

[0120] 本发明的另一个方面涉及调控补体活化的方法。一般地，所述方法包括将其中期望调控补体活化的介质与本发明的坎普他汀类似物接触，其中所述接触导致介质中补体活化的调控。介质可以是其中期望调控补体活化的任何介质。在某些实施方案中，介质包括生物体的细胞或组织，包括(1)培养的细胞或组织，(2)受试者或患者机体内的细胞或组织；和 (3)已从一个受试者的机体内取出并且将被置于相同患者的体内(例如，血液的体外分流或自体移植)或转移至另一个患者的细胞或组织。就后一种实施方案而言，介质还可包含生物材料，例如在体外分流过程中接触细胞或组织的管线、滤器或膜。或者，介质可包含被置入受试者的生物材料。

[0121] 在某些实施方案中，调控补体活化的方法适用于活的患者或受试者，并且包括针对与补体活化(特别地AP介导的补体活化)相关的病理状况治疗患者的方法的部分或全部。许多这样的病理状况在本领域中是已知的(参见，例如，Holers,2008,同上)，包括但不限于如非典型性溶血性尿毒症综合征(aHUS)、致密沉积物病、年龄相关黄斑变性(AMD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、冷凝集素疾病(CAD)、类风湿关节炎 (RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、几种自身免疫性和自身炎症性肾病、自身免疫性心肌炎、多发性硬化、外伤性脑和脊髓损伤、肠和肾缺血-再灌注 (IR)损伤、自发和反复性妊娠失败、抗磷脂综合征(APS)、阿尔茨海默病、哮喘症、抗细胞核胞浆相关寡免疫血管炎(anti-nuclear cytoplasmic antigen-associated pauci-immune vasculitis)(Wegener’s综合征)、非-狼疮自身免疫性皮肤病例如天疱疮、大疱性类天疱疮和大疱性表皮松解、创伤后休克(post-traumatic shock)、某些形式的癌症和动脉粥样硬化。在一些具体的实施方案中，病理状况与编码FH和/或CD46的基因中的突变和多态性相关，但不限于：AMD、aHUS和膜增生性肾小球肾炎 II型(MPGN-II，也称为致密沉积物病(DDD))。在其它实施方案中，本发明的坎普他汀类似物适合用作依库珠单抗或TT30的替代品用于治疗在目前针对性开具这些药剂的疾病的治疗中，或正在进行临床前和临床研究开发的疾病的治疗中。这些疾病包括但不限于aHUS、PNH、CAD和AMD。

[0122] 治疗方法通常包括(1)鉴定具有可通过调控补体活化(如上文中描述的)治疗的疾病或病况的受试者，和(2)使用适合于待治疗病况的治疗方案和持续时间给受试者施用有效量的本发明的坎普他汀类似物。适当剂量和治疗方案的开发将取决于许多因素而变化，包括但不限于患者的类型和待治疗的疾病状态的类型、患者的年龄和施用途径。本领域技术人员熟悉将这样的变量考虑在内的给药方案的设计。例如，对于本领域技术人员来说很显然的是本发明的坎普他汀类似物的口服施用因相较于例如静脉内注射而言具有更少的生物利用度而需要更高的初始制剂。

[0123] 提供下列实施例以更详细地描述本发明。它们意欲举例说明本发明，但不限定本发明。

[0124] 实施例1

[0125] 本实施例描述了具有N末端修饰的坎普他汀类似物和某些类似物与白蛋白结合小分子的缀合物的合成。

[0126] 化学药品。Rink酰胺MBHA树脂、Oxyma和下列Fmoc-氨基酸获自 Novabiochem(San Diego,CA)：Ile、Cys(Trt)、Val、Tyr(tBu)、Gln(Trt)、 Asp(OtBu)、Trp(Boc)、Gly、Sar、Ala、MeAla、His(Trt)、Arg(Pbf)、 MeIle、Phe、MePhe和D-Cha。DIC和Fmoc-Trp(Me)-OH购自AnaSpec(San Jose,CA)。HOAt购自Advanced ChemTech(Louisville,KY)。NMP和DCM 获自Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)。用于合成的所有其它化学试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，并且可直接使用而无需进一步纯化。

[0127] 肽合成和纯化。所有肽通过Fmoc固相法，使用DIC和Oxyma作为偶联剂来人工合成。下列方法用于合成线性肽：将Rink酰胺MBHA树脂 (0.59mmol/g)置于在底部配备有釉料的肽合成玻璃容器中，并且在DCM 中溶胀30min。在除去Fmoc保护基团(NMP中的25％哌啶，5和
10min) 后，用NMP洗涤树脂7次，用DCM洗涤2次，将各氨基酸偶联至树脂。对于每一个偶联，使用3个当量的氨基酸、HOAt和DIC，于NMP中预活化10分钟。将所有偶联进行1h，通过Kaiser测试或氯醌测试进行监控。在阳性测试结果的情况下，重复偶联直至观察到阴性测试结果。
在偶联位置1处的Cys后，终止合成。随后在HSW聚丙烯注射中将树脂与底部上釉料分离(Torviq,Niles,MI)，使用先前报导的方法偶联另外的氨基酸。

[0128] 在完成固相合成后，用NMP、DCM和DCM/二乙醚(1:1)洗涤树脂4 次，在高真空下干燥4h。利用94％TFA,2.5％水以及2.5％EDT和1％TIPS 的混合物将肽从树脂上切割下来，进行2h。在于真空下蒸发TFA后，将肽沉淀，利用冷二乙醚洗涤3次。通过离心将液体与固体分离，并将液体轻轻倒出。将粗制肽于真空中干燥，溶解在30％的乙腈中。使用浓氢氧化铝将溶液的pH调整至8-9。伴随剧烈搅拌向溶液中添加稀释的过氧化氢(1:100,2当量)。通过使用MALDI-TOF监控环化。当反应完成时，用TFA补充溶液以将pH降至2。冷冻干燥溶液。如先前所述(Qu等人,2011, 同上)，利用RP-HPLC纯化粗制肽。纯化肽的纯度>95％，如通过分析型 RP-HPLC(Phenomenex 00G-4041-E0Luna 5μC18 100A柱,250x4.60mm； Phenomenex,Torrance,CA)测定的。每一种肽的质量使用Waters MALDI micro MX仪或Synapt HDMS来确认。

[0129] 将某些坎普他汀类似物缀合于白蛋白结合小分子，其实例示于下面。

[0130]

[0131]

[0132] 在一个构建体中，按照WO2010/127336中描述的方法将ABM2通过微型PEG-3间隔子缀合于肽Cp30(SEQ ID NO:7；下文中的表1)的C末端。

[0133]

[0134] 在其它构建体中，将ABM、ABM0或ABM2偶联于CP20(SEQ ID NO:3) 或CP40(SEQ ID NO:18)的N末端而不用间隔子。

[0135] 实施例2

[0136] 测量通过实施例1中描述的方法合成的坎普他汀类似物的C3结合和补体抑制活性。

[0137] 材料和方法:

[0138] 补体活化的抑制。如其它地方描述的(Katragadda等人,2006,同上；Mallik等人,2005,同上)，通过ELISA评价坎普他汀类似物抑制补体的经典途径的活化的能力。将百分比抑制对肽浓度作图，使用Origin 8.0 软件将所得的数据组拟合对数剂量-反应函数。IC50值获自产生最小χ2值的拟合参数。每一种类似物测定至少3次。

[0139] SPR分析。使用Biacore 3000仪(GE Healthcare,Corp., Piscataway,NJ)表征坎普他汀类似物与C3b的相互作用。电泳缓冲液为含有0.005％Tween-20的PBS,pH 7.4(10mM磷酸钠,150mM NaCl)。将生物素化C3b以约3000和5000RU的密度位点特异性地捕获在链霉抗生物素蛋白芯片上；将两个未处理的流动池用作参照表面。为了进行动力学分析，在单个循环中将成组的5个递增浓度的特定化合物一个接一个地注射在芯片表面上。以30ul/min注射3倍稀释系列(0.49-40nM)；每一次注射进行2min，从而每一次允许肽在开始下一次注射之前解离 5min。在最后一次注射结束时，进行40min的解离时间。将肽4(1MeW) 包含在每一个实验系列中作为内部对照和参照。使用Scrubber(BioLogic Software,Campbell,Australia)和BiaEvaluation(GE Healthcare, Corp.,Piscataway,NJ)进行数据分析。扣除来自未处理的流动池和缓冲液空白注射总体的信号以修正缓冲效应和注射假象。将已加工的生物传感器数据全局性地拟合1:1Langmuir结合模型(由GE Helthcare友好地提供)，从公式KD＝kd/ka计算平衡解离常数(KD)。每一个测定进行至少2 次。

[0140] 将肽停靠到C3c。将AutoDock Vina(Trott and Olson,2010)用于停靠研究。除唯一可被Vina处理为刚性的环状核心区域的主链外，肽的所有其它部分(末端残基、侧链)被确定为在各轮停靠中是柔性的。靠近类似物Cp20(SEQ ID NO:3)N末端的C3c残基(即，Asp349、Lys386、 Ser388、Asn390、Ser437、Asn452、Leu454、Asp491和Leu492)对于停靠实验被确定为柔性的，以允许这些肽的延长N末端与C3c之间存在更合理的相互作用。唯一例外是肽19，其N末端不延伸为其它肽；C3c上的结合部位因此在肽19的停靠中保持刚性。在基于4W9A的C3c结合结构的PyMol中手工地建立所有肽的初始结构。将AutoDockTools用于界定结合口袋和制备C3c的初始结构，将来自pdb的所有肽格式化成 Vina(pdbqt).55的输入格式。在计算相对实验的结合自由能(△G)的比较图中，从通过SPR测定的亲和力值将实验△G计算为△G＝RTln(KD)，R＝1.986 cal K-1mol-1和T＝293.15K。

[0141] 结果:

[0142] N末端延伸的结构/活性。通过使用分子建模方法，在与靶片段C3c 的共晶结构中用Cp20(SEQ ID NO:3)替代早期坎普他汀类似物4W9A。该复合物的计算分析确认了Sar8的甲基与C3c中G489的氧原子形成接触 (距离～ )。结合部位的分析还显示了C3c上可被肽配体的N末端延伸利用的疏水区域的存在。虽然未包埋在C3c的结合口袋中，但坎普他汀的N末端先前已被乙酰基部分保护以改善肽的稳定性；然而，这样的加帽还对抑制效力具有有益作用。基于目前的先导化合物Cp20(SEQ ID NO:3)，评价替代N末端乙酰基部分对靶结合的作用(表1)。为此目的，对类似物进行针对与C3b结合的定量动力学作图，并与临床上使用的类似物4(1MeW)和Cp20(SEQ ID NO:3)相比较(表1,图1)。事实上，利用更短的甲基(肽1)取代末端乙酰基导致亲和力下降几乎1个数量级，低于4(1MeW)的亲和力，从而确认N末端加帽的优势。相反地，利用甘氨酸残基(肽2)的加帽改善解离速率(kd)，然而略微降低缔合速率(ka)，从而仅导致极小的亲和力净变化(相较于Cp20(SEQ ID NO:3))。GlyN-甲基化为Sar(肽3)恢复了缔合性质，同时保持有益的解离值，得到显著改善了亲和力(KD＝1.6nM；表1)的化合物。

[0143] 为了进一步利用N末端最优化的益处，筛选在位置Xaa0(图1B；表 1)处具有天然氨基酸(肽4-8)、甲基化氨基酸(肽9-13)和D-氨基酸(肽 14-18)的另外的基于Cp20(SEQ ID NO:3)的类似物。所述组包括代表性的疏水性、亲水性和带电荷的侧链。所有测试的化合物都显示强结合(KD <20nM)，在整个小组中ka值(1-4×106M-1s-1)显示比kd值(1-25×10-3s-1) 有更小的变化性(表1,图1B)。当筛选对C3b的结合时，所有类似物遵循1:1Langmuir动力学模型，从而强有力支持单一高亲和力结合部位的存在。一般地，具有疏水侧链的D-氨基酸似乎比Cp20(SEQ ID NO:3)的乙酰基(Ac)部分更有利。在这些肽中，在该位置上具有Dtyr的肽14是最有效力的，具有亚纳摩尔亲和力(KD＝0.5nM；表1)和小组内最慢解离速率。其中Ac被其它氨基酸替代的肽的亲和力落在肽1与14的亲和力之间，大多数类似物聚簇在Cp20(SEQ ID NO:3)的特征谱周围(图1B)。酪氨酸通常似乎是优选的，因为所有具有N末端Tyr、其O-甲基类似物和其D-异构体的肽属于其中具有约1nM或低于1nM的亲和力的最佳结合剂。相反地，具有更短侧链的残基如Gly、Thr或Ala衍生物相较于Cp20(SEQ ID NO:3)似乎不太有利并且未改善亲和力。因此，加帽Xaa0 残基的替代对于具有不同性质(从疏水性至带电荷)的广泛氨基酸残基似乎都能被良好地耐受。

[0144] 表1.在N末端具有修饰的一系列坎普他汀类似物 (Xaa0-Xaa1-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]- mIle-NH2)(SEQ ID NO:4)的动力学参数和抑制效力的评价。ka:缔合速率；kd:解离速率；KD:来自SPR的结合常数；IC50,实现经典途径补体活化的50％抑制的肽浓度。ND:未测定。

[0145]

[0146] a Ac-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys]-Thr -NH2(Katragadda等人,2006,同上,WO 2007/062249；在本文中有时称为“4(1MeW)”)；在所有分析中均被包括在内作为标准，但不遵循 Cp20(SEQ ID NO:3)模板。

[0147] b用于N末端修饰的基础化合物；来自先前出版物(WO2010/127336)的结合/效力值。

[0148] c被选择用于进一步测定：肽3-Cp30(SEQ ID NO:7)；肽14-Cp40(SEQ ID NO:18)[0149] 计算分析。进行扩展的停留分析以提供观察到的对结合亲和力的效果的结构证据，并且产生用于预测新型类似物的计算模型。最初，使用来自Cp20(SEQ ID NO:3)的N末端修饰类似物(肽1-18；表1)的筛选的数据组验证停靠策略。为此目的，在芯片上制备化合物，将其停留至人 C3c的坎普他汀结合口袋中(Janssen等人,2007,同上)，计算结合自由能(△G)，通过测定皮尔逊系数((R，图2)将其与SPR亲和力衍生值相比较。基于整个数据组上的5个独立停靠研究，实验与计算△G值之间的总体相关性为0.46(图2)。在数据组的19个类似物中，3个具有极短部分 (甲基；肽1)或芳香族天然氨基酸(肽5和7)的肽显示显著更高的偏离；当不包括这些类似物时，相关性增加至0.69(图2)。

[0150] 停留肽的更详细分析表明大多数N末端修饰坎普他汀类似物与C3c 上的极性区域和浅口袋形成额外的接触。例如，C3c的涉及Asp349、 Ser388和Ser437的极性区域与肽14中的Dtyr的N末端氨基相互作用(图 3A)。相反地，由于氨基的不同取向，这样的极性相互作用对于在该位置上具有天然氨基酸的肽是不利的，如对于肽4所举例说明的(图3A)。此外，肽14中延伸氨基酸(DTyr)的侧链与C3c上的浅延伸口袋中的Leu454 和Leu492形成另外的疏水性接触。最后，Dtyr的羟基与C3c的Asn452 形成弱氢键。这些作用的组合可能有助于观察到的肽14的亚纳摩尔浓度结合亲和力。

[0151] 为了进一步探究阐明N末端口袋的独特策略，设计两个类似物，其中芳香残基位于位置Xaa0或Xaa1处(肽19和20；表1)。基于上述开发的计算模型，预测肽19中的新Trp的侧链很好地拟合进入疏水结合口袋 (图3B)，然而在肽20中选择短的柔性Gly接头以使Tyr侧链能够更好地定向(当与同系物肽4相比较时)。虽然肽20显示为肽4的1/3的弱结合亲和力，但肽19达到亚摩尔浓度结合亲和力(KD＝0.5nM；表1)，从而使得其与肽14同样有效力。综上所述，这些结果显示了与位置2上的 Cys相邻的正确定向的疏水性残基的优势。

[0152] 基于Cp40(肽14,SEQ ID NO:18,表1)构建另外的类似物。这些类似物示于下面表2中。

[0153] 表2.评估基于Cp40(SEQ ID NO:18)的在肽内部具有修饰的类似物的动力学参数和抑制效力。肽名称中的编号表示相对于坎普他汀的位置。ka:缔合速率；kd:解离速率；KD:来自SPR的结合常数；IC50,实现经典途径补体活化的50％抑制的肽浓度。

[0154]

[0155] a鸟氨酸取代位置11处的精氨酸。

[0156] b天冬酰胺取代位置6处的天冬氨酸。

[0157] 如上所述，在不使用间隔子的情况下将ABM、ABM0或ABM2偶联于 CP20(SEQ ID NO:3)或CP40(SEQ ID NO:18)和其某些变体的N末端。这些类似物显示结合和补体抑制活性在与Cp40类似物及表2中显示的其衍生物相同的范围内。

[0158] 实施例3

[0159] 测量如实施例1中所述合成的某些坎普他汀类似物在注射用水(WFI) 和Dulbecco's PBS(DPBS)中的溶解度。

[0160] 材料和方法:

[0161] 称取约5mg的每一种肽(醋酸盐形式)，放入分开的LoBind Eppendorf管，向每一个管中添加50μL注射用水(WFI)。将每一个样品以13000rpm离心2min，随后稀释以使用测量NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific,Wilmington,DE)在280nm测量光密度(OD)。将每一个浓缩的样品以1:20稀释入Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液(DPBS，不含钾和钙；
Invitrogen,Carlsbad,California)。监控样品的沉淀，将每一个样品涡旋5分钟，以
13000rpm离心2min。测量每一个DPBS 上清液的OD以测定饱和时肽的浓度。

[0162] 结果:

[0163] 虽然3个酸性或碱性残基(Asp6、His10、Arg11)在大多数坎普他汀类似物中的存在有助于水溶液中总体上有利的溶解度，但它们的两性离子性质可不利地影响缓冲液中的溶解度。因此，评价选择的化合物在两种临床上相关的溶剂即注射用水(WFI)和Dulbecco's PBS(DPBS)中的溶解度。此外，测量这些肽在C18柱上的超高效液相色谱(UPLC)停留时间来反映它们的表观相对疏水性(表3)。

[0164] 表3.肽在WFI(注射用水)和DPBS中的溶解度，和作为疏水性指标的UPLC(超高效液相色谱)停留时间。

[0165]

[0166] a测量为饱和时的OD(280nm)；WFI＝注射用水，DPBS＝Dubelcco’s磷酸缓冲盐溶液[0167] b测量为在C18柱上进行UPLC分析过程中的停留时间

[0168] c在ELISA研究过程中，肽19不能以100μM或更高浓度溶解在PBS中。

[0169] WFI中的溶解度是极好的，除了Cp20(SEQ ID NO:3)以外，所有化合物的值超过50mg/mL。一般地，对于所有类似物，DPBS中的溶解度显著更低。相较于4(1MeW)，Cp20(SEQ ID NO:3)在两种溶剂中的溶解度降低被认为是因两个N-甲基化(位置8和13)和C末端Thr至Ile的取代引起的其疏水性的结果。4(1MeW)和Cp20(SEQ ID NO:3)的N-末端乙酰基部分被未加帽的氨基酸残基替代诱导了Cp30(SEQ ID NO:7)和Cp40(SEQ ID NO:18)的疏水性的显著增加，并且恢复了它们在WFI中的高溶解度(>50 mg/mL)。然而，在其N末端掺入疏水性Dtyr不利地影响了Cp40(SEQ ID NO:18)在DPBS中的溶解度(0.8mg/mL)。相反地，Cp30(SEQ ID NO:7) 中小的N末端Sar的存在大大改善了其在DPBS中的溶解度(6.9mg/mL)，从而使得该肽的溶解度几乎为临床使用的4(1MeW)类似物的2倍。

[0170] 实施例4

[0171] 测量如实施例1中所述合成的某些坎普他汀类似物在人血浆中的血浆稳定性和血浆蛋白结合。

[0172] 材料和方法:

[0173] 血浆稳定性。将含有来匹卢定(3.75单位/ml)的新鲜人血浆在37℃与终浓度各自为20μM的Cp30(SEQ ID NO:7)、Cp40(SEQ ID NO:18)或对照肽2B一起温育。取100μL的样品用于固相提取。将96孔板HLB Oasis 30μm 10mg(Waters,Milford,MA)用于提取。通过添加各自500μL 的甲醇和ACN，随后通过添加500μL的milli-Q水来条件化SPE材料。利用4％H3PO4以1:1稀释样品。在加载样品后，利用500μL的0.1％甲酸中的10％ACN洗涤2次。利用200μL的0.1％甲酸中的65％ACN洗脱样品，将其收集在Eppendorf LoBind收集板中。将用于UPLC-MS的样品以1:10 稀释在含有0.1％甲酸的milli-Q水中。在将SPE用作内部标准之前，在每一个样品中掺入Cp20(SEQ ID NO:3)。

[0174] 血浆蛋白结合。将Cp30(SEQ ID NO:7)掺入500μL含有来匹卢定 (3.75单位/ml)的新鲜人血浆中，以便终肽浓度为20μM(C3:1.2mg/mL, 6.4μM)。使用Cp30(SEQ ID NO:7)和milli-Q水以相同的方式制备对照样品，以在1μM下在UPLC-MS中测定肽的面积。将血浆样品在室温下平衡10min。随后，在混合的情况下，将500μL的milli-Q水中的 30％PEG(MW3350)缓慢地添加至血浆样品中。将混合物以14000rpm离心 10min以分离上清液。将沉淀溶解在1000μL的FPLC缓冲液A中，使用Mono Q 5/5柱通过FPLC进行分离，以每管1mL收集级分。将
0.5mL 的每一个级分与相同体积的4％H3PO4混合以进行SPE和UPLC-MS分析。

[0175] UPLC-MS分析。在配备有通过MassLynx 4.1软件(Waters)控制的 ESI源的SYNAPT HDMS(Waters,Milford,MA)上进行UPLC-MS分析。以一式四份注射每一个样品。通过反相液相色谱，将在线ACQUITY UPLC(Waters)系统用于肽分离。毛细管电压为3.2kV，锥孔电压为30V 并且源温度为120℃。将[Glu1]-血纤蛋白原肽以30s的采样速率用于锁定质量修正(lock-mass correction)。以1s的扫描速率在200-2000Da 的m/z范围内以正模式获得质谱图。分析物的存在通过保留时间和质量来确认。通过分析空白血浆样品和纯肽以测定与分析物共洗脱的任何干扰的存在来研究选择性。注射后，在1.7μm UPLC BEH130C18柱(Water,
2.1μm x 150mm,部分编号186003556)上分离分析物。使分析柱温度保持在40℃。以0.3mL/min的流速分离肽。梯度为在8分钟内线性10-60％ B(乙腈中的0.1％甲酸)。

[0176] 结果:

[0177] 血浆稳定性。为了研究具有游离N末端的新型类似物的稳定性，选择Cp30(SEQ ID NO:7)和Cp40(SEQ ID NO:18)用来在人血浆中于37℃进行温育(图4A)。对照线性肽2B(LRFLNPFSLDGSGFW,SEQ ID NO:28)在与血浆接触后被快速切割。0时间点样品显示在Arg位置处的切割。肽在30min内完全消失。在相同条件下，Cp30(SEQ ID NO:7)和Cp40(SEQ ID NO:18)都显示显著的血浆稳定性。5天后，超过55％的肽得以保留。第0、24和120h的时间点的UPLC-MS色谱图十分相似(图4B)。未观察到主要切割产物。

[0178] 血浆蛋白结合。为了研究Cp30(SEQ ID NO:7)的结合特异性，在新鲜人血浆中温育过量的肽。利用PEG3350沉淀血浆蛋白，使用小的Mono Q柱进行分离。测量每一个1mL的级分中Cp30(SEQ ID NO:7)的存在。使用UPLC-MS进一步定量分析包含Cp30(SEQ ID NO:7)的级分，测试共洗脱蛋白的身份。发现7.5％的Cp30(SEQ ID NO:7)位于流过物中，而88.0％和4.5％分别与C3和C3c共洗脱。这些蛋白质的身份通过SDS-PAGE，随后通过考马斯染色和Western印迹来鉴定。此外，检测到的Cp30(SEQ ID NO:7)的总量等于血浆C3的量。

[0179] 实施例5

[0180] 测量如实施例1中所述合成的坎普他汀类似物Cp20(SEQ ID NO:3)、 Cp30(SEQ ID NO:7)和Cp40(SEQ ID NO:18)在食蟹猴模型中的体内停留。使用上述SPR法，在4个灵长类动物物种：人、食蟹猴、猕猴和狒狒的血浆中比较这些肽的结合特征谱。

[0181] 材料和方法:

[0182] 灵长类动物研究和样品收集。在Simian Conservation Breeding and Research Center(SICONBREC,Makati City,Philippines)于食蟹猴(Macaca fascicu laris)中进行主要代谢产物的血浆半衰期和产生的评价。对于每一种类似物(Cp20(SEQ ID NO:3)、Cp30(SEQ ID NO:7)和 Cp40(SEQ ID NO:18))，使两只健康动物镇静，利用2mg/kg的化合物(溶解于注射用盐水中)进行静脉内注射。在即将注射化合物之前和在注射后不同的时间点(2、5和30min；1、2、4、6和24小时)将血样品(1-2 mL)收集在EDTA涂覆的真空采血管中，以防止凝固和补体活化，以～800 x g将其离心10min以获得血浆。将血浆样品立即冷冻和贮存以待将来分析。按照动物福利法规进行所有NHP研究。

[0183] 血浆样品的分析。在利用UPLC-MS分析之前，在96孔板版式(HLB Oasis 30μm,10mg；Waters,Milford,MA)中通过固相提取法(SPE) 提取血浆样品中的坎普他汀类似物。
使用乙腈和水对SPE材料进行充分条件化。用4％磷酸以1:1稀释血浆样品，将恒定浓度的Cp20(SEQ ID NO:3)(5pM)掺入所有包含Cp30(SEQ ID NO:7)或Cp40(SEQ ID NO:18) 作为内部标准的样品中；在含Cp20(SEQ ID NO:3)的样品的情况下，将 Cp40(SEQ ID NO:18)用作内部对照。将样品加载在SPE板上，用0.1％甲酸中的10％乙腈进行洗涤。利用200μL的
0.1％甲酸中的65％乙腈洗脱提取的肽，将其收集在LoBind管(Eppendorf)中以避免肽吸附。最后，用 45μL 0.1％甲酸稀释5μL的每一种洗脱物，将其注射进入UPLC-MS系统，该系统由偶联至配备有ESI源并且受MassLynx 4.1软件(Waters)控制的SYNAPT G2-S HDMS仪的在线ACQUITY UPLC组成。以一式四份注射每一个样品。在40℃的柱温下，利用1.7μm UPLC BEH130C18柱(2.1μm× 150mm；Waters)将反相液相色谱用于肽分离。利用10-60％的乙腈(于含 0.1％甲酸的水中)的线性梯度以0.15mL/min的流速在8min内分离肽。利用HDMS直接分析洗脱的肽；将ESI源毛细管电压设置为3.2kV，锥孔电压设置为30V以及将源温度设置为
120℃。以30s的取样速度将 [Glu1]-纤维蛋白肽B(Sigma)用于锁定质量修正。以1s的扫描速率在 50-1950Da的m/z范围内以正模式获得质谱图。

[0184] 血浆半衰期的测定。在分析的当天，通过将坎普他汀类似物 (Cp20(SEQ ID NO:3)、Cp30(SEQ ID NO:7)和Cp40(SEQ ID NO:18))以0.5、 1、2、4和8μM的终浓度掺入来自未处理食蟹猴的新鲜解冻的血浆中来制备校准曲线。对所有校准样品进行SPE并使用上述UPLC-HDMS进行测量。通过积分法测定MS峰面积，将其针对浓度作图，从而产生校准曲线，该曲线显示良好的线性，回归系数(R2)大于0.993。为了进行药代动力学分析，使用对应的标准曲线，从每一个肽的提取峰面积计算每一个时间点上的血浆浓度(Cp)。使用下列公式从终末消除期(0.5-24h)的斜率测定消除常数(ke)和血浆半衰期(t1/2)：ln(Cp)＝ln(Cp0)-ke×t和 t1/2＝0.693/ke。C3水平的测定。利用ELISA测定本研究中使用的各食蟹猴的C3血浆浓度。简而言之，用PBS中的单克隆抗-C3抗体1μg/ml(克隆8E11；Tosic等人,1989,J.Immunol.Methods 120:241-249)在 4.25℃涂覆96孔板(MaxiSorp；Nunc)过夜。用PBS/Tween 0.05％洗涤孔，随后用PBS/BSA 1％在室温下封闭1h。随后将血浆(以1:10,000和 1:
20,000于PBS/BSA中稀释)或纯化的食蟹猴C3的系列稀释物在室温温育1h，随后洗涤，用以
1:1,000稀释于PBS/BSA中的缀合有过氧化物酶的抗-C3(MP Biomedicals,Solon,OH)在室温下温育，进行1h。按照制造商的说明书使用四甲基联苯胺底物(R&D Systems,
Minneapolis, MN)进行反应，使用波长设置在450nm的微量滴定板读数器测定光密度。

[0185] 溶血测定。兔红细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行洗涤，随后用弗罗那钠缓冲盐水(VBS)Mg+/EGTA进行洗涤。在VBS缓冲液中制备1:20的稀释物。用兔红细胞溶液(50μl)于96孔板中在37℃温育血浆样品(1:10于 VBS-100μl中)，进行1h。添加EDTA(0.2mM-15μl)以终止反应，将板离心(2500x g 3min)。将上清液(100μl)转移至新孔，在405nm测量光密度。将用水或缓冲液进行的红细胞温育分别用作阳性(100％裂解)和阴性 (0％裂解)对照。

[0186] 结合特征谱。为了进行NHP特异性实验，使用标准胺偶联法将来自人、食蟹猴、猕猴和狒狒血浆的C3固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare) 的各流动池上，达到6,000-7,000RU的靶密度。如实施例2中所述，使用单循环动力学方法定量评价肽Cp20(SEQ ID NO:3)和Cp40(SEQ ID NO:18)。为了目视比较不依赖于靶密度或活性的差异的动力学特征谱，将每一个结合曲线针对最大反应进行标准化并且迭合在原始曲线中。

[0187] 结果:

[0188] 肽类药物通常因比较快地从血浆消除而受到阻碍，这在依赖于恒定全身性药物水平(例如，在补体抑制剂的情况下PNH)的临床应用中可能极其受限。进行包括Cp20(SEQ ID NO:3)以及新开发的Cp30(SEQ ID NO:7) 和Cp40(SEQ ID NO:18)的比较研究，其中利用2mg/kg的每种类似物静脉内注射食蟹猴，在24小时的时期内通过LC-MS评估血浆水平。所有测试的类似物遵照相似的双相性消除特征谱，其中血浆水平在注射后头一个小时内更快地下降，随后在整个后来的时间点上慢得多地下降(图 5A)。动力学变化发生时的肽浓度与靶蛋白C3的预期生理血浆水平的浓度极其相似。事实上，通过ELISA进行的相关猴内C3水平的测量 (4.9-12.8μM)确认了坎普他汀水平的初始下降在确定的C3范围内慢下来了(图5A)。
这些观察表明了靶驱动的消除模型，其中对丰富的靶C3 的紧密结合大大影响了肽的排出。
事实上，当基于终末对数-线性部分 (1-24h)计算血浆半衰期时，观察到与对于C3的结合亲和力的直接关联性，Cp20(SEQ ID NO:3)、Cp30(SEQ ID NO:7)和Cp40(SEQ ID NO:18)的半衰期值分别为9.3、10.1和11.8h(图5B)。观察到Cp30-ABM2缀合物的半衰期为22小时(未显示)。

[0189] 使用红细胞溶血测定，针对血浆样品中通过可选择途径进行的补体活化的抑制测量坎普他汀类似物的浓度。观察到补体抑制活性紧随每一个时间点上测量的样品中类似物的浓度。

[0190] 鉴于主要消除相与结合亲和力的强表观依赖性，将这些基于NHP的研究翻译成人系统似乎受到这些坎普他汀类似物对于人和NHP C3的差异亲和力影响。因此，使用上述SPR法测量所述肽对于来自人的C3和3个相关NHP(食蟹猴、猕猴、狒狒)的结合特征谱。所有类似物的亲和力和动力学特征谱是高度相当的(图5C)。

[0191] 实施例6

[0192] 测量如实施例1中所述合成的坎普他汀类似物Cp40(SEQ ID NO:18) 在食蟹猴模型中来自皮下和口服施用途径的生物利用度。

[0193] 材料和方法:

[0194] 灵长类动物研究和样品收集。在Simian Conservation Breeding and Research Center(SICONBREC,Makati City,Philippines)于食蟹猴中进行生物利用度的评价。每一个施用途径使用两支健康动物。使动物镇静，给其皮下注射2mg/kg的化合物或通过胃内灌服法口服给其施用4mg/kg的化合物。在即将注射化合物时和在注射后不同的时间点(2、 5和30min；1、2、4、6和24小时)上将血液样品(1-2mL)收集在涂覆有EDTA的真空采血管中以防止凝固和补体活化，将其以～800x g离心 10min以获得血浆。将血浆样品立即冷冻和贮存以待将来分析。按照动物福利法规进行所有NHP研究。

[0195] 分析。如实施例5中所述进行血浆样品的分析、血浆半衰期和血浆中补体抑制活性的测定。

[0196] 结果:

[0197] 除非常昂贵、不被患者良好地耐受，并且通常需要受过训练的专业人员来进行静脉内施用外，通过任何其它途径施用时肽类药物的生物利用度通常较低。在皮下或口服递送后，测试坎普他汀类似物Cp40(SEQ ID NO:18)的生物利用度。给食蟹猴皮下注射2mg/kg的类似物或口服注射 4mg/kg的类似物，在24h的时期内通过LC-MS评估血浆水平。结果示于图6中。

[0198] Cp40(SEQ ID NO:18)的血浆浓度在通过皮下注射施用后4-5小时内达到约12.5μM的峰值(图6，顶图框)。类似物的口腔注射在注射的1 小时内导致约0.023μM的血浆浓度(图6，底图框；要指出的是，口腔注射仅在两只猴子的一只中是成功的)。通过比较(图5B)，该类似物的静脉内注射导致注射后立即达到约28μM的峰值血浆浓度。

[0199] 使用红细胞溶血测定，针对来自皮下注射的血浆样品中通过另外的途径进行的补体活化的抑制测量坎普他汀类似物的浓度。观察到补体抑制活性有所测量的每一个时间点上密切遵循类似物的浓度。

[0200] 实施例7

[0201] 测量如实施例1中所述的坎普他汀类似物Cp30(SEQ ID NO:7)和 Cp-30-ABM2缀合物在狒狒模型中的体内停留。

[0202] 材料和方法:

[0203] 使用体重5-8kg的青少年狒狒(P.Anubis,Baboon Research Resources,University of Oklahoma)。将两只狒狒用于研究，每一种化合物一只狒狒。每一只动物通过经由外周静脉的注射接受单次剂量的肽(10mg)。将用于LC-MS/MS测定的血液样品收集在装有50μg来匹卢定的1-ml塑料管中，在4℃以2000g离心20min以进行血浆分离。将血浆样品于-70℃贮存。在Cp30(SEQ ID NO:7)或Cp30(SEQ ID NO:7)-ABM2 缀合物注射后以预定的时间间隔收集血液样品。用SPE处理样品，使用 LC-MS/MS进行分析。使用血浆中不同浓度的标准肽产生校准曲线，以测定每一个样品的肽浓度。

[0204] 利用SPE从血浆样品提取坎普他汀类似物。将96孔板HLB Oasis 30μm 10mg(Waters,Milford,MA)用于提取。通过添加500μl甲醇、 ACN，随后添加500μL的milli-Q水来条件化SPE材料。利用4％H3PO4稀释样品。在加载样品后，利用500μL的水和含有0.1％甲酸的10％ACN 进行洗涤。利用200μL的65％ACN(于0.1％甲酸中)洗脱样品，将其收集在收集板中。将用于LC-MS的样品以1:2至1:11稀释于含有含有0.1％甲酸的10％ACN的milli-Q水中。
在进行SPE之前将CP20(SEQ ID NO:3) 作为内部标准掺入每一个样品。

[0205] LC-MS/MS分析。在配备有通过MassLynx 4.1软件(Waters)控制的 ESI源的SYNAPT HDMS(Waters,Milford,MA)上进行LC-MS/MS分析。以一式三份注射每一个样品。通过反相液相色谱将在线ACQUITY UPLC(Waters)系统用于肽分离。毛细管电压为3.2kV，锥孔电压为30V 并且源温度为120℃。将[Glu1]-血纤蛋白原肽以30s的采样速率用于锁定质量修正。以
1s的扫描速率在500-1800Da的m/z范围内以正模式获得质谱图。分析物的存在通过保留时间和质量来确认。注射后，在1.7 μm UPLC BEH130C18柱(Water,1.0μm x 100mm)上分离分析物。使分析柱温度保持在40℃。以0.15mL/min的流速分离肽。梯度为7分钟内的线性15-
55％B(乙腈中的0.1％甲酸)。

[0206] 结果:

[0207] 在静脉内单次快注射至狒狒后使用LC-MS/MS测定肽Cp30(SEQ ID NO:7)和ABM2缀合物的血浆浓度。肽Cp30(SEQ ID NO:7)显示5小时的半衰期，Cp30(SEQ ID NO:7)-ABM2显示7.5hr的半衰期。比较而言，在相同的狒狒模型中，WO2010/127336中公开的坎普他汀类似物4(1MeW) 和强效类似物(肽3)先前被测定为具有约60-90分钟的半衰期。

[0208] 实施例8

[0209] 在狒狒模型中测量如实施例1中所述合成的坎普他汀类似物 Cp40(SEQ ID NO:18)的来自肌内途径施用的生物利用度。

[0210] 方法:

[0211] 给青少年狒狒肌内注射2mg/kg Cp40(SEQ ID NO:18)。将用于 LC-MS/MS测定的血液样品收集在含有50μg来匹卢定的1-ml塑料管中，在4℃以2000g离心20min以进行血浆分离。将血浆样品在-70℃贮存。在注射类似物后以预定的时间间隔收集血液样品。利用SPE处理样品，使用LC-MS/MS进行分析。使用血浆中不同浓度的标准肽产生校准曲线, 以测定每一个样品的肽浓度。

[0212] 如实施例7中所述，从血浆样品提取坎普他汀类似物和进行 LC-MS/MS分析。如实施例5中所述进行溶血测定。

[0213] 结果:

[0214] 结果示于图7中。Cp40(SEQ ID NO:18)的血浆浓度在通过肌内注射施用后约5-6小时内达到约10μM的峰值。观察到补体抑制活性密切遵循每一个时间点处测量的样品中类似物的浓度。

[0215] 本发明涉及以下实施方案：

[0216] 1.一种包含经修饰坎普他汀肽(ICVVQDWGHHRCT(环C2-C12；SEQ ID NO:1)或其类似物的化合物，其中所述修饰包括添加的或取代的N末端组分所述组分相较于等同条件下的未修饰坎普他汀肽而言改善了(1)所述肽的C3、C3b或C3c结合亲和力，(2)所述肽在含水液体中的溶解度，和 /或(3)所述肽的血浆稳定性和/或血浆停留时间。

[0217] 2.实施方式1的化合物，其中所述添加的组分是除L-Gly外的氨基酸或氨基酸的非肽类似物。

[0218] 3.实施方式2的化合物，其中所述添加的组分是D-氨基酸。

[0219] 4.实施方式2的化合物，其中所述添加的组分包括至少一个芳环。

[0220] 5.实施方式2或实施方式3的化合物，其中所述添加的组分是 D-Tyr。

[0221] 6.实施方式2的化合物，其中所述氨基酸是N-甲基化。

[0222] 7.实施方式6的化合物，其中所述氨基酸是N-甲基甘氨酸(Sar)。

[0223] 8.实施方式2-6中任一项的化合物，其中所述添加的组分是 D-Tyr、D-Phe、Tyr(Me)、D-Trp、Tyr、D-Cha、Cha、Phe、Sar、Arg、 mPhe、mVal、Trp、mIle、D-Ala、mAla、Thr或Tyr。

[0224] 9.实施方式1的化合物，其包含取代的N末端组分，其中位置1 处的Ile被Ac-Trp或二肽Tyr-Gly取代。

[0225] 10.实施方式1-9中任一项的化合物，其还包括Ala对位置9处His 的替代。

[0226] 11.实施方式1-10中任一项的化合物，其还包含Trp或Trp类似物对位置4处Val的替代。

[0227] 12.实施方式11的化合物，其中位置4处的Trp类似物是1-甲基 Trp或1-甲酰基Trp。

[0228] 13.实施方式11的化合物，其还包括Trp类似物对位置7处Trp 的替代。

[0229] 14.实施方式13的化合物，其中位置7处Trp类似物是卤代Trp。

[0230] 15.实施方式1-14中任一项的化合物，其还包括位置8处Gly的修饰以约束该位置处的主链构象。

[0231] 16.实施方式15的化合物，其中通过用Nα-甲基Gly替代位置8处的Gly(Gly8)来约束主链。

[0232] 17.实施方式15的化合物，其还包括利用Ile、Leu、Nle、N-甲基 Thr或N-甲基Ile替代位置13处的Thr。

[0233] 18.实施方式1-17中任一项的化合物，其还包括利用硫醚键替代 C2与C12之间的二硫键以形成胱硫醚或羊毛硫氨酸。

[0234] 19.实施方式1-18中任一项的化合物，其还包括利用Orn替代位置 11处的Arg。

[0235] 20.实施方式1-19中任一项的化合物，其还包括利用Asn替代位置 6处的Asp。

[0236] 21.实施方式1的化合物，其为包含具有SEQ ID NO:29所示序列的肽的坎普他汀类似物，其为：

[0237] Xaa1-Xaa2-Cys-Val-Xaa3-Gln-Xaa4-Xaa5-Gly- Xaa6-His-Xaa7-Cys-Xaa8，其中Xaa4与Xaa5之间的Gly任选地被修饰以约束主链构象；

[0238] 其中：

[0239] Xaa1不存在或为Tyr、D-Tyr或Sar；

[0240] Xaa2为Ile、Gly或Ac-Trp；

[0241] Xaa3为Trp或Trp类似物，其中所述Trp类似物相较于Trp具有增强的疏水特征；

[0242] Xaa4为Asp或Asn；

[0243] Xaa5为Trp或Trp类似物，所述Trp类似物包括对其吲哚环的化学修饰，其中所述化学修饰增加吲哚环的氢键潜能；

[0244] Xaa6为His、Ala、Phe或Trp；

[0245] Xaa7为Arg或Orn；和

[0246] Xaa8为Thr,Ile,Leu,Nle,N-甲基Thr或N-甲基Ile，其中Thr、 Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile中任一个的羧基末端-OH任选地被-NH2替代，和

[0247] 所述肽通过Cys-Cys或硫醚键呈环状。

[0248] 22.实施方式19的化合物，其中：

[0249] 位置8处的Gly为N-甲基化的；

[0250] Xaa1为D-Tyr或Sar；

[0251] Xaa2为Ile；

[0252] Xaa3为Trp,1-甲基-Trp或1-甲酰基-Trp；

[0253] Xaa5为Trp；

[0254] Xaa6为Ala；和

[0255] Xaa8为Thr、Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile，任选地用-NH2替代羧基末端-OH。

[0256] 23.实施方式22的化合物，其中Xaa8为Ile、N-甲基Thr或N-甲基Ile，任选地用-NH2替代羧基末端-OH。

[0257] 24.实施方式23的化合物，其包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18。

[0258] 25.前述实施方式中任一项的化合物，其包含增加所述化合物的生物利用度或延长所述化合物的体内停留的另外的组分。

[0259] 26.实施方式25的化合物，其中所述另外的组分是聚乙二醇(PEG)。

[0260] 27.实施方式25的化合物，其中所述另外的组分是白蛋白结合小分子。

[0261] 28.实施方式27的化合物，其中将所述白蛋白结合小分子在N末端或C末端连接于所述肽。

[0262] 29.实施方式25的化合物，其在所述肽与白蛋白结合小分子之间包含间隔子。

[0263] 30.实施方式25的化合物，其中所述另外的组分是白蛋白结合肽。

[0264] 31.一种药物组合物，其包含前述实施方式中任一项的化合物和药学上可接受的载体。

[0265] 32.实施方式31的药物组合物，其被配制用于所述化合物的口服施用。

[0266] 33.实施方式31的药物组合物，其被配制用于所述化合物的局部施用。

[0267] 34.实施方式31的药物组合物，其被配制用于所述化合物的肺部施用。

[0268] 35.实施方式31的药物组合物，其被配制用于所述化合物的皮下或肌内注射。

[0269] 36.实施方式31的药物组合物，其被配制用于所述化合物的静脉内注射。

[0270] 37.前述实施方式中任一项的化合物用于制备用于抑制补体活化的药剂的用途。

[0271] 38.前述实施方式中任一项的化合物用于抑制补体活化的用途。

[0272] 本发明不限于上文中描述和举例说明的实施方案，而是能够在所附实施方式的范围内变化和变动。

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