技术领域
[0001] 本
发明涉及农业
害虫生物防治领域，特别涉及加强果蝇类生物防治效果的蛹寄生蜂人工繁育生产方法，属于优势寄主的人工饲养方法和对加强果蝇类害虫生物防治效果的蛹寄生蜂人工繁育生产方法。
背景技术
[0002] 果蝇食性广泛，生长环境特殊，喜阴暗潮湿的栖息场所，对酸甜和腐败气味具有明显趋性，可为害多种瓜果蔬菜及许多
植物的多汁器官，是重要的农业害虫。当果蝇危害
农作物时通常以混合种的形式存在，包括
黑腹果蝇Drosophila melanogaster、伊米果蝇D.immigrans、斑翅果蝇D.suzukii等。寄生蜂能够控制寄主的种群数量，是重要的生物防治因子。因此，在害虫综合防治管理中越来越多地采用天敌昆虫对果蝇类害虫进行种群控制。
[0003] 毛
角锤角细蜂Trichopria drosophilae Perkins，属膜翅目锤角细蜂科，是果蝇蛹期的主要寄生蜂，寄主范围广。在实验室条件下，其寄生效率高于环腹瘿蜂科Figitida的两种主要果蝇幼虫寄生蜂，但目前在果蝇-寄生蜂体系的研究却很少针对果蝇蛹期寄生蜂，而毛角锤角细蜂在斑翅果蝇成为全球性害虫之前更是鲜有报道。
[0004]
申请号CN201610213523.3的中国
专利公开了一种室内繁育毛角锤角细蜂的方法，但由于
实施例中所采用的寄主斑翅果蝇群体虫态发育不一，且人工繁育条件复杂，不利于标准化和大规模饲养，故并未对实际生产中大量获得毛角锤角细蜂带来便利；申请号CN201210448362.8的中国专利介绍了一种利用替代寄主培育蝇蛹金小蜂的方法，该实施例中源于优势寄主的寄生蜂对果蝇具有更强的控制效果，但蝇蛹金小蜂的生存能
力和寄生效率等各项生物学特性均不及毛角锤角细蜂。
[0005] 发育自黑腹果蝇蛹的毛角锤角细蜂
羽化率和寄生效率高，寿命长，繁殖能力强，是防治果蝇方面的良好资源。但相比于黑腹果蝇，海德氏果蝇D.hydei寿命更长，繁殖力更强，且各发育阶段个体更大，是繁育寄生蜂的优势替代寄主。现国内尚未有规模化繁殖毛角锤角细蜂并将其应用到防治果蝇类害虫方面的研究报道，若能大规模扩繁毛角锤角细蜂，对于实际生产中提高害虫防治的效果有重要的参考意义。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是，克服
现有技术中的不足，提供一种加强果蝇类生物防治效果的蛹寄生蜂人工繁育生产方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
[0008] 提供一种加强果蝇类生物防治效果的蛹寄生蜂人工繁育生产方法，包括下述步骤：
[0009] (1)收集和扩繁蜂种
[0010] 收集被毛角锤角细蜂寄生的黑腹果蝇蛹，置于
温度为25±1℃、RH为50％的恒温恒湿
培养箱中发育；待收集到的蛹羽化出蜂后，先使其充分交配，然后按雌蜂和蝇蛹为1∶10的比例置于装有毛角锤角细蜂食物的培养瓶内进行寄生扩繁，待雌蜂寄生产卵完毕将雌蜂移出；
[0011] 将得到的毛角锤角细蜂后代以同样的方法连续三代用于海德氏果蝇蛹的寄生，使来自海德氏果蝇蛹的毛角锤角细蜂种群得以稳定，最终收集50头左右体长在4.5～4.9毫米的雄蜂和200头左右体长在3.6～4.0毫米的雌蜂作为人工繁殖用的蜂种，饲养于温度为18±1℃、RH为50％的恒温恒湿培养箱内保存；
[0012] (2)海德氏果蝇的接种繁殖
[0013] 取羽化后一周左右且充分交配的海德氏果蝇25头，雌果蝇与雄果蝇的比例为20∶5；以CO2麻醉并放入装有海德氏果蝇食物的培养瓶中，在25℃的恒温箱中培育至产卵100-
120头后取出果蝇；将培养瓶置于温度为25±1℃、RH为50％的恒温恒湿培养箱内，观察并记录开始
化蛹时间，化蛹数目以及果蝇生长发育状况；
[0014] (3)毛角锤角细蜂接种
[0015] 待步骤(2)中海德氏果蝇化蛹2天后，从步骤(1)保存的毛角锤角细蜂的蜂种里挑1/10蛹数的雌蜂放入前者的培育瓶中；观察雌蜂对海德氏果蝇化蛹进行寄生，12h后取出寄生蜂；
[0016] (4)毛角锤角细蜂培养与收集
[0017] 将步骤(3)中被寄生的海德氏果蝇蛹置于温度为25±1℃、RH为50％的恒温恒湿培养箱内，待寄生蜂在寄主蛹内发育至第15天时，寄生蜂开始陆续羽化，收集羽化后的寄生蜂；
[0018] (5)留种
[0019] 将步骤(4)中收集到的毛角锤角细蜂放入装有寄生蜂食物的培养管中，培养管置于温度为18±1℃、RH为50％的恒温恒湿培养箱内保存；共保存100头左右，用于下次育种时的毛角锤角细蜂接种。
[0020] 本发明中，所述寄生蜂食物的配置方法为：取27g琼脂加入1000ml
水中，充分搅拌混匀后进行高温
蒸汽灭菌；然后加入33g红糖和330ml纯苹果汁，充分搅拌混匀后自然冷却至60℃；将100g尼泊金甲酯溶于900ml的95％
乙醇中，然后加入冷却好的混合物中，充分搅拌混匀，4℃冷藏备用。
[0021] 本发明中，所述海德氏果蝇食物的配置方法为：取干
酵母80g加入300ml温水中溶解；称取琼脂10g、胰蛋白胨20g、酵母提取物20g、
蔗糖30g、
葡萄糖60g加入700ml温水中，充分搅拌混匀后加入已溶解的300ml酵母溶液，加热并搅拌；待混合物煮熟时依次加入0.5g MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，煮沸后自然冷却至50～60℃时，加入6ml丙酸、10ml尼泊金甲酯溶液和1g苯
甲酸钠并搅拌均匀，冷却6～7h后密封，放入4℃
冰箱冷藏备用；所述尼泊金甲酯溶液是以100g尼泊金甲酯溶于900ml的95％乙醇而成。
[0022] 本发明中，所述收集被毛角锤角细蜂寄生的黑腹果蝇蛹，是按下述步骤操作的：选择昆虫活跃且少有极端天气的季节，在植被丰富的水源附近放置果蝇寄生蜂诱捕装置，三周后回收，收集诱捕装置中被毛角锤角细蜂寄生的黑腹果蝇蛹。
[0023] 发明原理描述：
[0024] 毛角锤角细蜂寄生范围广，并非黑腹果蝇的专性寄生蜂，在室外诱捕蜂种的同时，还可能同时捕获果蝇属的其他品种。选择其中个体大、灵敏度高的野生型果蝇，经形态学和分子生物学鉴定为海德氏果蝇，作为寄主。如果用实验室饲养黑腹果蝇的传统食物配方(玉米粉-酵母-琼脂)饲养海德氏果蝇，幼虫活动力低，爬行能力弱，常埋于食物底部化蛹，这不仅不利于寄主的繁殖发育，而且也为毛角锤角细蜂的寄生和羽化带来不便。
[0025] 本发明通过不断试验改进，调整了原食物配方的主要营养成分比例，即加大了
蛋白质和糖的摄入量，从而不仅延长了寄主果蝇的寿命，缩短其生活周期，同时产卵率和化蛹率也显著提高，这为人工加强毛角锤角细蜂的生物防治效果提供了基本的技术支持。
[0026] 与使用黑腹果蝇蝇蛹繁殖的毛角锤角细蜂相比，使用海德氏果蝇蝇蛹获得的毛角锤角细蜂的形态特征以及在对黑腹果蝇的控制上，效率更为突出，两种繁殖方法对比结果如下：与实验室测定的通过黑腹果蝇蝇蛹繁育的毛角锤角细蜂相比，本发明得到的毛角锤角细蜂有更高的羽化率和产雌率，且具有个体寿命显著较长、个体形态显著较大、雌蜂可育时间显著延长、储精能力显著增强、抗逆能力显著提高等特点；此外，与使用黑腹果蝇蝇蛹相比，用本发明得到的毛角锤角细蜂在寄生黑腹果蝇蝇蛹时，寄生率和寄生效率均显著增大。
[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0028] 1、本发明对毛角锤角细蜂的培育更便利于寄生蜂的合理接种及利用；
[0029] 2、本发明在生产接种过程中控制了毛角锤角细蜂的寄生时间，避免了因寄生时间过短导致的低寄生率或因过度寄生而造成的低出蜂率；
[0030] 3、本发明对毛角锤角细蜂、寄主果蝇蛹的接种比例做了要求，接种寄生时将寄主集中在培养瓶内，大大缩短毛角锤角细蜂搜寻寄主的时间，从而提高了寄生蜂的寄生率；
[0031] 4、本发明能够进行大规模连续生产，完善优势寄主选择和繁蜂技术，实现优质、高效、大批量繁殖毛角锤角细蜂，为毛角锤角细蜂的繁殖利用奠定了良好
基础；
[0032] 5、本发明对其它蜂的繁殖、贮藏和释放具有参考作用；
[0033] 6、本发明提高了对果蝇等浆果类害虫的防治效果，应用于农业害虫防治领域能更大程度上满足农业生产需要。
附图说明
[0034] 图1为本发明的毛角锤角细蜂人工繁殖生产工艺流程示意图。
具体实施方式
[0035] 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
[0036] 如图1所示，毛角锤角细蜂的接种扩繁方法包括下述步骤：
[0037] (1)收集和扩繁蜂种；
[0038] 步骤(1)具体包括：
[0039] A、收集蜂种：选择昆虫活跃且少有极端天气的季节，在植被丰富的水源附近放置果蝇寄生蜂诱捕装置(参考申请号为CN201621171038.6的中国专利)，三周后回收，收集被毛角锤角细蜂寄生的黑腹果蝇蛹，置于温度为25±1℃、RH为50％的恒温恒湿培养箱(购于杭州来泊生物科技有限公司)中发育。
[0040] 已被毛角锤角细蜂寄生的黑腹果蝇蛹的判断方法：正常黑腹果蝇的蛹期为4天，然后羽化出果蝇；被毛角锤角细蜂寄生后的黑腹果蝇蛹需要15-20天才会有蜂从其中羽化，且幼蜂在果蝇蛹内发育的过程中，可观察到半透明的蛹壳内有虫体逐渐
颜色加深变黑。待毛角锤角细蜂从黑腹果蝇蛹内羽化之后将其收集，通过分类学和分子生物学等途径对其进行鉴定，确认该寄生蜂为毛角锤角细蜂。本发明在该收集步骤之后的扩繁等操作中，对毛角锤角细蜂的收集已无需采用野外捕获方式，直接将以上得到的第一代寄生蜂扩繁即可。
[0041] B、寄生蜂食物配制(1L)：称取27g琼脂加入1000ml水中，充分搅拌混匀后进行高温蒸汽灭菌；随后加入33g红糖，330ml纯苹果汁，充分搅拌混匀；待食物自然冷却至60℃后，将100g尼泊金甲酯溶于900ml的95％乙醇中，充分溶解并加入到冷却好的食物中，充分搅拌混匀；分装食物至透苯果蝇管和塑料饲养瓶(购买于海
门市中泰实验器材厂)，4℃冷藏备用。
[0042] C、蜂种扩繁：待步骤A中收集到的蛹羽化出蜂后，先使其充分交配，后按雌蜂和蝇蛹数为1:10的比例将其置于步骤B中的培养瓶内(不放雄蜂)，进行寄生扩繁。待雌蜂寄生产卵完毕将其移出。
[0043] D、蜂种优选和种群稳定：将步骤C中得到的得到的毛角锤角细蜂后代以同样的方法连续三代用于海德氏果蝇蛹的寄生，使来自海德氏果蝇蛹的毛角锤角细蜂种群得以稳定；最终选择体长在4.5～4.9毫米的雄蜂和体长在3.6～4.0毫米的雌峰作为人工繁殖用的蜂种，收集50头左右的毛角锤角细蜂雄峰和200头左右的毛角锤角细蜂雌峰。
[0044] E、蜂种保存：将步骤D中羽化的毛角锤角细蜂，饲养于步骤B的寄生蜂食物中，于温度为18±1℃、RH为50％的实验室恒温恒湿培养箱(购于南京百思禾生物科技有限公司)内保存；
[0045] (2)海德氏果蝇的接种繁殖；
[0046] 步骤(2)具体包括：
[0047] F、海德氏果蝇食物配制(1L)：称取干酵母80g，以300ml温水溶解；称取琼脂10g，胰蛋白胨20g，酵母提取物20g，蔗糖30g，葡萄糖60g于700ml温水中，充分搅拌混匀后，加入已溶解的300ml酵母溶液，加热并大力搅拌；待上述1000ml食物大致煮熟时分别加入0.5g MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，煮沸后换小火，再煮1-2min，关火，待食物自然冷却至50～60℃时，加入6ml丙酸，10ml尼泊金甲酯溶液(100g尼泊金甲酯溶于900ml的95％乙醇)和1g
苯甲酸钠，搅拌均匀后，分装食物于步骤C中的培养容器中，之后用纱布密封；待食物冷却6～7h后，用
包装袋密封，贴上胶布，放入4℃冰箱冷藏，随取随用。
[0048] G、寄主果蝇接种繁殖：取羽化后一周左右且充分交配的海德氏果蝇25头(雌果蝇：雄果蝇＝20:5)，以CO2麻醉并放入步骤F中分装好的培养瓶，在25℃的恒温箱中产卵2h后取出，使其产卵100-120头。
[0049] H、蝇蛹的发育：将10瓶步骤G中的果蝇瓶置于步骤A中的智能培养箱内，观察并记录开始化蛹时间，化蛹数目以及果蝇生长发育状况；
[0050] (3)毛角锤角细蜂接种；
[0051] 步骤(3)具体包括：
[0052] 待步骤H中的海德氏果蝇化蛹2天后，从步骤E保存的蜂种里挑1/10蛹数的雌蜂，置于步骤A中的智能培养箱内进行寄生(不放雄蜂)，12h后取出寄生蜂。
[0053] 进行寄生接种时，要保证毛角锤角细蜂已经过充分交配，且活动力强；毛角锤角细蜂正处于二日龄蛹期。
[0054] (4)毛角锤角细蜂培养与收集；
[0055] 步骤(4)具体包括：
[0056] 将步骤(3)中被寄生的果蝇蛹置于步骤(1)A中的智能培养箱内，待寄生蜂在寄主蛹内发育至第15天时，寄生蜂开始陆续羽化；将羽化的的寄生蜂收集在步骤(1)B的食物培养管内，并贮存在步骤(1)E中的恒温恒湿箱中。
[0057] (5)留种；
[0058] 步骤(5)具体包括：
[0059] 取步骤(4)中的毛角锤角细蜂约100头按照步骤(1)E的条件保存蜂种，用于下次育种时的毛角锤角细蜂接种。
[0060] 技术效果综述：
[0061] 与使用黑腹果蝇蝇蛹繁殖的毛角锤角细蜂相比，采用本发明的技术方案获得的毛角锤角细蜂对黑腹果蝇蝇蛹的寄生率、出蜂率以及产雌率分别为100％(N＝10)、96.50％(N＝10)和84.97％(N＝10)，以黑腹果蝇蝇蛹繁殖的毛角锤角细蜂对黑腹果蝇蝇蛹的寄生率、出蜂率以及产雌率分别为99.50％(N＝10)、85.93％(N＝10)和59.65％(N＝10)。两者在寄生率上无显著性差异，但在出蜂率(P<0.05)和产雌率(P<0.05)上，本发明获得的毛角锤角细蜂具有显著优势。
[0062] 本发明获得的毛角锤角细蜂个体更大，无论雌雄，其触角长(雄：P<0.01；雌：P<0.01)、体长(雄：P<0.01；雌：P<0.01)、翅长(雄：P<0.01；雌：P<0.01)均显著大于发育自黑腹果蝇蝇蛹的毛锤角细蜂个体。
[0063] 本发明获得的毛角锤角细蜂生殖能力更强：单头雌蜂的最大怀卵量为133.5±8.0个(N＝20)，在仅交配一次的情况下令其单头寄生，其产卵期为23.3±3.1天(N＝20)，平均寿命为26.2±3.3天(N＝20)；以黑腹果蝇蝇蛹繁殖的毛角锤角细蜂最大怀卵量为105.0±9.1个(N＝20)，产卵期为10.3±0.5天(N＝20)，平均寿命为12.2±0.8天(N＝20)。由此可得，本发明获得的毛角锤角细蜂寿命显著延长(P<0.01)，产卵期也显著延长(P<0.01)。本发明获得的毛角锤角细蜂的单头雌蜂在仅交配一次之后，可产后代总数为198.0±18.5个(N＝20)，其中雌蜂为74.0±3.3个(N＝20)；以黑腹果蝇蝇蛹繁殖的毛角锤角细蜂的单头雌蜂在相同情况下可产后代总数为119.0±18.7个(N＝20)，其中雌蜂为30.0±7.8个(N＝20)。
由此可得，本发明获得的毛角锤角细蜂雌蜂储精能力更强，后代个体数(P<0.05)与雌蜂(P<
0.05)所占数均显著较多。
[0064] 本发明获得的毛角锤角细蜂在抗逆能力方面也具有显著优势：在4℃低温与37℃高温下可分别存活至少25天(N＝100)和16天(N＝100)，在饥饿的情况下，最多可存活约15天(N＝100)；而以黑腹果蝇蝇蛹繁殖的毛角锤角细蜂在4℃低温与37℃高温下可分别存活至少15天(N＝100)和8天(N＝100)，在饥饿的情况下，最多可存活约7天(N＝100)。由此可得，本发明获得的毛角锤角细蜂在低温(P<0.05)、高温(P<0.05)以及饥饿(P<0.05)等逆境下的存活率均显著高于以黑腹果蝇蝇蛹繁殖的毛角锤角细蜂。
[0065] 发育自黑腹果蝇蝇蛹的毛角锤角细蜂在25℃，RH为50％的实验室条件下，若无寄生行为，仅能存活40天左右，而由本发明获得的毛角锤角细蜂在相同条件下，其羽化后第40天的寄生率、出蜂率以及产雌率仍可高达97.78±3.14％(N＝90)、96.50±2.91％(N＝90)和72.85±4.58％(N＝90)。
[0066] 综上所述，本发明繁殖的毛角锤角细蜂对黑腹果蝇有更强的防治效果。
[0067] 最后，需要注意的是，以上列举的仅是阐明本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多
变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
