一种吸附无细胞百白破-脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合
疫苗及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 百日咳、白喉、破伤
风、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌(Hib)感染都是严重危害人类健康、特别是婴幼儿生命健康的传染病，接种疫苗是
预防这些传染病最经济有效的措施。
[0003] 自1997年起，加拿大及欧洲一些国家已开始使用百日咳-白喉-破伤风-脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌(DTaP-IPV/Hib)联合疫苗，目前已有二十多个国家将其列为计划免疫。DTaP-IPV/Hib联合疫苗可以同时预防包括百日咳、白喉、破伤风、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌感染在内的五大严重威胁婴幼儿传染及感染性
疾病，极大的简化了免疫程序。
[0004] 目前，国内批准上市的DTaP-IPV/Hib联合疫苗仅有SanofiPasteur(SP)公司生产的Pentaxim TM，在该联合疫苗中，IPV疫苗选用的毒株为Salk株，但Salk株属于强野毒株，毒性较强，因此，世界卫生组织(WHO)鼓励更多厂家使用Sabin株生产脊髓灰质炎灭活疫苗(sIPV)。迄今为止，全球已上市的DTaP-IPV/Hib联合疫苗中，IPV选用的毒株大多为Salk株。因此，开发安全性和
稳定性更高的DTaP-IPV/Hib联合疫苗具有重要意义。
发明内容
[0005] 为了解决
现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种吸附无细胞百白破-脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合疫苗及其制备方法。
[0006] 本发明采用脊髓灰质炎(IPV)病毒的弱毒株Sabin毒株制备无细胞百白破、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌的联合疫苗，与目前广泛使用的强毒株Salk毒株相比，弱毒株Sabin毒株的安全性更高。
[0007] 本发明提供一种吸附无细胞百白破-脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合疫苗，所述联合疫苗包括无细胞百日咳
抗原、白喉抗原、破伤风抗原、灭活的脊髓灰质炎病毒和b型流感嗜血杆菌抗原；所述脊髓灰质炎病毒为Sabin毒株。
[0008] Sabin毒株分为不同的病毒亚型，本发明所述的脊髓灰质炎病毒可以包括Sabin毒株的任何亚型。
[0009] 优选地，本发明中，所述脊髓灰质炎病毒包括Sabin毒株的I型、II型和III型。
[0010] 尽管Sabin毒株具有安全性高的优势，但是作为弱毒株，Sabin毒株的免疫原性远不如目前现有技术中广泛使用的强毒株Salk毒株。为提高Sabin毒株的免疫原性，同时尽量避免其与联合疫苗中的其它抗原的干扰作用，本发明中，每0.5mL的所述联合疫苗包括如下组分：
[0011] I型Sabin株脊髓灰质炎病毒7.5-15DU；
[0012] II型Sabin株脊髓灰质炎病毒22.5-45DU；
[0013] III型Sabin株脊髓灰质炎病毒22.5-45DU；
[0014] 优选地，所述I型Sabin株脊髓灰质炎病毒和II型Sabin株脊髓灰质炎病毒的抗原比例为1：2～1：3。
[0015] 本发明中，所述无细胞百日咳抗原包括百日咳毒素PT、百日咳丝状血凝素FHA和百日咳杆菌粘附素PRN中的一种或多种。
[0017] 所述破伤风抗原包括破伤风类毒素TT。
[0018] 所述b型流感嗜血杆菌抗原包括b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖。
[0019] 优选地，本发明中，所述无细胞百日咳抗原为百日咳毒素PT、百日咳丝状血凝素FHA和百日咳杆菌粘附素PRN；
[0020] 所述白喉抗原为白喉类毒素DT。
[0021] 所述破伤风抗原为破伤风类毒素TT。
[0022] 具体地，本发明所述的联合疫苗包括百日咳毒素PT、百日咳丝状血凝素FHA和百日咳杆菌粘附素PRN、白喉类毒素DT、破伤风类毒素TT、b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖以及灭活的脊髓灰质炎病毒Sabin毒株的I型、II型和III型病毒。
[0023] 为更好地促进联合疫苗中抗原的吸附性和免疫原性的发挥，本发明中，所述联合疫苗还包括佐剂，所述佐剂包括氢
氧化
铝。
[0024] 优选地，所述联合疫苗的制备过程中，各种抗原组分采用氢氧化铝分别吸附后再混合；
[0025] 所述联合疫苗中，氢氧化铝的含量为1.0-2.0mg/mL联合疫苗。
[0026] 进一步地，
发明人还发现，通过添加
磷酸盐缓冲液可以进一步提高联合疫苗的稳定性，但过多的磷酸盐会造成抗原蛋白吸附率的降低，本发明中，所述联合疫苗还包括磷酸盐缓冲液。优选地，所述联合疫苗中，磷酸盐缓冲液的含量为2-6mmol/mL联合疫苗。
[0027] 本发明中，所述磷酸盐缓冲液可以为本领域常用的磷酸盐缓冲液，包括但不限于磷酸二氢
钾、磷酸二氢钠、
磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等磷酸盐组成的磷酸盐缓冲液。
[0028] 作为本发明的一种优选实施方式，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠。
[0029] 更进一步地，发明人发现，添加现有技术中常用于细胞培养的M199培养液对于联合疫苗中的病毒稳定性，尤其是IPV Sabin病毒株的抗原稳定性具有显著的提升作用，因此，本发明中，所述联合疫苗还包括M199培养基。
[0030] 优选地，所述联合疫苗中含有5％～20％的M199培养基浓缩液；所述M199培养基浓缩液为10×M199培养基。
[0031] 为尽量减少各抗原组分之间的干扰作用，提高疫苗的免疫效
力和稳定性，作为本发明的优选实施方式，每0.5mL的所述联合疫苗包括如下组分：
[0032]
[0033] 为使得联合疫苗更好地适用于中国人，本发明中，所述b型流感嗜血杆菌优选为MH200201菌株(冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗的初步研究，国际生物制品学杂志，2014年6月，第37卷第3期)。
[0034] 另一方面，本发明还提供所述联合疫苗的制备方法，具体包括如下步骤：
[0035] (1)分别制备I型、II型、III型Sabin株脊髓灰质炎病毒的灭活病毒液、无细胞百日咳原液、白喉原液、破伤风原液、b型流感嗜血杆菌原液；
[0036] (2)利用氢氧化铝佐剂分别对I型、II型、III型Sabin株脊髓灰质炎病毒的灭活病毒液、无细胞百日咳原液、白喉原液、破伤风原液单独进行吸附；
[0037] (3)将得到的氢氧化铝佐剂吸附液混合；
[0038] (4)在步骤(3)得到的
混合液中加入M199培养基充分混匀后，加入磷酸盐缓冲液，调节pH至6.0-7.0。
[0039] 优选地，上述步骤(1)中的b型流感嗜血杆菌原液无需氢氧化铝佐剂吸附，也无需加入M199培养基、磷酸盐缓冲液，即可独立
包装，与DTaP-IPV组成DTaP-IPV/Hib五联疫苗。
[0040] 根据需要，本发明提供的联合疫苗可以通过加入本领域允许的辅料，制备为注射剂、冻干剂等本领域常用的剂型。
[0041] 本发明的有益效果在于：本发明采用脊髓灰质炎病毒(IPV)的弱毒株Sabin毒株制备无细胞百白破-灭活脊髓灰质炎(IPV)-b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTaP-IPV/Hib)，与现有技术中使用的IPV强毒株Salk株相比，本发明提供的联合疫苗的生物安全性高、疫苗不良反应小，且生产成本低，对于脊髓灰质炎的预防具有重要的意义。此外，本发明采用的b型流感嗜血杆菌抗原来源于分离自中国人的MH200201毒株，因此，本发明提供的联合疫苗对于中国人能够产生更好的免疫保护。
[0042] 针对本发明提供的具有特定的抗原组合的联合疫苗，本发明通过优化联合疫苗中各抗原的组成和含量，减少了抗原之间的相互干扰，促进了各抗原免疫原性的充分发挥，通过筛选和优化合适的联合疫苗佐剂和疫苗稳定剂，显著同时提高了疫苗对于五种病原的免疫效力，同时有效提高了疫苗产品的稳定性。
附图说明
[0043] 图1为本发明
实施例3中添加不同浓度的磷酸盐缓冲液对DTaP-IPV/Hib联合疫苗pH稳定性的影响，其中，磷酸盐缓冲液的添加量分别为2mmol、4mmol、6mmol、8mmol、10mmol。
[0044] 图2为本发明实施例4中添加不同浓度的10×M199培养基对于IPV I型D抗原
热稳定性的影响。
[0045] 图3为本发明实施例4中添加不同浓度的10×M199培养基对于IPV II型D抗原热稳定性的影响。
[0046] 图4为本发明实施例4中添加不同浓度的10×M199培养基对于IPV III型D抗原热稳定性的影响。
具体实施方式
[0047] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种
修改和替换。
[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] 以下实施例中如无特殊说明，联合疫苗的制备方法如下：
[0051] (1)根据中华人民共和国药典2010版的要求，分别制备无细胞百日咳抗原(PT、FHA、PRN)、破伤风类毒素(TT)和白喉类毒素(DT)，I、II、III型Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活液以及b型流感嗜血杆菌抗原，其中制备百日咳抗原采用百日咳杆菌；制备破伤风毒素采用破伤风梭菌；制备白喉抗原采用白喉杆菌；制备I、II、III型Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活液分别采用脊髓灰质炎病毒Sabin毒株的I型、II型和III型毒株(CN201110123949.7)；制备b型流感嗜血杆菌抗原采用b型流感嗜血杆菌MH200201菌株(冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗的初步研究，国际生物制品学杂志，2014年6月，第37卷第3期)；
[0052] (2)将步骤(1)制备得到的I型、II型、III型Sabin株脊髓灰质炎病毒的灭活病毒液、百日咳毒素PT、百日咳丝状血凝素FHA、百日咳杆菌粘附素PRN、白喉类毒素DT、破伤风类毒素TT分别单独与适量的氢氧化铝佐剂进行吸附；吸附完成后将得到的抗原吸附液混合均匀，加入10×M199培养基进行混合搅拌，加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行混合搅拌，调节pH为6.5。
[0053] (3)b型流感嗜血杆菌荚膜多糖原液不经上述步骤(2)的处理，单独包装。
[0054] 实施例1不同Sabin毒株抗原含量的联合疫苗的IPV中和
抗体水平分析[0055] 为分析不同Sabin毒株抗原含量对联合疫苗的IPV免疫效果的影响，制备含有不同浓度I、II、III型D抗原的三种DTaP-IPV/Hib联合疫苗供试品(供试品1、2、3)，三种联合疫苗供试品的抗原含量如表1所示，以市售IPV疫苗为对照品。三种供试品和对照品分别免疫wistar大鼠，每组10只，每只注射0.5mL，免疫后21天
采血分离血清，用细胞法检测大鼠体内脊髓灰质炎中和抗体效价，计算ED50值。
[0056] 表1三种联合疫苗供试品的抗原含量
[0057]
[0058] I型、II型和III型脊髓灰质炎中和抗体效价的检测结果如表2、表3和表4所示，结果表明，采用三种DTaP-IPV/Hib联合疫苗供试品免疫的大鼠体内的I型、II型和III型脊髓灰质炎中和抗体的ED50值均不低于对照品，因此，三种DTaP-IPV/Hib联合疫苗供试品的脊髓灰质炎中和抗体效价的检测结果均符合
质量标准，其中，供试品1和供试品2的抗体效价高于供试品3。
[0059] 表2大鼠IPV I型中和抗体检测
[0060]
[0061] 表3大鼠IPV II型中和抗体检测
[0062]
[0063] 表4大鼠IPV III型中和抗体检测
[0064]
[0065] 实施例2含有不同浓度氢氧化铝的DTaP-IPV/Hib联合疫苗的保护效力分析[0066] 在实施例1的供试品1的
基础上，针对DTaP-IPV/Hib联合疫苗的佐剂进行优化，分别制备含有不同浓度氢氧化铝佐剂的DTaP-IPV/Hib联合疫苗，其中每0.5mL制剂中的氢氧化铝含量分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL和2.5mg/mL，分别进行百日咳、白喉、破伤风的效价、Hib的抗体阳转率以及IPV的体内免疫效力实验，分析联合疫苗的免疫效果。按照《中国药典》2015版第三部中百白破及Hib效价检测方法进行白喉、破伤风、百日咳和Hib效力实验。IPV采用原倍、1/3倍、1/9倍、1/27倍4个稀释度分别免疫wistar大鼠，每组10只，每只注射0.5mL，免疫后21天采血分离血清，用细胞法检测中和抗体效价，计算ED50值。白喉的抗体效价结果见表5、破伤风效价结果见表6、百日咳效价结果见表7、IPV中和抗体结果见表8、Hib抗体检测结果见表9。结果表明，当DTaP-IPV/Hib联合疫苗中的氢氧化铝含量为0.5mg/mL时，白喉免疫的抗体效价、IPV免疫的抗体效价均不符合质量标准，当氢氧化铝含量为1.0～2.0mg/mL时，各种抗原的免疫效价均符合质量标准，而当氢氧化铝含量继续提高时，疫苗的免疫效价有降低的趋势。
[0067] 表5 DTaP-IPV/Hib联合疫苗的白喉免疫效价
[0068]
[0069] 表6 DTaP-IPV/Hib联合疫苗的破伤风免疫效价
[0070]
[0071] 表7 DTaP-IPV/Hib联合疫苗的百日咳免疫效价
[0072]
[0073] 表8 DTaP-IPV/Hib联合疫苗的IPV免疫效力
[0074]
[0075] 表9 DTaP-IPV/Hib联合疫苗的Hib免疫效力
[0076]
[0077]
[0078] 实施例3磷酸盐缓冲液对DTaP-IPV/Hib联合疫苗的抗原蛋白吸附率及pH稳定性的影响
[0079] 在实施例1的供试品1含有1.5mg/mL氢氧化铝佐剂的DTaP-IPV/Hib联合疫苗的基础上，分别考察每毫升DTaP-IPV/Hib联合疫苗中添加2mmol、4mmol、6mmol、8mmol、10mmol磷酸二氢钠-磷酸氢二钠磷酸盐缓冲液(pH为6.0-7.0)时，对于氢氧化铝佐剂对抗原蛋白吸附率和pH稳定性的影响。蛋白吸附率分析如表10所示。在添加磷酸盐缓冲液后，蛋白吸附率随着磷酸盐缓冲液的浓度的增加逐渐降低，当磷酸盐缓冲液添加浓度为8mmol/mL时，蛋白吸附率降至90％以下，磷酸盐缓冲液的浓度在2-6mmol/mL时，吸附率均在90％以上，因此联合疫苗中的磷酸盐缓冲液的添加的浓度不应高于6mmolmL。将添加不同浓度的磷酸盐的DTaP-IPV/Hib联合疫苗放置于37℃条件下并进行pH监测，监测时间点为0天、7天、14天、21天。结果如图1所示，随着放置时间的延长，DTaP-IPV联合疫苗的pH不断升高，当磷酸根浓度为2-6mmol/mL时，样品pH在0-7天上升较快，平均上升0.2左右，7-14天上升幅度较小，pH趋于稳定；而当磷酸根含量为8mmol/mL和10mmol/mL时，样品pH在放置的0-14天都在不断上升，对疫苗稳定性造成不利的影响。
[0080] 表10磷酸盐缓冲液的添加量对于抗原蛋白吸附率的影响
[0081]
[0082]
[0083] 实施例4 M199培养基对联合疫苗稳定性的影响
[0084] 在制备得到的I型、II型和III型Sabin毒株的混合IPV吸附液中添加不同浓度的M199培养基，考察其对病毒抗原稳定性的影响。加入不同体积的M199培养基浓缩液(10×M199培养基，即所有组分终浓度为常规M199培养基的10倍的浓缩M199培养基)，分别设置不添加M199的对照组以及每0.5ml的IPV吸附液分别添加5％和10％(体积百分含量)的M199浓缩液的试验组，将含有不同浓度M199的IPV吸附液放置于37℃条件下，考察时间点为0天、7天、14天，分别测定IPV吸附液中D抗原含量。IPV的I型、II型、III型D抗原含量的检测结果分别如图2、图3和图4所示，在不添加M199时，D抗原含量随着放置时间的延长而不断下降，当IPV吸附液在37℃条件下放置14天后，脊髓灰质炎病毒I型、II型、III型的原液中D抗原下降幅度在20％-30％之间。当IPV吸附液中浓缩M199添加量为5％和10％时，I型、II型、III型的IPV D抗原含量在0-1天基本稳定，IPV吸附液在37℃条件下放置14天后，I型、II型、III型的D抗原含量都没有明显下降，结果表明，M199培养基的添加对于脊髓灰质炎病毒抗原的稳定性具有重要作用。
[0085] 实施例5 DTaP-IPV/Hib联合疫苗的体内免疫效力检测
[0086] 经实施例1～4的优化，得到采用Sabin弱毒株制备DTaP-IPV/Hib联合疫苗时，能够使得各种抗原组分充分、稳定发挥免疫活性的优选组分配方。本实施例以上述筛选得到的如下最佳配方的DTaP-IPV/Hib联合疫苗为例(试验组)，分析DTaP-IPV/Hib联合疫苗的免疫效力及其与目前市售的采用强度株Salk毒株制备的DTaP-IPV/Hib联合疫苗的效力比较，试验组中本发明的DTaP-IPV/Hib联合疫苗(0.5mL)的配方如下：
[0087]
[0088] 目前国内市场尚没有中国自行研制的DTaP-IPV/Hib五联疫苗，因此选用目前市售的进口DTaP-IPV/Hib五联疫苗作为对照与本发明的联合疫苗的IPV中和抗体进行比较，进口五联疫苗中的IPV为采用Salk强毒株制备。IPV中和抗体检测方法采用原倍、1/3倍、1/9倍、1/27倍4个稀释度分别免疫wistar大鼠，每组10只，每只注射0.5mL，免疫后21天采血分离血清，用细胞法检测中和抗体效价，计算ED50值。实验结果如表11所示，结果表明，本发明的五联疫苗(试验组)中的IPV效价和对照组联合疫苗相比，Ⅰ型体内效力结果明显高于对照组，Ⅱ型和Ⅲ型两者相比无明显差异，本发明制备的五联疫苗，虽然采用Sabin弱毒株，但是IPV免疫效果更好，具有良好的免疫原性。
[0089] 表11 DTaP-IPV/Hib五联疫苗的免疫效价与Salk强毒株五联疫苗的比较[0090]
[0091] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
