抗CCR2抗体
阅读：982发布：2023-03-08
专利汇可以提供抗CCR2抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了特异性结合CCR2特别是人CCR2和可用于抑制CCR2的 抗体 (包括人抗体)和其 抗原 结合部分。抗CCR2抗体包括结合CCR2的第1和/或第2细胞外环的抗体。还提供了人抗CCR2抗体和其抗原结合部分。提供了分离的来源于人抗CCR2抗体的重链和轻链免疫球蛋白和编码此类免疫球蛋白的核酸分子。提供了制备人抗CCR2抗体或抗原结合部分的方法、包含此类抗体或抗原结合部分的组合物、使用抗体和抗原结合部分的方法和用于诊断和 治疗 的组合物。还提供了使用编码重链和/或轻链免疫球蛋白分子的核酸分子的 基因治疗 方法，所述免疫球蛋白分子包含人抗CCR2抗体或其抗原结合部分。，下面是抗CCR2抗体专利的具体信息内容。
1.特异性结合人CCR2的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：SEQ ID NO:84中所示的VH CDR1，SEQ ID NO:85中所示的VH CDR2，SEQ ID NO:86中所示的VH CDR3，SEQ ID NO:102中所示的VL CDR1，SEQ ID NO:103中所示的VL CDR2和SEQ ID NO:104中所示的VL CDR3，其中所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、单链Fv、嵌合抗体和双抗体。
2.权利要求1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO:83的重链可变(VH)结构域氨基酸序列。
3.权利要求1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含轻链可变(VL)结构域氨基酸序列，所述轻链可变结构域氨基酸序列选自SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:113。
4.权利要求1的分离的人单克隆抗体或抗原结合部分，其进一步包含：来自由ATCC登录号为PTA-6980的杂交瘤产生的单克隆抗体的重链的重链CDR1、CDR2和CDR3；和来自由ATCC登录号为PTA-6980的杂交瘤产生的单克隆抗体的轻链的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
5.权利要求1的分离的人单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:82，轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:100。
6.权利要求1的分离的人单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述重链氨基酸序列是SEQ ID NO:116并且所述轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:112。
7.权利要求1的分离的人单克隆抗体或抗原结合部分，其还包含重链恒定结构域。
8.权利要求7的分离的人单克隆抗体或抗原结合部分，其还包含轻链恒定结构域。
9.包含权利要求1的抗体或抗原结合部分及药学可接受的载体的药物组合物。
10.产生权利要求1的抗体或抗原结合部分的分离的细胞系。
11.包含编码权利要求1的抗体或抗原结合部分的核苷酸序列的分离的核酸分子。
12.包含权利要求11的核酸分子的载体，其中所述载体任选地包含可操作地连接至所述核酸分子的表达控制序列。
13.权利要求1的抗体或抗原结合部分用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防或减轻有此需要的受试者的CCR2介导的病症的症状。
14.权利要求13的用途，其中所述受试者患有选自炎性病症、变应性病症、自身免疫病症、移植排斥病症、动脉粥样硬化、肥胖症、HIV感染、神经性疼痛、血管狭窄、血管再狭窄、多发性硬化、纤维化病况、年龄相关性黄斑变性和癌症的一种或多种病症或病况。
15.权利要求14的用途，其中所述纤维化病况是肝纤维化。
16.权利要求15的用途，其中所述肝纤维化是丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎的结果。
17.权利要求14的用途，其中所述炎性病症是葡萄膜炎或角膜感染。
抗CCR2抗体
[0002] 本申请要求2008年8月18日提交的美国临时专利申请案61/189,357(其以其全文通过引用合并入本文)的权益。
[0003] 联合研究协议
[0005] 背景
[0006] 白细胞浸润入炎性部位据信受称为趋化因子的8-10kD蛋白调控。此类趋化因子根据其N末端半胱氨酸残基的间隔分成4类，命名为CC、CXC、XC和CX3C。趋化因子可介导一系列对白细胞的促炎效应，例如触发趋化作用、脱粒、脂质介体(mediator)的合成以及整联蛋白激活(Oppenheim，J.J.等人，Annu.Rev.Immunol.，9：617-648(1991)；Baggiolini，M.，等 人，Adv.Imunol.，55：97-179(1994)；Miller，M.D. 和 Krangel，M.S.，Crit.Rev.Immunol.，12：17-46(1992))。
[0007] 一种趋化因子，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(也称为CCL2)作用于单核细胞、淋巴细胞和树突细胞，以诱导趋化作用、颗粒释放、呼吸爆发和细胞因子释放。研究已表明，MCP-1牵涉疾病例如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肉芽肿病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肥胖症/糖尿病、神经性疼痛、癌症和多发性硬化的病理(Koch，J.Clin.Invest.90：772-79(1992)；Hosaka 等 人，Clin.Exp.Immunol.97：451-457(1994)；Schwartz 等 人，Am.J.Cardiol.71(6)：9B-14B(1993)；Schimmer等 人，J.Immunol.160：
1466-1471(1998)；Flory 等 人，Lab.Invest.69： 396-404(1993)；Gong 等 人，J.Exp.Med.186：131-137(1997)；Salcedo 等 人 Blood 96(1)34-40(2000)；Bracke 等 人，Inflammation & Allergy-Drug Targets 6：75-79(2007)；Chung Current Drug
Targets-Inflammation & Allergy 4：619-625(2005)。
1466-1471(1998)；Flory 等 人，Lab.Invest.69： 396-404(1993)；Gong 等 人，J.Exp.Med.186：131-137(1997)；Salcedo 等 人 Blood 96(1)34-40(2000)；Bracke 等 人，Inflammation & Allergy-Drug Targets 6：75-79(2007)；Chung Current Drug
Targets-Inflammation & Allergy 4：619-625(2005)。
[0008] CCR2是七跨膜域(seven-transmembrane domain)G蛋白偶联趋化受体，其结合MCP-1以及其他趋化因子包括CCL8(MCP-2)、CCL7(MCP-3)和CCL13(MCP-4)(Charo，I.F.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2752-2756(1994)；Myers，S.J.，等人，J.Biol.Chem.270：5786-5792(1995)；Gong等人，J.Biol Chem 272：11682-11685(1997)；Garcia-Zepeda等人，J.Immunol.157：5613-5626(1996))。CCR2也称为CMKBR2和CKR2。已克隆了相异在于其C末端的CCR2的两个可选择的剪接形式CCR2A和CCR2B(Wong等人(1997)J.Biol.
Chem.272：1038-1045)。在信号转导研究中，CCR2A和CCR2B都介导激动剂依赖性钙动员和腺苷酸环化酶抑制。CCR2在单核细胞、T细胞和树突细胞上表达，并且与由内皮细胞、单核细胞和滑膜成纤维细胞分泌的趋化因子相互作用。
Chem.272：1038-1045)。在信号转导研究中，CCR2A和CCR2B都介导激动剂依赖性钙动员和腺苷酸环化酶抑制。CCR2在单核细胞、T细胞和树突细胞上表达，并且与由内皮细胞、单核细胞和滑膜成纤维细胞分泌的趋化因子相互作用。
[0009] 已使用CCR2敲除小鼠探测了CCR2的生物学作用(Boring等人，J ClinInvest.100(10)：2552-61(1997)；Boring 等 人，Nature394(6696)：894-7(1998)；De Paolo 等 人，J Immunol.171(7)：3560-7(2003)；Gaupp 等 人，Am J Pathol.162(1)：
139-50(2003))。CCR2-/-小鼠在迟发型超敏反应和Th1型细胞因子的产生中具有显著缺陷，并且通常较不易于发生实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。除了调节免疫应答外，CCR2还是HIV的共受体(Connor等人，J.Exp.Med.185：621-628(1997)；Frade等人，J Clin Invest.100(3)：497-502(1997))。
139-50(2003))。CCR2-/-小鼠在迟发型超敏反应和Th1型细胞因子的产生中具有显著缺陷，并且通常较不易于发生实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。除了调节免疫应答外，CCR2还是HIV的共受体(Connor等人，J.Exp.Med.185：621-628(1997)；Frade等人，J Clin Invest.100(3)：497-502(1997))。
[0010] 由于MCP-1和其受体CCR2参与不期望的免疫应答，因此CCR2拮抗剂可以是很有前景的治疗剂。然而，已描述的CCR2拮抗剂很少(参见Ogilvie等人，Blood 97(7)：1920-4(2001))。因此，存在对新型和改进的组合物的需要，所述组合物可结合CCR2并且阻断其配体介导的CCR2信号转导。
[0011] 概述
[0012] 提供了特异性结合CCR2特别是人CCR2并且可用作CCR2拮抗剂的分离的抗体或其抗原结合部分，以及包含所述抗体或部分的组合物。包括了在除了CCR2的N末端部分或第3环外的表位上结合CCR2的抗体或抗原结合部分。此类抗体可结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。
[0013] 提供了组合物，所述组合物包含(i)所述抗CCR2抗体的重链和/或轻链、其可变结构域或其抗原结合部分，或编码它们的核酸分子；和(ii)药学可接受的载体。组合物还可包含另一种成分例如治疗剂或诊断剂。
[0014] 还提供了诊断和治疗方法。类似地，提供了用于制备治疗炎性和非炎性病症的药剂的抗CCR2抗体和其部分。
[0015] 提供了包含所述核酸分子的载体和宿主细胞以及重组产生由所述核酸分子编码的多肽的方法。还提供了产生抗CCR2抗体或其抗原结合部分的分离的细胞系。
[0017] 图1A、1B和1C是显示CCR2抗体与细胞的结合(如通过FACS分析测定的)的图。图1A是举例说明与KLH对照抗体相比较AF-488(ALEXA 488，Invitrogen)缀合
的CCR2抗体4.40A68G S230P与人全血单核细胞的结合(如通过FACS分析测定的)的图。
图1B是举例说明AF-488缀合的CCR2抗体4.40A68G S230P与表达人CCR2的300-19细胞
的结合(如通过FACS分析测定的)的图。图1C是举例说明不同浓度的4.40A68GS230P抗体与CCR2转染的300-19细胞的结合(如使用抗人PE检测的)的图。
的CCR2抗体4.40A68G S230P与人全血单核细胞的结合(如通过FACS分析测定的)的图。
图1B是举例说明AF-488缀合的CCR2抗体4.40A68G S230P与表达人CCR2的300-19细胞
的结合(如通过FACS分析测定的)的图。图1C是举例说明不同浓度的4.40A68GS230P抗体与CCR2转染的300-19细胞的结合(如使用抗人PE检测的)的图。
[0018] 图2举例说明在饱和结合测定中4.40A68G S230P抗体与CCR2转染的300-19细胞的剂量相关结合。
[0019] 图3举例说明4.40A68G S230P抗体抑制THP-1细胞响应CCR2配体MCP-1(而非响应CCR1/CCR5配体MIP-1a)的趋化作用的能力。
[0020] 图4举例说明4.40A68G S230P抗体抑制原代人单核细胞响应MCP-1的趋化作用的能力。
[0021] 图5显示用于表达CCR1/CCR2嵌合体的逆转录病毒载体的质粒图谱。
[0022] 图6A和6B举例说明4.40A68G S230P抗体与表达嵌合受体的300-19细胞的结合，所述嵌合受体只由CCR2的细胞外第1和第2环以及CCR1的N末端和第3环组成。图6C描述了4.40A68G S230P与嵌合受体转染的300-19细胞的饱和结合测定，如通过FACS分析测定的。
[0023] 图7显示4.40A68G S230P抗体与如下细胞的饱和结合分析(3小时饱和曲线)：(A)300-19对照细胞；(B)表达全长CCR2的转染的300-19细胞；(C)表达flag-标记的(M1)MRRR嵌合体[经flag标记以确保受体表达的CCR2(M)的N末端和CCR1(R)的环区域]的
转染的300-19细胞；(D)表达flag-标记的(M1)RRRM嵌合体[经flag标记以确保受体表达的CCR1(R)的N末端和第1及第2环以及CCR2(M)的第3环]的转染的300-19细胞；和
(E)表达flag-标记的(M1)RMMR嵌合体[经flag标记以确保受体表达的CCR1(R)的N末
端和第3环以及CCR2(M)的第1和第2环]的转染的300-19细胞。
转染的300-19细胞；(D)表达flag-标记的(M1)RRRM嵌合体[经flag标记以确保受体表达的CCR1(R)的N末端和第1及第2环以及CCR2(M)的第3环]的转染的300-19细胞；和
(E)表达flag-标记的(M1)RMMR嵌合体[经flag标记以确保受体表达的CCR1(R)的N末
端和第3环以及CCR2(M)的第1和第2环]的转染的300-19细胞。
[0024] 图8显示如捕获ELISA中评估的4.40A68G S230P抗体与CCR2的第2环或第3环肽区域的结合。
[0025] 图9显示两个图，其举例说明用AF-488缀合的4.40.3A68G S230P抗体(图框A)或用抗CCR5抗体(图框B)对表达重组CCR5的300-19细胞的FACS免疫染色。
[0026] 图10举例说明了4.40A68G S230P抗体对MCP-1诱导的活性的抑制，如通过对CCR2转染的300-19细胞的钙动员评估的。
[0027] 图11显示了4.40A68G S230P抗体对MCP-3诱导的CCR2转染的300-19细胞的趋化作用的抑制。
[0028] 图12举例说明了4.40A68G S230P抗体对全血中响应MCP-1的人单核细胞肌动蛋白多聚化的抑制。
[0029] 图13举例说明4.40A68G S230P抗体在雌食蟹猴中对全血中响应MCP-1的单核细胞肌动蛋白多聚化的抑制。
[0030] 图14显示4.40A68G S230P抗体对hHSC细胞系LI90中胶原1mRNA合成的剂量依赖性抑制。
[0032] 图16显示在单次ConA注射后24小时，4.40A68G S230P抗体降低人CCR2敲入(knock-in)小鼠中血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性。
[0033] 图17A-17D显示重链和轻链可变区的种系氨基酸序列与分别地4.22.3、4.40.2、4.39.3和4.9.2抗体重链和轻链可变区(对于4.22.3、4.40.2、4.39.3和4.9.2抗体只显示错配)相比较的比对。CDR以下划线标示并且用井号(#)标示错配缺口。
[0034] 详述
[0035] 定义和一般技术
[0036] 除非在本文中另外定义，否则本文中使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的意义。此外，除非上下文要求，否则单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。通常，本文中描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交相关的术语和技术是本领域内熟知的和常用的术语和技术。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
[0037] 除非另外指出，否则通常按照本领域内熟知的以及各种一般和更具体的参考文献(其在整个本说明书中引用和论述)中描述的常规方法进行方法和技术。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)；和 Harlow 和 Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，其全部通过引 用合并入本文。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如在本领域内通常使用的或如本文描述的。本文中描述的与分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关的术语以及实验室方法和技术是本领域内熟知和常用的术语以及实验室方法和技术。将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
[0038] 除非另外指出，否则下列术语将理解为具有下列意义：
[0040] 术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”是指根据其来源或衍生的来源，(1)不与在天然状态下与其相伴的天然结合的组分结合；(2)不含来自相同物种的其他蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；或(4)非天然发生的蛋白质、多肽或抗体。因此，例如通过化学方法合成或在与其所天然源自的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分相“分离的”。还可使用本领域内熟知的蛋白质纯化技术通过分离使得蛋白质大体上不含天然结合的组分。
[0041] 分离的抗体的实例包括已使用CCR2或其部分亲和纯化的抗CCR2抗体、通过杂交瘤或其他细胞系体外合成的抗CCR2抗体以及从转基因小鼠产生的人抗CCR2抗体。
[0042] 当至少约60至75％的样品展示单一类别的多肽时，蛋白质或多肽是“大体上纯的”、“大体上均一的”或“大体上纯化的”。多肽或蛋白质可以是单体或多聚体。大体上纯的多肽或蛋白质通常可占蛋白质样品的约50％、60％、70％、80％或90％W/W，更通常地约95％，和纯度可以高于99％。蛋白质的纯度或均一性可通过本领域内熟知的许多方法来显示，例如进行蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在用本领域内熟知的染料对凝胶染色后显现单个多肽条带。为了某些目的，可通过使用HPLC或本领域内熟知的用于纯化的其他方法提供更高的分辨率。
[0043] 本文中使用的术语“抗体类似物”是指包含与氨基酸序列的部分 具有大体上的同一性的区段并且具有至少一个下列性质的抗体：(1)在适当的结合条件下特异性结合CCR2，(2)抑制CCR2的至少一个生物活性的能力。通常，抗体类似物包含相对于天然序列的保守氨基酸置换(或插入或缺失)。类似物通常为至少20或25个氨基酸长，至少50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸长或更长，并且通常可与抗体的全长重链或轻链一样长。一些例子包括与种系氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16或17个置换的抗体类似物。
16或17个置换的抗体类似物。
[0044] 在某些情况下，对抗CCR2抗体或其抗原结合部分的氨基酸置换是这样的氨基酸置换，其：(1)减少对蛋白水解的易感性，(2)减少对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)添加或除去糖基化位点和(5)提供或改进此类类似物的其他物理化学或功能性质但仍然保持对CCR2的特异性结合。类似物可包括除了正常发生的肽序列外的序列的各种突变蛋白。例如，可在多肽的一部分(该部分在形成分子间接触的结构域外部)的正常发生的序列中产生单个或多个氨基酸置换，例如保守氨基酸置换。保守氨基酸置换不应当显著地改变亲本序列的结构特征；例如，替代氨基酸不应当改变组成在亲本序列中存在的免疫球蛋白结合结构域的反向平行β-折叠片，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构。一般地，甘氨酸和脯氨酸不应该用于反向平行β-折叠片。
本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure (C.Branden和J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；以及Thornton等人，Nature 354：105(1991)(通过引用合并入本文)中。
本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure (C.Branden和J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；以及Thornton等人，Nature 354：105(1991)(通过引用合并入本文)中。
[0045] 当在本文中提及“抗体”时，其通常被理解为还可使用其抗原结合部分。抗原结合部分与完整抗体竞争特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))(以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的)。可通过重组DNA技术 或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fd，Fv，dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和包含足以赋予多肽特异性抗原结合的抗体的至少一部分的多肽。
[0046] 从N端至C端，抗体的成熟轻链和重链可变结构域都包含区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。本文中氨基酸至各结构域的分配依照Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；或Chothia等人Nature 342：878-883(1989)中的定义。
[0047] 如本文中所使用的，以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体4.40是与从杂交瘤4.40或其亚克隆获得的抗体相同的抗体。连续的亚克隆称为例如4.40.1、4.40.2和4.40.3，并且具有大体上相同的序列和功能性。
[0048] 如本文中所使用的，Fd片段意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；以及dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))由VH结构域组成。
[0049] 在一些情况下，抗体是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的合成连接体配对形成单价分子。(参见，例如，Bird等人，Science242：423-426(1988) 和Huston等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。
在一些情况下，抗体是双抗体，即，是双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位。(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：
1121-1123(1994))。在一些情况下，来自本文中的抗体的一个或多个CDR可被共价地或非共价地整合入分子以使其成为特异性结合CCR2的免疫粘附素。在此类情况下，可将CDR整合为更大的多肽链的部分，可将其共 价连接至另一条多肽链，或可将其非共价地整合。在具有一个或多个结合部位的情况下，结合部位可彼此相同或可以不同。
在一些情况下，抗体是双抗体，即，是双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位。(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：
1121-1123(1994))。在一些情况下，来自本文中的抗体的一个或多个CDR可被共价地或非共价地整合入分子以使其成为特异性结合CCR2的免疫粘附素。在此类情况下，可将CDR整合为更大的多肽链的部分，可将其共 价连接至另一条多肽链，或可将其非共价地整合。在具有一个或多个结合部位的情况下，结合部位可彼此相同或可以不同。
[0050] 如本文中所使用的，术语“人抗体”意指其中可变和恒定结构域序列是人序列的任何抗体。该术语包括具有来源于人基因的序列(其已被改变以例如减少可能的免疫原性、增加亲和力、消除可能引起不期望的折叠的半胱氨酸等)的抗体。该术语还包括在非人细胞中重组产生的此类抗体，所述非人细胞可能赋予与人细胞赋予的典型糖基化形式不同的糖基化。可以以许多方法如本文中描述的方法制备此类抗体。
[0051] 本文中使用的术语“嵌合抗体”意指包含来自两个或更多个不同的抗体的区域的抗体。在一种情况下，嵌合抗体的一个或多个CDR来源于人CCR2抗体。在另一种情况下，所有CDR来源于人CCR2抗体。在另一情况下，在嵌合抗体中组合来自多于一个人CCR2抗体的CDR。例如，嵌合抗体可包含来自第一人抗CCR2抗体的轻链的CDR1、来自第二人抗CCR2抗体的轻链的CDR2和来自第三人抗CCR2抗体的轻链的CDR3，并且来自重链的CDR可来源于一个或多个其他抗CCR2抗体。此外，构架区可来源于从其获得一个或多个CDR的抗CCR2抗体之一或来源于一个或多个不同的人抗体。
[0052] 在一些情况下，嵌合抗体是人源化的抗CCR2抗体。人源化的抗CCR2抗体包含一个或多个构架区的氨基酸序列和/或来自一个或多个人抗CCR2抗体的恒定区的至少一部分的氨基酸序列和来源于非人抗CCR2抗体的CDR。
[0053] 抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域技术人员按照本说明书的教导容易地制备。片段或类似物的优选氨基和羧基末端存在于功能性结构域的边界附近。
[0054] 本文中使用的术语“表面等离子体共振”是指允许通过检测生物传感器基质内蛋TM白质浓度的改变(例如使用BIACORE 系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.))来分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步描述，参见Jonsson U.等人，Ann.Biol.Clin.51：19-26(1993)；Jonsson U.等人， Biotechniques
11：620-627(1991)；Jonsson B.等人，J.Mol.Recognit.8：125-131(1995)；和Johnsson B.等人，Anal.Biochem.198：268-277(1991)。
11：620-627(1991)；Jonsson B.等人，J.Mol.Recognit.8：125-131(1995)；和Johnsson B.等人，Anal.Biochem.198：268-277(1991)。
[0055] 术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。当解离常数≤1mM，≤100nM或≤10nM时，抗体被认为特异性结合抗原。在某些情况下，KD为1pM至500pM。在其他情况下，KD为500pM至1μM，1μM至100nM或100mM至10nM。
[0056] 术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体或与分子相互作用的任何蛋白质决定簇(determinant)。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。一旦确定抗原上的期望的表位，就可例如使用本说明书中描述的技术产生抗该表位的抗体。可选择地，在发现过程中，抗体的产生和表征可阐明关于期望的表位的信息。根据该信息，则可能就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。实现这一点的方法是进行竞争和交叉竞争研究以发现彼此竞争或交叉竞争与CCR2结合的抗体，例如竞争与抗原的结合的抗体。基于它们的交叉竞争“划分(binning)”抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO 03/48731中。
[0057] 如本文中所使用的，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其通过引用合并入本文。
[0058] 术语“多核苷酸”，如本文中所指，表示长度为至少10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式)的多聚体形式。该术语包括单链和双链形式。
[0059] 术语“分离的多核苷酸”，如本文中所使用的，意指基因组、cDNA 或合成来源的多核苷酸或其的一些组合，根据其来源，“分离的多核苷酸”(1)不与和“分离的多核苷酸”一起被天然发现的多核苷酸的全部或部分结合，(2)可操作地连接至与其非天然连接的多核苷酸，或(3)不作为更大的序列的一部分天然发生。
[0060] 术语“天然发生的核苷酸”，如本文中所使用的，包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”，如本文中所使用的，包括例如具有修饰的或取代的糖基的核苷酸等。本文中提及的术语“寡核苷酸连接”包括寡核苷酸连接例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯(phosphoroamidate)等。参见，例 如LaPlanche 等 人，Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec 等 人，J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein 等 人，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon 等 人，Anti-Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon等人，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.，Oxford University Press，Oxford England(1991))；美国专利5,151,510；Uhlmann和Peyman，Chemical Reviews90：
543(1990)，其公开内容通过引用合并入本文。需要时，寡核苷酸可包括用于检测的标记物。
543(1990)，其公开内容通过引用合并入本文。需要时，寡核苷酸可包括用于检测的标记物。
[0061] “可操作地连接的”序列包括与目的基因邻近的表达控制序列和以反式或在远距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”，如本文中所使用的，意指进行与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质视宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般而言，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。 术语“控制序列”意欲包括，在最低程度上，其存在是表达和加工所必需的所有元件，并且还可包括其存在是有利的另外的元件，例如前导序列和融合伴侣序列。
[0062] 术语“载体”，如本文中所使用的，是指能够转运已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一些情况下，载体是质粒，即，可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA片段。在一些情况下，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接入病毒基因组。在一些情况下，载体能够在已向其中引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在其他情况下，载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后被整合入宿主细胞的基因组，从而可随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。
[0063] 术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)，如本文中所使用的，是指已向其中引入了重组表达载体的细胞。应当理解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅指特定受试细胞而且还指这样的细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在连续世代中发生，因此，这样的后代可能实际上与亲本细胞并不完全一致，但其仍然包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。
[0064] 术语“百分比序列同一性”，在核苷酸序列的背景中，是指当就最大相应性对齐时，两个序列中相同的残基。存在许多本领域内已知的可用于测量核苷酸序列同一性的不同算法。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(其为Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序)比较多核苷酸序列。FASTA，其包括例如程序FASTA2和FASTA3，提供质询序列与搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)；Pearson，Methods Enzymol.266：227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.276：71-84(1998)；通过引用合 并入本文)。除非另外指出，否则使用特定程序或算法的缺省参数。例如，可使用FASTA和其缺省参数(6的字长和用于评分矩阵的NOPAM因子)或使用GCG Version 6.1(通过引用合并入本文)中提供的Gap和其缺省参数来测定核苷酸序列之间的百分比序列同一性。
[0065] 除非另外指出，否则核苷酸序列包括其互补序列。因此，具有特定序列的核酸应当理解为包括具有其互补序列的其互补链。
[0066] 如本文中使用的，术语“百分比序列同一性”与“百分比序列同源性”可互换使用。
[0067] 术语“大体上的相似性”或“大体上的序列相似性”，当指核酸或其片段时，是指当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一个核酸(或其互补链)最佳对齐时，在至少约85％、至少约90％和至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，如通过任何熟知的序列同一性算法例如FASTA、BLAST或Gap(如上论述的)测量的。
[0068] 当用于多肽时，术语“大体上的同一性”，是指两个肽序列，当例如使用程序GAP或BESTFIT，利用程序提供的缺省缺口权重，进行最佳对齐时，共有至少70％、75％或80％的序列同一性，至少90％或95％的序列同一性，和至少97％、98％或99％的序列同一性。在某些情况下，不相同的残基位点相异在于保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有拥有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换的置换。一般地，保守氨基酸置换将基本上不改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此相异在于保守置换的情况下，可上调百分比序列同一性以就置换的保守性质进行修正。用于进行该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。参见例如Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、 精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0069] 可选择地，保守置换是在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)(通过引用合并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihood matrix)中具有正值的任何变化。“中度保守的”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
[0070] 通常使用序列分析软件测量多肽的序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给不同置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性的量度来匹配序列。例如，GCG包括程序例如“Gap”和“Bestfit”，所述程序(使用由程序指定的缺省参数)可用于测定密切相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG Version 6.1(University of Wisconsin，WI)。还可使用缺省或推荐的参数利用FASTA比较多肽序列，参见GCG Version 6.1。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供质询序列与搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：
185-219(2000))。当将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库相比较时，另一个优选算法是计算机程序BLAST，特别地blastp或tblastn(使用程序提供的缺省参数)。参见，例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)。
185-219(2000))。当将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库相比较时，另一个优选算法是计算机程序BLAST，特别地blastp或tblastn(使用程序提供的缺省参数)。参见，例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)。
[0071] CCR2是七跨膜域蛋白，并且因此其具有6个环。从细胞外N末端开始计数，环1、3和5是细胞内环，而环2、4和6是细胞外环。CCR2的第1、第2和第3细胞外环分别指环
2、4和6。
2、4和6。
[0072] 在整个本说明书和权利要求书中，术语“包括”或变型例如“包含”或“含有”将被理解为意指包括所述整体(integer)或整体的组且不排除任何其他整体或整体的组。
[0073] 人抗CCR2抗体和其特征
[0074] 在一些情况下，提供了人抗CCR2抗体。在一些情况下，通过免疫非人转基因动物例如啮齿类动物(其基因组包含人免疫球蛋白基因以便所述转基因动物产生人抗体)来产生人抗CCR2抗体。在一些情况下，抗CCR2抗体和抗原结合部分包括但不限于这样的抗体或抗原结合部分，其(i)结合CCR2的第1或第2细胞外环或两者；(ii)不结合CCR2的N末端或第3细胞外环或两者；或(iii)(i)和(ii)两者。在另一种情况下，提供了结合包含SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：129的氨基酸序列的多肽的人抗CCR2抗体。在另一种情况下，人抗CCR2抗体结合包含与SEQ IDNO：128或SEQ ID NO：129具有80，85，90，95，96，97，
98或99％的同一性的氨基酸序列的多肽。在另一种情况下，抗CCR2抗体和抗原结合部分包括但不限于结合CCR2的第3细胞外环的抗体或抗原结合部分。
98或99％的同一性的氨基酸序列的多肽。在另一种情况下，抗CCR2抗体和抗原结合部分包括但不限于结合CCR2的第3细胞外环的抗体或抗原结合部分。
[0075] 基于序列同源性将VH、Vκ、Vλ基因分类入家族。如果它们在超过80％的位置上共有相同的核苷酸序列，则两种VH、Vκ或Vλ基因属于相同家族。抗CCR2抗体可包含人κ轻链(Vκ)或人λ轻链(Vλ)或从其衍生的氨基酸序列。在一些包含λ轻链的情况下，轻链可变结构域(VL)利用人Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ4、Vλ5、Vλ6、Vλ7、Vλ8、Vλ9或Vλ10家族基因(Williams S.C.等人J.Mol.Bio.264：220-232，(1996))。
[0076] 在一些包含κ轻链的情况下，轻链可变结构域(VL)利用人VκI、VκII、VκIII、VκIV、VκV或VκVI家族基因(Cox J.P.L.等人，Eur.J.Immunol 24：827-836，(1994))，优选VκI、VκII、VκIV或VκVI家族基因，优选VκI或VκVI家族基因。在一些情况下，轻链种系序列选自人Vκ序列，包括但不限于，A1、A10、A11、A14、A17、A18、A19、A2、A20、A23、A26、A27、A3、A30、A5、A7、B2、B3、L1、L10、L11、L12、L14、L15、L16、L18、L19、L2、L20、L22、L23、L24、L25、L4/18a、L5、L6、L8、L9、O1、O11、O12、O14、O18、O2、O4和O8。在某些情况下，该轻链人种系基因选自V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-2、V1-20、V1-22、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V2-1、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、V2-6、V2-7、 V2-8、V3-2、V3-3、V3-4、V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、V 5-1、V5-2、V5-4和V5-6。在某些情况下，轻链利用人VκI O12、VκII A1、VκIVB3或VκVI A26种系基因。
[0077] 抗CCR2抗体可包含利用人VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6或VH7家族基因的重链可变结构域(VH)。在特定的实例中，该重链人种系基因选自VH1-18、VH1-2、VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1和VH7-81。在某些情况下，重链利用人VHI 1-46或VHIII 3-30基因。
[0078] 在特定的情况下，轻链可变区和/或重链可变区包含构架区或至少部分的构架区(例如，包含2或3亚区，例如FR2和FR3)。在某些情况下，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4是完全人的。在其他实例中，至少FRH1、FRH2、FRH3或FRH4是完全人的。在一些情况下，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4是种系序列(例如，人种系)或包含特定构架的人共有序列(可容易地在本文中描述的已知的人Ig序列的来源中获得)。在其他实例中，至少FRH1、FRH2、FRH 3或FRH4是种系序列(例如，人种系)或包含特定构架的人共有序列。
[0079] 在一些情况下，CCR2抗体的VL相对于人基因的种系氨基酸序列包含一个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入。在一些情况下，抗CCR2抗体的VL相对于种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。在一些情况下，一个或多个此类置换、缺失和/或插入位于轻链的CDR中。在一些情况下，相对于种系的氨基酸置换、缺失和/或插入在一个或多个与抗体4.40、4.9、4.22、4.39或4.40A68GS230P的任一个或多个VL中相对于种系的置换、缺失和/或插入相同的位点上。例如，抗CCR2抗体的VL可包含一个或多个在抗体4.40的VL中发现的与种系相比较的氨基酸置换、缺失和/或插入。在一些情况下， 氨基酸变化位于一个或多个相同的位点上，但牵涉与种系相比较不同的置换、缺失和/或插入。在一些情况下，置换可代表此类位置上相对于参照抗体中的氨基酸的保守氨基酸置换。例如，如果此类抗体之一中的特定位置相对于种系被置换并且是谷氨酸，那么在该位点上可用天冬氨酸置换。类似地，如果与种系相比较氨基酸置换是丝氨酸，那么可在该位置上用苏氨酸保守置换丝氨酸。
[0080] 在一些情况下，人抗CCR2抗体的轻链包含抗体4.40(SEQ ID NO：101)；4.9(SEQ ID NO：29)；4.22(SEQ ID NO：65)；4.39(SEQ ID NO：194)或4.40 A68G S230P(SEQ ID NO：113)的可变结构域(VL)氨基酸序列；或具有直至1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个保守氨基酸置换和/或总共直至3个非保守氨基酸置换的所述氨基酸序列。在一些情况下，轻链可包含CDR1、CDR2和CDR3，其分别独立地选自抗体4.40、4.9、4.22、4.39或4.40A68G S230P的轻链的轻链CDR1、CDR2和CDR3，或各自具有少于4个或少于3个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的CDR。在一些情况下，抗CCR2抗体的轻链包含轻链CDR1、CDR2和CDR3，其各自独立地选自单克隆抗体4.40(SEQ ID NO：100)、4.9(SEQ ID NO：28)、4.22(SEQ ID NO：64)、4.39(SEQ ID NO：193)或4.40A68G S230P(SEQ ID NO：112)的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在一些情况下，抗CCR2抗体的轻链包含抗体(其包含选自
4.40(SEQID NO：101)、4.9(SEQ ID NO：29)、4.22(SEQ ID NO：65)、4.39(SEQ IDNO：194)或
4.40A68G S230P(SEQ ID NO：113)的抗体的VL区的氨基酸序列)的轻链CDR1、CDR2和CDR
3，或各自具有少于4个或少于3个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的所述CDR。某些抗体的CDR的序列标志符列于表8中。
4.40(SEQID NO：101)、4.9(SEQ ID NO：29)、4.22(SEQ ID NO：65)、4.39(SEQ IDNO：194)或
4.40A68G S230P(SEQ ID NO：113)的抗体的VL区的氨基酸序列)的轻链CDR1、CDR2和CDR
3，或各自具有少于4个或少于3个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的所述CDR。某些抗体的CDR的序列标志符列于表8中。
[0081] 关于重链，在一些情况下，可变结构域(VH)利用人VH3-30或VH1-46基因序列。在一些情况下，抗CCR2抗体的VH序列相对于种系氨基酸序列包含一个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入(添加)。在一些情况下，重链的可变结构域相对于种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个置换、缺 失和/或插入。在一些情况下，与种系氨基酸序列相比较，置换是非保守置换。在一些情况下，置换、缺失和/或插入位于重链的CDR中。在一些情况下，在一个或多个与抗体4.40、4.22、4.39或4.9的任何一个或多个VH中相对于种系的突变相同的位点上产生氨基酸置换、缺失和/或插入。在其他情况下，氨基酸置换、缺失和/或插入位于一个或多个相同的位点上，但牵涉与参照抗体中的不同的置换、缺失和/或插入。在一些情况下，抗体包含具有SEQ ID NO：202或SEQ IDNO：203的氨基酸序列的重链CDR3。
[0082] 在一些情况下，重链包含抗体4.40(SEQ ID NO：83)、4.22(SEQ IDNO：47)、4.9(SEQ ID NO：11)、4.39(SEQ ID NO：176)的VH氨基酸序列；或具有直至1、2、3、4、6、8或10个保守氨基酸置换和/或总共直至3个非保守氨基酸置换的所述VH氨基酸序列。在一些情况下，重链包含任一上述抗体的从CDR1开始至CDR3结束的氨基酸序列。
[0083] 在一些情况下，重链包含抗体4.40、4.22、4.39或4.9的重链CDR1、CDR2和CDR 3，或各自具有少于8个、少于6个、少于4个或少于3个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的所述CDR。
[0084] 在一些情况下，重链CDR独立地选自抗体4.40、4.22、4.39或4.9的CDR。在另一种情况下，重链包含独立地选自从4.40(SEQ IDNO：83)、4.22(SEQ ID NO：47)、4.39(SEQ ID NO：176)或4.9(SEQ IDNO：11)中选择的两个或更多个VH区的CDR。在另一种情况下，抗体包含上文中公开的轻链和上文中公开的重链。在另外的情况下，轻链CDR和重链CDR来自相同的抗体。
[0085] 可产生的一种类型的氨基酸置换是改变抗体中的一个或多个半胱氨酸，所述半胱氨酸可与另一个残基例如但不限于丙氨酸或丝氨酸化学反应。在一种情况下，存在非典范(canonical)半胱氨酸的置换。可在抗体的可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中产生置换。在一些情况下，半胱氨酸是典范的。
[0086] 可产生的另一种类型的氨基酸置换是改变抗体中任何潜在的蛋白 质水解位点。此类位点可发生在抗体的可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中。半胱氨酸残基的置换和蛋白质水解位点的去除可减少抗体产物中任何异质性的风险，从而增加其同质性。
另一种类型的氨基酸置换是通过改变天冬酰胺和甘氨酸中的一个或两个来消除形成潜在的脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对。在一些情况下，将氨基酸置换用于插入或去除糖基化位点。在一些情况下，可通过蛋白质水解或基因工程去除抗CCR2抗体的重链的C末端赖氨酸。在多种情况下，抗CCR2抗体的重链和轻链可任选地包括信号序列。
另一种类型的氨基酸置换是通过改变天冬酰胺和甘氨酸中的一个或两个来消除形成潜在的脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对。在一些情况下，将氨基酸置换用于插入或去除糖基化位点。在一些情况下，可通过蛋白质水解或基因工程去除抗CCR2抗体的重链的C末端赖氨酸。在多种情况下，抗CCR2抗体的重链和轻链可任选地包括信号序列。
[0087] 在一个方面，抗体由杂交瘤产生。
[0088] 表1列出了示例性抗体的编码重链和轻链的全长和包含可变结构域的部分的核酸以及相应的推导的氨基酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。
[0089] 表1
[0090]
[0091] 还提供了某些上述人抗CCR2抗体的包含一个或多个氨基酸置换的重链和/或轻链变体。为了命名变体，第一个字母是天然发生的抗体链的氨基酸的单字母符号，数字表示氨基酸的位置(其中位置1是N末端氨基酸)，第二个字母是变异氨基酸的单字母符号。在一些情况下，提供了重链变体。一个这样的重链变体是减少半单体(half-monomer)的形成的铰链区稳定性突变(Angal，S.等人Molecular Immunology 30：105-108(1993))。4.40抗体重链变体的一个这样的铰链稳定性突变用脯氨酸置换了SEQ ID NO：82的位点230上的丝氨酸。编码S230P变体的 DNA序列具有始于SEQ ID NO：115的位点688的CCA密码子。
[0092] 还提供了单克隆抗体4.40的变异轻链。A68G是由SEQ ID NO：113所示的4.40轻链变体，其中残基68是甘氨酸残基。在DNA序列中，A68G4.40变体由SEQ ID NO：109编码，其中始于位点252的密码子是GGG。
[0093] 在其他情况下，可产生包含氨基酸变异的组合的抗体。变异的组合的实例是抗CCR2抗体4.40A68G S230P，其在4.40抗体的背景中包含轻链置换A68G和重链置换S230P。包括了4.40的变异重链和变异轻链的其他组合。
[0094] 在一种情况下，抗CCR2抗体是4.40、4.22、4.39、4.40A68G S230P或4.9。在另外的情况下，包括了含有与任何上文所列的人抗CCR2抗体的可变结构域氨基酸序列具有超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过96％、超过97％、超过98％或超过99％的序列同一性的可变结构域氨基酸序列的抗体。
[0095] 抗CCR2抗体的种类和亚类
[0096] 抗CCR2抗体的种类和亚类可通过本领域已知的任何方法来确定。一般地，可使用特异于特定抗体种类和亚类的抗体来确定抗体的种类和亚类。此类抗体是可商购获得的。可以通过ELISA或Western印迹以及其他技术来确定种类和亚类。可选择地，可通过下列来确定种类和亚类：测定抗体的轻链和/或重链的恒定结构域的全部或部分的序列，将它们的氨基酸序列与不同种类和亚类的免疫球蛋白的已知的氨基酸序列相比较，然后确定抗体的种类和亚类。
[0097] 在一些情况下，抗CCR2抗体是单克隆抗体。抗CCR2抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在一种情况下，抗CCR2抗体是属于例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的IgG。在另一种情况下，抗CCR2抗体是IgG4。在另一种情况下，抗体是IgG4同种异型(isoallotype)(Ellison J.和Hood L.，PNAS 79：1984-1988(1982)；& Brusco A.等人，Eur J.Immunogenticsl 25：349-355(1998))。
[0098] 抗CCR2抗体对CCR2的结合亲和力
[0099] 在一些情况下，抗CCR2抗体以高亲和力结合CCR2。
[0100] 在一些情况下，抗CCR2抗体以高亲和力结合CCR2的第1细胞外环，结合CCR2的第2细胞外环或结合由第1和第2细胞外环形成的表位。
[0101] 在相关的情况下，抗CCR2抗体结合由SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：129中所示的氨基酸序列组成的多肽。
[0102] 在一些情况下，抗CCR2抗体不结合CCR2的第3细胞外环或CCR2的N末端结构域。
[0103] 在另一种情况下，抗CCR2抗体不结合由SEQ ID NO：127或SEQ IDNO：130中所示-7 -8的序列组成的肽。在另一种情况下，抗CCR2抗体以约2x10 M或更低的KD，以约2x10 M或-9 -9 -10
更低的KD，以约2x10 M或更低的KD，以约1x10 M或更低的KD，以约9x10 M或更低的KD，以-10 -10 -10 -10
约8x10 M或更低的KD，以约7x10 M或更低的KD，以约6x10 M或更低的KD，以约5x10 M-10 -10 -10
或更低的KD，以约4x10 M或更低的KD，以约3x10 M或更低的KD，以约2x10 M或更低的KD结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。在某些情况下，抗体以大体上与选自4.40、4.9、
4.22、4.39或4.40A68G S230P的抗体相同的KD结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2
细胞外环。在另一种情况下，抗体以大体上与抗体(所述抗体包含具有于SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：176或SEQ ID NO：47中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域)相同的KD结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。在另一种情况下，
抗体以大体上与抗体(所述抗体包含具有于SEQ ID NO：101、SEQ IDNO：113、SEQ ID NO：
29、SEQ ID NO：194或SEQ ID NO：65中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域的CDR或包含具有于SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：176或SEQ ID NO：47中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域的CDR)相同的KD结合CCR2。
更低的KD，以约2x10 M或更低的KD，以约1x10 M或更低的KD，以约9x10 M或更低的KD，以-10 -10 -10 -10
约8x10 M或更低的KD，以约7x10 M或更低的KD，以约6x10 M或更低的KD，以约5x10 M-10 -10 -10
或更低的KD，以约4x10 M或更低的KD，以约3x10 M或更低的KD，以约2x10 M或更低的KD结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。在某些情况下，抗体以大体上与选自4.40、4.9、
4.22、4.39或4.40A68G S230P的抗体相同的KD结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2
细胞外环。在另一种情况下，抗体以大体上与抗体(所述抗体包含具有于SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：176或SEQ ID NO：47中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域)相同的KD结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。在另一种情况下，
抗体以大体上与抗体(所述抗体包含具有于SEQ ID NO：101、SEQ IDNO：113、SEQ ID NO：
29、SEQ ID NO：194或SEQ ID NO：65中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域的CDR或包含具有于SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：176或SEQ ID NO：47中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域的CDR)相同的KD结合CCR2。
[0104] 在一些情况下，抗CCR2抗体可具有低解离速率常数(koff)。在一些情况下，抗CCR2-3 -4 -1 -4 -1抗体可以以1.0x10 s-1或更低的koff、5.0x10 s 或更低的koff或2x10 s 或更低的koff结合CCR2，或更优选结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。在一些情况下，koff可以与本文中描述的抗体包括选自4.40、4.9、4.22、4.39和4.40A68G S230P的抗体大体上 相同。
在一些情况下，抗体可以以与抗体(所述抗体包含选自4.40、4.9和4.40A68G S230P的抗体的重链的CDR或轻链的CDR)大体上相同的koff结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2
细胞外环。在一些情况下，抗体可以以与抗体(所述抗体包含(i)具有在SEQ ID NO：83或SEQ IDNO：11中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域；(ii)具有在SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：29中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(iii)(i)和(ii))大体上相同的koff结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。在另
一种情况下，抗体可以以与抗体(所述抗体包含具有在SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：29中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域的CDR；和具有SEQ IDNO：83或SEQ ID NO：11中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域的CDR)大体上相同的koff结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。
在一些情况下，抗体可以以与抗体(所述抗体包含选自4.40、4.9和4.40A68G S230P的抗体的重链的CDR或轻链的CDR)大体上相同的koff结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2
细胞外环。在一些情况下，抗体可以以与抗体(所述抗体包含(i)具有在SEQ ID NO：83或SEQ IDNO：11中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域；(ii)具有在SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：29中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域，或(iii)(i)和(ii))大体上相同的koff结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。在另
一种情况下，抗体可以以与抗体(所述抗体包含具有在SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：29中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域的CDR；和具有SEQ IDNO：83或SEQ ID NO：11中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域的CDR)大体上相同的koff结合CCR2或结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。
[0105] 抗CCR2抗体对CCR2的结合亲和力和解离速率可使用本领域已知的方法来测定。TM
结合亲和力可使用ELISA、RIA、流式细胞术和表面等离子体共振术例如BIACORE 来测量。
解离速率可使用表面等离子体共振术来测量。可通过使用本领域已知的方法来确定抗体是否具有与抗CCR2抗体大体上相同的KD。实施例5例举了用于测定抗CCR2单克隆抗体的亲和力常数的方法。
结合亲和力可使用ELISA、RIA、流式细胞术和表面等离子体共振术例如BIACORE 来测量。
解离速率可使用表面等离子体共振术来测量。可通过使用本领域已知的方法来确定抗体是否具有与抗CCR2抗体大体上相同的KD。实施例5例举了用于测定抗CCR2单克隆抗体的亲和力常数的方法。
[0106] 被抗CCR2抗体识别的CCR2表位的鉴定
[0107] 提供了人抗CCR2单克隆抗体，所述单克隆抗体结合CCR2并且可与下列抗体竞争或交叉竞争和/或结合与下列抗体相同的表位：(a)选自4.40、4.9、4.22、4.39和4.40A68G S230P的抗体；(b)包含具有SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：176或SEQ ID NO：47中发现的可变结构域的氨基酸序列的重链可变结构域的抗体，(c)包含具有SEQ IDNO：
101、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：194或SEQ ID NO：65中发现的可变结构域的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗体，或(d)包含(b)中定义的重链可变结构域和(c)中定义的轻链可变结构域的抗体。如果两个抗体彼此相互竞争对CCR2的结合，则认为它们交叉竞争。
101、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：194或SEQ ID NO：65中发现的可变结构域的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗体，或(d)包含(b)中定义的重链可变结构域和(c)中定义的轻链可变结构域的抗体。如果两个抗体彼此相互竞争对CCR2的结合，则认为它们交叉竞争。
[0108] 可通过使用本领域已知的方法来确定抗体是否与本文中提供的抗 CCR2抗体结合相同的表位、竞争或交叉竞争结合。在一种情况下，让本文中提供的抗CCR2抗体在饱和条件下结合CCR2，然后测量受试抗体结合CCR2的能力。如果受试抗体能够与提供的抗CCR2抗体同时结合CCR2，那么受试抗体结合与抗CCR2抗体不同的表位。然而，如果受试抗体不能同时结合CCR2，那么受试抗体结合相同的表位、重叠的表位或与本文中提供的人抗CCR2抗体所结合的表位十分靠近的表位。为了确定受试抗体是否与参照抗体交叉竞争，进行交换(reversing)抗体顺序的实验，即，让测试抗体结合CCR2，然后测量本文中提供的抗CCR2TM抗体结合CCR2的能力。此类实验可使用ELISA、RIA、BIACORE 或流式细胞术(FACS)来进行。
[0109] 抗CCR2抗体对CCR2活性的抑制
[0110] 在一些情况下，提供了抑制CCR2-介导的信号转导的抗CCR2抗体。在其他情况下，提供了抑制MCP-1、MCP-2、MCP-3和/或MCP-4介导的通过CCR2的信号转导的抗CCR2抗体。在其他情况下，提供了抑制MCP-1、MCP-2、MCP-3和/或MCP-4与CCR2的结合的抗CCR2抗体。在一种情况下，CCR2是人CCR2。在一些情况下，CCR2是人CCR2A、CCR2B或两者。在其他情况下，抗CCR2抗体是人抗体。
[0111] 可在配体结合测定例如ELISA、RIA或相关测定和基于细胞的测定例如表达CCR2的细胞的趋化作用测定中测量抗CCR2抗体的IC50。在多种情况下，抗体或其抗原结合部分以不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.20μg/ml的IC50抑制MCP-1与CCR2之间的配体结合，如通过ELISA测定所测量的。
[0112] 在另一种情况下，提供了在CCR2配体例如MCP-1(CCL2)、MCP-2、MCP-3和/或MCP-4存在的情况下减少CCR2的激活的抗CCR2抗体。在一种情况下，抗CCR2抗体可抑制CCR2配体诱导的(i)G-蛋白激活，(ii)腺苷酸环化酶激活，(iii)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活，(iv)胞质钙动员，(v)ERK磷酸化，(vi)趋化作用或(vii)肌动蛋白多聚化。可通过测定用放射性标记的GTP标记的细胞中G-蛋白的GTP/GDP比率，通过测量GTPgS掺入，通过使用钙生色团测量胞质钙流或通过测量细胞中 MAPK的磷酸化状态来确定在MCP-1存在的情况下抗CCR2抗体是否可阻止、抑制或减少CCR2的激活。在例如Gabrilin等人，Biochem Biophys Res Commun.327(2)：533-40(2005)和Jimenez-Sainz等人，Mol Pharmacol.64(3)：773-82(2003)中描述了用于检测CCR2激活和/或MCP-1与CCR2的结合的测定。
[0113] 在一种情况下，可使用趋化作用测定确定CCR2激活的水平。在一些情况下，使用趋化作用测定测量的IC50不超过5μg/ml，不超过1μg/ml，不超过0.5μg/ml或不超过0.20μg/ml。实施例10例举了通过监控钙动员测量抗CCR2抗体对CCR2的抑制的一种类型的测定。
[0114] 在另一个方面，将细胞与抗体接触可导致细胞表面CCR2的表达在与抗体一起温育后下调。在一些情况下，温育可以是短时期(例如，4小时)或更长的时期(例如，24小时)。可使用Western印迹、ELISA或FACS分析来测量细胞表面CCR2表达的下调。在特定的情况下，将细胞与抗体接触可导致细胞表面CCR2的表达至少6％的减少，至少10％的减少，至少20％的减少，至少30％的减少或至少50％的减少，如通过Western印迹或ELISA测量的。
[0115] 在另一个方面，抗体减少MCP-1诱导的pERK磷酸化。可使用Western印迹、ELISA或FACS分析测量MCP-1诱导的pERK磷酸化的下调。在特定的情况下，抗体产生MCP-1诱导的pERK磷酸化的至少6％的减少，至少10％的减少，至少20％的减少，至少30％的减少或至少50％的减少，如通过FACS分析测量的。
[0116] 利用抗CCR2抗体体内抑制趋化作用
[0117] 根据一些情况，提供了体内抑制免疫细胞的趋化作用的抗CCR2抗体。其趋化作用被抑制的免疫细胞包括外周血单核细胞、THP细胞、单核细胞、记忆T淋巴细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、天然杀伤细胞和过继转移的CCR2+细胞(adoptively transferred CCR2+cell)。在一个情况下，抗CCR2抗体抑制免疫细胞响应MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4中的一种或多种的趋化作用。在一种情况下，趋化因子是MCP-1。在另一种情况下，趋化因子是MCP-3。抗CCR2抗体可抑制至炎症或损伤的位 置的趋化作用。
[0118] 根据一些情况，还提供了抑制非免疫细胞的趋化作用的抗CCR2抗体，所述细胞包括但不限于成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)(参见Garcia-Vicuna等人，Arthritis Rheum.50(12)：3866-77(2004))、成体神经干细胞(参见Widera等人，Eur J CellBiol.83(8)：381-7(2004))和人胎儿星形细胞(参见Andjelkovic等人，J Neurosci Res.70(2)：219-31(2002))。
[0119] 在一种情况下，与未处理的动物中的细胞的趋化作用相比较，抗体抑制细胞趋化作用。在另一种情况下，抗CCR2抗体减少趋化作用至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一种情况下，在用抗体开始处理动物后至少1小时测量趋化作用的抑制。在另一种情况下，在用抗体开始处理动物后至少
7天测量趋化作用的抑制。在另一种情况下，抗CCR2抗体导致至少10％至100％的趋化作用抑制。
7天测量趋化作用的抑制。在另一种情况下，抗CCR2抗体导致至少10％至100％的趋化作用抑制。
[0120] 物种和分子选择性
[0121] 在另一个方面中，抗CCR2抗体显示物种和分子选择性。在一些情况下，抗CCR2抗体结合人和食蟹猴CCR2。抗CCR2抗体可结合另外的非人灵长类动物的CCR2。在一些情况下，抗CCR2抗体不结合小鼠或大鼠CCR2。按照本说明书的教导，可使用本领域熟知的方法测定抗CCR2抗体的物种选择性。例如，可使用Western印迹、流式细胞术、ELISA、免疫沉淀或RIA测定物种选择性。在一种情况下，可使用流式细胞术测定物种选择性。在另一种情况下，可通过使用来自该物种的细胞评估抗体抑制MCP-1功能响应的能力来测定物种特异性。这可包括趋化作用、肌动蛋白多聚化、钙动员等。
[0122] 在另一种情况下，抗CCR2抗体对于由SEQ ID NO：126(人CCR2B)中所示的氨基酸序列组成的多肽具有优于对由SEQ ID NO：131(人CCR5)所示的氨基酸序列组成的多肽的选择性。在另一种情况下，抗CCR2抗体对于CCR2具有优于CCR5至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的选择性。在另一种情况下，人抗CCR2抗体结 合包含与SEQ ID NO：126具有80，85，90，95，96，97，98或99％的同一性的氨基酸序列的多肽。
[0123] 在另一种情况下，抗CCR2抗体对于由SEQ ID NO：125(人CCR2A)中所示的氨基酸序列组成的多肽可具有优于由SEQ ID NO：131(人CCR5)中所示的氨基酸序列组成的多肽至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的选择性。在另一种情况下，人抗CCR2抗体结合包含与SEQ ID NO：125具有80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性的氨基酸序列的多肽。
[0124] 可按照本说明书的教导，使用本领域熟知的方法测定抗CCR2抗体对CCR2的选择性。例如，可使用Western印迹、流式细胞术、ELISA、免疫沉淀或RIA和/或功能性测定例如趋化作用、钙动员或肌动蛋白多聚化来测定选择性。
[0125] 产生抗体和抗体产生性细胞系的方法
[0126] 免疫
[0127] 在一些情况下，通过用CCR2抗原免疫在其基因组中包含一些或全部人免疫球蛋白重链和轻链基因座的非人转基因动物来产生人抗体。在一种情况下，非人动物是TMXENOMOUSE 动物。(Amgen Fremont，Inc.(formerly Abgenix，Inc.)，Fremont，CA)。
[0128] XENOMOUSETM小鼠是包含大片段的人免疫球蛋白重链和轻链基因座并且在小鼠抗体产生中具有缺陷的基因工程改造的小鼠品系。参见，例如，Green等人，Nature Genetics7：13-21(1994)和美 国专利5,916,771，5,939,598，5,985,615，5,998,209，6,075,181，
6,091,001，6,114,598，6,130,364，6,162,963和6,150,584。 也 参 见WO 91/10741，WO
94/02602，WO 96/34096，WO 96/33735，WO 98/16654，WO 98/24893，WO 98/50433，WO
99/45031，WO 99/53049，WO 00/09560和WO 00/037504。
6,091,001，6,114,598，6,130,364，6,162,963和6,150,584。 也 参 见WO 91/10741，WO
94/02602，WO 96/34096，WO 96/33735，WO 98/16654，WO 98/24893，WO 98/50433，WO
99/45031，WO 99/53049，WO 00/09560和WO 00/037504。
[0129] 在另一个方面，提供了通过用CCR2抗原免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物来从非人、非小鼠动物产生抗CCR2抗体的方法。可使用上述文献中描述的方法产生此类动物。可如美国专利5,994,619(其通过引用合并入本文)中所述改进这些文献中公开的方法。美国专利 5,994,619描述了产生新型培养的内细胞团(CICM)细胞和细胞系(来源于猪和牛)和已向其中引入了异源DNA的转基因CICM细胞的方法。可将CICM转基因细胞用于产生克隆的转基因胚胎、胎儿和后代。′619专利还描述了产生能够将异源DNA传递至其后代的转基因动物的方法。在优选情况下，非人动物是哺乳动物，特别是大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。
[0130] XENOMOUSETM小鼠产生完全人抗体的成体样人库(repertoire)和产生抗原特异TM性人抗体。在一些情况下，XENOMOUSE 小鼠通过引入人重链基因座和κ轻链基因座的种系结构片段(configuration fragment)而包含约80％的人抗体V基因库。在其他情况下，TM
XENOMOUSE 小鼠还包含约全部人λ轻链基因座。参见Mendez等人，Nature Genetics 15：
146-156(1997)，Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188：483-495(1998)，和WO 98/24893，其公开内容通过引用合并入本文。
XENOMOUSE 小鼠还包含约全部人λ轻链基因座。参见Mendez等人，Nature Genetics 15：
146-156(1997)，Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188：483-495(1998)，和WO 98/24893，其公开内容通过引用合并入本文。
[0131] 在另一种情况下，使用从修饰的胚胎干(ES)细胞直接立即产生遗传上改变的TM小鼠的VELOCIMOUSE 技术(Regeneron Pharmaceuticals，Tarrytown，NY.)来产生抗体(Poueymirou W.T.，等人，Nature Biotechnology 25：91-99(2007))。
[0132] 在一些情况下，包含人免疫球蛋白基因的非人动物是具有人免疫球蛋白“微小基因座(minilocus)”的动物。在微小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的单独基因来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定结构域和第二恒定结构域(优选γ恒定结构域)形成用于插入动物的构建体。该方法，特别地，描述于美国专利5,545,807，5,545,806，5,569,825，5,625,126，5,633,425，5,661,016，5,770,429，5,789,650，5,814,318，5,591,669，5,612,205，5,721,367，
5,789,215和5,643,763(通过引用合并入本文)中。
5,789,215和5,643,763(通过引用合并入本文)中。
[0133] 在另一个方面，提供了用于产生人源化抗CCR2抗体的方法。在一些情况下，如本文中描述的，在允许抗体产生的条件下用CCR2抗原免疫非人动物。从动物分离抗体产生性细胞，并且分离编码目的抗CCR2抗体的重链和轻链的核酸。然后使用本领域技术人员已知的和下面进一步描述 的技术对这些核酸进行工程改造，以减少非人序列的量，即人源化抗体以减小在人中的免疫应答。
[0134] 在一些情况下，CCR2抗原是分离的和/或纯化的CCR2。在一种情况下，CCR2抗原是人CCR2。在一些情况下，CCR2抗原是CCR2的片段。在一些情况下，CCR2片段是CCR2的细胞外环、N末端结构域或C末端。在某些情况下，CCR2片段包含CCR2的第1或第2细胞外环。在其他情况下，CCR2片段包含SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：129中所示的氨基酸序列。
[0135] 在其他情况下，CCR2片段不包含CCR2的第3细胞外环或N末端结构域。
[0136] 在其他情况下，CCR2片段不包含SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：130中所示的氨基酸序列。在一些情况下，CCR2片段包含CCR2的至少一个表位。在其他情况下，CCR2抗原是在其表面上表达或过表达CCR2或其免疫原性片段的细胞。在一些情况下，CCR2抗原是CCR2融合蛋白。在一些情况下，CCR2是合成的肽免疫原。
[0137] 可利用本领域已知的任何方法免疫动物。参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring HarborPress，1990。用于免疫非人动物例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛或马的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Harlow和Lane，同上以及美国专利5,994,619。在一种情况下，将CCR2抗体与佐剂一起施用以刺激免疫应答。示例性佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此类佐剂可通过将多肽隔离在局部沉积物中来保护多肽免受快速分散，或它们可包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞和免疫系统的其他组分具有趋化作用的因子的物质。如果将要施用多肽，那么免疫接种安排将包括在数周内展开的两次或更多次TM
的多肽的施用。实施例1例举了用于在XENOMOUSE 小鼠中产生抗CCR2单克隆抗体的方法。
的多肽的施用。实施例1例举了用于在XENOMOUSE 小鼠中产生抗CCR2单克隆抗体的方法。
[0138] 抗体和抗体产生性细胞系的产生
[0139] 在用CCR2抗原免疫动物后，可从动物获得抗体和/或抗体产生性 细胞。在一些情况下，通过采血或杀死动物从动物获得含有抗CCR2抗体的血清。可使用血清(如其从动物获得的)，可从血清获得免疫球蛋白级分，或可从血清纯化抗CCR2抗体。
[0140] 在一些情况下，从分离自经免疫的动物的细胞制备产生抗体的永生化细胞系。在免疫后，杀死动物，然后通过本领域内已知的任何方法使外周血，淋巴结和/或脾B细胞永生化。永生化细胞的方法包括但不限于，用癌基因转染它们，用致癌病毒感染它们和在选择永生化细胞的条件下培养它们，将它们经历致癌或突变化合物，将它们与永生化细胞例如骨髓瘤细胞融合，以及使肿瘤抑制基因失活。参见，例如，Harlow和Lane，同上。如果使用与骨髓瘤细胞的融合，那么骨髓瘤细胞优选不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。使用CCR2或其部分或表达CCR2的细胞筛选永生化细胞。在一种情况下，CCR2部分(i)包含CCR2的第1和/或第2细胞外环；(ii)包含SEQ ID NO：128和/或SEQ ID NO：129中
所示的氨基酸序列；(iii)不包含CCR2的第3细胞外环和/或N末端结构域；(iv)不包含SEQ ID NO：127和/或SEQ ID NO：130中所示的氨基酸序列；或(v)其组合。在一种情况下，使用酶联免疫测定(ELISA)或放射性免疫测定来进行初步筛选。在WO 00/37504(通过引用合并入本文)中提供了ELISA筛选的实例。
所示的氨基酸序列；(iii)不包含CCR2的第3细胞外环和/或N末端结构域；(iv)不包含SEQ ID NO：127和/或SEQ ID NO：130中所示的氨基酸序列；或(v)其组合。在一种情况下，使用酶联免疫测定(ELISA)或放射性免疫测定来进行初步筛选。在WO 00/37504(通过引用合并入本文)中提供了ELISA筛选的实例。
[0141] 选择、克隆产生抗CCR2抗体的细胞例如杂交瘤并且就期望的特征(包括旺盛的生长、高抗体产量和期望的抗体特征)对其进行进一步筛选，如下文中进一步论述的。可在同基因动物(syngeneic animal)中，在缺乏免疫系统的动物例如裸小鼠中体内扩增或在细胞培养物中体外扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
[0142] 在一个方面，免疫的动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物，并且将脾B细胞融合至来自与该非人动物相同物种的骨髓瘤细胞系。在示例性情况下，免疫的动物是TMXENOMOUSE 小鼠，并且骨髓瘤细胞系是非分泌型小鼠骨髓瘤。在一种情况下，骨髓瘤细胞系是P3-X63-Ag8.653(美国典型培养物保藏中心)。参见，例如实施例1。
[0143] 通过测试由细胞产生的抗体是否结合包含CCR2的第1或第2细胞外环的氨基酸序列的肽来筛选永生化的抗体产生性细胞，以鉴定抗CCR2的第1和/或第2细胞外环的抗体。可选择地或组合地，可就与嵌合趋化因子受体的结合测试由细胞产生的抗体，所述受体主要具有另一种趋化因子受体的序列和CCR2的第1和/或第2细胞外环的序列。参见实施例8，其例举了嵌合体用于对抗CCR2抗体进行表位作图的用途。在互补的情况下，可就与嵌合趋化因子受体的结合测试由细胞产生的已知结合CCR2的抗体，所述受体主要具有CCR2的序列但缺乏CCR2的野生型第1和/或第2细胞外环，例如，具有来自另一种细胞因子受体的第1和/或第2细胞外环或在此类细胞外环的一个或两个中包含突变。
[0144] 在另一个方面，提供了产生人抗CCR2抗体的细胞和细胞系(包括杂交瘤)。在一种情况下，由细胞、细胞系或杂交瘤产生的人抗CCR2抗体是CCR2的拮抗剂。在另一种情况下，人抗CCR2抗体(i)结合CCR2的第1和/或第2细胞外环；(ii)结合SEQ ID NO：128和/或SEQ ID NO：129中所示的氨基酸序列；(iii)不结合CCR2的第3细胞外环和/或N末端结构域；(iv)不结合SEQ ID NO：127和/或SEQ ID NO：130中所示的氨基酸序列；或(v)其组合。在另一种情况下，由细胞、细胞系或杂交瘤产生的人抗CCR2抗体不以高亲和力结合第3细胞外环，不以高亲和力结合CCR2的N末端结构域或不以高亲和力结合任一者。
[0145] 在另一个方面，用CCR2免疫转基因动物，从免疫的转基因动物分离原代细胞例如脾或外周血细胞，并鉴定产生特异于期望的抗原的抗体的单个细胞。例如，分离来自每一个单个细胞的多腺苷酸化mRNA，使用与变区序列退火的有义引物(例如识别大部分或全部人重链和轻链可变区基因的FR1区的简并引物)和与恒定区或铰链(J)区序列退火的反义引物进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。然后克隆重链和轻链可变结构域的cDNA，将其在任何适当的宿主细胞例如骨髓瘤细胞中表达为具有各自的免疫球蛋白恒定区例如重链和κ或λ恒定结构域的嵌合抗体。参Babcook，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-48(1996)，其通过引用合并入本文。然后可如本文中所述鉴定和分离抗CCR2 抗体。
[0146] 在另一个方面，可使用噬菌体展示技术提供包含对于CCR2具有不同的亲和力的抗体的库的文库。可将原代B细胞直接用作DNA的来源。将获自B细胞(其例如来源于脾)的cDNA的混合物用于制备表达文库，例如，转染入大肠杆菌(E.coli.)的噬菌体展示文库。就对CCR2的免疫反应性测试所得的细胞。Griffiths等人，EMBO J.13：3245-3260(1994)；
Nissim等人，ibid，pp.692-698和Griffiths等人，ibid，12：725-734(通过引用合并入本文)描述了用于从此类文库鉴定高亲和力人抗体的技术。最终，鉴定来自文库的克隆，其对于抗原产生期望量级的结合亲和力，回收编码负责这样的结合的产物的DNA，并操作其以进行标准重组表达。还可使用之前操作的核苷酸序列构建噬菌体展示文库，并且以相似的方式进行筛选。一般地，独立地提供编码重链和轻链的cDNA，或将其连接以形成用于在噬菌体文库中产生的Fv类似物。
Nissim等人，ibid，pp.692-698和Griffiths等人，ibid，12：725-734(通过引用合并入本文)描述了用于从此类文库鉴定高亲和力人抗体的技术。最终，鉴定来自文库的克隆，其对于抗原产生期望量级的结合亲和力，回收编码负责这样的结合的产物的DNA，并操作其以进行标准重组表达。还可使用之前操作的核苷酸序列构建噬菌体展示文库，并且以相似的方式进行筛选。一般地，独立地提供编码重链和轻链的cDNA，或将其连接以形成用于在噬菌体文库中产生的Fv类似物。
[0147] 然后就具有对于CCR2的最高亲和力的抗体筛选噬菌体文库，并从适当的克隆回收遗传物质。更多轮次的筛选可增加分离的原始抗体的亲和力。
[0148] 产生抗体的核酸、载体、宿主细胞和重组方法
[0149] 核酸
[0150] 还包括编码抗CCR2抗体或其抗原结合部分的核酸分子。在一些情况下，不同核酸分子编码抗CCR2免疫球蛋白的重链和轻链。在其他情况下，相同核酸分子编码抗CCR2免疫球蛋白的重链和轻链。在一种情况下，核酸编码CCR2抗体或其抗原结合部分。
[0151] 在一些情况下，编码轻链的可变结构域(VL)的核酸分子包含人Vκ1，Vκ2，Vκ3，Vκ4，Vκ5或Vκ6基因家族区段和具有或不具有相对于种系的突变的Jκ1，Jκ2，Jκ4或Jκ5基因区段。
[0152] 在一些情况下，编码轻链的核酸分子编码相对于种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个置换的氨基酸序列。在一些情况下，核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与种系Vκ和Jκ序列相比较包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸置换 和/或1、2或3个非保守置换的VL氨基酸序列。置换可存在于CDR、构架区中或恒定结构域中。
[0153] 在一些情况下，核酸分子编码与种系序列相比较包含一个或多个变异的VL氨基酸序列，所述变异与抗体4.40、4.9、4.22、4.39或4.40A68GS230P之一的VL中发现的变异相同。在一些情况下，核酸编码VL氨基酸序列，所述氨基酸序列在与本文提供的CCR2抗体中相对于种系的突变相同的一个或多个位置上包含突变，但包含不同的置换(在一些情况下，与提供的抗体中的置换相比较，保守置换)。
[0154] 在一些情况下，与在抗体4.40、4.9、4.22、4.39或4.40A68G S230P之一的VL中发现的种系序列相比较，核酸分子编码至少3个氨基酸置换。
[0155] 在一些情况下，核酸分子包含编码单克隆抗体4.40(SEQ IDNO：101)、4.9(SEQ ID NO：29)、4.22(SEQ ID NO：65)、4.39(SEQ ID NO：194)或4.40A68G S230P(SEQ ID NO：113)的VL氨基酸序列或其变体或部分的核苷酸序列。在一些情况下，核酸编码包含上述抗体之一的轻链CDR的氨基酸序列。在一些情况下，所述部分是包含CDR1-CDR3的连续部分。
[0156] 在一些情况下，核酸分子编码与抗体4.40、4.9、4.22、4.39或4.40A68G S230P的任一个VL区的VL氨基酸序列或SEQ ID NO：101，SEQ IDNO：113，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：194或SEQ ID NO：65的任一个的VL区的氨基酸序列至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％同一的VL氨基酸序列。核酸分子包括编码SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：65中发现的VL区的核酸。
[0157] 在另一种情况下，核酸分子编码选自4.40、4.9、4.22、4.39或4.40A68G S230P的抗体的全长轻链，或包含SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：193或SEQ ID NO：28的氨基酸序列的轻链，或包含突变例如本文中公开的突变的所述轻链序列。
[0158] 在另一种情况下，核酸分子编码重链的可变结构域(VH)，其包含人3-30或1-46VH基因序列或来源于其的序列。在不同的情况下，核酸分子利用人3-30VH基因序列、人D1-7基因序列和人JH3B基因序列；人1-46VH基因序列、人D1-7基因序列和人JH3B基因序列；或来源于人基因的序 列。
[0159] 在一些情况下，核酸分子编码与人V、D或J基因的种系氨基酸序列相比较包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17或18个突变的氨基酸序列。在一些情况下，所述突变存在于VH区中。在一些情况下，所述突变存在于CDR中。
[0160] 在一些情况下，核酸分子编码与种系序列相比较包含一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列，所述突变与在单克隆抗体4.40、4.22、4.39或4.9的VH中发现的氨基酸突变相同。在一些情况下，与种系序列相比较，核酸编码至少3个氨基酸突变，所述突变与上述单克隆抗体之一中发现的至少3个氨基酸突变相同。
[0161] 在一些情况下，核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自4.40(SEQ ID NO：83)、4.22(SEQ ID NO：47)、4.39(SEQ ID NO：176)或4.9(SEQ ID NO：11)的单克隆抗体的VH氨基酸序列的至少一部分、其变体或具有保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的所述序列。在不同情况下，序列编码一个或多个CDR、CDR3区、全部3个CDR、包括CDR1-CDR3的连续部分或整个VH区(具有或不具有信号序列)。
[0162] 在一些情况下，核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQID NO：82，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：175或SEQ ID NO：116之一的氨基酸序列或具有信号序列的所述序列。在一些优选情况下，核酸分子包含SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：115的核苷酸序列的至少一部分或具有信号序列的所述序列。在一些情况下，所述部分编码VH区(具有或不具有信号序列)、CDR3区、全部3个CDR或包括CDR1-CDR3的连续区域。
[0163] 在一些情况下，核酸分子编码与抗体4.40、4.9、4.22、4.39或4.40A68G S230P的任一VH区的VH氨基酸序列或SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：176或SEQ ID NO：11的任一个的VH区的氨基酸序列至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％同一的VH氨基酸序列。还包括编码4.40(SEQ ID NO：83)、4.22(SEQ ID NO：47)、4.39(SEQ ID NO：176) 或4.9(SEQ ID NO：11)或其VH区的氨基酸序列的核酸，或具有SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：2的核苷酸序列的核酸或编码其VH区的核酸。
[0164] 在另一种情况下，核酸编码选自4.40、4.22、4.9、4.39或4.40A68GS230P的抗体的全长重链或具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：175或SEQ ID NO：116的氨基酸序列的重链(具有或不具有信号序列)或包含突变(例如本文中论述的变异之一)的重链。此外，核酸可包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：166或SEQ ID NO：115的核苷酸序列或编码包含突变(例如本文中论述的变异之一)的重链的核酸分子。
[0165] 编码抗CCR2抗体的重链或轻链或其部分的核酸分子可从产生这样的抗体的任何来源分离。在不同的情况下，从B细胞(分离自用CCR2免疫的动物)或从来源于表达抗CCR2抗体的这样的B细胞的永生化细胞分离核酸分子。分离编码抗体的mRNA的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Sambrook等人。可将mRNA用于产生用于聚合酶链式反应(PCR)或抗体基因的cDNA克隆的cDNA。在一种情况下，从杂交瘤分离核酸分子，所述杂交瘤将来自非人转基因动物的人免疫球蛋白产生性细胞作为其融合伴侣之一。在其他情况下，TM从XENOMOUSE 动物分离人免疫球蛋白产生性细胞。在另一种情况下，人免疫球蛋白产生性细胞来自本文中所述的非人、非小鼠转基因动物。在另一种情况下，从非人、非转基因动物分离核酸。从非人、非转基因动物分离的核酸分子可用于例如人源化的抗体。
[0166] 在一些情况下，编码抗CCR2抗体的重链的核酸包含与来自任何来源的编码重链恒定结构域的核苷酸序列符合读框地连接的编码VH结构域的核苷酸序列。类似地，编码抗CCR2抗体的轻链的核酸分子可包含与来自任何来源的编码轻链恒定结构域的核苷酸序列符合读框地连接的编码VL结构域的核苷酸序列。
[0167] 在另外的方面中，将编码重(VH)和/或轻(VL)链的可变结构域的核酸分子“转换”成全长抗体基因。在一种情况下，通过将编码VH或VL结构 域的核酸分子分别插入已编码重链恒定(CH)或轻链恒定(CL)结构域的表达载体(以便将VH区段可操作地连接至载体内的CH区段，和/或将VL区段可操作地连接至载体内的CL区段)来将所述核酸分子转换成全长抗体基因。在另一种情况下，通过使用标准分子生物学技术将编码VH和/或VL结构域的核酸分子连接例如连接至编码CH和/或CL结构域的核酸分子来将编码VH和/或VL结构域的核酸分子转换成全长抗体基因。人重链和轻链免疫球蛋白恒定结构域基因的核苷酸序列在本领域是已知的。参见例如，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publ.No.91-3242，1991。然后可从已将编码全长重链和/或轻链的核酸分子引入其中的细胞表达所述核酸分子，并且分离抗CCR2抗体。
[0168] 可将核酸分子用于重组表达抗CCR2抗体。核酸分子还可用于产生嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素、双抗体、突变的抗体和抗体衍生物，如下文中进一步描述的。如果核酸分子来源于非人、非转基因动物，那么核酸分子可用于抗体人源化，如本文中所描述的。
[0169] 在一些情况下，提供了编码全长重链或全长轻链的核酸，其中编码恒定区氨基酸序列的核苷酸序列与种系人恒定区序列相比较包含一个或多个突变。例如，核酸可编码通过添加或去除糖基化位点或编码提高抗体的稳定性或半衰期的置换来改善抗体的性质的氨基酸置换。核酸还可包含“沉默”突变以添加或去除限制性酶位点，例如以促进核酸至特定表达载体内的克隆。
[0170] 载体
[0171] 提供了包含核酸分子的载体，所述核酸分子编码抗CCR2抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分。还提供了包含编码融合蛋白、修饰的抗体、抗体片段和其探针的核酸分子的载体。
[0172] 在一些情况下，将如本文所述获得的编码部分或全长轻链和/或重链的DNA插入表达载体，以便将基因可操作地连接至需要的表达控制序列例如转录和翻译控制序列，从而表达抗CCR2抗体或抗原结合部分。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植 物病毒例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC和EBV衍生附加体等。在一些情况下，将抗体基因连接入载体以便载体内的转录和翻译控制序列能够发挥它们期望的调控抗体基因的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以与使用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体或插入相同的表达载体。利用标准方法(例如，抗体基因片段与载体上的互补限制性位点的连接，或者如果不存在限制性位点则平端连接)将抗体基因插入表达载体。
[0173] 方便的载体是这样的载体，其编码功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，具有适当的经工程改造的限制性位点以便任何VH或VL序列可插入和表达，如本文所述的。在此类载体中，剪接通常在插入的J区中的剪接供体位点与人C结构域之前的剪接受体位点之间发生，也可在存在于人CH外显子中的剪接区域上发生。多腺苷酸化和转录终止在编码区下游的天然染色体位点上发生。重组表达载体还可编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆入载体以便信号肽符合读框地连接至免疫球蛋白链的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
[0174] 除了抗体链基因外，重组表达载体具有控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。本领域技术人员理解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于这样的因素例如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如来源于逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)，猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤和强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子的启动子和/或增强子。关于病毒调控元件和其序列的进一步描述，参见例如，美国专利5,168,062、美国专利4,510,245和美国专利4,968,615。用于在植物中表达抗体(包括启动子和载体的描述)以及植物的转化的方法，在本领域内是已知的。参 见，例如，美国专利6,517,529，其通过引用合并入本文。在细菌细胞或真菌细胞例如酵母细胞中表达多肽的方法在本领域内也是熟知的。
[0175] 除了抗体链基因和调控序列外，重组表达载体可携带另外的序列，例如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因帮助选择已向其中引入了载体的宿主细胞(参见例如，美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017，其通过引用合并入本文)。例如，通常选择标记基因为向其中引入了载体的宿主细胞提供对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于使用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶(GS)基因。
[0176] 非杂交瘤宿主细胞和重组产生蛋白质的方法
[0177] 编码抗CCR2抗体的核酸分子和包含此类核酸分子的载体可用于转染适当的哺乳动物、植物、细菌、昆虫或酵母宿主细胞。可以通过将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知的方法来进行转化。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法在本领域内是熟知的并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的封装和DNA至细胞核内的直接显微注射。此外，可利用病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞。转化细胞的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(其通过引用合并入本文)。转化植物细胞的方法在本领域内是熟知的，包括，例如农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、基因枪转化(biolistic transformation)、直接注射、电穿孔和病毒转化。用于转化细菌、昆虫细胞和酵母细胞的方法在本领域内也是熟知的。
[0178] 可获得作为用于表达的宿主的哺乳动物细胞系在本领域内是熟知的，其包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化的细胞系。特别地，此类细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、NSO细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如， Hep G2)、A549细胞和许多其他细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可使用的其他细胞系是昆虫细胞系例如Sf9或Sf21细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞并进行足以允许抗体在宿主细胞中表达或允许抗体分泌入培养宿主细胞的培养基中的时间来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化方法来从培养基回收抗体。植物宿主细胞包括例如烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。
细菌宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)和链霉菌属(Streptomyces)的种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。
细菌宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)和链霉菌属(Streptomyces)的种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。
[0179] 此外，可使用许多已知的技术来增强抗体从产生性细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于在某些条件下增强表达的常用方法。在与欧洲专利216846、256055、323997和338841相关的全部或部分中论述了GS系统。
[0180] 由不同细胞系或在转基因动物中表达的抗体可能具有彼此不同的糖基化。然而，由本文中提供的核酸分子编码的或包含本文中提供的氨基酸序列的所有抗体都是本公开内容的部分，无论抗体的糖基化如何。
[0181] 转基因动物和植物
[0182] 还可通过产生就目的免疫球蛋白重链和轻链序列进行转基因并且以可回收的形式从其产生抗体的哺乳动物或植物来转基因地产生抗CCR2抗体。关于哺乳动物中的转基因产生，可在山羊、牛或其他哺乳动物的奶中产生并且回收抗CCR2抗体。参见，例如，美国专利5,827,690，5,756,687，5,750,172和5,741,957(通过引用合并入本文)。在一些情况下，如本文中描述的，用CCR2或其免疫原性部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物。在例如美国专利6,046,037和5,959,177(通过引用合并入本文)中描述了用于在植物中产生抗体的方法。
[0183] 在一些情况下，通过利用标准转基因技术将一个或多个编码抗CCR2抗体的核酸分子引入动物或植物来产生非人转基因动物或植物。参见 Hogan和美国专利6,417,429，同上。用于产生转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞或体细胞或受精卵。转基因非人生物可以是嵌合的、非嵌合的杂合子和非嵌合的纯合子。参见，例如，Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual第2版，Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson等人，Mouse Genetics andTransgenics：A Practical Approach，Oxford University Press(2000)； 和 Pinkert，Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook，Academic Press(1999)，其全部通过引用合并入本文。在一些情况下，转基因非人动物具有被编码目的重链和/或轻链的靶向构建体靶向的破坏和置换。在一种情况下，转基因动物包含和表达编码重链和轻链的核酸分子，所述重链和轻链特异性结合CCR2，和优选(i)结合CCR2的第1和/或第2细胞外环；(ii)不结合CCR2的N末端或第3细胞外环或两者；或(iii)(i)和(ii)两者。在一种情况下，转基因动物包含和表达编码特异性结合人CCR2的重链和轻链的核酸分子。在一些情况下，转基因动物包含编码修饰的抗体例如单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体的核酸分子。可在任何转基因动物中产生抗CCR2抗体。在一种情况下，非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非人转基因动物在血液、奶、尿、唾液、眼泪、粘液和其他体液中表达所述编码的多肽。
[0184] 噬菌体展示文库
[0185] 提供了用于产生抗CCR2抗体或其抗原结合部分的方法，其包括步骤：在噬菌体上合成人抗体的文库，用CCR2或其部分筛选文库，分离结合CCR2的噬菌体，以及从噬菌体获得抗体。例如，用于制备抗体文库(其用于噬菌体展示技术)的一个方法包括步骤：用CCR2或其抗原性部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫应答，从免疫的动物提取抗体产生性细胞；从提取的细胞分离编码抗体的重链和轻链的RNA，逆转录RNA以产生cDNA，使用引物扩增cDNA，然后将cDNA插入噬菌体展示载体以便在噬菌体上表达抗体。可用该方法获得重组抗CCR2抗体。
[0186] 可通过筛选重组组合抗体文库来分离重组抗CCR2人抗体。文库可 以是使用从分离自B细胞的mRNA制备的人VL和VHcDNA产生的scFv噬菌体展示文库。用于制备和筛选此类文库的方法在本领域内是已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是可商购获得的(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，catalog no.27-9400-01；TM
和Stratagene SurfZAP 噬菌体展示试剂盒，catalog no.240612)。还存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其他方法和试剂(参见，例如，美国专利5,223,409；PCT公开案WO 92/18619、WO91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO
92/09690；Fuchs 等 人，Bio/Technology 9：1370-1372(1991)；Hay 等 人，Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85(1992)；Huse等人，Science 246：1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature348：552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993)；Hawkins 等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580(1992)；Garrad等人，Bio/Technology 9：
1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nuc.AcidRes.19：4133-4137(1991)；和Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991)，其全部通过引用合并入本文。
和Stratagene SurfZAP 噬菌体展示试剂盒，catalog no.240612)。还存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其他方法和试剂(参见，例如，美国专利5,223,409；PCT公开案WO 92/18619、WO91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO
92/09690；Fuchs 等 人，Bio/Technology 9：1370-1372(1991)；Hay 等 人，Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85(1992)；Huse等人，Science 246：1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature348：552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993)；Hawkins 等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580(1992)；Garrad等人，Bio/Technology 9：
1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nuc.AcidRes.19：4133-4137(1991)；和Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991)，其全部通过引用合并入本文。
[0187] 在一种情况下，为了分离和产生具有期望的特征的人抗CCR2抗体，首先使用PCT公开案WO 93/06213(其通过引用合并入本文)中描述的表位印迹法将本文中描述的人抗CCR2抗体用于选择具有对CCR2的相似结合活性的人重链和轻链序列。用于该方法的抗体文库可以是如PCT公开案WO 92/01047，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；和Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993)(其全部通过引用合并入本文)中所述制备和筛选的scFv文库。可使用人CCR2作为抗原来筛选scFv抗体文库。
[0188] 在选择了初始的人VL和VH结构域后，进行“混合和匹配(mix and match)”实验，其中就CCR2结合筛选初始选择的VL和VH区段的不同配对以选择优选的VL/VH配对组合。此外，为了进一步提高抗体的质量， 可在与体内体细胞突变过程(其在天然免疫应答过程中负责抗体的亲和力成熟)相似的过程中，随机突变优选的VL/VH对的VL和VH区段(优选在VH和/或VL的CDR3区域内)。可通过使用分别与VHCDR3或VLCDR3互补的PCR引物扩
增VH和VL结构域来完成该体外亲和力成熟，所述引物已在某些位点上用4种核苷酸碱基的随机混合物进行“搀杂”以便所得的PCR产物编码已将随机突变引入VH和/或VLCDR3区域的VH和VL区段。可就对CCR2的结合再筛选这些随机突变的VH和VL区段。
增VH和VL结构域来完成该体外亲和力成熟，所述引物已在某些位点上用4种核苷酸碱基的随机混合物进行“搀杂”以便所得的PCR产物编码已将随机突变引入VH和/或VLCDR3区域的VH和VL区段。可就对CCR2的结合再筛选这些随机突变的VH和VL区段。
[0189] 在从重组免疫球蛋白展示文库筛选和分离抗CCR2抗体后，可从展示包装(例如，从噬菌体基因组)回收编码所选择的抗体的核酸，然后通过标准重组DNA技术将其亚克隆入其他表达载体。需要时，还可操纵核酸以产生其他抗体形式，如本文中所描述的。为了表达通过筛选组合文库而分离的重组人抗体，如本文中所描述的，将编码抗体的DNA克隆入重组表达载体并且引入哺乳动物宿主细胞。
[0190] 种类转换(Class switching)
[0191] 另一个方面提供了将抗CCR2抗体的种类或亚类转换成另一个种类或亚类的方法。在一些情况下，使用本领域熟知的方法分离编码VL或VH的核酸分子，其不包含编码CL或CH的序列。然后将核酸分子可操作地连接至编码来自期望的免疫球蛋白种类或亚类的CL或CH的核苷酸序列。这可使用包含CL或CH链的载体或核酸分子来实现，如本文中所描述的。例如，可将本来是IgM的抗CCR2抗体种类转换成IgG。此外，种类转换可用于将一个IgG亚类转换成另一个亚类，例如将IgG1或IgG2转换成IgG4。用于产生抗体(其包括期望的同种型)的另一个方法包括步骤：分离编码抗CCR2抗体的重链的核酸和编码抗CCR2抗体的轻链的核酸，分离编码VH区的序列，将VH序列连接至编码期望的同种型的重链恒定结构域的序列，在细胞中表达轻链基因和重链构建体，然后收集具有期望的同种型的抗CCR2抗体。
[0192] 去免疫化的抗体
[0193] 在另一个方面，可使用例如PCT公开案WO98/52976和WO00/34317(其通过引用合并入本文)中描述的技术将抗体去免疫化以减小其免疫 原性。
[0194] 突变的抗体
[0195] 在另一个方面中，可将核酸分子、载体和宿主细胞用于产生突变的抗CCR2抗体。可在重链和/或轻链的可变结构域中突变抗体例如以改变抗体的结合性质。例如，可在一个或多个CDR中产生突变以增加或减少抗体对CCR2的KD，增加或减少koff，或改变抗体的结合特异性。定点诱变中的技术在本领域内是熟知的。参见，例如，Sambrook等人和Ausubel等人，同上。在另一种情况下，可在氨基酸残基(其在单克隆抗体4.40、4.9、4.22、4.39或
4.40A68G S230P中与种系相比较已知被改变)上产生一个或多个突变。可在可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中产生突变。在一种情况下，在可变结构域中产生突变。在一些情况下，在氨基酸残基(其在选自SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：47，SEQID NO：83，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：194或SEQ ID NO：113的氨基酸序列的可变结构域的CDR或构架区中与种系相比较已知被改变)上产生一个或多个突变。
4.40A68G S230P中与种系相比较已知被改变)上产生一个或多个突变。可在可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中产生突变。在一种情况下，在可变结构域中产生突变。在一些情况下，在氨基酸残基(其在选自SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：47，SEQID NO：83，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：194或SEQ ID NO：113的氨基酸序列的可变结构域的CDR或构架区中与种系相比较已知被改变)上产生一个或多个突变。
[0196] 在另一个方面中，突变构架区以便所得的构架区具有相应种系基因的氨基酸序列。可在构架区或恒定结构域中产生突变以增加抗CCR2抗体的半衰期。参见，例如，PCT公开案WO 00/09560，通过引用合并入本文。还可在构架区或恒定结构域中产生突变以改变或减少抗体的免疫原性，为与另一个分子的共价或非共价结合提供位点，添加或去除一个或多个糖基化位点或改变这样的性质例如补体结合、FcR结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。单个抗体可在可变结构域的任何一个或多个CDR或构架区中或在恒定结构域中具有突变。
[0197] 在一些情况下，与突变前的抗CCR2抗体相比较，突变的抗CCR2抗体的VH或VL结构域中存在1至8个(包括其间的任何数量)的氨基酸突变。在任何上述抗体中，突变可存在于一个或多个CDR中。此外，任一突变可以是保守氨基酸置换。在一些情况下，在恒定结构域中存在不超过5、4、3、2或1个氨基酸变化。
[0198] 修饰的抗体
[0199] 在另一个方面中，可产生包含连接至另一种多肽的抗CCR2抗体的全部或部分的融合抗体或免疫粘附素。在一种情况下，只将抗CCR2抗体的可变结构域连接至多肽。在另一种情况下，将抗CCR2抗体的VH结构域连接至第一多肽，同时以使VH和VL结构域可彼此相互作用以形成抗原结合位点的方式将抗CCR2抗体的VL结构域连接至与第一多肽结合的第二多肽。在另一种情况下，通过连接体将VH结构域与VL结构域分开以便VH和VL结构域可彼此相互作用(参见下文，单链抗体)。然后将VH-连接体-VL抗体连接至目的多肽。融合抗体可用于指导多肽至表达CCR2的细胞或组织。多肽可以是治疗剂例如毒素、趋化因子或其他调控蛋白，或可以是诊断剂，例如可容易地显现的酶例如辣根过氧化物酶。此外，可产生其中两个(或更多个)单链抗体彼此连接的融合蛋白。如果想要在单条多肽链上产生双价或多价抗体或如果想要产生双特异性抗体，这是非常有用的。
[0200] 为了产生单链抗体(scFv)，将编码VH和编码VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性连接体(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个片段，以便VH和VL序列可表达为连续单链蛋白，且VL和VH结构域通过柔性连接体连接。参见例如，Bird等人Science 242：423-426(1988)；Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)。如果只使用单个VH和VL，则单链抗体可以是单价的，如果使用两个VH和VL，则其可以是二价的，或如果使用2个以上的VH和VL，则其可以是多价的。可产生特异性结合CCR2和另一个分子的双特异性或多价抗体。
[0201] 在另一个方面中，可使用编码抗CCR2抗体的核酸分子制备其他修饰的抗体。例如，可按照本说明书的教导使用标准分子生物学技术制备“Kappa bodies”(Ill等人，Protein Eng.10：949-57(1997))、“微小抗体”(Martin等，EMBO J.13：5303-9(1994))、“双 抗 体”(Holliger 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)) 或“Janusins”(Traunecker 等，EMBO J.10：3655-3659(1991) 和 Traunecker 等，Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992))。
[0202] 可利用许多方法(包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接)产生双特异性抗体或抗原结合片段。参见，例如，Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：
315-321(1990)，Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。此外，可将双特异性抗体形成为“双抗体”或“Janusins”。在一些情况下，双特异性抗体结合CCR2的两个不同表位。在一些情况下，双特异性抗体具有来自单克隆抗体4.40、4.9或4.40 A68G S230P的第一重链和第一轻链以及另外的抗体的重链和轻链。在一些情况下，另外的轻链和重链也来自上文鉴定的单克隆抗体之一，但与第一重链和轻链不同。
315-321(1990)，Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。此外，可将双特异性抗体形成为“双抗体”或“Janusins”。在一些情况下，双特异性抗体结合CCR2的两个不同表位。在一些情况下，双特异性抗体具有来自单克隆抗体4.40、4.9或4.40 A68G S230P的第一重链和第一轻链以及另外的抗体的重链和轻链。在一些情况下，另外的轻链和重链也来自上文鉴定的单克隆抗体之一，但与第一重链和轻链不同。
[0203] 在一些情况下，使用来自本文中提供的人抗CCR2单克隆抗体的一个或多个可变结构域或CDR来制备本文中描述的修饰的抗体。
[0204] 衍生的和标记的抗体
[0205] 可衍生抗CCR2抗体或抗原结合部分或将其连接至另一个分子(例如，另一个肽或蛋白质)。一般地，衍生抗体或其部分以使CCR2结合不受衍生或标记不利地影响。因此，抗体和抗体部分旨在包括本文中描述的人抗CCR2抗体的原封不动(intact)的形式和修饰的形式。例如，可将抗体或抗体部分功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)至一个或多个其他分子实体，例如另一个抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、检测试剂、细胞毒性剂、药剂和/或可介导抗体或抗体部分与另一个分子的结合的蛋白质或肽(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)。
[0206] 通过交联两种或更多种抗体(相同类型或不同类型的，例如，以产生双特异性抗体)来产生一种类型的衍生抗体。合适的交联剂包括具有被适当的间隔子分隔的两个不同的反应性基团的异双功能的(例如，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的(例如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。此类交联剂可从Pierce Chemical Company，Rockford，II获得。
[0207] 另一种类型的衍生抗体是标记抗体。可用其衍生抗体或抗原结合部分的有用的检测试剂包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光 素、罗丹明、藻红蛋白、5-二甲胺基-1-萘磺酰氯、镧系元素磷光体等。抗体还可用用于检测的酶标记，所述酶例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶等。当用可检测的酶标记抗体时，通过加入另外的试剂(酶可用其产生可辨别的反应产物)来检测酶。例如，当提供试剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入导致可检测的有色反应产物。还可用生物素标记抗体，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合来对其进行检测。还可用预先确定的被第二报道分子识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，二抗的结合部分，金属结合结构域、表位标签)标记抗体。在一些情况下，通过不同长度的间隔臂连接标记以减小潜在的空间位阻。
[0208] 还可用放射性标记的氨基酸标记抗CCR2抗体。放射性标记可用于诊断和治疗目的。例如，放射性标记可用于通过X射线或其他诊断技术检测表达CCR2的肿瘤。此外，还可在治疗上将放射性标记用作癌细胞或肿瘤的毒素。用于多肽的标记物的实例包括但不限3 14 15 35 90 99 111 125 131
于下列放射性同位素或放射性核素--H、C、N、S、Y、Tc、 In、I和 I。
于下列放射性同位素或放射性核素--H、C、N、S、Y、Tc、 In、I和 I。
[0209] 还可用化学基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团衍生抗CCR2抗体。此类基团可用于改进抗体的生物学特征，例如用于增加血清半衰期或增加组织结合。
[0210] 在一些情况下，可用顺磁性、放射性或荧光离子或部分(其在成像后可检测)标记抗CCR2抗体。
[0211] 在一些情况下，顺磁性离子是铬(III)，锰(II)，铁(III)，铁(II)，钴(II)，镍(II)，铜(II)，钕(III)，钐(III)，镱(III)，钆(III)，钒(II)，铽(III)，镝(III)，钬(III)或铒(III)。在其他情况下，放射性离子是碘123，锝99，铟111，铼188，铼186，铜67，碘131，钇90，碘125，砹211和镓67。在其他情况下，用X射线显象剂例如镧(III)，金(III)、铅(II)和铋(III)标记抗CCR2抗体。
[0212] 药物组合物和试剂盒
[0213] 提供了包含具有拮抗剂性质的人抗CCR2抗体的组合物。此类组合物 可用于治疗其中CCR2具有作用的病症，包括但不限于肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、银屑病、炎性病症、变应性病症、自身免疫疾病、移植排斥病症、动脉粥样硬化、肥胖症、HIV感染、神经性疼痛、与缺血关联的炎症、狭窄和再狭窄、癌症、脓毒症、硬皮病和糖尿病。在一些情况下，治疗是对由丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或酒精诱导的脂肪性肝炎(ASH)的介导的肝纤维化的治疗。在一些情况下，受试者需要减少白细胞至组织例如为炎症应答的位置的组织内的浸润。在一些情况下，治疗的受试者是人。在其他情况下，受试者是兽医的受试者。需要减少炎症或减少白细胞浸润的组织的实例包括但不限于结缔组织、软骨、肝、肺、肾、神经组织包括脑、脊髓和周围神经组织、心脏、血管、食管、胃、小肠、大肠、结肠、前列腺、胰腺、泌尿道、卵巢、乳房、子宫、睾丸、阴茎、骨、肌肉、甲状腺、肾上腺、垂体、脂肪组织、骨髓、血液、胸腺、脾、淋巴结、皮肤、眼、耳或鼻。在一种情况下，组织是具有粘膜表面的组织。
[0214] 如本文中所使用的，“药学可接受的载体”是指生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的一些实例例如是水、盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等以及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学可接受的物质的另外的实例是湿润剂或少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或功效。
[0215] 组合物可以以多种形式存在，例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。形式取决于期望的施用模式和治疗应用。典型的组合物以可注射或可输注溶液的形式存在，例如与用于人的被动免疫的组合物相似的组合物。优选的施用模式是胃肠外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一种情况下，通过静脉内输注或注射施用抗体。在另一种情况下，通过肌内或皮下注射施用抗体。
[0216] 治疗组合物在制造和贮存条件下必须是无菌且稳定的。可将组合 物配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。可通过将抗CCR2抗体以需要的量与上面列举的成分之一或组合(需要时)一起掺入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和来自上文例举的成分的需要的其他成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自之前其灭菌过滤的溶液的任何另外想要的成分的粉剂。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持需要的颗粒大小，和通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可注射组合物的延长的吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来产生。
[0217] 可通过许多本领域内已知的方法施用抗体，虽然对于许多治疗应用，优选的施用途径/模式是皮下、肌内或静脉内输注。如本领域技术人员所理解的，施用的途径和/或模式可根据期望的结果而改变。其他施用模式包括腹膜内、支气管内、经粘膜(transmucosal)、脊柱内、滑膜内、主动脉内、鼻内、经眼、经耳、局部和口腔以及肿瘤内施用。
[0218] 在某些情况下，可使用载体制备抗体组合物的活性化合物，所述载体将保护抗体免于快速释放，例如控释制剂，包括埋植剂、透皮贴剂和微型胶囊递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已被授予专利或是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978)。
[0219] 还可将另外的活性化合物掺入组合物。在某些情况下，将抑制性抗CCR2抗体与一种或多种另外的治疗剂、诊断剂或预防剂共配制和/或共施用。治疗剂包括但不限于，具有不同的精细特异性的抗CCR2抗体、结合其他靶的抗体、光敏剂、雄激素、雌激素、非类固醇抗炎剂、抗高血压剂、镇痛剂、抗抑郁药、抗生素、抗癌剂、麻醉剂、止吐药、 抗感染剂、避孕药、抗糖尿病剂、类固醇、抗过敏剂、化学治疗剂、抗偏头痛剂、戒烟药(agents for smoking cessation)、抗病毒剂、免疫抑制剂、溶血栓剂、降胆固醇剂和抗肥胖剂(anti-obesity agent)。
[0220] 治疗剂还包括抑制CCR2的肽类似物、结合MCP-1、MCP-2、MCP-3或MCP-4并且阻止它们与CCR2结合的抗体或其他分子和抑制CCR2表达的试剂。在一种情况下，抑制CCR2表达的另外的试剂包括能够与CCR2mRNA杂交的反义核酸例如发夹RNA或siRNA。能够通过RNA干扰抑制基因功能的序列特异性核酸在本领域内是熟知的。此类联合治疗可需要更低剂量的抑制性抗CCR2抗体以及共施用的试剂，从而避免与各种单一治疗相关的可能的毒性或并发症。
[0221] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的治疗剂是抗微生物剂。抗微生物剂包括抗生素(例如，抗细菌剂)、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。抗微生物剂的非限定性实例是磺胺类、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、喹诺酮类、青霉素和头孢菌素。
[0222] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的治疗剂是趋化因子拮抗剂、CCR2拮抗剂、MCP-1拮抗剂或CCR5拮抗剂。CCR2拮抗剂或
MCP-1拮抗剂包括但不限于：抗MCP-1抗体(美国专利7,202,343、US2005/0025768、
US2006/0039913、US2006/0246069和US2004/004/0047860)；四氢吡喃基环戊基苯甲酰胺化合物(US2006/0116421)；heterrarylpperdine化合物(US2005/0250781)；哌啶基环戊基芳基苯甲酰胺化合物(US2006/0173013)；环胺化合物(美国专利6,140,349和
美国专利6,476,054)；环戊基化合物(US2002/0049222和美国专利6,545,023)；四氢吡喃基环戊基四氢吡啶并吡啶化合物(US2004/0167156，美国专利6,812,234和美国专利
7,230,008)；氨基环戊基融合的杂三环酰胺化合物(US2007/0004714)；哌啶基-α-氨基酰胺化合物(US2005/0250814)；取代的吡唑化合物(WO06/88813)；四氢吡喃基环戊基杂环酰胺化合物(US2006/0178363)；7和8员杂环环戊基苯甲酰胺化合物(US2006/0183731)；
苯并噁嗪基-酰胺基环戊基-杂环化合物(US2006/0069088)；3-氨基环戊烷羧酰
胺化合物(US2007/0149532)；含 氮杂环化合物(US2007/0155713)；三唑基苯基
bensenesulonamide化合物(WO08/10934)；取代的吡咯啉衍生物(US2004/0186140)；取代的苯甲酰胺和取代的氨基甲酸苯酯衍生物(美国专利7,087,604)；取代的环烷基胺化合物(US2005/0054626)；取代的二环烷基胺化合物(US2005/0227960)；吡咯烷酮和吡咯烷-硫酮化合物(US2003/0149081，美国专利6,727,275和美国专利6,936,633)；巯基咪唑化合物(US2007/0244138)；取代的二哌啶化合物(US2007/0197590)；苯氨基取代的季盐化合物(US2006/0293379)；二环和桥接氮杂环(US2006/0074121)；3-氨基环戊烷羧酰胺化合物(US2006/0020133)；3-(4-杂芳基环己基氨基)-环戊烷羧酰胺化合物(US2005/0267146)；
三唑并化合物(美国专利6,492,364)；杂芳基磺酰胺化合物(US2006/0173019)；芳基磺胺(美国专利6,939,885)；双-芳基磺胺(美国专利7,227,035和US2004/0167113)；取代的苯甲酰胺化合物(美国专利6,821,964)；取代的地西泮化合物(US2007/0249589)；三氮杂螺[5.5]十一烷衍生物(US2005/267114)；取代的哌啶羧酰胺化合物(US2003/0114443和US6,562,978)；苯并氮杂卓(benzazepine)衍生物(US2004/0235822和美国专利
7,262,185)；
MCP-1拮抗剂包括但不限于：抗MCP-1抗体(美国专利7,202,343、US2005/0025768、
US2006/0039913、US2006/0246069和US2004/004/0047860)；四氢吡喃基环戊基苯甲酰胺化合物(US2006/0116421)；heterrarylpperdine化合物(US2005/0250781)；哌啶基环戊基芳基苯甲酰胺化合物(US2006/0173013)；环胺化合物(美国专利6,140,349和
美国专利6,476,054)；环戊基化合物(US2002/0049222和美国专利6,545,023)；四氢吡喃基环戊基四氢吡啶并吡啶化合物(US2004/0167156，美国专利6,812,234和美国专利
7,230,008)；氨基环戊基融合的杂三环酰胺化合物(US2007/0004714)；哌啶基-α-氨基酰胺化合物(US2005/0250814)；取代的吡唑化合物(WO06/88813)；四氢吡喃基环戊基杂环酰胺化合物(US2006/0178363)；7和8员杂环环戊基苯甲酰胺化合物(US2006/0183731)；
苯并噁嗪基-酰胺基环戊基-杂环化合物(US2006/0069088)；3-氨基环戊烷羧酰
胺化合物(US2007/0149532)；含 氮杂环化合物(US2007/0155713)；三唑基苯基
bensenesulonamide化合物(WO08/10934)；取代的吡咯啉衍生物(US2004/0186140)；取代的苯甲酰胺和取代的氨基甲酸苯酯衍生物(美国专利7,087,604)；取代的环烷基胺化合物(US2005/0054626)；取代的二环烷基胺化合物(US2005/0227960)；吡咯烷酮和吡咯烷-硫酮化合物(US2003/0149081，美国专利6,727,275和美国专利6,936,633)；巯基咪唑化合物(US2007/0244138)；取代的二哌啶化合物(US2007/0197590)；苯氨基取代的季盐化合物(US2006/0293379)；二环和桥接氮杂环(US2006/0074121)；3-氨基环戊烷羧酰胺化合物(US2006/0020133)；3-(4-杂芳基环己基氨基)-环戊烷羧酰胺化合物(US2005/0267146)；
三唑并化合物(美国专利6,492,364)；杂芳基磺酰胺化合物(US2006/0173019)；芳基磺胺(美国专利6,939,885)；双-芳基磺胺(美国专利7,227,035和US2004/0167113)；取代的苯甲酰胺化合物(美国专利6,821,964)；取代的地西泮化合物(US2007/0249589)；三氮杂螺[5.5]十一烷衍生物(US2005/267114)；取代的哌啶羧酰胺化合物(US2003/0114443和US6,562,978)；苯并氮杂卓(benzazepine)衍生物(US2004/0235822和美国专利
7,262,185)；
[0223] 在选择的情况下，与CCR2抗体共配制或共施用的趋化因子拮抗剂是TM
SELZENTRY (Maraviroc)，其在化学上可描述为4，4-二氟-N-{(1S)-3-[exo-3-(3-异丙基-5-甲基-4H-1，2，4-三唑-4-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基]-1-苯丙基}环己
烷羧酰胺：
SELZENTRY (Maraviroc)，其在化学上可描述为4，4-二氟-N-{(1S)-3-[exo-3-(3-异丙基-5-甲基-4H-1，2，4-三唑-4-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基]-1-苯丙基}环己
烷羧酰胺：
[0224]
[0225] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的 治疗剂是CB-1受体拮抗剂。如本文中所使用的，术语″CB-1受体″是指G蛋白偶联1型大麻素受体。术语″拮抗剂″包括完全拮抗剂和部分拮抗剂以及反激动剂。CB-1受体拮抗剂对于CB-1受体可具有选择性。″CB-1受体选择性″意指该化合物不具有或几乎不具有拮抗大麻素-2受体(CB-2)的活性。CB-1拮抗剂对于CB-1受体的选择性可以是对于CB-2受体的选择性的至少约10倍。例如，用于拮抗CB-1受体的抑制性浓度(IC50)是用于拮抗CB-2受体的IC50的约1/10或更低。适当的CB-1受体拮抗剂包括公开于下列中的化合物：美国专 利 5,462,960；5,596,106；5,624,941；5,747,524；6,017,919；6,028,084；6,432,984；6,476,060；6,479,479；6,518,264和 6,566,356；美 国 专 利 公 开 案 2003/0114495；
2004/0077650；2004/0092520；2004/0122074；2004/0157838；2004/0157839；
2004/0214837；2004/0214838；2004/0214855；2004/0214856；2004/0058820；
2004/0235926；2004/0259887；2005/0080087；2005/0026983 和 2005/0101592；PCT 专利 公 开 案WO03/075660；WO 02/076949；WO 01/029007；WO 04/048317；WO 04/058145；
WO 04/029204；WO 04/012671；WO 03/087037；WO 03/086288；WO03/082191；WO
03/082190；WO 03/063781；WO 04/012671；WO 04/013120；WO 05/020988；WO 05/039550；
WO 05/044785；WO 05/044822和WO05/049615；2004年12月6日提交的PCT专利申请系列案PCT/IB2004/004050；2004年12月6日提交的PCT/IB2004/004017；2004年12月6日提交的PCT/IB2004/004023；和2004年12月6日提交的PCT/IB2004/004019；和2003年11月21日提交的美国临时申请案60/523937；2003年12月16日提交的60/529908；2003年
12月16日提交的60/529909；2003年12月16日提交的60/529910；2003年12月16日提
交的60/530012；和2004年4月21日提交的60/564648。所有上述专利和专利申请通过引用合并入本文。用于本方法的优选CB-1受体拮抗剂包括：利莫那班(SR141716A，在商标TM
名Acomplia 下也是已知的)，可从Sanofi-Synthelabo获得或可如美国专利5,624,941中所述制备；N-(哌啶-1-基)-1-(2，4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3- TM
羧酰胺(AM251)，可从Tocris ，Ellisville，MO获得；可如美国专利6,645,985中所述制备的[5-(4-溴苯基)-1-(2，4-二氯-苯基)-4-乙基-N-(1-哌啶基)-1H-吡唑-3-羧酰
胺](SR147778)；可如PCT专利公开案WO 03/075660中所述制备的N-(哌啶-1-基)-4，
5-二苯基-1-甲基咪唑-2-羧酰胺，N-(哌啶-1-基)-4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-氯苯
基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺，N-(哌啶-1-基)-4，5-二-(4-甲苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺，N-环己基-4，5-二-(4-甲苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺，N-(环己基)-4-(2，
4-二氯苯基)-5-(4-氯苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺和N-(苯基)-4-(2，4-二氯苯
基)-5-(4-氯苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺；可如美国专利公开案2004/0092520中所述制备的1-[9-(4-氯-苯基)-8-(2-氯-苯基)-9H-嘌呤-6-基]-4-乙氨基-哌啶-4-羧
酸的盐酸盐、甲磺酸盐和苯磺酸盐；可如美国专利公开案2004/0157839中所述制备的
1-[7-(2-氯-苯基)-8-(4-氯-苯基)-2-甲基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基]-3-乙氨基-吖丁啶-3-羧酸酰胺和1-[7-(2-氯-苯基)-8-(4-氯-苯基)-2-甲基-吡唑
并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基]-3-甲氨基-吖丁啶-3-羧酸酰胺；可如美国专利公开案2004/0214855中所述制备的3-(4-氯-苯基)-2-(2-氯-苯基)-6-(2，2-二氟-丙
基)-2，4，5，6-四氢-吡唑并[3，4-c]吡啶-7-酮、2-(2-氯-苯基)-3-(4-乙基-苯
基)-5-(2，2，2-三氟-乙基)-4，5-二氢-2H-吡咯并[3，4-c]吡唑-6-酮和2-(2-氯-苯基)-3-(4-异丙基-苯基)-5-(2，2，2-三氟-乙基)-4，5-二氢-2H-吡咯并[3，4-c]吡唑-6-酮；可如美国专利公开案2005/0101592中所述制备的3-(4-氯-苯基)-2-(2-氯-苯基)-7-(2，2-二氟-丙基)-6，7-二氢-2H，5H-4-氧杂-1，2，7-三氮杂-薁-8-酮；可如美国专利公开案2004/0214838中所述制备的2-(2-氯-苯基)-6-(2，2，2-三氟-乙
基)-3-(4-三氟甲基-苯基)-2，6-二氢-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；可如PCT专利公开案WO 02/076949中所述制备的(S)-4-氯-N-{[3-(4-氯-苯基)-4-苯基-4，5-二氢-吡
唑-1-基]-甲氨基-亚甲基}-苯磺酰胺(SLV-319)和(S)-N-{[3-(4-氯-苯基)-4-苯
基-4，5-二氢-吡唑-1-基]-甲氨基-亚甲基}-4-三氟甲基-苯磺酰胺(SLV-326)；可
如美国专利6,432,984中所述制备的N-哌啶-5-(4-溴苯基)-1-(2，4-二 氯苯基)-4-乙基吡唑-3-羧酰胺；可如美国专利6,518,264中所述制备的1-[双-(4-氯-苯基)-甲
基]-3-[(3，5-二氟-苯基)-甲烷磺酰基-亚甲基]-吖丁啶；可如PCT专利公开案WO
04/048317中所述制备的2-(5-(三氟甲基)吡啶-2-基氧基)-N-(4-(4-氯苯基)-3-(3-氰基苯基)丁烷-2-基)-2-甲基丙酰胺；可如美国专利5,747,524中所述制备的4-{[6-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1-苯并呋喃-3-基]羰基}苯基氰(LY-320135)；可如WO
04/013120中所述制备的1-[2-(2，4-二氯苯基)-2-(4-氟苯基)-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-磺酰基]-哌啶；和可如WO 04/012671中所述制备的[3-氨基-5-(4-氯苯基)-6-(2，
4-二氯苯基)-氟[2，3-b]吡啶-2-基]-苯基-甲酮。
2004/0077650；2004/0092520；2004/0122074；2004/0157838；2004/0157839；
2004/0214837；2004/0214838；2004/0214855；2004/0214856；2004/0058820；
2004/0235926；2004/0259887；2005/0080087；2005/0026983 和 2005/0101592；PCT 专利 公 开 案WO03/075660；WO 02/076949；WO 01/029007；WO 04/048317；WO 04/058145；
WO 04/029204；WO 04/012671；WO 03/087037；WO 03/086288；WO03/082191；WO
03/082190；WO 03/063781；WO 04/012671；WO 04/013120；WO 05/020988；WO 05/039550；
WO 05/044785；WO 05/044822和WO05/049615；2004年12月6日提交的PCT专利申请系列案PCT/IB2004/004050；2004年12月6日提交的PCT/IB2004/004017；2004年12月6日提交的PCT/IB2004/004023；和2004年12月6日提交的PCT/IB2004/004019；和2003年11月21日提交的美国临时申请案60/523937；2003年12月16日提交的60/529908；2003年
12月16日提交的60/529909；2003年12月16日提交的60/529910；2003年12月16日提
交的60/530012；和2004年4月21日提交的60/564648。所有上述专利和专利申请通过引用合并入本文。用于本方法的优选CB-1受体拮抗剂包括：利莫那班(SR141716A，在商标TM
名Acomplia 下也是已知的)，可从Sanofi-Synthelabo获得或可如美国专利5,624,941中所述制备；N-(哌啶-1-基)-1-(2，4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3- TM
羧酰胺(AM251)，可从Tocris ，Ellisville，MO获得；可如美国专利6,645,985中所述制备的[5-(4-溴苯基)-1-(2，4-二氯-苯基)-4-乙基-N-(1-哌啶基)-1H-吡唑-3-羧酰
胺](SR147778)；可如PCT专利公开案WO 03/075660中所述制备的N-(哌啶-1-基)-4，
5-二苯基-1-甲基咪唑-2-羧酰胺，N-(哌啶-1-基)-4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-氯苯
基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺，N-(哌啶-1-基)-4，5-二-(4-甲苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺，N-环己基-4，5-二-(4-甲苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺，N-(环己基)-4-(2，
4-二氯苯基)-5-(4-氯苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺和N-(苯基)-4-(2，4-二氯苯
基)-5-(4-氯苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺；可如美国专利公开案2004/0092520中所述制备的1-[9-(4-氯-苯基)-8-(2-氯-苯基)-9H-嘌呤-6-基]-4-乙氨基-哌啶-4-羧
酸的盐酸盐、甲磺酸盐和苯磺酸盐；可如美国专利公开案2004/0157839中所述制备的
1-[7-(2-氯-苯基)-8-(4-氯-苯基)-2-甲基-吡唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基]-3-乙氨基-吖丁啶-3-羧酸酰胺和1-[7-(2-氯-苯基)-8-(4-氯-苯基)-2-甲基-吡唑
并[1，5-a][1，3，5]三嗪-4-基]-3-甲氨基-吖丁啶-3-羧酸酰胺；可如美国专利公开案2004/0214855中所述制备的3-(4-氯-苯基)-2-(2-氯-苯基)-6-(2，2-二氟-丙
基)-2，4，5，6-四氢-吡唑并[3，4-c]吡啶-7-酮、2-(2-氯-苯基)-3-(4-乙基-苯
基)-5-(2，2，2-三氟-乙基)-4，5-二氢-2H-吡咯并[3，4-c]吡唑-6-酮和2-(2-氯-苯基)-3-(4-异丙基-苯基)-5-(2，2，2-三氟-乙基)-4，5-二氢-2H-吡咯并[3，4-c]吡唑-6-酮；可如美国专利公开案2005/0101592中所述制备的3-(4-氯-苯基)-2-(2-氯-苯基)-7-(2，2-二氟-丙基)-6，7-二氢-2H，5H-4-氧杂-1，2，7-三氮杂-薁-8-酮；可如美国专利公开案2004/0214838中所述制备的2-(2-氯-苯基)-6-(2，2，2-三氟-乙
基)-3-(4-三氟甲基-苯基)-2，6-二氢-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；可如PCT专利公开案WO 02/076949中所述制备的(S)-4-氯-N-{[3-(4-氯-苯基)-4-苯基-4，5-二氢-吡
唑-1-基]-甲氨基-亚甲基}-苯磺酰胺(SLV-319)和(S)-N-{[3-(4-氯-苯基)-4-苯
基-4，5-二氢-吡唑-1-基]-甲氨基-亚甲基}-4-三氟甲基-苯磺酰胺(SLV-326)；可
如美国专利6,432,984中所述制备的N-哌啶-5-(4-溴苯基)-1-(2，4-二 氯苯基)-4-乙基吡唑-3-羧酰胺；可如美国专利6,518,264中所述制备的1-[双-(4-氯-苯基)-甲
基]-3-[(3，5-二氟-苯基)-甲烷磺酰基-亚甲基]-吖丁啶；可如PCT专利公开案WO
04/048317中所述制备的2-(5-(三氟甲基)吡啶-2-基氧基)-N-(4-(4-氯苯基)-3-(3-氰基苯基)丁烷-2-基)-2-甲基丙酰胺；可如美国专利5,747,524中所述制备的4-{[6-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1-苯并呋喃-3-基]羰基}苯基氰(LY-320135)；可如WO
04/013120中所述制备的1-[2-(2，4-二氯苯基)-2-(4-氟苯基)-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-磺酰基]-哌啶；和可如WO 04/012671中所述制备的[3-氨基-5-(4-氯苯基)-6-(2，
4-二氯苯基)-氟[2，3-b]吡啶-2-基]-苯基-甲酮。
[0226] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的治疗剂是血管生成因子(angiogenic factor)。血管生成因子包括但不限于碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血管生成素(angiogenin)、转化生长因子α和β肿瘤坏死因子、血管形成素(angiopoietin)、血小板源性生长因子、胎盘生长因子、肝细胞生长因子和增殖蛋白(proliferin)。
[0227] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的治疗剂是溶血栓剂。溶血栓剂包括但不限于，尿激酶纤溶酶原激活物、尿激酶、链激酶、α2-纤溶酶抑制剂的抑制剂和纤溶酶原激活物抑制剂-1的抑制剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、螺内酯、组织纤溶酶原激活物(tPA)、白介素1β转化酶的抑制剂、抗凝血酶III等。
[0228] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的治疗剂是抗肥胖剂。抗肥胖剂包括但不限于，apo-B/MTP抑制剂、11β-羟基类固醇脱氢酶-1抑制剂、肽YY3-36或其类似物、MCR-4激动剂、CCK-A激动剂、单胺重摄取抑制剂、拟交感神经剂、β3肾上腺素能受体激动剂、多巴胺激动剂、促黑素细胞(melanocyte-stimulating)激素受体类似物、5-HT2c受体激动剂、黑色素聚集激素拮抗剂、瘦素、瘦素类似物、瘦素受体激动剂、甘丙肽拮抗剂、脂肪酶抑制剂、铃蟾肽激动剂、神经肽Y受体拮抗剂、拟甲状腺素药(thyromimetic agent)、脱氢表 雄甾酮或其类似物、糖皮质激素受体拮抗剂、食欲素(orexin)受体拮抗剂、高血糖素样肽1受体激动剂、睫状神经营养因子、人刺鼠相关蛋白(agouti-related protein)拮抗剂、饥饿激素(ghrelin)受体拮抗剂、组胺3受体拮抗剂或反激动剂(inverse agonist)和神经介素U(neuromedin U)受体激动剂。
[0229] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的治疗剂是抑制中性粒细胞和/或单核细胞至血管损伤位置的募集和/或附着的试剂。此类治疗剂可以例如抑制通过其介导细胞粘附、趋化作用和/或归巢(homing)的细胞表面分子的活性(例如，结合活性、信号转导活性)。例如，可将细胞粘附分子(例如，整联蛋白(例如，β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7、β8整联蛋白)，选择蛋白(例如，E-选择蛋白，P-选择蛋白，L-选择蛋白)，钙粘蛋白(例如，E-，P-，N-钙粘蛋白)和免疫球蛋白超家族粘附分子(例如，LFA-2、LFA-3、CD44))的拮抗剂和细胞因子受体的拮抗剂(例如，趋化因子受体功能的拮抗剂)与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用。此外，还可将结合细胞因子或趋化因子或细胞粘附分子的配体并且抑制配体与中性粒细胞和/或单核细胞上表达的受体的结合的试剂与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用。
[0230] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的治疗剂是心脏病治疗剂。意欲用于治疗心脏病的示例性治疗剂包括但不限于，生长因子、血管生成剂(angiogenic agent)、钙通道阻断剂、抗高血压剂、变力剂(inotropic agent)、抗动脉粥样硬化剂、抗凝血剂、β-阻断剂、抗心律失常剂(anti-arrhythmia agent)、强心苷类、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂和抑制原生动物感染的试剂和抗肿瘤剂。
[0231] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的心脏病治疗剂是钙通道阻断剂。钙通道阻断剂包括但不限于，二氢吡啶类例如硝苯地平、尼卡地平、尼莫地平等；苯并噻氮卓类例如地尔硫卓(dilitazem)；苯烷基胺例如维拉帕米；二芳基氨基丙胺醚类例如苄普地尔；和苯并咪唑取代的四氢化萘(benzimidole-substituted tetraline)例如米贝拉地尔。
[0232] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的心脏病治疗剂是抗高血压剂。抗高血压剂包括但不限于，利尿剂，包括噻嗪类例如氢氯噻嗪、呋塞米、螺内酯、氨苯喋啶和阿米洛利；抗肾上腺素能剂，包括可乐定、胍那苄、胍法辛、甲基多巴、曲美芬、利舍平、胍乙啶、胍那决尔、酚妥拉明、酚苄明、哌唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪、普萘洛尔(propanolol)、美托洛尔(methoprolol)、纳多洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、倍他洛尔、卡替洛尔、吲哚洛尔、醋丁洛尔、拉贝洛尔；血管扩张剂，包括肼苯哒嗪(hydralizine)、米诺地尔、二氮嗪、硝普钠；和血管紧张素转化酶抑制剂，包括卡托普利、贝那普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、喹那普利、雷米普利；血管紧张素受体拮抗剂例如氯沙坦；和钙通道拮抗剂，包括硝苯地平(nifedine)、氨氯地平、非洛地平XL、isadipine、尼卡地平、苯并噻氮卓类(例如，地尔硫卓)和苯烷基胺(例如维拉帕米)。
[0233] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的心脏病治疗剂是抗凝血剂。抗凝血剂包括但不限于肝素、华法林、水蛭素、蜱抗凝血肽、低分子量肝素例如依诺肝素、达肝素和阿地肝素(ardeparin)、噻氯匹定、达那肝素、阿加曲班、阿昔单抗和替罗非班。
[0234] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的心脏病治疗剂是抗心律失常剂。抗心律失常剂包括但不限于，钠通道阻断剂(例如，利多卡因、普鲁卡因胺、恩卡尼、氟卡尼等)、β肾上腺素能阻断剂(例如，普萘洛尔)、动作电位持续时间的延长剂(例如，胺碘酮)和钙通道阻断剂(例如，维拉帕米、地尔硫卓，氯化镍等)。心脏抑制药(例如，利多卡因)、心脏兴奋剂(例如，异丙肾上腺素、多巴胺、去甲肾上腺素等)和多种心脏病药物的组合(例如，治疗心房颤动的地高辛/奎尼丁)的递送也是有益的。
[0235] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的心脏病治疗剂是用于治疗充血性心力衰竭的试剂。用于治疗充血性心力 衰竭的试剂包括但不限于，强心苷、变力剂、细胞外袢利尿剂、噻嗪类利尿剂、保钾利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、硝基血管扩张剂、磷酸二酯酶抑制剂、直接血管扩张剂(direct vasodilator)、α1-肾上腺素能受体拮抗剂、钙通道阻断剂和拟交感神经剂。
[0236] 在某些特定的情况下，与抑制性抗CCR2抗体共配制和/或共施用的心脏病治疗剂是适合用于治疗心肌病的试剂，例如但不限于多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和去氧肾上腺素。
[0237] 还包括用于在哺乳动物中抑制病毒感染特别是HIV感染的组合物，其包含一定量的抗体和一定量的抗病毒剂，其中抗CCR2抗体和抗病毒剂的量一起在抑制病毒复制、新细胞的病毒感染或病毒载量中是有效的。许多抗病毒剂目前在本领域内是已知的，包括核苷类似物(例如，AZT、3TC和ddl)，蛋白酶抑制剂和趋化因子受体拮抗剂可抑制HIV感染但不抑制病毒感染。
[0238] 在另一个方面中，可将抗CCR2抗体或其片段与其他治疗剂例如抗炎药物或分子一起共施用至患有炎性病症例如关节炎，动脉粥样硬化或多发性硬化的患者。在一个方面中，提供了用于治疗哺乳动物的炎性病症的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的与抗炎剂组合的化合物。抗炎剂包括但不限于，任何已知的非类固醇抗炎剂例如水杨酸衍生物(阿司匹林)、对氨基苯酚衍生物(对乙酰氨基酚)、吲哚和茚乙酸(吲哚美辛)、杂芳基乙酸(酮咯酸)、芳基丙酸(布洛芬)、邻氨基苯甲酸(甲芬那酸)、烯醇酸(昔康类)和链烷酮(alkanone)(萘丁美酮)，和任何已知的类固醇抗炎剂，其包括皮质类固醇和具有生物学活性的合成的类似物(在其相关糖皮质类固醇(代谢的)和盐皮质激素(调节电解质的)活性方面)。在另一种情况下，将抗CCR2抗体与非类固醇抗炎药例如阿司匹林(Bayer，Bufferin)、布洛芬(Motrin，Advil)、萘普生钠(Aleve)、酮洛芬(Orudis KT)、吲哚美辛(Indocin)、依托度酸(Lodine)、双氯芬酸钠(Voltaren)、罗非考昔(Vioxx)、塞来考昔(Celebrex)、萘丁美酮(Relafen)组合或与类固醇例如泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍氯米 松、布地奈德、氟替卡松或曲安西龙组合施用。
[0239] 此外，用于治疗炎症的其他药物包括但不限于，拮抗剂例如所有组胺和缓激肽受体拮抗剂、白三烯和前列腺素受体拮抗剂以及血小板活化因子受体拮抗剂。在另一种情况下，将抗体或联合治疗与放射疗法、化学疗法、光动力疗法、手术或其他免疫疗法即靶向免疫系统的疗法一起施用。在另一种情况下，将抗体与另一种抗体一起施用。例如，可将抗CCR2抗体与已知抑制炎症的抗体或其他试剂例如抑制α-4整联蛋白(US2004/0009169)或IL-8受体(US2004/0037830)的抗体或试剂一起施用。可与抗CCR2抗体共施用的另外的抗体描述于美国专利6,6965,50；6,406,865；6,352,832和6,084,075(其内容通过引用合并入本文)中。
[0240] 组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的抗体或抗原结合部分。“治疗有效量”是指在剂量上和在所需的一段时间内有效地实现期望的治疗结果的量。治疗有效量的抗体或抗体部分可根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引发期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害效应被治疗有益效应超越的剂量。“预防有效量”是指在剂量上和在所需的一段时间内有效地实现期望的预防结果的量。通常，因为预防性剂量在疾病之前或在其早期用于受试者，因此预防有效量可低于治疗有效量。
[0241] 可调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗性或预防性应答)。例如，可施用单次团注，可在一段时间内施用几个分开的剂量或可根据治疗情况的紧迫性而相应地减少或增加剂量。以剂量单位形式配制胃肠外组合物对于施用的容易性和剂量的一致性是特别有利的。剂量单位形式，如本文中所使用的，是指用于待治疗的哺乳动物受试者的适合作为单元剂量的物理上分开的单位；各单位包含预先确定量的活性化合物，所述量经计算与需要的药物载体一起产生期望的治疗效果。剂量单位形式的规格(specification)受制于和直接取决于(a)抗CCR2抗体或其部分的独特特征和要获得的具体治疗或预防效果，以及(b)配制用于治疗个体的敏感性的此类抗体的领域中固有的限制。
[0242] 抗体或抗体部分的治疗有效量或预防有效量的示例性非限定性范围是0.025至50mg/kg，0.1至50mg/kg，0.1-25，0.1至10或0.1至3mg/kg。在一种情况下，将抗体以无菌水溶液形式的制剂施用，所述无菌水溶液具有范围在约5.0至约6.5之间的pH并且含有约1mg/ml至约200mg/ml的抗体，约1mM至约100mM的组氨酸缓冲剂，约0.01mg/ml至约
10mg/ml聚山梨酯80或聚山梨酯20，约100mM至约400mM的选自但不限于海藻糖或蔗糖的非还原性糖，约0.01mM至约1.0mM的EDTA二钠二水合物，以及除了螯合剂外，任选地包含药学可接受的抗氧化剂。适当的抗氧化剂包括但不限于甲硫氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶和铂。例如，组合物可以包含浓度范围在1mM至大约100mM之间，特别地为约27mM的甲硫氨酸。在一些情况下，制剂在20mM柠檬酸钠，pH 5.5，140mM NaCl和0.2mg/ml聚山梨酯80的缓冲液中包含5mg/ml的抗体。要指出的是，剂量值可随待缓解的病况的类型和严重度而变化。还应理解，对于任何特定的受试者，应当随时间根据个体需要以及施用或指导组合物的施用的人的专业判断来调整特定剂量方案，并且本文中所示的剂量范围只是示例性的并且无意限定所请求保护的组合物的范围或施用。
10mg/ml聚山梨酯80或聚山梨酯20，约100mM至约400mM的选自但不限于海藻糖或蔗糖的非还原性糖，约0.01mM至约1.0mM的EDTA二钠二水合物，以及除了螯合剂外，任选地包含药学可接受的抗氧化剂。适当的抗氧化剂包括但不限于甲硫氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶和铂。例如，组合物可以包含浓度范围在1mM至大约100mM之间，特别地为约27mM的甲硫氨酸。在一些情况下，制剂在20mM柠檬酸钠，pH 5.5，140mM NaCl和0.2mg/ml聚山梨酯80的缓冲液中包含5mg/ml的抗体。要指出的是，剂量值可随待缓解的病况的类型和严重度而变化。还应理解，对于任何特定的受试者，应当随时间根据个体需要以及施用或指导组合物的施用的人的专业判断来调整特定剂量方案，并且本文中所示的剂量范围只是示例性的并且无意限定所请求保护的组合物的范围或施用。
[0243] 另一个方面提供了包含抗CCR2抗体或抗原结合部分或含有这样的抗体或抗原结合片段的组合物的试剂盒。除了抗体或组合物以外，试剂盒还可包括诊断剂或治疗剂。试剂盒还可包括用于诊断或治疗方法的说明书以及包装材料，例如但不限于冰、干TM冰、STYROFOAM 、泡沫材料、塑料、塞璐玢、收缩包装、泡沫包装、卡纸板和淀粉花生(starch peanut)。在一种情况下，试剂盒包括抗体或包含抗体的组合物以及可用于本文中描述的方法的诊断剂。在另一种情况下，试剂盒包括抗体或包含抗体的组合物以及一种或多种可用于本文中描述的方法的治疗剂。
[0244] 提供了用于抑制哺乳动物的癌症的组合物和试剂盒，其包含一定量的抗体和一定量的化学治疗剂，其中化合物、盐、溶剂合物或前体药物的量以及化学治疗剂的量一起在抑制异常细胞生长中是有效的。许多化 学治疗剂目前在本领域内是已知的。在一些情况下，化学治疗剂选自有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、趋化因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答调节剂、抗激素例如抗雄激素和抗血管生成剂(anti-angiogenesis agent)。
[0245] 使用的诊断方法
[0246] 在另一个方面中，提供了诊断方法。抗CCR2抗体可用于体内或体外检测生物样品中的CCR2。在一种情况下，提供了用于在有此需要的受试者中诊断表达CCR2的细胞的存在或定位的方法，其包括步骤：将抗体注射入受试者，通过定位抗体结合的地方来确定CCR2在受试者中的表达，将受试者中的表达与正常参照受试者或标准的表达相比较，以及诊断细胞的存在或定位。抗CCR2抗体还可用作炎症和/或免疫细胞(例如单核细胞)至组织内的浸润的标志物。
[0247] 抗CCR2抗体可用于常规免疫测定，包括但不限于，ELISA、RIA、流式细胞术、组织免疫组织化学、Western印迹或免疫沉淀。抗CCR2抗体可用于检测来自人的CCR2。在另一种情况下，抗CCR2抗体可用于检测来自食蟹猴或猕猴的CCR2。在另一种情况下，抗CCR2抗体可用于检测来自啮齿类动物例如小鼠和大鼠的CCR2。
[0248] 还提供了用于检测生物样品中的CCR2的方法，其包括将生物样品与抗CCR2抗体接触，然后检测结合的抗体。在一种情况下，用可检测的标记物直接标记抗CCR2抗体。在另一种情况下，不标记抗CCR2抗体(一抗)，而是标记可结合抗CCR2抗体的二抗或其他分子。如本领域技术人员所熟知的，选择能够特异性结合特定类别和种类的一抗的二抗。例如，如果抗CCR2抗体是人IgG，则二抗可以是抗人IgG。可结合抗体的其他分子包括但不限于，蛋白A和蛋白G，其两者都可例如从Pierce Chemical Co商购获得。
[0249] 已在上文中公开了用于抗体或二抗的合适的标记物，其包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/ 生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；以及合适的125 131 35 3
放射性材料的实例包括 I、 I、S或 H。
放射性材料的实例包括 I、 I、S或 H。
[0250] 在其他情况下，可使用用可检测物质标记的CCR2标准和未标记的抗CCR2抗体通过竞争性免疫测定来测定生物样品中的CCR2。在该测定中，将生物样品、标记的CCR2标准和抗CCR2抗体组合，然后测定结合至未标记的抗体的经标记的CCR2标准的量。生物样品中CCR2的量与结合至抗CCR2抗体的经标记的CCR2标准的量成反比。
[0251] 可将上文中公开的免疫测定用于许多目的。例如，可将抗CCR2抗体用于检测培养的细胞中的CCR2。在一种情况下，将抗CCR2抗体用于测定已用不同化合物处理的细胞的表面上的CCR2的量。该方法可用于鉴定调控CCR2蛋白水平的化合物。根据该方法，用受试化合物处理一个细胞样品一段时间，同时让另一个样品不接受处理。如果要测量总CCR2的表达，则裂解细胞，使用本文中描述的免疫测定之一来测量总CCR2的表达。将经处理的细胞与未经处理的细胞中的总CCR2表达相比较以测定受试化合物的作用。
[0252] 用于测量总CCR2表达的优选免疫测定是流式细胞术或免疫组织化学。如果要测量细胞表面CCR2表达，则不裂解细胞，使用本文中描述的免疫测定之一测量CCR2的细胞表面水平。用于测定CCR2的细胞表面水平的优选免疫测定包括步骤：用可检测的标记物例如125
生物素或 I标记细胞表面蛋白，用抗CCR2抗体免疫沉淀CCR2，然后检测标记的CCR2。
生物素或 I标记细胞表面蛋白，用抗CCR2抗体免疫沉淀CCR2，然后检测标记的CCR2。
[0253] 用于确定CCR2的定位例如细胞表面水平的另一个免疫测定是使用免疫组织化学。用于检测CCR2的细胞表面水平的免疫测定包括：结合用适当的荧光团例如荧光素或藻红蛋白标记的抗CCR2抗体，然后使用流式细胞术检测一抗。在另一个情况中，不标记抗CCR2抗体，而标记可结合抗CCR2抗体的二抗或其他分子。方法例如ELISA、RIA、流式细胞术、Western印迹、免疫组织化学、膜蛋白质的细胞 表面标记以及免疫沉淀在本领域内都是熟知的。参见，例如，Harlow和Lane，同上。此外，为了就CCR2的激活或抑制检测大量化合物，可将免疫测定按比例放大以进行高通量筛选。
[0254] 抗CCR2抗体还可用于测定组织中或来源于组织的细胞中CCR2的水平。在一些情况下，组织是患病组织。在一些情况下，组织是活检组织。在本方法的一些情况下，从患者切取组织或其活检组织。然后组织或活检组织可用于免疫测定中以通过上述方法来测定例如总CCR2表达、CCR2的细胞表面水平或CCR2的定位。此类方法可用于确定组织是否表达高水平的CCR2，高水平的CCR2可表示组织是用抗CCR2抗体进行治疗的靶。
[0255] 还可将抗体用于体内鉴定表达CCR2的组织和器官。在一些情况下，抗CCR2抗体用于鉴定表达CCR2的细胞。
[0256] 该方法包括步骤：将可检测地标记的抗CCR2抗体或包含其的组合物施用给需要这样的诊断测试的患者，然后使患者经历成像分析以确定表达CCR2的组织的位置。成像分析在医学领域内是熟知的，其包括但不限于x射线分析、磁共振成像(MRI)或，计算机x射线断层摄影(computed tomography，CT)。可用适合于体内成像的任何试剂例如造影剂例如钡(其可用于x射线分析)或磁性造影剂例如钆螯合剂(其可用于MRI或CT)来标记抗99
体。其他标记试剂包括但不限于放射性同位素例如 Tc。在另一种情况下，不标记抗CCR2抗体，而可通过施用可检测的并且可结合抗CCR2抗体的二抗或其他分子来进行成像。在另一种情况下，从患者获得活检组织以确定目的组织是否表达CCR2。
体。其他标记试剂包括但不限于放射性同位素例如 Tc。在另一种情况下，不标记抗CCR2抗体，而可通过施用可检测的并且可结合抗CCR2抗体的二抗或其他分子来进行成像。在另一种情况下，从患者获得活检组织以确定目的组织是否表达CCR2。
[0257] 在一些情况下，可检测地标记的抗CCR2包含荧光团。在某些情况下，荧光团选自近红外荧光染料、二硝基苯基、荧光素和其衍生物、罗丹明、罗丹明的衍生物、藻红蛋白、TM TM藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺、TEXAS RED 、RHODAMI NE GREEN 、OREGON TM TM TM TM TM TM
GREEN 、CASCADE BLUE 、藻红蛋白、CY3 、CY5 、CY2 、CY7 、香豆素、红外线40、MR 200、TM TM TM TM
IRD 40、ALEXA FLUOR 、四甲基罗丹明、PACIFICBLUE 、SYBR 和BODIPY 。在另一种情TM
况下，荧光团包括下列化合物 之一(在括号中以nm标示它们的最大发射)：CY2 (506)、GFP(RedShifted)(507)、 (509)、 (509)、钙黄绿 素(517)、
FITC(518)、 (519)、 (520)、罗丹明110(520)、5-FAM(522)、OREGON
500(522)、OREGON 488(524)、 (525)、RHODAMINE
(527)、罗 丹明 123(529)、MAGNESIUM (531)、CALCIUM
(533)、 (533)、 (533)、JOE(548)、 530/550(550)、
Dil(565)、 (568)、 558/568(568)、 564/570(570)、
(570)、 546(570)、TRITC(572)、MAGNESIUM (575)、藻红蛋
白R&B(575)、罗丹明鬼笔环肽(575)、CALCIUM (576)、派洛宁Y(580)、罗丹
明B(580)、TAMRA(582)、RHODAMINE (590)、 (596)、ROX(608)、CALCIUM
TM TM
CRIMSON (615)、 594(615)、TEXAS RED (615)、Nile Red(628)、
(631)、 (631)、R-藻青蛋白(642)、C-藻青蛋白(648)、
TM
(660)、 (660)、DiD DilC(5)(665)、CY5 (670)、Thiadicarbocyanine(671)和
TM
Cy5.5 (694)。
GREEN 、CASCADE BLUE 、藻红蛋白、CY3 、CY5 、CY2 、CY7 、香豆素、红外线40、MR 200、TM TM TM TM
IRD 40、ALEXA FLUOR 、四甲基罗丹明、PACIFICBLUE 、SYBR 和BODIPY 。在另一种情TM
况下，荧光团包括下列化合物 之一(在括号中以nm标示它们的最大发射)：CY2 (506)、GFP(RedShifted)(507)、 (509)、 (509)、钙黄绿 素(517)、
FITC(518)、 (519)、 (520)、罗丹明110(520)、5-FAM(522)、OREGON
500(522)、OREGON 488(524)、 (525)、RHODAMINE
(527)、罗 丹明 123(529)、MAGNESIUM (531)、CALCIUM
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Dil(565)、 (568)、 558/568(568)、 564/570(570)、
(570)、 546(570)、TRITC(572)、MAGNESIUM (575)、藻红蛋
白R&B(575)、罗丹明鬼笔环肽(575)、CALCIUM (576)、派洛宁Y(580)、罗丹
明B(580)、TAMRA(582)、RHODAMINE (590)、 (596)、ROX(608)、CALCIUM
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TM
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Cy5.5 (694)。
[0258] 使用的治疗方法
[0259] 在另一个方面中，提供了通过给有此需要的患者施用抗CCR2抗体来抑制CCR2活性的方法。可治疗性使用本文中描述的任何类型的抗体。在不同的情况下，抗CCR2抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些情况下，抗体或其抗原结合部分结合CCR2的第1和/或第2细胞外环。抗体或其抗原结合部分优选不结合CCR2的第3细胞外环或N末端结构域。
[0260] 在另一种情况下，CCR2是人的并且患者是人患者。可选择地，患者可以是表达CCR2(抗CCR2抗体与其交叉反应)的哺乳动物。为了兽医目的或作为人疾病的动物模型，可将抗体施用给表达CCR2(抗体与其交叉反应)的非人哺乳动物。此类动物模型可用于评估抗体的治疗功效。
[0261] 在一个方面，提供了通过给受试者施用治疗有效量的抗CCR2抗体治 疗、帮助治疗、预防或帮助预防受试者的CCR2-介导的病症的方法。如本文中所使用的，术语“CCR2介导的病症”旨在包括这样的疾病和其他病症，其中已显示高水平的CCR2表达或活性在患有病症的受试者中的存在是或怀疑是造成病症的病理生理异常的原因或促成病症恶化的因素。此类病症可以例如通过下列得到证明：患有病症的受试者的受影响的细胞或组织中细胞表面上的CCR2水平增加，或细胞类型例如嗜碱性粒细胞、单核细胞或淋巴细胞中CCR2介导的活性增加(其促成病症的病理或促成病症的恶化)，或CCR2配体例如MCP-1的水平在炎性部位增加。可以例如使用抗CCR2抗体检测CCR2表达的增加。可通过G-蛋白激活的增加、F-肌动蛋白多聚化或表达CCR2的细胞的增加的趋化作用(例如响应MCP-1或其他CCR2配体的趋化作用)来检测CCR2活性的增加。
[0262] 在一个方面中，CCR2介导的病症的特征在于纤维化。术语“纤维化”，如本文中所使用的，是指特征在于响应组织损伤的纤维变性材料(例如，细胞外基质)的过度沉积和代谢的病理状况。在许多情况下，纤维化代表这样的正常修复过程(即，伤口愈合)，其由于慢性或过度组织损伤而出错，从而导致成纤维细胞或星形细胞活化和增殖以及胶原积累。纤维化病况包括，与血管疾病例如心脏病、脑病和外周血管病以及所有主要组织和器官系统例如眼、皮肤、肾、肺、肠和肝相关的纤维增生性病症(Wynn，Nature Reviews 4：583-594(2004)；Bataller，R和 Brenner，D.，J.Clin.Invest.115：209-218(2005))。 其他来源是化学治疗药物、辐射诱发的纤维化以及损伤和烧伤。虽然纤维化病况包括一大类病理状况，但据信对于大多数此类病况，导致纤维变性组织积累的一般机制具有许多共同的元素。通常病况响应炎性细胞的流入而被起始，然后被浸润细胞(例如，巨噬细胞、T细胞)与组织内的驻留细胞(resident cell)(例如，星形细胞、成肌纤维细胞、枯否细胞)之间的细胞因子信号转导途径保持。例如，已显示MCP-1在肺的几种疾病中起着重要作用(Rose CE Jr，Sung SS，Fu SM.Microcirculation 10：273-288(2003))并且CCR2缺陷小鼠被保护而免于发生肺纤维化(Moore BB，等人Protection from Pulmonary Fibrosis in the Absence of CCR2 Signaling.J.Immunol.167：4368-4377(2001))，这表明该受体在肺中的至关重要的作用。类似地，周细胞是参与硬皮病的发展的至关重要的纤维发生细胞类型并且已显示PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)减缓周细胞的增殖并且抑制患有该进行性疾病的患者的皮肤损伤。在肾中，白细胞浸润在介导慢性肾病中的肾小管间质性炎症和纤维化中起主要作用。Vielhauer和同事已确定，在梗阻性肾病的小鼠模型中，CCR2和
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CCR5在积累的巨噬细胞和CD 淋巴细胞上的表达与组织损伤的位置上的进行性纤维化相关(VielhauerV，等人J.Am.Soc.Nephrol.12：1173-1187(2001))。
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CCR5在积累的巨噬细胞和CD 淋巴细胞上的表达与组织损伤的位置上的进行性纤维化相关(VielhauerV，等人J.Am.Soc.Nephrol.12：1173-1187(2001))。
[0263] 如本文中所使用的，也将术语“纤维化”与“成纤维细胞积累和胶原沉积”同义地使用。成纤维细胞是结缔组织细胞，其分散在整个躯体的结缔组织中。成纤维细胞分泌含有I型和/或III型胶原的非刚性细胞外基质。响应对组织的损伤，附近的成纤维细胞或星形细胞迁移入伤口、增殖并且产生大量的胶原细胞外基质。胶原是富含甘氨酸和脯氨酸的纤维状蛋白，其为细胞外基质和结缔组织、软骨和骨的主要成分。胶原分子是称为α链的三链螺旋结构，其在绳状螺旋中彼此相互缭绕。胶原以几种形式或类型存在；其中，I型(最常见的)，发现于皮肤、腱和骨中；以及III型发现于皮肤、血管和内部器官中。示例性纤维化病况包括但不限于，与纤维化相关的肺病，例如，特发性肺纤维化、辐射诱发的纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、硬皮病、博来霉素诱发的肺纤维化、慢性哮喘，硅肺，石棉诱发的肺纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫(包括细菌性肺炎诱发的，创伤诱发的，病毒性肺炎诱发的，呼吸机诱发的，非肺性(non-pulmonary)脓毒症诱发的和吸入(aspiration)诱发的)；与损伤/纤维化(肾纤维化)相关的慢性肾病，例如，狼疮、糖尿病、硬皮病、肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化、IgA肾病、高血压、同种异体移植、狼疮和Alport；肠纤维化，例如，硬皮病和辐射诱发的肠纤维化；肝纤维化，例如，肝硬化，酒精诱发的肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胆管损伤，原发性胆汁性肝硬化，感染或病毒诱发的肝纤维化(例如慢性HCV感染)和自身免疫肝 炎；头颈纤维化，例如，辐射诱发的；角膜瘢痕形成，例如，TMLASIX 、角膜移植和小梁切除术(trabeculectomy)；肥厚性瘢痕形成和疤痕疙瘩，例如，烧伤诱发的和手术诱发的；和其他纤维化疾病，例如，肉瘤样病、硬皮病、脊髓损伤/纤维化、骨髓纤维化、血管再狭窄、动脉粥样硬化、韦格纳氏肉芽肿(Wegener′s granulomatosis)、混合性结缔组织病和佩罗尼氏病(Peyronie′s disease)。
[0264] 在一个方面，CCR2介导的病 症的特征在于病理炎症 (pathologicalinflammation)。术语″病理炎症″，如本文中所使用的，意指与病症关联的不适当的和/或慢性炎症，所述病症包括但不限于哮喘、动脉粥样硬化、AIDS痴呆、糖尿病、炎性肠病、类风湿性关节炎、移植排斥、移植物抗宿主病、多发性硬化(特别是抑制进一步脱髓鞘)、肿瘤、肿瘤转移、肾炎、特应性皮炎、银屑病、心肌缺血和慢性前列腺炎、肥胖症、代谢综合征。
此类炎症的特征在于加强的炎性细胞包括浸润白细胞的响应。随着时间流逝，这样的病理炎症通常导致对具有不适当炎症的区域中的组织的损害。因此，提供了治疗患有病理炎症的受试者的方法，包括给受试者施用治疗有效量的结合并且抑制CCR2的抗体或其抗原结合部分。
此类炎症的特征在于加强的炎性细胞包括浸润白细胞的响应。随着时间流逝，这样的病理炎症通常导致对具有不适当炎症的区域中的组织的损害。因此，提供了治疗患有病理炎症的受试者的方法，包括给受试者施用治疗有效量的结合并且抑制CCR2的抗体或其抗原结合部分。
[0265] 抗体或其抗原结合片段还可用于治疗其中牵涉趋化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4的结合对CCR2的激活的病症。
[0266] 拮抗性抗CCR2抗体或其抗原结合片段(例如，4.40和/或4.9或其抗原结合片段)可用于治疗炎性或变应性疾病和病症，包括变应性呼吸疾病例如哮喘、变应性鼻炎、超敏性肺疾病、超敏性肺炎、间质性肺疾病(ILD)(例如，特发性肺纤维化，或与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、系统性硬化、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、多肌炎或皮肌炎关联的ILD)、慢性阻塞性肺疾病、过敏反应或超敏反应、药物变态反应(例如，对青霉素、头孢菌素)、昆虫叮咬变态反应、炎性肠病例如克罗恩病和溃疡性结肠炎、脊柱关节病、硬皮病、银屑病和炎性皮肤病例如皮炎、湿疹、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、荨麻疹、血管炎(例如，坏死性、皮肤性和超敏性血管炎)。
[0267] 拮抗性抗CCR2抗体或其抗原结合片段(例如，4.40和/或4.9或其 抗原结合片段)可用于治疗自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于，阿狄森氏病(Addison′s Disease)、溶血性贫血、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎、皮炎、变应性脑脊髓炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture′s Syndrome)、格雷夫斯病(Graves′Disease)、多发性硬化、重症肌无力、神经炎、眼炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、多内分泌腺病、紫癜、赖特尔病(Reiter′s Disease)、僵人综合征、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性肺炎症、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、胰岛素依赖型糖尿病和自身免疫性炎性眼疾病。
[0268] 在某些情况下，用拮抗性抗CCR2抗体治疗的自身免疫性疾病是类风湿性关节炎(RA)。TH1病症RA是在高加索人中具有约1％的发病率的常见人自身免疫性疾病(Harris，B.J.等人，1997，In Textbook of Rheumatology 898-932)，其目前影响二百五十万美国人。RA的特征在于滑膜关节的慢性炎症和活化的T细胞、巨噬细胞和浆细胞的浸润，从而导致关节软骨的渐进性破坏。其是最严重的关节疾病形式。
[0269] 在另一个方面中，用拮抗性抗CCR2抗体治疗的自身免疫性疾病是多发性硬化(MS)。MS，也是TH1病症，是最常见的中枢神经系统(CNS)脱髓鞘病，其影响北美的
350,000(0.1％)个个体和全世界的110万个体。通常，MS被认为是部分由促炎CD4T(Th1)细胞和单核细胞介导的自身免疫性疾病，所述细胞识别与在抗原(Ag)呈递细胞(APC)上表达的MHC II类分子结合的特定髓磷脂多肽。
350,000(0.1％)个个体和全世界的110万个体。通常，MS被认为是部分由促炎CD4T(Th1)细胞和单核细胞介导的自身免疫性疾病，所述细胞识别与在抗原(Ag)呈递细胞(APC)上表达的MHC II类分子结合的特定髓磷脂多肽。
[0270] 拮抗性抗CCR2抗体或其抗原结合片段(例如，4.40和/或4.9或其抗原结合片段)还可用于治疗人I型或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，特征在于朗格汉斯胰岛中β细胞的自身免疫性破坏的疾病。β细胞的耗竭导致不能调节血液中的葡萄糖水平。在人中，在糖尿病的发作之前存在长的症状前时期(presymptomatic period)。在该时期，胰腺β细胞的功能逐渐丧失。疾病的发展与抗胰岛素、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酯酶IA2(IA2)的自身抗体的存在有关。
[0271] 拮抗性抗CCR2抗体或其抗原结合片段(例如，4.40和/或4.9或其 抗原结合片段)还可用于治疗神经性疼痛。已显示缺乏CCR2的小鼠具有减轻的神经性疼痛(Abbadie等人，Proc Natl Acad Sci U S A.100(13)：7947-52(2003))。如本文中所使用的，术语″神经性疼痛″意指由对神经的损伤而引起的疼痛。神经性疼痛与伤害性疼痛(其是由牵涉小的皮神经或肌肉或结缔组织中的小神经的急性组织损伤而引起的疼痛)不同。牵涉感受伤害的机制的疼痛在持续时间上通常限定于组织修复的时期并且通常可利用可获得的镇痛剂或阿片样物质缓解，如Myers，Regional Anesthesia 20：173-184(1995)中描述的。神经性疼痛通常是持久的或慢性的，并且通常在初始急性组织损伤后数天或数月发生。神经性疼痛可包括持久的自发性疼痛以及异常性疼痛(其是对通常非疼痛的刺激的疼痛响应)。神经性疼痛还可由痛觉过敏(其中存在对通常是轻微的疼痛刺激例如针刺的加重的响应)表征。
[0272] 拮抗性抗CCR2抗体可用于缓解由周围神经、背根神经节、脊髓、脑干、丘脑或皮层的病症而引起的神经性疼痛。所述方法可用于缓解神经性疼痛而无论疼痛的病因学。例如，所述方法可用于缓解由周围神经病症例如神经瘤；神经压迫；神经压碾(nerve crush)、神经牵张(nerve stretch)或不完全神经切断；单神经病或多神经病而引起的神经性疼痛。所述方法还可用于缓解由病症例如背根神经节压迫；脊髓的炎症；脊髓的挫伤、肿瘤或部分切除(hemisection)；脑干、丘脑或皮层的肿瘤；或对脑干、丘脑或皮层的创伤而引起的神经性疼痛。
[0273] 拮抗性抗CCR2抗体或其抗原结合片段(例如，4.40和/或4.9或其功能性片段)还可用于治疗动脉粥样硬化。动脉粥样硬化斑块在数十年内发展并且牵涉炎性细胞浸润、平滑肌细胞增殖、细胞外基质的积累、纤维帽形成和血管生成。(Bayes-Genis等人Circ.Res.86：125-130(2000))。趋化作用参与动脉粥样硬化的早期发展。细胞群体向血管壁的内部部分迁移并且引起新内膜，这导致动脉粥样硬化斑块的形成。例如，单核细胞趋化作用由单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)诱导，所述蛋白在损伤的动脉壁中在动脉粥样硬化发展的早期表达。(Furukawa等人Circ.Res.84：306-314(1999)；Han等人J.Lipid Res.40：1053(1999))。 来自CCR2-/-小鼠但非来自CCR2+/+小鼠的骨髓至ApoE3-Leiden小鼠
(对饮食诱导的动脉粥样硬化易感的小鼠品系)的移植减少了动脉粥样化形成，这表明经由CCR2的MCP-1信号转导促成动脉粥样硬化(Guo等人(2003)Arterioscler Thromb Vasc Biol.；23(3)：447-53)。因此，可给受试者施用CCR2拮抗性抗体，特别是结合CCR2的第1和/或第2细胞外环的拮抗性抗体，以减少动脉粥样硬化的发病率、治疗或帮助治疗动脉粥样硬化。
(对饮食诱导的动脉粥样硬化易感的小鼠品系)的移植减少了动脉粥样化形成，这表明经由CCR2的MCP-1信号转导促成动脉粥样硬化(Guo等人(2003)Arterioscler Thromb Vasc Biol.；23(3)：447-53)。因此，可给受试者施用CCR2拮抗性抗体，特别是结合CCR2的第1和/或第2细胞外环的拮抗性抗体，以减少动脉粥样硬化的发病率、治疗或帮助治疗动脉粥样硬化。
[0274] 拮抗性抗CCR2抗体或其抗原结合片段(例如，4.40和/或4.9或其抗原结合片段)还可用于治疗肥胖症。在肥胖症中，已显示脂肪组织包含大量单核细胞。此类单核细胞可促成脂肪沉积或通常与通常称为代谢综合征的肥胖症关联的各种后遗症的发展。代谢综合征包括这样的改变如糖尿病的发展。
[0275] 拮抗性抗CCR2抗体或其抗原结合片段(例如，4.40和/或4.9或其抗原结合片段)还可用于治疗脉管系统特别是动脉例如冠状动脉的狭窄或再狭窄，例如由血管介入(例如，手术性、治疗性或机械性介入)以及新内膜增生引起的狭窄或再狭窄。例如，通常引起血管腔开口狭窄的再狭窄可因血管损伤而引起，所述血管损伤包括但不限于由下列引起的血管损伤：血管移植操作、血管成形术，包括通过气囊进行的血管成形术、动脉粥样硬化斑块切除术、激光或其他适当的方法(例如经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA))、支架放置(例如，机械或生物学血管内支架置入)、血管旁路操作(vascular bypass procedure)或其组合以及用于治疗狭窄或闭塞的血管的其他方法。
[0276] 拮抗性抗CCR2抗体或其抗原结合片段(例如，4.40和/或4.9或其抗原结合片段)还可用于治疗移植排斥(例如，在移植中)，包括同种异体移植排斥或移植物抗宿主病和器官移植相关动脉硬化。
[0277] 作为CCR2的拮抗剂的抗体和其抗原结合片段可用作治疗HIV感染的治疗剂。+
HIV-1和HIV-2是人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体。AIDS部分因CD4T淋巴细
胞在HIV感染的个体中耗竭而引起。HIV-1主要感染T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞和在中枢神经系统中， 小胶质细胞。所有此类细胞都表达CD4糖蛋白，其用作HIV-1和HIV-2的受体。HIV至靶细胞内的有效进入依赖于病毒外部包膜糖蛋白gp120与氨基端CD4结构域的结合。
HIV-1和HIV-2是人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体。AIDS部分因CD4T淋巴细
胞在HIV感染的个体中耗竭而引起。HIV-1主要感染T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞和在中枢神经系统中， 小胶质细胞。所有此类细胞都表达CD4糖蛋白，其用作HIV-1和HIV-2的受体。HIV至靶细胞内的有效进入依赖于病毒外部包膜糖蛋白gp120与氨基端CD4结构域的结合。
[0278] 此外，已显示CCR2充当HIV-1的共受体(Frade等人(1997)J Clin Invest.；100(3)：497-502)。在病毒结合后，HIV-1包膜糖蛋白介导病毒和宿主细胞膜的融合，从而完成进入过程。由被感染的细胞表面上表达的HIV-1包膜糖蛋白指导的膜融合导致细胞间融合，从而导致合胞体。
[0279] 作为CCR2的拮抗剂的抗体和其抗原结合片段可用作治疗多种眼科病症包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、葡萄膜炎和角膜感染的治疗剂。
[0280] 年龄相关性黄斑变性(AMD)
[0281] 已显示CCR2在脉络膜新血管生成(CNV)的发展中的巨噬细胞的募集(其在年龄相关性黄斑变性患者以及血管样条纹、高度近视、眼组织胞浆菌病患者中观察到)中起着重要作用(Tsutsumi，C.等人Journal of Leukocyte Biology 74：25-32，2003)。
[0282] 葡萄膜炎
[0283] 已在患有急性特发性前葡萄膜炎(Yeo，TK，等人Cytokine 35：29-352006)和特发性免疫介导的后段葡萄膜炎(Ahad，MA，等人MolVis 13：388-3962007)的患者中证明了CCR2的单核苷酸多态性与其配体(MCP-1)之间的相关性。
[0284] 角膜感染(细菌性)：
[0285] 已显示CCL2在角膜感染期间在多形核中性粒细胞(PMN)募集的调控中起着重要作用(Xue，M.L，等人Immunology and Cell Biology 85：525-5312007)。虽然PMN是在角膜中消除细菌和促进伤口愈合所必需的，但此类细胞的持久存在可导致慢性炎性疾病。
[0286] 作为CCR2的拮抗剂的抗体和其抗原结合片段可用作治疗剂用于治疗多种实体瘤和癌症，包括慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、恶性骨髓瘤、何杰金氏病以及前列腺、膀胱、乳腺、宫颈、结肠、肺、肝或胃实体瘤和癌症。
[0287] 前列腺癌
[0288] 已显示MCP-1用作前列腺癌生长和浸润的旁分泌和自分泌因子(Lu，Y.等人The Prostate 66：1311-1318，2006)并且已显示CCR2的表达与前列腺癌进展相关(Lu，Y.等人Journalof cellular biochemistry101：676-685，2007)。已显示中和性抗MCP-1抗体的全身性递送诱导小鼠中前列腺癌肿瘤的消退(Loberg，R.D.，Cancer Res 67：
9417-94242007)。
9417-94242007)。
[0289] 乳腺癌
[0290] 肿瘤相关巨噬细胞据认为在肿瘤免疫监督和发展中起着至关重要的作用，并且淋巴细胞的活化和募集受趋化因子包括MCP-1调节。已在乳腺癌中显示对于CCR2多态性的显著相关性(Zafiropoulos，A.，N.等人Journal of medical genetics 41：e592009)。还已显示CCL2/CCR2途径在骨髓样抑制细胞至癌症包括乳腺癌、卵巢癌和胃癌的募集(这促进肿瘤进展、血管生成和vasculoangiogenesis)中起着中枢作用(Huang，B.，等人Cancer letters 252：86-92，2007)。
[0291] 黑色素瘤
[0292] 还已显示MCP-1功能的阻断在小鼠中抑制肿瘤相关巨噬细胞的募集并且阻止肿瘤血管生成和恶性黑色素瘤的生长(Koga，M.等人Biochemical and biophysical research communications 365：279-284，2008)。
[0293] 肝癌
[0294] 已显示CCR2的阻断减少了肝星形细胞(基质金属蛋白酶2的主要来源，其在肝肿瘤形成过程中促进了新血管形成)的运输(Yang，X.等人International journal of cancer 118：335-345，2006)。
[0295] 宫颈癌
[0296] 已显示CCR2在巨噬细胞募集(其在来自鳞状表皮内病损的宫颈瘤的发展中导致肿瘤血管生成)中起着重要作用(Coelho，A.，等人Gynecologic oncology 96：760-764，2005；Coelho，A.，等人Gynecologic and obstetric investigation 64：208-212，2007)。
[0297] 卵巢癌
[0298] 已显示CCL2/CCR2途径在骨髓样抑制细胞至癌症包括乳腺癌、卵巢癌和胃癌的募集(这促进了肿瘤进展、血管生成和vasculoangiogenesis)中起着中枢作用(Huang，B.，等人Cancer letters 252：86-92，2007)。
[0299] 可施用抗体一次或多次。可以以每天4次至每6个月或更长时间1次施用抗体。施用可以按计划进行，例如每天3次，每天2次，每天1次，每2天1次，每3天1次，每周1次，每2周1次，每个月1次，每2个月1次，每3个月1次和每6个月1次。还可通过微型泵(minipump)连续施用抗体。可通过粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、胃肠外、瘤内或局部途径施用抗体。可局部或全身性施用抗体。
[0300] 可施用抗体1次，至少2次或进行至少一段时间直至病况得到治疗、缓解或治愈。通常将抗体作为本文中描述的药物组合物的一部分来施用。抗体的剂量通常在0.1至100mg/kg、0.5至50mg/kg、1至20mg/kg或1至10mg/kg的范围内。抗体的血清浓度可通过本领域已知的任何方法来测量。
[0301] 下列实施例仅用于举例说明并且不被解释为以任何方式限定范围。
[0302] 实施例1
[0303] 产生抗CCR2抗体的杂交瘤的产生
[0304] 在小鼠后足垫中利用用CCR2B(Genbank MN000648，SEQ ID NO：204)转染7 TM
的300-19细 胞 (10 个 细 胞/剂 量 /小 鼠，于 TITERMAX Gold Adjuvant，Sigma，Catalog#T2684，lot#K1599中；制备50/50体积)免疫产生人IgG2和IgG4抗体的8至10TM
周龄XENOMOUSE 小鼠。小鼠在3至8周的时间内接受5至9次在Aluminium Phosphate
Gel Adjuvant(Catalog#1452-250，batch#8937，HCI Biosector(5ul/小鼠/加强))和TM
qCpG(IMMUNEASY Mouse Adjuvant)(Catalog#303101；lot#11551249；Qiagen(15ul/小鼠/加强))中的加强注射。在融合前4天，给小鼠提供于PBS中的最后的注射。收
集经免疫的小鼠的脾和淋巴结淋巴细胞，将其与非分泌型骨髓瘤P3-X63-Ag8.653细
胞系融合。将融合的细胞经历如之前所述的HAT选择(Galfre和Milstein,Methods
Enzymol.73:3-46(1981))。回收全部分泌CCR2-特异性人抗体的一组杂交瘤。就与CCR2的结合鉴定许多抗体，如通过FACS分析评估的。选择杂交瘤用于进一步研究，其中一些杂交瘤列于表6中。
的300-19细 胞 (10 个 细 胞/剂 量 /小 鼠，于 TITERMAX Gold Adjuvant，Sigma，Catalog#T2684，lot#K1599中；制备50/50体积)免疫产生人IgG2和IgG4抗体的8至10TM
周龄XENOMOUSE 小鼠。小鼠在3至8周的时间内接受5至9次在Aluminium Phosphate
Gel Adjuvant(Catalog#1452-250，batch#8937，HCI Biosector(5ul/小鼠/加强))和TM
qCpG(IMMUNEASY Mouse Adjuvant)(Catalog#303101；lot#11551249；Qiagen(15ul/小鼠/加强))中的加强注射。在融合前4天，给小鼠提供于PBS中的最后的注射。收
集经免疫的小鼠的脾和淋巴结淋巴细胞，将其与非分泌型骨髓瘤P3-X63-Ag8.653细
胞系融合。将融合的细胞经历如之前所述的HAT选择(Galfre和Milstein,Methods
Enzymol.73:3-46(1981))。回收全部分泌CCR2-特异性人抗体的一组杂交瘤。就与CCR2的结合鉴定许多抗体，如通过FACS分析评估的。选择杂交瘤用于进一步研究，其中一些杂交瘤列于表6中。
[0305] 根据布达佩斯条约的条款，将示于表2中的杂交瘤保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209。杂交瘤已被赋予下列登录号：
[0306] 表2
[0307]
[0308] 实施例2
[0309] 抗CCR2抗体的测序
[0310] 为了分析产生的抗体的结构，从产生抗CCR2单克隆抗体的杂交瘤克隆编码包含重链和轻链可变结构域的片段的核酸。克隆CCR2抗体的轻链和重链并进行序列验证，如下文用4.40.2抗体进行举例说明的：
[0311] 使用RNEASYTM MINI KIT(Qiagen)分离Poly(A)+mRNA，使用ADVANTAGERT-for-PCR试剂盒(BD Biosciences)，利用oligo(dT)引物从mRNA合成cDNA。使用表3中所列的引物扩增克隆4.40.2的oligo(dT)引发的cDNA。使用PFUULTRA HIGH-FIDELITY
Polymerase(Stratagene)和PTC-200DNA Engine(MJ Research)，利用如下的循环进行扩增：在95℃下进行2分钟；25X(在95℃下进行20秒,在55℃下进行30秒,在72℃下进行
30秒)；在72℃下进行10分钟。将PCR扩增子克隆入重链和轻链表达载体。然后使用标准th
方案将载体转化入MAX EFFICIENCY DH5α化学感受态细胞(Invitrogen)。使用Grills16 BDTv3.1/dGTP化学药品(Applied Biosystems Inc)和3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc)验证克隆的序列。根据抗体的核苷酸序列和预测的氨基酸序列，鉴定TM TM
每一个抗体链的基因利用(gene usage)。使用MACVECTOR 和GENEWORKS 软件程序
(Oxford Molecular Group，Campbell，CA，USA)进行与“V Base sequence directory”(MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK；Tomlinson，等人，J.Mol.Biol.，227，
776-798(1992)；Hum.Mol.Genet.，3，853-860(1994)；EMBO J.，14，4628-4638(1995))的比对。
Polymerase(Stratagene)和PTC-200DNA Engine(MJ Research)，利用如下的循环进行扩增：在95℃下进行2分钟；25X(在95℃下进行20秒,在55℃下进行30秒,在72℃下进行
30秒)；在72℃下进行10分钟。将PCR扩增子克隆入重链和轻链表达载体。然后使用标准th
方案将载体转化入MAX EFFICIENCY DH5α化学感受态细胞(Invitrogen)。使用Grills16 BDTv3.1/dGTP化学药品(Applied Biosystems Inc)和3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc)验证克隆的序列。根据抗体的核苷酸序列和预测的氨基酸序列，鉴定TM TM
每一个抗体链的基因利用(gene usage)。使用MACVECTOR 和GENEWORKS 软件程序
(Oxford Molecular Group，Campbell，CA，USA)进行与“V Base sequence directory”(MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK；Tomlinson，等人，J.Mol.Biol.，227，
776-798(1992)；Hum.Mol.Genet.，3，853-860(1994)；EMBO J.，14，4628-4638(1995))的比对。
[0312] 表3：设计用于扩增4.40.2的可变结构域引物(5′至3′)
[0313]
[0314] 表4显示了选择的杂交瘤抗体克隆的基因利用。
[0315] 表4：重链和轻链的基因利用
[0316]
[0317] 在IgG4小鼠中产生杂交瘤克隆，并且一旦获得序列，将可变结构域克隆入IgG1、IgG2和IgG4形式的表达载体以进行比较。
[0318] 实施例3
[0319] 抗CCR2抗体的诱变
[0320] 轻链可变区中至种系序列的恢复
[0321] 如下通过定点诱变将CCR24.40.2的轻链中位置68上的丙氨酸残基 恢复至种系TM残基甘氨酸。使用表5中的引物进行氨基酸残基68的密码子中的点突变。使用QUIKCHANGE II Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)，利用标准方案进行定点诱变，所述方案包括对循环的下列改动：在96℃进行2分钟；16X(在96℃下进行50秒，在68℃下进行10秒)；在68℃下进行10分钟。将经诱变的载体转化入XL1-Blue超级感受态细胞th
(supercompetent cell)。为了证实诱变是成功的，使用Grills16 BDTv3.1/dGTP化学药品(Applied Biosystems Inc.)和3730xl DNAAnalyzer(Applied Biosystems Inc.)测定克隆的序列。
(supercompetent cell)。为了证实诱变是成功的，使用Grills16 BDTv3.1/dGTP化学药品(Applied Biosystems Inc.)和3730xl DNAAnalyzer(Applied Biosystems Inc.)测定克隆的序列。
[0322] 表5：诱变引物(5′至3′)
[0323]
[0324] *改变的核苷酸以粗体和下划线标示。
[0325] 所得的抗体称为4.40A68G(SEQ ID NO：112)，其在轻链可变区的位置68处具有甘氨酸。
[0326] 具有铰链稳定性突变的IgG4重链恒定区的产生
[0327] 从pCON-G4(pro)(Lonza，Basel，Switzerland)衍生的IgG4表达载体分离IgG4重链恒定区，所述恒定区在IgG4L309同种异型(Brusco A.等人，Eur J.Immunogenticsl 25：349-355(1998))的背景中在氨基酸230处具有从种系丝氨酸至脯氨酸的铰链区稳定性突变(Angal，S.等人Molecular Immunology 30：105-108(1993))。
[0328] 使用下列扩增引物，通过PCR诱变将沉默突变(Lys，AAG→AAA)引入pCON-G4(pro)载体的G4CH1外显子的第11个核苷酸残基，以除去ApaI识别位点，从而促进亚克隆：
[0329] G4_Forward
[0330] ttatgctgggcccagctctgtcccacaccgcggtcacatggcaccacctctcttgcaGCTTCCACCAAAGGCCCATCCGTCTTCCCCC(SEQ ID NO：153)
[0331] (杂交碱基以大写字母标示(CH1的残基#11的突变以粗体标示)；非杂交碱基以小写字母标示)
[0332] G4_Reverse：
[0333] tcatattctctagaTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAGG(SEQ ID NO：154)
[0334] (杂交碱基以大写字母标示。具有XbaI位点的非杂交碱基以小写字母标示)
[0335] 使用Expand Hi-Fi Polymerase(Roche)和PTC-200 DNA ENGINETM(MJResearch)，利用如下热循环进行扩增：在95℃下进行3分钟；22X(在95℃下进行20秒，在58℃下进行30秒，在72℃下进行2分10秒)；在72℃下进行10分钟。
[0336] 使用下列引物通过PCR诱变在pCON-G4(pro)载体的G4CH1外显子的核苷酸残基209处引入另一个沉默突变(Thr，ACC→ACA)以除去BstEII位点，从而便于使用该酶将可变区亚克隆入表达载体：
[0337] G4delBst_F
[0338] CAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCAG(SEQ ID NO：155)
[0339] G4delBst_R
[0340] CTGCTGGAGGGCACTGTCACCACGCTG(SEQ ID NO：156).
[0341] 使用QUIKCHANGETM Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)和PTC-200 DNA Engine(MJ Research)，利用如下热循环来进行扩增：在96℃下进行1分钟；14X(在96℃下进行50秒，在68℃下进行15分钟48秒)；在72℃下进行10分钟。
[0342] 然后将称为S230P的包含铰链区突变和2个沉默突变的所得的IgG4恒定区作为ApaI/XbaI片段亚克隆入DHFR抗体表达载体的ApaI/XbaI位点。然后将4.40.2抗体的重链可变区克隆入包含G4S230P恒定区的表达载体，从而产生全长重链构建体。具有轻链可变区A68G种系置换和重链铰链区S230P置换的4.40衍生的抗体被称为4.40 A68G S230P，其具有SEQ ID NO：112的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：116的重链氨基酸序列。
[0343] 收集来自用表达载体转染的细胞的上清液，利用标准蛋白A亲和层析进行纯化以分离重组免疫球蛋白。然后利用SDS-PAGE、光散射和分光光度法来表征此类蛋白质。
[0344] 实施例4
[0345] 体外结合
[0346] 图1显示AF-488缀合的抗体4.40A68G S230P与全血中的人单核细胞(图1A)、与CCR2-转染的300-19细胞(图1B)的体外结合以及不同浓度的4.40A68G S230P抗体与CCR2-转染的300-19的细胞的结合(如使用抗人PE检测的)(图1C)。简而言之，使用含有2％的热灭活的胎牛血清和0.002％的叠氮化钠的Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline，用测试抗体对100ul体积中的1百万个细胞进行染色。15分钟后，加入第二检测抗体。30分钟后，在缓冲液中洗涤细胞，将其重悬浮于500ul中，并在FACS CALIBUR上就染色对其进行评估。评估总共10,000个事件/管。将每一个抗体浓度的平均通道荧光强度评估为染色量级的指标。
[0347] 实施例5
[0348] 抗CCR2单克隆抗体的亲和常数(KD)的测定
[0349] 为了评估抗体对于CCR2的KD，在3小时的测定中利用FACS评估抗体与表达CCR2的300-19细胞的结合。简而言之，使用含有2％的热灭活的胎牛血清、0.002％叠氮化钠和0.005mg/ml细胞松弛素B(Sigma 6762)的Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline缓冲液，用测试抗体对100ul体积中的1百万个细胞进行染色。15分钟后，加入第二检测抗体R-藻红蛋白缀合的亲和纯化F(ab′)片段驴抗人IgG H+L(Jackson709-116-149)。将管在室温下轻轻振荡3小时。在缓冲液中洗涤2次后，将细胞重悬浮于500ul缓冲液中并且在TM
FACS CALIBUR 上进行评估。评估总共10,000个事件/管。将每一个抗体浓度的平均通道荧光强度评估为染色量级的指标。此类结合研究显示，4.40A68G S230P抗体以0.085ug/mL(0.58nM)的KD结合转染的细胞上的人CCR2(图2)。当在表达具有CCR2的第1和第2细胞外环的CCR2/CCR5嵌合受体的细胞上评估饱和结合时(参见实施例7)，如图6C中所示，获得相似的浓度曲线和KD(KD＝0.023ug/mL(0.16nM))。
FACS CALIBUR 上进行评估。评估总共10,000个事件/管。将每一个抗体浓度的平均通道荧光强度评估为染色量级的指标。此类结合研究显示，4.40A68G S230P抗体以0.085ug/mL(0.58nM)的KD结合转染的细胞上的人CCR2(图2)。当在表达具有CCR2的第1和第2细胞外环的CCR2/CCR5嵌合受体的细胞上评估饱和结合时(参见实施例7)，如图6C中所示，获得相似的浓度曲线和KD(KD＝0.023ug/mL(0.16nM))。
[0350] 实施例6
[0351] MCP-1诱导的趋化作用的抑制
[0352] 就其抑制THP-1单核细胞(ATCC#TIB 202)响应CCR2配体MCP-1(CCL2)的趋化作用的能力评估人抗CCR2抗体。如之前所述(参见GladueRP等人，J Biol Chem 278：
40473-40480(2003))，在购自NeuroProbe，Inc.(Gaithersburg，MD)的96孔趋化小室中进行趋化作用。简而言之，将CCL2稀释于含有0.1％BSA的RPMI 1640培养基(Roswell Park Memorial Institute)中，然后加入至小室的底部小孔。将具有5μm孔的滤膜
(Neuroprobe)置于小室的上下孔之间。然后在不同浓度的测试抗体存在或不存在的情况
5
下向顶部小室中加入THP-1细胞(8x10)。将装置在37℃下于5％CO2潮湿培养箱中温育3小时。在温育期后，从上部小室除去非迁移细胞，擦静滤膜的顶部。然后向上部小孔中加入
2mM冷EDTA，将趋化小室于4℃下温育20分钟。然后除去EDTA，以800xg离心96孔微量滴定板10分钟。然后取走滤膜，弃去培养基，向板中加入0.2％FDA。然后于37℃下温育板
1.5小时，直至显现黄色。通过在微量滴定板读取器上读取490nm处的颜色强度来定量迁移细胞的数量。如表6中所显示的，鉴定到抑制THP1趋化作用至不同程度的几种抗体。
40473-40480(2003))，在购自NeuroProbe，Inc.(Gaithersburg，MD)的96孔趋化小室中进行趋化作用。简而言之，将CCL2稀释于含有0.1％BSA的RPMI 1640培养基(Roswell Park Memorial Institute)中，然后加入至小室的底部小孔。将具有5μm孔的滤膜
(Neuroprobe)置于小室的上下孔之间。然后在不同浓度的测试抗体存在或不存在的情况
5
下向顶部小室中加入THP-1细胞(8x10)。将装置在37℃下于5％CO2潮湿培养箱中温育3小时。在温育期后，从上部小室除去非迁移细胞，擦静滤膜的顶部。然后向上部小孔中加入
2mM冷EDTA，将趋化小室于4℃下温育20分钟。然后除去EDTA，以800xg离心96孔微量滴定板10分钟。然后取走滤膜，弃去培养基，向板中加入0.2％FDA。然后于37℃下温育板
1.5小时，直至显现黄色。通过在微量滴定板读取器上读取490nm处的颜色强度来定量迁移细胞的数量。如表6中所显示的，鉴定到抑制THP1趋化作用至不同程度的几种抗体。
[0353] 表6：MCP-1诱导的THP-1趋化作用的抑制
[0354]抗体克隆 IC50(ug/ml)
4.40.3 0.137
4.22.3 0.138
4.39.3 0.139
4.9.2 0.198
4.6.3 0.400
4.48.3 0.491
4.41.1 0.521
4.3.1 0.618
4.52.1 0.641
4.59.2 1.020
4.24.3 2.264
4.40.3 0.137
4.22.3 0.138
4.39.3 0.139
4.9.2 0.198
4.6.3 0.400
4.48.3 0.491
4.41.1 0.521
4.3.1 0.618
4.52.1 0.641
4.59.2 1.020
4.24.3 2.264
[0355] 类似地，抗体4.40A68G S230P抑制THP-1单核细胞响应MCP-1(而非CCR1/CCR5配体MIP-1)的趋化作用(IC50＝0.148ug/ml)，如图3中所显示的。
[0356] 原代单核细胞的趋化作用
[0357] 将肝素化的人全血在ACCUSPIN HISTOPAQUE 1077管(Sigma；St.Louis，MO)上分层，然后进行离心。收集单核细胞级分并用PBS洗涤3次，用水裂解红细胞(RBC)，将细胞6
以4x10/ml重悬浮于含有0.1％BSA(Sigma)和10mM HEPES(Gibco)的RPMI(Gibco；Grand Isle，NY)中。将KLH对照或抗体稀释物加入至0.25nM MCP-1(Peprotech；Rocky Hill，NJ)并且将30ul置于48孔Boyden小室(Neuroprobe；Gaithersburg，MD)的底部；阴性对照是单独的培养基。将5um无PVP滤膜(Neuroprobe)置于其上方并且密封小室。将分离的单核细胞与KLH对照或抗体稀释物一起在室温下温育30分钟。然后向上部小孔中加入50ul。
将小室在37℃下于5％CO2潮湿培养箱中温育90分钟。温育后，将细胞从上部小孔中吸出，TM
擦静滤膜顶部，风干，用DIFF-QUIK (Dade-Behring；Newark，DE)染色，然后计数6个视野中迁移细胞的数量。抗体4.40 A68G S230P对原代分离的人单核细胞响应MCP-1的趋化作用的抑制示于图4中。
以4x10/ml重悬浮于含有0.1％BSA(Sigma)和10mM HEPES(Gibco)的RPMI(Gibco；Grand Isle，NY)中。将KLH对照或抗体稀释物加入至0.25nM MCP-1(Peprotech；Rocky Hill，NJ)并且将30ul置于48孔Boyden小室(Neuroprobe；Gaithersburg，MD)的底部；阴性对照是单独的培养基。将5um无PVP滤膜(Neuroprobe)置于其上方并且密封小室。将分离的单核细胞与KLH对照或抗体稀释物一起在室温下温育30分钟。然后向上部小孔中加入50ul。
将小室在37℃下于5％CO2潮湿培养箱中温育90分钟。温育后，将细胞从上部小孔中吸出，TM
擦静滤膜顶部，风干，用DIFF-QUIK (Dade-Behring；Newark，DE)染色，然后计数6个视野中迁移细胞的数量。抗体4.40 A68G S230P对原代分离的人单核细胞响应MCP-1的趋化作用的抑制示于图4中。
[0358] 此外，如用4.40抗体例证的，针对CCR1/CCR5配体MIP-1a，未观察到对THP-1细胞的抑制(图3)。
[0359] 实施例7
[0360] CCR2/CCR1嵌合体的构建
[0361] 就与CCR2嵌合体的结合测试抑制MCP-1诱导的趋化作用的抗体以定位其表位。这通过评估抗体与300-19细胞的结合来实现，所述细胞表达由用CCR1的部分进行的CCR2的细胞外环(第1、第2和/或第3)和N末端置换(M＝CCR2，R＝CCR1)组成的不同受体嵌合体。
[0362] 嵌合受体MRRR的构建
[0363] 使用来自Stratagene的 Site-Directed mutagenesis试剂盒和用于突变野生型人CCR1中的第一ApaL限制性酶位点的下列诱变引物构建MRRR嵌合受体(CCR2(M)的N末端、CCR1(R)的第1、第2和第3细胞外环)，使用下列引物将其克隆入表达载体pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA)至BamHI位点：
[0364] 有义引物40A：
[0365] CGAGAGGGCCTTTGGGATCCAACTGCTGCC(SEQ ID NO：132)
[0366] 反义引物40B：
[0367] GGCAGCAGTTGGATCCCAAAGGCCCTCTCG(SEQ ID NO：133)
[0368] 由J.David Gladstone Institutes的Israel Charo提供克隆入pCMV-1衍生的表达载体(Pharmacia；Piscataway，NJ)的包含FLAG标记的MMRR嵌合体(CCR2的N末端和第1细胞外环、CCR1的第2和第3细胞外环)的嵌合受体。MMRR嵌合体(该作者称为“2211”)的构建描述于Monteclaro F.S.等人(Methods in Enzymology 228：70-84(1997))中。使用下列诱变引物将嵌合体中的第一ApaL位点突变成BamH1位点：
[0369] 有义引物41A：
[0370] GCAAATTGGGATCCAACTCCTGCC(SEQ ID NO：134)
[0371] 反义引物41B：
[0372] GGCAGGAGTTGGATCCCAATTTGC(SEQ ID NO：135).
[0373] 使用NdeI和BamHI切割每一个所得的突变的克隆。凝胶分离包含来自CCR1/pcDNA3BamHI突变体的载体的片段和只包含来自突变的MMRR/pCMV1质粒的CCR2N末端的
632个碱基对的NdeI/BamHI片段，将其连接在一起，产生MRRR/pcDNA3嵌合体。
632个碱基对的NdeI/BamHI片段，将其连接在一起，产生MRRR/pcDNA3嵌合体。
[0374] 使用下列诱变引物将MRRR嵌合体中的BamHI位点突变回ApaL位点：
[0375] 有义引物41C：
[0376] GCAAATTGGGGCCCAACTGCTGCC(SEQ ID NO ：136)
[0377] 反义引物41D：
[0378] GGCAGCAGTTGGGCCCCAATTTGC(SEQ ID NO：137).
[0379] 使用与载体的FLAG标记区域同源的有义引物66C(SEQ ID NO：138)和与CCR1的3′末端同源并且包含HindIII位点的反义引物66D(SEQ IDNO：139)PCR扩增完整的MRRR片段。
[0380] 有义引物66C
[0381] CTCTTGTGCCAGGGTGTGGTCTCCGA(SEQ ID NO：138)
[0382] 反义引物66D
[0383] GATCGAAGCTTTCAGAACCCAGCAGAGAGTTCATG(SEQ ID NO：139)
[0384] 然 后 将 该 片 段 亚 克 隆 入pMIG(Van Parijs，L. 等 人，Immunity 11：281-188(1999))衍生的逆转录病毒构建体的PflMI和HindIII位点(图 5)，从而取代了插入的基因(小鼠/人嵌合体)，所述插入的基因之前是FLAG标记，之后是Sal1位点并且已除去内部核糖体进入位点-增强型绿色荧光蛋白位点(IRESEGFP)。
[0385] 嵌合受体RRRM和RMMR的构建
[0386] 使用两步骤PCR法制备RRRM(CCR1的N末端、第1和第2细胞外环，和CCR2的第3细胞外环)和RMMR(CCR1的N末端和第3细胞外环，和CCR2的第2和第3细胞外环)嵌
合受体。
合受体。
[0387] 对于RRRM嵌合体，首先使用下列引物PCR扩增人野生型CCR2的第3环：
[0388] 有义嵌合引物89A：
[0389] GACTATACTTATTTCTGTTTTCATTGTCATTCTCCTGAACACC(SEQ ID NO：140)
[0390] 反义引物81B：
[0391] CGCCAAGCTTCATTATAAACCAGCCGAGA(SEQ ID NO：141).
[0392] 将野生型人CCR2克隆入逆转录病毒衍生的表达载体pMIG作为模板。使用下列引物PCR扩增N末端区域至第二细胞外环：
[0393] 有义引物89C：
[0394] ACGCGTCGACGAAACTCCAAACACCACAGAG(SEQ ID NO：142)
[0395] 反义嵌合引物89B：
[0396] GTTCAGGAGAATGACAATGAAAACAGAAATAAGTATAGTC(SEQ ID NO：143)，
[0397] 并且将野生型CCR1克隆入表达载体pcDNA3作为模板。
[0398] 凝胶纯化这些片段，将其组合，并使用5′和3′末端引物：89C(SEQID NO：142)和81B(SEQ ID NO：141)将其PCR扩增在一起。将所得的片段连接入逆转录病毒载体(包含N末端FLAG标记并且已除去IRESEGFP的pMIG)的SalI/HindII位点。
[0399] 嵌合受体RMMR的构建
[0400] 使用克隆入表达载体pcDNA3的野生型CCR1作为模板和下列引物PCR扩增CCR1的第3细胞外环至细胞质尾部：
[0401] 有义嵌合引物85A：
[0402] TCATTCTCCTGAACACCTTCCAAGACTTCCTGTTCACCCA(SEQ ID NO：144)
[0403] 反义引物78D：
[0404] GCCAAGCTTCCAGTGTGATGGATATCTGA(SEQ ID NO：145)，
[0405] 所述引物与野生型CCR1/pcDNA3质粒中插入物的载体3′的区域杂交。
[0406] 使用获自J.David Gladstone Institutes的Israel Charo的FLAG标记的RMMM/pcDNA3质粒作为模板PCR扩增包含CCR1的N末端和包含CCR2的第1和第2细胞外环的区域的第二片段。RMMM嵌合构建体(该作者称为“2111”)的构建描述于Monteclaro，F.S.等人(Methods in Enzymology 228：70-84(1997))中。使用的引物是与FLAG标记杂交的有义引物66C(SEQ ID NO：138)和反义嵌合引物85B：
[0407] TGGGTGAACAGGAAGTCTTGGAAGGTGTTCAGGAGAATGA(SEQ ID NO：146).
[0408] 凝胶纯化这两个片段，将其组合，使用5′和3′末端引物：66C(SEQID NO：138)和78D(SEQ ID NO：144)将其PCR扩增在一起。用Pf lMI和HindIII消化该终片段，然后将其连接入含有N-末端FLAG标记并且除去了IRESEGFP的pMIG逆转录病毒载体。
[0409] 嵌合体表达
[0410] 从每一个嵌合构建体产生逆转录病毒并且将其用于转导300-19细胞。使用抗FLAG表位的抗体M1(Sigma；St.Louis，MO，catalog#F3040)通过FACS分析测定表达。
[0411] 实施例8
[0412] 表位作图
[0413] 使用FACS分析评估抗体与CCR2/CCR1嵌合受体的结合。用FLAG在N末端标记所有受体，并且还用抗FLAG抗体M1进行染色，以便可确认受体的表达。图6A和B举例说明了使用M1抗体对N末端上的FLAG的FACS染色(图6A)，与4.40的染色相比较(图6B)。图6C举例说明了4.40A68G S230P抗体对RMMR嵌合体转染的300-19细胞的饱和结合曲线。
4.40A68G S230P抗体与未用CCR2转染的300-19细胞的饱和结合在高至10ug/mL的浓度上未显示结合(图7A)，然而用全长人CCR2转染的300-19细胞在高于0.01ug/mL的浓度上展示剂量依赖性结合(图7B)。此外，4.40A68G S230P抗体与只表达CCR2的N末端和CCR1的3个环区域(MRRR)(图7C)或只表达CCR2的第3细胞外环与CCR1的N末 端及第1和
第2环区域(RRRM)的嵌合受体的饱和结合在高至10ug/mL的浓度上未展示任何显著结合(图7D)。相反地，4.40A68G S230P抗体与表达CCR1的N末端和第3环区域以及CCR2的第
1和第2环区域的嵌合受体(RMMR)的饱和结合在高于0.001ug/mL的浓度上显示显著的剂量依赖性结合(图7E)。通过评估M1抗体(Sigma#F3040)对N末端上的FLAG的染色来确
认所有此类受体转染子上的受体表达。
4.40A68G S230P抗体与未用CCR2转染的300-19细胞的饱和结合在高至10ug/mL的浓度上未显示结合(图7A)，然而用全长人CCR2转染的300-19细胞在高于0.01ug/mL的浓度上展示剂量依赖性结合(图7B)。此外，4.40A68G S230P抗体与只表达CCR2的N末端和CCR1的3个环区域(MRRR)(图7C)或只表达CCR2的第3细胞外环与CCR1的N末 端及第1和
第2环区域(RRRM)的嵌合受体的饱和结合在高至10ug/mL的浓度上未展示任何显著结合(图7D)。相反地，4.40A68G S230P抗体与表达CCR1的N末端和第3环区域以及CCR2的第
1和第2环区域的嵌合受体(RMMR)的饱和结合在高于0.001ug/mL的浓度上显示显著的剂量依赖性结合(图7E)。通过评估M1抗体(Sigma#F3040)对N末端上的FLAG的染色来确
认所有此类受体转染子上的受体表达。
[0414] 表7：表位作图
[0415]
[0416] *复合的＝结合野生型但不结合嵌合体
[0417] 肽ELISA
[0418] 此外，还使用肽ELISA评估表位与CCR2的第一和/或第二环的结合。用TM
PBS/0.05％Tween20洗涤Reacti-Bind NEUTRAVIDIN 包被的HighBinding Capacity
ELISA板(Pierce；Rockford，IL)3次，然后用100ul/孔的6ug/ml生物素化的CCR2环2(SEQ ID NO：129)或环3(SEQ ID NO：130)肽(AnaSpec；San Jose，CA)进行包被。将板温育1小时，然后洗涤3次。然后以系列稀释向板中加入于PBS/0.1％BSA/0.05％Tween20中稀释的CCR2拮抗性抗体4.40.3A68G S230P或其他一抗并温育1小时，对于其他对照亦如此。
将板洗涤3次，以1∶5000的稀释度向所有孔中加入100ul/ 孔的HRP-小鼠抗人IgG4二抗(Zymed；So.San Francisco，CA)，温育1小时。清洗板3次，向所有孔中加入TMB底物，温育约30分钟。用2M H2SO4终止颜色反应，在板读取器上测量450nM处的吸光度读数(图
8)。鉴定到结合受体的第二细胞外环肽并且不结合第三环的抗体，包括抗体4.9和4.40。
PBS/0.05％Tween20洗涤Reacti-Bind NEUTRAVIDIN 包被的HighBinding Capacity
ELISA板(Pierce；Rockford，IL)3次，然后用100ul/孔的6ug/ml生物素化的CCR2环2(SEQ ID NO：129)或环3(SEQ ID NO：130)肽(AnaSpec；San Jose，CA)进行包被。将板温育1小时，然后洗涤3次。然后以系列稀释向板中加入于PBS/0.1％BSA/0.05％Tween20中稀释的CCR2拮抗性抗体4.40.3A68G S230P或其他一抗并温育1小时，对于其他对照亦如此。
将板洗涤3次，以1∶5000的稀释度向所有孔中加入100ul/ 孔的HRP-小鼠抗人IgG4二抗(Zymed；So.San Francisco，CA)，温育1小时。清洗板3次，向所有孔中加入TMB底物，温育约30分钟。用2M H2SO4终止颜色反应，在板读取器上测量450nM处的吸光度读数(图
8)。鉴定到结合受体的第二细胞外环肽并且不结合第三环的抗体，包括抗体4.9和4.40。
[0419] 实施例9
[0420] 结合选择性
[0421] 通过与密切相关的趋化因子受体CCR5的结合的不存在(如图9中所示)和通过对由CCR5/CCR1配体MIP-1a诱导的趋化作用的抑制的缺乏(图3)来确认4.40A68G S230P抗体对人CCR2的选择性。抗CCR5抗体(Pharmingen，catalog#555992)结合表达CCR5的细胞(图9b)，而CCR2抗体4.40.3A68G S230P未显示与此类相同细胞的结合(图9a)。为了进行此类研究，将经工程改造以表达CCR5的300.19细胞与CCR2选择性抗体4.40A68G S230P或CCR5选择性抗体一起温育30分钟。然后在FACS缓冲液(0.02％叠氮化钠、2％的在PBS中的热灭活的胎牛血清)中洗涤细胞，并使用标准方法，利用流式细胞仪就细胞表面表达进行分析。
[0422] 实施例10
[0423] 钙动员
[0424] 为了确定抗体4.40是否充当针对CCR2的功能性拮抗剂并且不具有任何显著的激动剂性质，如之前所述(Gladue RP等人，J Biol Chem 278：40473-40480(2003))测试4.40.3对CCR2转染的300-19细胞的钙动员的效应。将CCR2转染的300-19细胞离心，然后
6
以2x10 个细胞/ml重悬浮于PTI缓冲液(含有10mM Hepes(Gibco)和4.0mM CaCl2(Sigma；
St.Louis，MO) 的 HBSS(Gibco，Grand Island，NY)) 中。 用 2ul indo-1AM(Molecular Probes；Eugene，OR)/ml(2uM的终浓度)装载细胞，在37℃下温育25分钟。然后用PTI缓
7
冲液洗涤细胞2次，并以1x10/ml重悬浮。将几个浓度的抗体或适当的对照加入细胞并
2
且在室温下温育30 分钟。向1mm 的比色杯(Sarstedt；Germany)中加入1.8ml预温热的PTI缓冲液和200ul细胞悬浮液。激发细胞，使用来自Photon Technology Corporation International(PTI；Lawrenceville，NJ)的设备测量荧光。使机器暂停，加入20ul 100nM MCP-1(Peprotech；Rocky Hill，NJ)。在响应后，按该顺序加入下列试剂以释放和螯合总钙：20ul 18％Triton X-100；20ul 3M Tris pH 8.5；20ul 0.5M EGTA pH 8.5(全部来自Sigma)。抗体4.40以剂量反应方式抑制MCP-1诱导钙动员的能力(图10)。使用4.40A68G S230P抗体获得相似的结果。
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以2x10 个细胞/ml重悬浮于PTI缓冲液(含有10mM Hepes(Gibco)和4.0mM CaCl2(Sigma；
St.Louis，MO) 的 HBSS(Gibco，Grand Island，NY)) 中。 用 2ul indo-1AM(Molecular Probes；Eugene，OR)/ml(2uM的终浓度)装载细胞，在37℃下温育25分钟。然后用PTI缓
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冲液洗涤细胞2次，并以1x10/ml重悬浮。将几个浓度的抗体或适当的对照加入细胞并
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且在室温下温育30 分钟。向1mm 的比色杯(Sarstedt；Germany)中加入1.8ml预温热的PTI缓冲液和200ul细胞悬浮液。激发细胞，使用来自Photon Technology Corporation International(PTI；Lawrenceville，NJ)的设备测量荧光。使机器暂停，加入20ul 100nM MCP-1(Peprotech；Rocky Hill，NJ)。在响应后，按该顺序加入下列试剂以释放和螯合总钙：20ul 18％Triton X-100；20ul 3M Tris pH 8.5；20ul 0.5M EGTA pH 8.5(全部来自Sigma)。抗体4.40以剂量反应方式抑制MCP-1诱导钙动员的能力(图10)。使用4.40A68G S230P抗体获得相似的结果。
[0425] 实施例11
[0426] 朝向CCL2和CCL7的趋化作用的抑制
[0427] 为了确定4.40A68G S230P抗体对趋化作用的抑制是否是特异于MCP-1的或其是否也可用于其他CCR2配体，将THP-1细胞朝向MCP-1(CCL2)的趋化作用与朝向
CCL3(MIP-1a)的趋化作用相比较，如图3中显示的。此外，在抗体4.40A68G S230P存在的情况下，还使用与实施例6中所述的相似的趋化作用测定评估CCR2转染的300-19细胞朝向另一个CCR2配体CCL7(MCP-3)的迁移。虽然4.40A68G S230P抗体抑制朝向两种已知的CCR2配体CCL2(图3)和CCL7(图11)的趋化作用，但图3显示其不阻断朝向CCR1/CCR5配体CCL3(MIP-1a)的趋化作用。
CCL3(MIP-1a)的趋化作用相比较，如图3中显示的。此外，在抗体4.40A68G S230P存在的情况下，还使用与实施例6中所述的相似的趋化作用测定评估CCR2转染的300-19细胞朝向另一个CCR2配体CCL7(MCP-3)的迁移。虽然4.40A68G S230P抗体抑制朝向两种已知的CCR2配体CCL2(图3)和CCL7(图11)的趋化作用，但图3显示其不阻断朝向CCR1/CCR5配体CCL3(MIP-1a)的趋化作用。
[0428] 实施例12
[0429] 单核细胞中的肌动蛋白多聚化
[0430] 人全血肌动蛋白的多聚化
[0431] 如图12中所示，还就其抑制人全血中肌动蛋白的多聚化的能力测试单克隆抗体4.40A68G S230P。将血液收集在EDTA真空采血管(VWR；Boston，MA)中，然后将其与抗体的稀释物或KLH对照一起在室温下温育30分钟。向48孔Corning板(VWR)中加入缓冲液对照或10μl 100nMMCP-1(Peprotech；Rocky Hill，NJ)。然后加入100μl血液同时轻轻混合，温育40秒，之后用0.8ml终止/裂解试剂(10％的FACS裂解溶液 (Becton Dickinson；
San Jose，CA)、20％的16％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences；Ft.Washington，PA)和70％的H2O)终止反应。将板在室温下温育10分钟，离心，然后将细胞转移至96孔圆底聚丙烯板中，用PBS洗涤2次。每孔加入100μl PBS。然后加入50μl染色剂(10％的在10X HBSS中的5mg/ml溶血卵磷脂(Sigma)，80％的16％多聚甲醛和10％的6.6uM NBD类鬼笔环肽(Molecular Probes；Eugene，OR))。在室温下于黑暗中将细胞染色1小时。温育后，用含有2％胎牛血清(Hyclone，Logan UT)的PBS洗涤细胞2次，在对单核细胞门控的FACSCAN(Becton Dickinson)上定量荧光。如图12中所显示的，抗体4.40A68GS230P以
0.168ug/ml的IC50抑制肌动蛋白多聚化。
San Jose，CA)、20％的16％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences；Ft.Washington，PA)和70％的H2O)终止反应。将板在室温下温育10分钟，离心，然后将细胞转移至96孔圆底聚丙烯板中，用PBS洗涤2次。每孔加入100μl PBS。然后加入50μl染色剂(10％的在10X HBSS中的5mg/ml溶血卵磷脂(Sigma)，80％的16％多聚甲醛和10％的6.6uM NBD类鬼笔环肽(Molecular Probes；Eugene，OR))。在室温下于黑暗中将细胞染色1小时。温育后，用含有2％胎牛血清(Hyclone，Logan UT)的PBS洗涤细胞2次，在对单核细胞门控的FACSCAN(Becton Dickinson)上定量荧光。如图12中所显示的，抗体4.40A68GS230P以
0.168ug/ml的IC50抑制肌动蛋白多聚化。
[0432] 食蟹猴全血肌动蛋白多聚化
[0433] 将血液收集在EDTA真空采血管(VWR；Boston，MA)中，然后将其与抗体的稀释物或同种型对照一起在室温下温育30分钟。在该时间内，向48孔Corning板(VWR)中加+2
入10ul 100nM MCP-1(Peprotech；Rocky Hill，NJ；终浓度10nM)或缓冲液对照(无Ca+2
或Mg 但具有0.2％BSA(Sigma；St.Louis，MO)的HBSS(Gibco；Grand Island，NY))。然后加入100ul血液并轻轻混合，温育40秒。用0.8ml终止/裂解试剂(10％的FACS裂解
溶液(Becton Dickinson；San Jose，CA)，20％的16％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences；Ft.Washington，PA)和70％的H2O)终止反应。将板温育10分钟，离心，用PBS洗涤2次。然后用染色剂(10％的在10X HBSS中的5mg/ml溶血卵磷脂(Sigma)，80％的16％多聚甲醛和10％的6.6uM NBD类鬼笔环肽(Molecular Probes；Eugene，OR))在室温下于黑暗中将细胞染色1小时。温育后，用含有2％胎牛血清(Hyclone，Logan UT)的PBS洗涤细胞2次，在对激活的单核细胞门控的FACSCAN(Becton Dickinson)上定量荧光。如图13中所示，抗体4.40A68GS230P以0.49ug/ml的IC50抑制食蟹猴的全血肌动蛋白多聚化。
入10ul 100nM MCP-1(Peprotech；Rocky Hill，NJ；终浓度10nM)或缓冲液对照(无Ca+2
或Mg 但具有0.2％BSA(Sigma；St.Louis，MO)的HBSS(Gibco；Grand Island，NY))。然后加入100ul血液并轻轻混合，温育40秒。用0.8ml终止/裂解试剂(10％的FACS裂解
溶液(Becton Dickinson；San Jose，CA)，20％的16％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences；Ft.Washington，PA)和70％的H2O)终止反应。将板温育10分钟，离心，用PBS洗涤2次。然后用染色剂(10％的在10X HBSS中的5mg/ml溶血卵磷脂(Sigma)，80％的16％多聚甲醛和10％的6.6uM NBD类鬼笔环肽(Molecular Probes；Eugene，OR))在室温下于黑暗中将细胞染色1小时。温育后，用含有2％胎牛血清(Hyclone，Logan UT)的PBS洗涤细胞2次，在对激活的单核细胞门控的FACSCAN(Becton Dickinson)上定量荧光。如图13中所示，抗体4.40A68GS230P以0.49ug/ml的IC50抑制食蟹猴的全血肌动蛋白多聚化。
[0434] 实施例13
[0435] 胶原I mRNA的定量测定
[0436] 将人肝星形细胞系LI-90(JCRB Cellbank，Japan)在37℃下于5％CO2潮湿的培养箱中培养在装有DME培养基(补充有10％的灭活的FBS，100U/ml青霉素/100ug/ml链霉素和2mM L-Gln(Invitrogen))的培养瓶中。将细胞以20,000个细胞/孔在96孔组织培养板中培养3天，用1000nM MCP-1(PeproTech)和不同浓度的4.40A68G S230P在37℃下TM处理48小时。除去培养基，通过加入100ul QUANTIGENE Expression试剂盒(Panomics)提供的裂解缓冲液来裂解细胞。按照制造商的说明书进行分支DNA测定。简而言之，将总RNA样品装载在含有杂交缓冲液和50fmol/ul的Col1A1/GAPDH探针组的96孔微量滴定板上。通过在46℃下温育60分钟将捕获的mRNA与包含碱性磷酸酶分子的分支DNA分子杂交。
在与化学发光底物于46℃下进一步温育30分钟后，使用发光计(ARVOsx，Perkin Elmer；
Massachusetts，USA)定量发光。计算Col1A1对GAPDH的发光比率，利用Prism 4.0软件分析数据以测定IC50值(GraphPad)。如图14中所显示的，4.40A68G S230P以0.89μg/mL(6.2nM)的IC50值抑制由MCP-1诱导的LI90细胞中的胶原IAI mRNA的合成。
在与化学发光底物于46℃下进一步温育30分钟后，使用发光计(ARVOsx，Perkin Elmer；
Massachusetts，USA)定量发光。计算Col1A1对GAPDH的发光比率，利用Prism 4.0软件分析数据以测定IC50值(GraphPad)。如图14中所显示的，4.40A68G S230P以0.89μg/mL(6.2nM)的IC50值抑制由MCP-1诱导的LI90细胞中的胶原IAI mRNA的合成。
[0437] 实施例14
[0438] pERK磷酸化
[0439] 从健康志愿者新鲜分离人全血。FACS分析显示，在加入MCP-1后6分钟在CD14+单核细胞中存在高水平的细胞外信号调节激酶的磷酸化(pERK)。4.40A68G S230P以剂量依赖性方式抑制全血中MCP-1诱导的pERK磷酸化(图15)。在用MCP-1离体刺激后，单核细胞中的pERK磷酸化可用作机制生物标志物，从而便于PK/PD和转化药理学(translational pharmacology)。在全血测定中获得的4.40A68G S230P抗体的IC50和IC90值分别是0.44μg/mL(2.9nM)和0.89μg/ml(6.1nM)。
[0440] 实施例15
[0441] 鼠急性肝炎模型
[0442] 还使用肝炎的急性小鼠ConA模型检查4.40A68G S230P抗体的功效。为了进行该研究，使用其中已用人CCR2替代了小鼠CCR2的转基因小鼠，因为4.40A68G S230P抗体不识别啮齿类动物CCR2。给动物单次腹膜内注射0.1、0.3或1.0mg/kg的在盐水中的mAb。给单独的组施用I gG4同种型对照抗体。30分钟后，通过i.v.尾静脉注射给予动物0.1mL的15mg/kg的在无热原的盐水中的ConA。给对照组施用无ConA的盐水。24小时后，获得血液样品，分析血浆肝酶。如图16中所示，ALT和AST在对照抗体组中显著升高，值接近
25,000U/L。相反地，用0.5和1.0mg/kg4.40A68G S230P处理的小鼠显示其血浆肝酶分别显著降低约50％和80％。
25,000U/L。相反地，用0.5和1.0mg/kg4.40A68G S230P处理的小鼠显示其血浆肝酶分别显著降低约50％和80％。
[0443] 实施例17
[0444] 动物疾病模型中的治疗效果
[0445] 炎症
[0446] 使用炎症的体内哺乳动物模型测试人抗CCR2抗体或其抗原结合片段(包括4.40和4.9抗体)的治疗效果。在将趋化因子例如MCP-1和与哺乳动物CCR2反应的抗体或其片段例如4.40抗体皮内注射入适当的动物例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠或猕猴后，监控白细胞浸润(参见例如，VanDamme，J.等人，J.Exp.Med.176：59-65(1992)；Zachariae，C.O.C.等人，J.Exp.Med.171：2177-2182(1990)；Jose，P.J.等人，J.Exp.Med.179：881-887(1994))。就白细胞(例如，嗜酸性粒细胞和粒细胞)的浸润在组织学上评估皮肤活组织检查样品。预期与对照动物相比较，拮抗性抗CCR2抗体将减少白细胞的浸润。
[0447] 多发性硬化
[0448] 使用多发性硬化的体内哺乳动物模型测试抗体或其片段(包括4.40和4.9抗体)的治疗效果。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是用作多发性硬化(MS)的动物
模型的中枢神经系统(CNS)的T细胞介导的炎性疾病(参见Steinman L，Neuron 24：
511-514(1999))。在用致脑炎的MOG35-55肽免疫后(p.i.)的第0天和第7天，通过皮下(s.c.)注射(两个位置，背 侧面)总共600μg的致脑炎的MOG35-55(其在含有70μg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(Difco)的不完全弗氏佐剂(IFA；Difco，Detroit，MI)中乳化)，使C57/J129和/或C57BL/6小鼠对活性EAE敏感。在免疫后第
0天和第2天，每一只小鼠还经尾静脉静脉内(i.v.)接受500ng百日咳毒素(PTX；List Biological Laboratories，Campbell，CA)。一些动物还接受增加剂量的抗CCR2拮抗性抗体例如4.40抗体。每天就临床体征估量动物并按照下列等级进行评估：0级，无异常；1级，虚弱的尾；2级，无力的尾和后肢的虚弱；3级，后肢轻瘫；4级，四肢麻痹；和5级，垂死或死亡。
模型的中枢神经系统(CNS)的T细胞介导的炎性疾病(参见Steinman L，Neuron 24：
511-514(1999))。在用致脑炎的MOG35-55肽免疫后(p.i.)的第0天和第7天，通过皮下(s.c.)注射(两个位置，背 侧面)总共600μg的致脑炎的MOG35-55(其在含有70μg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(Difco)的不完全弗氏佐剂(IFA；Difco，Detroit，MI)中乳化)，使C57/J129和/或C57BL/6小鼠对活性EAE敏感。在免疫后第
0天和第2天，每一只小鼠还经尾静脉静脉内(i.v.)接受500ng百日咳毒素(PTX；List Biological Laboratories，Campbell，CA)。一些动物还接受增加剂量的抗CCR2拮抗性抗体例如4.40抗体。每天就临床体征估量动物并按照下列等级进行评估：0级，无异常；1级，虚弱的尾；2级，无力的尾和后肢的虚弱；3级，后肢轻瘫；4级，四肢麻痹；和5级，垂死或死亡。
[0449] 此外，对来自视神经、大脑、小脑和脊髓的戊二醛/锇酸固定的组织样品进行光学显微镜研究。使组织样品脱水并且包埋在环氧树脂中，从所述树脂切取1-μm切片，用甲苯胺蓝染色。如之前所述(Cannella等人，Proc Natl Acad Sci USA 95：10100-10105(1998))，按照0至5的等级给炎症、脱髓鞘、Wallerian变性(WD)和髓鞘再生评分。预期用抗CCR2拮抗性抗体处理的小鼠与对照动物相比较将展示减轻的临床异常、炎症、脱髓鞘和WD的体征。还预期此类减轻将以剂量依赖性的方式发生。
[0450] 神经性疼痛
[0451] 使用神经性疼痛的体内哺乳动物模型测试抗体或其片段(包括4.40和4.9抗体)的治疗效果。将C57BL小鼠分成两组。每日经尾静脉注射给实验组施用抗CCR2拮抗性抗体例如4.40抗体，而不给第二组施用抗体。在治疗起始后在下列测定中每隔一定时间测试两个组：
[0452] 跳台实验(Rota-rod)。开始时，将小鼠在跳台(以10rpm的速度)上训练3分钟。为了进行测试，将速度设置为10rpm，进行60秒，然后加速至600rpm。记录小鼠在加速开始后跌落所花的时间。
[0453] 热板法。使小鼠习惯温度设置在45℃的热板装置2分钟。然后，将小鼠置于热板上，随后将温度改变至52.5℃和55.5℃(截断值设置为30秒)各一次，然后改变至58.5℃(截断值设置为20秒)。记录当小鼠舔其足或跳跃时的时间。
[0454] 福尔马林试验。在测试前4天中，每一天使小鼠在测试平台上习惯2小时。在研究的当天，将小鼠放置在测试平台上1小时，然后在左足的跖面(plantar surface)中施用10μl 2％福尔马林。以5分钟的间隔记录2分钟的时间内小鼠花在舔或抬起被注射的足的时间，进行50分钟。
[0455] 热和机械刺激。通过测量对辐射热刺激的缩足反应时间来评估热敏感性(Hargreaves等人，Pain 32：77-88(1988))。通过使用上上下下的范式(up-and-down paradigm)用标刻度的弗莱丝(von Frey filament)测定机械敏感性(Chaplan等人，
J.Neurosci.Methods 53，55-63(1994))。
J.Neurosci.Methods 53，55-63(1994))。
[0456] 神经损伤。用氯胺酮(50mg/kg，i.m.)和美托咪啶(1mg/kg，i.m.)的混合物麻醉小鼠。紧在髋骨下方平行于坐骨神经产生切口。暴露神经并且从神经上除去任何附着组织。围绕坐骨神经直径的1/3至1/2用6-0丝缝线紧密结扎。用缝合线闭合肌肉，用创伤夹(wound clip)闭合伤口。在神经损伤之前和在之后达到15天，测试小鼠对机械刺激的反应。
[0457] 预期用抗CCR2拮抗性抗体处理的小鼠与对照小鼠相比较将展示减小的神经性疼痛体征。
[0458] 表8：CDR序列(SEQ ID NO：)
[0459]抗体 VHCDR1 VHCDR2 VHCDR3 VLCDR1 BLCDR2 VLCDR3
4.9 12 13 14 30 31 32
4.22 48 49 50 66 67 68
4.40 84 85 86 102 103 104
4.39 177 178 179 195 196 197
4.9 12 13 14 30 31 32
4.22 48 49 50 66 67 68
4.40 84 85 86 102 103 104
4.39 177 178 179 195 196 197
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