细胞外核酸的稳定化和分离
阅读：633发布：2020-07-17
专利汇可以提供细胞外核酸的稳定化和分离专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了使用丁酰胺使含有细胞的 生物 样品中的细胞外核酸群体稳定的方法、组合物和装置。，下面是细胞外核酸的稳定化和分离专利的具体信息内容。
1.用于收集含有细胞的生物样品的容器，其中所述容器包含丁酰胺和选自下列的至少一种其他添加剂：
-凋亡抑制剂，
-抗凝剂，和
-式1的化合物
其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。
2.权利要求1的容器，其中所述容器包含适用于使含有细胞的生物样品稳定的组合物，其中所述组合物包含丁酰胺和选自下列的至少一种其他添加剂：
-凋亡抑制剂，
-抗凝剂，和
-式1的化合物
其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。
3.权利要求2的收集容器，其中该稳定化组合物包含的凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。
4.权利要求1至3的一项或多项的收集容器，其中所述容器包含：
a)丁酰胺，其浓度使得当所述含有细胞的生物样品被收集至所述容器中时，丁酰胺在得到的混合物中的浓度为至少0.25％(w/v)、至少0.3％(w/v)、至少0.4％(w/v)、至少
0.5％(w/v)、至少0.75％(w/v)或至少1％(w/v)、至少1.5％(w/v)、至少1.75％(w/v)、至少2％(w/v)或至少2.5％(w/v)，以及其中优选地，得到的混合物包含的丁酰胺浓度在以下范围内：0.25％(w/v)至15％(w/v)、0.5％(w/v)至12.5％(w/v)、0.75％(w/v)至
10％(w/v)、0.8％(w/v)至9％(w/v)、0.9％(w/v)至8％(w/v)、1％(w/v)至7％(w/v)、
1.1％(w/v)至6％(w/v)、1.2％(w/v)至6％(w/v)、1.3％(w/v)至5.5％(w/v)、1.4％(w/v)至5.25％(w/v)、1.5％(w/v)至5％(w/v)、1.75％(w/v)至4.75％(w/v)、2.0％(w/v)至4.5％(w/v)、2.2％(w/v)至4.25％(w/v)、2.3％(w/v)至4％(w/v)、2.4％(w/v)至
3.75％(w/v)或2.5％(w/v)至3.5％(w/v)；以及
b)至少一种半胱天冬酶抑制剂，其浓度使得当所述含有细胞的生物样品被收集至所述容器中时，所述半胱天冬酶抑制剂在得到的混合物中的浓度为至少0.01μM、至少0.1μM、至少0.25μM、至少0.5μM、至少0.6μM、至少0.7μM、至少0.8μM、至少0.9μM或至少1μM，以及其中优选地，得到的混合物包含的半胱天冬酶抑制剂的浓度在以下范围内：
0.01μM至100μM、0.1μM至75μM、0.25μM至50μM、0.5μM至40μM、0.6μM至30μM、
0.7μM至 35μM、0.8μM至 30μM、0.9μM至 25μM、1μM至 20μM、1.1μM至 17.5μM、
1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM。
5.权利要求1至4的一项或多项的收集容器，其包含：
a)丁酰胺；
b)至少一种泛半胱天冬酶抑制剂；
c)任选地，至少一种式1的化合物，优选为N,N-二烷基-羧酸酰胺，更优选为N,N-二烷基丙酰胺；以及
d)任选地，抗凝剂，优选为螯合剂，更优选为EDTA。
6.权利要求5的收集容器，其中所述泛半胱天冬酶抑制剂选自Q-VD-OPh和
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK，并且更优选为Q-VD-OPh。
7.权利要求1至6的一项或多项的收集容器，其中所述容器还包含：
c)式1的化合物。
8.权利要求7的收集容器，其中式1的化合物具有一种或多种下列特征：
i)它是叔羧酸酰胺；
ii)它是N,N-二烷基-羧酸酰胺；
iii)它选自N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺和N,N-二甲基丙酰胺；
iv)它是N,N-二烷基丙酰胺；
v)它是N,N-二甲基丙酰胺；
vi)它是无毒性化合物；和/或
vii)它被包含在容器中的浓度使得当所述含有细胞的生物样品被收集至所述容器中时，式1的化合物在得到的混合物中的浓度为至少0.1％、至少0.5％、至少0.75％、至少
1％、至少1.25％或至少1.5％，以及其中优选地，得到的混合物包含的式1的化合物的浓度在以下范围内：0.1％至30％、0.25％至20％、0.5％至15％、0.7％至10％、0.8％至7.5％、
0.9％至6％或1％至5％。
9.权利要求7或8的收集容器，其包含半胱天冬酶抑制剂、丁酰胺和N,N-二甲基丙酰胺。
10.权利要求1至9的一项或多项的收集容器，其中所述容器还包含抗凝剂。
11.权利要求10的收集容器，其中所述容器包含螯合剂，优选为EDTA，其浓度使得当所述含有细胞的生物样品被收集至所述容器中时，螯合剂在得到的混合物中的浓度在选自以下的范围内：0.05mM至100mM、0.1mM至50mM、0.5mM至30mM、1mM至20mM、1.5mM至15mM或
2mM至15mM。
12.权利要求1至11的一项或多项的收集容器，其中所述容器被排空。
13.权利要求2至12的一项或多项的收集容器，其中所述容器中包含的稳定化组合物具有一种或多项下列特征：
a)它能够稳定细胞并减少基因组DNA从所述含有细胞的生物样品中包含的细胞释放到所述样品的无细胞部分中；
b)它能够减少稳定化的样品中存在的核酸、尤其是基因组DNA的降解；
c)它能够减少或防止所述生物样品中包含的细胞外DNA群体被源自于稳定化的样品中包含的细胞的基因组DNA污染；
d)它能够减少或防止所述生物样品中包含的细胞外核酸群体被源自于稳定化的样品中包含的细胞的细胞内核酸污染；
e)该稳定化组合物不包含其浓度会诱导或促进细胞裂解的添加剂；
f)该稳定化组合物不包含诱导蛋白质-DNA和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂；
g)该稳定化组合物不包含甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂；
h)该稳定化组合物不包含有毒试剂，和/或
i)它能够不需冷藏、优选地在室温下使包含在所述含有细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定一段时间，所述一段时间选自至少两天、至少三天、至少两天到三天、至少两天到六天和/或至少两天到七天。
14.权利要求1至13的一项或多项的收集容器，其中所述组合物具有一种或多种下列特征：
i)所述组合物包含浓度为5％至50％、7.5％至40％、10％至35％、12.5％至30％或
15％至25％的丁酰胺，
ii)所述组合物包含至少一种半胱天冬酶抑制剂；
iii)所述组合物包含浓度为2％至50％、3％至40％、3.5％至30％、4％至25％、4.5％至20％或5％至17.5％的至少一种式1的化合物，优选为N-N-二甲基丙酰胺，和/或iv)所述组合物包含抗凝剂。
15.权利要求1至14的一项或多项的收集容器，其中含有的化合物作为与含有细胞的生物样品的混合物存在，并且其中所述含有细胞的生物样品具有一种或多种下列特征：
a)它选自体液、全血、源自于血液的样品、血浆、血清、淋巴液、尿液、溶液、脑脊液、腹水、乳汁、粪便、支气管灌洗液、唾液、羊水、精子/精液、拭子/涂片、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物以及细胞培养上清液；
b)它是细胞贫乏的或含有细胞的体液；
c)它是含有细胞的体液；
d)它是循环体液；
e)它选自血液、血浆、血清或尿液；
f)它是血液。
16.权利要求1至15的一项或多项的收集容器，其还包含至少一种聚氧乙烯聚合物。
17.权利要求2至15的一项或多项的收集容器，其中所述组合物还包含至少一种聚氧乙烯聚合物。
18.权利要求16或17的收集容器，其中所述聚氧乙烯聚合物是聚乙二醇。
19.权利要求16至18的一项或多项的收集容器，其中所述聚氧乙烯聚合物是分子量为至少1500，优选地在选自2000至40000、2500至30000、3000至20000、3500至15000、4000至10000、4500至9000、5000至8000和5500至7000的范围内的高分子量聚氧乙烯聚合物。
20.权利要求16至19的一项或多项的收集容器，其中所述容器或组合物包含分子量不同的至少两种聚氧乙烯聚合物，其中所述分子量的差异为至少100，优选为至少200、至少
300、至少400或至少500。
21.权利要求19的收集容器，其中所述容器或组合物还包含分子量为1000或更低，优选地在选自100至800、150至700、200至600和200至500的范围内的低分子量聚氧乙烯聚合物。
22.权利要求19或21的收集容器，其中所包含的至少一种聚氧乙烯聚合物的浓度使得当所述含有细胞的生物样品被收集至所述容器中时，得到的混合物包含：
-高分子量聚氧乙烯聚合物，其浓度范围选自i)0.1％至3％(w/v)、0.2％至2.5％(w/v)、0.25％至2％(w/v)、0.3％至1.75％(w/v)和0.35％至1.5％(w/v)；或ii)0.25％至
1.5％(w/v)、0.3％至1.25％(w/v)、0.35％至1％(w/v)和0.4％至0.75％(w/v)；
-以及当从属于权利要求21时，得到的混合物还包含低分子量聚氧乙烯聚合物，其浓度范围选自0.5％至10％、1.5％至9％、1.75％至8％、2％至7％和2.5％至6％。
23.权利要求19至22的一项或多项的收集容器，其包含丁酰胺、至少一种聚氧乙烯聚合物和凋亡抑制剂。
细胞外核酸的稳定化和分离
[0001] 引起本发明的工作得到欧洲共同体第七框架计划(European Community's Seventh Framework Programme)(FP7/2007-2013)的资助，资助协议号为222916。
技术领域
[0002] 本文中公开的技术涉及适合于使含有细胞的样品、尤其是血样中的细胞外核酸群体稳定的方法和组合物，并涉及用于从相应的稳定化的生物样品分离细胞外核酸的方法。
背景技术
[0003] 已在血液、血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由于它们受到对抗核酸酶的保护(例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或被包含在囊泡内)这一事实，因此在某种程度上具有降解抗性。在许多医学病症、恶性肿瘤和感染过程中高水平的细胞外核酸例如DNA和/或RNA的存在，对于疾病进展的筛查、诊断、预后、监督，对于鉴定潜在治疗靶点以及对于监测治疗响应来说，是尤为令人感兴趣的。此外，母体血液中高的胎儿DNA/RNA，被用于确定例如性别同一性、评估染色体畸变和监测妊娠相关的并发症。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，因此具有诊断相关性(例如胎儿来源或肿瘤来源的核酸)。然而，在健康人类中也发现了细胞外核酸。细胞外核酸的常见应用和分析方法被描述在例如下述文献中：WO97/035589，WO97/34015，Swarup等，FEBS Letters 581(2007)795-799，Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075:40-49(2006)，Fleischhacker 和 Schmidt，Biochmica et Biophysica Acta 1775(2007)191-232，Hromadnikova等，(2006)DNA and Cell biology,Volume 25,Number 11pp 635-640，Fan 等，(2010)Clinical Chemistry56:8。
[0004] 传统上，从含有细胞的生物样品例如血液分离细胞外核酸的第一步是获得所述样品的基本上无细胞的级分，例如在血液情况下的血清或血浆。然后从所述无细胞级分，在处理血样时通常为血浆，分离细胞外核酸。然而，样品的基本上无细胞的级分的获得可能是有困难的，并且分离常常是繁琐和耗时的多步过程，这是因为重要的是使用仔细控制的条件以防止离心期间细胞破裂，所述细胞破裂可能使细胞外核酸被破裂期间释放的细胞内核酸污染。此外，除去所有细胞通常是困难的。因此，许多通常并且一般被分类为“无细胞”的处理过的样品例如血浆或血清，事实上仍含有在分离过程中未被除去的残留量的细胞。另一个重要的考虑因素是在收集样品后，由于离体温育期间的细胞破碎，导致细胞内核酸从样品中包含的细胞释放，所述离体温育通常在从抽血事件起相对短的时间段内进行。一旦开始细胞裂解，裂解的细胞释放出大量的其他核酸，其与细胞外核酸混合，并且回收用于试验的细胞外核酸变得越来越困难。这些问题已在现有技术中讨论(参见例如Chiu等(2001)，Clinical Chemistry 47:9 1607-1613；Fan等(2010)和US2010/0184069)。此外，在一段时间后，可获得的细胞外核酸的量和可回收性可能由于降解而显著降低。
[0005] 因此，血浆和血清样品可以用作用于诊断目的的重要样品材料，这是由于它们含有来自于不同来源的游离的循环核酸。例如，在血浆样品中检测来自于肿瘤的DNA是可能的。在母体血浆中检测来自于胎儿的DNA并对其进行遗传障碍(例如三体症)分析，也是可能的。这与羊膜穿刺术相比对母亲和婴儿的侵入性低得多，因此危险性也低得多。然而，正如上面讨论的，对于来自于肿瘤或胎儿来源的循环的无细胞核酸(cfNA)的分析来说，除了在血清中并且可能也在血浆中发生的降解之外，主要的问题是在血液收集后，细胞外DNA(和RNA)可能被来自于损坏或衰退的血细胞的遗传材料稀释。白细胞的裂解特别成问题，因为它们除了RNA之外还释放大量基因组DNA。红细胞不含基因组DNA。因此，全血中循环核酸的稳定化必须包括使血细胞稳定的机制，以便在稳定化期间防止细胞外核酸群体被细胞的基因组DNA以及RNA污染。
[0006] 除了例如源自于肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸之外，含有细胞的样品还可能包含不包含在细胞内的其他目标核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。含有细胞的样品、尤其是例如血液样本中的病毒核酸在运输和操作期间的完整性的保持，对于随后的分析和病毒载量监测也是关键的。
[0007] 细胞外核酸通常仅以低浓度包含在样品中。例如，游离的循环核酸以1-100ng/ml血浆的浓度存在于血浆中。此外，细胞外核酸通常作为尺寸为500nt、300nt(当指示尺寸以及因此链长时，术语“nt”在DNA的情形中也包括“bp”)或甚至更小(循环核小体)的片段循环。另外，出于诊断目的打算鉴定的真正的细胞外靶核酸，通常也仅代表总细胞外核酸中的一小部分。例如，肿瘤特异性DNA片段非常稀少，并且通常以比“正常的”细胞外核酸背景低1000倍的浓度被包含。因此，在收集样品后，必须防止这些稀少的核酸被细胞内核酸进一步稀释。
[0008] 如果正如在例如使用全血样品的情形中那样样品包含大量细胞，则上面讨论的问题尤其成为焦点。因此，为了避免或相应地减轻上述问题，通常基本上在获得样品后立即将样品的基本上无细胞的级分与样品中包含的细胞分离开。例如，推荐在抽取血液后基本上直接从全血获得血浆，和/或将全血和/或得到的血浆或血清冷却，以便保持细胞外核酸的完整性并避免细胞外核酸群体被所包含的细胞释放出的细胞内核酸污染。然而，需要例如直接从血液分离血浆是主要缺点，因为许多抽取血液的机构(例如医生操作)不具有能够高效分离血浆的离心机。此外，如上所述，在常规条件下获得的血浆通常包含残留量的细胞，因此其在样品操作期间也可能被破坏或可能死亡，从而释放出细胞内核酸、尤其是基因组DNA。这些残留的细胞还造成了下述风险，即它们在操作期间被破坏，使得它们的核酸内含物、尤其是基因组(核)DNA和细胞质RNA与细胞外循环核酸级分合并，从而污染并相应地稀释所述级分。为了除去这些残留的污染细胞并避免/减轻上述问题，已知以更高速度进行第二个离心步骤。然而，同样地，这样的强有力离心机在获得血液的机构处通常不可用。另外，即使在抽取血液后直接获得血浆，如果不能直接分离核酸，也推荐将其在-80℃下冷冻以保护其中包含的核酸。这也对样品的处理强加了实际限制，因为例如血浆样品必须被冷冻运输。这提高了成本，并且还造成在冷冻链中断的情况下样品受损的风险。
[0009] 除了细胞外核酸之外，细胞内核酸对于许多应用来说也是重要的。例如，基因组的转录本(尤其是mRNA和miRNA)的情况剖析，在分子体外诊断中被广泛用作生物标志物，并为正常的生物和病理过程提供见解，有希望预测疾病结果并指示个体化治疗过程。因此，细胞内核酸、尤其是RNA的情况剖析，在疾病诊断、预后和用于生物标志物发现的临床试验中变得越来越重要。在待分析的样品的稳定化中不采取预防措施，样品在运输和储存期间将经历可能改变被靶向分子的表达情况的变化。如果转录组由于样品的操作而显著改变，则后续分析不反映样品以及因此患者的原始情况，而是测量在样品操作、运输和储存期间产生的人为情况。因此，需要使基因表达情况稳定的优化的稳定化方法。
[0010] 血样目前通常收集在含有喷雾干燥的或液体EDTA(例如BD Vacutainer K2EDTA)的血液收集管中。EDTA螯合镁、钙和其他二价金属离子，从而抑制酶反应，例如血凝或由DNA酶造成的DNA降解。然而，尽管EDTA是高效的抗凝结剂，但EDTA不能高效地防止细胞外核酸群体被储存期间释放的细胞内核酸稀释并相应地污染。因此，EDTA稳定化的样品的无细胞部分中存在的细胞外核酸群体在储存期间变化，并被大量细胞内核酸、尤其是基因组DNA污染。因此，EDTA不能使细胞外核酸群体充分稳定，尤其是因为它不能避免细胞外核酸群体被例如抽血后在样品运输和储存期间由细胞降解和细胞不稳定性而产生的基因组DNA片段的污染。
[0011] 此外，含有在样品收集的时间点立即使RNA基因表达情况以及因此转录组稳定的试剂的血液收集管是已知的(参见例如US 6,617,170，US 7,270,953，Kruhoffer等，2007)。然而，这些方法是基于样品中包含的细胞的立即裂解。因此，这些方法和引起细胞裂解的其他方法不适合于使含有细胞的样品中的细胞外核酸群体稳定，因为它们引起细胞内核酸释放，从而使细胞内核酸与细胞外核酸群体混合。
[0012] 此外，在现有技术中，用于使含有细胞的样品例如血液或组织样品稳定的方法是已知的，所述方法使例如细胞、转录组、基因组和蛋白质组稳定。这样的方法公开在例如WO2008/145710中。所述方法是基于特定稳定化化合物例如N,N-二甲基乙酰胺的使用。然而，N,N-二甲基乙酰胺是有毒试剂。因此，对于提供避免使用有毒试剂的可替选的稳定化方法，存在着需求。
[0013] 在现有技术中，具体地旨在使全血中包含的循环核酸稳定的其他方法是已知的。一种方法使用甲醛使细胞膜稳定从而减少细胞裂解，并且此外，甲醛抑制核酸酶。相应的方法描述在例如US 7,332,277和US 7,442,506中。为了解决对同时的细胞稳定化和核酸稳定化的需求，开发了基于使用甲醛释放剂的稳定化系统。相应的稳定化试剂可以从Streck Inc.，在名称无细胞RNA BCT(血液收集管)下商购。10ml的血液收集管旨在用于使血浆中的无细胞RNA在室温下受到保护并稳定长达3天。防腐剂使血浆中的无细胞RNA稳定并防止非靶背景RNA在样品处理和储存期间从血细胞释放。US 2011/0111410描述了使用甲醛释放组分在同一血样中实现细胞和RNA稳定化。因此，该文献描述了一种技术，其中稳定化试剂使抽取的血液中的血细胞稳定，从而防止细胞的RNA被无细胞RNA或球蛋白RNA污染，抑制RNA合成至少2小时，并且血细胞内的细胞RNA受到保护，以保持血细胞的蛋白质表达模式与抽血时相比基本上不变。可以从相应的稳定化样品分离白细胞，然后从所述白细胞提取细胞RNA。然而，甲醛或释放甲醛的物质的使用具有缺点，因为它们通过诱导核酸分子之间或蛋白质与核酸之间的交联而损害细胞外核酸的分离效率。使血样稳定的方法也描述在例如US 2010/0184069和US 2010/0209930中。这些相当新开发的方法证实了对提供用于使含有细胞的生物样品稳定，以允许高效回收例如在这样的样品中包含的细胞外核酸的手段的极大需求。
[0014] 未公布的PCT/EP2012/070211和PCT/EP2012/068850描述了用于使含有细胞的生物样品例如全血样品中的细胞外核酸群体稳定的不同方法。在这些未公布的申请中描述的稳定化组合物有效地使细胞外核酸群体稳定，尤其是通过防止细胞内核酸释放到细胞外核酸群体中。
[0015] 对于开发使含有细胞的样品、例如尤其是血样稳定的处理方法，存在着持续不断的需求。具体来说，需要使包含在含有细胞的生物样品，包括怀疑含有细胞的样品、特别是全血、血浆或血清中的细胞外核酸群体稳定，从而使这样的样品的操作和相应的处理更加容易(例如通过避免对从全血直接分离血浆或冷却或甚至冷冻分离到的血浆的需要)的方法。通过提供不妨碍随后的核酸分离的高效和可靠的样品稳定化技术，这样的样品中包含的细胞外核酸的分离和试验变得更加可靠，因此细胞外核酸的诊断和预后应用/用途通过这样的稳定化技术得以改进。具体来说，对用于保护全血样品中的细胞外核酸群体，以例如用于产前检测和/或用于疾病例如肿瘤、尤其是恶性前或恶性疾病的筛查的解决方案，存在着持续不断的需求。
[0016] 本发明的目的是提供用于使包含在含有细胞的样品中的细胞外核酸群体稳定的方法和组合物。具体来说，目的是克服现有技术的样品稳定化方法的至少一种缺点。此外，本发明的目的尤其是提供一种适合于使含有细胞的生物样品、尤其是全血样品在室温下稳定的方法。此外，本发明的目的是提供一种样品收集容器，尤其是血液收集管，其能够有效地使含有细胞的生物样品稳定，尤其是能够使包含在所述样品中的细胞外核酸群体稳定。此外，本发明的一个目的是提供一种稳定化技术，其允许包含在所述样品中的核酸的后续分离具有良好的收率。
[0017] 发明概述
[0018] 本发明是基于下述令人吃惊的发现，即丁酰胺有效地使包含细胞外核酸的含有细胞的生物样品，尤其是全血样品或源自于血液的样品例如血浆或血清稳定。已发现，丁酰胺可以使细胞外核酸群体稳定，并且尤其是能够降低样品收集后细胞外核酸群体被基因组DNA、尤其是片段化基因组DNA污染的风险。因此，使用丁酰胺作为稳定剂降低了细胞外核酸群体被细胞内核酸稀释的风险，这明显有助于保持细胞外核酸群体的状况。有利的是，丁酰胺未被分类为有毒、有害或刺激性试剂。此外，可以使用标准的核酸分离方法从丁酰胺稳定化的样品高效分离核酸。
[0019] 根据第一方面，提供了一种适合于使包含在含有细胞的样品中的细胞外核酸群体稳定的方法，其中将所述含有细胞的样品与丁酰胺相接触。
[0020] 根据第二方面，提供了一种用于从稳定化的含有细胞的生物样品分离核酸的方法，其中所述方法包括：
[0021] a)按照在本发明的第一方面中限定的方法，使所述含有细胞的生物样品稳定；以及
[0022] b)从稳定化的样品分离核酸。
[0023] 步骤a)中的稳定化按照如上所述本发明的第一方面来实现，其涉及使用丁酰胺作为稳定剂。本发明的稳定化，具有使含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持在所述生物样品被获得和相应地收集并使用丁酰胺稳定化时所显示的状态下的效果。正如实施例所示，基因组DNA和其他细胞内核酸的释放显著降低。与从未稳定化的样品分离的细胞外核酸相比，从相应地稳定化的样品分离的细胞外核酸包含明显更少的被细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA的污染。从未稳定化的样品分离的细胞外核酸包含大量细胞内核酸，例如在储存期间由样品中包含的衰退细胞释放出的基因组DNA和细胞内RNA。当使用本文中描述的稳定化技术时，细胞外核酸群体的这种稀释和改变可以被显著减少。使用本文中描述的稳定化技术实现的细胞外核酸群体的显著保护是重要的优点，因为细胞外核酸群体的这种稳定化/保护提高了旨在分析细胞外核酸的任何后续试验的准确性。这允许将细胞外核酸群体的分离和后续分析标准化，从而使基于细胞外核酸级分的诊断或预后应用更加可靠，并且更加独立于所使用的储存/操作条件。因此，提高了相应地分离的细胞外核酸的诊断和预后适用性。具体来说，本文中描述的稳定化具有下述优点，即包含在细胞外核酸群体中的某些细胞外核酸分子的比率保持基本上恒定，因此可以与生物样品被收集时存在的所述比率相当。因此，细胞外核酸群体的状况可以被有利地保持。
[0024] 根据第三方面，提供了一种适合于使含有细胞的生物样品稳定的组合物，其中所述组合物包含丁酰胺和选自下列的至少一种其他添加剂：
[0025] -凋亡抑制剂，
[0026] -抗凝剂，和
[0027] -式1的化合物
[0028]
[0029] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。
[0030] 相应的稳定化组合物通过使包含在含有细胞的生物样品、尤其是全血、血浆和/或血清中的细胞和细胞外核酸群体稳定，特别有效地使所述样品稳定。相应的稳定化组合物允许稳定化的样品例如全血在室温下储存和/或操作例如运输至少两天或优选地至少三天，而不明显损坏样品和相应地包含在其中的细胞外核酸群体的品质。因此，当使用本发明的稳定化组合物时，样品收集例如血液收集与核酸提取之间的时间可以变化，而对样品中包含的细胞外核酸群体没有显著影响。这是重要的优点，因为它降低了可归因于不同操作程序的细胞外核酸群体的变化性。例如，当使用所述稳定化组合物使血样稳定时，可以从稳定化的样品分离细胞级分以提供包含有受到保护的细胞外核酸群体的血浆或血清样品。
[0031] 根据第四方面，本发明涉及使用第三方面的组合物使含有细胞的生物样品、优选为血样中的细胞外核酸群体稳定。
[0032] 根据第五方面，提供了一种用于收集含有细胞的生物样品的容器，其中所述容器包含丁酰胺和选自下列的至少一种其他添加剂：
[0033] -凋亡抑制剂，
[0034] -抗凝剂，和
[0035] -式1的化合物
[0036]
[0037] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。用于收集含有细胞的生物样品、优选为血样的容器，可以包含本发明的第三方面的稳定化组合物。提供包含稳定化组合物的相应容器例如样品收集管，具有在一旦将样品收集在相应容器中后就立即使含有细胞的生物样品稳定的优点。此外，相应的样品收集容器、尤其是血液收集管，能够稳定化血样中包含的血细胞、细胞外核酸和任选地病毒以及相应地病毒核酸。
[0038] 根据第六方面，提供了一种方法，所述方法包括将生物样品、优选为血液从患者直接收集、优选地抽取到本发明的第五方面的容器的腔室中的步骤。
[0039] 根据第七方面，提供了生产本发明的第三方面的组合物的方法，其中将所述组合物的组分混合，优选地在溶液中混合。当在本文中使用时，术语“溶液”尤其是指液体组合物，优选为水性组合物。它可以是仅仅一个相的均质混合物，但是溶液包含固体组分例如沉淀物，也在本发明的范围之内。
[0040] 对于本领域技术人员来说，从下面的描述和权利要求书，本申请的其他目的、特点、优点和方面将变得明显。然而，应该理解，下面的描述、权利要求书和具体实例，尽管指出了本申请的优选实施方式，但是仅仅是为了说明而给出的。
[0041] 发明详述
[0042] 本发明涉及在使用丁酰胺作为稳定剂的基础上，用于使含有细胞的生物样品稳定，尤其是用于使包含在含有细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定的方法、组合物和装置以及因此技术。此外，描述了丁酰胺与其他稳定剂的有利组合。本文中公开的稳定化技术降低了含有细胞的样品中包含的细胞外核酸群体被源自于样品中包含的损坏和/或死亡细胞的细胞内核酸、尤其是片段化基因组DNA污染并因此稀释的风险。使用本发明的方法和组合物实现的稳定化，允许在室温下长期储存和/或操作稳定化的样品，而不损害样品的质量以及相应地其中包含的细胞外核酸群体的组成。由于在获得样品时细胞外核酸群体的组成被稳定化并因此受到显著保护，因此样品收集与核酸分离之间的时间可以在适合的稳定化时间段内变化，而对细胞外核酸群体的组成没有显著的负面影响。由于样品的操作/储存中的变化性对包含在含有细胞的生物样品中的细胞外核酸群体的质量、相应地组成以及因此分布情况具有较小影响，这例如简化了诊断或预后性细胞外核酸分析的标准化。因此，相应的含有细胞的生物样品和相应地从相应稳定化的样品获得的细胞外核酸的分析，变得更加可比。此外，本发明的教示排除了为了避免以及相应地减少细胞外核酸被否则将在储存/运输期间从死亡或衰退细胞释放的细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA污染，而将生物样品中包含的细胞与样品的无细胞部分直接分离的必要性。这一优点相当大地简化了含有细胞的生物样品例如全血样品的操作。例如，在诊所中获得并按照本发明的教示稳定化的全血样品可以在室温下运输，并且可以在接收的临床实验室中方便地将含有细胞外核酸的血浆与样品的细胞级分分离开。然而，当处理细胞贫乏的生物样品或通常为称为“无细胞的”样品例如血浆或血清时，本发明的教示也是有利的。相应的细胞贫乏的或“无细胞的”生物样品可能仍然(也取决于所使用的分离方法)包含残留的细胞、尤其是包含基因组DNA的白细胞。所述残留细胞造成了下述风险，即如果(潜在)残留的细胞在运输或储存过程中破坏或死亡，细胞外核酸群体将变得被细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA越来越多地污染。当使用本发明教示的稳定化方法时，这种风险被相当大地降低。由于本发明的技术允许在样品被收集并与丁酰胺和任选地一种或多种本文中教示的其他稳定剂相接触时高效地保护样品的细胞外核酸群体，因此所述样品可以在接收机构中正确发挥作用，以便从所述样品分离细胞外核酸，同时基本上避免并相应地减少细胞外核酸群体被细胞内核酸污染。接收样品的机构例如实验室通常也具有必需的设备例如高速离心机(或其他手段，也参见下文)，以高效地除去稳定化的样品中包含的细胞，包括可能存在于细胞贫乏样品例如血浆中的残留细胞。这样的设备在获得含有细胞的生物样品的机构中通常不存在。因此，本发明在稳定化包含大量细胞的生物样品例如全血样品时具有许多优点，而且在稳定化包含较少或仅仅少量细胞或可能仅仅是被怀疑含有细胞的生物样品例如血浆、血清、尿液、唾液、滑液、羊水、泪液、淋巴液、溶液、脑脊液等时，也具有重要优点。
[0043] A.稳定化方法
[0044] 根据第一方面，提供了适合于通过将含有细胞的生物样品与丁酰胺相接触，使含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法。
[0045] 如上所述，所述基于使用丁酰胺作为稳定剂的方法高效地使含有细胞的样品例如血样稳定，尤其是使含有细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定。所述方法降低了细胞外核酸群体被源自于所包含的细胞、例如源自于损坏或死亡细胞的细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA严重污染的风险。因此，在所述含有细胞的样品被收集并使用本发明的方法稳定化时，在所述含有细胞的样品中包含的细胞外核酸群体的组成被显著保持并相应地被稳定化。当细胞外核酸随后出于诊断目的进行分析时，样品中包含的细胞外核酸群体的组成以及因此分布情况的保持是尤其重要的。正如在实施例中所示，使用丁酰胺作为稳定剂实现长达三天的稳定化效果。使用丁酰胺作为稳定剂与例如使用例如有毒试剂N,N-二甲基乙酰胺的方法相比是有利的，这是因为丁酰胺是无毒的。这是基本的益处，因为它简化了稳定化组合物的操作。此外，由于丁酰胺不具有交联性质，因此可以使用标准的核酸分离方法从丁酰胺稳定化的样品高效分离核酸。这是一个重要优点，因为它例如简化了稳定化的样品的进一步处理，并且也提高了可以随后检测细胞外核酸群体中包含的稀有靶核酸的机会。
[0046] 当在本文中使用时，术语“细胞外核酸”尤其是指未包含在细胞中的核酸。相应的细胞外核酸通常也被称为无细胞核酸。这些术语在本文中作为同义词使用。因此，细胞外核酸通常存在于样品内细胞的外部或多个细胞的外部。术语“细胞外核酸”是指例如细胞外RNA以及细胞外DNA。在生物样品例如体液的无细胞级分(相应地部分)中存在的典型的细胞外核酸的实例，包括但不限于哺乳动物细胞外核酸例如细胞外肿瘤相关或肿瘤衍生DNA和/或RNA、其他细胞外疾病相关DNA和/或RNA、表观遗传上修饰的DNA、胎儿DNA和/或RNA、小干扰RNA例如miRNA和siRNA，以及非哺乳动物细胞外核酸例如从原核生物(例如细菌)、病毒、真核寄生虫或真菌释放到细胞外核酸群体中的病毒核酸、病原体核酸。细胞外核酸群体通常包含一定量的从损坏或死亡细胞释放的细胞内核酸。例如，血液中存在的细胞外核酸群体通常包含从损坏或死亡细胞释放的细胞内球蛋白mRNA。这是在体内发生的自然过程。细胞外核酸群体中存在的这种细胞内核酸甚至可以在随后的核酸检测方法中用于对照的目的。本文中描述的稳定化方法尤其降低了在含有细胞的样品被收集后，细胞外核酸群体中包含的细胞内核酸例如基因组DNA的量由于样品的离体操作而显著增加的风险。因此，由于离体操作而引起的细胞外核酸群体的变化被减少并且甚至可以被阻止。根据一种实施方式，含有细胞的生物样品是或者源自于体液，例如血液、血浆、血清、唾液、尿液、溶液、脑脊液、痰液、泪液、汗液、羊水或淋巴液。在本文中，我们将从循环体液例如血液或淋巴液获得的细胞外核酸称为循环细胞外核酸或循环无细胞核酸。根据一种实施方式，术语细胞外核酸尤其是指哺乳动物的细胞外核酸。其实例包括但不限于疾病相关或疾病来源的细胞外核酸，例如肿瘤相关或肿瘤衍生的细胞外核酸、由于炎症或损伤、尤其是创伤而释放的细胞外核酸、与其他疾病相关和/或由于其他疾病而释放的细胞外核酸、或源自于胎儿的细胞外核酸。当在本文中使用时，术语“细胞外核酸”还指从其他含有细胞的生物样品、尤其是体液之外的生物样品获得的细胞外核酸。通常，样品包含超过一种类型或种类的细胞外核酸。细胞外核酸涵盖细胞外DNA以及细胞外RNA。
[0047] 当在本文中使用时，术语“细胞外核酸群体”尤其是指包含在含有细胞的样品中的不同细胞外核酸的集合。含有细胞的样品通常包含特征性并因此独特的细胞外核酸群体。因此，特定样品的细胞外核酸群体中包含的一种或多种细胞外核酸的类型、种类、比率和/或量，可能是重要的样品特征。因此，正如上面讨论的，重要的是使所述细胞外核酸群体稳定并因此将其基本上保持在样品被收集时的状态下，因为样品的细胞外核酸群体中包含的一种或多种细胞外核酸的组成和/或量，可以提供有价值的医学、预后或诊断信息。因此，如果细胞外核酸群体的分布情况被高效地稳定化，将是有利的。本文中描述的稳定化技术在样品收集并稳定化后，减少了细胞外核酸群体被细胞内核酸、尤其是基因组DNA的污染和因此稀释。因此，实现了细胞外核酸群体的显著保护。正如实施例所示，在稳定化期间，细胞外核酸群体在所包含的细胞外核酸的数量、质量和/或组成方面的变化，尤其是可归因于释放出的基因组DNA的增加的变化，与未稳定化的样品或在血样或源自于血液的样品的情形中通过例如EDTA稳定化的相应样品相比，被显著降低。根据一种实施方式，从T0(稳定化时间点)到稳定化时间段结束时(优选地在T0后48h、72h或96h)基因组DNA的增加，与未稳定化的样品或在血样(例如1.5mg EDTA/ml稳定化的血样)或源自于血液的样品的情形中通过例如EDTA稳定化的相应样品相比，降低了至少60％、至少70％、至少75％、至少
80％、至少85％、至少90％或至少95％。
80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0048] 在将含有细胞的生物样品与丁酰胺并任选地与其他添加剂接触后获得的混合物，可能包含浓度为至少0.1％(w/v)、至少0.2％(w/v)、至少0.3％(w/v)、至少0.4％(w/v)、至少0.5％(w/v)、至少0.6％(w/v)、至少0.75％(w/v)、至少1％(w/v)、至少1.25％(w/v)、至少1.5％(w/v)、至少1.75％(w/v)、至少1.85％(w/v)、至少2％(w/v)、至少2.1％(w/v)、至少2.2％(w/v)、至少2.3％(w/v)、至少2.4％(w/v)、至少2.5％(w/v)、至少2.6％(w/v)、至少2.7％(w/v)、至少2.8％(w/v)、至少2.9％(w/v)或至少3％(w/v)的丁酰胺。丁酰胺以对含有细胞的生物样品、尤其是含有细胞的样品的无细胞部分中包含的细胞外核酸群体发挥稳定化效果的浓度使用。正如实施例所示，丁酰胺在各种不同浓度下有效。适合于不同样品类型的丁酰胺的浓度也可以由专业技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中描述的试验测定法中试验丁酰胺的不同浓度。正如实施例所示，适合于丁酰胺的浓度范围也取决于是否与丁酰胺相组合使用一种或多种其他稳定剂。例如，如果与丁酰胺相组合使用本文中所描述的一种或多种其他稳定化添加剂、优选为至少一种半胱天冬酶抑制剂和/或式1的化合物(参见下文)来稳定化含有细胞的生物样品例如血液，则可以使用较低浓度的丁酰胺。当与含有细胞的生物样品并任选地与其他添加剂混合时，丁酰胺的适合浓度范围包括但不限于0.1％(w/v)直至15％、0.25％(w/v)至13％(w/v)、0.4％(w/v)至12％(w/v)、0.5％(w/v)至10％(w/v)、0.75％(w/v)至8％(w/v)、1％(w/v)至
7.5％(w/v)、1.25％(w/v)至7％(w/v)、1.5％(w/v)至6.5％(w/v)、1.75％(w/v)至6％(w/v)、1.8％(w/v)至5.5％(w/v)、1.9％(w/v)至5.25％(w/v)、2％(w/v)至5％(w/v)、
2.1％(w/v)至4.75％(w/v)、2.2％(w/v)至4.5％(w/v)、2.3％(w/v)至4.25％(w/v)、
2.4％(w/v)至4％(w/v)、2.5％(w/v)至3.75％(w/v)或2.5％(w/v)至3.5％(w/v)。根据一种实施方式，所述在将含有细胞的生物样品与丁酰胺和任选地其他添加剂接触后获得的混合物，包含浓度在0.5％(w/v)至3.5％(w/v)、优选地0.75％(w/v)至3.25％或0.9％(w/v)至3％(w/v)范围内的丁酰胺。这样的浓度特别适合于使血样稳定。正如实施例所示，使用浓度在这些范围内的丁酰胺对血样提供了出色的稳定化效果，并且此外防止了血样中包含的红细胞的溶血。当另外使用其他稳定剂例如优选为半胱天冬酶抑制剂和/或式
1的化合物时，≤2％(w/v)的较低丁酰胺浓度特别有效。正如实施例所示，使用这些稳定剂的组合对于使血样稳定来说特别有利。
7.5％(w/v)、1.25％(w/v)至7％(w/v)、1.5％(w/v)至6.5％(w/v)、1.75％(w/v)至6％(w/v)、1.8％(w/v)至5.5％(w/v)、1.9％(w/v)至5.25％(w/v)、2％(w/v)至5％(w/v)、
2.1％(w/v)至4.75％(w/v)、2.2％(w/v)至4.5％(w/v)、2.3％(w/v)至4.25％(w/v)、
2.4％(w/v)至4％(w/v)、2.5％(w/v)至3.75％(w/v)或2.5％(w/v)至3.5％(w/v)。根据一种实施方式，所述在将含有细胞的生物样品与丁酰胺和任选地其他添加剂接触后获得的混合物，包含浓度在0.5％(w/v)至3.5％(w/v)、优选地0.75％(w/v)至3.25％或0.9％(w/v)至3％(w/v)范围内的丁酰胺。这样的浓度特别适合于使血样稳定。正如实施例所示，使用浓度在这些范围内的丁酰胺对血样提供了出色的稳定化效果，并且此外防止了血样中包含的红细胞的溶血。当另外使用其他稳定剂例如优选为半胱天冬酶抑制剂和/或式
1的化合物时，≤2％(w/v)的较低丁酰胺浓度特别有效。正如实施例所示，使用这些稳定剂的组合对于使血样稳定来说特别有利。
[0049] 正如提供的实施例所示，单独的丁酰胺已经可以有效地使含有细胞的样品稳定并保护细胞外核酸群体以防其组成的变化，尤其是由片段化的基因组DNA污染引起的变化。血样可以使用丁酰胺稳定化长达三天的稳定化时间段。考虑到例如血样的常规运输和操作时间段，这是足够的。然而，根据优选实施方式，将含有细胞的生物样品另外地与至少一种凋亡抑制剂相接触。当在本文中使用时，术语“凋亡抑制剂”具体是指其在含有细胞的生物样品中的存在提供了细胞内凋亡过程的减少、阻止和/或抑制，和/或使细胞对凋亡刺激更有抗性的化合物。凋亡抑制剂包括但不限于蛋白质、肽或蛋白质或肽样的分子、有机和无机分子。凋亡抑制剂包括起到代谢抑制剂、核酸降解和相应地核酸途径的抑制剂、酶抑制剂尤其是半胱天冬酶抑制剂、钙蛋白酶抑制剂和参与凋亡过程的其他酶的抑制剂的作用的化合物。相应的凋亡抑制剂列于表1中。优选地，用于使含有细胞的生物样品稳定的至少一种凋亡抑制剂选自代谢抑制剂、半胱天冬酶抑制剂和钙蛋白酶抑制剂。每种类型的实例在表1中列于相应的类目中。优选地，凋亡抑制剂是可透过细胞的。使用来自于相同或不同凋亡抑制剂类型的不同凋亡抑制剂的组合，以及相应地使用通过相同或不同作用机制抑制凋亡的不同凋亡抑制剂的组合，也在本发明的范围之内。
[0050] 在本发明的有利实施方式中，凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。半胱天冬酶基因家族的成员在凋亡中发挥重要作用。为了开发成功地竞争半胱天冬酶结合的肽，已利用了各个半胱天冬酶的底物偏好性或特异性。通过将半胱天冬酶特异性肽偶联于例如醛、腈或酮化合物，可以产生半胱天冬酶激活的可逆或不可逆抑制剂。适合的实例在下文中描述。因此，根据优选实施方式，将含有细胞的生物样品与丁酰胺和至少一种半胱天冬酶抑制剂相接触。正如实施例所示，使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合显著提高了实现的稳定化效果。具体来说，实现了长时间的稳定化效果。此外，已发现，尤其是使用含有大量细胞并且组成上有差异的生物样品例如血样时，实现的稳定化效果更强并且更均匀。例如，源自于不同献血者的血样可能在离体操作期间发生的细胞外核酸群体的变化方面有差异。一些样品显示出细胞外核酸群体的分布情况的强烈改变(尤其是基因组DNA的强烈增加)，而在其他样品中影响不太显著。这样的样品可能也对稳定化具有不同反应。当使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合使从不同献血者获得的血样稳定时，实现了更均衡化、均匀的稳定化效果。因此，原始血样的变化性对实现的稳定化具有更低或甚至没有影响。因此，优选地，将含有细胞的样品与丁酰胺和至少一种半胱天冬酶抑制剂相接触。在得到的混合物中存在的半胱天冬酶抑制剂显著支持稳定化。丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂的组合尤其使包含在生物样品中的有核细胞稳定，从而阻止细胞内核酸例如尤其是基因组DNA从生物样品中包含的细胞释放。已发现，半胱天冬酶抑制剂与丁酰胺的组合，在降低细胞外核酸群体被源自于样品中包含的细胞的细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA污染的风险方面特别有效。正如所述，这样的污染是成问题的，因为它们稀释细胞外核酸，并且进一步改变细胞外核酸群体的组成以及因此分布情况。然而，保持所述分布情况对于诊断应用来说通常是重要的。此外，通过所述稳定剂的组合，减少了样品中存在的核酸、尤其是基因组DNA的降解。
因此，使用丁酰胺与至少一种半胱天冬酶抑制剂的组合显著改进了稳定化效果，从而支持了使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持在获得生物样品以及相应地收集样品时所显示出的状态下，即使在长的储存时期内。细胞外核酸群体、尤其是其组成/分布情况的可靠保持，为现有技术做出了重要贡献。本发明的组合与单独的半胱天冬酶抑制剂或单独的丁酰胺相比具有更好的稳定化效果。使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合实现的结果与使用半胱天冬酶抑制剂与N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)的组合所实现的稳定化效果相当。后一种稳定剂组合描述在未公布的PCT/EP2012/070211和PCT/EP2012/068850中。正如这些未公布的申请所示，半胱天冬酶抑制剂与DMAA的组合在使含有细胞的生物样品例如全血样品中包含的细胞外核酸群体稳定中非常有效。然而，N,N-二甲基乙酰胺是有毒试剂。与此相反，丁酰胺是无毒的，此外，它也没有伤害或刺激性。因此，使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合使含有细胞的生物样品稳定，与使用半胱天冬酶抑制剂与N,N-二甲基乙酰胺的组合相比具有重要的优点。本发明允许高效地使含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定，而不使用有毒试剂。
因此，使用丁酰胺与至少一种半胱天冬酶抑制剂的组合显著改进了稳定化效果，从而支持了使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持在获得生物样品以及相应地收集样品时所显示出的状态下，即使在长的储存时期内。细胞外核酸群体、尤其是其组成/分布情况的可靠保持，为现有技术做出了重要贡献。本发明的组合与单独的半胱天冬酶抑制剂或单独的丁酰胺相比具有更好的稳定化效果。使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合实现的结果与使用半胱天冬酶抑制剂与N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)的组合所实现的稳定化效果相当。后一种稳定剂组合描述在未公布的PCT/EP2012/070211和PCT/EP2012/068850中。正如这些未公布的申请所示，半胱天冬酶抑制剂与DMAA的组合在使含有细胞的生物样品例如全血样品中包含的细胞外核酸群体稳定中非常有效。然而，N,N-二甲基乙酰胺是有毒试剂。与此相反，丁酰胺是无毒的，此外，它也没有伤害或刺激性。因此，使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合使含有细胞的生物样品稳定，与使用半胱天冬酶抑制剂与N,N-二甲基乙酰胺的组合相比具有重要的优点。本发明允许高效地使含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定，而不使用有毒试剂。
[0051] 优选地，半胱天冬酶抑制剂是可透过细胞的。使用不同半胱天冬酶抑制剂的组合，也在本发明的范围之内。半胱天冬酶基因家族的成员在凋亡中发挥显著作用。为了开发成功地竞争半胱天冬酶结合的肽，已利用了各个半胱天冬酶的底物偏好性或特异性。通过将半胱天冬酶特异性肽偶联于例如醛、腈或酮化合物，可以产生半胱天冬酶激活的可逆或不可逆抑制剂。例如，氟甲基酮(FMK)衍生的肽例如Z-VAD-FMK起到有效的不可逆抑制剂的作用，并且没有附加的细胞毒性效应。在N-端和O-甲基侧链处具有苯甲酰氧基羰基(BOC)的合成的抑制剂表现出增强的细胞渗透性。此外，还合成了在C-端处具有酚基的适合的半胱天冬酶抑制剂。一个实例是Q-VD-OPh，其是可透过细胞的不可逆广谱半胱天冬酶抑制剂，在阻止凋亡以及因此支持稳定化方面甚至比半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK更加有效。
[0052] 根据一种实施方式，与丁酰胺相组合用于使含有细胞的生物样品稳定的半胱天冬酶抑制剂是泛半胱天冬酶抑制剂，因此是广谱半胱天冬酶抑制剂。根据一种实施方式，半胱天冬酶抑制剂包含修饰的半胱天冬酶特异性肽。优选地，所述半胱天冬酶特异性肽用醛、腈或酮化合物修饰。根据优选实施方式，半胱天冬酶特异性肽优选地在羧基端用O-苯氧基(OPh)或氟甲基酮(FMK)基团修饰。根据一种实施方式，半胱天冬酶抑制剂选自Q-VD-OPh和Z-VAD(OMe)-FMK。在一种实施方式中，使用泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK，其是竞争性不可逆肽抑制剂并阻断半胱天冬酶-1家族和半胱天冬酶-3家族的酶。在优选实施方式中，使用Q-VD-OPh进行稳定化，其是半胱天冬酶的广谱抑制剂。Q-VD-OPh是可透过细胞的，并抑制通过凋亡的细胞死亡。Q-VD-OPh即使在极高浓度下也对细胞无毒，并包含偶联到氨基酸缬氨酸和天冬氨酸的羧基端苯氧基。它在阻止由三种主要凋亡途径即半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10以及半胱天冬酶-12介导的凋亡中同等地有效(Caserta等，2003)。可以按照本发明的教示使用的其他半胱天冬酶抑制剂列于表1中。根据一种实施方式，用于使含有细胞的样品稳定的半胱天冬酶抑制剂，是作用于位于细胞的细胞内细胞死亡途径下游的一种或多种半胱天冬酶例如半胱天冬酶-3的抑制剂。在本发明的一种实施方式中，半胱天冬酶抑制剂是选自半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10和半胱天冬酶-12的一种或多种半胱天冬酶的抑制剂。正如所述，使用半胱天冬酶抑制剂的组合也在本发明的范围之内。
[0053] 在将生物样品与丁酰胺和至少一种半胱天冬酶抑制剂(和任选地其他添加剂)接触后获得的混合物，可以包含浓度为至少0.01μM、至少0.05μM、至少0.1μM、至少0.5μM、至少0.6μM、至少0.7μM、至少0.75μM至少0.8μM、至少0.9μM、至少1μM、至少
1.25μM、至少1.5μM、至少1.75μM、至少2μM、至少2.25μM、至少2.5μM、至少2.75μM、至少3μM、至少3.25μM或至少3.5μM的半胱天冬酶抑制剂(或半胱天冬酶抑制剂的组合)。当然，如果稳定化效果得以维持，也可以使用更高的浓度。当与含有细胞的生物样品和丁酰胺(以及任选地其他添加剂)混合时，半胱天冬酶抑制剂的适合的浓度范围包括但不限于0.01μM至100μM、0.1μM至75μM、0.25μM至50μM、0.5μM至40μM、0.6μM至30μM、0.7μM 至35μM、0.8μM 至30μM、0.9μM 至25μM、1μM 至20μM、1.1μM 至
17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM。已发现浓度越高越有效，但是在较低浓度下也实现良好的稳定结果。因此，在较低浓度下，例如在选自0.25μM至10μM、0.5μM至7.5μM、0.75μM至5μM或1μM至3μM的范围内，也实现高效的稳定化。上述浓度适用于使用单一半胱天冬酶以及使用半胱天冬酶抑制剂的组合。如果使用半胱天冬酶抑制剂的组合，在所述半胱天冬酶抑制剂混合物中使用的各个半胱天冬酶抑制剂的浓度也可以低于上述浓度，如果凋亡抑制剂的组合的总浓度满足上述特点的话。使用仍然能够有效地稳定细胞和/或减少样品中存在的核酸的降解的较低浓度的半胱天冬酶抑制剂，具有可以降低稳定化成本的优点。尤其是，由于半胱天冬酶抑制剂与丁酰胺组合以及任选地与本文中所描述的一种或多种其他稳定剂组合使用，因此可以使用较低浓度。当使用泛半胱天冬酶抑制剂、尤其是修饰的半胱天冬酶特异性肽例如Q-VD-OPh和/或Z-VAD(OMe)-FMK时，上述浓度是特别适合的。上述浓度非常适合于例如使全血稳定。用于各个半胱天冬酶抑制剂和/或用于其他含有细胞的生物样品的适合的浓度范围，可以由专业技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中描述的试验测定法中试验相应的半胱天冬酶抑制剂的不同浓度。根据一种实施方式，有效量的半胱天冬酶抑制剂将含有细胞的生物样品中的凋亡与不含相应的半胱天冬酶抑制剂的对照样品相比，减少或降低至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、优选地至少75％、更优选地至少85％。
1.25μM、至少1.5μM、至少1.75μM、至少2μM、至少2.25μM、至少2.5μM、至少2.75μM、至少3μM、至少3.25μM或至少3.5μM的半胱天冬酶抑制剂(或半胱天冬酶抑制剂的组合)。当然，如果稳定化效果得以维持，也可以使用更高的浓度。当与含有细胞的生物样品和丁酰胺(以及任选地其他添加剂)混合时，半胱天冬酶抑制剂的适合的浓度范围包括但不限于0.01μM至100μM、0.1μM至75μM、0.25μM至50μM、0.5μM至40μM、0.6μM至30μM、0.7μM 至35μM、0.8μM 至30μM、0.9μM 至25μM、1μM 至20μM、1.1μM 至
17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM。已发现浓度越高越有效，但是在较低浓度下也实现良好的稳定结果。因此，在较低浓度下，例如在选自0.25μM至10μM、0.5μM至7.5μM、0.75μM至5μM或1μM至3μM的范围内，也实现高效的稳定化。上述浓度适用于使用单一半胱天冬酶以及使用半胱天冬酶抑制剂的组合。如果使用半胱天冬酶抑制剂的组合，在所述半胱天冬酶抑制剂混合物中使用的各个半胱天冬酶抑制剂的浓度也可以低于上述浓度，如果凋亡抑制剂的组合的总浓度满足上述特点的话。使用仍然能够有效地稳定细胞和/或减少样品中存在的核酸的降解的较低浓度的半胱天冬酶抑制剂，具有可以降低稳定化成本的优点。尤其是，由于半胱天冬酶抑制剂与丁酰胺组合以及任选地与本文中所描述的一种或多种其他稳定剂组合使用，因此可以使用较低浓度。当使用泛半胱天冬酶抑制剂、尤其是修饰的半胱天冬酶特异性肽例如Q-VD-OPh和/或Z-VAD(OMe)-FMK时，上述浓度是特别适合的。上述浓度非常适合于例如使全血稳定。用于各个半胱天冬酶抑制剂和/或用于其他含有细胞的生物样品的适合的浓度范围，可以由专业技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中描述的试验测定法中试验相应的半胱天冬酶抑制剂的不同浓度。根据一种实施方式，有效量的半胱天冬酶抑制剂将含有细胞的生物样品中的凋亡与不含相应的半胱天冬酶抑制剂的对照样品相比，减少或降低至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、优选地至少75％、更优选地至少85％。
[0054] 根据一种实施方式，将待稳定化的含有细胞的生物样品与丁酰胺和至少一种式1的化合物相接触
[0055]
[0056] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。
[0057] 正如实施例所示，如上定义的式1的化合物单独地或与丁酰胺一起使用时，有效地实现稳定化效果。式1的一种或多种化合物的混合物，也可以与丁酰胺一起用于稳定化。与丁酰胺一起使用一种或多种式1的化合物是有利的，因为它允许降低稳定化所必需的丁酰胺的浓度。这是有利的，因为包含丁酰胺和式1的化合物的稳定化组合物的储存稳定性增加，尤其是在较低温度下。这允许使用小体积的稳定化组合物以使大量含有细胞的生物样品例如血液稳定。
[0058] 根据一种实施方式，为了稳定化，将含有细胞的生物样品与丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和至少一种式1的化合物相接触。优选地，含有细胞的样品是血样。根据一种实施方式，在得到的混合物中，丁酰胺以3％(w/v)或更低、2.5％(w/v)或更低、优选地2.25％(w/v)或更低、更优选地2％(w/v)或更低的浓度被包含。适合的范围包括例如0.1％至3％、0.3％至2.5％、0.5％至2％和0.6％至1.75％，全部都是重量体积比(w/v)。
[0059] 式1的化合物的R2和/或R3相同或不同，并选自氢和烃基。因此，式1的化合物可以是伯、仲或叔酰胺。优选地，式1的化合物是羧酸酰胺。根据一种实施方式，R2和R3是相同或不同的烃基。烃基R2和/或R3可以彼此独立地选自烷基包括短链烷基和长链烷基、烯基、烷氧基、长链烷氧基、环烷基、芳基、卤代烷基、烷基甲硅烷基、烷基甲硅烷基氧基、亚烷基、烯二基(alkenediyl)、亚芳基、羧酸酯和羰基。在说明书和权利要求书中要求并描述了通用集团例如烷基、烷氧基、芳基等。优选地，在本发明的范围内，在通述的基团内使用下列基团：
[0060] (1)烷基：优选为短链烷基，尤其是直链和支链C1-C5烷基，或长链烷基：直链和支链C5-C20烷基；
[0061] (2)烯基：优选为C2-C6烯基；
[0062] (3)环烷基：优选为C3-C8环烷基；
[0063] (4)烷氧基：优选为C1-C6烷氧基；
[0064] (5)长链烷氧基：优选为直链和支链C5-C20烷氧基；
[0065] (6)亚烷基：优选为具有2至18个碳原子并任选地含有杂原子的二价直链或支链脂族、环脂族或芳香族烃基，例如选自：亚甲基；1,1-亚乙基；1,1-亚丙基；1,2-亚丙基；1,3-亚丙基；2,2-亚丙基；丁-2-醇-1,4-二基；丙-2-醇-1,3-二基；1,4-亚丁基；1,4-亚戊基；1,6-亚己基；1,7-亚庚基；1,8-亚辛基；1,9-亚壬基；1,10-亚癸基；1,11-亚十一基；1,12-亚十二基；环己-1,1-二基；环己-1,2-二基；环己-1,3-二基；环己-1,4-二基；
环戊-1,1-二基；环戊-1,2-二基；和环戊-1,3-二基；
环戊-1,1-二基；环戊-1,2-二基；和环戊-1,3-二基；
[0066] (7)烯二基：优选地选自：1,2-丙烯二基；1,2-丁烯二基；2,3-丁烯二基；1,2-戊烯二基；2,3-戊烯二基；1,2-己烯二基；2,3-己烯二基；和3,4-己烯二基；
[0067] (8)炔二基：等于-C≡C-；
[0068] (9)芳基：优选地选自分子量低于300Da的芳香族化合物；
[0069] (10)亚芳基：优选地选自：1,2-亚苯基；1,3-亚苯基；1,4-亚苯基；1,2-亚萘基；1,3-亚萘基；1,4-亚萘基；2,3-亚萘基；1-羟基-2,3-亚苯基；1-羟基-2,4-亚苯基；1-羟基-2,5-亚苯基；1-羟基-2,6-亚苯基；
[0070] (11)羧酸酯：优选为–C(O)OR基团，其中R选自：氢；C1-C6烷基；苯基；C1-C6烷基-C6H5；Li；Na；K；Cs；Mg；Ca；
[0071] (12)羰基：优选为–C(O)R基团，其中R选自：氢；C1-C6烷基；苯基；C1-C6烷基-C6H5和选自-NR’2的胺基(产生酰胺)，其中每个R’独立地选自：氢；C1-C6烷基；C1-C6烷基-C6H5和苯基，其中如果两个R表示C1-C6烷基，则它们可以形成NC3至NC5杂环，并且所述环的烷基取代基形成另一个烷基链；
[0072] (13)烷基甲硅烷基：优选为–SiR1R2R3基团，其中R1、R2和R3彼此独立地选自：氢；烷基；长链烷基；苯基；环烷基；卤代烷基；烷氧基；长链烷氧基；
[0073] (14)烷基甲硅烷基氧基：优选为–O-SiR1R2R3基团，其中R1、R2和R3彼此独立地选自：氢；烷基；长链烷基；苯基；环烷基；卤代烷基；烷氧基；长链烷氧基。
[0074] R2和/或R3的链长n具体来说可以具有值1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。优选地，R2和R3具有1-10的碳链长度。在这种情况下，链长n具体来说可以具有值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。优选地，R2和R3具有1-5的碳链长度，并且在这种情况下，链长具体来说可以具有值1、2、3、4和5。对于R2和R3来说，特别优选的是
1或2的链长。优选地，R2和R3两者是烷基，优选为C1-C5烷基。
1或2的链长。优选地，R2和R3两者是烷基，优选为C1-C5烷基。
[0075] R1的链长n优选地具有1、2、3、4或5的值。对于R1来说，特别优选的是1或2的链长。
[0076] R4优选为氧。
[0077] 根据优选实施方式，式1的化合物是羧酸酰胺。它可以是伯、仲或叔羧酸酰胺。在特别优选的实施方式中，式1的化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。优选的R1、R2、R3和R4基团如上所述。使用相应的式1的化合物具有可以另外地使含有细胞的样品中的细胞内核酸例如尤其是RNA例如mRNA和/或miRNA转录本稳定的优点。细胞内核酸、尤其是基因转录本水平的额外稳定化是有利的，因为它例如允许随后分析所包含的细胞中的靶转录本或转录本分布情况。根据一种实施方式，式1的化合物选自N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二乙基甲酰胺。相应的硫基类似物也是适合的，其包含硫代替氧作为R4。例如N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)实现良好的稳定化结果，然而是有毒试剂。优选地，将式1的化合物与根据GHS分类不是有毒试剂的丁酰胺相组合，用于使含有细胞的生物样品稳定。
[0078] 根据特别优选的实施方式，为了稳定化，将含有细胞的生物样品与丁酰胺和作为式1的化合物的N,N-二烷基丙酰胺相接触，优选地将样品与丁酰胺和N,N-二甲基丙酰胺相接触。优选地，另外将半胱天冬酶抑制剂用于稳定化。根据一种实施方式，将含有细胞的生物样品与丁酰胺、半胱天冬酶抑制剂和N,N-二甲基丙酰胺相接触。如实施例中所示，用半胱天冬酶抑制剂、丁酰胺和N,N-二甲基丙酰胺使含有细胞的生物样品例如血样稳定，获得出色的稳定化结果。使用相应的组合可以实现细胞外核酸群体的稳定化以及细胞内核酸的稳定化。此外，有利的是，与DMAA相反，N,N-二甲基丙酰胺不被分类为有毒试剂。然而，N,N-二甲基丙酰胺是昂贵的化合物，与丁酰胺(并且优选另外地与半胱天冬酶抑制剂)相组合使用N,N-二甲基丙酰胺，允许将低浓度的N,N-二甲基丙酰胺用于稳定化，从而允许降低使含有细胞的样品稳定的成本。
[0079] 当将含有细胞的生物样品与丁酰胺和式1的化合物或相应化合物(和任选地其他添加剂例如优选为半胱天冬酶抑制剂)的混合物相接触时，获得的混合物可能包含浓度为至少0.1％、至少0.25％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少1.25％或至少1.5％的式1的化合物(或这样的化合物的混合物)。适合的浓度范围包括但不限于0.1％至30％、0.25％至20％、0.5％至15％、0.7％至10％、0.8％至7.5％、0.9％至6％和1％至5％。当在本文中使用时，以百分率值标出的浓度或浓度范围，具体对于液体组合物中的固体化合物、物质或组合物来说作为单位体积的重量百分率(w/v)给出，并且对于液体组合物中的液体化合物、物质或组合物来说，作为单位体积的体积百分率(v/v)给出。当使用N,N-二烷基-羧酸酰胺、优选为N-N-二烷基丙酰胺例如N,N-二甲基丙酰胺作为附加稳定剂时，相应的浓度特别适合。上述浓度非常适合于例如使全血或血液制品例如血浆稳定。对于其他式1的化合物和/或其他含有细胞的生物样品来说，在本发明的方法中使用的适合的浓度范围也可以由专业技术人员使用常规实验来确定，例如通过在实施例中描述的试验测定法中试验化合物及其相应的不同浓度。
[0080] 根据一种实施方式，为了稳定化，将含有细胞的生物样品与丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和如上定义的至少一种式1的化合物相接触。如上所述，优选地使用无毒的式1的化合物。特别优选的是与无毒试剂N-N-二烷基丙酰胺例如N,N-二甲基丙酰胺相组合使用。
[0081] 根据一种实施方式，将待稳定化的含有细胞的生物样品与作为稳定剂的丁酰胺和至少一种聚氧乙烯聚合物相接触。
[0082] 术语聚氧乙烯聚合物具体是指环氧乙烷的寡聚物或聚合物。它包含至少两个环氧乙烷单元。具有低和高分子量的聚氧乙烯聚合物是已知的。它们的分子量通常为其单体的分子量44的倍数，并且范围可以高达100000。本文中描述的相应分子量以Da为单位。聚氧乙烯聚合物可以是直链或支链的，或可能具有其他几何形状。直链聚氧乙烯聚合物是优选的。聚氧乙烯聚合物可以是未取代或取代的，并且优选为聚乙二醇。正如在实施例中证实的，具有各种不同分子量和各种不同浓度的聚乙二醇对细胞具有稳定化效果，并且可以与丁酰胺和任选地其他稳定化试剂组合使用，以便支持含有细胞的样品中的细胞外核酸群体的稳定化，尤其是通过协助减少细胞外核酸群体被细胞内核酸例如尤其是基因组DNA的稀释。然而，也可以使用其他聚氧乙烯聚合物，其实现对聚乙二醇所示的稳定化效果。正如提到的，也可以使用具有稳定化效果的取代的聚氧乙烯聚合物，例如烷基聚氧乙烯聚合物如烷基聚乙二醇，以及聚氧乙烯酯、聚氧乙烯胺、聚氧乙烯硫醇化合物、聚氧乙烯甘油酯等。作为稳定剂使用的聚氧乙烯聚合物的优选实施方式是聚乙二醇。它优选地是未分支的，并且可以是未取代或取代的。已知的聚乙二醇的取代的形式包括例如在一个或两个末端处被C1-C5烷基取代的烷基聚乙二醇。优选地，使用式HO-(CH2CH2O)n-H的未取代的聚乙二醇。
在本申请中总体对于聚氧乙烯聚合物来说描述的所有公开内容，都特别适用于并具体是指优选实施方式的聚乙二醇，即使没有明确地陈述。可以使用各种不同分子量的聚氧乙烯聚合物。优选地，术语聚乙二醇是指寡聚物或聚合物，正如也可以从本文中为聚氧乙烯聚合物指定为适合和优选的分子量明显看出的，所述分子量也适用于优选实施方式的聚乙二醇。
在本申请中总体对于聚氧乙烯聚合物来说描述的所有公开内容，都特别适用于并具体是指优选实施方式的聚乙二醇，即使没有明确地陈述。可以使用各种不同分子量的聚氧乙烯聚合物。优选地，术语聚乙二醇是指寡聚物或聚合物，正如也可以从本文中为聚氧乙烯聚合物指定为适合和优选的分子量明显看出的，所述分子量也适用于优选实施方式的聚乙二醇。
[0083] 在聚氧乙烯聚合物的稳定化效果与其分子量之间发现了关联性。发现较高分子量的聚氧乙烯聚合物与较低分子量的聚氧乙烯聚合物相比是更加有效的稳定剂。为了使用较低分子量的聚氧乙烯聚合物实现高效的支持性稳定化效果，一般可以推荐与较高分子量的聚氧乙烯聚合物相比更高的浓度。对于某些应用例如血样来说，保持用于稳定化的添加剂的量低是优选的。因此，在实施方式中，使用较高分子量的聚氧乙烯聚合物作为稳定剂，因为它们允许使用较低的聚氧乙烯聚合物浓度并同时实现对细胞外核酸群体的强的稳定化效果。
[0084] 因此，根据一种实施方式，与丁酰胺一起使用作为其他稳定剂的具有至少1500的分子量的高分子量聚氧乙烯聚合物，并与含有细胞的样品相接触。高分子量聚氧乙烯聚合物可以具有在选自1500至50000、2000至40000、2500至30000、3000至20000、3500至15000、4000至10000、4500至9000、5000至8000和5500至7000的范围内的分子量。这些分子量对于聚乙二醇、尤其是未取代的聚乙二醇的使用来说是特别优选的。在实施例中也使用了未取代的聚乙二醇。具有特定分子量的聚氧乙烯聚合物的分子量可以随着制造条件在一定范围内变化，正如专业技术人员公知的。
[0085] 高分子量聚氧乙烯聚合物以支持包含在含有细胞的样品中的细胞外核酸群体的稳定化的浓度使用。适合于不同样品类型的浓度可以由专业技术人员确定，例如通过在实施例中描述的试验测定法中试验特定高分子量聚氧乙烯聚合物的不同浓度。正如由实施例所证实的，高分子量聚氧乙烯聚合物在各种不同浓度下有效，并支持丁酰胺的稳定化效果。实现的稳定化效果和优选的浓度也取决于除了丁酰胺之外是否使用一种或多种其他稳定剂。优选的组合描述在本文中。根据一种实施方式，在将含有细胞的生物样品与丁酰胺和高分子量聚氧乙烯聚合物以及任选地其他添加剂相接触后获得的混合物，包含选自0.05％至
4％(w/v)、0.1％至3％(w/v)、0.2％至2.5％(w/v)、0.25％至2％(w/v)、0.3％至1.75％(w/v)和0.35％至1.5％(w/v)的浓度范围内的高分子量聚氧乙烯聚合物。根据一种实施方式，高分子量聚氧乙烯聚合物在较低浓度范围例如0.25％至1.5％(w/v)、0.3％至1.25％(w/v)、0.35％至1％(w/v)和0.4％至0.75％(w/v)内使用。上述浓度范围特别适合于血液的稳定化。在某些实施方式中，使用浓度为1.5％(w/v)或更低、1.25％(w/v)或更低、
1％(w/v)或更低，特别是浓度为0.75％(w/v)或更低的高分子量聚氧乙烯聚合物是有利的。在高分子量聚氧乙烯聚合物在包含稳定剂和含有细胞的样品例如血样的得到的混合物中以某些较高浓度使用的实施方式中，已发现当使用某些涉及例如二氧化硅柱的使用的标准核酸分离程序时，细胞外核酸的后续分离可能受损。然而，使用与大多数标准核酸分离方法相容的稳定化技术是有利的，并且使用二氧化硅柱来分离细胞外核酸被广泛地使用和确立。使用在含有样品的稳定化混合物中浓度为1.5％(w/v)或更低、1.25％(w/v)或更低、
1％(w/v)或更低或0.75％或更低的高分子量聚氧乙烯聚合物，支持了可以使用这样的标准方法以良好的收率从稳定化的样品高效分离细胞外核酸，即使使用较大体积的稳定化组合物。这是有利的，因为细胞外核酸以及尤其是包含在细胞外核酸群体中的特定靶核酸，通常仅以很少的拷贝存在。正如在实施例中证实的，观察到的损害也取决于含有高分子量聚氧乙烯聚合物的稳定化组合物的使用体积。使用较小体积的稳定化组合物进行稳定化可以补偿所述损害，即使高分子量聚氧乙烯聚合物以较高浓度使用，以便后续的核酸分离不受损害。因此，降低含有样品的混合物中高分子量聚氧乙烯聚合物的总浓度和/或减少含有高分子量聚氧乙烯聚合物的稳定化组合物的体积，是减少或甚至避免损害的可选的选项。
这种在实施例中证实的体积依赖性效应是显著并且高度令人吃惊的，因为含有样品的混合物中的聚氧乙烯二醇的总浓度是相同的。
4％(w/v)、0.1％至3％(w/v)、0.2％至2.5％(w/v)、0.25％至2％(w/v)、0.3％至1.75％(w/v)和0.35％至1.5％(w/v)的浓度范围内的高分子量聚氧乙烯聚合物。根据一种实施方式，高分子量聚氧乙烯聚合物在较低浓度范围例如0.25％至1.5％(w/v)、0.3％至1.25％(w/v)、0.35％至1％(w/v)和0.4％至0.75％(w/v)内使用。上述浓度范围特别适合于血液的稳定化。在某些实施方式中，使用浓度为1.5％(w/v)或更低、1.25％(w/v)或更低、
1％(w/v)或更低，特别是浓度为0.75％(w/v)或更低的高分子量聚氧乙烯聚合物是有利的。在高分子量聚氧乙烯聚合物在包含稳定剂和含有细胞的样品例如血样的得到的混合物中以某些较高浓度使用的实施方式中，已发现当使用某些涉及例如二氧化硅柱的使用的标准核酸分离程序时，细胞外核酸的后续分离可能受损。然而，使用与大多数标准核酸分离方法相容的稳定化技术是有利的，并且使用二氧化硅柱来分离细胞外核酸被广泛地使用和确立。使用在含有样品的稳定化混合物中浓度为1.5％(w/v)或更低、1.25％(w/v)或更低、
1％(w/v)或更低或0.75％或更低的高分子量聚氧乙烯聚合物，支持了可以使用这样的标准方法以良好的收率从稳定化的样品高效分离细胞外核酸，即使使用较大体积的稳定化组合物。这是有利的，因为细胞外核酸以及尤其是包含在细胞外核酸群体中的特定靶核酸，通常仅以很少的拷贝存在。正如在实施例中证实的，观察到的损害也取决于含有高分子量聚氧乙烯聚合物的稳定化组合物的使用体积。使用较小体积的稳定化组合物进行稳定化可以补偿所述损害，即使高分子量聚氧乙烯聚合物以较高浓度使用，以便后续的核酸分离不受损害。因此，降低含有样品的混合物中高分子量聚氧乙烯聚合物的总浓度和/或减少含有高分子量聚氧乙烯聚合物的稳定化组合物的体积，是减少或甚至避免损害的可选的选项。
这种在实施例中证实的体积依赖性效应是显著并且高度令人吃惊的，因为含有样品的混合物中的聚氧乙烯二醇的总浓度是相同的。
[0086] 根据一种实施方式，与丁酰胺一起用于稳定化的聚氧乙烯聚合物具有低于1500的分子量，并且可以是分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物。它以能够支持对含有细胞的生物样品的细胞外核酸群体的稳定化效果的浓度使用。适合于不同样品类型的浓度可以由专业技术人员确定，例如通过在实施例中描述的试验测定法中试验不同的浓度。相应的聚氧乙烯聚合物例如分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，可以以选自0.5％至10％、1.5％至9％、2％至8％、2至7％、2.5％至7％和3％至6％的浓度范围存在于在将含有细胞的生物样品于所述聚氧乙烯聚合物和任选地其他添加剂相接触后获得的混合物中。百分率值在聚氧乙烯聚合物是固体的情形中是指(w/v)，在聚氧乙烯聚合物是液体的情形中是指(v/v)。所指示的浓度特别适合于在血样的情况下使用。对于低分子量聚氧乙烯聚合物来说，至少1％、优选地至少1.5％的较高浓度，对于与丁酰胺相组合支持细胞外核酸群体的稳定化是有利的。已发现，分子量为1000或更低、优选地700或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，可以以明显更高的浓度使用，因为即使使用较大体积的稳定化组合物，它也不显著妨碍随后从稳定化的样品分离细胞外核酸。然而，如果实现稳定化效果所需的量过高，这对于样品的处理和操作可能是不方便的。使用相当少量或小体积的稳定剂来稳定化样品，一般是优选的。在某些样品例如血样的情况下尤为如此，此时可以向样品添加的稳定剂的量受到所使用的标准收集管的限制。例如，对于用于收集10ml血液的标准收集装置来说，最多可以添加约2ml稳定剂。
[0087] 根据一种实施方式，除了丁酰胺之外，将分子量不同的至少两种聚氧乙烯聚合物用于稳定化。它们可以是相同种类的，并且优选地两者都是聚乙二醇例如未取代的聚乙二醇。根据一种实施方式，分子量的差异为至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000。正如后面对这种实施方式的特定实施方式详细描述的，使用分子量不同的两种聚氧乙烯聚合物是有利的。正如本文中描述的，聚氧乙烯聚合物的稳定化效果似乎取决于它们的分子量。在试验的实施例中已发现，分子量越高，稳定化效率越高。然而，取决于分子量，聚氧乙烯聚合物在它们对后续核酸分离方法的影响方面可能不同。如上所述，在涉及使用较高分子量聚氧乙烯聚合物作为稳定剂，尤其是在含有样品的稳定化混合物中使用较大体积的稳定化组合物和较高浓度的聚合物的某些实施方式中，已发现使用某些核酸分离方法时核酸分离不太有效。正如由实施例所证实的，这种在某些情形中发生的问题，在使用分子量不同的聚氧乙烯聚合物的混合物时可以被克服。因此，这种除了丁酰胺之外还将分子量不同的至少两种聚氧乙烯聚合物用于稳定化的实施方式是有利的，因为它允许提供聚氧乙烯聚合物的均衡组合物，其具有对于待实现的稳定化效果来说所需的特征和例如对于某些下游用途来说所需的特征。
[0088] 根据一种实施方式，将如上定义的分子量为至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物与分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物相组合使用，并将含有细胞的样品另外地与两种类型的聚氧乙烯聚合物相接触。使用高分子量聚氧乙烯聚合物与低分子量聚氧乙烯聚合物的组合是有利的，因为低分子量聚氧乙烯聚合物允许降低实现样品的有效稳定化所需的高分子量聚氧乙烯聚合物的浓度。因此，高分子量聚氧乙烯聚合物可以以一定浓度使用在与样品的混合物中，在所述浓度下，它例如不显著损害使用某些标准方法例如涉及二氧化硅柱的方法进行的后续核酸分离。这种实施方式是有利的，因为它在可以使用的稳定化组合物的体积或量方面提供了更多自由。低分子量聚氧乙烯聚合物有助于稳定化，但是与高分子量聚氧乙烯聚合物相反，在使用诸如涉及二氧化硅柱的方法时，在所试验的实施例中未发现显著损害随后的核酸分离，而较高分子量的聚氧乙烯聚合物在实施例中，在某些浓度和/或体积下显示出损害效应。因此，使用丁酰胺与高和低分子量聚氧乙烯聚合物的组合使含有细胞的样品中的细胞外核酸群体稳定，是有利的实施方式。低分子量聚氧乙烯聚合物可以是与上面描述的高分子量聚氧乙烯聚合物相同的种类。对于低分子量聚氧乙烯聚合物来说，使用聚乙二醇例如未取代的聚乙二醇，也是优选的。低分子量聚氧乙烯聚合物可以具有在选自100至1000、150至800、150至700、优选地200至600、更优选地200至500的范围内的分子量。
[0089] 根据一种实施方式，在将优选为血液的含有细胞的生物样品与丁酰胺和高和低分子量聚氧乙烯聚合物以及任选地用于稳定化的其他添加剂相接触后获得的混合物，包含可能具有3000至40000、优选地4000至20000、更优选地4500至10000范围内的分子量的高分子量聚氧乙烯聚合物，其浓度在0.2％至1.5％(w/v)、优选地0.3％至1.25％(w/v)的范围内，并且在某些实施方式中在0.4％(w/v)至0.75％(w/v)的范围内，以及优选地具有在200至800、优选地200至600的范围内的分子量的低分子量聚氧乙烯聚合物，其浓度在选自1.5％至8％、优选地2％至7％或2％至6％的范围内。所述高和低分子量聚氧乙烯聚合物优选为聚乙二醇，例如未取代的聚乙二醇。丁酰胺的适合浓度如上所述，并且也适用于这种实施方式。在这种实施方式中含有细胞的生物样品可以是血液，并将血样另外地与抗凝剂相接触。抗凝剂的适合实例描述在本文中。
[0090] 根据一种实施方式，为了稳定化，将含有细胞的生物样品与丁酰胺、至少一种聚氧乙烯聚合物以及至少一种半胱天冬酶抑制剂和/或至少一种如上定义的式1的化合物相接触。具体来说，为了稳定化，可以将含有细胞的生物样品与丁酰胺、至少一种聚氧乙烯聚合物和至少一种半胱天冬酶抑制剂相接触。任选地，可以另外使用如上定义的至少一种式1的化合物以使含有细胞的样品的细胞外核酸群体稳定。如上所述，至少一种聚氧乙烯聚合物优选地是高分子量聚氧乙烯聚合物或高和低分子量聚氧乙烯聚合物的组合。高分子量聚氧乙烯聚合物优选地具有至少1500，更优选地在2000至40000、更优选地3000至20000或4500至10000范围内的分子量。聚氧乙烯聚合物优选为聚乙二醇，例如未取代的聚乙二醇。
[0091] 根据一种实施方式，将待稳定化的含有细胞的生物样品与丁酰胺和作为支持性稳定剂的单乙二醇(1,2-乙二醇)相接触。具体来说，可以将待稳定化的含有细胞的生物样品与丁酰胺、单乙二醇和任一种或多种本文中描述的其他化合物，包括至少一种聚氧乙烯聚合物和至少一种半胱天冬酶抑制剂和/或至少一种如上定义的式1的化合物相接触。
[0092] 使用稳定剂的组合观察到的稳定化效果，强于任何单个稳定剂在单独使用时观察到的效果，和/或允许使用较低浓度的各个稳定剂，从而使稳定剂的组合使用成为有吸引力的选项。此外，可以将其他添加剂用于稳定化，例如抗凝剂和螯合剂，其在稳定化血样时特别有用。
[0093] 正如在发明背景中讨论的，细胞外核酸通常不“裸露地”存在于含有细胞的样品的细胞外部分中，而是例如通过被释放保护在复合物中或通过被包含在囊泡等中，在一定程度上被稳定化。这具有使细胞外核酸已被天然稳定化至一定程度，并且通常不被含有细胞的样品例如全血、血浆或血清中的核酸酶快速降解的效果。因此，当打算使含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸稳定时，在获得或收集含有细胞的生物样品后，主要问题之一是在收集到的含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体被源自于含有细胞的生物样品中包含的损坏和/或死亡细胞的细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA的污染。这稀释了细胞外核酸并且改变了细胞外核酸群体的分布情况。这在处理细胞贫乏样品例如血浆或血清(其有时也被描述为“无细胞”，尽管它们可能包含少量残留细胞)时也产生问题。就此而言，本发明的稳定化技术是特别有利的，因为它不仅基本上保护样品中存在细胞外核酸并例如抑制所包含的细胞外核酸的降解(在稳定化时期内，与未稳定化的样品或在血液的情形中例如EDTA稳定化的样品相比，优选地抑制至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或更优选地至少95％)，而且进一步有效地减少基因组DNA从获得的含有细胞的生物样品中包含的细胞的释放和/或减少相应基因组DNA的片段化。根据一种实施方式，使用丁酰胺、任选但优选地半胱天冬酶抑制剂和任选地式1的化合物以及任选地抗凝剂以使含有细胞的生物样品稳定，具有与未稳定化的样品相比，减少由基因组DNA从样品中包含的细胞的释放引起的DNA增加的效果。根据一种实施方式，在稳定化期间，与未稳定化的样品或用EDTA稳定化的相应样品(尤其是在血样或源自于血液的样品例如血浆或血清的情况下)相比，所述基因组DNA的释放减少至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少17倍或至少20倍。根据一种实施方式，在稳定化期间，与未稳定化的样品或用EDTA稳定化的相应样品(尤其是在血样或源自于血液的样品例如血浆或血清的情况下)相比，所述基因组DNA的释放减少至少
60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。DNA的释放可以通过如在本文实施例部分中所描述的核糖体18S DNA的定量来确定。如实施例中所示，使用本发明的教示可以实现的稳定化，在稳定化期间显著降低这种DNA的释放。因此，根据一种实施方式，使用丁酰胺、任选地与半胱天冬酶抑制剂和/或式1的化合物相组合所实现的稳定化效果，导致在稳定化期间DNA从稳定化的样品中包含的细胞的释放至少减少到10倍的最大值，优选地至少减少到7倍的最大值，更优选地至少减少到5倍的最大值，更优选地例如至少减少到4倍的最大值，更优选地至少减少到3倍或2倍的最大值，正如可以在例如实施例中描述的18S DNA测定法中所测定的。正如实施例所示，使用本发明的方法，细胞外核酸群体的有效稳定化可以实现至少3天的时间段，并且当使用本文中描述的稳定剂的组合时甚至长达6天。在例如另外将聚氧乙烯聚合物例如聚乙二醇优选地与半胱天冬酶抑制剂一起用于稳定化的实施方式中，稳定化效果甚至可以更长。在例如直至最长3天的较短的储存以及相应的稳定化期间，DNA释放可以被至少减少至2倍的最大值，正如可以在例如实施例中描述的18S DNA测定法中所测定的。因此，当使用本发明的稳定化方法时，DNA释放可以在长达3天的储存中减少到3倍或更少或2倍或更少。与现有技术的方法相比，这在使细胞外核酸群体稳定方面是显著的改进。这显著提高了分析细胞外核酸的任何后续试验的准确性。在某些情况下，例如如果样品材料必须长距离运输或例如在室温下储存较长时间段(正如例如在某些国家中可能的情况)，本发明的方法能够使这些试验在这样的时间段后可靠地进行。但是，如果需要，当然样品也可以更早地进一步处理。不必使用全部可获得的稳定化时间长度。使用本发明实现的稳定化作用，尤其是当丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂组合使用时，减少了可能由样品收集后样品的不同操作/处理(例如储存条件和时间长度)引起的细胞外核酸群体的变化。此外，由于不发生样品的交联，可以使用标准方法从相应地稳定化的样品高效分离核酸。这极大改进了依赖于细胞外核酸的分析的分子分析的标准化。
60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。DNA的释放可以通过如在本文实施例部分中所描述的核糖体18S DNA的定量来确定。如实施例中所示，使用本发明的教示可以实现的稳定化，在稳定化期间显著降低这种DNA的释放。因此，根据一种实施方式，使用丁酰胺、任选地与半胱天冬酶抑制剂和/或式1的化合物相组合所实现的稳定化效果，导致在稳定化期间DNA从稳定化的样品中包含的细胞的释放至少减少到10倍的最大值，优选地至少减少到7倍的最大值，更优选地至少减少到5倍的最大值，更优选地例如至少减少到4倍的最大值，更优选地至少减少到3倍或2倍的最大值，正如可以在例如实施例中描述的18S DNA测定法中所测定的。正如实施例所示，使用本发明的方法，细胞外核酸群体的有效稳定化可以实现至少3天的时间段，并且当使用本文中描述的稳定剂的组合时甚至长达6天。在例如另外将聚氧乙烯聚合物例如聚乙二醇优选地与半胱天冬酶抑制剂一起用于稳定化的实施方式中，稳定化效果甚至可以更长。在例如直至最长3天的较短的储存以及相应的稳定化期间，DNA释放可以被至少减少至2倍的最大值，正如可以在例如实施例中描述的18S DNA测定法中所测定的。因此，当使用本发明的稳定化方法时，DNA释放可以在长达3天的储存中减少到3倍或更少或2倍或更少。与现有技术的方法相比，这在使细胞外核酸群体稳定方面是显著的改进。这显著提高了分析细胞外核酸的任何后续试验的准确性。在某些情况下，例如如果样品材料必须长距离运输或例如在室温下储存较长时间段(正如例如在某些国家中可能的情况)，本发明的方法能够使这些试验在这样的时间段后可靠地进行。但是，如果需要，当然样品也可以更早地进一步处理。不必使用全部可获得的稳定化时间长度。使用本发明实现的稳定化作用，尤其是当丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂组合使用时，减少了可能由样品收集后样品的不同操作/处理(例如储存条件和时间长度)引起的细胞外核酸群体的变化。此外，由于不发生样品的交联，可以使用标准方法从相应地稳定化的样品高效分离核酸。这极大改进了依赖于细胞外核酸的分析的分子分析的标准化。
[0094] 正如所述，除了丁酰胺之外，可以使用其他添加剂。如上所述，丁酰胺优选地与半胱天冬酶抑制剂相组合使用。任选地，可以在丁酰胺之外或丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合之外使用式1的化合物，以进一步提高对含有细胞的生物样品的稳定化效果和/或以便允许降低丁酰胺的浓度。根据一种实施方式，在组合中使用的式1的化合物是N-N-二烷基丙酰胺，优选为N,N-二甲基丙酰胺。此外，如上所述，除了丁酰胺之外可以使用聚氧乙烯聚合物，以支持稳定化效果。特别优选的是丁酰胺、半胱天冬酶抑制剂和至少一种聚氧乙烯聚合物、优选为聚乙二醇的组合。可以另外使用式1的化合物。
[0095] 可能也对稳定化效果有贡献的适合的添加剂的选择，也可能取决于待稳定化的含有细胞的样品的类型。例如，当处理作为含有细胞的生物样品的血液时，包含抗凝剂以防血液凝结是有利的也是常见的。抗凝剂以能够防止待稳定化的量的血液凝结的浓度使用。抗凝剂可以例如选自例如肝素、螯合剂例如乙二胺四乙酸、羧酸盐例如柠檬酸盐或草酸盐及其任何组合。在有利的实施方式中，抗凝剂是螯合剂。螯合剂是能够通过有机化合物的两个或更多原子与金属形成配位键的有机化合物。本发明的螯合剂包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚乙基二氮基四乙酸(EDTA),乙二醇四乙酸(EGTA)和N,N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)，以及例如柠檬酸盐或草酸盐。根据优选实施方式，使用EDTA作为抗凝剂。当在本文中使用时，术语“EDTA”尤其是指EDTA化合物例如K2EDTA、K3EDTA或Na2EDTA的EDTA部分。使用诸如EDTA的螯合剂还具有抑制核酸酶例如DNA酶和RNA酶，从而例如防止细胞外核酸被核酸酶降解的有利效果。因此，当使用血液之外的含有细胞的样品时，使用螯合剂例如EDTA也是有利的。此外，已发现，以较高浓度使用/添加的EDTA支持稳定化效果。然而，单独的EDTA不能实现足够用于本文中描述的目的的稳定化效果。然而，与本发明的教示组合，尤其是与丁酰胺(和本文中所描述的其他添加剂)组合使用时，由于上面讨论的原因，它可以进一步提高稳定化效果。
[0096] 根据一种实施方式，在将含有细胞的生物样品与丁酰胺和任选地一种或多种其他添加剂相接触后获得的混合物中，螯合剂、优选为EDTA的浓度，在接触步骤后在选自0.1mM至100mM、0.5mM至50mM、1mM至30mM、2.5mM至25mM、5mM至20mM和7.5mM至17.5mM的范围内。根据一种实施方式，在将含有细胞的生物样品与丁酰胺和任选地一种或多种其他添加剂相接触时获得的混合物中，螯合剂、优选为EDTA的浓度在选自0.5至40mg/ml、1至30mg/ml、1.6至25mg/ml、5至20mg/ml和7.5至17.5mg/ml的范围内。在稳定化血液、血浆和/或血清样品时，相应的浓度是特别有效的。适合的浓度也可以由专业技术人员确定。
[0097] 为了进一步支持含有细胞的样品的稳定化并相应地支持细胞外核酸群体的保护，也可以使用其他添加剂。相应添加剂的实例包括但不限于核酸酶抑制剂，尤其是RNA酶和DNA酶抑制性化合物。RNA酶抑制剂的实例包括但不限于抗核酸酶抗体或核糖核苷-氧钒-复合物。当选择相应的其他添加剂以支持稳定化时，应该小心以便不损害和/或抵消稳定化效果。因此，使用的添加剂例如离液剂的浓度不应该引起或支持被稳定化的含有细胞的生物样品中包含的有核细胞的裂解和/或降解，和/或支持所述生物样品的无细胞级分中包含的核酸的降解。因此，优选地，稳定化不涉及具有下列特征的添加剂的使用：(i)诱导或促进有核细胞的裂解，(ii)诱导或促进总体细胞的裂解，和/或(iii)引起含有细胞的生物样品的无细胞级分中包含的核酸的降解。由于本文中描述的稳定化方法不基于细胞裂解而是保护细胞，因此可以在稳定化时间段后从含有细胞的样品分离细胞，从而允许获得包含细胞外核酸群体的无细胞级分或细胞贫乏级分。由于本文中描述的基于丁酰胺的稳定化，因此所述细胞外核酸群体基本上对应于或至少近似于在样品收集和稳定化时存在的细胞外核酸群体。此外，可以从分离到的细胞分离核酸并可将其用于分析。如上所述，包含式1的化合物的组合也具有转录组稳定化性质。在上面描述为优选的式1的化合物特别适合于使被污染的细胞的转录组稳定。为此目的，优选地将至少3％、至少3.5％、优选地至少4％、更优选地至少5％的浓度用于实现强烈的转录组稳定化效果。因此，涉及在丁酰胺之外使用这样的式1的化合物的方法，适合于另外地使细胞内核酸、尤其是RNA稳定。通过在细胞外核酸群体之外使转录组稳定，相应地稳定化的样品也适用于基因表达情况分析。此外，如果需要，相应地稳定化的样品允许从同一稳定化的样品分开地分析细胞外和细胞内核酸群体。
[0098] 本文中所公开的稳定化方法，与基于使用交联试剂例如甲醛、甲醛释放剂等的用于使含有细胞的样品中的细胞外核酸群体稳定的现有技术的稳定化方法相比，提供了显著优点。交联试剂引起核酸分子之间或核酸与蛋白质之间的分子间或分子内共价键。这种交联效应可以妨碍随后从这种稳定化的样品分离核酸。由于例如全血样品中循环核酸的浓度已经相对低，因此进一步降低这种核酸的收率的任何措施都应该避免。当检测和分析例如源自于恶性肿瘤或源自于妊娠前三个月中正发育的胎儿的非常稀少的核酸分子时，这一点可能是特别重要的。正如实施例所示，本发明的方法不需要将交联剂用于稳定化。因此，根据一种实施方式，本发明的稳定化方法不涉及诱导蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂的使用。具体来说，稳定化不涉及甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂的使用。此外，如上所述，根据一种实施方式，本发明的稳定化方法不涉及被分类为有毒试剂的添加剂的使用。
[0099] 在本发明的有利实施方式中，将优选为血样或源自于血液的样品例如血浆或血清的含有细胞的生物样品，与下列物质相接触：
[0100] a)丁酰胺，其浓度优选地使具有含有细胞的生物样品的混合物中丁酰胺的浓度在0.25％(w/v)至7％(w/v)、0.4％(w/v)至5％(w/v)、0.5％(w/v)至4％(w/v)、0.75％(w/v)至3.5％(w/v)或1％(w/v)至3％(w/v)的范围内；
[0101] b)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选为泛半胱天冬酶抑制剂，更优选为Q-VD-OPh，其浓度优选地使具有含有细胞的生物样品的混合物中半胱天冬酶抑制剂的浓度在0.5μM至30μM、更优选地0.75μM至25μM、更优选地1μM至10μM的范围内；以及[0102] c)任选地，至少一种上文定义的式1的化合物(优选的实施方式例如N,N-二烷基羧酸酰胺，尤其是N,N-二烷基丙酰胺，优选为N,N-二甲基丙酰胺，并且适合和优选的浓度在上文描述)，和/或
[0103] d)任选地，其他添加剂，优选为螯合剂，最优选为EDTA，其浓度优选地使具有含有细胞的生物样品的混合物中EDTA的浓度在1mM至50mM、优选地1.5mM至25mM、更优选地2mM至20mM的范围内。
[0104] 优选地，上述组分a)和b)以及任选地c)和d)被包含在稳定化组合物中。
[0105] 在本发明的有利实施方式中，将优选为血样或源自于血液的样品例如血浆或血清的含有细胞的生物样品，与下列物质相接触：
[0106] a)丁酰胺，其浓度优选地使具有含有细胞的生物样品的混合物中丁酰胺的浓度在0.25％(w/v)至7％(w/v)、0.4％(w/v)至5％(w/v)、0.5％(w/v)至4％(w/v)、0.75％(w/v)至3.5％(w/v)或1％(w/v)至3％(w/v)的范围内；
[0107] b)至少一种聚氧乙烯聚合物；
[0108] c)任选地，至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选为泛半胱天冬酶抑制剂，更优选为Q-VD-OPh，其浓度优选地使具有含有细胞的生物样品的混合物中半胱天冬酶抑制剂的浓度在0.5μM至30μM、更优选地0.75μM至25μM、更优选地1μM至10μM的范围内；
[0109] d)任选地，至少一种上文定义的式1的化合物(优选的实施方式例如N,N-二烷基羧酸酰胺，尤其是N,N-二烷基丙酰胺，优选为N,N-二甲基丙酰胺，并且适合和优选的浓度在上文描述)，和/或
[0110] e)任选地，其他添加剂，优选为螯合剂，最优选为EDTA。
[0111] 根据一种实施方式，聚氧乙烯聚合物是分子量为至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物，更优选为聚乙二醇，例如未取代的聚乙二醇。适合的分子量和浓度在上文描述并参考上面的公开内容。根据一种实施方式，它的使用浓度使得具有含有细胞的生物样品的混合物中聚氧乙烯聚合物的浓度在0.2％至1.5％(w/v)、0.25％至1.25％(w/v)、0.3％至1％(w/v)或0.4％至0.75％(w/v)的范围内。根据一种实施方式，高分子量聚氧乙烯聚合物具有至少1500，优选地在2000至40000、更优选地3000至20000或4500至10000的范围内的分子量。在有利实施方式中，将含有细胞的样品与丁酰胺、至少一种聚氧乙烯二醇和至少一种半胱天冬酶抑制剂相接触。根据一种实施方式，另外地使用式1的化合物。为了进行血液的稳定化，有利情况下使用抗凝剂例如螯合剂，优选为EDTA。
[0112] 优选地，将本发明的第三方面的稳定化组合物用于含有细胞的生物样品的稳定化。稳定化组合物的组分可以包含并相应地溶解在溶剂例如水，缓冲液例如生物缓冲液如MOPS、TRIS、PBS等中。此外，可以将组分溶解在极性非质子溶剂中，或者稳定化组合物可以包含极性非质子溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)。
[0113] 丁酰胺、任选地至少一种半胱天冬酶抑制剂和任选地式1的化合物、以及任选地存在的其他添加剂例如抗凝剂，可以存在于用于收集含有细胞的生物样品的装置、优选为容器中。这也同样适用于在丁酰胺之外使用至少一种聚氧乙烯聚合物的情况。丁酰胺和任选地另外用于稳定化的一种或多种化合物，可以存在于相应的装置中存在的稳定化组合物中，或者可以作为分开的实体存在。此外，它们可以在即将收集含有细胞的生物样品之前添加到相应的收集容器，或者可以在将含有细胞的生物样品收集在收集装置中后立即添加到其中。将稳定剂和任选地其他添加剂分开地添加到含有细胞的生物样品，也在本发明的范围之内。然而，为了易于操作，优选地将丁酰胺和用于稳定化的一种或多种或任何其他添加剂提供在相应的收集装置中，例如采取单一组合物的形式。然而，它们也可以作为分开的组分或组合物存在于收集装置中。根据一种实施方式，丁酰胺和用于稳定化的一种或多种或所有其他添加剂不被包含在单一稳定化组合物中。在有利实施方式中，丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和任选地如上所述的式1的化合物和任选地其他添加剂例如抗凝剂如EDTA，在添加含有细胞的生物样品之前存在于收集容器中。这确保含有细胞的生物样品在与按照本发明的教示使用的稳定剂接触后立即被稳定化。稳定化试剂以有效地使待收集并相应地包含在容器中的量的含有细胞的生物样品稳定的量存在于所述容器中。正如上面讨论的，丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和任选地如上所述的式1的化合物和任选地其他添加剂例如抗凝剂如EDTA，可以存在于收集装置中包含的组合物中。这也同样适用于在丁酰胺之外使用至少一种聚氧乙烯聚合物的情况。相应的收集装置的适合和优选的实施方式，也随后与本发明的第五实施方式相结合进行描述，并且它参考所述公开内容。
[0114] 优选地，在含有细胞的生物样品收集之后和/或期间，将含有细胞的生物样品直接与丁酰胺和任选地其他添加剂相接触。因此，如上所述，优选地，用于稳定化的试剂以稳定化组合物的形式提供。优选地，所述稳定化组合物以液体形式提供。它可以被例如预装填在样品收集装置中，使得含有细胞的生物样品在收集期间立即被稳定化。根据一种实施方式，将稳定化组合物与含有细胞的样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。这些比率对于使血样稳定是特别有用的。在得到的具有含有细胞的样品、尤其是血样的混合物中添加剂的适合和优选的浓度在上文中描述，并参考相应的公开内容。本发明的教示的特别优点在于可以使用小体积的本发明的稳定化组合物来实现大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品的比率在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。根据一种实施方式，将稳定化组合物与含有细胞的样品以1:10至
1:5的体积比相接触。这个比率对于例如血液的稳定化是有利的。
1:5的体积比相接触。这个比率对于例如血液的稳定化是有利的。
[0115] 当在本文中使用时，术语“含有细胞的生物样品”、“含有细胞的样品”和类似术语尤其是指包含至少50、250、至少500、至少1000、至少1500、至少2000或至少5000个细胞的样品。此外，包含相当多细胞的含有细胞的样品也被所述术语涵盖，并且可以按照本发明的教示稳定化。然而，术语“含有细胞的生物样品”还指称并因此涵盖细胞贫乏样品，包括通常被称为“无细胞”的细胞贫乏样品例如血浆，因为相应的样品通常包含残留的细胞。至少，通常可以不完全排除即使是所谓的“无细胞”样品例如血浆也包含残留量的细胞，这因此造成细胞外核酸群体被从所述残留细胞释放的细胞内核酸污染的风险。因此，根据一种实施方式，相应的细胞贫乏样品和“无细胞”样品也被术语“含有细胞的生物样品”涵盖。
因此，“含有细胞的样品”可以包含大量细胞，正如例如使用全血的情况，但是也可以仅含有少量细胞。因此，术语“含有细胞的生物样品”还涵盖可能仅被怀疑含有细胞或具有含细胞的风险的样品。正如上面讨论的，对于仅包含少量、相应地残留量的细胞的生物样品例如血浆(取决于制备方法，血浆通常含有少量残留量的细胞，尽管它通常被称为无细胞的)来说，本发明的方法也具有相当大的优点，因为这些残留细胞也可能引起所包含的细胞外核酸的不想要的污染。使用本发明的稳定化技术还确保仅包含残留量细胞或仅仅被怀疑或有风险包含残留量细胞的相应生物样品被高效稳定化，从而保护其中包含的细胞外核酸群体，正如也在上面详细描述的。根据一种实施方式，细胞部分占含有细胞的生物样品的至少
1％、至少2％、至少2.5％、至少5％，优选地至少10％、至少15％、至少20％，更优选地至少
25％、至少30％、至少35％或至少40％。其中细胞级分占比超过40％的含有细胞的样品也可以使用本文中描述的教示进行稳定化。使用本发明的稳定化方法具有下列优点，即基本上不论含有细胞的生物样品的组成和其中包含的细胞数量如何，包含在所述样品中的细胞外核酸群体可以基本上被保护并相应地稳定化，由此允许对随后所包含的细胞外核酸的分离和/或分析进行标准化。
因此，“含有细胞的样品”可以包含大量细胞，正如例如使用全血的情况，但是也可以仅含有少量细胞。因此，术语“含有细胞的生物样品”还涵盖可能仅被怀疑含有细胞或具有含细胞的风险的样品。正如上面讨论的，对于仅包含少量、相应地残留量的细胞的生物样品例如血浆(取决于制备方法，血浆通常含有少量残留量的细胞，尽管它通常被称为无细胞的)来说，本发明的方法也具有相当大的优点，因为这些残留细胞也可能引起所包含的细胞外核酸的不想要的污染。使用本发明的稳定化技术还确保仅包含残留量细胞或仅仅被怀疑或有风险包含残留量细胞的相应生物样品被高效稳定化，从而保护其中包含的细胞外核酸群体，正如也在上面详细描述的。根据一种实施方式，细胞部分占含有细胞的生物样品的至少
1％、至少2％、至少2.5％、至少5％，优选地至少10％、至少15％、至少20％，更优选地至少
25％、至少30％、至少35％或至少40％。其中细胞级分占比超过40％的含有细胞的样品也可以使用本文中描述的教示进行稳定化。使用本发明的稳定化方法具有下列优点，即基本上不论含有细胞的生物样品的组成和其中包含的细胞数量如何，包含在所述样品中的细胞外核酸群体可以基本上被保护并相应地稳定化，由此允许对随后所包含的细胞外核酸的分离和/或分析进行标准化。
[0116] 根据一种实施方式，含有细胞的生物样品选自体液和源自于体液的含有细胞的样品，具体来说为全血、源自于血液的样品例如血浆或血清、血沉棕黄层、尿液、痰液、泪液、淋巴液、汗液、溶液、脑脊液、腹水、乳液、粪便、支气管灌洗液、唾液、羊水、鼻分泌物、阴道分泌物、精子/精液、伤口分泌物、细胞培养物和拭子样品。根据一种实施方式，含有细胞的生物样品是体液、身体分泌物或身体排泄物，优选为体液，最优选为尿液、淋巴液、全血、血沉棕黄层、血浆或血清。具体来说，含有细胞的生物样品可以是循环体液例如血液或淋巴液。优选地，使用本文中描述的技术稳定化的含有细胞的生物样品是血样。根据一种实施方式，含有细胞的生物样品从人类获得。含有细胞的生物样品包含细胞外部分中的细胞外核酸。可以使用本发明的方法稳定化的含有细胞的生物样品的其他实例包括但不限于包含细胞外核酸的细胞悬液、细胞培养物、细胞培养物的上清液等。
[0117] 根据一种实施方式，本发明的方法用于使包含在血样中的细胞外核酸群体稳定，并包括将血样与丁酰胺和抗凝剂相接触，其中在所述稳定化期间，从血样中包含的细胞释放到血样的无细胞部分中的基因组DNA减少。具体来说，本发明提供了用于使包含在血样中的细胞外核酸群体稳定的方法，所述方法包括将血样与丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂相接触，其中从血样中包含的有核细胞释放到血样的无细胞部分中的基因组DNA减少。此外，样品中存在的核酸的降解由于稳定化而减少。如实施例中所示，半胱天冬酶抑制剂可以抑制例如基因组DNA的片段化。特别优选的是与本文中所描述的聚氧乙烯聚合物组合，因为这显著支持对白细胞的稳定化效果。具体来说，在稳定化期间白细胞的裂解被阻止/减少。根据一种实施方式，所述方法被用于使血样中包含的细胞外核酸群体稳定，并包括将血样与丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂、式1的化合物和抗凝剂相接触，所述式1的化合物优选为叔羧酸酰胺，尤其是N,N-二烷基丙酰胺，更优选为N,N-二甲基丙酰胺，其中从血样中包含的细胞释放到血样的无细胞部分中的基因组DNA减少。优选地，所述稳定化效果可以实现至少48h，优选地至少78h。根据一种实施方式，将至少一种聚氧乙烯聚合物与丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂组合使用。正如所述，可以另外使用其他稳定剂和添加剂。
[0118] 当使用本发明的方法稳定化血样时，另一个优点是在稳定化期间可以显著减少溶血。因此，与未稳定化的样品或标准的EDTA血样相比，发生明显更少的溶血并且甚至可以阻止溶血。溶血是红细胞破裂并将它们的细胞质释放到周围的细胞外流体例如血浆中。溶血的程度可以例如通过目测检查来分析，因为释放出的血红细胞将使血清或血浆显现红色。体外溶血的的大多数原因与样本收集相关。然而，如果没有使用适合的稳定化方法，体外溶血通常也在离体储存期间发生在血样中。取决于目标细胞外核酸，溶血可能是相当大的问题。如果目标细胞外核酸是DNA，溶血的问题较小，因为红细胞不含核，因此不含基因组DNA。因此，在溶血期间没有细胞内DNA从红细胞释放。当目标细胞外核酸是DNA时，具体来说白细胞的裂解或衰败是一个问题，因为在这种情况下除了细胞内RNA之外还释放基因组DNA。因此，当目标细胞外核酸是细胞外DNA时，具体来说白细胞的裂解必须被阻止。白细胞的稳定性特征可能彼此不同。因此，某些类型的白细胞比其他类型更加稳定。然而，一般来说，白细胞明显比红细胞更稳定。因此，红细胞的裂解不一定表明白细胞被裂解。白细胞和红细胞对裂解的不同易感性也在本领域中被用于例如特异性裂解红细胞并同时保护白细胞，以便允许例如收集白细胞。然而，如果目标细胞外核酸是RNA，溶血以及因此红细胞的裂解确实构成问题。成熟的红细胞也不含RNA，但它们的前体(网织红细胞)含有RNA。网织红细胞占红细胞的约0.5％至1％，并含有大量球蛋白RNA。因此，尤其是在目标细胞外核酸是RNA时，在储存期间红细胞以及因此网织红细胞的裂解应该被阻止/减少，以便减少细胞外核酸群体、尤其是细胞外RNA群体被球蛋白mRNA稀释。此外，如上所述，重要的是维持细胞外核酸群体的组成以及因此分布情况，这使用本文中描述的稳定化方法来实现，因为这对于许多诊断应用来说是重要的。正如实施例所示，当使用本发明的稳定化方法时，溶血被高效地阻止/减少。由此，细胞外核酸群体受到显著保护，此外，由于阻止了溶血和总的来说细胞裂解，稳定化的血样、尤其是从稳定化的血样获得的血浆或血清，也适合于其他标准实验室分析。
[0119] 正如上面描述的并且正如实施例所证实的，使用本发明的方法允许不冷藏或冷冻即可使含有细胞的样品稳定长时间段。因此，可以将样品保持在室温或甚至高温下，例如高达30℃或甚至高达40℃。根据一种实施方式，稳定化效果可以获得至少两天、优选地至少三天、更优选地至少四天。根据一种实施方式，本发明的稳定化方法不需冷藏，优选地在室温下实现包含在含有细胞的生物样品中的细胞外核酸群体的稳定化，其时间长度为至少两天到三天、至少两天到至少六天和/或至少两天到至少七天。优选地，在所述稳定化期间，本发明的稳定化方法具有使样品中包含的细胞稳定，并且从样品中包含的细胞释放到样品的无细胞部分中的基因组DNA减少和/或样品中存在的核酸的降解由于稳定化而减少的效果。具体来说，在所描述的稳定化期间，稳定化减少了包含在生物样品中的细胞外DNA群体被在稳定化期间源自于稳定化的样品中包含的细胞的基因组DNA的稀释。可以使用本发明的方法获得的稳定化效果在上面进行了详细描述，并参考上述公开内容。优选地，在所述稳定化期间，稳定化减少了包含在生物样品中的细胞外核酸群体被在稳定化期间源自于稳定化的样品中包含的细胞的细胞内核酸、尤其是基因组DNA的污染。如实施例中所示，在室温下，血样可以被稳定化长达3天或更长时间。即使在室温下长达6天或甚至更长的更长期储存期间，当使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂和/或式1的化合物的组合时，细胞外核酸群体也被显著稳定化(尤其是与未稳定化的样品相比或例如与使用标准方法例如EDTA处理稳定化的样品相比)。尽管稳定化效果可能随时间降低，这可能也取决于来源，例如含有细胞的生物样品所源自的供体，但它仍足以保持细胞外核酸群体的组成，以允许细胞外核酸的分析和/或进一步处理。因此，按照本发明的方法稳定化的含有细胞的生物样品，以及尤其是使用丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂稳定化的样品，即使在室温下长期储存后，仍适合于分离和分析其中包含的细胞外核酸。丁酰胺与至少一种聚氧乙烯聚合物和任选地至少一种半胱天冬酶抑制剂的组合的使用，甚至进一步提高含有细胞的生物样品的稳定性，并因此进一步显著延长适合的储存时间。因此，可以设想甚至更长的储存/运输时间。然而，更长的时间段通常不是必需的，因为常规的储存和例如向在其中进行核酸分离和任选的分析的实验室的运输时间，通常不超过6或7天，但通常甚至在2或3天后完成。如实施例中所示，在这个时间段中稳定化效率特别良好。然而，可以使用本发明的方法获得的长的稳定化时间和稳定化效率提供了重要的安全性因素。
[0120] 本发明的方法以及随后描述的稳定化组合物允许使用小体积/量的添加的稳定剂实现大体积的含有细胞的生物样品的稳定化，这是因为丁酰胺和所描述的按照本发明的教示用于稳定化的稳定剂的组合具有高活性，尤其是在组合时。这是重要的优点，因为样品的大小/体积对随后的核酸分离程序提出了相当大的限制，特别是当打算使用自动化过程来分离样品中包含的细胞外核酸时。此外，人们必须考虑到细胞外核酸通常仅以少量包含在含有细胞的生物样品中。因此，处理较大体积的含有细胞的生物样品例如血样，具有更多的细胞外核酸可以从样品分离并因此可用于随后的分析的优点。
[0121] 生物样品的稳定化后可以直接跟随用于分析核酸的技术，或者可以首先从稳定化的样品分离核酸。因此，使用本发明的方法稳定化的含有细胞的生物样品，可以在核酸分析和/或检测方法中进行分析，和/或可以被进一步处理。例如，可以从稳定化的样品分离细胞外核酸，然后可以将其在核酸分析和/或检测方法中进行分析，或可以将其进一步处理。关于核酸分离和分析的详细情况在下文中结合本发明的第二方面进行描述，并且可以参考所述公开内容。正如所描述的，本发明的稳定化方法的一个重要优点在于随后的核酸分离由于稳定化而不受妨碍，正如例如将交联剂例如甲醛释放剂用于稳定化的情况那样。
[0122] B.核酸分离方法
[0123] 根据第二方面，提供了一种用于从含有细胞的生物样品分离核酸的方法，其中所述方法包括下列步骤：
[0124] a)按照本发明的第一方面中描述的方法使含有细胞的样品稳定化；
[0125] b)从稳定化的样品分离核酸。
[0126] 优选地，所述方法被用于从含有细胞的生物样品分离细胞外核酸，并包括下列步骤：
[0127] a)按照在本发明的第一方面中描述的方法使含有细胞的样品中包含的细胞外核酸群体稳定；
[0128] b)分离细胞外核酸。
[0129] 正如上面讨论的，本发明的稳定化具有使样品中包含的细胞外核酸群体基本上保持在生物样品被获得和相应地收集时所显示的状态下的效果。具体来说，通常在储存/操作期间观察到的由细胞内核酸、尤其是基因组DNA、更具体为片段化的基因组DNA引起的核酸的大量增加，被高效减少或甚至阻止，正如在实施例中所证实的。不受理论限制，据信本文中描述的基于丁酰胺的稳定化使细胞稳定和/或减少稳定化期间的细胞破坏，由此减少细胞内核酸的释放。所述方法允许在所需稳定化时间段后从稳定化的样品分离细胞级分。因此，与未稳定化的样品相比，从相应地稳定化的样品获得的细胞外核酸包含明显更少的被源自于降解或死亡细胞的细胞内核酸的污染，并且尤其是包含更少量的片段化的基因组DNA。此外，本文中描述的独特的稳定化允许提高可回收的细胞外核酸的量。如上所述，本发明的稳定化不需使用交联剂。这与涉及使用交联剂例如甲醛或甲醛释放剂的现有技术方法相比是重要的优点，因为在使用标准的核酸分离方法时，这些试剂由于交联而通常减少可回收的细胞外核酸的量。相反，不需交联剂的本发明的稳定化方法不妨碍随后的核酸分离。因此，本发明的方法提高了细胞外核酸的诊断和预后能力。此外，本文中描述的稳定化即使在室温下，也允许在分离样品中包含的细胞之前和/或在步骤b)中分离其中包含的核酸之前，将样品储存和/或操作例如运输更长的时间段。对于在步骤a)中执行的稳定化的详细情况，参考上文中也适用于这里的公开内容。
[0130] 根据一种实施方式，在步骤a)中，使用丁酰胺和至少一种凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂以及任选地其他稳定剂和/或添加剂，使含有细胞的生物样品例如全血样品稳定。如上所述，根据一种实施方式，另外地将至少一种聚氧乙烯聚合物用于稳定化。在步骤a)中进行的本发明的稳定化方法的适合和优选的实施方式在上文中描述，并且参考上文中也适用于这里的公开内容。特别优选的是将丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和任选的式1的化合物用于稳定化。如上所述，这也允许实现所包含的细胞的转录组的稳定化。因此，所述方法还可以包括从样品中包含的细胞分离细胞内核酸。如上所述，优选地预先分离相应的细胞。当稳定化全血样品时，优选的是与抗凝剂、优选为螯合剂例如EDTA的组合。如上所述，使用丁酰胺、至少一种聚氧乙烯聚合物和至少一种半胱天冬酶抑制剂并任选地与一种或多种本文描述的其他添加剂组合，也是有利的。另外使用聚氧乙烯聚合物是有利的，因为它支持所包含的细胞的稳定化，从而阻止细胞内核酸例如基因组DNA的释放。
[0131] 如果正如在例如全血的情况下含有细胞的生物样品包含大量细胞，则将细胞与其余样品分离开，以便获得稳定化的样品的无细胞、相应地细胞减少或细胞贫乏的级分，然后在步骤b)中从其分离细胞外核酸。因此，根据一种实施方式，在步骤a)与步骤b)之间从含有细胞的样品除去细胞。这一中间步骤仅仅是任选的，并且例如如果处理仅包含少量残留细胞的样品例如血浆或血清和/或其中目标细胞外核酸是DNA的样品，则所述步骤可以废弃。由于本发明的稳定化，在稳定化期间基因组DNA从所包含的细胞的释放被减少或甚至阻止，此外，特别是当除了丁酰胺之外还使用半胱天冬酶抑制剂时，基因组DNA的片段化减少。如本文中所述，由于其明显更大的尺寸，未片段化的基因组DNA可以与更小的细胞外DNA区分开。这即使在未片段化的基因组DNA存在下，也允许通过使用尺寸选择性分离流程来选择性地分离细胞外DNA。然而，为了改进结果，优选地在步骤b)中分离细胞外核酸之前从稳定化的样品除去细胞(或可能残留的细胞)，以便减少细胞外核酸群体被否则将在核酸分离期间从细胞释放的细胞内核酸的污染。如果目标细胞外核酸是RNA，则除去所包含的细胞是特别有利的，因为将细胞内RNA与细胞外RNA区分开可能是困难的，此外，由此可以防止细胞外RNA的稀释。然而，如果目标细胞外核酸是DNA，在步骤b)之前的细胞移除步骤一般也是有利的，也是优选的，因为这允许在步骤b)中使用标准的核酸分离程序。取决于含有细胞的生物样品的类型，可以例如通过离心、优选地高速离心，或者如果希望避免离心步骤，通过使用离心之外的手段例如过滤、沉降或结合于例如(任选地磁性)粒子上的表面，来分离并除去细胞、包括残留细胞。相应的细胞分离方法在现有技术中是公知的，并因此不需详细描述。相应的细胞移除步骤也可以容易地包含在自动样品制备流程中。如果需要，相应地移除的细胞也可以被进一步处理。可以例如将细胞储存、分析，和/或可以从移除的细胞分离生物分子例如核酸或蛋白质。此外已发现，细胞内核酸例如细胞内RNA可以被稳定化，尤其是当另外地将式1的化合物例如DMPA用于稳定化含有细胞的样品时。转录组的另外稳定化是有利的，因为它允许例如分析被分离的细胞内核酸中转录本的分布情况，这对于体外诊断来说也可能是重要的生物标志物。
[0132] 此外，在本发明的范围内还包括准备稳定化的样品的其他中间步骤。
[0133] 在步骤b)中，优选地从稳定化的样品的无细胞级分或相应的细胞贫乏级分，例如在稳定化的含有细胞的样品是血样的情况下从上清液、血浆和/或血清，分离细胞外核酸。为了分离细胞外核酸，可以使用适合于从稳定化的样品、相应地获得的细胞贫乏样品分离核酸的任何已知的核酸分离方法。相应的纯化方法的实例包括但不限于提取、固相提取、基于二氧化硅的纯化方法、基于磁性粒子的纯化、酚-氯仿提取、层析、阴离子交换层析(使用阴离子交换表面)、电泳、过滤、沉淀及其组合。通过例如使用能够序列特异性结合并偶联于固相支持物的适合的探针特异性地分离特定的细胞外靶核酸，也在本发明的范围之内。还可以使用专业技术人员已知的任何其他核酸分离技术。根据一种实施方式，在步骤b)中使用离液剂和/或醇类来分离核酸。优选地，通过将核酸结合于固相、优选为包含二氧化硅或阴离子交换官能团的固相，来分离核酸。相应的方法在现有技术中是公知的，因此不需任何详细描述。用于分离细胞外核酸的适合的方法和试剂盒也是可商购的，例如 循
环核酸试剂盒(QIAGEN)、Chemagic循环NA试剂盒(Chemagen)、NucleoSpin血浆XS试剂盒(Macherey-Nagel)、血浆/血清循环DNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)、血浆/血清循环RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)、高纯病毒核酸大体积试剂盒(Roche)以及适用于提取和纯化细胞外核酸的其他可商购试剂盒。
环核酸试剂盒(QIAGEN)、Chemagic循环NA试剂盒(Chemagen)、NucleoSpin血浆XS试剂盒(Macherey-Nagel)、血浆/血清循环DNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)、血浆/血清循环RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)、高纯病毒核酸大体积试剂盒(Roche)以及适用于提取和纯化细胞外核酸的其他可商购试剂盒。
[0134] 根据一种实施方式，从在步骤a)后获得的稳定化的含有细胞的样品或任选地在中间步骤中从稳定化的含有细胞的样品除去细胞后获得的样品，分离总核酸。优选地，从稳定化的样品的无细胞级分或相应地细胞贫乏级分分离核酸。例如，可以从血浆或血清分离总核酸，并且细胞外核酸作为这些提取的核酸中的一部分被包含。如果包含在稳定化的样品中的细胞在核酸分离之前被高效移除，分离的总核酸将主要包含细胞外核酸或甚至由细胞外核酸构成。
[0135] 至少主要地分离特定靶核酸，也在本发明的范围之内。靶核酸可以是例如某种类型的细胞外核酸例如DNA或RNA，包括mRNA、microRNA、其他非编码核酸、表观遗传上修饰的核酸和其他核酸。例如，细胞外靶核酸可以是DNA，并且细胞外非靶核酸可以是RNA，反之亦然。旨在特异性分离DNA或RNA的靶特异性核酸分离方法，在现有技术中也是公知的，因此在本文中不需任何详细描述。根据一种实施方式，通过加入特异性破坏非靶核酸的适当的酶，例如如果靶核酸是DNA时的RNA酶或如果靶核酸是RNA时的DNA酶，来破坏非靶核酸。所述酶可以添加到裂解或结合混合物，或者可以在将细胞外核酸结合于固相后添加。用于执行相应的非靶核酸消化步骤的适合的实施方式在现有技术中是已知的，因此在本文中不需任何进一步描述。根据在DNA和RNA被结合于固相支持物时可行的一种实施方式，可以施加对靶核酸具有选择性的洗脱条件，以主要并因此选择性地从固相支持物回收靶核酸。根据一种实施方式，使用在非靶核酸例如RNA不结合的条件下使靶核酸例如DNA选择性结合于固相的分离方法。适合的结合条件在现有技术中是公知的，并例如描述在WO 95/21849中。根据一种实施方式，通过在适合条件下将至少一部分非靶核酸结合于固相，然后将结合于固相的非靶核酸与包含细胞外靶核酸的其余样品分离开，来除去非靶核酸。这可以例如通过在主要使靶核酸例如DNA结合于固相而非靶核酸例如RNA保留在样品中并在分开的步骤中从其回收的条件下添加适合的固相来实现。适合用于从靶核酸选择性移除非靶核酸的方法，描述在例如通过参考并入本文的EP 0 880 537和WO 95/21849中。如果需要，所述非靶核酸也可以被进一步使用例如进一步处理，例如从固相上洗脱。然而，它也可能被丢弃。
例如在分离靶核酸后使用核酸酶消化非靶核酸或其残留物，也在本发明的范围之内。
例如在分离靶核酸后使用核酸酶消化非靶核酸或其残留物，也在本发明的范围之内。
[0136] 术语靶核酸也可以是指特定种类的核酸，例如已知是某些疾病标志物的特定细胞外核酸。正如上面讨论的，细胞外核酸的分离也可以包含相应靶核酸的特异性分离，例如通过使用支持靶核酸的选择性分离的适合的捕获探针。
[0137] 术语靶核酸还可以是指具有一定长度的核酸，例如长度为5000nt或更短、2000nt或更短、1000nt或更短、900nt或更短、800nt或更短、700nt或更短、600nt或更短、500nt或更短、400nt或更短或350nt或更短的核酸。在本发明的情形中，分离某个最大尺寸的靶核酸可能是有利的。已知细胞外核酸通常具有小于2000nt、小于1000nt、通常甚至小于500nt的尺寸。本文中指明的尺寸和相应地尺寸范围是指链长。即在双链核酸例如双链DNA的情况下，它是指bp。在步骤b)中选择性分离较小的核酸，可以提高在分离的核酸中获得的细胞外核酸的比例。尤其是由于抑制基因组DNA的释放和/或抑制释放的基因组DNA的片段化，本发明的稳定化方法允许更高效地将这样的高分子量基因组DNA与更小的细胞外核酸群体分离开。由于使用本发明的稳定化技术，基因组DNA与细胞外核酸之间的显著尺寸差异基本上得以保持，因此例如使用尺寸选择性核酸分离流程可以更高效地移除基因组DNA。由于在按照本文中所述稳定化的样品中基因组DNA(通常>10,000bp)与细胞外核酸(通常<1000nt/bp)之间的尺寸差异由于高效的稳定化作用而通常相对大，因此可以使用用于选择性分离具有一定目标长度的核酸的已知方法。因此，根据一种实施方式，步骤b)包括选择性地分离长度为5000nt或更短、2000nt或更短、1500nt或更短、1000nt或更短、900nt或更短、800nt或更短、700nt或更短、600nt或更短或500nt或更短的靶核酸。适合于例如通过去除高分子量基因组DNA来实现核酸的相应尺寸选择性分离的方法，在现有技术中是已知的，并因此不需在本文中详细描述。用于分离目标尺寸的DNA的经典方法包括在凝胶中分离DNA，切出所需的凝胶条带，然后从凝胶段分离目标尺寸的DNA。另一种广泛使用的技术是用基于聚乙二醇的缓冲液进行尺寸选择性沉淀(Lis和Schleif，Nucleic Acids Res.1975 Mar；2(3):383-9)或在羧基官能化的珠子上结合/沉淀(DeAngelis等，Nuc.Acid.Res.1995,Vol 23(22),4742-3；US 5,898,071和US 5,705,628，由Beckman-Coulter商业化(AmPure XP；SPRIselect)和US 6,534,262)。此外，基于使用包含阴离子交换基团的固相支持物和变化的pH值的尺寸选择性分离方法是已知的。尺寸选择性分离为减少分离的细胞外核酸中细胞内核酸的量提供了进一步的机会。例如，当感兴趣的细胞外靶核酸是DNA时，在核酸分离步骤b)期间移除基因组DNA，也可以补充或甚至代替在开始核酸提取之前为了移除残留细胞而进行的血浆样品的单独的高离心力离心。由于本发明的稳定化，阻止了从所述残留细胞释放的基因组DNA被大规模降解，尤其是如果在丁酰胺之外还使用半胱天冬酶抑制剂的话，因此，可以通过在步骤b)中使用尺寸选择性核酸分离流程，来脱除所述未片段化或片段化较低的基因组DNA。这种选择方案是特别有利的，因为许多临床实验室不具有能够执行这样的高离心力离心的离心机或用于移除尤其是痕量残留细胞的其他手段。
[0138] 然后可以在步骤c)中使用适合的测定法和/或分析方法对分离的细胞外核酸进行分析和/或进一步处理。例如，可以将它们鉴定、修饰、与至少一种酶相接触、扩增、反转录、克隆、测序、与探针相接触、检测(它们的存在或不存在)和/或可以对它们定量。相应的方法在现有技术中是公知的，并通常应用于医学、诊断和/或预后领域，以便分析细胞外核酸(也参见在本发明的背景中的详细描述)。因此，在步骤b)中在将细胞外核酸任选地作为总核酸、总RNA和/或总DNA的一部分分离(参见上文)后，可以对它们进行分析以例如鉴定疾病状态的存在、不存在或严重性，包括但不限于多种肿瘤性疾病、尤其是恶性前和恶性疾病，例如不同形式的肿瘤或癌症。例如，在许多应用领域中，可以对分离的细胞外核酸进行分析以便检测诊断和/或预后标志物(例如胎儿或肿瘤来源的细胞外核酸)，所述领域包括但不限于非侵入性产前遗传测试和相应地筛查、疾病筛查、病原体筛查、肿瘤学、癌症筛查、早期癌症筛查、癌症疗法监测、遗传试验(基因分型)、传染病试验、损伤诊断、创伤诊断、移植医学或许多其他疾病，因此是诊断和/或预后相关的。根据一种实施方式，对分离的细胞外核酸进行分析，以鉴定和/或表征疾病或胎儿的特征。因此，正如上面讨论的，本文描述的分离方法还可以包括核酸分析和/或处理的步骤c)。
[0139] 因此，根据一种实施方式，在步骤c)中对分离的细胞外核酸进行分析，以鉴定、检测、筛选、监测或排除疾病和/或至少一种胎儿特征。分离的细胞外核酸的分析/进一步处理可以使用任何核酸分析/处理方法来进行，包括但不限于扩增技术、聚合酶链反应(PCR)、等温扩增、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)、数字PCR、凝胶电泳、毛细管电泳、质谱术、荧光检测、紫外光谱术、杂交测定法、DNA或RNA测序、下一代测序、限制性分析、反转录、NASBA、等位基因特异性聚合酶链反应、聚合酶循环组装(PCA)、不对称聚合酶链反应、指数后线性聚合酶链反应(LATE-PCR)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、热启动聚合酶链反应、序列间特异性聚合酶链反应(ISSR)、反向聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应、甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、多重聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、固相聚合酶链反应或其任何组合。相应的技术对于专业技术人员来说是公知的，因此在这里不需进一步描述。
[0140] 根据一种实施方式，分离步骤b)和分析步骤c)中的任一者或两者，在按照本发明的教示将含有细胞的生物样品收集并相应地稳定化后至少一天直至三天或两天直至七天进行。含有细胞的生物样品、尤其是血样以及相应地其中包含的细胞外核酸群体可以使用本发明的方法稳定化的适合的时间长度，也在上文中结合稳定化方法进行了描述，相应的公开内容也适用于此处。根据一种实施方式，核酸分离步骤b)在含有细胞的样品按照本发明的方法收集并稳定化后至少1天、至少2天或至少3天进行。
[0141] C.稳定化组合物
[0142] 此外，根据本发明的第三方面，提供了一种适用于使含有细胞的生物样品稳定的组合物，其中所述组合物包含丁酰胺和选自凋亡抑制剂、抗凝剂和式1的化合物的至少一种其他添加剂
[0143]
[0144] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。
[0145] 正如上面讨论的，本发明提供的稳定化组合物、尤其是包含丁酰胺和凋亡抑制剂的组合物，通过使包含的细胞和包含的细胞外核酸稳定，从而在稳定化时基本上保护并相应地稳定化细胞外核酸群体，在使含有细胞的生物样品、尤其是血液、血浆和/或血清稳定中特别有效。相应的稳定化组合物允许含有细胞的生物样品、优选为全血在室温下储存和/或操作例如运输至少两天、优选地至少三天或甚至更长时间，而不显著损害血样和相应地包含在其中的细胞外核酸群体的质量。当然，并不强制使用整个可能的稳定化时间段。如果需要，也可以更早对样品进行处理。将生物样品与稳定化组合物相接触，允许在分离和任选地分析和/或处理所包含的细胞外核酸之前，将样品甚至在室温下储存和/或操作例如运输。因此，含有细胞的样品的收集和稳定化与核酸提取之间的时间可以变化，而不显著影响其中包含的细胞外核酸群体的总数和相应的组成。具体来说，减少或甚至阻止了细胞外核酸组成被细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA的稀释和相应的污染。优选地，在收集含有细胞的生物样品期间或其之后立即将稳定化组合物与含有细胞的样品相接触。
[0146] 根据一种实施方式，包含丁酰胺的稳定化组合物另外地包含半胱天冬酶抑制剂。与丁酰胺组合使用半胱天冬酶抑制剂的优点以及半胱天冬酶抑制剂的适合和优选的实施方式，在上文中结合第一方面的稳定化方法进行了详细描述，并且可以参考上面也适用于这里的公开内容。优选地，半胱天冬酶抑制剂是泛半胱天冬酶抑制剂。优选地，半胱天冬酶抑制剂是优选地在C-端处用O-苯氧基修饰的修饰的半胱天冬酶特异性肽例如Q-VD-OPh。
[0147] 根据一种实施方式，所述组合物另外地包含至少一种聚氧乙烯聚合物。与丁酰胺组合使用聚氧乙烯聚合物的优点以及聚氧乙烯聚合物的适合和优选的实施方式，在上文中结合第一方面的稳定化方法进行了详细描述，并且可以参考上面也适用于这里的公开内容。聚氧乙烯聚合物的分子量可以在例如100至40000的范围内。优选地，聚氧乙烯聚合物是分子量为至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物。优选地，聚氧乙烯聚合物是聚乙二醇，例如未取代的聚乙二醇。在某些实施方式中，分子量可以在选自1500至40000、2000至30000、2500至25000、3000至20000、3500至15000、优选地4000至10000、4500至9000和
5000至8000的范围内。优选地，所述包含丁酰胺和至少一种聚氧乙烯聚合物的组合物另外地包含半胱天冬酶抑制剂。
5000至8000的范围内。优选地，所述包含丁酰胺和至少一种聚氧乙烯聚合物的组合物另外地包含半胱天冬酶抑制剂。
[0148] 在特定实施方式中，包含丁酰胺和高分子量聚氧乙烯聚合物的稳定化组合物另外地包含至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量比所述高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100、优选地低至少200、至少300或至少400。正如上文中结合第一方面的稳定化方法所描述的，使用分子量不同的聚氧乙烯聚合物的组合是有利的。优选地，两种聚氧乙烯聚合物都是聚乙二醇例如未取代的聚乙二醇。根据有利的实施方式，包含分子量为至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物的稳定化组合物，另外地包含分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物作为其他聚氧乙烯聚合物。详细情况在上文中结合第一方面的稳定化方法进行了描述，并且相应的公开内容也适用于此处。低分子量聚氧乙烯聚合物优选为聚乙二醇，例如未取代的聚乙二醇。低分子量聚氧乙烯聚合物的分子量可以在选自100至1000、150至800的范围内，并且优选地在200至600的范围内。
[0149] 根据一种实施方式，包含丁酰胺的稳定化组合物另外地包含至少一种式1的化合物
[0150]
[0151] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基，更优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒。优选的实施方式在上文中结合稳定化方法进行了描述，并且应该指出上述公开内容也适用于此处。式1的化合物可以是伯、仲或叔羧酸酰胺。优选地，至少一种式1的化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。优选地，使用不被分类为有毒试剂的式1的化合物。根据一种实施方式，组合物包含丁酰胺和N,N-二烷基丙酰胺，优选为N,N-二甲基丙酰胺。N,N-二甲基丙酰胺不被分类为有毒试剂。此外，N,N-二甲基丙酰胺具有如果以适合的浓度使用，能够使细胞内核酸稳定，尤其是可以使转录情况稳定的有利效果。优选地，所述包含丁酰胺和式1的化合物的组合物另外地包含半胱天冬酶抑制剂。根据一种实施方式，它另外地包含至少一种聚氧乙烯聚合物。
[0152] 根据一种实施方式，稳定化组合物包含丁酰胺和至少一种抗凝剂。这种实施方式特别适用于使血样或源自于血液的含有细胞的样品稳定。根据一种实施方式，稳定化组合物包含丁酰胺和螯合剂。也起到抗凝剂作用的适合的螯合剂以及用于稳定化的适合的浓度，在上面结合本发明的方法进行了描述，并且应该指出上述公开内容也适用于此处。优选地，将EDTA用作抗凝剂，并相应地用作螯合剂。为了使血液稳定，稳定化组合物优选地包含丁酰胺、优选为半胱天冬酶抑制剂的至少一种凋亡抑制剂和抗凝剂，以及任选地至少一种式1的化合物。式1的化合物优选为N,N-二烷基丙酰胺，优选为N,N-二甲基丙酰胺。为了稳定化血液，稳定化组合物也可以包含丁酰胺、优选为半胱天冬酶抑制剂的至少一种凋亡抑制剂、抗凝剂和优选为聚乙二醇的至少一种聚氧乙烯聚合物，以及任选地至少一种式1的化合物。式1的化合物优选为N,N-二烷基丙酰胺，优选为N,N-二甲基丙酰胺。
[0153] 稳定化组合物还可以包含如上所述的其他添加剂。
[0154] 凋亡抑制剂、尤其是半胱天冬酶抑制剂、式1的化合物和抗凝剂的适合和优选的实施方式，在上文中结合稳定化方法进行了详细描述，并且应该指出上述公开内容也适用于此处。这同样适用于至少一种聚氧乙烯聚合物。此外，可以在包含稳定化组合物和含有细胞的生物样品的稳定化混合物中用于稳定化的各个试剂的适合和优选的浓度在上文中描述，并且专业技术人员可以选择所述试剂在稳定化组合物中的适合浓度，以便在将目标量的稳定化组合物与待稳定化的目标量的含有细胞的样品混合时在混合物中获得所述浓度。对于稳定化组合物来说，可以参考上文中也适用于此处的公开内容。
[0155] 根据一种实施方式，本发明的稳定化组合物具有一种或多种，优选地至少两种、至少三种，更优选地所有下述特征：
[0156] i)组合物包含浓度为5％(w/v)至50％(w/v)、7.5％(w/v)至40％(w/v)、10％(w/v)至35％(w/v)、12.5％(w/v)至30％(w/v)或15％(w/v)至25％(w/v)的丁酰胺，[0157] ii)组合物包含至少一种半胱天冬酶抑制剂，
[0158] iii)组合物包含浓度为2％至50％、3％至40％、3.5％至30％、4％至25％、4.5％至20％或5％至17.5％的至少一种式1的化合物，优选为N-N-二甲基丙酰胺，和/或[0159] iv)组合物包含抗凝剂。
[0160] 根据一种实施方式，本发明的稳定化组合物具有一种或多种，优选地至少两种、至少三种，更优选地所有下述特征：
[0161] i)组合物包含浓度为5％(w/v)至50％(w/v)、7.5％(w/v)至40％(w/v)、10％(w/v)至35％(w/v)、12.5％(w/v)至30％(w/v)或15％(w/v)至25％(w/v)的丁酰胺，[0162] ii)组合物包含至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选为泛半胱天冬酶抑制剂，更优选为Q-VD-OPh；
[0163] iii)组合物包含至少一种聚氧乙烯聚合物，优选为分子量为至少1500，优选地在2000至40000、更优选地在3000至20000或4500至10000的范围内的至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物；
[0164] iv)组合物包含浓度为2％至50％、3％至40％、3.5％至30％、4％至25％、4.5％至20％或5％至17.5％的至少一种式1的化合物，优选为N-N-二甲基丙酰胺，和/或[0165] v)组合物包含抗凝剂和/或螯合剂，优选为EDTA。
[0166] 如上所述，根据一种实施方式，将高分子量聚氧乙烯聚合物与至少一种其他聚氧乙烯聚合物组合使用，所述其他聚氧乙烯聚合物的分子量比所使用的高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100，优选地低至少200、至少300或至少400。所述其他聚氧乙烯聚合物可以是分子量为1000或更低，优选地分子量在200至800或200至600的范围内的低分子量聚氧乙烯。详细情况在上文中结合第一方面的方法进行了描述。
[0167] 根据一种实施方式，所述稳定化组合物是液体。
[0168] 根据一种实施方式，提供了液体稳定化组合物，其包含丁酰胺和优选为聚乙二醇的至少一种聚氧乙烯聚合物。随后，指定如果存在于特别优选用于血样稳定化的稳定化组合物中，各个试剂的浓度。例如，0.5ml至2ml、优选地1ml至1.5ml的包含下面指定浓度的稳定剂的液体稳定化组合物，可用于使10ml血液稳定。根据一种实施方式，组合物包含丁酰胺和分子量为至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物，其浓度选自0.4％至35％(w/v)、0.8％至25％(w/v)、1.5％至20％(w/v)、3％至15％(w/v)和4％至10％(w/v)。根据一种实施方式，所述液体稳定化组合物包含丁酰胺和分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，其优选为聚乙二醇，浓度选自0.8％至92.0％、3.8％至76.7％、11.5％至53.7％和19.2％至38.3％。取决于低分子量聚氧乙烯聚合物是否为液体，上述浓度是指(w/v)或(v/v)。如上所述，根据一种实施方式，稳定化组合物包含高和低分子量聚氧乙烯聚合物。当与低分子量聚氧乙烯聚合物相组合使用高分子量聚氧乙烯聚合物时适合的浓度范围的实例，包括但不限于选自0.4％至30.7％、0.8％至15.3％、1％至10％、1.5％至7.7％和
3.1％至5.4％的浓度。根据一种实施方式，所述液体稳定化组合物包含浓度选自0.4％至
38.3％、0.8％至23.0％、2.3％至11.5％和3.8％至9.2％(均为(w/v))的丁酰胺。根据一种实施方式，所述液体稳定化组合物包含浓度选自0.1μM至220μM、0.8μM至115.0μM、
7.7μM至76.7μM和23.0μM至50μM的半胱天冬酶抑制剂。根据一种实施方式，所述液体组合物包含螯合剂，优选为EDTA例如K2EDTA，其浓度选自9.5mM至1100mM、20mM至750mM、
50mM至600mM、75mM至550mM、100mM至500mM和125mM至450mM。
3.1％至5.4％的浓度。根据一种实施方式，所述液体稳定化组合物包含浓度选自0.4％至
38.3％、0.8％至23.0％、2.3％至11.5％和3.8％至9.2％(均为(w/v))的丁酰胺。根据一种实施方式，所述液体稳定化组合物包含浓度选自0.1μM至220μM、0.8μM至115.0μM、
7.7μM至76.7μM和23.0μM至50μM的半胱天冬酶抑制剂。根据一种实施方式，所述液体组合物包含螯合剂，优选为EDTA例如K2EDTA，其浓度选自9.5mM至1100mM、20mM至750mM、
50mM至600mM、75mM至550mM、100mM至500mM和125mM至450mM。
[0169] 本发明提供的稳定化组合物使含有细胞的生物样品稳定，因此不引起有核细胞以及优选地样品中包含的有核细胞的裂解和/或破坏。因此，稳定化组合物不包含其浓度会诱导或促进相应的细胞以及优选地总体细胞的细胞裂解的添加剂。稳定化组合物可以减少样品中包含的细胞的破坏，正如可以通过实施例部分中描述的测定法确定的。具体来说，本文中描述的稳定化组合物能够减少基因组DNA从含有细胞的生物样品中包含的细胞释放到所述样品的无细胞部分中。此外，尤其是在包含半胱天冬酶抑制剂时，稳定化组合物可能能够减少稳定化的样品中存在的核酸、尤其是基因组DNA的降解。正如所述，稳定化组合物能够减少或阻止生物样品中包含的细胞外DNA群体被源自于稳定化的样品中包含的细胞的基因组DNA的污染。优选地，它能够减少或阻止生物样品中包含的细胞外核酸群体被源自于稳定化的样品中包含的细胞的细胞内核酸、尤其是DNA和RNA的污染。优选地，稳定化组合物不包含引起蛋白质-DNA和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂。具体来说，稳定化组合物不包含甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂或类似的交联剂。优选地，稳定化组合物不包含按照GHS被分类为有毒试剂的试剂。优选地，本发明的稳定化组合物能够不需冷藏，优选地在室温下使含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定选自至少两天、至少三天、至少两天到三天、至少两天到六天和/或至少两天到七天的时间段。具体来说，在所限定的稳定化时间段内，实现一种或更多种、优选地所有上述稳定化效果。
[0170] 根据一种实施方式，稳定化组合物基本上由稳定剂即丁酰胺和优选为半胱天冬酶抑制剂的一种或多种凋亡抑制剂、式1的化合物和优选为螯合剂例如EDTA的抗凝剂，以及任选地溶剂和/或缓冲剂构成。根据一种实施方式，所述稳定化组合物包含一种或多种聚氧乙烯聚合物。
[0171] 稳定化组合物可以以固体形式、半液体形式或作为液体提供。如果例如待稳定的含有细胞的生物样品含有液体以溶解固体(例如含有细胞的体液、培养基中的细胞、尿液)或者如果向其加入液体例如水以溶解固体组合物，则固体组合物是适合的选项。使用固体稳定化组合物的优点在于固体通常在化学上更加稳定。然而，也可以使用液体稳定化组合物。液体组合物通常具有可以快速获得与待稳定化的样品的混合物，从而基本上在样品一与液体稳定化组合物发生接触后就提供即时稳定化效果的优点。优选地，液体稳定化组合物中存在的稳定剂在溶液中保持稳定，并且不需要由用户进行预处理，例如将溶解度有限的沉淀物溶解，因为这种预处理带来了稳定化效率改变的风险。相应的储存稳定的液体稳定化组合物的实例包含丁酰胺、半胱天冬酶抑制剂和式1的化合物，优选为N,N-二烷基丙酰胺例如N,N-二甲基丙酰胺。相应的储存稳定的液体稳定化组合物的另一个实例包含丁酰胺、半胱天冬酶抑制剂和至少一种聚氧乙烯聚合物。
[0172] 本发明还提供了包含与含有细胞的生物样品混合的本发明的第三方面的稳定化组合物的混合物。含有细胞的生物样品的适合和优选的实例以及当与含有细胞的生物样品混合时稳定剂的适合浓度，在上文中尤其结合本发明的稳定化方法进行了描述。应该指出，上述公开内容也适用于此处。正如所述，含有细胞的样品优选为血样。
[0173] 根据一种实施方式，将本发明的稳定化组合物预装填到样品收集装置中，以便在收集期间或之后立即使样品稳定。根据一种实施方式，将稳定化组合物与含有细胞的生物样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。本发明的稳定化组合物的特别优点在于，可以使用小体积的稳定化组合物实现大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品的比例在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。根据一种实施方式，将稳定化组合物与含有细胞的生物样品以1:10至1:5的体积比相接触。
[0174] 本发明的第三方面的稳定化组合物可用于使含有细胞的样品例如优选为血样中包含的细胞外核酸群体稳定。特别有利的是另外使用至少一种聚氧乙烯聚合物。此外，本发明的第三方面的稳定化组合物也可用于使样品中包含的细胞和/或细胞内核酸稳定。如上所述，稳定化组合物可以使细胞稳定，从而尤其是减少基因组DNA和其他细胞内核酸从含有细胞的生物样品中包含的细胞释放。因此，减少了细胞外核酸群体被基因组DNA和其他细胞内核酸的污染。此外，尤其是如果稳定化组合物包含式1的化合物，例如尤其是在上文中被描述为优选的羧酸酰胺，则可以使转录组稳定。
[0175] D.用途
[0176] 根据第四方面，本发明涉及使用丁酰胺和优选地第三方面的稳定化组合物，来稳定化含有细胞的生物样品以及尤其是含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体。具体来说，稳定化组合物可用于本发明的第一方面的方法中。所述方法的详细情况在上文中描述，并且应该指出上述公开内容也适用于此处。根据另一方面，本发明涉及使用第三方面的组合物来稳定化含有细胞的生物样品中的细胞和/或转录组。优选地，如上所述，如果如优选实施方式那样含有细胞的生物样品是血液，则所述组合物包含抗凝剂。
[0177] G.制造方法
[0178] 还提供了制造本发明的第三方面的稳定化组合物的方法，其中将稳定化组合物的组分混合，以优选地提供液体溶液。
[0179] E.收集装置
[0180] 本发明的稳定化组合物也可以并入到样品收集装置、尤其是血液收集套件例如血液收集容器中，由此提供这样的装置的新的和有用的版本。这样的装置通常包括具有开放和封闭末端的容器。容器优选为血液收集管。容器类型也取决于待收集的样品，其他适合的格式在下面描述。
[0181] 此外，根据第五方面，本发明提供了用于收集含有细胞的生物样品的容器，其中所述容器包含丁酰胺和选自下列的至少一种其他添加剂：
[0182] -凋亡抑制剂，
[0183] -抗凝剂，以及
[0184] -式1的化合物
[0185]
[0186] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。
[0187] 此外，容器可以包含至少一种聚氧乙烯聚合物，优选为至少一种聚乙二醇。
[0188] 提供相应的容器例如样品收集管，具有在样品被收集在相应容器中时将样品快速稳定化的优点。用于收集含有细胞的生物样品、优选为血样的容器可以包含本发明的稳定化组合物。使用丁酰胺和任选地一种或多种其他添加剂用于稳定化以及稳定化组合物的详细情况在上文中描述，应该指出上述公开内容也适用于此处。
[0189] 根据一种实施方式，提供了一种用于接收并收集含有细胞的生物样品的收集容器，其中所述容器包含：
[0190] a)丁酰胺，其浓度使得当含有细胞的生物样品被收集到容器中时，在得到的混合物中丁酰胺的浓度为至少0.25％(w/v)、至少0.3％(w/v)、至少0.4％(w/v)、至少0.5％(w/v)、至少0.75％(w/v)或至少1％(w/v)、至少1.5％(w/v)、至少1.75％(w/v)、至少2％(w/v)或至少2.5％(w/v)，并且其中优选地，得到的混合物包含浓度在0.25％(w/v)至
15％(w/v)、0.5％(w/v)至12.5％(w/v)、0.75％(w/v)至10％(w/v)、0.8％(w/v)至9％(w/v)、0.9％(w/v)至8％(w/v)、1％(w/v)至7％(w/v)、1.1％(w/v)至6％(w/v)、1.2％(w/v)至6％(w/v)、1.3％(w/v)至5.5％(w/v)、1.4％(w/v)至5.25％(w/v)、1.5％(w/v)至5％(w/v)、1.75％(w/v)至4.75％(w/v)、2.0％(w/v)至4.5％(w/v)、2.2％(w/v)至4.25％(w/v)、2.3％(w/v)至4％(w/v)、2.4％(w/v)至3.75％(w/v)或2.5％(w/v)至3.5％(w/v)范围内的丁酰胺；以及
15％(w/v)、0.5％(w/v)至12.5％(w/v)、0.75％(w/v)至10％(w/v)、0.8％(w/v)至9％(w/v)、0.9％(w/v)至8％(w/v)、1％(w/v)至7％(w/v)、1.1％(w/v)至6％(w/v)、1.2％(w/v)至6％(w/v)、1.3％(w/v)至5.5％(w/v)、1.4％(w/v)至5.25％(w/v)、1.5％(w/v)至5％(w/v)、1.75％(w/v)至4.75％(w/v)、2.0％(w/v)至4.5％(w/v)、2.2％(w/v)至4.25％(w/v)、2.3％(w/v)至4％(w/v)、2.4％(w/v)至3.75％(w/v)或2.5％(w/v)至3.5％(w/v)范围内的丁酰胺；以及
[0191] b)至少一种半胱天冬酶抑制剂，其浓度使得当含有细胞的生物样品被收集到容器中时，在得到的混合物中半胱天冬酶抑制剂的浓度为至少0.01μM、至少0.1μM、至少0.25μM、至少0.5μM、至少0.6μM、至少0.7μM、至少0.8μM、至少0.9μM或至少1μM，并且其中优选地，得到的混合物包含浓度在0.01μM至100μM、0.1μM至75μM、0.25μM至50μM、0.5μM至40μM、0.6μM至30μM、0.7μM至35μM、0.8μM至30μM、0.9μM至
25μM、1μM至20μM、1.1μM至17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM范围内的半胱天冬酶抑制剂。
25μM、1μM至20μM、1.1μM至17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM范围内的半胱天冬酶抑制剂。
[0192] 根据一种实施方式，所述容器另外地包含：
[0193] c)式1的化合物，优选为无毒性化合物，优选为N,N-二烷基丙酰胺，更优选为N,N-二甲基丙酰胺，其浓度使得当含有细胞的生物样品被收集到容器中时，在得到的混合物中式1的化合物的浓度为至少0.1％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少1.25％或至少1.5％，并且其中优选地，得到的混合物包含浓度在0.1％至30％、0.25％至20％、0.5％至15％、0.7％至10％、0.8％至7.5％、0.9％至6％或1％至5％范围内的式1的化合物。
[0194] 式1的化合物的适合和优选的实施方式在上文中结合稳定化方法和稳定化组合物进行了描述，应该指出上述公开内容也适用于此处。正如实施例所示，包含半胱天冬酶抑制剂、丁酰胺和N,N-二甲基丙酰胺的稳定化组合物在稳定化含有细胞的生物样品、尤其是全血样品中非常有效。
[0195] 根据一种实施方式，一种用于接收并收集含有细胞的生物样品的收集容器，其中所述容器包含：
[0196] a)丁酰胺，其浓度使得当含有细胞的生物样品被收集到容器中时，在得到的混合物中丁酰胺的浓度为至少0.25％(w/v)、至少0.3％(w/v)、至少0.4％(w/v)、至少0.5％(w/v)或至少0.75％(w/v)，并且其中优选地，得到的混合物包含浓度在0.1％至5％、0.2％至3.5％、0.3％至3％、0.5％至2.5％和0.6％至2％(均为(w/v))范围内的丁酰胺；以及[0197] b)至少一种半胱天冬酶抑制剂，其浓度使得当含有细胞的生物样品被收集到容器中时，在得到的混合物中半胱天冬酶抑制剂的浓度为至少0.01μM、至少0.1μM、至少0.25μM、至少0.5μM、至少0.6μM、至少0.7μM、至少0.8μM、至少0.9μM或至少1μM，并且其中优选地，得到的混合物包含浓度在0.01μM至100μM、0.1μM至75μM、0.25μM至50μM、0.5μM至40μM、0.6μM至30μM、0.7μM至35μM、0.8μM至30μM、0.9μM至
25μM、1μM至20μM、1.1μM至17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM范围内的半胱天冬酶抑制剂；以及
25μM、1μM至20μM、1.1μM至17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM范围内的半胱天冬酶抑制剂；以及
[0198] c)至少一种聚氧乙烯聚合物。
[0199] 对于聚氧乙烯聚合物以及聚氧乙烯聚合物的组合来说，适合和优选的实施方式在上文中详细描述，并且应该指出上述公开内容也适用于此处。根据一种实施方式，使用分子量为至少1500，优选地在2000至40000、更优选地3000至20000或4500至10000范围内的高分子量聚氧乙烯聚合物。优选地，它是聚乙二醇，例如未取代的聚乙二醇。它可以以一定浓度包含在容器中，使得当含有细胞的生物样品被收集到容器中时，在得到的混合物中聚氧乙烯聚合物的浓度在选自0.05％至4％(w/v)、0.1％至3％(w/v)、0.2％至2.5％(w/v)、0.25％至2％(w/v)、0.3％至1.75％(w/v)和0.35％至1.5％(w/v)的范围内，优选地在0.25％至1.5％(w/v)、0.3％至1.25％(w/v)、0.35％至1％(w/v)或0.4％至0.75％(w/v)的范围内。
[0200] 根据一种实施方式，容器另外地包含至少一种其他添加剂，优选为抗凝剂例如螯合剂，优选为EDTA。如果容器被用于收集血液或源自于血液的样品例如血浆或血清，这种实施方式是特别适合的。抗凝剂以能够阻止血液凝结的浓度被包含。适合的抗凝剂在上文中结合第一方面的方法进行了描述，应该指出上述公开内容也适用于此处。根据一种实施方式，容器包含一定浓度的螯合剂、优选为EDTA，使得当含有细胞的生物样品被收集到容器中时，在得到的混合物中螯合剂的浓度在选自0.05mM至100mM、0.1mM至50mM、0.5mM至30mM、1mM至20mM、1.5mM至15mM或2mM至15mM的范围内。根据一种实施方式，容器包含一定浓度的螯合剂、优选为EDTA，使得当含有细胞的生物样品被收集到容器中时，在得到的混合物中螯合剂的浓度在选自0.5至40mg/ml、1至30mg/ml、1.6至25mg/ml、5至20mg/ml和7.5至17.5mg/ml的范围内。
[0201] 包含在收集容器中用于稳定化的稳定化组合物和/或各个化合物可以以液体、半液体或干燥形式提供。正如上面讨论的，丁酰胺和选自凋亡抑制剂、抗凝剂和式1的化合物的至少一种其他添加剂，可以以稳定化组合物的形式提供。这同样适用于将至少一种聚氧乙烯聚合物与丁酰胺组合使用以支持稳定化的情况。用于稳定化的化合物也可以作为分开的实体提供在容器中，并且也可以以不同形式提供在容器中。例如，丁酰胺可以以干燥形式提供，同时式1的化合物可以被提供成液体。其他的组合也是可行的。此外，将丁酰胺和例如凋亡抑制剂以稳定化组合物的形式与抗凝剂和/或式1的化合物分开地提供在容器中，也在本发明的范围之内。适合的配制和制造选项对于专业技术人员来说是已知的。
[0202] 为了使全血稳定，优选地将抗凝剂例如EDTA包含在容器内，例如在稳定化组合物中。如果待稳定化的生物样品含有液体以溶解固体(例如含有细胞的体液、培养基中的细胞、尿液)或者如果向其加入液体例如水或其他溶剂以溶解固体，则干燥形式是例如适合的选项。使用固体稳定化组合物的优点在于与液体相比固体通常在化学上更加稳定。根据一种实施方式，将容器的内壁用本发明的稳定化组合物或用其单个组分例如抗凝剂处理/覆盖。所述组合物或组分可以使用例如喷雾干燥方法施加到内壁。可以对稳定化组合物执行液体移除技术，以便获得基本上固体状态的保护的组合物。液体移除条件可以使它们能够导致分发的液体稳定化组合物的原始量的至少约50重量％、至少约75重量％或至少约85重量％被移除。液体移除条件可以使它们导致足够的液体被移除，以使得到的组合物采取薄膜、凝胶或其他基本上固体或高度粘稠的层的形式。例如，它可以产生基本上不动的包衣(优选为可以在与优选为血液制品样品的含有细胞的样品相接触后重新溶解或以其他方式分散的包衣)。可能可以利用冻干或其他技术来实现保护剂的基本上固体的形式(例如采取一个或多个球粒的形式)。因此，液体移除条件可以使得它们产生的材料一旦与所考虑的样品(例如全血样品)接触后，保护剂将分散在样品中并显著保护样品中的组分(例如细胞外核酸)。液体移除条件可以使得它们产生的剩余组合物基本上没有结晶性，具有使剩余组合物在室温下基本上不动的足够高的粘度，或两者。
[0203] 然而，也可以使用液体组合物，并且它对于血液的稳定化来说具有优势。液体组合物通常具有可以快速地获得与待稳定化的含有细胞的生物样品的混合物，从而基本上在样品一与液体稳定化组合物发生接触后提供即时稳定化效果的优点。此外，如果使用较大量的稳定化组合物，因此其不能或难以喷雾干燥，或者如果组合物妨碍提供干燥组合物，则液体组合物是有利的。优选地，液体稳定化组合物中存在的稳定剂在溶液中保持稳定，并且不需由用户进行预处理——例如将溶解性有限的沉淀物溶解，因为这种类型的预处理引起稳定化效率变化的风险。如上所述，包含丁酰胺和式1的化合物、优选为N,N-二烷基丙酰胺、优选为N,N-二甲基丙酰胺和任选地半胱天冬酶抑制剂以及任选地抗凝剂例如EDTA的稳定化组合物，是储存稳定的。具体来说，它在广温度范围内是储存稳定的。为了使血液稳定，根据一种实施方式，在稳定化组合物中存在所有化合物。如上所述，在有利的实施方式中，稳定化组合物另外地包含至少一种聚氧乙烯聚合物，其优选为聚乙二醇。
[0204] 稳定化组合物以有效地为将要收集在容器中的量的样品提供稳定化的量，包含在所述容器中。根据一种实施方式，将液体稳定化组合物与生物样品以选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5的体积比相接触。根据一种实施方式，将液体稳定化组合物与生物样品以1:10至1:5的体积比相接触。本发明的稳定化组合物的特别优点，在于可以使用小体积的稳定化组合物获得大样品体积的稳定化。因此，优选地，稳定化组合物与样品之比在1:2至1:7、更优选地1:3至1:5的范围内。
[0205] 根据一种实施方式，将容器排空。排空优选地对将特定体积的含有细胞的流体生物样品抽入内部有效。由此，确保了正确量的样品与容器中包含的预装量的稳定化组合物相接触，并因此确保了高效的稳定化。根据一种实施方式，容器包含具有用隔膜密封的开口端的管。例如，容器预装填有确定量的采取固体或液体形式的稳定化组合物，并提供有确定的真空并用隔膜密封。隔膜被构造成使其与标准的取样附件(例如插管等)相容。当与例如插管接触时，由真空预先确定的样品量被收集在容器中。相应的实施方式对于收集血液来说是特别有利的。适合的容器公开在例如US 6,776,959中。
[0206] 本发明的容器可以由玻璃、塑料或其他适合的材料制成。塑料材料可以是不透氧气的材料，或者可以含有不透氧气的层。或者，容器可以由可透过空气的塑料材料制成。本发明的容器优选地由透明材料制成。适合的透明热塑性材料的实例包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二酯。容器可以具有根据待收集的生物样品的所需体积选择的适合尺寸。如上所述，优选地，将容器排空至内部压力低于大气压。这样的实施方式对于收集体液例如全血来说特别适合。压力优选地被选择成将预定体积的生物样品抽取到容器中。除了这样的真空管之外，非真空管、机械分离管或凝胶屏蔽管也可以用作样品容器，尤其是用于血样的收集。适合的容器和顶盖装置的实例公开在US 5,860,397和US 2004/0043505中。作为用于收集含有细胞的样品的容器，也可以使用其他收集装置，例如注射器、尿液收集装置或其他收集装置。容器的类型也可以取决于待收集的样品类型，并且适合的容器对于专业技术人员来说也是可获得的。
[0207] 根据一种实施方式，容器具有开放的顶部、底面和在其间延伸以构成仓室的侧壁，其中丁酰胺和选自凋亡抑制剂、抗凝剂和式1的化合物的至少一种其他添加剂或本发明的稳定化组合物被包含在所述仓室中。它可以以液体或固体形式包含在其中。根据一种实施方式，它是液体。根据一种实施方式，另外的至少一种聚氧乙烯聚合物、优选为聚乙二醇，被另外地包含在仓室中。根据一种实施方式，容器是管，底面是封闭底面，容器还在开放顶部包含封闭物，并且仓室处于减压下。仓室中的减压的优点在上文中描述。优选地，封闭物能够用针或插管刺穿，并且减压被选择成将特定体积的液体样品抽取到仓室中。根据一种实施方式，仓室处于被选择成将特定体积的液体样品抽取到仓室中的减压下，稳定化组合物是液体并配置在仓室中，使得稳定化组合物与所述特定体积的含有细胞的样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5。根据一种实施方式，所述体积比为1:10至1:5。相关的优点在上面描述。
[0208] 优选地，容器用于从患者抽取血液。
[0209] F.收集含有细胞的样品的方法
[0210] 根据第六方面，提供了一种方法，其包括将含有细胞的生物样品从患者直接收集到本发明的第五方面的容器的仓室中的步骤。关于容器和含有细胞的生物样品的详细情况在上文中描述。可以参考相应的公开内容。根据一种实施方式，收集血样，优选地将它从患者抽取到容器中。
[0211] 本文公开的方法和组合物使含有细胞的生物样品稳定，并允许例如高效地保护和分离细胞外核酸，同时降低在收集含有细胞的生物样品中细胞外核酸群体被污染，尤其是被源自于生物样品中包含的细胞并可能由于细胞损伤以及相应地细胞裂解而释放的细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA稀释的风险。本发明的方法以及组合物和公开的装置(例如收集容器)允许减少细胞外核酸的降解并且也减少细胞裂解和/或基因组核酸、尤其是片段化基因组DNA从细胞的释放，使得样品中包含的细胞外核酸不被细胞内核酸污染，相应地，通过本发明的教示减少了相应的污染。正如上面讨论的，细胞外核酸与细胞内核酸、尤其是片段化的基因组DNA的相互混合，可能降低生物样品中细胞外核酸量的任何测量的准确性。正如上面讨论的，本发明的重要优点是基本上同时稳定化样品中包含的细胞(在全血、血浆或血清的情况下尤其是白细胞或多种白细胞类型)和细胞外核酸两者的可能性。这帮助防止细胞内核酸例如基因组DNA被释放到样品的无细胞部分中，并稀释包含的目标细胞外核酸(和相关的生物标志物)。正如本文中讨论的，将含有细胞的生物样品例如全血或血浆与按照本发明的教示使用的稳定剂相接触，允许在分离细胞外核酸之前将样品储存一段时间。更优选地，可以在一个地点(例如卫生护理机构)抽取含有细胞的生物样品例如血液或血浆，与稳定剂相接触，并在晚些时候运输到不同的远处地点(例如实验室)，用于核酸分离和测试过程。此外，如上所述，稳定剂的某些组合在另外地使所包含的细胞的转录组稳定中特别有效，其具有上面描述的优点。
[0212] 此外，在本文中公开的稳定化技术与涉及使用交联试剂例如甲醛、甲醛释放剂等的已知现有技术稳定化试剂相比，提供了优势，因为本发明的样品的稳定化不需要使用这样的交联试剂。交联试剂在核酸分子之间或核酸与蛋白质之间产生分子间或分子内共价键。这种效应可以导致在从复杂生物样品纯化或提取后，这种稳定化和部分交联的核酸的回收率降低。由于例如全血样品中循环核酸的浓度已经相当低，进一步降低这种核酸的收率的任何措施都应该避免。当检测和分析源自于恶性肿瘤或妊娠前三个月的发育胎儿的非常稀少的核酸分子时，这可能是特别重要的。因此，根据一种实施方式，在稳定化组合物中不包含交联剂例如甲醛或甲醛释放剂，它相应地也不另外用于稳定化。
[0213] 本发明不受本文中公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文中描述的相似或等同的任何方法和材料，可以使用在本发明实施方式的实践或测试中。数值范围包括定义范围的数字。本文中提供的标题不是可以参考说明书总体理解的本发明的各个方面或实施方式的限制。
[0214] 当在本文中使用时，术语“溶液”尤其是指液体组合物，优选为水性组合物。它可以是仅仅一个相的均质混合物，但是溶液包含固体添加剂例如沉淀物，尤其是所包含的化学品例如稳定剂的沉淀物，也在本发明的范围之内。
[0215] 本文中对于核苷酸所指明的尺寸和相应的尺寸范围(nt)是指链长，因此是为了描述单链以及双链分子的长度而使用。在双链分子中，所述核苷酸是配对的。
[0216] 根据一种实施方式，在本文中被描述为在方法的情况下包含某些步骤或在组合物、溶液和/或缓冲液的情况下包含某些成分的主题内容，是指由相应的步骤或成分构成的主题内容。优选地选择并组合本文描述的优选实施方式，并且由优选实施方式的相应组合产生的特定主题内容，也属于本发明的公开内容。
[0217] 下面再一次描述特别优选的方面和实施方式。
[0218] 第一方面，本发明具体涉及一种通过将含有细胞的生物样品与丁酰胺相接触，使所述含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定的方法。根据一种实施方式，另外地将所述含有细胞的生物样品与至少一种凋亡抑制剂、优选为半胱天冬酶抑制剂相接触。根据一种实施方式，将所述样品另外地与作为泛半胱天冬酶抑制剂的半胱天冬酶抑制剂相接触，并且优选地，所述泛半胱天冬酶抑制剂选自Q-VD-OPh和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK，并且所述半胱天冬酶抑制剂优选为Q-VD-OPh。
[0219] 根据一种实施方式，将所述含有细胞的生物样品另外地与至少一种聚氧乙烯聚合物相接触。所述聚氧乙烯聚合物优选为聚乙二醇，例如未取代的聚乙二醇。如上所述，所述至少一种聚合物可以具有100至40000范围内的分子量，适合的实施方式在上文中描述。优选地，所述至少一种聚氧乙烯聚合物是高分子量聚氧乙烯聚合物或高与低分子量聚氧乙烯聚合物的组合。所述高分子量聚氧乙烯聚合物优选地具有至少1500、更优选地在2000至40000、更优选地3000至20000或4500至10000范围内的分子量。适合的浓度在上文中描述。
[0220] 根据一种实施方式，将所述含有细胞的生物样品另外地与至少一种式1的化合物相接触
[0221]
[0222] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。所述式1的化合物优选为叔羧酸酰胺，并且其中优选地，式1的化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。所述式1的化合物优选地选自N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺和N,N-二甲基丙酰胺。所述式1的化合物优选为N,N-二烷基丙酰胺，更优选为N,N-二甲基丙酰胺。所述式1的化合物优选地不是有毒试剂。在丁酰胺之外使用这样的式1的化合物和半胱天冬酶抑制剂，是特别优选的。
[0223] 根据一种实施方式，所述含有细胞的生物样品是血样或源自于血液的样品，并将所述样品另外地与抗凝剂、优选为螯合剂、更有选为EDTA相接触。
[0224] 根据一种实施方式，样品中包含的细胞被稳定化，并且由于稳定化，从样品中包含的细胞释放到样品的无细胞部分中的基因组DNA减少和/或样品中存在的核酸的降解减少。根据一种实施方式，所述稳定化减少了在稳定化期间生物样品中包含的细胞外DNA群体被源自于稳定化的样品中包含的细胞的基因组DNA的污染。根据一种实施方式，所述稳定化减少了在稳定化期间生物样品中包含的细胞外核酸群体被源自于稳定化的样品中包含的细胞的细胞内核酸的污染。
[0225] 根据一种实施方式，在将所述含有细胞的生物样品与丁酰胺和任选地用于稳定化的其他添加剂相接触后，得到的混合物包含浓度为至少0.25％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少1.5％、至少1.75％、至少2％或至少2.5％的丁酰胺。根据一种实施方式，在将所述含有细胞的生物样品与丁酰胺和任选地用于稳定化的其他添加剂相接触后，得到的混合物包含浓度范围为0.25％至15％、0.5％至12.5％、0.75％至10％、1％至9％、1.25％至8％、1.5％至7％、1.75％至6％、1.8％至5.5％、1.9％至5.25％、2％至5％、2.1％至4.75％、2.2％至4.5％、2.3％至4.25％、2.4％至4％、2.5％至
3.75％或0.75％至2％的丁酰胺。丁酰胺的浓度优选为(w/v)。
3.75％或0.75％至2％的丁酰胺。丁酰胺的浓度优选为(w/v)。
[0226] 根据一种实施方式，在将所述含有细胞的生物样品与丁酰胺、半胱天冬酶抑制剂和任选地用于稳定化的其他添加剂相接触后，得到的混合物包含优选为如上所述的泛半胱天冬酶抑制剂的半胱天冬酶抑制剂，其
[0227] i)浓度为至少0.01μM、至少0.1μM、至少0.25μM、至少0.5μM、至少0.6μM、至少0.7μM、至少0.8μM、至少0.9μM或至少1μM，
[0228] 和/或
[0229] ii)浓度在0.01μM至100μM、0.1μM至75μM、0.25μM至 50μM、0.5μM至40μM、0.6μM至30μM、0.7μM至35μM、0.8μM至30μM、0.9μM至25μM、1μM至20μM、
1.1μM至17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM的范围内。
1.1μM至17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM的范围内。
[0230] 根据一种实施方式，在将所述含有细胞的生物样品与丁酰胺、分子量为至少1000的至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物和任选地用于稳定化的其他添加剂相接触后，得到的混合物包含至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，其
[0231] i)浓度在0.05％至4％(w/v)、0.1％至3％(w/v)、0.2％至2.5％(w/v)、0.25％至2％(w/v)、0.3％至1.75％(w/v)和0.35％至1.5％(w/v)的范围内；和/或
[0232] ii)浓度在0.25％至1.5％(w/v)、0.3％至1.25％(w/v)、0.35％至1％(w/v)和0.4％至0.75％(w/v)的范围内。
[0233] 根据一种实施方式，在将所述含有细胞的生物样品与丁酰胺、式1的化合物和任选地用于稳定化的其他添加剂相接触后，得到的混合物包含式1的化合物，其
[0234] i)浓度为至少0.1％、至少0.25％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少1.25％或至少1.5％；和/或
[0235] ii)浓度在0.1％至30％、0.25％至20％、0.5％至15％、0.7％至10％、0.8％至7.5％、0.9％至6％或1％至5％的范围内。
[0236] 根据一种实施方式，在将所述含有细胞的生物样品与丁酰胺、抗凝剂和任选地用于稳定化的其他添加剂相接触后，得到的混合物包含浓度范围选自0.05mM至100mM、0.05mM至50mM、0.1mM至30mM、0.5mM至25mM、1mM至20mM、1.5mM至15mM和2mM至10mM的抗凝剂，其优选为EDTA。
[0237] 根据一种实施方式，为了稳定化，将所述含有细胞的样品与包含下列物质的稳定化组合物相接触：
[0238] a)丁酰胺；
[0239] b)至少一种泛半胱天冬酶抑制剂；
[0240] c)任选地至少一种式1的化合物，优选为N,N-二烷基-羧酸酰胺，更优选为N,N-二烷基丙酰胺；以及
[0241] d)任选地抗凝剂，优选为螯合剂，更优选为EDTA，
[0242] 并且优选地，将所述含有细胞的样品与本文中所限定的稳定化组合物相接触。
[0243] 根据一种实施方式，为了稳定化，将所述含有细胞的样品与包含下列物质的稳定化组合物相接触：
[0244] a)丁酰胺；
[0245] b)至少一种聚氧乙烯聚合物，优选为聚乙二醇；
[0246] c)任选地至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选为泛半胱天冬酶抑制剂；
[0247] c)任选地至少一种式1的化合物，优选为N,N-二烷基-羧酸酰胺，更优选为N,N-二烷基丙酰胺；以及
[0248] d)任选地抗凝剂，优选为螯合剂，更优选为EDTA，
[0249] 并且优选地，将所述含有细胞的样品与本文中所限定的稳定化组合物相接触。
[0250] 特别有利的是使用丁酰胺、至少一种聚氧乙烯聚合物和至少一种半胱天冬酶抑制剂进行稳定化。
[0251] 根据一种实施方式，所述稳定化实现了在含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体，在不冷藏、优选地在室温下稳定化选自至少两天、至少三天、至少两天到三天、至少两天到六天和/或至少两天到七天的时间长度。根据一种实施方式，所述稳定化实现了在含有细胞的生物样品中包含的细胞在稳定化期间的稳定化，并减少了基因组DNA从稳定化的样品中包含的所述细胞的释放。根据一种实施方式，所述稳定化不涉及使用其浓度会诱导或促进有核细胞裂解的添加剂。具体来说，所述稳定化不涉及使用裂解剂例如离液剂。根据一种实施方式，所述稳定化不涉及使用引起蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂；和/或所述稳定化不涉及使用有毒试剂。
[0252] 根据一种实施方式，所述含有细胞的生物样品具有一个或多个下列特征：
[0253] a)它选自体液、全血、源自于血液的样品、血浆、血清、淋巴液、尿液、溶液、脑脊液、腹水、乳汁、粪便、支气管灌洗液、唾液、羊水、精子/精液、拭子/涂片、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物以及细胞培养上清液；
[0254] b)它是细胞贫乏的或含有细胞的体液；
[0255] c)它是含有细胞的体液；
[0256] d)它是循环体液；
[0257] e)它选自血液、血浆、血清或尿液；
[0258] f)它是血液。
[0259] 根据一种实施方式，所述方法用于使包含在血样中的细胞外核酸群体稳定，包括将血样与丁酰胺和抗凝剂相接触，其中从血样中包含的细胞释放到血样的无细胞部分中的基因组DNA减少。根据一种实施方式，所述方法用于使包含在血样中的细胞外核酸群体稳定，包括将血样与丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂相接触，其中从血样中包含的细胞释放到血样的无细胞部分中的基因组DNA减少。根据一种实施方式，所述方法用于使包含在血样中的细胞外核酸群体稳定，包括将血样与丁酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂、至少一种式1的化合物和抗凝剂相接触，其中从血样中包含的细胞释放到血样的无细胞部分中的基因组DNA减少。
[0260] 根据一种实施方式，所述稳定化减少了稳定化期间的溶血。根据一种实施方式，丁酰胺和任选地用于稳定化的其他添加剂被包含在稳定化组合物中，并且其中稳定化组合物与指定体积的含有细胞的样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5。根据一种实施方式，它是1:10至1:5。
[0261] 根据一种实施方式，在所述稳定化时间段后，所述方法包括一个或多个下列步骤：
[0262] a)使稳定化的样品经历核酸分析和/或检测方法；
[0263] b)从稳定化的样品分离细胞外核酸；
[0264] c)从稳定化的样品分离细胞外核酸，并对分离的核酸进行分析和/或检测；
[0265] d)除去包含在稳定化的样品中的细胞；
[0266] e)在进行核酸分离、分析和/或检测步骤之前除去包含在稳定化的样品中的细胞；
[0267] f)从稳定化的样品除去细胞并从稳定化的样品的无细胞部分或细胞贫乏部分分离细胞外核酸；
[0268] g)储存(i)稳定化的样品，(ii)已从其除去细胞的稳定化的样品，和/或(iii)从所述样品移除的细胞；
[0269] h)从稳定化的样品除去细胞并将其丢弃；和/或
[0270] i)从稳定化的样品除去细胞，并从已从稳定化的样品移除的细胞分离核酸；
[0271] j)从稳定化的样品除去细胞，并使用尺寸选择性核酸分离方法从稳定化的样品的无细胞部分或细胞贫乏部分分离细胞外核酸。
[0272] 第二方面，本发明具体涉及一种用于从稳定化的含有细胞的生物样品分离核酸的方法，所述方法包括下列步骤：
[0273] a)按照第一方面的方法使所述含有细胞的生物样品稳定；以及
[0274] b)从稳定化的样品分离核酸。
[0275] 具体来说，所述第二方面提供了一种用于从稳定化的含有细胞的生物样品分离细胞外核酸的方法，所述方法包括下列步骤：
[0276] a)按照第一方面的用于使细胞外核酸群体稳定的方法，使所述含有细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定；以及
[0277] b)分离细胞外核酸。
[0278] 根据一种实施方式，所述方法包括在步骤a)与步骤b)之间从所述含有细胞的生物样品除去细胞，并且步骤b)包括从稳定化的样品的无细胞部分或细胞贫乏部分分离细胞外核酸。根据一种实施方式，所述方法包括执行一个或多个下列步骤：
[0279] a)使稳定化的样品经历核酸分析和/或检测方法；
[0280] b)从稳定化的样品分离细胞外核酸；
[0281] c)从稳定化的样品分离细胞外核酸，并对分离的核酸进行分析和/或检测；
[0282] d)除去包含在稳定化的样品中的细胞；
[0283] e)在进行核酸分离、分析和/或检测步骤之前除去包含在稳定化的样品中的细胞；
[0284] f)从稳定化的样品除去细胞并从稳定化的样品的无细胞部分或细胞贫乏部分分离细胞外核酸；
[0285] g)储存(i)稳定化的样品，(ii)已从其除去细胞的稳定化的样品，和/或(iii)从所述样品移除的细胞；
[0286] h)从稳定化的样品除去细胞并将其丢弃；和/或
[0287] i)从稳定化的样品除去细胞，并从已从稳定化的样品移除的细胞分离核酸；
[0288] j)从稳定化的样品除去细胞，并使用尺寸选择性核酸分离方法从稳定化的样品的无细胞部分或细胞贫乏部分分离细胞外核酸。
[0289] 根据一种实施方式，所述含有细胞的样品是血样，并且其中步骤a)中的稳定化如对第一方面的方法所限定的来进行。
[0290] 根据一种实施方式，将所述分离的细胞外核酸在另一个步骤c)中进行处理和/或分析，并优选地进行：
[0291] i)修饰；
[0292] ii)与至少一种酶相接触；
[0293] iii)扩增；
[0294] iv)反转录；
[0295] v)克隆；
[0296] vi)测序；
[0297] vii)与探针相接触；
[0298] viii)检测；
[0299] ix)定量；和/或
[0300] x)鉴定。
[0301] 根据一种实施方式，在步骤b)中分离的细胞外核酸群体具有一个或多个下列特征：
[0302] i)它作为被分离的总核酸的一部分被包含；
[0303] ii)它是DNA和RNA的混合物；
[0304] iii)它主要包含DNA；
[0305] iv)它主要包含RNA；
[0306] v)它包含哺乳动物细胞外核酸；
[0307] vi)它包含循环细胞外核酸；
[0308] vii)它包含疾病相关的核酸；
[0309] viii)它包含肿瘤相关或肿瘤来源的核酸；
[0310] ix)它包含炎症相关的核酸；
[0311] x)它包含病毒核酸；
[0312] xi)它包含病原体核酸；和/或
[0313] xii)它包含胎儿核酸。
[0314] 根据一种实施方式，在步骤c)中进行分析和/或进一步处理、优选地检测的细胞外核酸，具有一个或多个下列特征：
[0315] i)它是DNA；
[0316] ii)它是RNA；
[0317] iii)它是哺乳动物细胞外核酸；
[0318] iv)它是循环细胞外核酸；
[0319] v)它是疾病相关的核酸；
[0320] vi)它是肿瘤相关或肿瘤来源的核酸；
[0321] vii)它是炎症相关的核酸；
[0322] viii)它是病毒核酸；
[0323] ix)它是病原体核酸；和/或
[0324] x)它是胎儿核酸。
[0325] 第三方面，本发明具体来说涉及适用于使含有细胞的生物样品稳定的组合物，其中所述组合物包含丁酰胺和选自凋亡抑制剂、抗凝剂和式1的化合物的至少一种其他添加剂，
[0326]
[0327] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。
[0328] 根据一种实施方式，所述组合物包含凋亡抑制剂，优选为半胱天冬酶抑制剂。根据一种实施方式，所述组合物包含泛半胱天冬酶抑制剂，其优选地选自Q-VD-OPh和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK，并且其中所述半胱天冬酶抑制剂更有选为Q-VD-OPh。
[0329] 根据一种实施方式，所述组合物另外包含至少一种聚氧乙烯聚合物。如上所述，优选地，所述至少一种聚氧乙烯聚合物是高分子量聚氧乙烯聚合物或高与低分子量聚氧乙烯聚合物的组合。所述聚氧乙烯聚合物优选为聚乙二醇，例如未取代的聚乙二醇。所述高分子量聚氧乙烯聚合物优选地具有至少1500、更优选地在2000至40000、更优选地3000至20000或4500至10000范围内的分子量。优选地，所述组合物另外包含半胱天冬酶抑制剂。
[0330] 根据一种实施方式，所述组合物包含至少一种式1的化合物，
[0331]
[0332] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。所述式1的化合物优选为叔羧酸酰胺，并且其中优选地，式1的化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。所述式1的化合物优选地选自N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺和N,N-二甲基丙酰胺。所述式1的化合物优选为N,N-二烷基丙酰胺，更优选为N,N-二甲基丙酰胺。所述式1的化合物优选地不是有毒试剂。优选地，所述式1的化合物与半胱天冬酶抑制剂和丁酰胺相组合使用。根据一种实施方式，所述组合物包含至少一种抗凝剂，优选为螯合剂。
[0333] 根据一种实施方式，所述组合物具有一个或多个下列特征：
[0334] a)它能够稳定细胞并减少基因组DNA从所述含有细胞的生物样品中包含的细胞释放到所述样品的无细胞部分中；
[0335] b)它能够减少稳定化的样品中存在的核酸、尤其是基因组DNA的降解；
[0336] c)它能够减少或防止生物样品中包含的细胞外DNA群体被源自于稳定化的样品中包含的细胞的基因组DNA污染；
[0337] d)它能够减少或防止生物样品中包含的细胞外核酸群体被源自于稳定化的样品中包含的细胞的细胞内核酸污染；
[0338] e)该稳定化组合物不包含其浓度会诱导或促进细胞裂解的添加剂；
[0339] f)该稳定化组合物不包含诱导蛋白质-DNA和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂；
[0340] g)该稳定化组合物不包含甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂；
[0341] h)该稳定化组合物不包含有毒试剂，和/或
[0342] i)它能够不需冷藏、优选地在室温下使包含在所述含有细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定一段时间，所述一段时间选自至少两天、至少三天、至少两天到三天、至少两天到六天和/或至少两天到七天。
[0343] 根据一种实施方式，所述稳定化组合物包含稳定剂，其浓度使得当与目标量的待稳定化的含有细胞的生物样品、优选为血液混合时，得到的混合物包含
[0344] -丁酰胺，i)其浓度为至少0.25％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少1.5％、至少1.75％、至少2％或至少2.5％；和/或ii)其浓度范围为0.25％至15％、0.5％至12.5％、0.75％至10％、1％至9％、1.25％至8％、1.5％至7％、
1.75％至6％、1.8％至5.5％、1.9％至5.25％、2％至5％、2.1％至4.75％、2.2％至4.5％、
2.3％至4.25％、2.4％至4％、2.5％至3.75％或0.75％至2％；
1.75％至6％、1.8％至5.5％、1.9％至5.25％、2％至5％、2.1％至4.75％、2.2％至4.5％、
2.3％至4.25％、2.4％至4％、2.5％至3.75％或0.75％至2％；
[0345] -半胱天冬酶抑制剂，如果存在的话，i)其浓度为至少0.01μM、至少0.1μM、至少0.25μM、至少0.5μM、至少0.6μM、至少0.7μM、至少0.8μM、至少0.9μM或至少1μM；和/或ii)其浓度在0.01μM至100μM、0.1μM至75μM、0.25μM至50μM、0.5μM至40μM、
0.6μM至30μM、0.7μM至35μM、0.8μM至30μM、0.9μM至25μM、1μM至20μM、1.1μM至17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM的范围内；以及
0.6μM至30μM、0.7μM至35μM、0.8μM至30μM、0.9μM至25μM、1μM至20μM、1.1μM至17.5μM、1.25μM至15μM或1.5μM至12.5μM的范围内；以及
[0346] -式1的化合物，如果存在的话，i)其浓度为至少0.1％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少1.25％或至少1.5％；和/或ii)其浓度在0.1％至30％、0.25％至20％、0.5％至15％、0.7％至10％、0.8％至7.5％、0.9％至6％或1％至5％的范围内；和/或[0347] -抗凝剂，如果存在的话，其浓度范围选自0.05mM至100mM、0.05mM至50mM、0.1mM至30mM、0.5mM至25mM、1mM至20mM、1.5mM至15mM和2mM至10mM。
[0348] 根据一种实施方式，所述稳定化组合物包含至少一种聚氧乙烯聚合物，其浓度使得当与目标量的待稳定化的含有细胞的生物样品、优选为血液混合时，得到的混合物包含i)浓度在0.05％至4％(w/v)、0.1％至3％(w/v)、0.2％至2.5％(w/v)、0.25％至2％(w/v)、0.3％至1.75％(w/v)和0.35％至1.5％(w/v)的范围内，和/或ii)浓度在0.25％至1.5％(w/v)、0.3％至1.25％(w/v)、0.35％至1％(w/v)和0.4％至0.75％(w/v)范围内的聚氧乙烯聚合物。
[0349] 根据一种实施方式，所述组合物具有一个或多个下列特征：
[0350] i)所述组合物包含浓度为5％至50％、7.5％至40％、10％至35％、12.5％至30％或15％至25％的丁酰胺，
[0351] ii)所述组合物包含至少一种半胱天冬酶抑制剂，
[0352] iii)所述组合物包含浓度为2％至50％、3％至40％、3.5％至30％、4％至25％、4.5％至20％或5％至17.5％的至少一种式1的化合物，优选为N-N-二甲基丙酰胺，和/或[0353] iv)所述组合物包含抗凝剂。
[0354] 根据一种实施方式，所述组合物包含至少一种聚氧乙烯聚合物。
[0355] 根据一种实施方式，所述组合物被提供成固体形式、半液体形式或液体形式。根据一种实施方式，所述稳定化组合物作为与含有细胞的生物样品的混合物存在，并且其中所述含有细胞的生物样品具有一个或多个下列特征：
[0356] a)它选自体液、全血、源自于血液的样品、血浆、血清、淋巴液、尿液、溶液、脑脊液、腹水、乳汁、粪便、支气管灌洗液、唾液、羊水、精子/精液、拭子/涂片、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物以及细胞培养上清液；
[0357] b)它是细胞贫乏的或含有细胞的体液；
[0358] c)它是含有细胞的体液；
[0359] d)它是循环体液；
[0360] e)它选自血液、血浆、血清或尿液；
[0361] f)它是血液。
[0362] 具体来说，所述混合物具有一个或多个如上定义的浓度特征。此外，所述稳定化组合物与指定体积的含有细胞的样品的体积比选自10:1至1:20、5:1至1:15、1:1至1:10和1:2至1:5。根据一种实施方式，它是1:10至10:1。
[0363] 第四方面，本发明具体来说涉及使用本发明的第三方面的组合物使含有细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定。根据一种实施方式，所述组合物包含抗凝剂，并且其中所述含有细胞的生物样品是血液。根据一种实施方式，所述组合物被用于本发明的第一或第二方面的方法中。
[0364] 第五方面，本发明具体来说涉及适用于收集含有细胞的生物样品、优选为血液、血浆或血清样品的容器，其包含适合于使含有细胞的生物样品中包含的细胞外核酸群体稳定的稳定化组合物，其中所述稳定化组合物包含丁酰胺。根据一种实施方式，所述稳定化组合物还包含
[0365] a)至少一种凋亡抑制剂，优选为半胱天冬酶抑制剂；和/或
[0366] b)至少一种式1的化合物
[0367]
[0368] 其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选为C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，并选自氢和以直链或支链方式排列的碳链长度为1-20个原子的烃基，并且R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧；和/或
[0369] c)抗凝剂，优选为螯合剂，更优选为EDTA。
[0370] 根据一种实施方式，所述稳定化组合物包含至少一种聚氧乙烯聚合物，优选为聚乙二醇。根据一种实施方式，所述稳定化组合物包含丁酰胺、至少一种聚氧乙烯聚合物和凋亡抑制剂，优选为半胱天冬酶抑制剂。
[0371] 式1的化合物优选为N,N-二烷基丙酰胺，更优选为N,N-二甲基丙酰胺。所述凋亡抑制剂优选为泛半胱天冬酶抑制剂，其优选地选自Q-VD-OPh和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK，更优选为Q-VD-OPh。根据一种实施方式，所述稳定化组合物包含：
[0372] a)丁酰胺；
[0373] b)至少一种泛半胱天冬酶抑制剂；
[0374] c)任选地至少一种式1的化合物，优选为N,N-二烷基-羧酸酰胺，更优选为N,N-二烷基丙酰胺；以及
[0375] d)任选地抗凝剂，优选为螯合剂，更优选为EDTA。
[0376] 根据一种实施方式，所述稳定化组合物或容器不包含诱导蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂；和/或其中所述稳定化组合物或容器不包含有毒试剂。根据一种实施方式，所述稳定化组合物是本发明的第三方面的组合物。根据一种实施方式，所述容器具有本文中为本发明的其他方面而限定的一个或多个特点。
[0377] 第六方面，本发明涉及一种方法，其包括将来自于患者的样品收集到本发明第五方面的容器的仓室中的步骤。
[0378] 表1：凋亡抑制剂的概述
[0379]
[0380]
[0381]
[0382]
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[0384]
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[0386]
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[0390]
[0391]
[0392]
[0393]
[0394]
[0395]
[0396]
[0397]
[0398]实施例
[0399] 应该理解，下面的实施例仅仅是出于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。
[0400] 试验了几种不同化合物单独或与半胱天冬酶抑制剂和/或不同的式1化合物组合时，使含有细胞的生物样品、在这里是血液稳定的能力。与参比样品(EDTA稳定化的血液)相比，发现丁酰胺(BA)能够使血样高效稳定，具体来说，发现丁酰胺抑制了基因组DNA从稳定化的血液中包含的细胞释放到细胞外核酸群体。此外，已发现，使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合显著提高了获得的稳定化效果。具体来说，将丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合用于稳定化产生延长的稳定化效果，并且使用从不同供体获得的血样所实现的稳定化效果的变动性更低。这是重要的优点，因为它为血样提供了均匀、可靠的稳定化方法。
[0401] 实施例1
[0402] 在实施例1中，试验了单独或与半胱天冬酶抑制剂组合的丁酰胺对EDTA稳定化的血样的稳定化效果，并与作为参比的EDTA稳定化的血液进行比较。
[0403] 血液收集和稳定化
[0404] 将来自于两个不同献血者的血液收集到10ml K2 EDTA管(BD)中。将4.5ml相应地收集的血液与0.9ml两种不同的稳定化溶液A和B混合。所述稳定化溶液含有(每ml稳定化溶液)：
[0405] A:34.2mg K2 EDTA和0.15g或0.18g丁酰胺在水中。当使用稳定化溶液A时，获得下列在血液/稳定化混合物中的终浓度：7.2mg K2 EDTA/ml和2.5％(w/v)或3％(w/v)丁酰胺。
[0406] B：34.2mg K2 EDTA，0.18g丁酰胺和1.2μl喹啉-Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)溶液(1mg溶解在388μl DMSO中)。当使用稳定化溶液B时，获得下列在血液/稳定化混合物中的终浓度：7.2mg K2 EDTA/ml，3％(w/v)丁酰胺和1μM喹啉-Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)。
[0407] 所有稳定化的血样在每种条件和每个试验时间点设置三份平行样。在时间点0(参比)时，即混合稳定化溶液和血液后即刻，产生血浆并提取循环细胞外DNA。将残留的稳定化血样在室温下储存3天和6天。
[0408] 作为参比对照，将EDTA稳定化的血样(收集在不含其它添加剂的K2 EDTA管中)也储存3天和6天。
[0409] 细胞外核酸分离和分析
[0410] 通过将含有血液的管颠倒四次，从稳定化和未稳定化(EDTA)的血样产生血浆。然后将管在4℃下以1900xg离心10分钟。将2.5ml血浆级分转移到新的15ml falcon管，并在4℃下以16.000xg离心10分钟。使用QIAamp循环核酸试剂盒(QIAGEN)，按照制造商的说明，将2ml相应地澄清的血浆用于细胞外核酸分离。
[0411] 使用靶向18S核糖体DNA的不同片段长度的两种不同的qPCR测定法，对分离到的细胞外DNA进行分析：
[0412] 18S核糖体DNA：66bp扩增子
[0413] 18S核糖体DNA：500bp扩增子
[0414] 表2：概述了所使用的通过qPCR检测的DNA靶序列的信息
[0415]
[0416] 根据gDNA标准曲线，将各个样品的循环阈值转换成洗脱物中gDNA的量。将各个储存时间点的gDNA量与来自于同一献血者的零时gDNA水平进行比较，并在图中示出为增加倍数。特别是，储存后血样的血浆级分中500bp片段的增加，是白细胞裂解/破坏的指示。因此，释放的500bp DNA的量越低，稳定化方法的性能越好。
[0417] 结果
[0418] 结果示出在图1和2中。示出了使用18S rRNA基因的不同扩增子长度，使用不同稳定化溶液时DNA相对于0时间点的增加(倍数变化)。条指示每种条件和试验时间点的三个平行样的平均值。与未稳定化的EDTA血液相比，本发明的所有相应地包含丁酰胺的稳定化溶液在室温下储存3天后，显示出明显较低量的释放的DNA。正如可以看到的，添加稳定化溶液A在所试验的样品中实现至少三天的稳定化。与EDTA稳定化的参比样品相比，稳定化效果明显改进。三天的稳定化效果对于许多应用来说是足够的，因为这覆盖了血样的常规运输/储存时间。此外，本发明的另外包含半胱天冬酶抑制剂的稳定化溶液B，实现了至少6天的延长的稳定化效果。此外，当在来自于几个不同献血者的血样上试验稳定化溶液时，发现使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合所实现的稳定化效果，显示出所实现的稳定化效果的较小的变动(数据未示出)。因此，当与半胱天冬酶抑制剂相组合使用丁酰胺时，稳定化得到显著改进。
[0419] 实施例2
[0420] 在实施例2中，试验了丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合对EDTA稳定化的血样的稳定化效果，并与半胱天冬酶抑制剂与N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)的组合以及作为参比的EDTA稳定化的血液的稳定化效果进行比较。
[0421] 血液收集和稳定化
[0422] 将来自于4个不同献血者的血液收集在10ml K2EDTA管(BD)中。将4.5ml血液与0.9ml不同的稳定化溶液混合，所述稳定化溶液含有(每ml稳定化溶液)：
[0423] -34.2mg K2EDTA
[0424] -1.2μl喹啉–Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)溶液(1mg溶解在388μl DMSO中)
[0425] -分别为0.15g、0.18g或0.21g丁酰胺或0.3ml DMAA。
[0426] 由此，在血液/稳定化混合物中获得下列终浓度：
[0427] -7.2K2EDTA/ml
[0428] -1μM喹啉–Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)
[0429] -分别为2.5、3或3.5％(w/v)丁酰胺或5％(v/v)DMAA。
[0430] 所有稳定化的血样在每种条件和每个试验时间点设置三份平行样。在时间点0(参比)时，即混合稳定化溶液和血液后即刻，产生血浆并提取循环细胞外DNA。将残留的稳定化血样在室温下储存3天和6天。
[0431] 作为参比对照，将EDTA稳定化的血样(不含其它添加剂)也储存3天和6天。
[0432] 细胞外核酸分离和分析
[0433] 如实施例1中所述制备血浆并分离和分析细胞外核酸。
[0434] 结果
[0435] 来自于4个不同献血者的qPCR分析的结果示出在图3至6中。示出了使用18SrRNA基因的不同扩增子长度，使用2.5％、3％和3.5％丁酰胺或5％DMAA时DNA相对于零时的增加(倍数变化)。条指示每种条件和试验时间点的三个平行样的平均值。与参比EDTA血样相比，所使用的所有稳定化溶液在储存3和6天后显示出明显更低量的释放的DNA。所有三种试验的丁酰胺浓度显示出至少与DMAA相当的稳定化能力，并且与EDTA血液相比明显占优势。DMAA是用于血样的稳定剂，尤其是与半胱天冬酶抑制剂组合时(参见未公开的PCT/EP2012/070211和PCT/EP2012/068850)。正如本实施例所示，就其稳定化性质来说，丁酰胺至少同等地有效。此外，与DMAA相比丁酰胺具有明显的优点，因为丁酰胺无毒并且也没有伤害性或刺激性。因此，本发明允许提供无毒无害的稳定化组合物。这对用户来说简化了稳定化组合物的操作以及稳定化的样品的操作。
[0436] 此外，在储存6天后，通过稳定化的样品的目测检查，分析了不同稳定化溶液对溶血(可以作为血浆级分的红色增加而看到)的影响。图7中示出的结果证实，对于所有4个献血者来说，使用本发明的稳定化溶液与EDTA对照中相比溶血的防止明显更好，并且与DMAA稳定化的样品相当。
[0437] 实施例3
[0438] 在实施例3中，试验了丁酰胺、半胱天冬酶抑制剂和N,N-二甲基丙酰胺(DMPA)对EDTA稳定化的血样的稳定化效果，并与半胱天冬酶抑制剂与N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)的组合和作为参比的EDTA血液的稳定化效果进行比较。
[0439] 血液收集和稳定化
[0440] 血液收集和稳定化总体来说如实施例2中所述来进行，但使用不同的稳定化溶液。在血液/稳定化混合物中建立起下列终浓度：
[0441] -7.2mg K2EDTA/ml(所有样品)
[0442] -1μM喹啉–Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)(所有样品)
[0443] 以及
[0444] -0.5％(w/v)丁酰胺和2.5％(v/v)DMPA；或
[0445] -1.5％(w/v)丁酰胺和1.5％(v/v)DMPA；或
[0446] -2％(w/v)丁酰胺和1％(v/v)DMPA；或
[0447] -5％(v/v)DMAA.
[0448] 细胞外核酸分离和分析
[0449] 如实施例1中所述制备血浆并分离和分析细胞外核酸。
[0450] 结果
[0451] 结果示出在图8至11中。示出了基于18SrRNA基因的不同扩增子长度，使用本发明的稳定化溶液(其除了半胱天冬酶抑制剂(1μM喹啉–Val-Asp-CH2-OPH)和作为抗凝剂的EDTA之外，还包含(i)0.5％丁酰胺和2.5％DMPA，(ii)1.5％丁酰胺和1.5％DMPA或(iii)2％丁酰胺和1％DMPA)时DNA相对于零时的增加(倍数变化)。条指示每种条件和试验时间点的三个平行样的平均值。在室温下储存3天和6天后，与参比EDTA血液相比，本发明的所有稳定化溶液显示出明显较低量的释放的DNA。所有三种试验浓度的丁酰胺与DMPA相组合显示出相当的稳定化能力(与包含DMAA的稳定化溶液相比)，并且与参比的EDTA血液相比显示出明显优势。使用丁酰胺与DMPA的组合允许使用较低浓度的丁酰胺并在同时保持稳定化效果。这是有利的，因为如果稳定化组合物在低温下储存，包含高浓度丁酰胺的稳定化溶液可能引起丁酰胺的沉淀。因此，使用丁酰胺与式1的化合物例如DMPA的组合允许提供高度有效、储存以及特别是温度稳定的稳定化组合物，其也可以在更低温度下运输。由于所实现的良好稳定化性能，并且还由于丁酰胺和N,N-二甲基丙酰胺两者都是无毒的，在这样的稳定化组合物中丁酰胺与N,N-二甲基丙酰胺的组合是有利的。此外，在储存6天后，通过稳定化的样品的目测检查，分析了不同稳定化溶液对溶血(可以作为血清级分的红色增加而看到)的影响。图11中示出的结果证实，对于所有4个献血者来说，使用本发明的稳定化溶液与EDTA对照中相比溶血的防止明显更好，并且与DMAA稳定化的样品相当。因此，溶血被有效减少并且甚至可以被阻止。
[0452] 实施例4
[0453] 在实施例4中，使用不同浓度的丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂相组合用于使血样稳定。分析的焦点同样是通过分析18S rDNA的增加而确定的细胞外核酸群体的稳定化。样品的稳定化和处理如实施例2中所述来进行。当向血样添加所试验的稳定化溶液时，在血液/稳定化溶液混合物中获得下列终浓度：
[0454] 7.2mg K2 EDTA/ml，1μM喹啉-Val-Asp-CH2-OPH(半胱天冬酶抑制剂)和不同浓度的丁酰胺(0.5％(w/v)、1.5％(w/v)和2.5％(w/v))。
[0455] 图12示出了获得的稳定化结果。正如可以看到的，在与半胱天冬酶抑制剂相组合时，较低浓度的丁酰胺也有效地使细胞外核酸群体稳定，正如可以从丁酰胺稳定化的样品中18S rDNA增加的显著降低看到的。
[0456] 实施例5
[0457] 在实施例5中，示出了单独和与DMAA组合的半胱天冬酶抑制剂对血样的稳定化效果。
[0458] 1.材料和方法
[0459] 1.1血浆的分离
[0460] 为了从全血分离血浆，将血液样品以5000rpm离心15min，并将得到的血浆样品在4℃下以16.000x g再次离心10min。
[0461] 将得到的血浆用于分离其中包含的核酸。
[0462] 1.2核酸纯化
[0463] 使用 循环NA试剂盒(QIAGEN，按照手册)，从得到的血浆样品纯化循环的细胞外核酸。简单来说：
[0464] -输入10ml样品；
[0465] -裂解：1ml蛋白酶K和8ml缓冲液ACL(QIAGEN)
[0466] -结合：18ml缓冲液ACB(QIAGEN)
[0467] -清洗步骤：不改变并按照手册
[0468] -在60μl缓冲液AVE(QIAGEN)中洗脱
[0469] 1.3洗脱液的分析
[0470] 将在核酸纯化后得到的洗脱液储存在-20℃下，直至纯化所有样品(包括第6/7天样品)。随后，将相同条件的洗脱液合并并如下处理：
[0471] 1.3.1使 用 芯 片 凝 胶 电 泳 (2100Bioanalyzer；Agilent Technologies；Inc.,USA)，按照制造商的说明书(参见Agilent DNA 7500和DNA12000试剂盒指南手册)，通过测定DNA尺寸分布来测量血细胞稳定性/DNA释放，区别在于将1.5μl而不是1μl样品转移到孔中。
[0472] 1.3.2使用对DNA降解敏感的实时PCR测定法进行DNA定量(靶：500和66bp长的核糖体18S DNA编码序列)。
[0474] -引物浓度从8μM放大到16μM。
[0475] -退火/延伸步骤从1min延长到2min。
[0476] (在扩增之前将样品1:10稀释)。
[0477] 对于qPCR的详细情况，参见实施例1.
[0478] 2.进行的实验和结果
[0479] 随后，解释进行的实验的详细情况。在实施例中使用的方法的详细情况描述在上面的1下。
[0480] 2.1.添加半胱天冬酶抑制剂的稳定化
[0481] 测试了用作广谱半胱天冬酶抑制剂的两种不同寡肽Q-VD-OPh和Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK：
[0482] 表3：测试的半胱天冬酶抑制剂
[0483]
[0484] 向全血样品加入每种测试的半胱天冬酶抑制剂(在10ml血液中20μM终浓度；血液收集在BD的Vacutainer K2E管中)。全血样品如部分1(血浆制备和核酸分离)中所述进行处理。
[0485] 芯片凝胶电泳的结果
[0486] 将洗脱的循环无细胞DNA使用芯片凝胶电泳按照尺寸进行分离(方法的详细情况参见上文)。图13示出了得到的结果。DMSO对照和K2E血液(没有按照本发明的教示进行处理)显示出同样的梯状条带图案。这种图案出现在发生凋亡的样品中。在凋亡期间，内切核酸酶在核小体间连接区处降解基因组DNA，并产生约180bp或180bp的倍数的DNA片段。因此，凋亡发生在显示出清楚的梯状图案的样品中。此外，图案的强度(暗度)是决定性的。条带越暗，从细胞释放并因此污染细胞外核酸群体的基因组DNA越多。
[0487] 图13显示，DMSO对照和K2E血液样品在第3天已经显示出强的梯状图案，其在第7天变得甚至更强。因此，基因组DNA从样品中包含的细胞释放并且也被降解。这种释放和降解的DNA污染样品中包含的无细胞核酸。因此，使用这些样品没有获得可接受的稳定化作用。
[0488] 相反，用Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK处理的全血样品与对照相比显示出梯状图案的减少，尤其是在第7天，指示了对由凋亡引起的基因组DNA的释放和相应的基因组DNA片段化的抑制。这种效果得到了图14中示出的结果的证实(参见下文)。在用Q-VD-OPh处理的血液样品中，效果甚至更加显著，其在第3天和第7天已经显示出明显的梯状图案减少。因此，通过添加半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPh，有效阻止并分别减少了基因组DNA的释放和降解，尤其是片段化。
[0489] DNA定量的结果
[0490] 还使用了对DNA降解敏感的实时PCR测定法来定量洗脱的循环无细胞DNA(方法的详细情况参见实施例1)。图14显示了在室温下储存7天内，测试的半胱天冬酶抑制剂对细胞外核酸群体的稳定化的效果(18S DNA双链体测定法)，在这里是DNA的增加。
[0491] 通过定量实时PCR检测核糖体18S DNA，能够计算从第0天至第3或7天DNA的增加倍数(计算：用第3(或7)天的拷贝除以第0天的拷贝)。图14中示出的结果证实了当向全血样品添加半胱天冬酶抑制剂特别是Q-VD-OPh时，DNA的增加减少。与标准样品相比，Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK的稳定化效果在第7天更加显著，从而验证了图13中示出的结果。
[0492] 概述
[0493] 概述实时PCR和凝胶电泳的结果，证实了Q-VD-OPh或Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK的添加抑制DNA片段化，并且此外减少基因组DNA释放到血浆中。因此，向全血添加半胱天冬酶抑制剂，即使在室温下也有效地使样品和尤其是细胞外核酸群体稳定。因此，使用丁酰胺与半胱天冬酶抑制剂的组合是优选的。两种稳定剂的组合显著提高并延长稳定化效果。因此，涉及使用丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂的本发明的稳定化方法的使用，改进了稳定化并允许甚至在室温下运输全血样品而不损害样品的质量。为了在更长的储存时间段中也完全阻止基因组DNA的释放，也可以提高Q-VD-OPh的浓度。
[0494] 2.2.添加N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)的稳定化
[0495] 与K2EDTA一起测试了两种不同浓度的DMAA，并与单独的EDTA(K2E BD；18mg K2EDTA)进行比较。
[0496] 向全血样品的平行样加入DMAA(在10ml血液中0.75％和1.5％的终浓度；血液收集在Vacutainer K2E管中；BD)。
[0497] 将血液样品在室温下温育长达6天。在第0、3和6天，将全血样品在室温下以1912x g离心15min，然后将血浆样品在4℃下以16.000x g离心10min。使用1ml样品输入量，按照材料和方法部分中描述的流程进行DNA分离。将DNA洗脱在80μl EB缓冲液中，并使用实施例1中描述的RT PCR测定法进行定量。
[0498] DNA定量的结果
[0499] 图15显示了测试浓度的DMAA对血浆中基因组DNA增加的影响。添加DMAA显著减少了基因组DNA在血浆中的释放。向全血添加的DMAA越多，释放的DNA越少。如果向全血样品加入DMAA，则在储存的3天内仅观察到无细胞DNA的少量增加。
[0500] 概括来说，DMAA的添加减少基因组DNA在血浆中的释放。因此，向血液样品添加DMAA即使在室温下也有效地使样品稳定。然而，DMAA是有毒试剂。
[0501] 2.3.DMAA与OPH(半胱天冬酶抑制剂)浓度的组合对ccfDNA水平的影响
[0502] 首先将10ml全血样品收集在BD Vacutainer K2E-EDTA(4.45mM EDTA＝参比)中。然后加入2ml下列溶液(给出的浓度表示稳定化的血液溶液中的终浓度)。每种条件使用来自于不同献血者的6个管进行试验。
[0503] 1：EDTA参比(BD Vacutainer K2E)‘
[0504] 2：50mg EDTA，1μM OPH；
[0505] 3：50mg EDTA，2μM OPH；
[0506] 4：50mg EDTA，1μM OPH，5％DMAA；
[0507] 5：50mg EDTA，1μM OPH，10％DMAA；
[0508] 6：50mg EDTA，2μM OPH，5％DMAA；
[0509] 7：50mg EDTA，2μM OPH和10％DMAA。
[0510] 如实施例1中所述进行样品温育、血浆分离和从澄清的血浆级分分离核酸。然而，在3.000rpm的第一离心步骤后，将稳定化条件一致的血浆样品合并，然后进行用于血浆澄清的第二离心步骤(16.000x g)。结果显示在图16中。正如可以看到的，使用半胱天冬酶抑制剂和DMAA的组合比单独的半胱天冬酶抑制剂更加有效。此外，正如上面的实施例所示，无毒试剂丁酰胺与DMAA同等地有效并因此提供了无毒性的稳定化替选方案。图17示出了与图16相同的结果，但由于排除了参比数据而使用不同的缩放比例。
[0511] 2.4.检测极限(LoD)
[0512] 细胞外核酸通常以非常小的量包含在样品中。因此，获得不仅高效地保护稳定化的样品中的细胞外核酸，而且另外允许随后从稳定化的样品以高得率回收细胞外核酸的稳定化程序，是重要的。实施例5.(2.4)证实，不涉及甲醛释放剂的使用的稳定化方法优于现有技术的稳定化方法之处在于可以以高得率从稳定化的样品分离细胞外核酸。这有利地降低了检测极限，并且因此也允许可靠地确定细胞外核酸群体内的稀有靶核酸。
[0513] 比较了下列稳定化溶液/管：
[0514] 1.无细胞RNA BCT(Streck Inc，目录号：218976-包含甲醛释放剂作为稳定剂)[0515] 2.BD Vacutainer K2E(BD，目录号：367525-包含EDTA)＝参比
[0516] 3.QGN稳定化(5％DMAA，14mM EDTA，2μM OPH(半胱天冬酶抑制剂))
[0517] 将全血样品收集在无细胞RNA BCT和BD Vacutainer K2E管中。向收集在BD管中的一半血液加入QGN稳定化溶液。因此，按照本发明稳定化的样品包含由BD Vacutainer稳定化所贡献的附加量的EDTA。将样品以3.000x rpm离心10分钟，并将得到的血浆等分成1.5ml平行样。随后，向每个样品加入下列量的掺有DNA的对照(1.000bp)：1.000个拷贝，5000个拷贝，100个拷贝，50个拷贝和10个拷贝。
[0518] 制备500至10个拷贝/样品的8个平行样，1.000个拷贝/样品和5个拷贝/样品的4个平行样。将样品在室温下温育3天。样品制备在QIAsymphony SP自动化系统上进行，使用允许从血浆样品分离细胞外核酸的QIAsymphony病毒/细菌无细胞1000应用。将核酸洗脱在60μl中；随后的PCR进行一式三份。
[0519] 结果显示在图18中。正如可以看到的，当使用BD EDTA管或本发明的稳定化溶液时，每个样品≥1.000个拷贝时获得100％命中。这显示，当使用包含半胱天冬酶抑制剂和DMAA的稳定化溶液时，核酸的分离不受损害。相反，基于使用甲醛释放剂(Streck)的稳定化显示出核酸分离的强烈抑制。正如可以看到的，可以从相应样品分离的核酸明显更少，即使使用其中掺有500或甚至1.000个拷贝的样品。此外，图18显示，使用利用半胱天冬酶抑制剂和DMAA稳定化的样品时获得最佳灵敏度。即使对于其中每个样品仅掺入10个拷贝的实施方式来说，仍获得13％的阳性PCR命中。因此，不使用甲醛释放剂的稳定化方法允许随后回收甚至非常低丰度的细胞外核酸。这与基于交联的稳定化相比是重要的优点，因为它使这种方法特别适用于诊断应用和例如稀有的目标细胞外核酸例如肿瘤来源的细胞外核酸或胎儿核酸的检测。特别是，在较低拷贝数下，基于使用甲醛释放剂的稳定化溶液具有非常低的性能，并显示出最高的检测极限。这也通过表4得到证实。
[0520] 表4：稳定化方法对核酸分离的影响
[0521]
[0522] 正如可以从所述表看出的，对于1.000bp片段来说，使用EDTA样品和包含DMAA和半胱天冬酶抑制剂的稳定化溶液获得的结果是可比的。因此，稳定化不损害随后的核酸分离。使用甲醛释放剂的稳定化显示出最高的检测极限，因此表明随后的核酸分离严重受损。
[0523] 这也通过图19和20中示出的结果得到证实。正如可以看到的，对于EDTA稳定化的样品和使用半胱天冬酶抑制剂和DMAA稳定化的样品来说，获得了可比的ccfDNA得率(通过18S rDNA qPCR测量)。然而，对于涉及使用甲醛释放剂的稳定化(Streck管)来说，获得降低的ccfDNA得率。甲醛稳定化的样品与EDTA稳定化的样品相比，得率降低约50％。相反，当使用常规核酸分离方法时，不包含甲醛释放剂的稳定化试剂对ccfDNA得率没有显示出不利影响。正如可以通过上述实施例1至4看到的，对于下游核酸分离来说，使用丁酰胺作为稳定剂的稳定化方法显示出与DMAA等同的性能。因此，可以做出与基于甲醛释放剂的稳定化的间接比较。因此，不涉及使用交联剂的基于丁酰胺的稳定化也对ccf DNA得率没有不利影响。这是重要的优点，因为它允许将这样的稳定化方法整合到现有的核酸分离程序和工作流程中。使用基于丁酰胺的使用的本发明的方法获得了相似结果。由于也没有使用交联剂，因此核酸分离不受损害。
[0524] 实施例6
[0525] 使用的缩写：
[0526] BA：丁酰胺
[0527] ccfDNA：循环的无细胞DNA
[0528] DMPA：二甲基丙酰胺
[0529] EDTA：乙二胺四乙酸
[0530] PEG：聚乙二醇
[0531] 在实施例6中，试验了聚乙二醇(PEG)单独或与丁酰胺组合并任选地包含半胱天冬酶抑制剂和/或叔酰胺时使含有细胞的生物样品、这里是血样稳定化的能力。与参比样品(EDTA血液相比)，发现PEG能够以防止基因组DNA释放到细胞外核酸群体中的方式高效地使全血样品中的白细胞稳定。对于不同分子量的PEG并且当以不同浓度使用时，证实了这种稳定化效果。证实了PEG可以作为无水粉末或液体、作为纯的试剂或溶解在水性溶液中添加。单独的PEG自身具有强的稳定化效果，但是它与丁酰胺的组合也明显改进稳定化。优选地另外使用半胱天冬酶抑制剂。已证实，使用这种有利的组合实现了在第0天(紧接抽血之后)与第6天(在室温下储存6天)之间从白细胞释放到血浆中的DNA的增加可重复地降低到2倍或甚至更低。因此，稳定化效果也可以延长到6天或甚至更长时间。这种实现的长期高效的稳定化是重要的优点，因为它为含有细胞的样品例如血样提供了一致、可靠的稳定化方法。此外，实施例证实了使用高分子量PEG与低分子量PEG的组合是有利的，这是因为实现了强的稳定化效果，并且可以使用例如基于二氧化硅柱的核酸分离方法高效地从稳定化的样品分离细胞外核酸。
[0532] 材料和方法
[0533] 除非另有指明，否则在实施例6中遵从下列程序。
[0534] 血液收集和稳定化
[0535] 将血液抽取到10ml喷雾干燥的EDTA管(BD)中，所述管含有每ml全血1.8mg K2EDTA。在抽血后30min内，直接加入稳定化试剂，或者将血液倾倒在含有稳定化试剂的新管中。通过将管颠倒10次来混合血液和试剂。将稳定化的血样在室温下以直立方式放置储存。
[0536] 血浆的制备
[0537] 将全血样品在环境温度下以3.000rpm(每分钟转数)离心15min。通过吸取并转移到新的离心管中，取出透亮的血浆级分。在第二轮中，将血浆样品在4℃下以16.000xg离心10min。将上清液转移到新的管中，并直接用于ccfDNA的纯化或在-20℃下储存直至使用。
[0538] ccfDNA的纯化
[0539] 使用QIAamp循环核酸试剂盒(QIAGEN GmbH)，使用“从1ml、2ml或3ml血清或血浆纯化循环核酸”的流程，从血浆分离DNA。除非另有陈述，否则按照制造商的推荐，将2ml血浆与蛋白酶K和裂解缓冲液ACL混合，在60℃温育30min，与缓冲液ACB混合，使用QIAvac24Plus多头抽真空装置将其结合到QIAamp Mini柱(其包含用于结合核酸的二氧化硅固相)上，清洗并用60μl洗脱缓冲液AVE洗脱。
[0540] 用于分析分离到的细胞外DNA的定量实时PCR测定法
[0541] 在Abi Prism HT7900(Life technologies)上，使用3μl洗脱液，在实时PCR测定法中分析分离到的细胞外DNA。在20μl测定体积中，使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒试剂(QIAGEN GmbH)，将人类18S rDNA基因的两个片段66bp和500bp在多重PCR中进行扩增。按照gDNA标准曲线，将各个样品的循环阈值(Ct值)转换成洗脱液中gDNA的量：总定量通过与使用稀释到3000至0.3个基因组当量(1个基因组当量等于约6.6pg人类基因组DNA)的人类基因组DNA产生的标准曲线进行比较来获得。将储存时间点(一般为抽血后6天)的gDNA量与来自于同一献血者的零时gDNA水平进行比较。关于所使用的通过定量实时PCR靶检测的DNA靶序列的详细情况，概述在上面的表2中。
[0542] 再次使用66bp片段的定量来反映血浆中18S rDNA拷贝的总量。使用500bp片段的的量来确定源自于全血的凋亡或机械裂解的白细胞的18S rDNA拷贝的量。无细胞DNA通常具有140–170bp的长度。因此，500bp片段据信源自于凋亡、裂解或通过其他方式破坏的血细胞。在T0与6天储存之间500bp片段的拷贝数增加，被用作稳定化效能的度量。因此，释放的500bp DNA的量越低，稳定化方法的性能越好。释放的500bp DNA的量较高，表明发生白细胞裂解以及因此细胞外核酸群体被细胞内基因组DNA污染。
[0543] 对于使用不同稳定化组合物的后续实验来说，使用来自于多个不同个体献血者的血样。对于每个个体献血者样品来说，单个计算相比于抽血后时间点0(第0天)，在室温下储存不同时间点(天)的稳定化或未稳定化的血液中18S rDNA基因的66bp和500bp片段的拷贝数的平均变化倍数。相应的单个计算的平均值(变化倍数)的平均数被用作所使用的不同稳定化组合物的稳定化效能的度量。由于取决于献血者，血样隐含有组成和所包含的细胞外核酸的量的天然个体变化性，因此这可能导致标准偏差升高。
[0544] 5.血红蛋白的测量
[0545] 在spectramax分光光度计上测量在414nm处的吸光度，已发现所述吸光度与血浆的溶血变色线性相关。
[0546] 在实施例6中试验的条件
[0547] 6.1.实施例6.1
[0548] 在实施例6.1中，试验了在不存在水的情况下，具有不同分子量的聚乙二醇(PEG)与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合的稳定化效果，并与组合的BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)方法进行比较。此外，平行地测量在血浆样品中这样的稳定化混合物对溶血的影响。EDTA血样用作未稳定化的参比对照。
[0549] 血液收集和稳定化
[0550] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用不添加水并含有或不含不同分子量的PEG的丁酰胺(BA)和EDTA的混合物稳定化。通过移液添加溶解在DMSO中的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外6天。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行实验。
[0551] 对于每种条件和试验点，设立所有稳定化的血样的三份平行样。在将稳定化溶液与血液混合后即刻的0时间点(参比时间点)，产生血浆并提取循环细胞外DNA。作为参比对照，将EDTA稳定化的血样(收集在不含其他添加剂的K2EDTA管中)也储存0或6天，并一式三份进行分析。
[0552] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0553] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0554] -BA、EDTA、Q-VD-OPh：100mg BA，132mg K2EDTA，10μl Q-VD-OPh(1mg 溶 解 在388μl DMSO中)，加水2ml
[0555] -PEG(600、1000 或 3000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：250mg PEG(600、1000 或 3000)，100mg BA，132mg K2EDTA，10μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)(不含水)
[0556] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0557] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0558] -BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0559] -PEG(600、1000 或 3000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2.5 ％ (w/v)PEG(600、1000 或3000)，1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0560] 结果
[0561] 对于8位献血者中的每一位来说，单个计算相比于抽血后时间点0(第0天)，在室温下储存6天的来自于8位献血者的稳定化或未稳定化的血液中18S rDNA基因的66bp和500bp片段的拷贝数的平均变化(x变化倍数)。图21示出了每种条件来自于8位献血者的拷贝数的相应的平均变化倍数。与未稳定化的对照(EDTA血液)相比，所有稳定化组合物显示出明显更低的在室温下储存6天后释放的基因组DNA的量，这是由于平均变化倍数的增加明显更少。因此，即使在整个这种6天的长稳定化时间段中，稳定化效果也得以实现。图21证实了将血样另外与聚乙二醇相接触明显提高了获得的稳定化效果。因此，不同分子量的PEG在提高稳定化效果方面高度有效，因为平均变化倍数的增加一致地降低到低于2倍，并且在某些实施方式中甚至低于1倍。即第6天的DNA水平与基线时间点(第0天)的水平相当。
[0562] 概括来说，当与聚乙二醇相组合时，包含半胱天冬酶抑制剂和丁酰胺的稳定化组合物的稳定化效果可以被显著提高。不同分子量的聚乙二醇都是有效的。此外，结果表明，PEG的稳定化性能随着PEG分子量的增加而提高，表明在所使用的PEG的分子量与得到的样品稳定化效果之间存在正相关。更高的分子量提高获得的稳定化效果。
[0563] 6.2.实施例6.2
[0564] 在实施例6.2中，试验了在不存在水的情况下EDTA、BA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合的稳定化效果，并与另外包含不同量(0.2g、0.3g或0.4g)的分子量为600的PEG(PEG600)的相应组合物进行比较。EDTA血液用作未稳定化参比。
[0565] 血液收集和稳定化
[0566] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于6位献血者的10ml全血样品，用含有或不含不同量的分子量为600的PEG(PEG600)并且不添加水的丁酰胺(BA)与EDTA的混合物稳定化。此外，通过移液加入溶解在DMSO中的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外6天。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，每种条件和每个时间点进行三份平行实验。作为参比对照，将EDTA稳定化的血样(收集在不含其他添加剂的K2 EDTA管中)也储存6天。
[0567] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0568] -BA、EDTA、Q-VD-OPh：100mg BA，182mg K2EDTA，10μl Q-VD-OPh(1mg 溶 解 在388μl DMSO中)，加2ml水
[0569] -PEG600(0.2-0.4g)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：200、300和400mg PEG600，100mg BA，188mg K2EDTA，10μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)
[0570] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0571] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0572] -BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)BA，20mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0573] -PEG600(0.2-0.4g)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2、3和4％(w/v)PEG600，1％(w/v)BA，20mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0574] 结果
[0575] 来自于6位个体献血者样品的描绘为平均变化倍数的定量实时PCR分析的结果示出在图22中。示出了使用0.2g、0.3g或0.4g PEG600时DNA(66bp和500bp片段)相对于零时的增加(平均变化倍数)。与参比的EDTA血液相比，所有试验的稳定化组合物显示出明显更低的在室温下储存6天后释放的DNA的量。如果将含有细胞的样品另外与聚乙二醇相接触，稳定化效果将明显提高。与不包含PEG的组合物(BA、EDTA、Q-VD-OPh)相比，在所有三种基于PEG的稳定化方法中两种18S rDNA扩增子拷贝数的平均变化倍数明显更小。在所有情况下x变化倍数都低于2倍。这个实施例证实，为了使细胞外核酸群体而使用不同量的聚乙二醇，明显改进了使用半胱天冬酶抑制剂和丁酰胺实现的稳定化结果。
[0576] 6.3.实施例6.3
[0577] 在实施例6.3中，试验了在存在水的情况下直接冻干在血液收集管中的包含高分子量PEG(PEG3000)、EDTA、BA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的试剂混合物的稳定化效果，并与用包含BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的溶液同时处理的样品进行比较。
[0578] 样品收集和稳定化
[0579] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用含有或不含PEG3000的丁酰胺(BA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物稳定化。为了冻干，将包括半胱天冬酶抑制剂、EDTA、BA和PEG的所有组分溶解在水中。将1ml体积(终浓度参见下文)在5ml管中在冷冻干燥机Epsilon 2-25D(Christ GmbH)上冻干。将血液从K2EDTA管转移到含有冻干的稳定化试剂的5ml管中，并通过将管颠倒10次进行稳定化。作为参比，新鲜制备试剂并通过移液添加溶解在DMSO中的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)。
[0580] 血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外6天。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行实验。
[0581] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0582] -新鲜制备的BA、EDTA、Q-VD-OPh：100mg BA，132mg K2EDTA，10μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加2ml水
[0583] -新鲜制备的PEG3000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：250mg PEG3000，100mg BA，132mg K2EDTA，10μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)(没有水)
[0584] 5ml管中用于冻干的0.5ml稳定化试剂混合物的组成：
[0585] -冻干的：0.5ml稳定化试剂，含有125mg PEG3000、50mg BA、67.5mg K2EDTA、5μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)
[0586] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0587] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0588] -BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0589] -PEG3000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：1 ％ (w/v)PEG 3000，1 ％ (w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0590] 结果
[0591] 结果示出在图23中。示出了基于18S rDNA基因的不同扩增子长度，抽血后6天相对于零时的DNA的增加(平均变化倍数)。结果再次证实，如果另外将聚乙二醇用于稳定化，稳定化效果将明显提高，并且它增强了使用BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)所实现的稳定化效果。此外，在所试验的长稳定化时间段(6天)期间，x变化倍数低于2倍。此外，实施例证实了这些稳定化组合物可以新鲜制备或以冻干形式使用。
[0592] 6.4.实施例6.4
[0593] 在实施例6.4中，试验了在还含有BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的水性稳定化溶液中具有不同分子量的PEG(PEG300、PEG600、PEG1000)的稳定化效果，并与用BA、二甲基丙酰胺(DMPA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)共同处理的样品进行比较。未稳定化的EDTA血液用作参比对照。
[0594] 血液收集和稳定化
[0595] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用含有或不含不同分子量的PEG的丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)在水性溶液中的混合物稳定化。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外6天。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行实验。
[0596] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0597] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA，180μl DMPA，68.4mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0598] -PEG(300、600 或 1000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：287.5mg PEG(300,600 或 1000)，115mg BA，154.5mg K2EDTA，11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1.5ml[0599] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0600] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0601] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA，1.5％(v/v)DMPA，7.2mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0602] -PEG(300、600或1000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2.5％(w/v)PEG，1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0603] 结果
[0604] 图24示出了获得的稳定化结果。正如可以看到的，包含不同分子量的PEG的水性稳定化组合物提高了使用丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂实现的稳定化效果。正如可以从污染的基因组DNA的量减少看出的，白细胞的稳定化明显改进。结果还证实，稳定化效果随着所使用的PEG的分子量的增加而提高。当使用分子量为1000的聚乙二醇时，500bp片段的增加降低到低于2倍。
[0605] 6.5.实施例6.5
[0606] 在这里，试验了在与丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)相组合的水性稳定化溶液中降低PEG浓度(2％、1.5％、1％或0.7％)的稳定化效果。未稳定化的EDTA血液用作参比对照。平行地试验了包含BA、EDTA和Q-VD-OPh的组合物。
[0607] 血液收集和稳定化
[0608] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用含有或不含不同浓度的PEG6000的丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)在水性溶液中的混合物稳定化。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外6天。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行实验。
[0609] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0610] -BA、EDTA、Q-VD-OPh：110mg BA，147mg K2EDTA，11μl Q-VD-OPh(1mg 溶 解 在388μl DMSO中)，加水1ml
[0611] -PEG6000(2–0.7％)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：220、165、110、77mg PEG6000，110mg BA，147mg K2EDTA，11μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1ml
[0612] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0613] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0614] -BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0615] -PEG6000(2–0.7％)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2、1.5、1、0.7％(w/v)PEG6000，1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0616] 结果
[0617] 在实施例6.5中，试验了浓度逐渐降低的较高分子量PEG6000当与丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂组合使用时对白细胞的稳定化的影响。图25示出了通过经定量实时PCR分析18S rDNA的增加所确定的获得的细胞外核酸群体的稳定化结果。本发明的所有包含PEG的稳定化组合物显示出明显较低量的在室温下储存6天后释放的DNA，从而在这样的长稳定化时间段内改进了包括丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂的稳定化方法。此外，正如可以看到的，可以使用不同浓度的高分子量聚乙二醇使水性溶液中的白细胞稳定，从而减少了细胞外核酸群体被基因组DNA的污染。此外，再次显示了PEG提高丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂的稳定化效果，由此提供了非常有效的稳定化方法。
[0618] 6.6.实施例6.6
[0619] 在实施例6.6中，试验了PEG在不同体积的水性稳定化溶液中并与EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA相组合的稳定化效果。未稳定化的EDTA血液用作参比对照。平行地试验包含BA、DMPA、EDTA和Q-VD-OPh的组合物。
[0620] 血液收集和稳定化
[0621] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用PEG6000、丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)在0.8和1.2ml的不同体积的水性溶液中的混合物稳定化。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外6天。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行实验。
[0622] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0623] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA，180μl DMPA，68,4mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0624] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：112mg PEG6000，56mg BA，150mg K2EDTA，2.23μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1.2或0.8ml
[0625] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0626] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0627] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA，1.5％(v/v)DMPA，7.2mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0628] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh加水1.2ml：1％(w/v)PEG6000，0.5％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，1μM Q-VD-OPh
[0629] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh加水0.8ml：1.04％(w/v)PEG6000，0.52％(w/v)BA，15.6mg/ml K2EDTA，1.03μM Q-VD-OPh
[0630] 结果
[0631] 图26示出了这些稳定化测定的结果。示出的是相对于抽血后的时间点(第0天)，在室温下储存6天的稳定化或未稳定化的血液中不同18S rDNA基因扩增子(66bp或500bp)的DNA拷贝的拷贝数的平均变化(变化倍数)。结果证实，聚乙二醇可以与不同酰胺组合，在不同体积的水性溶液中使白细胞稳定，从而提供了稳定化的血样，其中细胞外核酸群体通过防止细胞内核酸的稀释而得到保护。
[0632] 6.7.实施例6.7
[0633] 在实施例6.7中，利用溶血测定法试验了稳定化试剂在水性稳定化溶液中的效果。
[0634] 血液收集和稳定化
[0635] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用含有或不含PEG并添加水的丁酰胺或丁酰胺与DMPA的组合以及EDTA的混合物稳定化。通过移液加入溶解在DMSO中的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外3、6和10天。血红蛋白含量通过在分光光度计上在414nm处测量吸光度来确定。
[0636] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0637] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA，180μl DMPA，68,4mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0638] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：137.5mg PEG6000，55mg BA，165mg K2EDTA，11μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1.0ml
[0639] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0640] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0641] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA，1.5％(v/v)DMPA，7.2mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0642] -PEG6000，BA，EDTA，Q-VD-OPh：1.25％(w/v)PEG6000，0.5 ％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0643] 结果
[0644] 图27示出了在储存0、3、6和10天后对来自于8位不同献血者的血浆样品中的溶血的影响。图27将来自于8位献血者的溶血的平均增加描绘为血浆级分中在414nm处吸光值的增加。
[0645] 尽管在EDTA对照实验中溶血随着储存时间而升高，但在图27中可以看到，与EDTA参比相比，使用本发明的含有与EDTA和BA组合的PEG6000的水性稳定化溶液时，在所分析的时间点中溶血减少。值得注意的是，在EDTA对照中看到的从储存第6天到储存第10天溶血的增加，在包含本发明的稳定化试剂组合物和水的所有被试验的溶液中被根本上减少。在含有PEG的水性溶液中溶血减少的程度，与组合的BA、DMPA、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)稳定化的样品相当。因此，水性稳定化组合物是有利的，因为它有效地减少溶血。
[0646] 6.8.实施例6.8
[0647] 在实施例6.8中，试验了与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)组合使用不同分子量的PEG(PEG300、PEG600、PEG1000、PEG3000)对ccfDNA拷贝数的影响，并与未稳定化的EDTA对照血液进行比较。平行地试验了含有BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合物。
[0648] 血液收集和稳定化
[0649] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用包含分子量逐渐增加的PEG的丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)在水性溶液中的组合稳定化。血浆在血液收集后1小时直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行试验。
[0650] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0651] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA，180μl DMPA，68.4mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0652] -PEG(300、600、1000或3000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：287.5ml PEG 300或287.5mg PEG(600、1000或3000)，115mg BA，154.5mg K2EDTA，11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1.5ml
[0653] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0654] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0655] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA，1.5％(v/v)DMPA，7.2mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0656] -PEG(300、600、1000或3000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2.5％(v/v或w/v)PEG，1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0657] 结果
[0658] 来自于8位不同献血者的绝对定量实时PCR分析的结果作为平均值示出在图28中。具体显示了在抽血后第0天，在献血者的稳定化或未稳定化的血样中不同的18S rDNA基因扩增子(66bp或500bp)的DNA的绝对拷贝数的平均值。目的是为了试验所使用的稳定化方法对随后使用基于二氧化硅柱的核酸分离程序时的核酸得率的影响。图28显示，与EDTA参比样品(未稳定化方法)或含有BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的稳定化血液溶液相比，添加较高分子量PEG导致血浆中可检测的扩增子基因拷贝数减少。结果表明，将具有增加的分子量或链长的PEG用于稳定化，当以较高浓度使用时，可以导致当使用基于二氧化硅柱的核酸分离方法从稳定化的样品分离细胞外核酸时血浆中可检测的ccfDNA基因拷贝数的减少。
[0659] 6.9.实施例6.9
[0660] 在实施例6.9中，试验了与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)相组合的不同浓度(1.0％、1.25％或1.5％)的PEG6000。EDTA稳定化的血样用作参比对照。平行地分析了含有BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的血液混合物。
[0661] 血液收集和稳定化
[0662] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用含有或不含PEG6000的酰胺(DMPA和/或BA)、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合稳定化，其中组合物的体积为每10ml血液1.5ml，并且PEG浓度逐渐增加。血浆在血液收集后1小时从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行试验。
[0663] 对于每份10ml K2EDTA全血来说稳定化试剂混合物的组成：
[0664] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA，180μl DMPA，68,4mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0665] -PEG6000(1–1.5 ％)、BA、EDTA、Q-VD-OPh– 加 水 1.5ml：115、144 和 172mg PEG6000，115mg BA，155mg K2EDTA，11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1.5ml
[0666] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0667] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0668] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA，1.5％(v/v)DMPA，7.2mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0669] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：1、1.25和1.5％(w/v)PEG6000，1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0670] 结果
[0671] 实施例6.9的结果示出在图29中。示出了使用本发明的包含不同浓度(1.0％、1.25％或1.5％)PEG6000和BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的稳定化组合物时，基于18S rDNA基因的不同扩增子长度，来自于8位献血者的抽血后第0天ccfDNA的绝对拷贝数的平均减少。图29显示，在含有PEG的稳定化的血液-血浆中，18S rDNA基因的66bp和500bp片段的绝对拷贝数的减少，以PEG浓度依赖性的方式发生。这证实了提高稳定化溶液中较高分子量PEG(PEG6000)的浓度，导致当使用基于二氧化硅柱的核酸分离方法时血浆中可检测的ccfDNA基因拷贝数的减少。
[0672] 6.10.实施例6.10
[0673] 在实施例6.10中，分析了不同体积的包含高分子量PEG(PEG6000)与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合的水性稳定化组合物的稳定化效果。平行地分析了与包含两种酰胺(DMPA、BA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合的稳定化溶液温育的血液。EDTA血液用作未稳定化的参比。
[0674] 血液收集和稳定化
[0675] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用含有或不含PEG6000的酰胺(DMPA和/或BA)、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合的不同体积的水性溶液稳定化。血浆在血液收集后1小时从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行试验。
[0676] 对于每份10ml K2EDTA全血来说稳定化试剂混合物的组成：
[0677] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA，180μl DMPA，68,4mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0678] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh– 加 水 1ml：110mg PEG6000，110mg BA，147mg K2EDTA，11μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1ml
[0679] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh–加水1.5ml：115mg PEG6000，115mg BA，155mg K2EDTA，11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1.5ml
[0680] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh– 加 水 2ml：120mg PEG6000，120mg BA，162mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0681] 由此，在与血液接触后在混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0682] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0683] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA，1.5％(v/v)DMPA，7.2mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0684] -PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh，加水1、1.5或2ml：1％(w/v)PEG6000，1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0685] 结果
[0686] 在实施例6.10中，试验了不同体积的本发明的包含PEG6000与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合的稳定化溶液(1ml、1.5ml或2ml)。图30中示出的结果证实，在稳定化的样品中18S rDNA基因的两种所试验的片段的绝对拷贝数的减少，依赖于稳定化试剂的体积。因此，增加含有高分子量PEG的稳定化组合物的体积(以及因此提高稳定化组合物与血液的比率)，导致血浆中可检测的ccfDNA基因拷贝数减少。当使用较小体积时拷贝数不明显减少，正如从为1ml稳定化溶液所显示的结果明显看出的。
[0687] 6.11.实施例6.11
[0688] 在实施例6.11中，分析了合并在含有BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的水性稳定化溶液中的高分子量PEG(0.5％PEG6000)和低分子量PEG(2.5％或5％PEG300)的组合的稳定化效果。同时分析了与包含两种酰胺(DMPA、BA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物的稳定化溶液温育的血液。EDTA血液用作未稳定化的参比对照。
[0689] 血液收集和稳定化
[0690] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用体积为1.5ml的PEG300和PEG6000、BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)在水性溶液中的混合物稳定化。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外6天。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行试验。
[0691] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0692] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA，180μl DMPA，68,4mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0693] -0.5％PEG6000、2.5或5％PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh–1.5ml：57.5mg PEG6000，287.5μl或 575μl PEG300，115mg BA，155mg K2EDTA，11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶 解 在
388μl DMSO中)，加水1.5ml
388μl DMSO中)，加水1.5ml
[0694] 由此，在全血/稳定化的混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0695] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0696] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA，1.5％(v/v)DMPA，7.2mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0697] -PEG6000、PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh–1.5ml：0.5％(w/v)PEG6000，2.5或5％(v/v)PEG300，1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0698] 结果
[0699] 图31将来自于8位献血者的qPCR分析结果显示成与抽血后的0时间点(第0天)相比，在室温储存6天的来自于献血者的稳定化和未稳定化的血液中所试验的66bp或
500bp长的18S rDNA基因扩增子的拷贝数的平均变化(x变化倍数)。尽管未稳定化的EDTA血液对照表现出拷贝数的平均变化倍数的提高，但含有PEG的所有稳定化组合物仅仅显示出18S rDNA基因扩增子拷贝数的平均x变化倍数的少量增加。结果指示了所试验的含有PEG的稳定化组合物的相似的稳定化能力。所实现的稳定化改进了包含BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂的稳定化组合物，从而再一次证实了在另外使用聚乙二醇时获得的重要优势。
500bp长的18S rDNA基因扩增子的拷贝数的平均变化(x变化倍数)。尽管未稳定化的EDTA血液对照表现出拷贝数的平均变化倍数的提高，但含有PEG的所有稳定化组合物仅仅显示出18S rDNA基因扩增子拷贝数的平均x变化倍数的少量增加。结果指示了所试验的含有PEG的稳定化组合物的相似的稳定化能力。所实现的稳定化改进了包含BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂的稳定化组合物，从而再一次证实了在另外使用聚乙二醇时获得的重要优势。
[0700] 此外，证实了所使用的含有高和低分子量PEG的组合的稳定化溶液的所描述的有利的稳定化能力，不伴有ccfDNA拷贝数的降低。这通过试验相同溶液在抽血后第0天的血浆中18S rDNA扩增子的绝对拷贝数的变化来分析。图32示出了得到的结果。得到的绝对拷贝数与包含BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂的稳定化组合物相近。因此，在这种测定法中没有检测到绝对ccfDNA拷贝数的显著减少。因此，不同分子量的PEG、尤其是高和低分子量PEG的组合，可以合并在含有BA的不同体积的水性溶液中，以有效地使血样的细胞外核酸群体稳定，尤其是通过使白细胞稳定，并且在使用包含二氧化硅膜的标准核酸分离程序时没有绝对ccfDNA拷贝数的显著降低。
[0701] 6.12.实施例6.12
[0702] 在实施例6.12中，通过溶血测定法试验了水性稳定化溶液的效果。在这里，分析了与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)相组合的高分子量PEG(0.5％PEG6000)和低分子量PEG(2.5％或5％PEG300)的组合。同时分析了与包含两种酰胺(DMPA、BA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物的稳定化溶液温育的血液。EDTA血液用作未稳定化的参比对照。
[0703] 血液收集和稳定化
[0704] 将收集在10ml喷雾干燥K2EDTA管中的来自于8位献血者的10ml全血样品，用体积为1.5ml的PEG300和PEG6000、BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)在水性溶液中的混合物稳定化。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外6天。血红蛋白含量通过在分光光度计上测量414nm处的吸光值来确定。
[0705] 稳定化试剂混合物的组成(对于每份10ml K2EDTA全血来说)：
[0706] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA，180μl DMPA，68,4mg K2EDTA，12μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水2ml
[0707] -0.5 ％ PEG6000、2.5 或 5 ％ PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh：57.5mg PEG6000，287.5μl或 575μl PEG300，115mg BA，155mg K2EDTA，11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶 解 在
388μl DMSO中)，加水1.5ml
388μl DMSO中)，加水1.5ml
[0708] 由此，在全血/稳定化混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0709] -未稳定化的：1.8mg/ml K2EDTA
[0710] -BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA，1.5％(v/v)DMPA，7.2mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0711] -PEG6000、PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh：0.5％(w/v)PEG6000，2.5或5％(v/v)PEG300，1％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0712] 结果
[0713] 图33示出了在抽血后将血液储存0和6天后，所分析的包含不同分子量PEG和BA的水性溶液对来自于8位不同献血者的血浆样品中的溶血的影响。图33将溶血的增加显示成在血液储存0和6天后血浆级分中414nm处吸光值的增加。
[0714] 正如可以在图33中看到的，EDTA对照实验揭示出与储存后0天的初始时间点相比，在血样储存6天后溶血的增加(414nm处吸光值的增加)。使用包含与EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA相组合的0.5％PEG6000(较高分子量PEG)和浓度为5％的PEG300(较低分子量PEG)的混合物的稳定化组合物，溶血与EDTA参比样品类似。相反，使用与0.5％PEG6000、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA相组合的较低浓度的PEG300(这里是2.5％)的本发明的稳定化组合物，减少了血液储存6天后的溶血。这证实了在含有溶解在水性溶液中的高和低分子量PEG的平衡的组成的稳定化组合物中，溶血可以被阻止。
[0715] 6.13.实施例6.13
[0716] 将包含预装填在真空血液收集管(Alpha管)中的PEG6000、BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的稳定化组合物，与包含基于使用甲醛释放剂作为稳定剂的稳定化组合物的可商购的Streck无细胞DNA BCT管进行比较。
[0717] 血液收集和稳定化
[0718] 将来自于8位献血者的10ml全血样品收集在10ml喷雾干燥K2EDTA Alpha管中，所述管预装填有一定量的本发明的包含PEG6000、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA的稳定化组合物在Streck无细胞DNA BCT管中。血浆直接从5ml稳定化或未稳定化的血样产生。在产生血浆之前，将剩余的血液在室温下储存另外3、6和10天。从2ml血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR测定18S rDNA基因的拷贝数，进行三份平行试验。
[0719] 不同管中稳定化试剂混合物的组成(全都具有10ml血液抽取体积)：
[0720] -EDTA–10ml喷雾干燥的EDTA
[0721] -Alpha1-管(PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh)：137.5mg PEG6000，55mg BA，165mg K2EDTA，11μl Q-VD-OPh(1mg溶解在388μl DMSO中)，加水1.0ml
[0722] -Streck无细胞DNA BCT管：包含甲醛释放剂作为稳定剂
[0723] 由此，在全血/稳定化混合物中获得下列不同组分的终浓度：
[0724] -EDTA管：1.8mg/ml K2EDTA
[0725] -Alpha1-管(PEG6000,BA,EDTA,Q-VD-OPh)：1.25％(w/v)PEG6000，0.5％(w/v)BA，15mg/ml K2EDTA，5μM Q-VD-OPh
[0726] -Streck无细胞DNA BCT管：浓度不适用
[0727] 结果
[0728] 结果示出在图34和35中。分析了在室温下储存3、6或10天的来自于8位献血者的稳定化或未稳定化的血液中，18S rDNA基因的66bp片段(图34)和500bp片段(图35)的拷贝数相对于从8位献血者抽血后的时间点0(第0天)的平均变化(x变化倍数)。条表示每种条件来自于8位献血者的拷贝数的平均变化倍数的相应标准偏差。如图34和35中所示，包含PEG6000、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA的两种所试验的稳定化组合物，在使血液中的细胞外核酸群体稳定中高度有效。对于所有试验的时间点来说，18S rDNA的66bp片段的拷贝数的平均变化倍数保持在0时间点的基线水平(变化倍数在1.0左右)。图35显示了18S rDNA基因的500bp片段水平的可比的结果，即在所试验的时间段中，在细胞破裂期间释放的细胞核酸的试验片段保持在0时间点的状态。这种稳定化效果与使用Streck无细胞DNA BCT管的结果相当。因此，本发明的稳定化组合物通过与包含甲醛释放剂的Streck无细胞DNA BCT管类似地减少细胞内核酸例如尤其是基因组DNA从白细胞的释放，有效地使血样中的细胞外核酸群体稳定。然而，正如上面解释的，甲醛释放物质的使用具有缺点，因为它们通过诱导核酸分子之间或蛋白质与核酸之间的交联，损害了细胞外核酸分离的效能。因此，必须使用特定核酸分离方法。本发明的不涉及这样的交联物质的使用的稳定化组合物，与基于交联的稳定化技术相比具有重要优点。
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