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分离的包括含硫酸根部分的表位的分子,抗这样的表位的抗体,和它们的应用

阅读：104发布：2022-06-22

专利汇可以提供分离的包括含硫酸根部分的表位的分子,抗这样的表位的抗体,和它们的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及癌细胞上存在的并且在细胞滚动，转移，和 炎症 等生理现象中重要的表位。提供了使用能与所述表位结合的 抗体 的 治疗 和诊断方法和组合物。在癌症等 疾病 ，包括 肿瘤 生长和转移，白血病，自身免疫疾病，和炎症疾病的诊断和治疗中能使用本发明的方法和组合物。，下面是分离的包括含硫酸根部分的表位的分子,抗这样的表位的抗体,和它们的应用专利的具体信息内容。

1.一种包括下式的分离的表位
式(I)
其中：
W是除了天冬氨酸和谷氨酸之外的任何氨基酸，
Y是能被硫酸化的任何天然存在的部分，
P是(A)m(A)n(X)u或(X)u(A)n(A)m或(A)n(X)u(A)m或(A)n(A)m(X)u或 (X)u(A)m(A)n或(A)m(X)u(A)n
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除了天冬氨酸，谷氨酸或酪氨酸之外的任何氨基酸，
A是任何带负电荷的氨基酸或亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，丝 氨酸，或甘氨酸
q是1至6
z是0，1，或2
r是0或1
t是1，2或3
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝0，则n＞0；其中如果q 是1，r是1，并且如果q＞1，则Y中至少一个被硫酸化；并且进一步 地，其中分离的表位能被抗体，其抗原结合片段，或者其包括至少一 种抗体或者其包括含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：20的第一高变 区的结合片段的复合体结合。
2.权利要求1的分离的表位，其中所述硫酸化部分是肽或糖或脂 偶联物。
3.权利要求1的分离的表位，其中：
W是甘氨酸，
Y是酪氨酸的肽偶联物或天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的糖偶联物，
A是谷氨酸，γ羧基谷氨酸或天冬氨酸，
q是1，2，或3。
4.权利要求3的分离的表位，其中：
Y是酪氨酸的肽偶联物；
q是3；
并且r是1。
5.一种包括下式的分离的表位，
式II
其中：
W是除了天冬氨酸和谷氨酸之外的任何氨基酸，
Y是能被硫酸化的任何天然存在的部分，
P是(A)m(A)n(X)u或(X)u(A)n(A)m或(A)n(X)u(A)m或(A)n(A)m(X)u或 (X)u(A)m(A)n或(A)m(X)u(A)n
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除了天冬氨酸，谷氨酸或酪氨酸之外的任何氨基酸，
A是任何带负电荷的氨基酸或亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，丝 氨酸，或甘氨酸
z是0，1，或2
r是0或1
t是1，2或3
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝0，则n＞0；其中至少 一个Y被硫酸化；并且进一步地，其中分离的表位能被抗体，其抗原结 合片段，或者其包括至少一种抗体或者其包括含有SEQ ID NO：8或 SEQ ID NO：20的第一高变区的结合片段的复合体结合。
6.权利要求5的分离的表位，其中所述硫酸化部分是肽或糖或脂 偶联物。
7.权利要求5的分离的表位，其中：
W是甘氨酸，
Y是酪氨酸的肽偶联物或天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的糖偶联物；
A是谷氨酸，γ羧基谷氨酸或天冬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸， 苯丙氨酸，丝氨酸或甘氨酸。
8.权利要求7的分离的表位，其中：
Y是酪氨酸的肽偶联物；
q是3；并且
r是1。
9.一种包括下式的分离的表位：
式III
其中：
G是甘氨酸
E是谷氨酸
D是天冬氨酸
Y是酪氨酸
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除上述之外的任何氨基酸
z是0，1，或2
t是1，2或3
r是0或1
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中至少一个Y被硫酸化；其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝ 0，则n＞0；并且进一步地，其中分离的表位能被抗体，其抗原结 合片段，或者其包括至少一种抗体或者其包括含有SEQ ID NO：8或 SEQ ID NO：20的第一高变区的结合片段的复合体结合。
10.权利要求9的分离的表位，其中r是1。
11.权利要求1-8的任一项的分离的表位，其中能被硫酸化的天 然存在部分Y包括脂质，碳水化合物，肽，糖脂，糖蛋白，脂蛋白，和 /或脂多糖分子。
12.权利要求1-10的任一项的分离的表位的同系物或模拟物。
13.权利要求1-10的任一项的分离的表位，其中所述分离的表 位除了硫酸化作用之外具有至少一个翻译后修饰作用。
14.含有权利要求1-10的任一项的分离的表位的组合物。
15.权利要求14的组合物，进一步含有能提高所述表位的结合能 力的上游或下游区。
16.权利要求15的组合物，其中所述上游或下游区与所述表位邻 接。
17.编码含有权利要求1-10的任一项的分离的表位的至少一部 分的分离的多核苷酸。
18.能与权利要求1的分离的表位结合或交叉反应的抗体，其抗 原结合片段，或者其包括至少一种抗体或者其结合片段的复合体。
19.能与权利要求5的分离的表位结合或交叉反应的抗体，其抗 原结合片段，或者其包括至少一种抗体或者其结合片段的复合体。
20.能与权利要求9的分离的表位结合或交叉反应的抗体，其抗 原结合片段，或者其包括至少一种抗体或者其结合片段的复合体。
21.能与权利要求4，6-8，或10-13的任一项的分离的表位结合 或交叉反应的抗体，其抗原结合片段，或者其包括至少一种抗体或者 其结合片段的复合体。
22.能与权利要求1-13的任一项的分离的表位结合或交叉反应的 抗体，其抗原结合片段，或者其包括至少一种抗体或者其结合片段的 复合体的制备方法，包括步骤
(a)提供噬菌体展示文库；
(b)提供根据权利要求1-13的任一项的分离的表位；
(c)对噬菌体展示文库淘选显示能与所述分离的表位结合的寡肽 或多肽的噬菌体颗粒；和
(d)制备能与所述分离的表位结合的抗体，其抗原结合片段，或者 包括至少一种抗体或其结合片段的复合体，包括肽或多肽。
23.具有SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：203的scFv抗体片段 结合能力的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结 合片段的其复合体。
24.具有肽或多肽结合能力的抗体，其抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述肽或多肽具有包 括SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：20的第一高变区。
25.权利要求23-24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包 括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，进一步地，其中所述肽或 多肽具有包括SEQ ID NO：115的第二高变区和/或包括SEQ ID NO：114 的第三高变区。
26.抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合 片段的其复合体，它能与长度大约3至大约126个氨基酸残基并且包 括至少两个酸性氨基酸和至少一个硫酸化酪氨酸残基的肽或多肽表位 结合。
27.权利要求26的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，其中所述表位进一步包括脯氨酸，亮氨 酸，异亮氨酸，丝氨酸，甘氨酸，或苯丙氨酸残基。
28.权利要求23-27的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包 括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述抗体或其抗原 结合片段进一步能与碳水化合物，肽，糖脂，糖蛋白，脂蛋白，和/或 脂多糖分子上的表位结合。
29.权利要求28的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，进一步地，其中碳水化合物，肽，糖脂， 糖蛋白，脂蛋白，和/或脂多糖分子上的表位包括至少一个硫酸化部 分。
30.抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合 片段的其复合体，它能与选自下面的至少两种不同的分子结合： PSGL-1，纤维蛋白原γ原型(γ’)，GPlbα，肝素，lumican，补体 化合物4(CC4)，间α抑制剂，和凝血酶原。
31.抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合 片段的其复合体，它能与选自下面的至少两种不同的分子结合： PSGL-1，纤维蛋白原γ原型(γ’)，GPlbα，肝素，lumican，补体 化合物4(CC4)，间α抑制剂，和凝血酶原，并且还能与选自B-CLL细 胞，AML细胞，多发性骨髓瘤细胞，和转移细胞的至少一种细胞类型结 合。
32.权利要求31的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它能结合PSGL-1，纤维蛋白原γ原型 (γ’)，GPlbα，和肝素的每一种。
33.权利要求32的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它能与PSGL-1，纤维蛋白原γ原型 (γ’)，GPlbα，和肝素之一结合，并且能与选自B-CLL细胞，AML 细胞，多发性骨髓瘤细胞，和转移细胞的至少一种细胞类型结合。
34.抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合 片段的其复合体，它能与选自下面的至少两种不同的分子结合： PSGL-1，纤维蛋白原γ原型(γ’)，GPlbα，肝素，lumican，补体 化合物4(CC4)，间α抑制剂，和凝血酶原，并且进一步能与脂质，碳 水化合物，肽，糖脂，糖蛋白，脂蛋白和/或脂多糖分子上的表位结合。
35.权利要求34的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，进一步地，其中脂质，碳水化合物，肽， 糖脂，糖蛋白，脂蛋白和/或脂多糖分子上的表位包括至少一个硫酸化 部分。
36.抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合 片段的其复合体，它能与两个或多个表位交叉反应，每个表位包括一个 或多个硫酸化酪氨酸残基和至少一簇两个或多个酸性氨基酸。
37.权利要求36的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它能与PSGL-1交叉反应。
38.权利要求37的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸 化的QATEYEYLDYDFLPETE结合。
39.权利要求36的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它能与GPlb-α交叉反应。
40.权利要求36的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸 化的DEGDTDLYDYYPEEDTEGD结合。
41.权利要求39的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸 化的TDLYDYYPEEDTE结合。
42.权利要求39的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸 化的DEGDTDLYDYYP结合。
43.权利要求39的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸 化的YDYYPEE结合。
44.权利要求39的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸 化的TDLYDYYP结合。
45.权利要求36的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它能与纤维蛋白原γ原型(γ’)交叉反 应。
46.权利要求45的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸 化的EPHAETEYDSLYPED结合。
47.权利要求36的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它能与肝素交叉反应。
48.权利要求36的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它能与补体化合物4(CC4)交叉反应。
49.权利要求48的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸 化的MEANEDYEDYEYDELPAK结合。
50.权利要求36的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗 体或者其结合片段的其复合体，它能与选自B-CLL细胞，AML细胞，多 发性骨髓瘤细胞，和转移细胞的至少一种细胞类型交叉反应。
51.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 细胞滚动。
52.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 炎症。
53.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 自身免疫疾病。
54.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 血栓形成。
55.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 再狭窄。
56.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 转移。57.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原 结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑 制肿瘤细胞的生长和/或复制。
58.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能提高 肿瘤细胞死亡率。
59.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 白血病细胞的生长和/或复制。
60.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能提高 白血病细胞死亡率。
61.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能提高 病变细胞对于抗疾病剂损伤的易感性。
62.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能提高 肿瘤细胞对于抗癌剂损伤的易感性。
63.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能提高 白血病细胞对于抗白血病剂损伤的易感性。
64.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 肿瘤患者中肿瘤细胞数目的增加。
65.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能减少 癌症患者中肿瘤细胞数目。
66.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 白血病患者中白血病细胞数目的增加。
67.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能减少 白血病患者中白血病细胞数目。
68.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血小板，和/或细胞- 血小板复合体形成。
69.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血小板，和/或细胞- 血小板粘附作用。
70.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，它能抑制 细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血小板，和/或细胞- 血小板聚集作用。
71.与选自抗癌剂，抗转移剂，抗白血病剂，抗疾病剂，抗粘附 剂，抗血栓形成剂，抗再狭窄剂，抗自身免疫剂，抗聚集作用剂，抗细 菌剂，抗病毒剂，和抗炎剂的试剂偶联或复合的根据权利要求18- 20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体。
72.根据权利要求71的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自阿昔洛韦，更 昔洛韦和齐多夫定的抗病毒剂。
73.根据权利要求71的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自西洛他唑，达 肝素钠，瑞维肝素钠，和阿司匹林的抗血栓形成/抗再狭窄剂。
74.根据权利要求71的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自扎托洛芬，普 拉洛芬，朵昔康，乙酰水杨酸17，双氯酚酸钠，布洛芬，右布洛芬，舒 林酸，萘普生，氨托美丁，塞利克西，消炎痛，罗非克西，和尼美舒 利的抗炎剂。
75.根据权利要求71的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自来氟米特， denileulcin diftitox，subreum，WinRho SDF，去纤苷酸，和环磷 酰胺的抗自身免疫剂。
76.根据权利要求71的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自利脉前列素， 氯克罗孟，和透明质酸的抗粘附/抗聚集作用剂。
77.根据权利要求71的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂选自毒素，放射性 同位素，和药物试剂。
78.根据权利要求77的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述毒素选自gelonin，假 单胞菌外毒素(PE)，PE40，PE38，蓖麻毒，或者其修饰物或衍生物。
79.根据权利要求77的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述放射性同位素选自γ-发 射体，正电子-发射体，和x-射线发射体和β-发射体和α-发射体。
80.根据权利要求77的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述放射性同位素选自111铟， 113铟，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲，165铥，167铥， 168铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇，213铋，77溴， 18氟，95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。
81.根据权利要求77的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述药物试剂选自阿霉素，甲 氧基吗啉基阿霉素(吗啉代阿霉素)，阿得里亚霉素，顺铂，紫杉醇， 加利车霉素，长春新碱，阿糖孢苷(Ara-C)，环磷酰胺，强的松，柔红 霉素，去甲氧柔红霉素，氟达拉滨，瘤可宁，α干扰素，羟基脲，替 莫唑胺，沙利度胺和博莱霉素，及其衍生物和组合物。
82.与能与一种以上试剂偶联或复合的赋形剂或载体偶联或复合 的根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段， 或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
83.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述 赋形剂或载体选自葡聚糖，亲脂性聚合物，HPMA，和脂质体。
84.与放射性同位素或其它成像剂偶联或复合的根据权利要求 18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体。
85.含有根据权利要求84的抗体，其抗原结合片段，或者包括至 少一种抗体或者其结合片段的其复合体的诊断试剂盒。
86.含有抑制细胞滚动有效量的根据权利要求18-20，23，或24 的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结 合片段的其复合体的药物组合物。
87.含有抑制炎症有效量的根据权利要求18-20，23，或24的任 一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片 段的其复合体的药物组合物。
88.含有抑制自身免疫疾病有效量的根据权利要求18-20，23，或 24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其 结合片段的其复合体的药物组合物。
89.含有抑制血栓形成有效量的根据权利要求18-20，23，或24 的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结 合片段的其复合体的药物组合物。
90.含有抑制再狭窄有效量的根据权利要求18-20，23，或24的 任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合 片段的其复合体的药物组合物。
91.含有抑制转移有效量的根据权利要求18-20，23，或24的任 一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片 段的其复合体的药物组合物。
92.含有抑制肿瘤细胞生长和/或复制有效量的根据权利要求 18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
93.含有提高肿瘤细胞死亡率有效量的根据权利要求18-20，23， 或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者 其结合片段的其复合体的药物组合物。
94.含有抑制白血病细胞生长和/或复制有效量的根据权利要求 18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
95.含有提高白血病细胞死亡率有效量的根据权利要求18-20，23， 或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者 其结合片段的其复合体的药物组合物。
96.含有提高病变细胞对于抗疾病剂损伤的易感性有效量的根据 权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者 包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
97.含有提高肿瘤细胞对于抗癌剂损伤的易感性有效量的根据权 利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包 括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
98.含有提高白血病细胞对于抗白血病剂损伤的易感性有效量的 根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段， 或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
99.含有抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数目增加有效量的根据权利要 求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至 少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
100.含有减少肿瘤患者中肿瘤细胞数目有效量的根据权利要求 18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
101.含有抑制白血病患者中白血病细胞数目增加有效量的根据权 利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包 括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
102.含有减少白血病患者中白血病细胞数目有效量的根据权利要 求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至 少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
103.含有抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板- 血小板，和/或细胞-血小板聚集作用有效量的根据权利要求18-20，23， 或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者 其结合片段的其复合体的药物组合物。
104.含有抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板- 血小板，和/或细胞-血小板复合体形成有效量的根据权利要求18- 20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
105.含有抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板- 血小板，和/或细胞-血小板粘附有效量的根据权利要求18-20，23，或 24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其 结合片段的其复合体的药物组合物。
106.含有与选自抗癌剂，抗转移剂，抗白血病剂，抗疾病剂，抗 粘附剂，抗血栓形成剂，抗再狭窄剂，抗自身免疫剂，抗聚集作用剂， 抗细菌剂，抗病毒剂，和抗炎剂的试剂偶联或复合的根据权利要求 18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少 一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物。
107.根据权利要求106的含有抗体，其抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物，其中所述试 剂是选自阿昔洛韦，更昔洛韦和齐多夫定的抗病毒剂。
108.根据权利要求106的含有抗体，其抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物，其中所述试 剂是选自西洛他唑，达肝素钠，瑞维肝素钠，和阿司匹林的抗血栓形成 /抗再狭窄试剂。
109.根据权利要求106的含有抗体，其抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物，其中所述试 剂是选自扎托洛芬，普拉洛芬，朵昔康，乙酰水杨酸17，双氯酚酸钠， 布洛芬，右布洛芬，舒林酸，萘普生，氨托美丁，塞利克西，消炎痛， 罗非克西，和尼美舒利的抗炎剂。
110.根据权利要求106的含有抗体，其抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物，其中所述试 剂是选自来氟米特，denileulcin diftitox，subreum，WinRho SDF， 去纤苷酸，和环磷酰胺的抗自身免疫剂。
111.根据权利要求106的含有抗体，其抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合物，其中所述试 剂是选自利脉前列素，氯克罗孟，和透明质酸的抗粘附/抗聚集作用 剂。
112.根据权利要求106的药物组合物，其中所述试剂选自毒素，放 射性同位素，和药物试剂。
113.根据权利要求106的药物组合物，其中所述毒素选自 gelonin，假单胞菌外毒素(PE)，PE40，PE38，蓖麻毒，或者其修饰物 或衍生物。
114.根据权利要求106的药物组合物，其中所述放射性同位素选 自γ-发射体，正电子-发射体，和x-射线发射体和β-发射体和α-发 射体。
115.根据权利要求106的药物组合物，其中所述放射性同位素选 自111铟，113铟，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲， 165铥，167铥，168铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇， 213铋，77溴，18氟，95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。
116.根据权利要求106的药物组合物，其中所述药物试剂选自阿 霉素，甲氧基吗啉基阿霉素(吗啉代阿霉素)，阿得里亚霉素，顺铂， 紫杉醇，加利车霉素，长春新碱，阿糖孢苷(Ara-C)，环磷酰胺，强的 松，柔红霉素，去甲氧柔红霉素，氟达拉滨，瘤可宁，α干扰素，羟 基脲，替莫唑胺，沙利度胺和博莱霉素，及其衍生物和组合物。
117.含有与能与一种以上试剂偶联或复合的赋形剂或载体偶联或 复合的根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合 片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体的药物组合 物。
118.根据权利要求117的药物组合物，其中所述赋形剂或载体选 自葡聚糖，亲脂性聚合物，HPMA，和脂质体。
119.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制细胞滚动的药物中的用途。
120.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制炎症的药物中的用途。
121.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制自身免疫疾病的药物中的用途。
122.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制再狭窄的药物中的用途。
123.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制血栓形成的药物中的用途。
124.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制转移的药物中的用途。
125.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制肿瘤细胞生长和/或复制的药物中的用途。
126.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 提高肿瘤细胞死亡率的药物中的用途。
127.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制白血病细胞生长和/或复制的药物中的用途。
128.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 提高白血病细胞死亡率的药物中的用途。
129.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 提高病变细胞对于抗疾病剂损伤的易感性的药物中的用途。
130.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 提高肿瘤细胞对于抗癌剂损伤的易感性的药物中的用途。
131.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 提高白血病细胞对于抗白血病剂损伤的易感性的药物中的用途。
132.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数目增加的药物中的用途。
133.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 减少肿瘤患者中肿瘤细胞数目的药物中的用途。
134.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制白血病患者中白血病细胞数目增加的药物中的用途。
135.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 减少白血病患者中白血病细胞数目的药物中的用途。
136.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血小板，和/或细 胞-血小板复合体形成的药物中的用途。
137.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血小板，和/或细 胞-血小板聚集作用的药物中的用途。
138.根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体在制备能 抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血小板，和/或细 胞-血小板粘附的药物中的用途。
139.权利要求119-138的任一项的方法，其中所述抗体，其抗原 结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体与选自 抗癌剂，抗转移剂，抗白血病剂，抗疾病剂，抗粘附剂，抗血栓形成 剂，抗再狭窄剂，抗自身免疫剂，抗聚集作用剂，抗细菌剂，抗病毒剂， 和抗炎剂的试剂偶联或复合。
140.权利要求139的方法，其中所述试剂是选自阿昔洛韦，更昔 洛韦和齐多夫定的抗病毒剂。
141.权利要求139的方法，其中所述试剂是选自西洛他唑，达肝 素钠，瑞维肝素钠，和阿司匹林的抗血栓形成/抗再狭窄剂。
142.权利要求139的方法，其中所述试剂是选自扎托洛芬，普拉 洛芬，朵昔康，乙酰水杨酸17，双氯酚酸钠，布洛芬，右布洛芬，舒 林酸，萘普生，氨托美丁，塞利克西，消炎痛，罗非克西，和尼美舒 利的抗炎剂。
143.权利要求139的方法，其中所述试剂是选自来氟米特， denileulcin diftitox，subreum，WinRho SDF，去纤苷酸，和环磷 酰胺的抗自身免疫剂。
144.权利要求139的方法，其中所述试剂是选自利脉前列素，氯 克罗孟，和透明质酸的抗粘附/抗聚集作用剂。
145.权利要求139的方法，其中所述试剂选自毒素，放射性同位 素，和药物试剂。
146.权利要求139的方法，其中所述毒素选自gelonin，假单胞 菌外毒素(PE)，PE40，PE38，蓖麻毒，或者其修饰物或衍生物。
147.权利要求139的方法，其中所述放射性同位素选自γ-发射 体，正电子-发射体，和x-射线发射体和β-发射体和α-发射体。
148.权利要求139的方法，其中所述放射性同位素选自111铟， 113铟，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲，165铥，167铥， 168铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇，213铋，77溴，18氟， 95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。
149.权利要求139的方法，其中所述药物试剂选自阿霉素，甲氧 基吗啉基阿霉素(吗啉代阿霉素)，阿得里亚霉素，顺铂，紫杉醇，加 利车霉素，长春新碱，阿糖孢苷(Ara-C)，环磷酰胺，强的松，柔红霉 素，去甲氧柔红霉素，氟达拉滨，瘤可宁，α干扰素，羟基脲，替莫 唑胺，沙利度胺和博莱霉素，及其衍生物和组合物。
150.权利要求119-138的任一项的方法，其中所述抗体，其抗 原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体与能 与一种以上试剂偶联或复合的赋形剂或载体偶联或复合。
151.权利要求150的方法，其中所述赋形剂或载体选自葡聚糖， 亲脂性聚合物，HPMA，和脂质体。
152.用作能抑制细胞滚动的药物的根据权利要求18-20，23，或24 的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结 合片段的其复合体。
153.用作能抑制炎症的药物的根据权利要求18-20，23，或24的 任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合 片段的其复合体。
154.用作能抑制自身免疫疾病的药物的根据权利要求18-20，23， 或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者 其结合片段的其复合体。
155.用作能抑制再狭窄的药物的根据权利要求18-20，23，或24 的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结 合片段的其复合体。
156.用作能抑制血栓形成的药物的根据权利要求18-20，23，或 24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其 结合片段的其复合体。
157.用作能抑制转移的药物的根据权利要求18-20，23，或24的 任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合 片段的其复合体。
158.用作能抑制肿瘤细胞生长和/或复制的药物的根据权利要求 18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体。
159.用作能提高肿瘤细胞死亡率的药物的根据权利要求18- 20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体。
160.用作能抑制白血病细胞生长和/或复制的药物的根据权利要 求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至 少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
161.用作能提高白血病细胞死亡率的药物的根据权利要求18- 20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体。
162.用作能提高病变细胞对于抗疾病剂损伤的易感性的药物的根 据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或 者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
163.用作能提高肿瘤细胞对于抗癌剂损伤的易感性的药物的根据 权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者 包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
164.用作能提高白血病细胞对于抗白血病剂损伤的易感性的药物 的根据权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段， 或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
165.用作能抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数目增加的药物的根据权利 要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
166.用作能减少肿瘤患者中肿瘤细胞数目的药物的根据权利要求 18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或者其结合片段的其复合体。
167.用作能抑制白血病患者中白血病细胞数目增加的药物的根据 权利要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者 包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
168.用作能减少白血病患者中白血病细胞数目的药物的根据权利 要求18-20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
169.用作能抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板- 血小板，和/或细胞-血小板复合体形成的药物的根据权利要求18- 20，23，或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体。
170.用作能抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板- 血小板，和/或细胞-血小板聚集作用的药物的根据权利要求18-20，23， 或24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者 其结合片段的其复合体。
171.用作能抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板- 血小板，和/或细胞-血小板粘附的药物的根据权利要求18-20，23，或 24的任一项的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其 结合片段的其复合体。
172.根据权利要求152-171的任一项的抗体，其抗原结合片段， 或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述抗体， 其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体 与选自抗癌剂，抗转移剂，抗白血病剂，抗疾病剂，抗粘附剂，抗血 栓形成剂，抗再狭窄剂，抗自身免疫剂，抗聚集作用剂，抗细菌剂，抗 病毒剂，和抗炎剂的试剂偶联或复合。
173.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自阿昔洛韦，更 昔洛韦和齐多夫定的抗病毒剂。
174.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自西洛他唑，达 肝素钠，瑞维肝素钠，和阿司匹林的抗血栓形成/抗再狭窄剂。
175.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自扎托洛芬，普拉 洛芬，朵昔康，乙酰水杨酸17，双氯酚酸钠，布洛芬，右布洛芬，舒 林酸，萘普生，氨托美丁，塞利克西，消炎痛，罗非克西，和尼美舒 利的抗炎剂。
176.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自来氟米特， denileulcin diftitox，subreum，WinRho SDF，去纤苷酸，和环磷 酰胺的抗自身免疫剂。
177.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂是选自利脉前列素，氯 克罗孟，和透明质酸的抗粘附/抗聚集作用剂。
178.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述试剂选自毒素，放射性同 位素，和药物试剂。
179.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述毒素选自gelonin，假单 胞菌外毒素(PE)，PE40，PE38，蓖麻毒，或者其修饰物或衍生物。
180.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述放射性同位素选自γ-发射 体，正电子-发射体，和x-射线发射体和β-发射体和α-发射体。
181.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述放射性同位素选自111铟， 113铟，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲，165铥，167铥， 168铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇，213铋，77溴，18氟， 95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。
182.权利要求172的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述药物试剂选自阿霉素，甲 氧基吗啉基阿霉素(吗啉代阿霉素)，阿得里亚霉素，顺铂，紫杉醇， 加利车霉素，长春新碱，阿糖孢苷(Ara-C)，环磷酰胺，强的松，柔红 霉素，去甲氧柔红霉素，氟达拉滨，瘤可宁，α干扰素，羟基脲，替 莫唑胺，沙利度胺和博莱霉素，及其衍生物和组合物。
183.根据权利要求152-171的任一项的抗体，其抗原结合片段， 或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述抗体， 其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体 与能与一种以上试剂偶联或复合的赋形剂或载体偶联或复合。
184.权利要求183的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或者其结合片段的其复合体，其中所述赋形剂或载体选自葡聚糖， 亲脂性聚合物，HPMA，和脂质体。
185.包括GPIbα氨基酸序列Tyr 276至Glu 282的分离的表位， 其中氨基酸276，278和279的至少一个被硫酸化。
186.权利要求185的分离的表位，进一步包括GPIbα氨基酸 283-285。
187.能与权利要求185的表位结合的抗体，其抗原结合片段，或 者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体，其中当权利要求 185的表位进一步包括GPIbα氨基酸283-285时结合被增强。
188.表观分子量是大约40KDa的分离的GPlbαN-末端肽，所述 肽包括具有序列YDYYPEE的表位，其中该表位中至少一个酪氨酸残基 被硫酸化。
189.由氨基酸1至282组成的分离的GPlbα肽，其中氨基酸 276，278和279中至少一个被硫酸化。
190.包括至少一个第一和一个第二抗原结合片段的抗体多聚体， 其中至少第一或第二抗原结合片段或者两者能与具有下式的表位结合 或交叉反应
式(I)
其中：
W是除了天冬氨酸和谷氨酸之外的任何氨基酸，
Y是能被硫酸化的任何天然存在的部分，
P是(A)m(A)n(X)u或(X)u(A)n(A)m或(A)n(X)u(A)m或(A)n(A)m(X)u或 (X)u(A)m(A)n或(A)m(X)u(A)n
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除了天冬氨酸，谷氨酸或酪氨酸之外的任何氨基酸，
A是任何带负电荷的氨基酸或亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，丝 氨酸，或甘氨酸
q是1至6
z是0，1，或2
r是0或1
t是1，2或3
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝0，则n＞0；其中如果q 是1，r是1，并且如果q是＞1，则Y中至少一个被硫酸化。
191.权利要求190的抗体多聚体，其中所述第一或第二抗原结合 片段或者两者与这样的表位结合或交叉反应，其中：
W是甘氨酸，
Y是酪氨酸的肽偶联物或天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的糖偶联物，
A是谷氨酸，γ羧基谷氨酸或天冬氨酸，
q是1，2，或3。
192.权利要求190的抗体多聚体，其中所述第一或第二抗原结合 片段或者两者与这样的表位结合或交叉反应，其中：
Y是酪氨酸的肽偶联物；
q是3；
r是1。
193.包括至少一个第一和一个第二抗原结合片段的抗体多聚体， 其中第一或第二抗原结合片段或者两者能与具有下式的表位结合或交 叉反应
式II
其中：
W是除了天冬氨酸和谷氨酸之外的任何氨基酸，
Y是能被硫酸化的任何天然存在的部分，
P是(A)m(A)n(X)u或(X)u(A)n(A)m或(A)n(X)u(A)m或(A)n(A)m(X)u或 (X)u(A)m(A)n或(A)m(X)u(A)n
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除了天冬氨酸，谷氨酸或酪氨酸之外的任何氨基酸，
A是任何带负电荷的氨基酸或亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，丝 氨酸，或甘氨酸
z是0，1，或2
r是0或1
t是1，2或3
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝0，则n＞0；其中至少 一个Y被硫酸化。
194.权利要求193的抗体多聚体，其中所述第一或第二抗原结合 片段或者两者与这样的表位结合或交叉反应，其中：
W是甘氨酸，
Y是酪氨酸的肽偶联物或天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的糖偶联物；
A是谷氨酸，γ羧基谷氨酸或天冬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸， 苯丙氨酸，丝氨酸或甘氨酸。
195.权利要求193的抗体多聚体，其中所述第一或第二抗原结合 片段或者两者与这样的表位结合或交叉反应，其中：
Y是酪氨酸的肽偶联物；
q是3；并且
r是1。
196.包括至少一个第一和一个第二抗原结合片段的抗体多聚体， 其中第一或第二抗原结合片段或者两者能与具有下式的表位结合或交 叉反应
式III
其中：
G是甘氨酸
E是谷氨酸
D是天冬氨酸
Y是酪氨酸
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除上述之外的任何氨基酸
z是0，1，或2
t是1，2或3
r是0或1
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中至少一个Y被硫酸化；其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝ 0，则n＞0。
197.权利要求196的抗体多聚体，其中所述第一或第二抗原结合 片段或者两者与其中r是1的表位结合或交叉反应。
198.权利要求190，193或196的抗体多聚体，其中所述多聚体 是二聚体，三聚体或四聚体。
199.权利要求198的抗体多聚体，其中所述多聚体是二聚体。
200.权利要求199的二聚体，其中所述第一和第二抗原结合片段 中至少一个选自Y1和Y17的scFv片段。
201.权利要求199的二聚体，其中所述第一和第二抗原结合片段 通过二硫桥连接。
202.权利要求201的二聚体，其中所述第一和第二抗原结合片段 是Y1-Cys KAK。
203.权利要求199的二聚体，其中所述第一和第二抗原结合片段 通过5-20个氨基酸的多肽接头连接。
204.权利要求203的二聚体，其中所述多肽接头包括5个氨基 酸。
205.权利要求204的二聚体，其中所述多肽接头是Gly4Ser。
206.权利要求198的抗体多聚体，其中所述多聚体是三聚体。
207.权利要求206三聚体，包括三个抗原结合片段，其中所述抗 原结合片段中至少一个是Y1 scFv片段或Y17 scFv片段。
208.权利要求207的三聚体，其中所述抗原结合片段通过多肽接 头连接。
209.权利要求208的三聚体，其中所述多肽接头包括1-5个氨基 酸。
210.权利要求198的抗体多聚体，其中所述多聚体是四聚体。
211.权利要求210的四聚体，包括四个抗原结合片段，其中所述 抗原结合片段中至少一个是Y1 scFv片段或Y17 scFv片段。
212.权利要求211的四聚体，其中所述抗原结合片段通过多肽接 头连接。
213.权利要求212的四聚体，其中所述多肽接头包括1-5个氨基 酸。
214.权利要求210的四聚体，其中所述四个抗原结合片段通过链 霉抗生物素蛋白-生物素缔合形成复合体。
215.权利要求198的抗体多聚体，包括相同的抗原结合片段。
216.权利要求198的抗体多聚体，其中至少第一或第二抗原结合 片段包括具有SEQ ID NO：8的第一高变区。
217.权利要求198的抗体多聚体，其中至少第一或第二抗原结合 片段中包括具有SEQ ID NO：20的第一高变区。
218.权利要求216或217的抗体多聚体，其中至少第一或第二抗 原结合片段或者两者具有包括SEQ ID NO：115的第二高变区和/或包 括SEQ ID NO：114的第三高变区。
219.权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚 体，其中所述多聚体能与选自下面的至少两种不同的分子结合： PSGL-1，纤维蛋白原γ原型(γ’)，GPlbα，肝素，lumican，补体 化合物4(CC4)，间α抑制剂，和凝血酶原。
220.权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚 体，其中所述多聚体能与选自下面的至少两种不同的分子结合： PSGL-1，纤维蛋白原γ原型(γ’)，GPlbα，肝素，lumican，补体 化合物4(CC4)，间α抑制剂，和凝血酶原，并且还能与选自B-CLL细 胞，AML细胞，多发性骨髓瘤细胞，和转移细胞的至少一种细胞类型结 合。
221.包括第一和第二抗原结合片段的抗体二聚体，其中所述第一 或第二抗原结合片段或者两者包括具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列高 变区[Y1 CD3]。
222.包括第一和第二抗原结合片段的抗体二聚体，其中所述第一 或第二抗原结合片段或者两者包括具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列 高变区[Y17 CD3]。
223.权利要求221或222的抗体二聚体，其中所述第一或第二抗 原结合片段或者两者进一步包括具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列的 第二高变区和/或具有SEQ ID NO：114的第三高变区。
224.包括第一和第二抗原结合片段的抗体多聚体，其中所述第一 或第二抗原结合片段或者两者能与两个或多个表位交叉反应，每个表 位包括一个或多个硫酸化酪氨酸残基和至少一簇两个或多个酸性氨基 酸。
225.权利要求224的抗体多聚体，其中所述多聚体能与PSGL-1 交叉反应。
226.权利要求224的抗体多聚体，它与其中至少一个酪氨酸残基 被硫酸化的QATEYEYLDYDFLPETE结合。
227.权利要求224的抗体多聚体，其中所述多聚体能与GPlb-α 交叉反应。
228.权利要求224的抗体多聚体，它与其中至少一个酪氨酸残基 被硫酸化的DEGDTDLYDYYPEEDTEGD结合。
229.权利要求224的抗体多聚体，它与其中至少一个酪氨酸残基 被硫酸化的TDLYDYYPEEDTE结合。
230.权利要求224的抗体多聚体，它与其中至少一个酪氨酸残基 被硫酸化的DEGDTDLYDYYP结合。
231.权利要求224的抗体多聚体，它与其中至少一个酪氨酸残基 被硫酸化的YDYYPEE结合。
232.权利要求224的抗体多聚体，它与其中至少一个酪氨酸残基 被硫酸化的TDLYDYYP结合。
233.权利要求224的抗体多聚体，其中所述多聚体能与纤维蛋白 原γ原型交叉反应。
234.权利要求233的抗体多聚体，它与其中至少一个酪氨酸残基 被硫酸化的EPHAETEYDSLYPED结合。
235.权利要求224的抗体多聚体，其中所述多聚体能与肝素交叉 反应。
236.权利要求224的抗体多聚体，其中所述多聚体能与补体4 (CC4)交叉反应。
237.权利要求224的抗体多聚体，它与能与选自B-CLL细胞，AML 细胞，多发性骨髓瘤细胞，和转移细胞的至少一种细胞交叉反应。
238.含有根据权利要求1，4，7，27和28的任一项的抗体多聚 体的药物组合物。
239.权利要求238的药物组合物，含有提高肿瘤细胞死亡率或者 提高肿瘤细胞对于抗癌剂损伤的易感性有效量的抗体多聚体。
240.权利要求238的药物组合物，含有抑制白血病细胞生长和/ 或复制有效量的抗体多聚体。
241.权利要求238的药物组合物，含有抑制异常细胞-细胞，细 胞-基质，血小板-基质，血小板-血小板，和/或细胞-血小板粘附有效 量的抗体多聚体。
242.权利要求238的药物组合物，含有提高病变细胞对于抗疾病 剂损伤的易感性有效量的抗体多聚体。
243.权利要求238的药物组合物，含有提高白血病细胞死亡率或 者提高白血病细胞对于抗白血病剂损伤的易感性有效量的抗体多聚 体。
244.含有与选自抗癌剂，抗转移剂，抗白血病剂，抗疾病剂，抗 粘附剂，抗血栓形成剂，抗再狭窄剂，抗自身免疫剂，抗聚集作用剂， 抗细菌剂，抗病毒剂，和抗炎剂的试剂偶联或复合的根据权利要求 190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚体的药物组合物。
245.权利要求244的药物组合物，其中所述试剂选自毒素，放射 性同位素和药物试剂。
246.权利要求244的药物组合物，其中所述试剂是选自阿昔洛韦， 更昔洛韦和齐多夫定的抗病毒剂。
247.权利要求244的药物组合物，其中所述试剂是选自西洛他唑， 达肝素钠，瑞维肝素钠，和阿司匹林的抗血栓形成/抗再狭窄剂。
248.权利要求244的药物组合物，其中所述试剂是选自扎托洛芬， 普拉洛芬，朵昔康，乙酰水杨酸17，双氯酚酸钠，布洛芬，右布洛芬， 舒林酸，萘普生，氨托美丁，塞利克西，消炎痛，罗非克西，和尼美 舒利的抗炎剂。
249.权利要求244的药物组合物，其中所述试剂是选自来氟米特， denileulcin diftitox，subreum，WinRho SDF，去纤苷酸，和环磷 酰胺的抗自身免疫剂。
250.权利要求244的药物组合物，其中所述试剂是选自利脉前列 素，氯克罗孟，和透明质酸的抗粘附/抗聚集作用剂。
251.权利要求245的药物组合物，其中所述放射性同位素选自γ -发射体，正电子-发射体，和x-射线发射体和β-发射体和α-发射 体。
252.权利要求251的药物组合物，其中所述放射性同位素选自111铟 ，113铟，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲，165铥， 167铥，168铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇，213铋， 77 溴，18氟，95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。
253.权利要求245的药物组合物，其中所述药物试剂选自阿霉素， 甲氧基吗啉基阿霉素(吗啉代阿霉素)，阿得里亚霉素，顺铂，紫杉醇， 加利车霉素，长春新碱，阿糖孢苷(Ara-C)，环磷酰胺，强的松，柔红 霉素，去甲氧柔红霉素，氟达拉滨，瘤可宁，α干扰素，羟基脲，替 莫唑胺，沙利度胺和博莱霉素，及其衍生物和组合物。
254.与能与一种以上试剂偶联或复合的赋形剂或载体偶联或复合 的权利要求244的药物组合物。
255.权利要求254的药物组合物，其中所述赋形剂或载体选自葡 聚糖，亲脂性聚合物，HPMA，和脂质体。
256.权利要求238的药物组合物，含有抑制细胞滚动有效量的抗 体多聚体。
257.权利要求238的药物组合物，含有抑制炎症有效量的抗体多 聚体。
258.权利要求238的药物组合物，含有抑制自身免疫疾病有效量 的抗体多聚体。
259.权利要求238的药物组合物，含有抑制血栓形成有效量的抗 体多聚体。
260.权利要求238的药物组合物，含有抑制再狭窄有效量的抗体 多聚体。
261.权利要求238的药物组合物，含有抑制转移有效量的抗体多 聚体。
262.权利要求238的药物组合物，含有抑制肿瘤细胞的生长和/ 或复制，提高肿瘤细胞死亡率，或者提高肿瘤细胞对于抗癌剂损伤的 易感性有效量的抗体多聚体。
263.权利要求238的药物组合物，含有抑制白血病细胞的生长和 /或复制，提高白血病细胞死亡率，或者提高白血病细胞对于抗癌剂损 伤的易感性有效量的抗体多聚体。
264.权利要求238的药物组合物，含有提高病变细胞对于抗疾病 剂损伤易感性有效量的抗体多聚体。
265.权利要求238的药物组合物，含有抑制异常细胞-细胞，细 胞-基质，血小板-基质，血小板-血小板，和/或细胞-血小板聚集作 用，粘附或复合体形成有效量的抗体多聚体。
266.与选自抗癌剂，抗转移剂，抗白血病剂，抗疾病剂，抗粘附 剂，抗血栓形成剂，抗再狭窄剂，抗自身免疫剂，抗聚集作用剂，抗细 菌剂，抗病毒剂，和抗炎剂的试剂偶联或复合的权利要求238的药物 组合物。
267.权利要求266的药物组合物，其中所述试剂是选自阿昔洛韦， 更昔洛韦和齐多夫定的抗病毒剂。
268.权利要求238的药物组合物，其中所述抗体多聚体与能与一 种以上试剂偶联或复合的赋形剂或载体偶联或复合。
269.权利要求238的药物组合物，其中所述赋形剂或载体选自葡 聚糖，亲脂性聚合物，HPMA，和脂质体。
270.根据权利要求1，4，7，27和28的任一项的抗体多聚体在 制备抑制细胞滚动的药物中的用途。
271.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制炎症的药物中的用途。
272.根据权利要求1，4，7，27和28的任一项的抗体多聚体在 制备抑制自身免疫疾病的药物中的用途。
273.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制再狭窄的药物中的用途。
274.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制血栓形成的药物中的用途。
275.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制转移的药物中的用途。
276.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制肿瘤细胞生长和/或复制的药物中的用途。
277.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备提高肿瘤细胞死亡率的药物中的用途。
278.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制白血病细胞生长和/或复制的药物中的用途。
279.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备提高白血病细胞死亡率的药物中的用途。
280.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备提高病变细胞对于抗疾病剂损伤的易感性的药物中的用 途。
281.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备提高肿瘤细胞对于抗癌剂损伤的易感性的药物中的用 途。
282.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备提高白血病细胞对于抗白血病剂损伤的易感性的药物中 的用途。
283.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数目增加的药物中的用途。
284.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备减少肿瘤患者中肿瘤细胞数目的药物中的用途。
285.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制白血病患者中白血病细胞数目增加的药物中的用 途。
286.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备减少白血病患者中白血病细胞数目的药物中的用途。
287.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血 小板，和/或细胞-血小板复合体形成的药物中的用途。
288.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血 小板，和/或细胞-血小板聚集作用的药物中的用途。
289.根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体 多聚体在制备抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血 小板，和/或细胞-血小板粘附的药物中的用途。
290.权利要求270-289的任一项的方法，其中所述抗体多聚体与 选自抗癌剂，抗转移剂，抗白血病剂，抗疾病剂，抗粘附剂，抗血栓 形成剂，抗再狭窄剂，抗自身免疫剂，抗聚集作用剂，抗细菌剂，抗病 毒剂，和抗炎剂的试剂偶联或复合。
291.权利要求290的方法，其中所述试剂是选自阿昔洛韦，更昔 洛韦和齐多夫定的抗病毒剂。
292.权利要求290的方法，其中所述试剂是选自西洛他唑，达肝 素钠，瑞维肝素钠，和阿司匹林的抗血栓形成/抗再狭窄剂。
293.权利要求290的方法，其中所述试剂是选自扎托洛芬，普拉 洛芬，朵昔康，乙酰水杨酸17，双氯酚酸钠，布洛芬，右布洛芬，舒 林酸，萘普生，氨托美丁，塞利克西，消炎痛，罗非克西，和尼美舒 利的抗炎剂。
294.权利要求290的方法，其中所述试剂是选自来氟米特， denileulcin diftitox，subreum，WinRho SDF，去纤苷酸，和环磷 酰胺的抗自身免疫剂。
295.权利要求290的方法，其中所述试剂是选自利脉前列素，氯 克罗孟，和透明质酸的抗粘附/抗聚集作用剂。
296.权利要求290的方法，其中所述试剂选自毒素，放射性同位 素，和药物试剂。
297.权利要求290的方法，其中所述毒素选自gelonin，假单胞 菌外毒素(PE)，PE40，PE38，蓖麻毒，或者其修饰物或衍生物。
298.权利要求290的方法，其中所述放射性同位素选自γ-发射 体，正电子-发射体，和x-射线发射体和β-发射体和α-发射体。
299.权利要求290的方法，其中所述放射性同位素选自111铟，113铟 ，99m铼，105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲，165铥，167铥， 168铥，123碘，126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇，213铋，77溴，18氟， 95钌，97钌，103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。
300.权利要求290的方法，其中所述药物试剂选自阿霉素，甲氧 基吗啉基阿霉素(吗啉代阿霉素)，阿得里亚霉素，顺铂，紫杉醇，加 利车霉素，长春新碱，阿糖孢苷(Ara-C)，环磷酰胺，强的松，柔红霉 素，去甲氧柔红霉素，氟达拉滨，瘤可宁，α干扰素，羟基脲，替莫 唑胺，沙利度胺和博莱霉素，及其衍生物和组合物。
301.权利要求270-289的任一项的方法，其中所述抗体，其抗原 结合片段，或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体与能与 一种以上试剂偶联或复合的赋形剂或载体偶联或复合。
302.权利要求301的方法，其中所述赋形剂或载体选自葡聚糖， 亲脂性聚合物，HPMA，和脂质体。
303.用作抑制细胞滚动的药物的根据权利要求190，193，196， 216和217的任一项的抗体多聚体。
304.用作抑制炎症的药物的根据权利要求190，193，196，216 和217的任一项的抗体多聚体。
305.用作抑制自身免疫疾病的药物的根据权利要求190，193， 196，216和217的任一项的抗体多聚体。
306.用作抑制再狭窄的药物的根据权利要求190，193，196，216 和217的任一项的抗体多聚体体。
307.用作抑制血栓形成的药物的根据权利要求190，193，196， 216和217的任一项的抗体多聚体。
308.用作抑制转移的药物的根据权利要求190，193，196，216 和217的任一项的抗体多聚体。
309.用作抑制肿瘤细胞生长和/或复制的药物的根据权利要求 190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚体。
310.用作提高肿瘤细胞死亡率的药物的根据权利要求190，193， 196，216和217的任一项的抗体多聚体。
311.用作抑制白血病细胞生长和/或复制的药物的根据权利要求 190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚体。
312.用作提高白血病细胞死亡率的药物的根据权利要求190， 193，196，216和217的任一项的抗体多聚体。
313.用作提高病变细胞对于抗疾病剂损伤的易感性的药物的根据 权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚体。
314.用作提高肿瘤细胞对于抗癌剂损伤的易感性的药物的根据权 利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚体。
315.用作提高白血病细胞对于抗白血病剂损伤的易感性的药物的 根据权利要求190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚体。
316.用作抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数目增加的药物的根据权利要 求190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚体。
317.用作减少肿瘤患者中肿瘤细胞数目的药物的根据权利要求 190，193，196，216和217的任一项的抗体多聚体。
318.与人单克隆抗体scFv Y1的可变轻链交叉反应的多克隆抗 体，抗体片段或抗体复合体。
319.与人单克隆抗体Y-1的可变轻链的NdeI-EcoR1限制性酶切 片段交叉反应的权利要求318的多克隆抗体，抗体片段或抗体复合体。
320.含有权利要求318-319的任一项的抗体或抗体片段或复合体 的诊断试剂盒。
321.含有与阿霉素偶联的权利要求318-319的任一项的抗体或抗 体片段或复合体的组合物。
322.含有权利要求318-319的任一项的抗体或抗体片段或复合体 和选自葡聚糖，HPMA，和亲脂性聚合物的药学可接受载体的组合物。
323.含有与阿霉素修饰的脂质体混合的权利要求318-319的任一 项的抗体或抗体片段或复合体的组合物。

说明书全文

发明领域

本发明涉及例如癌细胞，转移细胞，白血病细胞和血小板细胞上 存在的表位，所述表位在这样的不同的生理现象中是重要的，所述生 理现象如细胞滚动，转移，炎症，自身免疫疾病，例如自发性血小板 减少性紫癜(ITP)，粘连，血栓形成和/或再狭窄，和凝集作用。本发 明涉及使用抗这样的表位的抗体的治疗和诊断方法和组合物。本发明 还涉及组织定向和鉴定领域，借助于与靶细胞特异性结合的肽和多肽 的噬菌体展示技术。这样的肽和多肽是抗体及其抗原结合片段，其构 建体，其抗原结合片段或其构建体的片段，或者片段的构建体。更特别 地，肽和多肽可以具有抗癌活性，抗转移活性，抗白血病活性，抗病毒活 性，抗感染活性，和/或抗其它疾病的活性，例如炎症疾病，涉及异常或 病原性粘连的疾病，血栓形成和/或再狭窄，涉及异常或病原性凝集作 用的疾病，和自身免疫疾病，心血管疾病例如心肌梗塞，视网膜病变性 疾病，硫酸化酪氨酸依赖性蛋白质-蛋白质相互作用引起的疾病，一般 性病变细胞。

发明背景

抗体，噬菌体展示，和组织定向
治疗药物组织选择性定向是制药工业正在形成的领域。设计以定 向为基础的新的癌症治疗来提高治疗的特异性和效力，同时减小毒性， 从而提高总体功效。有人使用针对肿瘤相关抗原的小鼠单克隆抗体 (MAb′s)-试图使毒素，放射性核苷酸，和化学治疗偶联物定向于肿 瘤。另外，分化抗原，例如CD19，CD20，CD22和CD25，已经被开发为 治疗血生成恶性肿瘤中癌症特异性靶物。虽然进行了大量研究，该方 法还是有几方面的局限性。一个局限是分离显示选择性结合的合适的 单克隆抗体困难。第二个局限是抗体成功分离的先决条件是需要高抗 体免疫原性。第三个局限是终产物包含非人序列，它引起对非人材料的 免疫应答(例如，人抗-小鼠抗体-HAMA应答)。HAMA应答经常导致更 短的血清半衰期并且防止重复治疗，因此降低了抗体的治疗价值。这 后一种局限刺激了人们对鼠源工程嵌合或人源化单克隆抗体以及在发 现人抗体中的兴趣。该方法的另一个局限在于它能分离仅一种针对仅 是已知和纯化抗原的抗体物质。此外，该方法不是选择范围内的因为 其使正常的和恶性的细胞上存在的抗细胞表面标记物抗体分离。
有很多影响用于治疗癌症的Mab的治疗功效的因素。这些因素包 括肿瘤细胞上抗原表达的特异性，表达水平，抗原异质性和肿瘤质的可 进性。
与实体肿瘤例如癌相比，白血病和淋巴瘤一般对用抗体治疗更易 感。Mab与血液中的白血病和淋巴瘤细胞快速结合，并且容易穿透淋巴 组织中的恶性细胞，因此使得淋巴样肿瘤是以Mab为基础的治疗的极好 的候选者。一个理想体系详述了鉴定识别产生恶性子代细胞的干细胞 细胞表面上的标记物的Mab。
利用噬菌体文库随机淘选与分离的预先测定的靶蛋白质例如抗 体，激素和受体结合的单链Fv′s(scFv′s)。另外，使用一般抗体展示 文库，特别是噬菌体scFv文库，有利于发现靶特异性的但是还没有识 别没有测定的细胞表面部分的独特分子的替代方法。
白血病，淋巴瘤和骨髓瘤是源自骨髓和淋巴组织的癌并且在细胞 不受控制生长中涉及。急性成淋巴细胞白血病(ALL)是一种异质疾病， 由特定临床和免疫学特征确定。和ALL其它形式一样，尽管还不知道 大多数情况下B-细胞ALL(B-ALL)的决定性原因，但是单细胞中DNA 的获得性基因改变导致疾病，引起它变得异常并且连续繁殖。对于儿 童和成年人来说，与其它白血病患者相比，受B ALL折磨的患者的预 后要坏得多。
急性髓细胞性白血病(AML)是一组异质肿瘤，在正常情况下始祖细 胞引起骨髓系列(红细胞，粒细胞，单核细胞，和血小板)最后分化细 胞。作为瘤形成的其它形式，AML与获得性基因改变有关，获得性基因 改变导致相对未分化胚细胞代替正常分化的骨髓细胞，表现出早期骨 髓分化的一种或多种类型。骨髓中一般包括AML，但程度较小，并且在 二级造血器官中。AML主要影响成年人，发生高峰是在15-40岁年 龄之间，但是已知也影响儿童和老年人。几乎所有的AML患者在诊断 之后需要立即治疗实现临床症状减轻，其中没有循环的没有分化的胚 细胞异常水平的证据。
迄今为止，开发出了诱导抗肿瘤细胞的细胞溶解活性的各种各样 的单克隆抗体。FDA批准了针对P 185-生长因子受体(HER2)的人源化 单克隆抗体MuMAb4D5，并且被用来治疗乳腺癌(美国专利Nos. 5,821,337和5,720,954)。结合之后，抗体能抑制依赖于HER2生长因 子受体的肿瘤细胞生长。另外，一种抗CD20的嵌合抗体，其引起外周 B细胞快速消耗，包括与淋巴瘤相关的那些，最近被FDA批准了(美国 专利No.5,843,439)。这种抗体与靶细胞的结合导致补体依赖性溶胞 作用。该产品最近被批准并且目前临床上被用来治疗低等级B-细胞非 何杰金氏淋巴瘤。
几种其它人源化和嵌合抗体正在开发或者在进行临床试验。另外， 在正常骨髓细胞上和在大多数类型的骨髓白血病细胞上都表达的与 CD33抗原特异性反应的人源化Ig，与抗癌剂加利车霉素，CMA-676 (Sievers等，血液增刊(Blood Supplement)，308，504a(1997)) 偶联。这种已知是Mylotarg的偶联物，最近受到FDA批准(Caron 等，癌症增刊(Cancer Supplement)，73，1049-1056(1994))。着 眼于它的细胞溶解活性，一种另外的抗-CD33抗体(HumM195)，最近处 于临床试验中，与几种细胞毒性物质偶联，包括gelonin毒素(McGraw 等，Cancer Immunol.Immunother，39，367-374(1994))和放射性 同位素131I(Caron等，血液(Blood)83，1760-1768(1994))，90Y (Jurcic等，血液增刊(Blood Supplement)，92，613a(1998))和 213Bi(Humm等，血液增刊(Blood Supplement)，38：231P(1997))。
抗白细胞抗原CD45的嵌合抗体(cHuLym3)处于用于治疗人白血病 和淋巴瘤的临床研究中(Sun等，Cacer Immunol.Immullother.，48， 595-602(2000))。在体外分析中，在ADCC(抗体依赖性细胞介导的 细胞毒性)测试中发现特异性细胞溶胞作用(Henkart，免疫学 (Immunity)，1，343-346(1994)；Squier和Cohen，Current Opin. Immunol.，6，447-452(1994))。
与小鼠单克隆人源化作用和嵌合抗体构建体相反，利用噬菌体展 示技术能分离包括全人序列的scFv′s。最近开发了以来自噬菌体展 示技术的scFv克隆为基础的抗人TGFb2受体全人抗体。这种scFv，转 换成能与TGFb2的结合竞争的全长人IgG4(Thompson等，免疫学方 法杂志(J.Immunol Methods)，227，17-29(1999))，具有强抗增 殖活性。本领域技术人员公知的这项技术更具体地描述于下面的公开 文献中：Smith，科学(Science)，228，1315(1985)；Scott等， Science 249，386-390(1990)；Cwirla等，PNAS，87，6378-6382 (1990)；Devlin等，Science，249，404-406(1990)；Griffiths 等，EMBO J.，13(14)，3245-3260(1994)；Bass等，蛋白质 (Proteins)，8，309-314(1990)；McCafferty等，自然(Nature)， 348，552-554(1990)；Nissim等，EMBO J.，13，692-698(1994)；美 国专利Nos 5,427,908，5,432,018，5,223,409和5,403,484。
用于分离scFv抗体分子的抗体
血小板，纤维蛋白原，GPIb，选择蛋白，和PSGL-1分别在几种致 病环境或疾病状态中起着重要的作用，所述致病环境或疾病状态是例 如异常或致病炎症，异常或致病免疫反应，自身免疫反应，转移，异 常或致病粘着，血栓形成和/或再狭窄，和异常或致病聚集作用。因此， 在涉及这些及其它致病情况的疾病和病症的诊断和治疗中，与血小板 和与这些分子交叉反应的抗体会是有用的。
血小板
血小板是被充分表征的血液体系的成分，并且在止血法，血栓形 成和/或再狭窄，和再狭窄中起着几项重要的作用。在已知为止血法的 方法的滚动中产生对血管的损伤，其特征在于一系列连续的作用。损伤 血管的初始反应是血小板与血管内表面上受影响的区域粘着。下一步 是很多层血小板聚集到前面粘着的血小板上的聚集作用，形成止血栓 塞。血小板的这种凝块封闭了血管壁。纤维蛋白聚合物的沉积增强了 止血栓塞。只有当补救损伤时凝块才降解。
血小板在转移中的重要性
肿瘤转移可能是限制癌症患者存活的最重要的因素。累积数据表 明肿瘤细胞与宿主血小板相互作用的能力代表转移所必需的决定因素 之一。Leslie Oleksowicz，Z.M.，“肿瘤诱导的血小板凝集作用的 特征：MCF-7乳腺癌细胞的免疫相关的GPIb和GPIIb/IIIa表达的作 用”，血栓形成研究(Thrombosis Research)79：261-274(1995)。
已经证明肿瘤细胞聚集血小板的能力与肿瘤细胞转移可能性相关， 并且已经证明在啮齿动物模型中肿瘤诱导的血小板凝集作用的抑制与 转移的抑制有关。已经证明肿瘤细胞与血小板的相互作用涉及膜粘着 分子和激动剂分泌。已经在肿瘤细胞系上鉴定了免疫相关血小板糖蛋 白的表达。证明血小板免疫相关糖蛋白，GPIb，GPIIb/IIIa。在乳腺 肿瘤细胞系表面上表达GPIb/IX和整联蛋白αv亚基。Leslie Oleksowicz，Z.M.，“肿瘤诱导的血小板凝集作用的特征：MCF-7乳 腺癌细胞的免疫相关的GPIb和GPIIb/IIIa表达的作用”，血栓形成 研究(Thrombosis Research)79：261-274(1995)；Kamiyama，M.， 等，“血清因子对血小板GPIIb/IIIa结合纤维蛋白原的抑制：血友病， 免疫血小板减少性紫癜，人免疫缺陷病毒-相关免疫血小板减少性紫 癜，，和全身性红斑狼疮患者循环免疫复合体和血小板抗体之研究”，J Lab Clin Med 117(3)：209-17(1991)。
Gasic(J.T.B.Gasic等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)61：46-52(1968))和同事证明抗体诱导的血小板 减少显著减少CT26结肠腺癌，Lewis肺癌，和B16黑素瘤产生的转 移的数目和体积。Karpatkin，S.，等，“粘着蛋白在体外血小板肿瘤 相互作用中和体内转移形成中的作用”，临床研究杂志(J.Clin. Invest.)，81(4)：1012-9(1988)；Clezardin，P.，等，“在人 骨肉瘤细胞诱导的血小板凝集作用中血小板膜糖蛋白Ib/IX和 IIb/IIIa的作用，和血小板α-颗粒蛋白质的作用”，癌症研究(Cancer Res.)53(19)：4695-700(1993)。此外，发现单多肽链(60kd)在 与GPIb紧密相关的HEL细胞的表面膜上表达并且相当于不完全或异 常O-糖基化GPIbα亚基。Kieffer，N.，等，“HEL细胞中血小板糖 蛋白Ibα的表达”(″Expression of platelet glycoprotein Ib alpha in HEL cells″)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)261(34)：15854-62 (1986)。
GPIb复合体
止血法中的每一个步骤要求血小板表面上存在受体。止血法中重 要的一个受体是糖蛋白Ib-IX复合体(也已知为CD42)。该受体通过内 皮下膜中结合vonWillebrand因子(vWF)而介导血小板与受伤部位血 管壁的粘着(最初的粘附)。它在止血法中重要的其它两个血小板功能 中具有重要的作用：(a)动脉狭窄区中高剪切诱导的血小板的凝集作 用和(b)低浓度凝血酶诱导的血小板激活作用。
GPIb-IX复合体是血小板血浆膜外表面主要成分之一。GPIb-IX复 合体包括三种跨膜多肽-GPIb的二硫键连接的130kDaα-链和25 kDaβ-链和非共价缔合的GPIX(22kDa)。所有四种遗传单位都以等摩 尔量存在于血小板膜上，用于CD42复合体的有效细胞表面表达和功能， 表明三种亚基适当组装成一个复合体对于血浆膜上的全表达是必需 的。GPIb的α-链由三个不同的结构域组成：(1)包含富亮氨酸重复序 列和Cys-键合的支链序列的球形N-末端肽；(2)高度糖基化粘蛋白样 大糖肽结构域；和(3)包含与GPIbβ和跨膜和细胞质序列的膜缔合C-末 端区。
几套证据表明GPIb-IX复合体的vWF和凝血酶结合结构域位于包 括GPIbα的氨基末端大约300个氨基酸的球形区中。人血小板GPIb- IX复合体一种介导血小板功能和反应性的关键膜受体。GPIb对内皮下 结合的vWF的识别使得血小板与受伤的血管粘着。此外，vWF与GPIbα 的结合也诱导血小板激活，其可能包括GPIb-IX的胞质结构域与细胞 支架或磷脂酶A2的相互作用。此外，GPIbα包含对于α-凝血酶的高亲 和性结合位点，其有助于血小板激活，但是迄今没有完全确定其机理。
GPIbα的N-末端球形结构域包含带负电荷的氨基簇。几组证据表 明，在表达GPIb-IX复合体的转染CHO细胞中和在血小板GPIbα中， 该结构域(Tyr-276，Tyr-278，和Tyr-279)经硫酸化而包含三个酪氨 酸残基。
蛋白质硫酸化
蛋白质硫酸化是一种普遍的翻译后修饰，它涉及硫酸根与糖侧链 或者与多肽主链酶促共价连接。这种修饰发生在高尔基体外侧区室中， 因此只影响横越该区室的蛋白质。这样的蛋白质包括分泌蛋白，以颗粒 体为目标的蛋白质，和血浆膜蛋白的胞外区。酪氨酸是现在已知经硫 酸化的氨基酸残基。J.W.Kehoe等，化学和生物学(Chemistry and Biol)7：R57-R61(2000)。其它氨基酸，例如苏氨酸，也可能经硫 酸化，特别是在病变细胞中。
发现很多种蛋白质是酪氨酸-硫酸化的，但是在一个多肽中存在三 个或多个硫酸化酪氨酸，如在GPIb上发现的，不是常见的。GPIbα (CD42)，它由血小板表达，并且巨核细胞介导血小板粘附和通过与vWF 结合在内皮下膜上的滚动，还在其N-末端结构域带有多价负电荷。
认为这样一种高度酸性和亲水性环境是硫酸化的一个先决条件， 因为酪氨酰基蛋白质磺基转移酶特异性识别与酸性氨基酸残基邻接的 酪氨酸并且将其硫酸化。J.R.Bundgaard等，JBC 272：21700-21705 (1997)。GPIbα的酸性区的完全硫酸化得到具有显著负电荷密度的一 个区-19个氨基酸的片段中有13个负电荷，使得它成为与其它蛋白 质静电相互作用的候选位点。
选择蛋白和PSGL-1
P-，E-，和L-选择蛋白是粘连分子的一个家族，其功能当中，介 导血管内皮上白细胞的滚动。P-选择蛋白贮存在血小板中的颗粒体 中，并且在被凝血酶，组胺，佛波醇酯，或者其它刺激分子激活之后运 输到表面。P-选择蛋白在激活的内皮细胞上表达。E-选择蛋白在内 皮细胞上表达，而L-选择蛋白在嗜中性白细胞，单核细胞，T细胞，和 B细胞上表达。
P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1，也称作CD162)是P-选择蛋 白，E-选择蛋白，L-选择蛋白的一种粘蛋白糖蛋白配体。PSGL-1是 一种二硫键连接的同型二聚体，其具有一个PACE(配对碱基氨基酸转 化酶)酶切位点。PSGL-1还具有三个可能的酪氨酸硫酸化位点，后面 接着脯氨酸，丝氨酸和苏氨酸比例高的大约15个十二聚体重复单元。 PSGL-1的胞外部分包含三个N-连接的糖基化位点并且具有多个唾液 酸化，岩藻糖基化O-连接低聚糖支链。K.L.Moore等，JBC 118： 445-456(1992)。大多数N-聚糖位点和很多O-聚糖位点被占据。确 定了来自人HL-60细胞的PSGL-1的O-聚糖的结构。这些O-聚糖中的 一组是核心-2，唾液酸化，岩藻糖基化结构，那是与选择蛋白结合所 要求的。与P-选择蛋白和L-选择蛋白结合还要求PSGL-1的氨基末端 区的酪氨酸硫酸化作用。此外，还有可能在翻译后被酶切的N-末端前 肽。
HL-60细胞中PSGL-1具有361个残基，带有267个残基的胞外区， 25个残基的跨膜区，和69个残基的胞内区。编码PSGL-1的序列是 单一的外显子，这样两者择一的剪接应该是不可能的。但是，HL-60细 胞中的，和大多数细胞系中的PSGL-1胞外区中存在10个残基共有序 列的15个连续重复单元，但是在多形核白细胞，单核细胞，和几种其 它细胞系，包括大多数天然白细胞中存在该序列的14和16个重复单 元。PSGL-1在细胞表面形成二硫键键合的同型二聚体。V.Afshar- Kharghan等，Blood 97：3306-3312(2001)。
PSGL-1作为二聚体在嗜中性白细胞上表达，表观分子量是250 kDa和160kDa，而在HL60上二聚体形式是大约220kDa。当在还原 条件下分析时，每个亚基都被还原一半。分子量不同可能归因于存在 不同数目十聚体重复单元引起的分子中的多态性。白细胞型分析VI (Leukocyte Typing VI)，T.Kishimoto等编著(1997)。
PSGL-1在大多数血液白细胞上表达，例如嗜中性白细胞，单核 细胞，白细胞，B细胞亚型，和所有的T细胞，并且介导P-选择蛋白 上嗜中性白细胞的滚动。白细胞型分析VI(Leukocyte Typing VI)， T.Kishimoto等编著(1997)。PSGL-1还可以介导通过与L-选择蛋白 结合的嗜中性白细胞-嗜中性白细胞相互作用，从而介导炎症。Snapp， 等，Blood 91(1)：154-64(1998)。
PSGL-1介导激活的内皮上，激活的血小板上，及其它白细胞上和 炎症部位上白细胞的滚动。
产生了商业上可获得的抗人PGSL-1的单克隆抗体，KPL1，并且证 明抑制PGSL-1和P-选择蛋白之间和PGSL-1和L-选择蛋白之间的相互 作用。对PGSL-1的酪氨酸硫酸化作用共有基序(YEYLDYD)作出KPL1 表位图谱。KPL1只识别这个特定的表位，并且不与其它细胞例如B- CLL细胞，AML细胞，转移细胞，多数骨髓瘤细胞，等之上存在的硫酸 化表位交叉反应。
白细胞滚动在炎症中是重要的，P-选择蛋白(在激活的内皮和血小 板上表达，其可以在受伤位点被固定)和PSGL-1之间的相互作用是管 壁上白细胞束缚和滚动的作用手段。Ramachandran等，PNAS 98(18)： 10166-71(2001)；Afshar-Kharghan，等，Blood 97(10)：3306- 7(2001)。
细胞滚动在转移中也是重要的，相信内皮细胞上P-和E-选择蛋白 结合转移细胞，从而有利于从血流中外渗到周围的组织中。
转移过程中也涉及血小板；当转移癌细胞进入血液时，形成包被肿 瘤细胞的血小板和白细胞组成的多细胞复合体。这些复合体可以称作 微栓，有助于肿瘤细胞逃避免疫系统。血小板包被肿瘤细胞要求血小 板表达P-选择蛋白。
用肝素处理，P-和L-选择蛋白的抑制剂抑制肿瘤细胞-血小板相 互作用。用O-唾液酸糖蛋白酶预处理肿瘤细胞，其去除唾液酸化，岩 藻糖基化粘蛋白配体，还抑制肿瘤细胞-血小板复合体形成。体内实验 表明这些处理的任一项产生与循环的肿瘤细胞相缔合的更大的单核细 胞，提示减少血小板结合增加了免疫细胞发病成循环肿瘤细胞的机 会。Varki和Varki，Braz.，生物学研究杂志(J.Biol.Res.) 34(6)：711-7(2001)。
PSGL-1和GPIb有着结构相似性，具有粘蛋白样高度糖基化配体 结合区。Afshar-Kharghan，等，Blood 97(10)：3306-7(2001)。
所有的白细胞：嗜中性白细胞，单核细胞，淋巴细胞，激活的外 周T-细胞，粒细胞，嗜酸性细胞，血小板上以及在一些CD34阳性干 细胞上和B-细胞一些亚型上都发现了PSGL-1。P-选择蛋白在激活的血 小板和内皮细胞上选择性表达选择蛋白。P-选择蛋白和PSGL-1之间 的相互作用促进白细胞在管壁上滚动，而白细胞在血管位点的异常蓄 积导致各种病理学炎症。各酪氨酸硫酸酯在PSGL-1上的立体特异性分 布对于P-选择蛋白和PSGL-1的结合是重要的。电荷对于结合也是重 要的：减少NaCl(从150减少至50mM)增强结合(Kd约75nM)。 PSGL-1上酪氨酸硫酸化增强P-选择蛋白PSGL-1粘附，但不是最终必需 的。PSGL-1酪氨酸硫酸化支持所有的剪切速度下更慢的滚动粘附， 并且支持高得多的剪切速率的滚动粘附。(Rodgers SD，等，生物物理 杂志(Biophys J.)81：2001-9(2001))。
纤维蛋白原
有两种形式的正常人纤维蛋白原：较多的纤维蛋白原γ和较少的 纤维蛋白原γ原型变体，各自都在正常个体中被发现。正常纤维蛋白 原，它是最大量形式(包括体内发现的纤维蛋白原的大约90％)，由两 个相同的55kDaα链，两个相同的95kDaβ链，和两个相同的49.5 kDaγ链组成。正常变体纤维蛋白原，它是较小丰度形式(包括体内 发现的纤维蛋白原的大约10％)，由两个相同的55kDaα链，两个相同 的95kDaβ链，一个49.5kDaγ链和一个50.5kDa原型(γ’)链组 成。γ和γ原型链都由相同基因编码，在3′端发生交替剪接。正常γ链 由氨基酸1-411构成。正常变体γ原型链由427个氨基酸组成：氨基 酸1-407与正常γ链中的那些相同，氨基酸408-427是 VRPEHPAETEYDSLYPEDDL。正常地，这个区一般被凝血酶分子占据。
通过在离子化钙的存在下凝血酶的作用纤维蛋白原被转化为纤维 蛋白，产生血液的凝固作用。纤维蛋白也是血栓和急性炎症渗出物的 一个成分。
血小板和在细胞-细胞相互作用，细胞基质相互作用，血小板-血 小板相互作用，血小板-细胞相互作用，血小板-基质相互作用，细胞 滚动和粘附，和止血法中起着重要作用的分子(例如纤维蛋白原，GPIb， 选择蛋白，和PSGL-1)在致病症状或疾病变中也起着重要的作用，例如 在异常或致病炎症，异常或致病免疫反应，  自身免疫反应，转移，异 常或致病粘附，血栓形成和/或再狭窄，和异常或致病聚集作用中。因 此，与血小板和与这些分子交叉反应的抗体在涉及这些及其它致病症 状的疾病和失调的诊断和治疗中会是有用的。因此需要鉴定这些分子 中或者中间共同表位，和鉴定能起交叉反应的抗体。
可以提供很多形式的抗体，例如片段，复合体，和聚合体。抗体片 段的例子包括单链Fv(scFv)片段和Fab片段。
已经确定scFv渗透组织并且比全长抗体更快地从血液中清除，因 为它们的大小较小。Adams，G.P.，等，英国癌症杂志(Br.J. Cancer)77，1405-1412(1988)；Hudson，P.J.，Curr.Opin.I amuraol.11(5)，548-557(1999)；Wu，A.M.，等，肿瘤靶(Tumor Targeting)4，47(1999)。因此，经常在涉及放射性标记例如肿瘤成 像的诊断中使用scFv，使得从体内更快地清除放射性标记。多种定向 癌症的scFv多聚体最近接受了临床前体内稳定性和效力的评估。 Adams，G.P.，等，Br.J.Cancer 77，1405-1412(1988)；Wu，A. M.，等，Tumor Targeting 4，47(1999)。
单链Fv(scFv)片段由多肽接头连接在一起的重链(VH)和轻链(VL) 可变区组成。接头足够长，使得(VH)和(VL)结构域折叠成功能Fv结 构域，使得scFv识别并结合它的靶物，亲和性与母体抗体相似或提高。
典型地，设计scFv单体，带有通过多肽接头与VL的N-末端残基 连接在一起的VH结构域的C-末端。任选地，利用反向取向：VL结构域 的C-末端通过多肽接头与VH的N-末端残基连接在一起。Power，B.， 等，J.Immun.Meth.242，193-204(2000)。典型地，多肽接头长度 15个氨基酸左右。当接头减少至大约3-7个氨基酸时，scFvs不能 折叠成功能Fv结构域，反而与第二个scFv缔合生成二聚体。进一 步将接头长度减小至少于三个氨基酸使得scFv缔合成三聚体或四聚 体，取决于接头长度，组成和Fv结构域趋向。B.E.Powers，P.J. Hudson，J.Immun.Meth.242(2000)193-194。
最近，发现多价抗体片段例如scFv二聚体，三聚体，和四聚体经常 提供比母体抗体结合靶物高的亲和性。这种更高的亲和性提供了潜在 的利益，包括提高的对于肿瘤定向应用的药代动力学。另外，在P-选 择蛋白及其配体PSGL-1的研究中，它们涉及白细胞的聚集和滚动，科 学家推断表达PSGL-1二聚体形式的细胞建立更稳定的滚动粘附，因为 这种更高的结合亲和性。这些粘附力有更大偏转抗性并且表现出滚动 速度较小波动。Ramachandran，等，PNAS，vol.98(18)：10166- 71(2001)。
这些多价形式的更高结合亲和性在诊断和治疗法中可能是有益 的。例如，scFv可以被用作阻断剂来结合靶受体，因此阻断“天然” 配体的结合。在这样的情况下，期望在scFv和受体之间有更高的亲和 缔合作用来减少解缔合机会，这可能允许天然配体与靶物的不期望的 结合。另外，当粘附和滚动中涉及靶物受体时或者当高偏转流动区中存 在的细胞例如血小板上有靶受体时，这种更高的亲和性可能是有用 的。
本发明的一个目的是提供在例如细胞滚动，炎症，免疫反应，感 染，自身免疫反应，转移，粘附，血栓形成和/或再狭窄，和聚集作用 这样的过程中作为手段的各种分子上存在的，和病变细胞例如AML细 胞，B-CLL细胞，多骨髓瘤细胞，和转移细胞上存在的分离的表位。
本发明的另一个目的是提供使用这样的分离表位开发识别例如细 胞滚动，炎症，免疫反应，感染，自身免疫反应，转移，粘附，血栓 形成和/或再狭窄，和聚集作用这样的过程中作为手段的各种分子上存 在的，和病变细胞例如AML细胞，B-CLL细胞，多骨髓瘤细胞，和转 移细胞上存在的表位并且与其交叉反应的抗体。
本发明的其它目的包括这样的抗体在开发和提供用于抑制细胞滚 动，炎症，免疫反应，感染，自身免疫反应，转移，粘附，血栓形成 和/或再狭窄，和聚集作用，和用于治疗例如AML，B-CLL，多发性骨 髓瘤，转移，心血管病例如心肌梗塞，视网膜病，硫酸化酪氨酸依赖性 蛋白质-蛋白质相互作用引起的疾病，或者其中这样的细胞功能或作用 起着重要作用的其它疾病这样的疾病的药物的用途。
本发明的一个目的是在用于诊断各种个体疾病状态的方法中应用 所述表位和抗体，所述疾病例如AML，B-CLL，多发性骨髓瘤，和转移或 者其中这样的细胞功能或作用如细胞滚动，炎症，免疫反应，感染，自 身免疫反应，转移，粘附，血栓形成和/或再狭窄，和聚集作用起着重 要作用的其它疾病。
本发明的再一个目的是提供抗体的多价形式，片段和复合体。更 具体地，本发明的一个目的是提供二聚体，三聚体和四聚体，有时这里 分别指二聚体(双抗体)，三聚体(三抗体)，和四聚体(四抗体)。
这里提供本发明的这些及其它目的。
发明概述
本发明提供在如炎症，免疫反应，转移，粘附，血栓形成，再狭窄， 和聚集作用这样的不同过程中起着重要作用的配体和受体上发现的表 位。在白血病和肿瘤细胞上，特别是在骨髓来源的白血病上也发现了 根据本发明的表位。因此，这些表位对于这些过程的治疗介导是有用的 靶物。抗这样的表位的抗体用作抗下面疾病的治疗药物：癌症(即作为 抗肿瘤剂又作为抗转移剂)，白血病，自身免疫疾病，炎症，心血管病 例如心肌梗塞，视网膜病和血小板功能异常引起的其它疾病，和硫酸化 酪氨酸依赖性蛋白质-蛋白质相互作用引起的疾病。本发明提供了这样 的抗体，含有所述抗体的组合物，和使用所述抗体的治疗和诊断方法。
本发明提供一种分离的表位，包括下面的结构式
式(I)
其中：
W是除了天冬氨酸和谷氨酸之外的任何氨基酸，
Y是能被硫酸化的任何天然存在的部分，
P是(A)m(A)n(X)u或(X)u(A)n(A)m或(A)n(X)u(A)m或(A)n(A)m(X)u 或(X)u(A)m(A)n或(A)m(X)u(A)n
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除了天冬氨酸，谷氨酸或酪氨酸之外的任何氨基酸，
A是任何带负电荷的氨基酸或亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸， 丝氨酸，或甘氨酸
q是1至6
z是0，1，或2
r是0或1
t是1，2或3
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝0，则n＞0；其中 如果q是1，r是1，并且如果q是＞1，则Y中至少一个被硫酸化； 并且进一步地，其中分离的表位能被抗体，其抗原结合片段，或者其 包括抗体或者其包括含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：20第一高变 区的结合片段的复合体结合。
本发明提供了包括式I的分离的表位，其中硫酸化部分是肽或糖 或脂偶联物，或者它们的组合。
本发明还提供了包括式I的分离的表位，其中W是甘氨酸，Y是酪 氨酸的肽偶联物或天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的糖偶联物；A是谷氨酸， γ羧基谷氨酸或天冬氨酸；和q是1，2，或3。在这些实施方案的一些 中，Y是酪氨酸的肽偶联物；q是3；并且r是1。
本发明还提供一种分离的表位，包括下面的结构式
式II
其中：
W是除了天冬氨酸和谷氨酸之外的任何氨基酸，
Y是能被硫酸化的任何天然存在的部分，
P是(A)m(A)n(X)u或(X)u(A)n(A)m或(A)n(X)u(A)m或(A)n(A)m(X)u 或(X)u(A)m(A)n或(A)m(X)u(A)n
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除了天冬氨酸，谷氨酸或酪氨酸之外的任何氨基酸，
A是任何带负电荷的氨基酸或亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸， 丝氨酸，或甘氨酸
z是0，1，或2
r是0或1
t是1，2或3
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝0，则n＞0；其中 至少一个Y被硫酸化；并且进一步地，其中分离的表位能被抗体，其抗 原结合片段，或者其包括抗体或者其包括含有SEQ ID N0：8或SEQ ID NO：20第一高变区的结合片段的复合体结合。
本发明提供了包括式II的分离的表位，其中硫酸化部分是肽或糖 或脂偶联物，或者它们的组合。
本发明还提供了包括式II的分离的表位，其中W是甘氨酸，Y是 酪氨酸的肽偶联物或天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的糖偶联物；A是谷氨 酸，γ羧基谷氨酸或天冬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸， 丝氨酸或甘氨酸。在这些实施方案的一些中，Y是酪氨酸的肽偶联物； q是3；并且r是1。
本发明提供了包括下式的分离的表位：
式III
其中：
G是甘氨酸
E是谷氨酸
D是天冬氨酸
Y是酪氨酸
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除上述之外的任何氨基酸
Z是0，1，或2
t是1，2或3
r是0至1
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中至少一个Y被硫酸化；其中如果n＝0，则m＞0；其中如 果m＝0，则n＞0；并且进一步地，其中分离的表位能被抗体，其 抗原结合片段，或者其包括抗体或者其包括含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：20第一高变区的结合片段的复合体结合。
本发明提供包括式III的分离的表位，其中r是1。
在上述实施方案中，Y可以包括脂质，碳水化合物，肽，糖脂，糖 蛋白，脂蛋白，和/或脂多糖分子。
本发明还提供了上述表位的衍生物，同系物，模拟物，和变体， 并且除了硫酸化作用之外具有至少一个翻译后修饰作用。
本发明提供了含有上述分离的表位的一种或多种的组合物。还提 供了编码上述表位的至少一部分的分离的多核苷酸。
本发明还提供了能与至少一种上述表位结合或交叉反应的抗体， 其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的其复合体。
同样，提供了用于制备能与至少一种上述表位结合或交叉反应的 抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的其复合 体的方法。该方法包括步骤：(a)提供噬菌体展示文库；(b)提供上 述表位之一；(c)对噬菌体展示文库淘选显示能与所述分离的表位结 合的寡肽或多肽的噬菌体颗粒；和(d)制备能与分离的表位结合的抗 体，其结合片段，或者包括抗体或其结合片段的复合体，包括肽或多 肽。
本发明还提供了具有SEQ ID NO：25[Y1 scFv]和/或SEQ ID NO： 203[Y17 scFv]的scFv抗体片段结合能力的抗体，其抗原结合片段， 或者包括至少一种抗体或者其结合片段的其复合体。
提供了具有肽或多肽结合能力的抗体，抗体片段，和抗体复合体， 其中所述肽或多肽具有包括SEQ ID NO：8[Y1 CDR3]或SEQ ID NO： 20[Y17 CDR3]第一高变区。在这些实施方案中的一些中，肽或多肽 具有包括SEQ ID NO：115的第二高变区和/或包括SEQ ID NO：114 的第三高变区。
提供了能与长度大约3-126个氨基酸残基并且包括至少一个硫酸 化酪氨酸残基和至少两个酸性氨基酸的肽或多肽表位结合的抗体，抗 体片段，和抗体复合体。在一些实施方案中，所述表位进一步包括至少 一个亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸或甘氨酸残基。在 一些实施方案中，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸或甘 氨酸残基置换至少两个酸性氨基酸残基中的一个或多个。在一些实施 方案中，所述表位包括DYD或EYE。在一些实施方案中，所述表位是 DYD或EYE。在其它实施方案中，所述表位包括DYE或EYD。
在一些实施方案中，根据本发明提供的抗体，抗体片段，和抗体复 合体能与碳水化合物，肽，糖脂，糖蛋白，脂蛋白，和/或脂多糖分子 上的表位结合。优选地，根据本发明的抗体，抗原结合片段，或者包括 至少一种抗体或其结合片段的其复合体能结合碳水化合物，肽表位， 糖脂表位，糖蛋白表位，脂蛋白表位，和/或脂多糖表位。在很多实施 方案中，碳水化合物，肽，糖脂，糖蛋白，脂蛋白，和/或脂多糖分子 包括至少一个硫酸化部分。
本发明提供了能与选自下面的至少两种不同的分子结合的抗体， 抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的其复合体： PSGL-1，纤维蛋白原γ原型(prime)，GP1bα，肝素，lumican，补 体化合物4(CC4)，间α抑制剂(interalpha inhibitor)，和凝血 酶原，但是不是必须同时发生。还有，本发明的抗体，抗体片段，或者 复合体将结合这些蛋白质的任何类似物，只要受体表位是完整的。
在一些优选的实施方案中，提供了能与选自PSGL-1，纤维蛋白原 γ原型，GP1bα，lumican，补体化合物4(CC4)，间α抑制剂，和凝 血酶原和肝素的至少两种蛋白质结合并且能与病变细胞例如B-CLL细 胞，AML细胞，多发性骨髓瘤细胞，和转移细胞结合的抗体，其抗原结 合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体。在一些实施 方案中，提供了能与PSGL-1，纤维蛋白原γ原型，GP1bα，肝素， lumican，补体化合物4(CC4)，间α抑制剂，和凝血酶原之一结合的 抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合 体。在一些实施方案中，提供了能与PSGL-1，纤维蛋白原γ原型， GP1bα，和肝素之一结合的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或其结合片段的复合体；在一些实施方案中，这些抗体，其抗原 结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体能结合病变 细胞例如B-CLL细胞，AML细胞，多发性骨髓瘤细胞，和转移细胞。
本发明提供了能与选自PSGL-1，纤维蛋白原γ原型，GP1bα，肝 素，lumican，补体化合物4(CC4)，间α抑制剂，和凝血酶原的至少 两种不同的分子结合并且进一步能与碳水化合物和/或脂质分子上的 表位结合的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合 片段的复合体。在一些实施方案中，碳水化合物和/或脂质分子上的表 位包括至少一个硫酸化部分。
本发明提供了能与两个或多个表位交叉反应的抗体，其抗原结合 片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体，每个表位在酸性 氨基酸序列中包括一个或多个硫酸化酪氨酸残基。在一些实施方案中， 提供了能与选自B-CLL细胞，AML细胞，多发性骨髓瘤细胞，和转移 细胞的至少一种细胞类型交叉反应的抗体，其抗原结合片段，或者包 括至少一种抗体或其结合片段的复合体。在其它一些实施方案中，抗 体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体 能与PSGL-1交叉反应。优选地，能与PSGL-1交叉反应的抗体，其抗 原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体与其中至 少一个酪氨酸残基被硫酸化的表位QATEYEYLDYDFLPETE结合。
在另外一些实施方案中，抗体，其抗原结合片段，或者包括至少 一种抗体或其结合片段的复合体能与GP1b-α交叉反应。优选地，能与 GP1b-α交叉反应的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或 其结合片段的复合体与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸化的表位 DEGDTDLYDYYPEEDTEGD，其中至少一个酪氨酸残基被硫酸化的表位 TDLYDYYPEEDTE，其中至少一个酪氨酸残基被硫酸化的表位 GDEGDTDLYDYYP，其中至少一个酪氨酸残基被硫酸化的表位YDYYPEE， 和/或其中至少一个酪氨酸残基被硫酸化的表位TDLYDYYP结合。
在另外一些实施方案中，抗体，其抗原结合片段，或者包括至少 一种抗体或其结合片段的复合体能与纤维蛋白原γ原型交叉反应。优 选地，能与纤维蛋白原γ’交叉反应的抗体，其抗原结合片段，或者包 括至少一种抗体或其结合片段的复合体与其中至少一个酪氨酸残基被 硫酸化的表位EPHAETEYDSLYPED结合。
在另外一些实施方案中，提供了能与肝素交叉反应抗体，其抗原 结合片段，或者包括一种抗体或其结合片段的复合体。
在另外一些实施方案中，提供了能与补体化合物4(CC4)交叉反应 抗体，其抗原结合片段，或者包括一种抗体或其结合片段的复合体。 优选地，能与CC4交叉反应的抗体，其抗原结合片段，或者包括一种 抗体或其结合片段的复合体与其中至少一个酪氨酸残基被硫酸化的表 位MEANEDYEDYEYDELPAK结合。
本发明还提供了能与上述蛋白质的片段，类似物，变体和模拟物 结合的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段 的复合体，只要表位是基本上完整的。
本发明提供了能与选自B-CLL细胞，AML细胞，多发性骨髓瘤细 胞，和转移细胞的至少一种细胞类型交叉反应的抗体，其抗原结合片 段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体。
本发明还提供了能抑制细胞滚动；抑制炎症；抑制自身免疫疾病； 抑制血栓形成；抑制再狭窄；抑制转移；抑制肿瘤细胞的生长和/或复 制；提高肿瘤细胞死亡率；抑制白血病细胞的生长和/或复制；提高白 血病细胞死亡率；提高病变细胞对于抗疾病剂损伤的易感性；提高肿瘤 细胞对于抗癌剂损伤的易感性；提高白血病细胞对于抗白血病剂损伤 的易感性；抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数的增加；降低癌症患者中肿瘤细 胞数；抑制白血病患者中白血病细胞数的增加；降低白血病患者中白血 病细胞数；抑制细胞-细胞，细胞-基质，血小板-基质，血小板-血小 板，和/或细胞-血小板复合体形成；抑制细胞-细胞，细胞-基质，血 小板-基质，血小板-血小板，和/或细胞-血小板粘附；聚集作用的抗 体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体。
提供了含有有效抑制，治疗，改善，或者预防感兴趣的疾病和/或 症状的量的根据本发明的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种 抗体或其结合片段的复合体的药物组合物。
本发明提供了根据本发明的抗体，其抗原结合片段，或者其复合 体在制备抑制，治疗，改善，或者预防感兴趣的疾病和/或症状的药物 中的用途。
本发明提供了根据本发明的抗体，其抗原结合片段，或者其复合 体作为抑制，治疗，改善，或者预防感兴趣的疾病和/或症状的药物的 用途。
本发明提供了抑制，治疗，改善，或者预防感兴趣的疾病和/或症 状的方法，包括对需要的患者施用含有有效量的根据本发明的抗体， 其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体的药 物组合物。
根据本发明的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或 其结合片段的复合体可以与药物复合或偶联。
本发明提供了与选自下面的一种试剂偶联或复合的抗体，其抗原 结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体：抗癌剂，抗 转移剂，抗白血病剂，抗疾病剂，抗粘附剂，抗血栓形成剂，抗再狭 窄剂，抗自身免疫剂，抗聚集作用剂，抗细菌剂，抗病毒剂，和抗炎 剂。
本发明还提供了与一种或多种毒素，放射性同位素和药物试剂偶 联或复合的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合 片段的复合体。
本发明提供了与能与一种以上试剂偶联或复合的赋形剂或载体偶 联或复合的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合 片段的复合体。这样的赋形剂和载体的例子包括葡聚糖，亲脂性聚合 物，HPMA，和脂质体。
本发明还提供了与放射性同位素及其它成像剂偶联或复合的抗 体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结合片段的复合体。 还提供了包括根据本发明的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一 种抗体或其结合片段的复合体的诊断试剂盒。
本发明提供了包括GPIbα氨基酸序列Tyr 276至Glu 282的分离 的表位，其中氨基酸276，278和279中至少一个被硫酸化。在优选的实 施方案中，所述表位进一步包括GPIbα氨基酸283-285。
本发明还提供了能与包括GPIbα氨基酸序列Tyr 276至Glu 282 的表位结合的抗体，其抗原结合片段，或者包括至少一种抗体或其结 合片段的复合体，其中氨基酸276，278和279中至少一个被硫酸化，并 且当表位进一步包括GPIbα氨基酸283-285时结合被增强。
还提供了具有大约40Kda表观分子量的分离的GPIbαN-末端肽， 所述肽包括具有序列YDYYPEE的表位，所述表位中至少一个酪氨酸残 基被硫酸化，和由氨基酸1至282组成的其中氨基酸276，278和279 中至少一个被硫酸化的分离的GPIbα肽。
本发明还提供了与人单克隆抗体scFv Y1的可变轻链交叉反应的 多克隆抗体，抗体片段和抗体复合体。在一些实施方案中，多克隆抗 体，抗体片段或抗体复合体与人单克隆抗体Y-1的可变轻链的NdeI- EcoR1限制片段交叉反应。还提供了包括这样的多克隆抗体诊断试剂 盒。
定义：
抗体(Ab′s)，或免疫球蛋白(IgG′s)，是与抗原结合的蛋白质分 子。它们由二硫键键合在一起的四条多肽链(2条重链和2条轻链)单元 组成。各条链都具有恒定区和可变区。它们可以以它们的重链成分为 基础被分为五类，IgG，IgM，IgA，IgD，和IgE。IgG类包括几个亚 类，包括但不限于IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4。体内B淋巴细胞产 生免疫球蛋白并且识别特定外来抗原决定簇并且有利于那种抗原的清 除。
抗体可以以多种形式制备和使用，包括抗体复合体。如这里使用的， 术语″抗体复合体″或″抗体复合体类″被用来指一种或多种抗体与另一 种抗体或者与抗体的一个片段或几个片段的复合体，或者两个或多个 抗体片段的复合体。抗体片段的例子包括Fv，F(ab′)2，F(ab′)，Fc， 和Fd片段。
如这里说明书和权利要求书中使用的，Fv被定义为由可以是相同 或不同的人抗体重链可变区和人抗体轻链可变区构成的分子，其中重 链可变区与轻链可变区连接，键合，融合或共价连接，或缔合。Fv可 以是单链Fv(scFv)或二硫键稳定的Fv(dsFv)。ScFv由柔顺性氨基 酸多肽间隔基团或接头连接的抗体的重链和轻链的可变区组成。接头 可以是支化或没有支化的。优选地，接头是0-15个氨基酸残基，最 优选地，接头是(Gly4Ser)3。
Fv分子本身由第一链和第二链组成，每条链包括第一，第二和第 三高变区。轻链和重链可变区中高变环称作互补决定区(CDR)。各条重 链和轻链中有CDR1，CDR2和CDR3区。相信这些区形成抗原结合位点， 并且能被具体修饰，得到增强的结合活性。自然中这些区大多数是重 链CDR3区。CDR3区被理解是Ig分子最暴露的区，如图所示，这里提 供的是主要负责观察到的选择性和/或特异结合特征的位点。
Fv分子的片段定义为比源Fv小但是仍然保留源Fv的选择性和/ 或特异结合特征的任何分子。这样的片段的例子包括但不限于(1)小型 体，它只包括Fv重链的片段，(2)微型体，它包括抗体重链可变区 小的功能单位(PCT申请号No.PCT/IL99/00581)，(3)包括轻链片段 的类似体，和(4)包括轻链可变区功能单位的类似体。
如这里使用的，术语″Fab片段″是免疫球蛋白的一价抗原结合片 段。Fab片段由轻链可变区和重链的部分组成。
F(ab′)2片段是通过胃蛋白酶消化获得的免疫球蛋白的二价抗原 结合片段。它包含轻链和两条重链的部分。
Fc片段是免疫球蛋白的非抗原结合部分。它包含重链的羧基末端 部分和对于Fc受体的结合位点。
Fd片段是免疫球蛋白的重链的可变区和第一恒定区。
多克隆抗体是免疫反应的产物，并且由多种不同的B-淋巴细胞形 成。单克隆抗体得自单一细胞。
对于多肽应用的和作为本发明中定义的，所谓盒指给定的连续氨 基酸的序列，它作为构架并且被认为是单一单元并且以此被操作。在 一个末端或两个末端，氨基酸可以被置换，插入，去除或连接。
术语″表位″在这里用来指抗原决定簇或抗原位点，它与抗体，抗 体片段，抗体复合体或包括其结合片段或T-细胞受体的复合体相互作 用。术语表位在这里与术语配体，结构域和结合区互换使用。
选择性在这里定义为靶分子从细胞类型或细胞态的混合物中选择 和结合一种类型细胞或细胞态的能力，其所有的细胞类型或细胞态对 于该靶分子可以是特异性的。
这里使用的术语″亲和性″是受体(例如抗体上的一个结合位点) 和配体(例如抗原决定簇)之间的结合强度的量度(缔合常数)。抗 体上单一抗原结合位点和单一表位之间的非共价相互作用总和的强度 是所述抗体对那个表位的亲和性。低亲和性抗体对抗原结合弱并且有 容易解缔合的倾向，而高亲和性抗体对抗原结合更紧密并且保持结合 时间更长。术语″抗体亲抗原性″与亲和性不同，因为前者反映抗原-抗 体相互作用的效价。
抗体-抗原相互作用的特异性：虽然抗原-抗体反应是特异性的，在 某些情况下，一种抗原激发的抗体能与另一种不相关的抗原交叉反 应。如果两种不同的抗原共享一个同源或相似表位，或者其锚定区或 者如果对一个表位特异的抗体与具有类似的化学性质的不相关的表位 结合，则发生这样的交叉反应。
血小板是巨核细胞盘状细胞质片段，在髓窦中散布，随后在外周 血液中循环。血小板具有几种生理学功能，包括在凝固中的主要作用。 在中枢部分和外周，澄清原生质中，血小板含有颗粒，但是没有确定 的核。
这里使用的凝集作用指一种过程，通过该过程引起悬浮的细菌， 细胞，碎屑，或者相同大小的其它颗粒粘附并且形成凝块。该过程类 似于沉淀作用，但是颗粒更大并且是在悬浮液中而不是在溶液中。
术语凝集作用指体外产生的血小板，和凝血酶和胶原的凝集，是导 致血栓或止血栓形成的连续机理的部分。
保守的氨基酸取代作用定义为通过改变肽，多肽，或蛋白质，或 者其片段的一个或两个氨基酸的氨基酸成分的变化。取代作用一般是 具有一般相似性质(例如，酸性，碱性，芳香性，大小，带正电荷或负电 荷，极性，非极性)的氨基酸的取代作用，使得取代作用基本上不以主 要方式改变肽，多肽或蛋白质特征(例如，电荷，IEF，亲和性，抗体 亲抗原性，构象，溶解度)或活性。可以对这样的保守的氨基酸取代进 行的典型的取代作用如下各组氨基酸之间的取代作用：
(i)甘氨酸(G)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)和异亮氨酸 (I)
(ii)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
(iii)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
(iv)组氨酸(H)，赖氨酸(K)和精氨酸(R)
(v)天冬酰胺(N)和谷酰胺(Q)
(vi)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
在主要负责分子的选择性和/或特异性结合特征的高变区中或两 侧，以及分子的其它部分，例如重链可变盒，能进行保守氨基酸取代 作用。另外，或者，通过将分子再构建形成完全大小的抗体，双抗体 (二聚体)，三抗体(三聚体)，和/或四抗体(四聚体)或者形成小 型体或微型体来完成修饰作用。
噬菌粒定义为携带质粒DNA的噬菌体颗粒。噬菌粒是经设计而包 含来自有丝噬菌体的复制起点例如fd的m13的质粒载体。因为它携带 质粒DNA，噬菌粒颗粒不具有足够的空间来包含噬菌体基因组的全部补 体。从噬菌体基因组遗失的成分是包装噬菌体颗粒必需的信息。因 此，为了繁殖噬菌体，需要将期望的噬菌体颗粒与补足遗失的包装信 息的辅助噬菌体菌株一起培养。
启动子是DNA上的一个区，在这个区中RNA聚合酶结合并引发转 录。
噬菌体展示库(也称为噬菌体肽/抗体库，噬菌体库，或者肽/抗体 库)包括大量噬菌体(一般108至109)，各噬菌体颗粒具有不同的肽或多 肽序列。这些肽或多肽片段可以被构建成可变长度。展示的肽或多肽 可以从人抗体重链或轻链衍生，但是不必需局限于此。
药物组合物指含有本发明的肽或多肽和药学可接受载体，赋形剂 或其稀释剂的配方。
药物试剂指在哺乳动物的预防性治疗或诊断中有用的试剂，所述 哺乳动物包括但不限于人，牛，马，猪，鼠，狗，猫，或者其它温血 动物。药物试剂选自放射性同位素，毒素，寡核苷酸，重组蛋白质，抗 体片段，和抗癌剂。这样的药物试剂的例子包括但不限于抗病毒剂， 包括阿昔洛韦，更昔洛韦和齐多夫定；抗血栓形成/抗再狭窄药物，包 括西洛他唑，达肝素钠，瑞维肝素钠，和阿司匹林；抗炎剂，包括扎托 洛芬，普拉洛芬，朵昔康，乙酰水杨酸17，双氯酚酸钠，布洛芬，右 布洛芬，舒林酸，萘普生，氨托美丁，塞利克西(celecoxib)，消炎 痛，罗非克西(rofecoxib)，和尼美舒利；抗自身免疫剂，包括来氟 米特，denileulcin diftitox，subreum，WinRho SDF，去纤苷，和 环磷酰胺；和抗粘附/抗聚集作用剂，包括利脉前列素，氯克罗孟，和 透明质酸。
抗白血病剂是具有抗白血病活性的物质。例如，抗白血病剂包括 抑制或停止白血病细胞或未成熟白血病前细胞的药物，杀死白血病细 胞或白血病前细胞的药物，提高白血病细胞或白血病前细胞对其它抗 白血病剂易感性的药物，和抑制白血病细胞转移的药物。在本发明中， 抗白血病剂还可以是具有预防，抑制，阻止或停止肿瘤血管形成的抗 生血管活性的药物。
通过分析在不同条件下，以具体的时间，在各种组织中等产生的 基因产物的量能研究基因的表达模式。当基因产物的量比正常对照物 例如没有病的对照物中发现的要高时，认为基因是″超量表达″。
给定细胞可以在其表面上表达具有对于给定抗体的结合位点(或 者表位)的蛋白质，但是那个结合位点可以在可以称之为第一阶段(I 阶段)的状态中的细胞中以隐性形式(例如，是空间阻碍的或者被阻 断，或者没有抗体结合所需要的特征)存在。I阶段可以是，例如，正常 的，健康的，没有病的状态。当表位以隐藏形式存在时，给定抗体不 识别它，即，抗体不与I阶段的这个表位结合或者不与I阶段的给定 细胞结合。但是，例如通过接受修饰作用本身，或者去除阻断，可以 暴露出表位，因为附近的或结合的分子被修饰或者因为区域经历构象 变化。
修饰作用的例子包括折叠变化，翻译后修饰变化，磷酸脂质化作 用变化，硫酸化作用变化，糖基化作用变化，等等。当细胞进入可以称 之为第二阶段(I阶段)的不同状态时可以发生这样的修饰作用。第二 状态或阶段的例子包括激活，增殖，转化，或恶性状态。被修饰后，可 以暴露表位，并且抗体可以结合。
肽模拟物是具有另一个整体例如抗体的相同的功能作用或活性的 小分子，肽，多肽，脂质，多肽或其偶联物。
附图简述
图1说明内切蛋白酶对GPIbα链的酶切位点。
图2描述证明还原和非还原条件下Y1和Y17对血小板的结合的蛋 白质印迹。
图3描述Y1与它的表位结合的最佳决定簇。
图4给出证明O-唾液糖蛋白内切酶对血小板GPIb的酶切消除了 Y1和Y17的结合的蛋白质印迹。
图5给出证明O-唾液糖蛋白内切酶酶切之后Y1和Y17结合类似 glycocalicin片段的蛋白质印迹。
图6描述证明特异性GPIb蛋白水解消除Y1结合血小板的FACS分 析的结果。
图7给出证明mocarhagin酶切之后Y1与血小板GPIbα的N-末 端(His 1-Glu 282)片段结合的蛋白质印迹。
图8给出证明mocarhagin酶切之后Y1和Y17与glycocalicin 结合的蛋白质印迹。
图9给出证明Y1和Y17与血小板结合的蛋白质印迹。
图10给出类似地无花果蛋白酶酶切之后Y1和Y17与 glycocalicin结合的蛋白质印迹。
图11给出证明Y1与GPIbaα经组织蛋白酶G酶切产生的较大片 段反应的蛋白质印迹。
图12给出证明Y1和Y17与GPIbaα经组织蛋白酶G酶切产生的 较大片段反应的蛋白质印迹。
图13给出证明mocarhagin和组织蛋白酶G对glycocalicin 的酶切消除Y1的结合的蛋白质印迹。
图14给出说明Y1和Y17与mocarhagin和组织蛋白酶G酶切的 洗涤过的血小板的溶胞产物结合的蛋白质印迹。
图15是说明Y1-scFv对洗涤过的血小板的凝集作用抑制的图 形。
图16是说明Y1-scFv对富集血小板血浆中的血小板的凝集作用 抑制的图形。
图17是说明Y1-IgG对洗涤过的血小板的凝集作用的诱导的图 形。
图18是说明Y1-IgG对富集血小板血浆中的血小板的凝集作用的 诱导的图形。
图19提供了ELISA检验结果。
图20给出说明Y1和α-CD42(N1-19)与它们的配体结合的特异 性的蛋白质印迹。
图21给出Y1与应用免疫沉淀和RP-HPLC纯化的KG-1细胞膜上 Y1-配体的反应性的蛋白质印迹。
图22给出说明O-唾液糖蛋白内切蛋白酶酶切对Y1结合的作用的 蛋白质印迹。
图23给出说明芳基-硫酸酯酶酶切之后对Y1与RP-HPLC-纯化的 KG-1细胞溶胞产物，和肝素-BSA的作用的蛋白质印迹。
图24给出Y1结合特异性分析中使用的免疫沉淀图示，其结果在 17B页图Tab 2A中给出。
图25给出Y1与来自AML患者和正常全血细胞的抗-CD-162抗体 结合之比较蛋白质印迹。
图26描述说明抗体KPL1，PL1，和PL2与Y1竞争结合的能力的 FACS分析的结果。
图27描述证明Y1结合特异性的FACS分析的结果。
图28也描述证明Y1结合特异性的FACS分析的结果。
图29是说明在各种肽的存在下Y1结合的抑制作用百分比％的图 形。
图30是描述不同处理组中小鼠肝重的图形。
图31是描述不同处理组中小鼠骨髓中MOLT细胞百分比的图形。
图32是描述不同处理组中小鼠血液中MOLT细胞百分比的图形。
图33是描述第35天时小鼠肝重(平均值+/-SEM)的图形。
图34是描述第35天时小鼠肝重(平均值+/-SEM)的图形。
图35是说明处理对成活率的影响的图形。
图36是说明不同处理组中白血病发生率％的图形。
图37是说明不同处理组中血液中KG-1细胞百分比％的图形。
图38是说明实验动物骨髓中KG-1细胞百分比％的图形。
图39是说明静脉内对小鼠注射125I-CONY1之后血浆中TCA-沉淀 放射性药代动力学的图形。CONY1的序列如SEQ ED NO：204中给出的。
图40是说明静脉内对小鼠注射125I-CONY1之后各种器官/组织的 特异性放射性的图形。
图41是说明对小鼠静脉内注射125I-CONY1之后各种器官/组织的 放射性分布的图形。
图42是Y1-cys-kak的Superdex 75图形。
图43说明在还原和非还原条件下二聚体与单体相比较的大小。
图44给出证明IgG Y1分子的结合水平与scFv-Y1的结合水平 相比较的FACS分析。
图45给出证明Y1及其它抗体与天然人血小板衍生的 glycocalicin和与大肠杆菌产生的重组glycocalicin结合的蛋白质 印迹。
图46说明Y1二聚体，Y1 scFv(CONY1)，和Y1 IgG之间的结 合之比较。
图47说明Y1二硫桥二聚体与Y1 scFv(CONY1)之间的结合比较。
图48提供Y1-IgG的重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。提供了 Y1-HC的核苷酸序列的可读框(ORF)(SEQ ID NO：205)，Y1-HC的氨 基酸序列(SEQ ID NO：206)，和Y1-LC的核苷酸序列的ORF(SEQ ID NO：207)，和Y1-LC(SEQ ID NO：208)的氨基酸序列。
图49提供了TM1的氨基酸序列(SEQ ID NO：209)。
图50提供了Y16 scFv的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO： 210)。
图51提供了Y1生物标记物的氨基酸序列(SEQ ID NO：211)。
图52提供了Y1-cys-kak scFv的氨基酸序列(SEQ ID NO：212)。
本发明的详细描述
在本发明中，使用全细胞来筛选识别白血病细胞表面抗原决定簇 的特异性抗体，其中特异性受体先前是未知的或者没有表征。另外，应 用多步骤生物筛选方法，通过对一种以上细胞类型筛选来选择噬菌 体。这比其中抗原特异性噬菌体抗体的筛选大大依赖于抗固定单一抗 原的生物淘选的现有技术方法有显著改善，使用全细胞作为靶物只有 有限筛选。
通过硫酸化部分的存在表征通过该多步骤方法鉴定的某些表位， 例如在炎症，免疫反应，感染，自身免疫反应，转移，粘附，血栓形 成和/或再狭窄，细胞滚动，和聚集作用这样的不同过程中起重要作用 的配体和受体上发现硫酸化酪氨酸残基或者硫酸化碳水化合物或脂质 部分，优选地在两个或多个酸性氨基酸序列中。在病变细胞例如B-CLL 细胞AML细胞，多骨髓瘤细胞，和转移细胞上也发现了这样的表位。这 些表位对于这些过程的治疗性介导作用和对于诊断方法是有用的。
但是，这些表位具有可变的一级氨基酸序列，抗这样的硫酸化表 位的抗体经常能与一种以上的分子上的一种以上这样的表位结合或者 交叉反应，但是不必须同时是这种情况。这样的抗体用作抗下面疾病 的治疗药物：癌症(即作为抗肿瘤剂又作为抗转移剂)，白血病，自身 免疫疾病，病毒疾病，涉及异常聚集作用的疾病，涉及异常粘附的疾 病，梗塞，心血管疾病和炎症。
为了鉴定结合血小板的抗体，从用来筛选固定的人血小板的人抗 体噬菌体展示文库分离人scFv Y1抗体。分离出几个克隆(不同的 scFv抗体)并且表征。这些克隆中的一个，制定为Y1，出人意料地发 现与来自AML患者和患有某些其它白血病的患者得到的白血病细胞结 合。通过对固定的血小板筛选，也分离到了另一个克隆，Y17，并且发 现与人血液结合。
为了鉴定在血小板表面上抗体与之结合的受体，使用Y1 scFv抗 体和Y17 scFv抗体在SDS-PAGE对从人血小板提取的蛋白质进行蛋白 质印迹。利用这种方法，测得血小板上的Y1 scFv和Y17 scFv表位 是glycocalicin，CD42复合体的亚基之一。
从激活的血小板纯化来自人血小板的glycocalicin胞外片段。 为了精确定位glycocalicin分子上Y1结合表位，用各种蛋白酶消化， 例如无花果蛋白酶，mocarhagin，组织蛋白酶G。利用Y1抗体作为检 测工具，通过蛋白质印迹方法进行分析。另外，在与Y1抗体的竞争结 合测试中使用商售抗-glycocalicin抗体(已知与glycocalicin的不 同表位结合的抗体)来测定glycocalicin上Y1结合表位。
以这些结果为基础，得出结论：glycocalicin的氨基酸272至285 在Y1与glycocalicin的结合中起着重要的作用。另外，因为Y1抗 体检测不到大肠杆菌产生的glycocalicin的N-末端多肽(氨基酸1 至340和1至480)，得出结论：Y1与它的表位结合以翻译后修饰为 基础，例如糖基化作用或硫酸化作用，所述翻译后修饰是已知在大肠 杆菌中不发生的修饰。
为了验证这一假设，用从蛋白质去除N和O-连接糖基的酶(糖苷 酶)和从蛋白质去除硫酸酯部分的酶(硫酸酯酶)处理纯化的 glycocalicin。糖苷酶不影响Y1抗体与glycocalicin或 glycocalicin衍生片段的结合。这个结果表明硫酸化基团对于Y1与 glycocalicin的结合是必需的。
为了进一步验证这些结果，制备以鉴定的表位(glycocalicin的 氨基酸272至285)为基础的硫酸化和非硫酸化合成肽，并且用来评价 在它们的存在下Y1抗体与glycocalicin的结合特异性(ELISA分 析)。与相关的非硫酸化肽相比，硫酸化肽抑制Y1抗体与glycocalicin 的结合高出几倍，表明硫酸化作用对于结合是必需的。
从上述实验结果得出结论：Y1抗体的表位位于其中有带负电荷氨 基酸串的glycocalicin上氨基酸272和285之间。
平行地，研究了Y1抗体与KG-1细胞(来源于AML患者的人细胞系)， 与各种来自人血浆的蛋白质，和与原发白血病患者血样的结合。
发现Y1抗体以相对低的亲和性与两种来自人血浆的蛋白质结合， 一种大小分子量是大约50kD，其被鉴定是纤维蛋白原γ原型并且分子 量是大约80kD的蛋白质，其被纯化成补体化合物4(CC4)和人 lumican。这些蛋白质含有硫酸化酪氨酸残基并带有带负电荷氨基酸序 列。
KG-1细胞上Y1配体被鉴定为PSGL-1，其是E，L-和P-选择蛋白 的受体。根据竞争测试(其中在不同的商业上可购得的抗PSGL-1抗体 的存在下进行Y1抗体与KG-1细胞的结合)为基础以及以使用从 PSGL-1的N-末端位点衍生的硫酸化和非硫酸化合成肽的一套实验为 基础，PSGL-1被鉴定是KG-1细胞上Y1抗体配体。PSGL-1的N-末 端位点含有硫酸化酪氨酸残基并带有带负电荷氨基酸序列。
虽然Y1抗体与几种分子结合，例如血小板上的glycocalicin分 子，纤维蛋白原γ原型，人血浆补体化合物4，和KG-1细胞上PSGL- 1分子，其对来自AML或多样骨髓瘤(MM)患者的原发白血病细胞的亲 和性比先前提到的表位高几倍。此外，商售抗PSGL-1抗体(KPL1)不 识别所有的来自患者血样中原发白血病细胞(识别12中的7个)，而Y1 抗体特异性和选择性地识别它们，这个实事表明与KG-1细胞上的不同 的原发白血病细胞上有另外的对于Y1抗体的表位。
根据本发明的硫酸化表位的例子包括式I，II，和III中，描述 的那些，以及其衍生物，同系物，模拟物，和变体。
式(I)：

其中：
W是除了天冬氨酸和谷氨酸之外的任何氨基酸，
Y是能被硫酸化的任何天然存在的部分，
P是(A)m(A)n(X)u或(X)u(A)n(A)m或(A)n(X)u(A)m或(A)n(A)m(X)u 或(X)u(A)m(A)n或(A)m(X)u(A)n
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除了天冬氨酸，谷氨酸或酪氨酸之外的任何氨基酸，
A是任何带负电荷的氨基酸或亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸， 丝氨酸，或甘氨酸
q是1至6
z是0，1，或2
r是0或1
t是1，2或3
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝0，则n＞0；其中 如果q是1，r是1，并且如果q＞1，则Y中至少一个被硫酸化；并且 进一步地，其中分离的表位能被抗体，其抗原结合片段，或者其包括 抗体或者其包括含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：20的第一高变区 的结合片段的复合体结合。
优选的表位是式I的表位，其中W是甘氨酸，Y是酪氨酸的肽偶联 物或天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的糖偶联物；A是谷氨酸，γ羧基谷氨 酸或天冬氨酸；和q是1，2，或3。在一些实施方案中，Y是酪氨酸 的肽偶联物；q是3；并且r是1。
式II：
式II
其中：
W是除了天冬氨酸和谷氨酸之外的任何氨基酸，
Y是能被硫酸化的任何天然存在的部分，
P是(A)m(A)n(X)u或(X)u(A)n(A)m或(A)n(X)u(A)m或(A)n(A)m(X)u 或(X)u(A)m(A)n或(A)m(X)u(A)n
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除了天冬氨酸，谷氨酸或酪氨酸之外的任何氨基酸，
A是任何带负电荷的氨基酸或亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸， 丝氨酸，或甘氨酸
z是0，1，或2
r是0或1
t是1，2或3
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中如果n＝0，则m＞0；其中如果m＝0，则n＞0；其中 至少一个Y被硫酸化；并且进一步地，其中分离的表位能被抗体，其抗 原结合片段，或者其包括抗体或者其包括含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：20的第一高变区的结合片段的复合体结合。
优选的表位是式II的表位，其中W是甘氨酸，Y是酪氨酸的肽偶 联物或天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的糖偶联物；A是谷氨酸，γ羧基谷 氨酸或天冬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸或甘氨酸。 在一些实施方案的中，Y是酪氨酸的肽偶联物；q是3；并且r是1。
式III：

其中：
G是甘氨酸
E是谷氨酸
D是天冬氨酸
Y是酪氨酸
S是硫酸酯或硫酸化分子
X是除上述之外的任何氨基酸
Z是0，1，或2
t是1，2或3
r是0或1
u是0至2
n是0至3
m是0至3
其中至少一个Y被硫酸化；其中如果n＝0，则m＞0；其中如 果m＝0，则n＞0；并且进一步地，其中分离的表位能被抗体，其 抗原结合片段，或者其包括抗体或者其包括含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：20的第一高变区的结合片段的复合体结合。
优选的表位是式III的表位，其中r是1。
所有的结构式的硫酸化部分也可以是肽-或糖-或脂-偶联物。Y可 以包括脂质，和/或碳水化合物分子。除了硫酸化作用之外，表位可以 具有至少一个翻译后修饰作用。
在如GPIb和PSGL-1这样的不同的分子上发现这样的表位，并且 在一些病变细胞例如B-CLL细胞，AML细胞，多骨髓瘤细胞，和转移 细胞上发现这样的表位。酪氨酸和/或其它部分的硫酸化作用对于与这 些表位的结合是特别重要的。已知是被硫酸化酪氨酸的人蛋白质包括 如下：
       肽                                   序列
凝血调节蛋白(408-426)       E C P E G Y I L D D G F I C T D I D E
人GP1bα(269-287)           DEGDTDLYDYYPEEDTEGD
人肝素辅助因子II(56-75)     GEEDDDYLDLEEDDDYIDIVD
人纤维蛋白原γ′(408-427)   VRPEHPAETEYDSLYPEDOL
α-2-抗纤维蛋白溶酶         P P M E E D Y P Q F G S P
肠促胰肽酶(CCK)             R I S D R D Y M G W M D F
α-2-绒毛膜促性腺激素       C H C S T C Y Y H K S-C O O H
补体C4                      MEANEDYEDYEYDELPAK
PSGL-1                      QATEYEYLDYDFLPET
因子VIII(716-731)           GDYYEDSYEDISAYLL
Lumican                     GYYDYDFPL
Y1-制备和筛选
本发明的与式I-III的表位结合的抗体的一个例子是全人单克隆 抗体Y1。Y1的筛选，制备，和初步表征详细地描述于美国专利申请登 记号Nos.09/751,181和60/258,948中。简要地说，使用展示scFv 抗体片段的噬菌体展示文库来获得和制备定向分子，利用流式细胞 计，特别是荧光激活的细胞分类(FACS)，来鉴定和分离特异噬菌体克 隆，识别靶细胞的肽或多肽。从没有免疫的人供体的外周血淋巴细胞 构建这里使用的噬菌体展示文库。
用已知为生物淘选的多步骤方法筛选和鉴定噬菌体克隆。通过将 噬菌体展示蛋白质配体变体(噬菌体展示文库)与靶物温育，通过洗 涤技术去除没有结合的噬菌体，并且特异性洗脱结合的噬菌体，来进 行生物筛选。任选地，在进行另外的结合和任选的扩增的循环之前将 洗脱的噬菌体扩增，所述任选的扩增富集特异序列的集合，好处是那 些噬菌体克隆带有展示与靶物的最佳结合的抗体片段。几轮之后，表征 各个噬菌体克隆，并且通过对噬菌体病毒体相应的DNA测序来测定克 隆展示的肽的序列。
在本发明中，在初步生物淘选步骤中对没有确定的表位进行血小 板筛选，接着用期望的靶细胞(例如，B-CLL细胞，AML细胞，多骨髓瘤 细胞，和转移细胞)，靶细胞表面标记物是未知的，进行克隆筛选。
恶性和病变血液细胞(例如，白血病或淋巴瘤)被表征为未成熟细 胞，其表达通常在部分分化的造血祖代中发现的细胞表面蛋白质。因 此，血小板是鉴定在病变或恶性血细胞上表达的成熟前细胞表面标记 物的有吸引力的来源。
选择与血小板和骨髓源白血病细胞，特别是AML细胞结合的Y1， 一种scFv克隆。Y1 scFv具有序列SEQ ID NO：25。Y1的结合特性 主要归因于它的重链CDR3区，其具有序列SEQ ID NO：8。也制备了 全Y1-IgG抗体。
还选择了第二个scFv克隆，Y17，其与血小板和来自人 myleogenous白血病细胞的细胞系，特别是AML细胞，结合。Y17 scFv 具有序列SEQ ID NO：203。Y17的结合特性主要归因于它的重链CDR3 区，其具有序列SEQ ID NO：20。也制备了全Y17-IgG抗体。
抗体制备
也可以将根据本发明的CDRs插入盒中制备抗体。一种盒，对多肽 使用时或者在本发明中定义时，指作为构架的并且被认为是单一单元 并且以此操作的连续氨基酸的给定序列。氨基酸可以被置换，插入， 去除，或者连接在一个或两个末端。同样，一段或几段氨基酸序列可 以被置换，插入，去除，或者连接在一个或两个末端。
显然盒氨基酸序列可以是固定的，而置换的，插入的或连接的序列 可以是高度可变的。盒可以由几个结构域构成，每一个具有对最终构建 体重要的功能。
本发明抗体的高变区形成本发明抗体的抗原结合位点。抗原结合 位点与表位结构互补，抗体与该表位结合，因此称作互补决定区 (CDRs)。抗体的各条轻链和重链上有三个CDRs，每一个位于连接VH和 VL结构域的链的环上。
本发明的具体实施方案的盒包括，从N-末端，构架区1(FR1)， CDR1，构架区2(FR2)，CDR2，和构架区3(FR3)。
在本发明的实施方案中，在盒中置换不同的区是可能的。例如，盒 的CDR2和CDR1高变区可以被非保守的，或者，优选地，保守型氨基 酸取代作用置换或修饰。更具体地，选自SEQ ID NOs：30-113或者其 片段的连续氨基酸盒的CDR2和CDR1区可以分别被SEQ ID NOs：115 和114置换。甚至更具体地，选自SEQ ID NOs：30-32，35，37- 39，41，43，45，46，48，51，54，57，59-68，70，71，76-85，87，89- 92，94，97，99，103，106，112，和113或者其片段的连续氨基酸盒的 CDR2和CDR1区可以分别被SEQ ID NOs：115和114置换。
在本发明优选的实施方案中，肽或多肽包括重链和轻链，每条链包 括第一，第二和第三高变区，它们分别是CDR3，CDR2和CDR1区。测 定结合选择性和特异性，特别对链的CDR3区，可能对轻链的CDR3区 和，优选地，对重链的CDR3区，及其次对轻链的CDR2和CDR1区和， 优选地，对重链的CDR2和CDR1区。结合选择性和特异性其次也可以 受到第一，第二和/或第三高变区两侧上游区或下游区的影响。
在优选的实施方案中，肽或多肽的CDR3区具有选自SEQ ID NOs： 8-24的氨基酸序列。
在更优选的实施方案中，重链的CDR3区具有选自SEQ ID NOs： 8-24的氨基酸序列，CDR2具有和SEQ ID NO：115相同的氨基酸序 列，CDR1区具有和SEQ ID NO：114相同的氨基酸序列。
在最优选的实施方案中，CDR3区具有和SEQ ID NO：8相同的 氨基酸序列。
本发明的优选的实施方案是具有和SEQ ID NO：8相同的CDR3序 列的scFv，并且全scFv序列与SEQ ID NO：25相同。
在本发明最优选的实施方案中，CDR3，CDR2和CDR1区分别具有 氨基酸SEQ ID NOs：8，115和114。
在本发明的实施方案中，Fv肽包括可变重链的CDR1和CDR2区， 其本身包括具有选自SEQ ID NOs：30-113的氨基酸序列的盒；CDR3 区，优选可变重链的CDR3区，其具有选自SEQ ID NO：8-24的氨基 酸序列；具有SEQ ID NO：117的氨基酸序列的CDR3区两侧的上游区； 具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列的CDR3区两侧的下游区；SEQ ID NO：123或124的0-20个氨基酸残基的间隔区；其序列是SEQ ID NO： 7的可变轻链区。
类似地，在另一个实施方案中，CDR2区两侧的上游区具有SEQ ID NO：119的氨基酸序列，CDR2区两侧的下游区具有SEQ ID NO：118 的氨基酸序列，CDR1区两侧的上游区具有SEQ ID NO：121的氨基酸 序列，CDR1区两侧的下游区具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列。
本发明优选的实施方案对肽或多肽提供了，其中第二和第三高变 区分别是CDR2和CDR1高变区，并且其中CDR3氨基酸序列是SEQ ID NO：8，其中CDR2氨基酸序列是SEQ ID NO：115，其中CDR1氨 基酸序列是SEQ ID NO：114，其中CDR3区两侧的上游区具有SEQ ID NO：117的氨基酸序列，CDR3区两侧的下游区具有SEQ ID NO：116 的氨基酸序列，CDR2区两侧的上游区具有SEQ ID NO：119的氨基酸 序列，CDR2区两侧的下游区具有SEQ ID NO：118的氨基酸序列，其 中CDR1区两侧的上游区具有SEQ ID NO：121的氨基酸序列，CDR1区 两侧的下游区具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列。
本发明另一个优选的实施方案提供了Fv分子，其包括具有第一， 第二和第三高变区的第一链和具有第一，第二和第三高变区的第二链， 其中第一链的高变区的一个具有选自SEQ ID NOs：8-24的序列，并 且其中第二链的高变区的一个具有选自SEQ ID NOs：1-6和125-202 的序列，并且其中第一，第二和第三高变区分别是CDR3，CDR2和CDR1 区，并且其中Fv是scFv或dsFv，并且任选地带有一个或多个标记。
本发明另一个实施方案对肽或多肽提供了(i)其中第一链和第二 链各自包括选自SEQ ID NOs：8-24的第一高变区；或(ii)其中第 一和第二链的第一高变区是相同的，并且选自SEQ ID NOs：8-24； 或(iii)其中第一链的第一高变区选自SEQ ID NOs：8-24，并且第 二链的第一高变区选自SEQ ID NOs：1-6和125-202；或(iv)其中 第一链的第一高变区选自SEQ ID NOs：1-6和125-202，并且第二 链的第一高变区选自SEQ ID NOs：8-24。
另一个实施方案对本发明肽或多肽提供了其中第一链的第二和第 三高变区分别是SEQ ID NOs：114和115。
对于这里描述和详细说明的所有的小于等于25个氨基酸残基的氨 基酸序列(例如，CDR区，CDR两侧区)，理解和认为是本发明的另一个 实施方案，其中这些氨基酸序列在其范围内包括一个或两个氨基酸取 代，并且优选地取代作用是保守的氨基酸取代。对于这里描述和详细 说明的所有的大于25个氨基酸残基的氨基酸序列，理解和认为是本发 明的另一个实施方案，其中这些氨基酸序列在其范围内包括与源序列 有大于等于90％序列相似性的氨基酸序列(Altschul等，核酸研究 (Nucleic Acids Res.)，25，3389-3402(1997))。相似或同源氨 基酸定义是具有相似性质例如酸性，碱性，芳香性，大小，正电荷或 负电荷，极性，非极性的不同的氨基酸。
通过两个不同的肽或多肽的氨基酸序列比较确定氨基酸相似性或 同源性或序列相似性百分比。将两个序列比对，通常通过应用以此目的 设计的各种计算机程序之一，比较各位置的氨基酸残基。然后确定氨 基酸同一性或同源性。然后应用一种算法来确定氨基酸相似性百分 比。一般优选的是比较氨基酸序列，因为大大提高了肽，多肽或蛋白 质分子之间的精密关系检测的灵敏度。蛋白质比较可以考虑保守氨基 酸取代，通过保守氨基酸取代，如果不相同的氨基酸具有相似的物理和 /或化学性质，则错配也得到一个正分值(Altschul等，Nucleic Acids Res.，25，3389 3402(1997)。
在本发明的实施方案中，各条轻链和重链的三个高变区可以在两 条链之间和链中和/或链间三个高变位点之间交换。
抗VL 的多克隆抗体(从Y1衍生)
使用下面的合成寡核苷酸引物从Y1克隆PCR-克隆出编码VL结构 域(可变轻链)的DNA片段(从Nissim I文库中能获得相同的DNA片 段(Nissim等，″来自‘单点’噬菌体展示文库的抗体片段作为免疫化 学试剂″，EMBO J.13(3)：692-698(1994))或者甚至使用相同的方 法来自人基因组)：寡5′-NdeI(TTT CATATGGAGCTGACTCAGGACCCTGCT) 和寡3′-EcoRI(TTT GAATTCCTATTTTGCTTTTGCGGC)。聚合酶链反应扩 增之后(PCR条件：94°1′，56°2′，72°2′x30，然后65°5′)， 将得到的DNA片段用NdeI和EcoRI限制性内切酶消化，并且克隆到 预先消化过的质粒的NdeI和EcoRI限制性酶切位点，这预先消化过 的质粒是用于在大肠杆菌中原核表达重组蛋白质的I PTG可诱导表达载 体。用连接混合物转化大肠杆菌细胞，并且使用上述寡核苷酸引物通 过PCR扩增筛选阳性克隆。培养携带这种质粒的细胞并且通过IPTG诱 导表达。通过离心从1升IPTG诱导后培养物离心收集细菌细胞，分离 包涵体并且溶解于胍-HCl+DTE，通过在含有TRIS-精氨酸-EDTA的 缓冲液中稀释而重折叠。5-10℃下重折叠48小时之后，将含有蛋白 质的溶液透析并且浓缩至20mM甘氨酸pH 9。通过使用离子交换树 脂，HiTrapQ，并且用梯度NaCl洗脱，将透析过的含有蛋白质的溶液再 次纯化。通过SDS PAGE并且通过凝胶过滤分析主峰。从原始的1升 培养物获得至少10毫克纯化的VL。
以2-4周间隔，在CFA(弗氏完全佐剂)的存在下用VL(400mg)然 后在IFA(弗氏不完全佐剂)的存在下用VL(200mg)免疫兔。获得的滴 度低(1∶50-1∶100)，可能是由于来自人和兔的VL之间的高同源性。
抗scFv抗体的多克隆抗体
分别培养来自Nissim I抗体噬菌体展示文库(Nissim等，″来自 ‘单点’噬菌体展示文库的抗体片段作为免疫化学试剂″，EMBO J.13 (3)：692-698(1994))的两个scFv抗体克隆(Y1和N14)。IPTG诱 导之后培养物在22℃下培养16小时。从细菌细胞周质收获scFv抗体 片段并且在蛋白A-琼脂糖柱子上纯化。根据Harrison J.L.，Williams S.C.，Winter G，和Nissim A.，酶学方法(Methods Enzymol.) 267：83-109(1996)实施所有的细菌克隆培养的程序，诱导方案，scFv 抗体片段收获和抗体片段纯化。基本上，为了制备兔产生的多克隆抗 体，能从Nissim I抗体噬菌体展示文库筛选两个或多个各scFv克 隆，所述多克隆抗体识别Nissim文库中存在的任何个体scFv抗体或 者任何IgG或者其片段，前提是它包含相同的VL或者其片段。
以2-4周间隔，在弗氏完全佐剂的存在下，用400mg的1∶1比 例的纯化的scFv抗体片段的混合物，然后在弗氏不完全佐剂的存在 下，用200mg的那种混合物免疫兔。
为了通过流式细胞仪(FACS)检测scFv抗体与细胞或者在SDS- PAGE(蛋白质印迹分析)上与各种蛋白质级分的结合，使用直接来自免 疫的兔的血清的或者在蛋白A-琼脂糖柱子上纯化过的多克隆抗scFv 抗体。
血小板上Y1结合位点的表征
循环血小板是从巨核细胞外周释放的细胞质颗粒。在止血中血小 板起着重要的作用。血管受到损伤时，血小板粘附在受伤的组织表面 并且彼此粘附(内聚)。这种作用快速发生，在血管受伤部位形成没有 结构的块(通常称作血小板栓或血栓)。内聚现象，也已知为聚集作用， 可以由各种物质或激动剂体外引发，例如：胶原，腺苷二磷酸(ADP)， 肾上腺素，血清素，和瑞斯托菌素。聚集作用是体外进行的多种测试之 一，是血小板功能的一个量度。
现有技术几组数据证明GPIbα的Asp269和Asp287之间带负电荷 的氨基酸串对于与血小板结合的von Willebrand Factor(vWF)是重 要的，其接着介导与受伤的血管的血小板粘附，动脉狭窄区中高剪切 力诱导的血小板凝集作用，低浓度凝血酶诱导的血小板激活作用。Ward， C.M.，等，生物化学(Biochemistry)35(15)：4929-39(1996)。 vWF与GPIb的相互作用依赖于激活作用或当与基质结合或者暴露给剪 切力时vWF结构构象变化。与vWF例如瑞斯托菌素和botrocetin结 合的特异调节剂体外模仿该过程。
Y1与血小板细胞提取物的反应性
利用免疫印迹和内切酶裂解技术来鉴定血小板表面膜上Y1的表 位。图1给出了GPIbα分子上内切酶裂解位点。
蛋白质印迹分析
通过对人血小板的生物筛选从噬菌体抗体文库筛选Y1 scFv，并 且发现与固定的和洗涤过的人血小板结合。利用ELISA测定和FACS分 析进行Y1的表征。
为了表征血小板膜上Y1结合的表位，通过SDS-PAGE(还原条件 和非还原条件下)分离血小板表面蛋白质，并且使用生物素标记的Y1 在还原条件和非还原条件下进行免疫印迹。这项实验的结果证明Y1与 分子量135kDa的蛋白质在还原条件下反应，与分子量大约160kDa的 蛋白质在非还原条件下反应。这些分子量与血小板GPIbα相一致，血 小板GPIbα在还原条件下分子量是135kDa。非还原条件下，与GPIbβ 二硫键键合的GPIbα链具有160-kDa分子量(图2)。
GPIbα链与GPIbβ二硫键键合，形成血小板膜蛋白GPIb。已知单 克隆抗体，MCA466S(Serotec)和S.C.7071(Santa Cruz)分别与 GPIbα的C-末端片段和与GPIbα的N-末端片段结合，并且发现和在 还原条件下和非还原条件下与Y1反应的相同的片段反应(还原条件下 只使用S.C.)。这些结果进一步证明Y1与GPIbα血小板表面蛋白质 结合。
通过Western分析对半纯化GPIb片段(glycocalicin)的进一步 分析证明事实上Y1与GPIb复合体的α亚基结合。
大肠杆菌中表达的重组GPIb的Western分析证明，大肠杆菌中 表达的GPIb不与Y1反应。因此，表明在大肠杆菌中不发生的翻译后 修饰对于Y1结合是必需的。无论N-还是O-多糖酶都不影响Y1与KG-l 细胞的结合。但是，用芳基硫酸酯酶或者通过蛋白水解酶处理配体能灭 活Y1结合。(图3)。
glycocalicin(GC)的GPIbα片段上Y1表位位点的定位
为了进一步定位Y1结合位点，使用具有已知的酶切位点的特异性 内切酶消化GP1b，并且对该片段测试Y1结合。
O-唾液糖蛋白内切酶对Y1与血小板GPIbα结合的作用
来自溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)(Cedarlan CLE 100)的O-唾液糖蛋白内切酶选择性酶切人血小板GPIb并且特异性地 只酶切含有唾液酸化O-连接多糖地蛋白质。O-唾液糖蛋白内切酶不 酶切N-连接地糖蛋白或者没有糖基化的蛋白质。据报道这种酶酶切 GPIb，它是高度O-糖基化的，但是不酶切GPIIb-IIIa或者血小板上 的其它受体。为了进一步确定Y1与分子的结合，用O-唾液糖蛋白内切 酶消化GPIbα。
免疫印迹(图4和5)和FACS分析(图6)证明洗涤过的血小板与O- 唾液糖蛋白内切酶温育取消了Y1结合，和单克隆抗体MCA466S (Serotec)的结合，该单克隆抗体抗GPIbα。该内切酶不改变抗 GPIIb/IIIa单克隆抗体(抗-CD61)的结合(图4)。这些结果提供了另 外的证据，即血小板膜上Y1的受体是GPIbα。
GPIb的Mocarhagin酶切--Y1表位的图谱
Mocarhagin是一种眼镜蛇蛇毒金属蛋白酶，它在残基glu-282和 asp-283之间的一个单一位点特异性酶切血小板GPIbα，从而产生两种 稳定产物：约45-kDa N-末端片段(His1-Glu282)，它释放到上清液 中，和膜结合的约95kDa C-末端片段。
用mocarhagin处理洗涤过的血小板，并且在SDS-聚丙烯酰胺凝 胶上对血小板溶胞产物进行电泳。使用Y1的mocarhagin处理过洗涤 过的血小板的溶胞产物的蛋白质印迹分析表明缺少了相应于GPIbα的 泳带(135kDa)并且Y1与N-末端大约45kDa胰蛋白酶片段结合。 抗GPIbα的C-末端的单克隆抗体(MCA466S)与大约95kDa C-末端 片段反应，抗GPIbα的N-末端的单克隆抗体(S.C.7071)与Y1识别 的相同的大约45kDa片段反应(图7)。
用Mocarhagin处理glycocalicin(可溶的，GPIbα的胞外片段) 给出和用洗涤过的血小板观察到的那些结果相同的结果，表明Y1和单 克隆抗体S.C.7071与GPIbα的大约45kDa N-末端酶切产物片段 结合(图8)。这些结果提示Y1的表位包含在序列His1-Glu282中。
Y17克隆的表征--与GPIb结合
Y17，本发明的第二种scFv人抗体片段，以和Y1一样的方法筛 选，利用用来表征Y1的方法来表征[参见实施例17]。简要地说，通 过对人血小板生物筛选从噬菌体抗体文库筛选Y17。利用ELISA测试 和FACS分析进行Y17的表征。发现Y17与固定的和洗涤过的人血小 板都结合。为了进一步表征结合Y17的血小板膜上的受体，通过SDS- PAGE和免疫印迹，使用标记的-Y17，在还原和非还原条件下，分离血 小板蛋白质。结果证明在还原条件下Y17与表观分子量为135kDa的 蛋白质反应，并且在非还原条件下与表观分子量为大约160kDa的蛋 白质反应。这些结果与还原条件下具有135kDa的分子量，非还原条 件下具有135kDa的分子量的血小板GPIbα相一致，并且由二硫键连 接GPIbα的GPIbα链组成。在还原和非还原条件下，抗识别GPIbα的 N-末端的GPIbα单克隆抗体S.C.7071(Santa Cruz)的C-末端片段 的单克隆抗体，MCA466S(Serotec)与和Y17相同的泳带反应(图2)。
蛋白质印迹表明Y1和Y17类似地结合血小板溶胞产物。(图9)。
O-唾液糖蛋白内切酶或无花果蛋白酶酶切glycocalicin之后，Y1 和Y17也类似地结合glycocalicin(图5和10)。
FACS分析表明Y1具有相似的与血小板和KG-1的结合曲线。另外， 两者都结合Raji和T2细胞。相反，TM1(SEQ ID NO：209)，Y16(SEQ ID NO：210)和Y45不结合任何上述人细胞系。
这些结果证明，Y1和Y17，本发明的两种单克隆抗体片段，在不同 的细胞共同由一种表位，并且这种表位不被任何其它试验的单克隆抗 体识别。
GPIb的组织蛋白酶G酶切-Y1表位图谱
组织蛋白酶G(Sigma C4428)，一种嗜中性白细胞丝氨酸蛋白酶， 在残基Leu-275和Tyr-276之间的第一酶切位点和残基Val-296和 Lys-297之间的第二酶切位点酶切glycocalicin。glycocalicin的 组织蛋白酶G处理产生两种N-末端片段：小的N-末端42kDa片段 (His1-Leu275)，大的N-末端45kDa N-末端片段(His1-Val-296)，和 相应的大约95kDa C-末端片段(图1)。
组织蛋白酶G消化产生的Glycocalicin和glycocalicin片段在 SDS-聚丙烯酰胺上进行电泳，并且转移给硝基纤维素进行蛋白质分 析。在免疫印迹中，Y1与较大的N-末端片段(His1-Val-296)结合， 而不与较小的N-末端片段(His1-Leu275)结合，也不与C-末端片段结 合。同样，商售单克隆抗体SZ2(Immunotech 0719)，已知它识别GPIbα 上残基Tyr276和Glu282之间的表位，也只与较大的N-末端片段反应 (图11和12)。
此外，已知识别His1和Leu275之间的表位的单克隆抗体S.C. 7071，与两个N-末端片段结合。Y1不与S.C.7071结合的His 1- Leu 275片段结合。这些结果表明Y1的表位位于Tyr 276-Val 296 序列中第一和第二组织蛋白酶G酶切位点之间，更可能在氨基酸约276 至282之间。
合成的部分GPIbα肽对Y1结合纯化的Glycocalicin和结合洗涤 过的血小板(WP)的影响
进行ELISA测试来评价GPIb衍生的合成的肽对Y1与纯化的 glycocalicin结合的影响。另外，使用洗涤过的血小板进行FACS分 析。为了评价GPIb的Y1结合位点中的硫酸化酪氨酸的重要性，应用 竞争结合FACS分析。浓度1微克的Y1-scFv与浓度2.5和200μM的 不同的肽预先温育。室温下预温育30分钟之后，将混合物加给含有约 107洗涤过的血小板的试管，并且使用多克隆兔抗-scFv-PE评价Y1 与洗涤过的血小板的结合。通过测定Y1与洗涤过的血小板的残留结合 评价与对照结合(只有Y1)相比较的肽的抑制作用。表1描述了肽和结 果，并且类似于在ELISA测试中(表B)使用相同的肽观察到的结果。 在这两项测试中，如下测定Y1结合的对照水平。用(a)纯化的 glycocalicin或(b)洗涤过的血小板包被聚苯乙烯微量滴定maxisorb 平板。充分洗涤之后，加入0.5微克/孔的Y1。然后平板与兔抗-scFv 温育，然后加入抗兔-HRP(辣根过氧化物酶)和HRP底物。通过产生 的颜色的强度测量抗兔HRP结合的水平，并且抗兔-HRP结合的水平 与抗Y1-scFv的结合水平和Y1的结合水平有相关性。测定A405的光密 度。每个样品测定两次，并且计算平均值。
通过将各种浓度的肽与恒定量的Y1混合来评价合成的GPIbα肽对 Y1与纯化的glycocalicin结合的影响。和对于没有肽存在下评价Y1 结合的描述一样，室温下温育30分钟之后，将混合物加给纯化的 glycocalicin包被聚苯乙烯微量滴定maxisorb平板。和对于没有肽 存在下评价Y1结合的描述一样，使用兔抗YlscFv和抗兔-HRP抗体 通过测定Y1与glycocalicin的残留结合来评价肽的抑制效果。使用 代表序列268至285的不同亚组的四种肽和对照肽进行这项研究。在 不同的浓度下测试各种肽：200μM，25μM，2.5μM，和0.5μM。
五种肽如下面表1所示：
表1     肽名称         特征         序列     EGR  阴性对照肽  REEGRQHFFLLEGRSSYS     P-1  GPIbα的残基268-285  GDEGDTDLYDYYPEEDTE     P-1-S  GPIbα的残基268-285  GDEGDTDLY*DY*Y*PEEDTE     P-2-S  GPIbα的残基273-285  TDLY*DY*Y*PEEDTE     P-3-S  GPIbα的残基268-280  GDEGDTDLY*DY*Y*P
Y*与Y相同，它是硫酸化酪氨酸。
下面表2和表3给出了从这些测试获得的结果。
表2
合成的GPIbα肽对Y1结合Glycocalicin的作用
0.25微克/孔Y1        Y1残基结合百分比(占基线的百分比％)     肽浓度   200μM    25μM   2.5μM   0.5μM     EGR     85     89     100     121     P-1     61     71     94     88     P-1-S     0     25     62     89     P-2-S     15     52     78     P-3-S     21     67     80
这些结果清楚地表明，含有硫酸化酪氨酸的肽的抑制作用显著高 于对于没有硫酸化的肽所观察到的。这种作用是剂量依赖性的，包含较 长N′(上游)侧翼序列的肽比具有延伸的C′(下游)侧翼序列的肽具有 更高的抑制作用。这些结果清楚地支持这样的结论，即Y1与GPIbα结 合需要硫酸化酪氨酸，来自硫酸化区的上游和下游序列增强Y1与 GPIbα结合。
表3
根据竞争FACS分析描述的合成的GPIbα肽对Y1结合洗涤过的血 小板的影响 Y1的残基结合(占基线的百分比)(Geo平均 值)    肽浓度    200μM    2.5μM   EGR     119     96   P-1     87     106   P-1-S     5     41   P-2-S     7     61   P-3-S     26     82   对照-没有肽     114
这些结果进一步支持这样的假设：特异区中硫酸化酪氨酸残基对 于GPIb上Y1识别是重要的。总之，mocarhagin和组织蛋白酶G的 N-末端肽蛋白水解片段的分析表明GPIbα氨基酸序列Tyr276-Glu- 282是或者包含用于Y1结合的重要的表位(图Tab 1C，第6和7页)。 进一步表征表明，除了glycocalicin的残基276-282(硫酸化阴离子 序列)，Y1的识别位点中也包括上游氨基酸283-285。
Y1 scFv，Y17 scFv和IgG Y1对血小板功能的生物活性
定位化实验表明Y1结合位点在α-凝血酶和vWF结合位点，它对 于血小板聚集作用是重要的。研究Y1 scFv，Y17 scFv，和Y1 IgG对 洗涤过的血小板和对富集血小板的血浆的结合，确定这种结合对血小 板聚集作用的影响。
Y1-scFv和Y17-scFv对洗涤过的血小板(W.P.)聚集作用的影响
在PRP中测定由于存在栓塞物质的聚集作用，同时测定洗涤过的血 小板的聚集作用。以各种浓度的Y1测试Y1(scFv)对洗涤过的血小板 的聚集作用的影响。在暴露给血小板凝集作用和聚集作用的诱导剂瑞 斯托菌素之前，血小板在37℃下与Y1 scFv，Y17 scFv，Y16-scFv，或 对照TM-1 scFv预温育4分钟。
表4和图15给出了该项研究的结果。血小板与25微克/毫升Y1 scFv预温育抑制瑞斯托菌素诱导的洗涤过的血小板的凝集作用。Y1浓 度12.5微克/毫升时，只观察到血小板凝集作用的部分抑制作用。Y1浓 度是微克/毫升下，没有观察到血小板凝集作用的抑制作用。这些结果 表明Y1对洗涤过的血小板的凝集作用的抑制活性是剂量依赖性的。洗 涤过的血小板与阴性对照scFv TM1温育对瑞斯托菌素诱导的血小板的 凝集作用没有影响。不管Y17还是Y16，它是从相同的噬菌体展示文 库并且使用用于筛选Y1的相同的多步骤程序筛选的另一个scFv克隆， 都不显著抑制洗涤过的血小板的凝集作用。
表4  ScFv浓度 抑制百分比％ 凝集作用％  TM-1 scFv 25微克/毫升     10     90  Y1 scFv 25微克/毫升     77     23  Y1 scFv 12.5微克/毫升     33     67  Y1 scFv 14微克/毫升     8     92  Y17 scFv 25微克/毫升     15     85  Y16 scFv 38微克/毫升     14     86
*以瑞斯托菌素处理为基础校正100％凝集作用。
Y1-scFv和Y17-scFv对富集血小板血浆聚集作用的影响
以各种浓度的Y1测试Y1(scFv)对富集血小板血浆(PRP)的聚 集作用的影响。在暴露给血小板凝集作用和聚集作用的诱导剂瑞斯托 菌素之前，PRP在37℃下与Y1 scFv，Y17 scFv，或对照sTM-1 scFv 预温育4分钟。当在加入瑞斯托菌素之前将scFv加给PRP时观察到可 逆转抑制作用，它是剂量依赖性的。
表5和图16给出了该项研究的结果。根据头4分钟的记录，最终 浓度是50微克/毫升的Y1抑制瑞斯托菌素诱导的血小板富集血浆中血 小板聚集作用的约80％。Y1浓度是25微克/毫升时没有血小板聚集 作用的显著抑制作用。Y17不抑制血小板的聚集作用。洗涤过的血小 板与50微克/毫升的I阴性对照scFv，TM1温育，对瑞斯托菌素诱导的 血小板聚集作用没有影响。
表5  ScFv浓度 抑制百分比％  聚集作用％  TM-1 scFv50微克/毫升 0  100  Y1 scFv50微克/毫升 80  20  Y1 scFv25微克/毫升 13  87  Y17 scFv38微克/毫升 0  100
*以瑞斯托菌素处理为基础校正100％聚集作用。
Y1-IgG对洗涤过的血小板(W.P.)的凝集作用的影响
由于其天然结构，完整IgG Y1在GPIbα上有两个结合位点并且 一个结合位点是对于Fc受体。可能的是，如果完整IgG Y1结合两种 GPIbα分子，它将激活血小板并且诱导血小板凝集作用。此外，因为血 小板具有Fc-受体，Y1-IgG能通过与GPIbα结合和与Fc-受体结合而 诱导血小板凝集作用，从而产生通过每一种IgG Y1与三种血小板结合 的血小板凝集作用。因此，在有或没有瑞斯托菌素的存在下以不同浓 度的Y1-IgG测定IgG Y1对洗涤过的血小板的聚集作用的影响。37 ℃下检测Y1-IgG对血小板聚集作用的诱导4分钟，之后加入瑞斯托 菌素。
表6和图17给出了没有激动剂的结果。单独的最终浓度是50微 克/毫升的Y1-IgG诱导洗涤过的血小板的正常凝集作用的约39％的血 小板凝集作用。37℃下检测Y1-IgG对血小板聚集作用的诱导4分钟， 之后加入瑞斯托菌素。加入瑞斯托菌素之后没有发现另外的对血小板 凝集作用的影响：观察到正常的血小板凝集作用。但是，当与微克/ 毫升的Y1温育时没有血小板凝集作用的诱导。
当如上所述使用抑制血小板凝集作用的商售单克隆抗体抗GPIbα (CD42)(Pharmigen)时，或者对照人λ-(Sigma)时，血小板凝集作 用没有减弱。
表6     抑制作用％       凝集作用％ IgG Ab浓度  没有瑞斯   托菌素  有瑞斯托   菌素 没有瑞斯托    菌素  有瑞斯托    菌素 Y1-IgG 50μg/ml     61     5     39     95 Y1-IgG 25μg/ml     65     5     35     95 Y1-IgG 12.5μg/ml     62     5     38     95 Y1-IgG 3.5μg/ml     66     14     34     86 Y1-IgG 1μg/ml     92     7     8     93 小鼠抗-人 CD42 IgG 20μg/ml     99.5     100     0.5     0 对照人 IgG 20μg/ml     99.5     25     0.5     75 对照瑞斯托菌 素激活作用     -     0     -     100
Y1-IgG对血小板-富集-血浆(PRP)的聚集作用的影响
在有或没有瑞斯托菌素的存在下以不同浓度的Y1-IgG测定IgG Y1对血小板-富集-血浆(PRP)的聚集作用的影响。37℃下检测Y1-IgG 对血小板聚集作用的诱导4分钟，之后加入瑞斯托菌素。
表7和图18给出了结果。加入瑞斯托菌素之后没有发现对血小板 凝集作用的影响：观察到正常的血小板聚集作用。加入瑞斯托菌素之 前，最终浓度是50微克/毫升的Y1-IgG诱导血小板-富集-血浆中的血 小板聚集作用。加入瑞斯托菌素之前，浓度是微克/毫升的Y1-IgG仅 部分诱导血小板聚集作用。10微克/毫升，4微克/毫升，或1微克/ 毫升浓度的Y1-IgG没有观察到血小板聚集作用的诱导。20微克/毫 升的抑制血小板凝集作用的商售单克隆抗体抗GPIbα(CD42) (Pharmigen)不诱导血小板凝集作用。和Y1-IgG相同浓度的对照人λ -IgG(Sigma)不诱导血小板凝集作用。
表7     抑制作用％          聚集作用％ IgG浓度 没有瑞斯托    菌素 有瑞斯托   菌素 没有瑞斯托    菌素   有瑞斯托     菌素 Y1-IgG 50μg/ml     64     0     36     100 Y1-IgG 25μg/ml     75     8     25     92 Y1-IgG 10μg/ml     93     10     7     90 Y1-IgG 4μg/ml     98     5     2     95 Y1-IgG 1μg/ml     95.5     0.5     0.5     99.5 人抗CD42 IgG 20μg/ml     99.5     0.5     0.5     99.5 对照瑞斯托菌 素激活作用     -     0     -     100
Y1血浆可溶配体和细胞系的鉴定
抗GPIbα(CD42b)抗体识别血小板溶胞产物和glycocalicin， 但是不识别KG-1细胞溶胞产物(Y1结合正骨髓细胞系)或Raji细胞 溶胞产物(对于KG-1细胞对于Y1结合是阳性的浓度下对于Y1结合是 阴性的B细胞系)。相反，Y1识别glycocalicin，血小板溶胞产物，和 KG-1细胞，但是不识别Raji细胞提取物。阴性对照scFv-181，不识 别任何相关的蛋白质(图20)。
在Y1和SZ2(抗GPIb的硫酸化区的Mab)之间的比较分析中进一 步证明Y1交叉反应性的唯一性。和SZ2相反，Y1只与GPIb结合，但 是还与血浆蛋白质结合，和如下所述的来自骨髓的细胞提取物结合。
人血浆中的Y1配体
两种蛋白质与正常的以及白血病患者血浆中的Y1发生免疫反应。 第一种被指定为H P-配体1，它在还原条件下具有约50kDa的分子 量，在非还原条件下具有＞300kDa的分子量，并且从凝结之后的血 清中完全消失；和(2)H P-配体2，它在还原和非还原条件下都具有约 80kDa的分子量并且保留在凝结之后的血清中。使用Q-琼脂糖柱反 相(RP-HPLC)2D凝胶电泳纯化之后，分析肽，这种约50kDa配体被 鉴定为人纤维蛋白原的γ链(γ原型)的正常变体。序列 VRPEHPAETEYDSLYPEDDL，只在纤维蛋白原γ原型中存在，不是纤维蛋 白原γ的大量形式，并且类似于含有硫酸化酪氨酸的GPIb阴离子区。 最可能的是这是对于Y1的结合位点。这种约80kDa被鉴定为补体化 合物4(CC4)和Lumican。如上所述，它包含硫酸化酪氨酸残基并且带 有带负电荷氨基酸的一段序列。
Y1与原发白血病细胞的结合
FACS分析表明，Y1选择性结合白血病细胞，但是不结合正常血 样中的正常血细胞和白血病样品血样中的正常细胞。下面的表中给出 了从患者分析得到的结果的总结。
表8：使用Y1的患者的结果      疾病    阳性数目   阳性百分比   多发性骨髓瘤     16/16     100％   AML     60/75     80％   B-白血病     29/43     67％
表9：B-白血病     类型    来源   阳性数目   阳性百分比  阴性百分比    Pre-B-ALL     BM     3/3     100     0    B-ALL     BM     3/9     33     67    B-CLL     PB     17/23     74     26    B-淋巴瘤     PB     5/8     62     38
BM＝骨髓
PB＝外周血
骨髓细胞(KG-1)上Y1表位的表征
收集大约250亿KG-1细胞，用于从KG-1细胞膜纯化Y1表位。发 现KG-1膜制剂含有至少2个亚基，Y1与这两个亚基结合：一个约110 kDa亚基和一个约120kDa亚基。还发现Y1与约220kDa亚基结 合，其可能是约110kDa亚基的二聚体。通过与Y1的免疫沉淀和反相 (RP-HPLC)完成Y1表位的纯化。2微升合并的级分被用于使用scFv Y1 的蛋白质印迹，40微升被用于银染色(图21)。
应用使用蛋白酶，多糖酶和硫酸酯酶的酶处理；使用Y1，抗-CD42 抗体，抗CD162抗体和181的蛋白质印迹，使用Y1和抗-CD162抗 体的免疫沉淀；使用Y1抗-CD162抗体的FACS分析；和测序，进一 步表征Y1配体。
下表总结了用来表征和定位KG-1细胞上Y1结合位点的生物化学 实验。
在SDS-PAGE还原凝胶上进行的蛋白质印迹分析
表10     底物      处理     条件   与Y1的反应       性  图中的表示   RP-HPLC   KG-1膜级分   O-唾液糖蛋白   内肽酶   37℃30’   只与120kDa   形式有反应性 Tab 2A玻片14   RP-HPLC   KG-1膜级分   O-唾液糖蛋白   内肽酶   37℃4小时   没有反应性 Tab 2A玻片14   RP-HPLC   KG-1膜级分   芳基-硫酸酯酶   22℃18小时   没有反应性 Tab 2A玻片14   RP-HPLC   KG-1膜级分   mocarhagin   37℃7’   没有反应性 Tab 2A玻片14   Glycocalic   in   O-唾液糖蛋白   内肽酶   37℃30’   增强的结合 Tab 2A玻片14   肝素-BSA   芳基-硫酸酯酶   22℃18小时   与没有处理的   Y1结合 Tab 2A玻片16
总之，用内肽酶处理之后，Y1信号被酶切掉而不能检测到。最 可能地，在N′-末端发现含有Y1结合位点地片段，并且它太小，在上 述实验中使用的条件下不能被检测。另外，使用从蛋白质去除硫酸酯部 分(KG-1细胞提取物中)但是不形成糖部分(肝素上)的芳基-硫酸酯 酶获得的结果进一步支持我们的假设：Y1识别需要硫酸酯。令人感兴 趣的是，O-唾液糖蛋白内肽酶增强GC酶切产物中的Y1信号。我们假 设这种处理之后，现在位于C′-末端的Y1结合位点更好地暴露给Y1结 合。
Y1和PSGL-1抗体-KPL1之间的相关性：蛋白质印迹分析
评价scFv Y1抗体和抗来自KG-1细胞的KPL1免疫沉淀(IP)膜蛋 白的商售抗-PSGL-1单克隆抗体(KPL1)的结合。使用Raji细胞溶胞 产物作为Y1和KPL1阴性对照。
用KPL1免疫沉淀KG-1细胞的膜级分。使用scFv Y1抗体或者使 用KPL1将IP级分进一步免疫沉淀。使用scFvYI或KPL1抗体通过蛋 白质印迹分析没有沉淀出的(洗出液)级分。
图24中给出了两种免疫沉淀方案和结果。KPL1不识别 glycocalicin。但是，scFv Y1和KPL1抗体两者都识别KG-1细胞上 的膜蛋白。
使用抗-CD162抗体免疫沉淀来自细胞系的溶胞产物和原始白细 胞，并且离心，产生上清液和洗出液。使用scFv Y1和抗-CD162抗体 进行洗出液中和上清液中存在的蛋白质的Western印迹分析。KG-1膜 制剂含有两种亚基(约110kDa和约120kDa)，抗-CD162(PSGL-1)抗 体与它们结合。相反，正常白细胞膜制剂只有较小的亚基。来自AML 患者的膜制剂只有较大的亚基。scFv Y1与不同的物质结合，在免疫 沉淀的上清液中发现这些物质，抗-CD 162抗体不与这些物质结合(图 25)。
FACS分析
利用FACS分析在竞争结合试验中评价在抗-PSGL-1(抗-CD162) (KPL1)抗体的存在下Y1抗体(scFv和IgG两种形式)与KG-1细胞的 结合。为此，使用不同的商售抗-PSGL-1抗体，KPL1(鉴定PSGL-1 的硫酸化酪氨酸N-末端结构域的抗体)，PL1(鉴定PSGL-1的没有硫 酸化的N-末端结构域的抗体)，和PL2(鉴定PSGL-1受体的没有硫酸 化的内部结构域的抗体)。只有KPL1完全抑制Y1与KG-1细胞的结 合，PL1部分抑制结合。在PL2抗体的存在下没有结合的抑制作用(图 26)。Raji细胞不与KPL1抗体结合。类似地，不同浓度的完整IgG Y1 以剂量依赖方式抑制KPL1抗体与KG-1细胞的结合(图27)。同样，KPL1 抗体以剂量依赖方式抑制完整IgG Y1抗体与KG-1细胞的结合(图 28)。
Y1和KPL1与原发白血病细胞结合之间的相关性
scFv Y1抗体和抗-CD162抗体与病变细胞的结合的分析也详细说 明了scFv Y1具有与抗-CD162抗体不同的结合特征。具体地说，Y1 和抗-CD162结合Pre-B-ALL，HCL，AML，B-ALL，B-CLL，没有分类 的白血病细胞，B-PLL，和来自人患者的多骨髓瘤细胞的FACS分析表 明两种抗体具有不同的结合曲线(表F)。在12个样品中的10个样品中 Y1与白血病细胞结合。相反，抗-CD162只结合12个样品中的5个。 在12个样品中，发现5个结合Y1但是不结合抗-CD162。因此，可以 得出结论，在白血病细胞中，scFv Y1与抗-CD162识别之外的配体。
表11：白血病样品--抗-CD162对Y1的分析     与白血病细胞的反应    患者编号       疾病   ScFv Y1   抗CD162     42291     Pre-B-ALL     +     -     42299     HCL     -     -     42311     AML     +     +     42321     B-ALL     -     -     42323     B-CLL     +     -     42325     没有分类     +     -     42332     B-CLL     +     -     42352     B-PLL     +     +/-     42330     AML     +     +     42334     MM     +     -     42366     AML     +     +     42370     AML/ALL     +     +/-
总之，GP1bα，Fngγ原型，和PSGL-1中含有硫酸化酪氨酸的Y1- 结合结构域分别是，DEGDTDLYDYYPEEDTEGD(氨基酸269- 287)，EHPAETEYDSLYPED(氨基酸411-427)，和QATEYELDYDFLPETE(氨 基酸1-17)。另一个结合位点，有更高的对于Y1的亲和性，最可能在原 发白血病细胞上表达。令人感兴趣地，对scFv Y1和抗-CD162都呈阳 性地血液样品来自AML患者，而B-细胞对抗-CD 162呈阴性。
硫酸化肽与Y1的结合分析
应用竞争结合ELISA测试来评价硫酸化酪氨酸的存在和位置对于 肽与Y1结合的重要性。
Glycocalicin固定在Maxisorb平板上。为了发现剂量响应，以 三种不同的浓度(1，10和100μM)将scFv Y1与感兴趣的肽预温育 10分钟(表12)。预温育之后，将混合物(Y1+肽)加给平板，使用识 别scFv Y1的VL链的多克隆兔抗-VL，接着使用抗-兔-HRP评价scFv Y1的结合。在其中肽与scFv Y1结合的混合物中，观察到与对照结合 相比较scFv Y1与glycocalicin结合的减弱。在其中肽与scFv Y1 没有结合的混合物中，观察到与对照结合相比较scFv Y1与 glycocalicin结合没有变化。
将实验重复两次，在ELISA图表中描述了结果(图29)。不管硫酸 化与否，从纤维蛋白原衍生的肽不抑制Y1的结合。来自PSGL-1的没 有硫酸化的肽不抑制Y1与glycocalicin结合。来自PSGL-1的所有 的硫酸化肽抑制Y1与glycocalicin结合。肽P-YYY*和P-YY*Y*是 最好的抑制剂，效力接着是P-Y*Y Y*，然后是P-YY*Y，然后是P- Y*Y*Y和P-Y*YY。来自glycocalicin的没有硫酸化的肽不抑制Y1 与glycocalicin结合，但是具有相同序列的在两个硫酸酯(G-Y*
Y*Y*)上被硫酸化的glycocalicin-衍生的肽确实抑制结合，效 力与P-Y Y*Y的类似。
因此，清楚的是，并不是每一种硫酸化肽都以相同的程度与scFv Y1结合。还有，明显地，这些结果证明，只有一个硫酸化酪氨酸对于 结合是必需的，这一点用肽P-Y*YY和P-YY Y*可以看到。此外，可以 看到硫酸化酪氨酸的氨基酸序列影响Y1结合。例如，P-Y*YY(在序列 EY*E中含有一个硫酸化酪氨酸)只在100μM下有效抑制结合。相反， P-YYY*(在序列DY*D中含有一个硫酸化酪氨酸)在1μM下有效抑制 结合。
表12：硫酸化肽 名称 肽的来源 序列  #  aa  MW 硫酸化 作用 F-YY 纤维蛋白原- γ-原型链 VRPEHPAETEYESLYPEDDL  20  2389 - F-Y*Y* 纤维蛋白原- γ-原型链 VRPEHPAETEY*ESLY*PEDD L  20  2549 硫酸化 P-YYY PSGL-1-n-末 端 QATEYEYLDYDFLPETE  17  2126 - P-Y*YY PSGL-1-n-末 端 QATEY*EYLDYDFLPETE  17  2206 硫酸化 P-Y* Y*Y PSGL-1-n-末 端 QATEY*EY*LDYDFLPETE  17  2286 硫酸化 P-Y*Y Y* PSGL-1-n-末 端 QATEY*EYLDY*DFLPETE  17  2286 硫酸化 P-Y Y*Y PSGL-1-n-末 端 QATEYEY*LDYDFLPETE  17  2286 硫酸化 P-Y Y*Y* PSGL-1-n-末 端 QATEYEY*LDY*DFLPETE  17  2286 硫酸化 P-YY Y* PSGL-1-n-末 端 QATEYEYLDY*DFLPETE  17  2286 硫酸化 G-YYY GPIbα GDEGDTDLYDYYPEEDTE  18  2126 - G-Y*Y*Y* GPIbα GDEGDTDLY*DY*Y*PEEDTE  18  2366 硫酸化
Y*＝硫酸化酪氨酸
假设/结论
(1)Y1类似识别硫酸化蛋白质和糖部分的L-选择蛋白，并且与 只识别硫酸化蛋白质的P-选择蛋白不同。因此，它能竞争两种蛋白质 的结合
(2)分化和细胞生长期间硫酸化作用的变化可以影响Y1结合。 因此，对于与它们的硫酸化配体的结合，Y1可以与P和L选择蛋白竞 争。
用于评价白血病特异性抗体的效能的体内模型
用免疫缺陷小鼠和测试系统创立两个人白血病模型。
使用的人细胞系是来自T细胞白血病患者的MOLT4细胞和来自 AML患者的KG-1细胞。使用每种细胞系上相关的人抗原特异性抗体 鉴定和定量测定恶性细胞移入。
T-ALL(MOLT4)模型
用于T-ALL的体内小鼠模型使用注射有来自T细胞白血病患者的 MOLT4细胞的SCID小鼠(Jackson Laboratories)。
在一个实施方案中，用100mg/kg环磷酰胺(CTX，注射用环磷酰胺， Mead Johnson)预处理SCID小鼠。CTX注射11天之后，对尾静脉静 脉内注射MOLT-4细胞。对照小鼠只注射PBS。注射MOLT-4之后一周 对小鼠注射CONY1-阿霉素，它是羧基末端具有KAK氨基酸残基的scFv CON Y1多肽和阿霉素之间通过短的有机连接基团的偶联物；CONY1，它 是从Y1 scFv衍生的scFv抗体片段，其中编码Y1的myc标记的DNA序 列缺失或者被编码氨基酸赖氨酸，丙氨酸，赖氨酸(KAK)的DNA序列 置换；或者游离的阿霉素。对小鼠每周注射三次，注射三周。对照小鼠 注射PBS；另一对照组不接受任何处理(表M)。
表13   小鼠编号     接种       处理     5     PBS  -     9     MOLT-4  -     9     MOLT-4  CONY-Dox(2.5mg/ml)     9     MOLT-4  CONY-Dox(2.5mg/ml)     8     MOLT-4  游离Dox(0.1mg/ml)
细胞接种之后32天，小鼠开始死亡，在此时杀死存活的小鼠。使 用抗-人CD44-FITC和Y1-生物素/SAV-PE通过流式细胞仪分析骨髓。 对来自几个动物的血样检查血小板和白细胞数目。将肝脏称重并且检 查是否出现肿瘤。也对其它肿瘤检查是否出现肿瘤。
图30，31和32给出结果。注射了MOLT-4细胞的所有的小鼠的肝 脏都发现大块肿瘤生长(白色小瘤)。但是，注射了MOLT-4和用CONY1 或CONY阿霉素偶联物处理过的小鼠的肝脏重量显著比注射了MOLT-4 和用游离的阿霉素处理过的或者没有处理的那些的肝脏中的肿瘤轻 (图30)。
骨髓中发现的MOLT-4细胞的百分比非常低(图31)。
总之，这些结果证明MOLT-4模型可以被用作白血病细胞肝转移的 有用的模型。
在第二个实施方案中，对SCID小鼠静脉内注射2×107MOLT-4细胞 /小鼠，用环磷酰胺后处理5天。从MOLT-4细胞注射后5天或者这之 前每周三次静脉内注射抗癌剂或PBS(阴性对照动物)。第35天，对 动物抽血，杀死动物，取出肝脏称重。在未治疗的，PBS-处理的MOLT-4 细胞携带动物中，肝脏出现非常多的肿瘤生长，相对OBS对照的没有感 染的动物，肿瘤大小增加2-3倍。在该项实验中，有五个处理小组：
1.PBS对照组，没有感染MOLT-4细胞
2.PBS-处理的MOLT-4对照组
3.MOLT-4组，用Y1 scFv(CONY 1)处理，75微克/小鼠
4.MOLT-4组，用CONY1 scFv-阿霉素处理，75微克/小鼠
MOLT-4组，用阿霉素处理，0.1mg/kg。
平行地，取出肝组织部分进行组织学检查并且收集细胞用于FACS 分析。记录相对于对照未治疗小鼠的另一组接受治疗的动物的成活 率。
图33给出第35天的肝脏重量。如图所示，感染肿瘤的小鼠的肝脏 大小几乎是相对于PBS对照物处理过的阴性对照PBS和没有注射 MOLT-4小鼠的三倍。接受低剂量阿霉素治疗的小鼠的肝脏重量类似于 PBS处理的感染肿瘤的小鼠。另一方面，CONY1 scFv和CONY1 scFv- 阿霉素偶联物治疗大大抑制肝脏中的肿瘤生长(肝脏重量低得多)。
在第三个实施方案中，使用相同的SCID/MOLT-4方案，有6组：
1.PBS对照组，没有感染MOLT-4细胞
2.PBS-处理的Molt对照组
3.Molt组，用CONY1 scFv处理，75微克/小鼠
4.Molt组，用来自Nissim I文库的非特异性scFv抗体处理， 75微克/小鼠(对照)
5.Molt组，用Y1-IgG处理，5微克/小鼠
6.MOLT-4组，用非特异性人-IgG处理，5微克/小鼠(对照)
图34中所示结果表明用CONY1 scFv或Y1 IgG处理都抑制肿瘤 生长(以肝脏重量为基础)，而在接受非特异性抗体分子处理的动物中 几乎没有或没有效果。
从接受连续治疗的三个组的小鼠评价成活率，图35给出结果。如 图所示，只有CONY1 scFv-处理小鼠的存活期延长了。
AML KG-1模型
用于人AML的体内小鼠模型使用接种了来自人AML细胞系的KG-1 细胞的SCID/NOD小鼠(Jackson Laboratories)。
在第一个实施方案中，用100mg/kg CYTOXAN预处理NOD/SCID 小鼠。CYTOXAN注射后4天，对六组小鼠的尾静脉静脉内注射KG-1 细胞(表N，第2和5-9组)。一组小鼠只注射PBS(对照)(表N，第 1组)。
从KG-1注射后19天开始，用下面的物质处理小鼠：CONY1，阿霉 素，CONY1-阿霉素偶联物，或Mylotarg。(Mylotarg是最近FDA 批准的用于治疗60岁AML患者和过了第一次复发的患者的与 calcheamicin化学偶联的单克隆抗体(抗CD33)。每周处理小鼠一次 或三次，治疗三周。一组(第2组)接种KG-1的小鼠没有接受治疗(表 N)。另两组小鼠(第3和4组)注射了先前在含有1％BSA的无血清RPMI 中与CONY1或181-scFv(负的，非特异性对照抗体)在4℃下温育1 小时的KG-1细胞。以0.25mg scFv/108细胞(75微克小鼠)的浓度使 用抗体。在对小鼠注射之前洗涤预温育的KG-1细胞并且悬浮于RPMI。 将RPMI中的KG-1细胞以每只小鼠75微克scFv/0.2ml RPMI的浓 度对小鼠接种。用KG-1+CONY1接种第3组小鼠，用KG-1+181-scFv 接种第4组小鼠(表N)。在第1-2和5-9组接种之后的第一天进行这 项处理(第3和4组)，即，CYTOXAN注射之后5天。
表14  小鼠编号   组号       接种 处理     9     1     PBS --     11     2     KG-1 --     9     3     KG-1+Y1 --     9     4     KG-1+181 --     8     5     KG-1 75微克/小鼠(2.5毫克/千克) CONY1，每周三次     9     6     KG-1 0.1毫克/千克阿霉素，每周三次     10     7     KG-1 5毫克/千克阿霉素，每周一次     11     8     KG-1 75微克/小鼠(2.5毫克/千克) CONY1-阿霉素，每周三次     9     9     KG-1 0.2毫克/千克Mylotarg，每 周一次
从细胞注射后60-65天杀死小鼠。使用小鼠抗人CD34 FITC(IQP 144F)(或者抗CD44-FITC(MCA89F，Serotec))和Y1-生物素/SAV-PE 通过流式细胞仪分析骨髓和血样。小鼠IgG1-FITC(IQP 191-F)被 用作同位型对照物，小鼠IgG2a-FITC(MCA929F，Serotec)被用作阴 性对照。使用FACSCalibur系统和CellQwest软件，Becton Dickinson进行流式细胞计数。
图Tab 6，第5和6页给出了结果。在处理开始之后三周内，用 5mg/kg游离阿霉素处理的10只KG-1细胞注射的小鼠(第7组)中有 9只死亡。
没有治疗的(第2组)注射有KG-1细胞的小鼠的骨髓在骨髓细胞 集落平均水平上含有大约30％KG-1细胞。这组中的所有的小鼠发生 了白血病。
总之，几乎所有的小鼠发生了白血病，骨髓中KG-1细胞含量大约 30％(根据FACS分析测定)。一般情况下，KG-1移入被限制在骨髓中。 在血液中发现KG-1细胞少于10％。在一例中在腹膜壁上观察到实体 肿瘤。
注射了KG-1细胞并且用0.1mg/kg游离阿霉素处理的小鼠(第6 组)与第2组相比，骨髓中KG-1细胞统计学意义(p＜0.05)百分比较 低。
注射了KG-1细胞并且用CONY1-阿霉素处理的小鼠(第5组)与第 2组相比，骨髓中KG-1细胞百分比较低(分别是16.3％对30.4％，)。 但是，发现这种差异不具有统计学意义。发现在实验中CONY1-阿霉素 被脂多糖(LPS)污染。因此，没有使用CONY1-阿霉素的最佳浓度，在实 验结束之前处理就终止了。
用体外与CONY1或181-scFv温育过的KG-1细胞注射的小鼠(分 别是第3和4组)其骨髓中KG-1细胞百分比显著地低。
只注射PBS(阴性对照)的小鼠和用KG-1细胞注射并且用 MylotargTM处理的小鼠(第9组)的骨髓都没有KG-1细胞。这些结果 证明这种体内模型是用于AML的有用的模型。
各个组的血液中发现KG-1细胞总的百分比总之都非常低，各组间 差异大。应该注意MylotargTM处理的一只小鼠证明血液中有相对高百 分比的KG-1细胞，但是在骨髓中则没有。
使用商售抗-人CD34或CD44抗体，平行使用Y1 scFv抗体，通 过FACS分析进行小鼠骨髓和血液中人白血病细胞(KG-1来源)鉴定。
在分析的第一天，与用CONY1-阿霉素处理的小鼠(第8组)相比， 骨髓中具有更高百分比的KG-1细胞的只注射KG-1的小鼠(第2组) 之间有显著差异。在分析的第三天，这种状况发生逆转：与第2组小 鼠相比较时，第8组的小鼠骨髓中有更高百分比的KG-1细胞。这种情 况是如下得出的：A)选择第一天生理状况恶化的小鼠，B)处理终止后 第8组的小鼠的KG-1细胞增殖，和C)各个组中小鼠数目太少不能产 生统计学意义结果。
进行另一个实验，其中用环磷酰胺处理后5天对SCID-NOD小鼠静 脉内注射3×104MOLT-4细胞/小鼠。从第14天以前每周三次静脉内注 射抗癌剂或PBS。在第60天，抽取血样并且杀死动物。提取骨髓并且 通过FACS分析进行分析，使用商售抗CD44抗体用于对小鼠骨髓检测 MOLT-4细胞的细胞增殖。
这项研究包括7组：
1.PBS对照组，没有感染MOLT-4细胞
2.PBS-处理的KG 1对照组
3.KG 1组，用CONY1 scFv处理，75微克/小鼠
4.KG 1组，用CONY I scFv-阿霉素处理，75微克/小鼠
5.KG 1组，用阿霉素处理，0.1mg/kg
6.KG 1组，用阿霉素处理，3mg/kg，每周一次
7.KG 1组，用MylotargTM处理，7微克/小鼠，每周一次 (MylotargTM是与化学治疗药物连接的抗体，并且是FDA-批准用于白 血病患者的)。
图38给出了这项研究的结果。如图所示，带有KG-1细胞的小鼠 骨髓中癌细胞最广泛存在。单独的CONY1 scFv对恶性肿瘤的产生没 有作用。Mylotarg完全抑制骨髓癌的发生。阿霉素，或者单独的，或 者以CONY1 scFv-阿霉素偶联物形式，都引起骨髓中肿瘤细胞数目减 少50％。
免疫抑制小鼠中CONY1的药代动力学
用125I-Bolton Hunter试剂(对赖氨酸)标记CONY 1 scFv。在4 ℃下在硼酸盐缓冲液(pH 9.2)中用125I-Bolton Hunter试剂进行标 记反应，然后在PD-10色谱柱上纯化125I-CONY1。然后将放射性蛋白质 与没有标记的CONY-1混合，得到盐水中含有2.5×106CPM/毫升的75 微克/毫升CONY-1的溶液。
通过以0.5ml/小鼠的剂量对雄性Balb-C小鼠腹膜内注射0.9％ NaI预处理小鼠。2小时之后，对小鼠静脉内注射0.2ml标记的 CONY-1溶液，每只小鼠125I-CONY-1剂量是15微克(5×105CPM)。
在注射之后的不同的时间，将血液收集到EDTA中，杀死小鼠，并 且切除组织。在注射之后5，15，和30分钟和1，2，4，8，和24小时取 样和器官。对于每个时间点使用2-4只小鼠。分离血浆并且测定γ放 射性或者用三氯乙酸(TCA)沉淀。离心之后，对TCA沉淀物进行γ放射 性测定。将肝脏，肺，肾，脾和骨髓样品称重并且计数γ放射性。血 浆TCA沉淀放射性对时间作图，并且设定两个隔间动力学模型。计算 器官/组织总的和特异性放射性值。图39，40和41给出了结果。
血液和血浆放射性值之比较表明实际上所有的CONY-1都存在于 血浆中并且不粘附红细胞。血浆放射性值类似于TCA沉淀物的那些， 表明它们与没有降解的蛋白质缔合。图39表明施药之后各个时间点血 浆中CONY-1水平。数值统计学上符合两隔间模型，并且获得的血液 清除率的半衰期分别是35和190分钟。
施药之后各个时间点不同组织中放射性分布分别以特异性和总的 放射性给出(图40和41)。在大多数组织中，没有特异性放射性积累， 这一点可以从特异性与血液的活性之比较证明。在4小时在肾中和在4 和8小时在骨髓中看到稍高的数值；这最可能与降解产物分泌有关。
结果表明小鼠分泌CONY-1，半衰期是35分钟。第二隔室分泌速 度重要性小并且可能是存在注射物质的某些聚合物形式的结果。体组 织中没有CONY-1主要的特异性吸收，除了骨髓中稍有增加。
抗体和片段的制备
可以在原核或真核表达系统中制备抗体，其片段，其构建体，肽， 多肽，蛋白质，及其片段和构建体。在原核和真核系统中制备抗体和 片段的方法是本领域公知的。
真核细胞系统，如本发明定义和讨论的，指通过遗传工程方法制备 肽或多肽的真核系统，其中宿主细胞是真核细胞。真核表达系统可以 是哺乳动物系统，哺乳动物表达系统中产生的肽或多肽，在纯化之后， 优选基本上没有哺乳动物污染物。有用的真核表达系统的其它例子包 括酵母表达系统。
用于制备本发明的肽或多肽的优选的原核系统使用大肠杆菌作为 表达载体的宿主。大肠杆菌系统中产生的肽或多肽，在纯化之后，基本 上没有大肠杆菌污染蛋白质。原核表达系统的使用可能导致对本发明 提供的序列的一些或全部的N-末端加甲硫氨酸残基。肽或多肽制备之 后去除N-末端甲硫氨酸残基，使得能进行肽或多肽的完全表达，这一 点是本领域公知的，一个例子是在适当的条件下使用气单胞菌属 (Aeromonas)氨基肽酶(美国专利No.5,763,215)。
抗体片段和构建体的类型
本发明提供了包括抗体或其抗原结合片段，其构建体，或片段的 构建体的肽或多肽。根据本发明的抗体包括IgG，IgA，IgD，IgE，或 IgM抗体。IgG类包括几个亚类，包括IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4。
根据本发明的抗体片段包括Fv，scFv，dsFv，Fab，Fab2，和Fd 分子。较小的抗体片段，例如Fv片段，都包括在术语″片段″中，只要 它们保持源抗体或较大片段的结合特性。这样的片段的例子可以是(1) 小型体，它只包括Fv重链的片段，(2)微型体，它包括抗体重链可 变区小的功能单位(PCT申请号No.PCT/IL99/00581)，(3)包括轻链 片段的类似体，和(4)包括轻链可变区功能单位的类似体。构建体包 括，例如多聚体，例如二聚体，三聚体，和四聚体。术语″抗体，其结 合片段，或者包括抗体或其结合片段的复合体″和″抗体或片段″意在 包括所有的这样的分子，以及其衍生物和同系物，模拟物，和变体，除 非另外具体说明或者另外根据说明书和/或公知常识证明。
一旦选择和/或开发具有期望的结合能力的抗体，片段，或构建体， 本领域技术人员就能够应用这里提供的指导制备保持源抗体特征的构 建体和片段。例如，能制备保持原来筛选或研发出的抗体，片段或构建 体期望的特征的完整抗体分子，Fv片段，Fab片段，Fab2片段，二 聚体，三聚体，及其它构建体。
如果期望取代氨基酸但是依然保留抗体或片段的特征，本领域技 术人员能进行保守氨基酸取代作用。也可以对抗体或片段进行修饰， 例如与药物或诊断试剂偶联，而不改变它们的结合特征。也可以对抗 体或片段进行其它修饰，例如产生更稳定抗体或片段而不改变它们的 特异性的那些修饰作用。例如，可以进行类胨修饰，半类胨修饰，环 肽修饰，N末端修饰，C末端修饰，肽键修饰，主链修饰，和残基修 饰。本领域技术人员还能够根据本发明说明书的指导测定修饰的抗体 或片段，评价它们的结合特征是否发生了改变。
同样，本领域技术人员根据这里提供的指导能改变抗体，片段， 或构建体的结合特征，获得具有更理想特征的分子。例如，一旦鉴定 了具有期望的性质的抗体，可以利用随机或定向诱变产生抗体的变体， 可以对那些变体筛选期望的特征。
根据本发明的抗体和片段还可以带有标记，可以连接或插入标 记，有助于制备和鉴定，和诊断。可以随后从分子上去除该标记。有用 的标记的例子包括：AU1，AU5，BTag，c-myc，FLAG，Glu-Glu，HA， His6，HSV，HTTPHH，IRS，KT3，Protein C，S-Tag，T7，V5，和 VSV-G(Jarvik和Telmer，Ann Rev.Gen.，32，601-618(1998))。 标记优选是c-myc。
多聚体抗体
本发明提供包括scFv分子的Y1或Y17肽或多肽。如这里使用的， scFv被定义为这样一种分子，其由人抗体的重链可变区和人抗体的轻 链可变区组成，这两个区可以是相同或不同的，其中重链可变区与轻链 可变区连接，键合，融合或共价连接，或缔合。
Y1和Y17 scFv构建体可以是scFv分子的多聚体(例如，二聚体， 三聚体，四聚体等)，它结合Y1或Y17抗体的一个或多个高变区。所 有的scFv衍生的构建体和片段保留增强的结合特征，这样从其它细胞 中选择性和/或特异性结合靶细胞。结合选择性和/或特异性主要由高 变区决定。
轻链和重链可变区中高变环称作互补决定区(CDR)。各条重链和轻 链中有CDR1，CDR2和CDR3区。这些区中最可变的是重链CDR3区。 CDR3区被理解是Ig分子最暴露的区，如图所示，这里提供的是主要负 责观察到的选择性和/或特异结合特征的位点。
本发明的Y1和Y17肽能构建折叠成多价Fv形式。构建Y1和 Y17多聚体形式，提高结合亲和性和特异性并且延长血液半衰期。
其他人合成出了scFv的多价形式。一个方案是用接头连接两个 scFvs。另一个方案包括使用两个scFvs之间的二硫键键合。Holliger 等，PNAS，90，6444-6448(1993)和A.Kortt，等，Protein Eng.， 10，423-433(1997)报道了制备二聚体或三聚体Fv的最简单的方案。 设计一种制备scFvs二聚体的这样的方法，加入FOS和JUN蛋白质区 的序列，在它们之间在scFv的C-末端形成亮氨酸链。Kostelny SA 等，J Immunol.1992年3月1日；148(5)：1547-53；De Kruif J 等，J Biol Chem.1996年3月29日；271(13)：7630-4。设计另 一种方法制备四聚体，在scFv的C-末端加链霉抗生物素蛋白编码序 列。链霉抗生物素蛋白由4个亚基组成，当scFv链霉抗生物素蛋白发 生折叠时，4个亚基自我调整形成四聚体。Kipriyanov SM等，人抗 体杂交瘤(Hum Antibodies Hybridomas)，1995；6(3)：93-101。 在另一个方法中，为了制备二聚体，三聚体和四聚体，在感兴趣的蛋 白质中导入自由的半胱氨酸。使用带有不同数目(2-4)的马来酰亚胺 基团的肽交联剂使感兴趣的蛋白质与自由的半胱氨酸交联。Cochran JR等，Immunity，2000年3月；12(3)：241-50。
在这个系统中，设计噬菌体文库(如上文所述)展示scFvs，其能 折叠成抗体的Fv区一价形式。此外，也如上所述，该构建体适合细菌 表达。遗传工程scFvs包括通过连续编码的15个氨基酸柔顺肽间隔 基团连接在一起的重链和轻链可变区。优选的间隔基团是(Gly4Ser)3。 这种间隔基团的长度，以及其氨基酸取代基提高不大的间隔基团，它使 得VH和VL区折叠成功能Fv结构域，提供与它的靶物的有效结合。
本发明涉及通过本领域任何公知的方法制备的Y1和Y17多聚 体。形成多聚体特别是二聚体的优选的方法，应用利用半胱氨酸在两 个单体之间形成二硫键。在该实施方案中，为了有利于二聚体形成， 在scFvs的羧基末端加上一个半胱氨酸，形成二聚体(称之为Y1-cys scFv或Y1二聚体)。制备了DNA构建体(参见实施例2D和6D)并用 于转染之后，在制备载体中表达Y1二聚体并且体外重折叠。通过 SDS-PAGE，HPLC，和FACS分析蛋白质。但是，这些初次尝试中没有一 个指出形成二聚体。因此，重复该方法，并且这一次，实现抗体的2升 发酵批量。再大肠杆菌菌株BL21中表达Y1-cys之后，在精氨酸中进 行重折叠。重折叠之后，将蛋白质透析并且通过Q-琼脂糖凝胶和凝胶 过滤(sephadex 75)纯化。通过SDS-PAGE(非还原)并且通过凝胶过 滤检测到两个峰。分别收集各个峰并且通过FACS分析。通过FACS检 查与Jurkat细胞结合的单体和二聚体。结合二聚体只需要1/100量的 单体抗体用于相同水平的染色，表明二聚体具有更大的抗体亲抗原 性。确定二聚体重折叠的条件，接着透析，色谱，和凝胶过滤步骤之 后产生含有＞90％二聚体(mg量)的物质。通过凝胶过滤和通过氧化 条件下的SDS-PAGE分析表征纯化的二聚体。通过放射受体测定， ELISA，和FACS分析证实二聚体的结合能力。
为了比较scFv单体(也称作CONY1)与Y1二聚体的结合，体外对 KG-1细胞进行结合竞争实验。另外，这些实验也比较了完整Y1 IgG与 scFv Y1单体的结合。为了进行这项研究，用生物素标记Y1 IgG。 这项研究表明Y1 IgG与IgG Y1-生物素竞争。不相关的人IgG不与 标记的Y1 IgG竞争。Y1 scFvs(5微克和10微克)与Y1 IgG生物 素(50ng)部分竞争。这项研究还表明1ng的IgGY1-FITC与KG-1细胞 (没有血清)键合的程度和1微克的Y1 scFv-FITC程度一样，但是在 血清存在下，这种结合大多数被阻断。这些研究还表明，根据放射受体 测定，ELISA，和FACS分析，Y1二聚体的结合至少比Y1 scFv单体 高20-倍。
在另一个实施方案中，除了在羧基末端加半胱氨酸之外还加入赖 氨酸-丙氨酸-赖氨酸(称作Y1-cys-kak scFv)。这种scFv构建体的 氨基酸序列下面复制并且也是SEQ ID NO：212。
1 MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ
APGKGLEWVS GINWNGGSTG 60
61 YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARM
RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG 120
121 SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY
YASWYQQKPG QAPVLVIYGK 180
181 NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR
DSSGNHVVFG GGTKLTVLGG 240
241 GGCKAK
在细菌中在λ-pL载体中产生Y1-cys-kak。通过将温度提高至 42℃诱导λ-pL载体中的表达。从诱导的培养物获得包涵体，并且通 过水溶液半纯化，去除不期望的溶解性蛋白质。包涵体溶解于胍，用 DTE还原，以精氨酸/ox-谷胱甘肽为基础在溶液中体外重折叠。重折 叠之后，将蛋白质透析并且通过正切流动过滤到含有脲/磷酸盐缓冲液 的缓冲液中浓缩。再次纯化蛋白质并且通过在SP-柱子中离子色谱浓 缩。
通过SDS-PAGE电泳，凝胶过滤色谱，ELISA，放射受体结合，和 FACS表征二聚体。二聚体的表观亲和性高于单体，由于抗体亲抗原性 作用。通过对glycocalicin的ELISA，对KG-1细胞的FACS，和放射 受体测试中的竞争，证实了该作用。
进行HPLC分析重折叠并且从Superdex 75凝胶过滤柱子上纯化 之后的二聚体。再图42中，Y1-cys-kak(二聚体)是左侧第一个峰(约 10.8分钟)并且接下来的峰是单体(约12分钟)。根据在相同的柱 子上对蛋白质大小标记物电泳得知，二聚体大约是52kDa，单体是 26kDa。通过改变重折叠条件(重折叠缓冲液中氧化剂浓度和蛋白质浓 度)能改变二聚体和单体之间的平衡。在superdex 75柱子上通过层 析来分离二聚体和单体。
在图43中，给出的凝胶有混合的二聚体和单体。在还原形式中， 由于两种单体之间的还原作用而可见到单体，在非还原形式中，可见 到两种物质(和在凝胶过滤实验种一样)，大约30kDa的单体级分和 大约60kDa的二聚体。
进行ELISA分析，确定单体(tY1 scFv-也已知是Y1-kak)和二 聚体Y1-cys-kak(半胱氨酸二聚体)对于来自血小板的抗原GPIb (glycocalicin)的结合之间的差异。使用多克隆抗单一链抗体和/或 新的多克隆抗-VL(来自兔)和抗-兔HRP，来测定与GPIb的结合。二 聚体活性比单体活性高大约100倍。例如，为了达到0.8OD单位， 使用12.8微克/毫升的单体比较只有0.1微克/毫升的二聚体。参见 兔19。
另外，对KG-1细胞的FACS结合分析表明当进行两步或三步结合 测试时，二聚体比单体更灵敏。直接用FITC标记的二聚体表现出比单 体稍好(使用少于10倍的材料)。使用二聚体作为竞争剂，对KG-1细 胞的放射受体测试表明二聚体比单体更有效30x倍。
改变间隔基团的长度也是另一个优选的形成二聚体，三聚体，和 四聚体(本领域经常分别称作二聚体，三聚体和四聚体)的方法。在 连接scFv的两个可变链的间隔基团缩短至一般5-12个氨基酸残基这 样的条件下形成二聚体。这种缩短的间隔基团阻止两个可变链从相同 的分子折叠成功能Fv结构域。取而代之的是，使结构域与另一个分 子的互补结构域配对，产生两个结合结构域。在优选的方法中，使用 只有5个氨基酸的间隔基团(Gly4Ser)构建二聚体。从两个相同的 scFvs，或者从两个不同的scFvs能形成这种二聚体，并且保持母体 scFv(s)的选择性和/或特异性增强的结合活性，和/或表现出增强的 结合强度或亲和性。
以相似的方式，在连接scFv的两个可变链的间隔基团缩短至一般 少于5个氨基酸残基这样的条件下形成三聚体，这样的条件阻止两个 可变链从相同的分子折叠成功能Fv结构域。取而代之的是，三个分 开的scFv分子缔合成三聚体。在优选的方法中，通过完全去除这种柔 顺间隔基团而获得三聚体。从三个相同的scFvs，或者从两个或三个 不同的scFvs能形成这种三聚体，并且保持母体scFv(s)的选择性和 /或特异性增强的结合活性，和/或表现出增强的结合强度或亲和性。
类似地，在连接scFv的两个可变链的间隔基团缩短至一般少于5 个氨基酸残基这样的条件下形成四聚体，这样的条件阻止两个可变链 从相同的分子折叠成功能Fv结构域。取而代之的是，四个分开的scFv 分子缔合成四聚体。从四个相同的scFvs，或者从1-4个来自不同的 scFvs的单元能形成这种四聚体，并且保持母体scFv(s)的选择性和 /或特异性增强的结合活性，和/或表现出增强的结合强度或亲和性。
在间隔基团一般少于5个氨基酸残基长这样的条件下形成三聚体 还是四聚体取决于混合物和反应条件下特定scFv(s)的氨基酸序列。
在优选的方法中，通过生物素/链霉抗生物素蛋白缔合形成四聚 体。产生能用生物素酶学标记的新的发酵构建体(这里称作Y1-生物标 记或Y1-B)。在Y1 C-末端加有BirA酶底物的序列。BirA酶将生物 素加给序列中的赖氨酸残基。Y1-生物标记在大肠杆菌中表达。分离包 涵体材料并且重折叠。折叠的蛋白质的纯度＞95％，并且从1-升培养 物获得＞100mg(小规模，没有使条件最佳化)。根据HPLC，SDS-PAGE， 和质谱，发现这种形式的分子量与scFv类似。发现Y1-生物标记是用 于FACS分析的最适当的试剂。但是，当在血清的存在下检查Y1-生物 标记与KG-1细胞的结合时，与不存在血清时的结合相比较需要高浓度 (10倍以上)。虽然如此，这种构建体为其中分子的结合位点保持完整 的特异性生物素化作用提供了好处。此外，只用一个生物素标记各个分 子--每个分子在羧基末端接受一个生物素。
在期望的位置限制性标记一个生物素/分子使得产生带有链霉抗 生物素蛋白的四聚体。通过温育Y1-B和链霉抗生物素蛋白-PE形成 四聚体。
FACS分析表明Y1-生物标记和链霉抗生物素蛋白-PE制备成的四 聚体比Y1 scFv单体灵敏100至1000倍。带有链霉抗生物素蛋白- PE的Y1-生物标记四聚体表现出与Y1-反应细胞系之一(KG-1)特异性 结合。由于结合背景，该反应的差异非常大，并且提供高灵敏性来检测 低量受体。使用Y1 BSAV四聚体对正常全血进行FACS评价表明不存 在高反应性物质。单核细胞和粒细胞在小程度上是阳性的。在其中存 在阳性结果的细胞系中，例如KG-1细胞，四聚体反应性高至少100- 倍。
然后，四聚体与细胞样品培养。低剂量Y1四聚体(5ng)很好地 结合细胞系(KG-1)，比先前用其它Y1抗体形式所观察到的响应高10至 20-倍。当用不同剂量的四聚体检查阴性细胞系时观察到次要反应。
用于诊断和制药用途的偶联物
本发明的抗体及其结合片段能与各种药物试剂例如药物，毒素， 和放射性同位素缔合，混合，融合或连接，任选地，含有药学有效载体， 形成具有抗疾病和/或抗癌活性的药物-肽组合物，融合体或偶联物。 这样的偶联物和融合体也可以用于诊断目的。
本发明中有用的载体的例子包括葡聚糖，HPMA(亲脂性聚合物) 或者任何其它聚合物。或者，使用修饰性脂质体，例如用scFv Y1分 子修饰的脂质体，例如Doxil，一种商售的含有大量阿霉素的脂质体。 可以制备这样的脂质体，含有一种或多种期望的药物试剂，和与本发 明的抗体混合，提供高比例药物与抗体之比。
或者，抗体或其片段和药物试剂之间的连接可以是直接连接。通过 分子元件之间或元件组之间的化学键合可以产生两个或多个相邻分子 之间的直接连接。化学建可以是例如离子键，共价键，疏水键，亲水键， 静电键或氢键。键可以是例如胺，羧酸，酰胺，羟基，肽和/或二硫键。 直接连接优选是蛋白酶抗性键。
肽和药物试剂之间的，或者肽和载体之间的，或者载体和药物试 剂之间的连接可以通过接头化合物。如这里在说明书和权利要求书中 使用的，接头化合物被定义为将两个或多个部分连接的一起的化合 物。接头可以是直链或支链的。支链接头化合物可以由双支链，三支 链，或四支链或者更多支链的化合物组成。本发明中使用的接头化合 物包括选自二元羧酸，马来酰亚胺酰肼，PDPH，羧酸酰肼，和小肽的那 些。
根据本发明有用的接头化合物的更具体的例子包括：
a.二元羧酸，例如琥珀酸，戊二酸，和己二酸；
b.马来酰亚胺酰肼，例如N-[-马来酰亚胺己酸]酰肼，4-[N- 马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基酰肼，和N-[-马来酰亚胺十一酸]酰 肼；
c.PDPH接头，例如与sulfurhydryl反应蛋白质偶联的(3-[2- 吡啶基二硫基]丙酰基酰肼)；和
d.选自2-5个碳原子的羧酸酰肼。
通过使用小肽接头直接偶联的连接也是有用的。例如，使用小肽 可以实现例如抗癌剂阿霉素的游离糖基和scFv之间的直接偶联。小肽 的例子包括AU1，AU5，BTag，c-myc，FLAG，Glu-Glu，HA，His6，HSV， HTTPHH，IRS，KT3，Protein C，S-Tag，T7，V5，和VSV-G。
本发明的抗体及其片段可以与成像剂(也称作指示标记)，例如 放射性同位素键合，偶联，复合或者缔合，这些偶联物可以用于诊断 和成像目的。提供了包括这样的放射性同位素-抗体(或片段)偶联物 的试剂盒。
用于诊断的放射性同位素的例子包括111铟，113铟，99m铼，105铼， 101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲，165铥，167铥，168铥，123碘，126碘 ，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇，213铋，77溴，18氟，95钌，97钌，103钌， 105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。优选的放射性同位素对是X-射线或顺 磁性离子不透明的。
指示标记分子也可以是荧光标记分子。荧光标记分子的例子包括 荧光素，藻红蛋白，或罗丹明，或者其修饰物或偶联物。
可以将与指示标记物偶联的抗体或片段用来诊断或检测疾病状 态。这样的监测可以体内，体外，离体进行。体内或离体进行监测或 诊断时，成像剂优选是生理可接受的，因为不对患者损伤至不可接受的 水平。医生应用象疾病的严重程度及其它选项的有效性这样的标准可 以确定损伤的可接受水平。
本发明提供在治疗之前，期间和之后用于体外分析治疗效力的诊 断试剂盒，包括包括与指示标记分子连接的本发明的肽的成像剂，或成 像剂。本发明进一步提供使用用于对癌症，更具体地，对肿瘤诊断定 位和成像的成像剂的方法，包括下面的步骤：
a)使细胞接触组合物，
b)测定与细胞结合的放射性，并且因此
c)目测肿瘤。
合适的成像剂的例子包括荧光染料，例如FITC，PE，等，和荧光 蛋白质，例如绿色荧光蛋白质。
其它例子包括放射性分子和与底物反应产生可识别的变化例如颜 色变化的酶。
在一个实施例中，试剂盒的成像剂是荧光染料，例如FITC，试剂 盒提供对癌症治疗功效的分析，更具体的是与血液相关的癌症，例如， 白血病，淋巴瘤和骨髓瘤。利用FACS分析来测定成像剂染色的细胞的 百分比。和疾病的各个阶段染色的强度，例如，诊断时，治疗期间，减 轻期间和复发期间。
本发明的抗体及其片段可以与下面的物质键合，偶联，或缔合： 抗癌剂，抗白血病剂，抗病毒剂，抗转移剂，抗炎剂，抗血栓形成剂， 抗再狭窄剂，抗聚集作用剂，抗自身免疫剂，抗粘附剂，抗心血管疾病 药物，或者其它抗疾病剂或药物试剂。药物试剂指用于哺乳动物预防 性处理或诊断的试剂，所述哺乳动物包括但不限于人，牛，马，猪，鼠， 狗，猫，或者其它温血动物。
这样的药物试剂的例子包括但不限于阿昔洛韦，更昔洛韦和齐多 夫定；抗血栓形成/抗再狭窄药物，包括西洛他唑，达肝素钠，瑞维肝 素钠，和阿司匹林；抗炎剂，包括扎托洛芬，普拉洛芬，朵昔康，乙酰 水杨酸17，双氯酚酸钠，布洛芬，右布洛芬，舒林酸，萘普生，氨托 美丁，塞利克西，消炎痛，罗非克西，和尼美舒利；抗自身免疫剂， 包括来氟米特，denileulcin diftitox，subreum，WinRho SDF，去 纤苷，和环磷酰胺；和抗粘附/抗聚集作用剂，包括利脉前列素，氯克 罗孟，和透明质酸。
其它例示的药物制剂包括阿霉素，甲氧基吗啉基阿霉素(吗啉代阿 霉素)，阿得里亚霉素，顺铂，紫杉醇，加利车霉素，长春新碱，阿糖 孢苷(Ara-C)，环磷酰胺，强的松，柔红霉素，去甲氧柔红霉素，氟达 拉滨，瘤可宁，α干扰素，羟基脲，替莫唑胺，沙利度胺和博莱霉素， 及其衍生物和组合物。
抗癌剂是具有抗癌活性的物质。例如，抗癌剂包括抑制或停止癌 细胞或未成熟癌变前细胞的药物，杀死癌细胞或癌变前细胞的药物，提 高癌细胞或癌变病前细胞对其它抗癌病药物易感性的药物，和抑制癌 细胞转移的药物。在本发明中，抗癌剂还可以是具有预防，抑制，阻 止或停止肿瘤血管形成的抗生血管活性的药物。
对癌细胞生长的抑制作用包括，例如，(i)阻止癌生长或转移生 长，(ii)延缓癌生长或转移生长，(iii)完全阻止癌细胞生长过程或 转移过程，同时保持细胞完整和存活，或者(iv)杀死癌细胞。
抗白血病剂是具有抗白血病活性的物质。例如，抗白血病剂包括 抑制或停止白血病细胞或未成熟白血病前细胞的药物，杀死白血病细 胞或白血病前细胞的药物，提高白血病细胞或白血病前细胞对其它抗 白血病剂易感性的药物，和抑制白血病细胞转移的药物。在本发明中， 抗白血病剂还可以是具有预防，抑制，阻止或停止肿瘤血管形成的抗 生血管活性的药物。
对白血病细胞生长的抑制作用包括，例如，(i)阻止白血病生长 或转移生长，(ii)延缓白血病生长或转移生长，(iii)完全阻止白血 病细胞生长过程或转移过程，同时保持细胞完整和存活，或者(iv)杀死 白血病细胞。
本发明的抗体和片段可以有用地与之连接的抗疾病剂，抗癌剂， 和抗白血病剂的例子包括毒素，放射性同位素和药物。
毒素的例子包括gelonin，假单胞菌外毒素(PE)，PE40，PE 38，白 喉毒素，蓖麻毒，或者其修饰物或衍生物。
放射性同位素的例子包括可以用于定位和/或治疗的γ-发射体， 正电子-发射体，和x-射线发射体和可以用于治疗的β-发射体和α- 发射体。
治疗性放射性同位素的更具体的例子包括111铟，113铟，99m铼， 105铼，101铼，99m锝，121m碲，122m碲，125m碲，165铥，167铥，168铥，123碘， 126碘，131碘，133碘，81m氪，33氙，90钇，213铋，77溴，18氟，95钌，97钌， 103钌，105钌，107汞，203汞，67镓和68镓。
抗癌或抗白血病剂试剂的非限制性例子包括阿霉素，阿得里亚霉 素，顺铂，紫杉醇，加利车霉素，长春新碱，阿糖孢苷(Ara-C)，环磷 酰胺，强的松，柔红霉素，去甲氧柔红霉素，氟达拉滨，瘤可宁，α 干扰素，羟基脲，替莫唑胺，沙利度胺和博莱霉素，及其衍生物和组 合物。
药物组合物
通过任何适合的方法可以对需它的患者施用本发明的抗体，构建 体，偶联物，和片段。例示的方法包括静脉内，肌内，皮下，局部，气 管内，鞘内，腹膜内，眼内，鼻内，舌下，口部，直肠，阴道，呼吸道， 口腔，真皮内，脑内或胸膜内给药。
对于静脉内给药，优选这样制备制剂使得对患者的施用量是大约 0.1mg至大约1000mg期望的组合物的有效量。更优选地，施用的量 在大约1mg至大约500mg期望的组合物的范围内。本发明的组合物 在宽的剂量范围内都有效，并且取决于下面的因素，例如要治疗的疾病 的特殊性，以肽或多肽为基础的药物组合物在患者体内的半衰期，药物 试剂和药物组合物的物理和化学特性，药物组合物的给药方式，要治疗 或诊断的患者的特殊性，以及治疗医生认为是重要的其它参数。
用于口服的药物组合物可以是任何合适的形式。例子包括片剂，液 体，乳剂，混悬液，糖浆，丸剂，小香囊，和胶囊剂。制备药物组合 物的方法是本领域公知的。参见，例如，Remington，The Science and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro(编著)Lippincott， Williams & Wilkins(pub)。
也可以这样配制药物组合物，使得有利于定时，持续，脉冲式， 或者连续释放。也可以在一个装置中施用药物组合物，例如一种定时， 持续，脉冲式，或者连续释放装置。
局部给药的药物组合物可以是任何适合的形式，例如乳油，软膏， 洗剂，贴，溶液，混悬液，和凝胶。
含有本发明的抗体，构建体，偶联物，和片段的组合物可以含有 常规药学可接受稀释剂，赋形剂，载体，等等。片剂，丸剂，小香囊 (caplets)和胶囊可以含有常规赋形剂，例如乳糖，淀粉和硬脂酸 镁。栓剂可以含有赋形剂例如蜡和甘油。注射液含有灭菌无热原介质， 例如盐水，并且可以含有缓冲剂，稳定剂或防腐剂。可以使用常规的 肠衣。
实施例
给出下面的实施例有助于理解但不是要也不应该认为是在任何方 面限制本发明的范围。虽然描述了具体试剂和反应条件，能进行本发 明范围意义所包括的修饰。因此提供下面的实施例进一步详细说明本 发明。
实施例1：血小板的制备
从血库获得血小板的柠檬酸葡萄糖(ACD)浓液，分离血小板，在以1∶ 7的比例含有ACD和盐水的缓冲液中洗涤一次。每次洗涤之后以800g 将血小板离心10分钟，并且重新悬浮于蒂罗德溶液(2mM MgCl2，137 mM NaCl，2.68mM KCl，3mM NaH2PO4，0.1％葡萄糖，5mM Hepes 和0.35％albumin白蛋白，pH 7.35)并且计数细胞数。
富血小板血浆的制备
将血液收集到盛有3.8％柠檬酸钠的试管中。以250xg离心10 分钟制备富血小板血浆。
实施例2：血小板凝集作用
对于血小板凝集作用的研究，在全血Lumiaggregometer (Chronolog，Havertown，PA)中将富集血小板的血浆(PRP)和洗涤过 的血小板在37℃下以500rpm搅拌。穿过血小板悬浮液和悬浮的介质 的光透射差异定为100％凝集作用。通过在加入激动剂之前加入不同浓 度的Y1来评价YI对血小板凝集的影响，并且记录该作用4分钟。
实施例3：用内切蛋白酶处理血小板
3.1  Mocarhagin对血小板的切割
对于mocarhagin消化，在22℃下，用12微克/毫升mocarhagin (终浓度)将含有1mM氯化钙的TS缓冲液(0.01M Tris，0.15M氯 化钠，pH 7.4)中的108洗涤过的血小板处理1小时，并且通过加入EDTA 达到0.01M来终止消化。
3.2 组织蛋白酶G对glycocalicin切割
含有1mM氯化钙的TS缓冲液中的108洗涤过的血小板与1.8微 克/毫升组织蛋白酶G(终浓度)在22℃下温育4小时，并且通过加入 PMSF至1mM终止消化。
3.3  O-唾液酸糖蛋白内切酶对glycocalicin的切割
在37℃下，含有0.2％白蛋白和蛋白酶抑制剂(10μM亮抑蛋白 酶肽，0.24mM PMSF)中106血小板和0.14mg/ml O-唾液酸糖蛋白 内切酶(终浓度)温育45分钟，并且通过加入样品缓冲剂并且沸腾来 终止消化。使用的样品缓冲剂含有3％SDS，12％甘油，50mM TrisHCl， 2％(3-巯基乙醇，和0.03％溴酚蓝。
实施例4：内切酶对Glycocalicin的切割
Mocarhagin对Glycocalicin的切割
对于mocarhagin消化，含有1mM氯化钙的TS缓冲剂中的 glycocalicin与10微克/毫升mocarhagin(终浓度)在22℃下温育 1小时，并且通过加入EDTA达到0.01M来终止消化。
组织蛋白酶G对glycocalicin的切割
对于组织蛋白酶G消化，含有1mM氯化钙的TS缓冲剂中的 glycocalicin与3.4微克/毫升组织蛋白酶G(终浓度)在22℃下温 育4小时，并且通过加入PMSF达到1mM来终止消化。
O-唾液酸糖蛋白内切酶对glycocalicin的切割
在37℃下，0.05M Tris缓冲剂pH 7.4中Glycocalicin和1.2 mg/ml O-唾液酸糖蛋白内切酶(终浓度)温育15分钟，并且通过加入 样品缓冲剂(如实施例3所述(YH))并且沸腾来终止消化。
实施例5：全长Y1 IgG的构建
全长IgG分子具有比Fv型好的几个优点，包括更长的体内半衰期 和减小体内细胞响应的可能性，例如ADCC或CDC介导的那些(补体依 赖性细胞毒性；Tomlinson，免疫学最新趋势(Current Opinions of Immunology)，5，83-89(1993))。通过下面描述的分子克隆方法， 我们已经将Y1 Fv区转化到完全大小的IgG1分子中。Y1-IgG1构建通 过以下面的顺序彼此连接的cDNA连接片段来完成：图48给出了Y1- IgG重链和轻链的序列。给出了Y1-HC核苷酸序列的可读框(ORF)(SEQ ID NO：205)，Y1-HC的氨基酸序列(SEQ ID NO：206)，Y1-LC核苷 酸序列的ORF(SEQ ID NO：207)，Y1-LC的氨基酸序列(SEQ ID NO： 208)。
与哺乳动物表达系统相容的前导序列：
设计使容易插入全IgG分子必需的元件的可替换系统。合成下面 的编码推导的前导序列的值得称赞的双链寡核苷酸，退火，并且连接到 哺乳动物表达载体的XhoI位点(SRα5启动子调控下)。
5’-TCGACCTCATCACCATGGCCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCA GGACACAGGGTCCTGGGCCGAT
和
5’-GATCGATTGCACCAGCTGGATATCGGCCCAGGACCCTGTGTCCTGAGTGAG GAGGGTGAGGAGCAGCAGAGCCCAGGCCATGGTGATGAGG
起始密码子ATG的上游，包括两个Kozak元件。另外，在前导序列 推导的切割位点和XhoI位点之间导入内EcoRV位点，使亚克隆可变 区。这种修饰的载体指定为pBJ-3。
在前导序列和轻链恒定区-编码序列之间插入从Y1 scFv cDNA序 列衍生的VL编码序列。类似地，在前导序列和重链恒定区-编码序列 之间插入从Y1 scFv cDNA序列衍生的VL编码序列。这通过编码源 Y1的载体pHEN-Y1的PCR扩增来实现，分别获得VL和VH区。
寡核苷酸
5′-TTTGATATCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA(有义)和5′- GCTGACCTAGGACGGTCAGCTTGGT(反义)被用于VLPCR反应。纯化预期 大小大约350bp的cDNA产物，测序并且用EcoRV和AvrII限制性内 切酶消化。相同的程序用于扩增和纯化VH cDNA区，分别使用有义和 反义寡核苷酸
5′-GGGATATCCAGCTG(C/G)(A/T)GGAGTCGGGC
和
5′-GGACTCGAGACGGTGACCAGGGTACCTTG。
恒定区：分别如下合成从IgG1 cDNA衍生的λ3(CL-λ3)恒定区 和恒定重链区CH1-CH3：
对于CL-λ3恒定区，使用有义5′-CCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGC 和反义
5′-TTTGCGGCCGCTCATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGT寡核苷酸，在 从正常外周B-细胞(CD19+细胞)库中提取的mRNA上进行。纯化预期 大小(大约400bp)的PCR产物，测序，并且用AvrII和NotI限制性 内切酶消化。
对于IgG1恒定区(γ链)，对于PCR扩增选择BTG不灭化人B细 胞克隆(CMV克隆#40)。证明该克隆分泌抗人CMV IgG1，并且在体外 试验中还证明诱导ADCC相应。对于CH1-CH3 cDNA，合成寡核苷酸
5′-ACCGCTCGAGTGC(T/C)TCCACCAAGGGCCCATC(G/C)GTCTTC(有 义)
和
5′-TTTGCGGCCGCTCATTTACCC(A/G)GAGACAGGGAGAGGCT(反义)并 且用于PCR扩增。和对于CL cDNA编码序列描述的一样，纯化预期大 小(大约1500bp)的PCR产物，测序，并且用AvrII和NotI限制性内 切酶消化。
对于最终表达载体，使用EcoRV-NotI预消化pBJ-3载体， EcoRV-AvrII可变区cDNAs和AvrII-NotI恒定区进行三联连接程序。 分别将pBJ-Y1-HC和pBJ-Y1-LC指定为重链和轻链表达的最终载体。
以pBJ-Y1-LC为基础构建另外一个载体，pBJ-Y1-LP，使得以嘌呤 霉素抗性基因(PAC)为基础二次选择。在这个载体中，编码PAC基因的 大约1600bp片段(来自pMCC-ZP载体)置换了pBJ-Y1-LC质粒的新霉 素抗性基因。
SEQ IDNOS.205-208给出了Y1-HC和Y1-LC的可读框(ORF)和 它们编码的氨基酸序列。
下划线是前导序列。粗体是氨基酸序列的VH和VL区，接着是 IgG1(对于重链)或λ3(对于轻链)恒定区序列。
Y1重链和轻链在CHO细胞中的表达
载体pBJ-Y1-HC和pBJ-Y1-LC分别用于表达重链和轻链的稳定细 胞的转染和筛选。对G418和细胞生长筛选之后，通过如下所述的捕获 EIA分析和通过蛋白质印迹分析对上清液中分泌的蛋白质分析IgG1表 达：
捕获EIA分析：用小鼠抗人IgG1 Fc(Sigma)预先包被96孔板的 孔。向孔中加入上面获得的上清液，用生物素化山羊抗-γ链特异性 抗体(Sigma)，链霉抗生物素蛋白-HRP和底物检测重链IgG1的存在。 ELISA平板读数器监测A405颜色的出现。
蛋白质印迹分析：上面细胞的上清液在12.5％SDS-PAGE上进行 电泳。用(a)用于重链检测的山羊抗-人血清IgG HRP(H+L；Sigma Cat #A8667)和(b)用于轻链检测的生物素化山羊抗-人血清λ3链 (Southern Biotechnology Association，Cat #2070-08)检测各条 链的表达。
上面测试证实两条链的表达，并且进行共同转染，获得完全大小的 Y1-IgG1。
IgG-Y1的表达和纯化
细胞培养和转染：37℃下5％CO2气氛中在含有10％胎牛血清和 40微克/毫升庆大霉素的F-12培养基中培养CHO-细胞。转染之前的一 天在90mm培养皿上接种0.8-1×106细胞。通过FuGene(Roche)转染 试剂技术用10微克轻链和重链DNA共同转染培养物。在非选择性培养 基中生长2天之后，在含有550微克/ml新霉素和3微克/ml嘌呤霉 素的F-12培养基中将细胞培养10-12天。使细胞受到胰蛋白酶作用 并且通过在Costar 96-孔板中0.5细胞/孔限制性稀释来克隆。取各 菌落，接种在6孔培养皿中并且转移到烧瓶中。
重链和轻链分泌的测定：利用夹心ELISA检测来测定分泌到转染 的CHO细胞上清液中的抗体的浓度。为了测定抗体浓度，使用下面的试 剂：单克隆抗人IgG1(Fc)(Sigma)为包被抗体，山羊抗人IgG(γ-链 特异性)生物素偶联物为检测剂(Sigma)，和纯人IgG1，λ(Sigma)为标 准物。以这项ELISA测试为基础，产率在3-4微克/ml之间。
从细胞制备和纯化Mab：细胞在摇瓶中生长至每瓶培养基中1- 2×108细胞的终浓度，培养基是含有10％胎牛血清，补充有新霉素和嘌 呤霉素的F-12培养基。对于生产，在含有2％胎牛血清的相同的培养 基中又培养细胞两天。
在蛋白质G-琼脂糖柱(Pharmacia)上纯化分泌的抗体。在20mM磷 酸钠缓冲剂，pH 7.0中结合；用0.1M甘氨酸缓冲剂，pH 2.5-3.0 进行洗脱。通过UV吸光度测定纯化的抗体的量；用SDS-PAGE分析纯 度。在不变性条件下，全IgG抗体具有其预期的160kD分子量。在变 性凝胶中，重链和轻链分别具有55和28kD预期的分子量。
完全大小IgG-Y1分子的结合：进行结合实验来测定IgG-Y1分子结 合水平与scFv-Y1分子结合水平之比较。利用两步染色方法，其中5ng 的IgG-Y1与RAJI细胞(阴性对照，图44)和Jurkat细胞(Y1阳性 细胞，图44)。对于检测，使用PE-标记山羊抗人IgG。类似地，1微 克的scFv-Y1与Jurkat细胞反应(图44)，并且使用PE-标记兔抗- scFv用于检测。结果表明IgG-Y1和scFv-Y1与Jurkat细胞结合， 获得与IgG-Y1类似检测水平需要比scFv-Y1分子多大约103-倍。
实施例6：从完整IgG Y1抗体制备Fab和F(ab′)2 片段 细胞培养和瞬时转染：
37℃下5％CO2气氛中在含有10％胎牛血清和40微克/毫升庆大 霉素的F-12培养基中培养CHO-细胞。转染之前的一天在90mm培养皿 上接种1-1.5-1×106细胞。各自在分开的真核表达系统中，用10微 克编码Y1抗体的可变轻链和可变重链的DNA共同转染培养物。利用 FuGene(Roche)转染试剂技术进行转柒。
在非选择性培养基中生长2天之后，在含有550微克/ml新霉素 和3微克/ml嘌呤霉素的F-12培养基中将细胞培养10-12天。使细胞 受到胰蛋白酶作用并且通过在Costar 96-孔板中0.5细胞/孔限制性 稀释来克隆。取各菌落，接种在6孔培养皿中并且转移到烧瓶中以进一 步筛选(测定表达水平和分泌到生长培养基中的抗体)。
细胞培养和长期转染：
37℃下5％CO2气氛中在含有10％胎牛血清和40微克/毫升庆大 霉素的F-12培养基中培养CHO-细胞。转染之前的一天在90mm培养皿 上接种0.8-1×106细胞。用10微克编码Y1抗体的可变轻链和可变重 链的DNA共同转染培养物，抗体是在CMV(巨细胞病毒)启动子调控下， sv-40启动子调控下dhfr基因克隆的。利用FuGene(Roche)转染试 剂技术进行转染。在非选择性培养基中生长2天之后，为了筛选表达高 水平的完整Y1抗体的克隆(有限稀释)在含有100nM-5μM甲氨喋呤 (MTX)和透析过的胎牛血清在培养基中培养细胞。
重链和轻链分泌的测定：
建立夹心ELISA分析来测定分泌到转染的CHO细胞上清液中的抗 体浓度。为了定量测定抗体的浓度，使用下面的试剂：单克隆抗人IgG1 (Fc)(Sigma)为包被抗体，山羊抗人IgG(γ-链特异性)生物素偶联物 为检测剂(Sigma)，和纯的人IgG1，λ(Sigma)为标准物。
从细胞制备和纯化Mab：
在摇瓶中在补充有10％胎牛血清，新霉素和嘌呤霉素(如上所述) 的F-12培养基中每瓶将细胞培养至1-2×108细胞的最终浓度。关于抗 体制备，在含有2％胎牛血清的相同的培养基中将细胞再培养两天。
在蛋白质G-琼脂糖柱(Pharmacia)和离子交换柱Q琼脂糖凝胶 (Pharmacia)上纯化分泌的抗体。在20mM磷酸钠缓冲剂，pH 7.0中 结合；用0.1M甘氨酸缓冲剂，pH 2.5-3.0进行洗脱。通过UV吸光 度和ELISA测定纯化的抗体的量。在不变性条件下，全IgG抗体具有 其预期的160kD分子量。在变性凝胶中，重链和轻链分别具有55和 28kD预期的分子量。
Y1 IgG片段化成Fab F(ab′)2：
IgG分子由两个相同的轻链和两个相同的重链组成。这些链通过 非共价相互作用和共价键(二硫键)的联合在折叠(结构域)中保持 在一起。轻链由一个可变区和一个恒定区组成。重链由一个可变区(VH) 和三个分开的恒定区(CH 1，2和3)组成。重链恒定区1(CH1)和重链 恒定区2(CH2)容易被酶酶解。在这个位点酶切产生Fab或F(ab′)2片 段和Fc部分。分子的Fab部分保留分子的抗原结合能力，但是具有低 非特异性结合。Fab部分最适合那些期望没有效应子功能的抗原结合 能力的情况。
体内Fab和F(ab′)2片段被用作诊断和治疗试剂。为了制备肿 瘤特异性对所有的细胞的损伤的癌症化疗药物，药物能与结合肿瘤细 胞表面抗原的抗体结合。使用Fab或F(ab′)2片段代替完整IgG提 供了几点好处：
(1)片段能更容易地穿过毛细管并且扩散在组织表面。
(2)与完整的没有结合的IgG相比，更快地澄清没有与偶联物结 合的片段；因此，将有更多的片段治疗物质达到目标区。
使用固定化无花果蛋白酶(Pierce)进行了制备一价和二价抗体 片段的最初的尝试。在1mM半胱氨酸存在下，无花果蛋白酶酶切产生 F(ab′)2片段。类似地，通过将消化缓冲液中的半胱氨酸激活剂的浓 度提高到10mM，能从源IgG产生Fab片段。
消化之后在固定化蛋白A柱上纯化片段。使用截留分子量是 10,000或30,000道尔顿的微型浓缩器浓缩F(ab′)2和Fab片段。 利用280nm的吸光度测定蛋白质回收率。利用凝胶电泳测定片段纯 度。
制备Fab片段的详细方法：
对2mg/ml半胱氨酸HCl(用于制备F(ab′)2片段)和20mg/ml(用 于制备Fab片段)浓度消化缓冲液中2ml固定化无花果蛋白酶柱子施 加1mg纯化的Y1抗体，37℃下温育5小时(对于Fab)和20小时 (F(ab′)2)。通过用4ml免疫纯结合缓冲液洗脱消化物来终止反应。 通过使用蛋白A柱子使用结合缓冲液实施从没有消化的IgG和Fc片 段分离Fab或F(ab′)2片段。流出液中含有Fab或F(ab′)2。通过 在280nm读出吸光度，合并含有片段的峰级分。浓缩片段并且使用截 留分子量是10,000道尔顿的微型浓缩器对PBS透析。通过利用280nm 的吸光度，凝胶电泳和HPLC，测定蛋白质回收，纯度和特征。
细胞提取物(溶胞产物)制备
收集2×106细胞并且在微型离心机中离心(1300rpm，4℃，5分 钟)。为了洗涤，对沉淀加0.5-1ml PBS+pi并且轻轻混合。和上面 一样将混合物离心。反复用0.5-1ml PBS+pi洗涤，和上面一样将 混合物离心。将沉淀的细胞重复悬浮于细胞溶解缓冲液中(200微升 /20×106细胞沉淀。使用的细胞溶解缓冲液是50mM Tris pH 7.4，1 mm PMSF 1％NP-40，和1mM EDTA，但是也可以使用其他合适的细 胞溶解缓冲液。缓冲液在冰上温育大约60分钟，然后离心(3000rpm， 4℃，5分钟)。收集上清液并且分成等份。
粗膜级分的制备和膜蛋白的提取
将20体积匀化缓冲液加给一体积的细胞。使用的匀化缓冲液是2％ (w/v)Tween 20，1mM MgSO4，2mM CaCl2，150mM NaCl，和25mM Tris-HCl，pH 7.4。还加入下面的蛋白酶抑制剂：1mM PMSF，5微克 /ml亮抑酶肽，5微克/ml抑肽酶。在带有旋转聚四氟乙烯棒 (Ultra-Torex)Potter-Elvehjem匀浆器中3-5次将细胞匀化。在 匀化期间样品保持冷却，然后在冰浴上搅拌1小时。使样品在均化器中 在操作几次，然后在4℃下以3000g离心30分钟。收集上清液并且 在4℃下以45000g离心1小时(19000rpm转子ss-34)。从45000g 离心物去除上清液。向沉淀加50mM Tris 7.4，1mM EDTA，1％NP-40 和蛋白酶抑制剂的溶液，将溶解的沉淀放置在冰上1小时。
HPLC柱上膜级分纯化
对于膜级分纯化使用RPC柱(Phannacia Type PLRP-S 300 A)。 使用缓冲液(A)20mM Tris 8.0和(B)60％丙醇DDW溶液。流速是1 毫升/分钟，除了洗涤步骤期间流速是2毫升/分钟。在室温下进行整 个程序。
用缓冲液A以1∶4的比例稀释样品缓冲液(62mM Tris pH 6.8，10％ 甘油，3％SDS，720mM巯基乙醇)加入Jurkat或KG-1膜级分的免疫 沉淀(IP)之后的洗脱样品。
将样品加到柱子上，收集流出的液体。用缓冲液A冲洗柱子直到流 出物光密度降至0。
根据下面的程序从柱子洗出蛋白质：用80％A 5分钟，然后是40 分钟的80-0％的A和20-100％B的梯度。然后施加第二梯度，使得流 出物的成分达到80％A，使用该组合物洗涤柱子5分钟以上。在级分 收集器中收集洗出液，1ml级分规模。
在Speed-Vac蒸发器中将样品蒸发至小体积，然后利用SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和蛋白质印迹进行分析。
Q-琼脂糖柱子上正常人血浆的纯化
使用起始缓冲液将5ml正常人新鲜冷冬血浆稀释1∶10并且通 过0.45微米注射式过滤器(Sartorius，cat # 16555)过滤。起始缓 冲液是20mM Tris-HCl，pH 8.0并且含有蛋白酶抑制剂(5微克/毫 升亮抑酶肽，5微克/毫升抑肽酶，和1mM PMSF)。
5ml HiTrap Q琼脂糖柱子(Amersham Pharmacia，cat #； 17-1154-01)连接P-1蠕动泵(Amersham Pharmacia)。根据商业说 明以大约4毫升/分钟的流速冲洗柱子。稀释的过滤过的血浆加到柱子 上，收集流出的液体。用20体积的0.3M NaCl的起始缓冲液溶液冲 洗柱子。用起始缓冲液中0.6M，0.8M，和1.0M NaCl溶液洗脱蛋 白质。洗脱体积分别是50，20和20ml。整个过程在4℃下进行。
在双份凝胶上对洗脱级分进行SDS-PAGE分析，接着使用生物素化 Y1和抗体181作为阴性对照进行蛋白质印迹分析。在0.6M NaCl洗 脱级分中发现纤维蛋白原γ原型。1.0M NaCl洗脱级分含有补体化合 物4(CC4)，lumican，凝血酶原，和间α抑制剂。
在HPLC柱子上正常人血浆的纯化
Q琼脂糖纯化的正常人血浆与脲(达到至少8M的最终浓度)，DTT (达到30mM的最终浓度)和TFA(达到0.1％的最终浓度)。
将纯化的血浆溶液加到3毫升RPC柱子(AmersOham Pharmacia) 上，收集流出的液体。用缓冲液A冲洗柱子直到流出物光密度降至0。 根据下面的程序从柱子洗出蛋白质：用90％A 5分钟，然后是40分 钟的90-0％的A和10-100％B的梯度。然后施加第二梯度，使得流出 物的成分达到90％A，使用该组合物连续洗涤柱子5分钟以上。使用 的缓冲液是(A)DDW中的0.1％TFA和(B)DDW中的80％CAN和0.1％ TFA。流速是1毫升/分钟，除了洗涤步骤期间流速是2毫升/分钟。
在级分收集器中收集洗出液，1ml级分规模。在室温下进行整个 程序。
在Speed-Vac蒸发器中将样品蒸发至小体积，然后利用SDS-PAGE 和蛋白质印迹进行分析。
没有标记的CD162抗体的间接免疫印迹
在Sigma Z37，503-9应用中，在140-160伏特下抗体样品在10％ SDS-PAGE上进行电泳3.5小时。室温下20伏特下，电泳过的样品转 移到硝基纤维素膜上过夜，在Tris甘氨酸缓冲液(20％MeOH，192mM 甘氨酸，25mM TRIS，pH 8.3)中。室温下使用PBS(磷酸缓冲盐水) 中的5％脱脂奶封闭硝基纤维素膜1小时。将硝基纤维素膜洗涤三次， 每次5分钟，使用PBS中0.05％Tween 20。根据厂商说明将膜与Super Signal混合物(Pierce)温育5分钟，然后干燥过量的溶液。使用膜， 将它暴露给X-射线胶片(Fuji)，将胶片显影。
Y1受体的蛋白质印迹分析-印迹之后过滤器的处理
室温下使用5％脱脂奶封闭硝基纤维素膜1小时。将硝基纤维素膜 洗涤三次，每次5分钟，使用PBS中0.05％Tween 20。室温下在2％ 脱脂奶PBS溶液中使用5微克/毫升Y1-生物素(或者181-生物素) 温育膜1小时。然后将膜洗涤三次，每次5分钟，使用低于室温(大 约4℃至大约10℃)的冷的PBS中0.05％Tween 20。然后在2％脱 脂奶，0.05％Tween以SAV-HRP(链霉抗生物素蛋白-HRP)(1g/ml 的终浓度)的1∶1000稀释度低于室温下温育膜。稀释在室温下进行 (大约25℃)，然后在使用之前在冰上将稀释的SAV-HRP冷却10-15 分钟。轻轻摇动进行温育1小时。与SAV-HRP温育之后，如上所述将 膜洗涤。根据厂商说明将膜与Super Signal混合物(Pierce)温育5 分钟，然后干燥过量的溶液。使用膜，将它暴露给X-射线胶片(Fuji)， 将胶片显影。
实施例7：重组glycocalicin(GC)的原核表达
编码glycocalicin(GC，GPIbα氨基酸1至氨基酸493)的DNA 片段被克隆到IPTG可诱导原核载体盒中。在37℃下将携带新构建的 质粒的大肠杆菌(BL21 DE3)细胞培养至O.D.0.7-0.8，然后在IPTG 存在下在37℃下温育3小时用于诱导。
将半纯化人血小板产生的glycocalicin(″GC″)或者将来自诱导 的和没有诱导的细胞的大肠杆菌细胞溶胞产物(″总″)加给SDS-聚丙 烯酰胺凝胶，进行分析。使用下面的物质进行蛋白质印迹分析：生物 素化Y1-scFv，多克隆兔抗-人glycocalicin抗体，商售小鼠抗-人 CD42单克隆抗体(SZ2 Immunotech，PM640 Serotec，HIP1 Pharmigen，AN51 DAKO)，和抗GPIbα的N-末端的多克隆抗体(Sc- 7071，Santa Cruz)。
两种多克隆抗体识别重组细菌产生的glycocalicin和天然人血 小板产生的glycocalicin。Y1-scFv和商售抗体识别天然人产生的 glycocalicin，但是不识别细菌产生的重组血小板glycocalicin。图 45。
原核系统(例如大肠杆菌)没有翻译后修饰机理，例如糖基化和硫 酸化机理。因此，不被细菌产生的glycocalicin的Y1-scFv识别支持 这样的结论，即翻译后修饰，例如糖基化和硫酸化，对于Y1-scFv结 合glycocalicin是必需的。
用于血液/骨髓样品的FACS程序
样品来自医院。患者样品30微升/试管。加入5微升/试管的 CD33-APC(用于AML)或CD19-APC(用于B-CLL)或CD38-APC(用于 多发性骨髓瘤)。加入5微升/试管的CD45-PerCp 5毫升的scFv-Y1或 对照scFv-N31或CD162-PE(KPL1)。低摇动速度下在4℃下将试管温 育30分钟。加入2ml PBS洗涤并且以1200rpm离心5分钟。弃除上 清液。
使用溶解步骤继续一步测试：
加入500微升用ddH2O以1∶10稀释的BD赖氨酸溶液(加给患者 300微升)。以高速涡旋并且在4℃下温育12分钟。如上所述进行洗 涤。弃除上清液。加入500微升PBS。用FACS分析样品，根据国际标 准，使用血样获得分析。
对于两项或多项测试：工作缓冲液是PBS+1％BSA+0.05％叠氮 化钠。如上所述温育和洗涤。
红细胞溶解是测试中的最后步骤，接着用500微升PBS再次悬浮。
实施例8：三聚体的构建
载体pHEN-Y1，编码原Y1，利用PCR分别对VL和VH区扩增。对于 VLPCR反应使用有义寡核苷酸5′AACTCGAGTGAGCTGACACAGGACCCT，和 反义寡核苷酸5′-TTTGTCGACTCATTTCTTTTTTGCGGCCGCACC。将期望大 小的cDNA产物约350bp纯化，测序，并且用XhoI和NotI限制性内 切酶消化。
使用相同的程序扩增VH区(使用有义寡核苷酸5′- ATGAAATACCTATTGCCTACGG和反义寡核苷酸5′- AACTCGAGACGGTGACCAGGGTACC)。用NcoI和XhoI限制性内切酶消化 VHPCR产物。对pHEN载体进行三次连接和用NcoI-NotI预消化程序。 最后的载体指定为pTria-Y1。
大肠杆菌转化之后，取几个克隆用于进一步分析，包括DNA测序， 蛋白质表达，和从细菌的周质间隙提取。进行还原条件下的SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析来证实Y1三聚体的大小。
实施例9：二聚体的构建
用XhoI限制性内切酶将上述载体pTria-Y1线性化，将合成的互补 双链寡核苷酸(5′-TCGAGAGGTGGAGGCGGT和5′TCGAACCGCCTCCACCTC) 预退火并且与Y1-重链和Y1-轻链之间的XhoI位点连接。这个新的载 体指定为pDia-Y1。和对于三聚体的描述一样，证实DNA序列和蛋白 质表达。
实施例10：二聚体和三聚体的表达和纯化
在大肠杆菌中的表达基本上与对于scFv-Y1的描述相同。但是， 从转化的大肠杆菌细胞的周质纯化Y1二聚体和三聚体是不同的。scFv Y1单体形式能在Protein-A琼脂糖小球的亲和柱子上纯化。但是Y1的 多聚体形式通过这个方法却没有效。因此，从细菌提取的周质蛋白质用 60％硫酸铵沉淀过夜，再次悬浮于水中，加到用0.1.XPBS预平衡过的 Sephacryl-200(Pharmacia)大小排阻柱子上。收集级分并且通过 HPLC分析，并且收集含有二聚体或三聚体形式的分离的级分进行FITC 标记和FACS分析。
实施例11：Y1二聚体和三聚体与细胞的结合
利用“三步染色方法”对Jurkat细胞进行FACS分析。首先，对 粗提物或纯化的没有标记的scFv染色，然后对小鼠抗-myc抗体，最后 对FITC-或PE-偶联抗-小鼠抗体。FACS分析需要5-8×105细胞，它们 经Ficoll-纯化并且再次悬浮于PBS+1％BSA。在4℃下进行结合1小 时每一个步骤之后，洗涤细胞并且再次悬浮于PBS+1％BSA。最后染 色步骤之后，通过再次悬浮于PBS，1％BSA，2％甲醛中固定细胞， 然后进行FACS(Becton-Dickinson)分析。
将Y1-scFv的结合与二聚体和三聚体的结合相比较。在该项分析 中(图44)，所有三种形式的结合曲线非常相似，表明上述分子中的修饰 不改变，掩盖或破坏Y1与它的配体的表观结合亲和性。
实施例12：与应用KG-1细胞的放射受体结合测试，S-S Y1-二聚 体与CONY1和Y1-IgG的亲和性比较研究
测试系统包括使用放射性配体，通过使用Y1-IgG构建体或 Bolton-Hunter(CONY1)试剂上的氯胺T，通过使用125I碘化制备该 放射性配体。测试试管中，PBS+0.1％BSA，pH 7.4中含有5×106KG-1 细胞/0.2ml和带有不同量的没有标记的竞争剂的标记的示踪剂。4 ℃下搅拌下温育1小时之后，用冷的缓冲液充分洗涤细胞并且用于放射 性计数。
对于放射性受体结合测试(RRA)，使用2ng/试管的125I-Y1-IgG， 并且用三种分子的每一个进行竞争。图46给出结果。该图中的结果证 明S-S Y1二聚体的抗体亲抗原性比大多数完整Y1抗体低2倍，并且 比CONY 1的高30倍。在该项实验中估计Y1-IgG的亲和性是2×10-8 M。因此相应的二聚体的亲和性是4×10-8M。
在使用标记的CONY1的第二RRA中，使用100ng/试管的125I- Y1-IgG，使用三种分子的每一种进行竞争。图47给出结果。这个图 表明S-S二聚体的亲和性比CONY1的高20倍。该项实验中CONY 1亲 和性总的估计是10-6M。二聚体相应的亲和性因此是5×10-8M。
实施例13：Y1-cys-kak(半胱胺酸二聚体)的制备
42℃下将1升λpL-y1-cys-kak细胞培养物温育2-3小时。这种 培养物以5000RPM离心30分钟。沉淀再次悬浮于180ml的TE(50mM Tris-HCl pH 7.4，20mM EDTA)中。加入8ml的溶菌酶(取自5mg/ml 原种液)并且温育1小时。加入20ml的5M NaCl和25ml的25％， 并且又温育1小时。4℃下以13000RPM将混合物离心60分钟。弃除 上清液。借助组织匀浆器(或匀化器)将沉淀再次悬浮于TE。重复该 过程3-4次直到包涵体(沉淀)颜色呈现灰/浅棕。包涵体溶解于6M胍 -HCl，0.1M Tris pH 7.4，2mM EDTA(10ml溶解缓冲液中1.5克 的包涵体提供约10mg/ml可溶性蛋白质)。这被温育至少4小时。测 定蛋白质浓度并且达到10mg/ml的浓度。加入DTE达到最后浓度是 65mM并且在室温下温育过夜。将10ml蛋白质(一滴一滴地)稀释 到含有0.5M精氨酸，0.1M Tris pH 8，2mM EDTA，0.9mM GSSG 的溶液引发重折叠。重折叠溶液在10℃下温育48小时。用含有25mM 磷酸盐缓冲液pH 6，100mM脲的缓冲液对含有蛋白质的重折叠溶液透 析，并且浓缩至500ml。浓缩的/透析的溶液与SP-sepharose柱子 结合，通过梯度NaCl(最高达1M)洗脱蛋白质。
实施例14：对GC(glycocalicin)的ELISA
在4℃下，在96孔maxisorp平板中将100ml纯化的 glycocalicin温育过夜。用PBST(PBS+0.05％tween)将平板冲洗3 次，然后加200ml of PBST-奶(PBST+2％脱脂奶)，室温下温育1 小时。用PBST冲洗平板，并且在PBST-奶中加入不同浓度的单体和二 聚体(100ml)，室温下温育1小时。然后冲洗平板并且加入抗-VL多 克隆(来自用从Y1衍生的VL免疫的兔)(在PBST-奶中以1∶100稀 释)，温育1小时。冲洗平板并且加入抗-兔HRP再温育1小时。将平 板冲洗5次并且用大约15分钟加入100微升TMB底物，然后加入100 微升的0.5 H2SO4终止反应。在ELISA读数器上测定450nm的平板的 光密度。
实施例15：重组glycocalicin(GC)的大肠杆菌表达
将编码人血小板GP1b-glycocalicin(GC，氨基酸1至氨基酸493) 的N-末端可溶部分的DNA片段克隆到IPTG可诱导原核载体盒中。携 带新构建质粒的大肠杆菌细胞(BL21 DE3)在37℃下培养至O.D. 0.7-0.8，然后在IPTG存在下在37℃下温育3小时用于诱导。对 SDS-聚丙烯酰胺凝胶加载半纯化的人血小板产生的GC或者从诱导的 和没有诱导的细胞产生的大肠杆菌细胞溶胞产物(总蛋白质内含 物)，进行分析。进行蛋白质印迹分析，使用scFv Y1-生物素化，多 克隆兔抗-人GC抗体，小鼠抗-人CD42单克隆抗体(SZ2 Immunotech， PM640 Serotec，HIP1 Pharmigen，AN51 DAKO，商售)和抗GP1bα 的N-末端的多克隆抗体(Sc-7071，Santa Cruz)。两种多克隆抗体识 别重组细菌产生的GC以及天然人血小板产生的GC。scFv Y1和商售 抗体只识别天然人产生的GC，但是不识别细菌产生的重组血小板GC。
翻译后修饰，例如糖基化作用和硫酸化作用，对于scFv和商售抗 体结合GC是必需的。原核系统(大肠杆菌)缺乏翻译后修饰机理，例 如糖基化作用和硫酸化作用。
实施例16：Y1四聚体的制备
设计构建体，其中通过PCR在Y1的C-末端加入下面的序列， LNDIFEAQKIEWHE，并且克隆到IPTG可诱导表达载体盒中。该克隆命 名为Y1-生物标记。该序列是BirA酶的底物，在自由生物素的存在下， 该酶能使生物素与赖氨酸残基(K)共价连接(抗原特异性T淋巴细胞的 表型分析(Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes)，Science.1996年10月4日；274(5284)：94-6， Altman JD等)。将这种构建体制备成BL21细菌细胞中的包涵体。如 上所述进行重折叠。包涵体溶解于胍-DTE。通过在含有精氨酸-tris EDTA的缓冲剂中稀释进行重折叠。HiTrapQ离子交换纯化之后进行透 析和浓缩。
根据厂商说明，纯化的Y1-生物标记scFv与BirA酶(从Avidity 购得)和生物素温育。通过HABA测定分析生物素化Y1-生物标记(估计 每个分子的生物素的量)，并且证明大约是＞0.8生物素残基/分子。
生物素化的Y1-生物标记与链霉抗生物素蛋白-PE (Phycoerythrin)温育，形成复合体，并且在使用KG-1细胞(对Y1 呈阳性)的FACS实验中使用。由于抗体亲抗原性提高，结合的灵敏性 提高至少100倍。链霉抗生物素蛋白能与最多4个生物素化Y1-生物 标记分子结合。
Y1-生物标记的序列如下，并且是SEQ ID NO：211：
1    MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ
41   APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL
81   YLQMNSLRAE DTAVYYCARM RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG
121  SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY
161  YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA
201  SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSGNNVVFG GGTKLTVLGG
241  GGLNDIFEAQ KIEWHE
实施例17：Y17活性表征
为了确定Y17与GPIbα结合的特异性，使用选择性裂解人血小板 GPIb的来自Pastoral haernolytica的酶O-唾液糖蛋白内切酶。O- 唾液糖蛋白内切酶特异性地只酶切含有唾液酸化O-连接多糖，而不裂 解N-连接糖蛋白或没有糖基化的蛋白质。据报道这种酶切割GPIb， GPIb是O-糖基化程度高的，但是不裂解GPIIb-11Ia或者血小板上的 其它受体。如免疫印迹和通过FACS分析所证明的，用酶切GPIb的O- 唾液糖蛋白内切酶诱导洗涤过的血小板，消除Y17的以及抗GPIbα的 单克隆抗体(MCA466S-serotec)对GPIb的结合。这些蛋白质内切酶不 改变抗GPIIb/IIIa的单克隆抗体(抗CD61)的结合(图4)。
实施例18：血小板GPIb上Y17表位的鉴定
鉴定血小板GPIb上Y17表位的令人感兴趣的方法是使用其在血小 板GPTb上的酶切位点完全表征的蛋白质内切酶。
18.1：Mocarhagin对Y1表位图谱的作用
Mocarhagin是一种眼镜蛇蛇毒金属蛋白酶，它在残基glu-282和 asp-283之间的一个单一位点特异性酶切血小板GPIbα，从而产生两种 稳定产物：约45-kDa N-末端片段(His1-Glu282)，存在于上清液中， 和膜结合的100kDa C-末端片段。
用mocarhagin处理洗涤过的血小板，并且在SDS-聚丙烯酰胺凝 胶上对血小板溶胞产物进行电泳分离并且转移给硝基纤维素。使用Y1 的mocarhagin处理过洗涤过的血小板的蛋白质印迹分析表明缺少了 相应于GPIb的泳带(135kDa)，并且Y17与N-末端45kDa胰蛋白酶 片段结合。抗GPIbα的C-末端片段的单克隆抗体MCA466S与100kDa C- 末端片段反应，同时识别GPIbα的N-末端的单克隆抗体S.C.7071与 Y17识别的相同的45kDa N-末端片段反应(图14)。
用Mocarhagin处理glycocalicin给出和用洗涤过的血小板观察 到的那些结果相似的结果，表明Y1和单克隆抗体S.C.7071与GPIbα 的45kDa N-末端酶切产物片段结合(图8)。这些结果提示Y17的表 位包含在序列His1-Glu282中。
18.2：组织蛋白酶G对Y17表位图谱的作用
组织蛋白酶G，一种嗜中性白细胞丝氨酸蛋白酶，在残基Leu-275 和Tyr-276之间的第一酶切位点和残基Val-296和Lys-297之间的第 二酶切位点酶切glycocalicin。组织蛋白酶G处理glycocalicin 产生两种N-末端片段：小的N-末端42kDa片段(His1-Leu275)，和大 的45kDa N-末端片段(His1-Val-296)，和约95kDa C-末端片段。 组织蛋白酶G消化产生的Glycocalicin和glycocalicin片段在SDS- 聚丙烯酰胺上进行电泳分离，并且转移给硝基纤维素。Y1与较大的片 段(His1-Val-296)结合，而不与较小的N-末端段(His1-Leu275)结 合。此外，识别His1-Leu275中的表位的单克隆抗体S.C.7071与 两种片段结合(图12)。mocarhagin和组织蛋白酶G的N-末端肽蛋 白质酶解片段的分析表明，BPIbα氨基酸序列Tyr-276-Glu-282是 Y17的结合的重要的识别基序。
实施例19：Y17-scFv对vWF-依赖性凝集作用的影响
在Y17不同的浓度下，测试Y17-scFv对血小板vWF-依赖性凝集 作用的影响。与Y1相反，10，25或50微克/毫升最终浓度下，Y17不 抑制瑞斯托菌素诱导的洗涤过的血小板中vWF-依赖性血小板凝集作 用。mocarhagin和组织蛋白酶G的N-末端肽蛋白质酶解片段的分析 表明，BPIbα氨基酸序列Tyr-276-Glu-282是Y17和Y1的结合的重 要的识别基序。因为Y17不抑制血小板凝集作用，似乎Y1和Y17不 与相同的序列结合，但是与重叠序列结合。
                        序列表
<110>生物技术通用公司
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人(Ilomo sapiens)
<400>1
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val
1               5                   10
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>2
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Gly
1               5                   10
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>3
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Leu Arg Val
1               5
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>4
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Thr
1               5
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>5
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Phe Gln Leu Val
1               5                   10
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>6
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr
1               5
<210>7
<211>111
<212>PRT
<213>人
<400>7
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
1               5                   10                  15
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
            20                  25                  30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
        35                  40                  45
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser
    50                  55                  60
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
65                  70                  75                  80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val
                85                  90                  95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala
            100                 105                 110
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>8
Met Arg Ala Pro Val Ile
1               5
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>9
Pro Trp Asp Asp Val Thr Pro Pro
1               5
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>10
Gly Phe Pro Arg Ile Thr Pro Pro Ser Ala Glu Ile
1               5                   10
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>11
Gly Phe Pro Met Pro
1               5
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>12
Gly Phe Pro His Ser Ser Ser Val Ser Arg
1               5                   10
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>13
Arg Phe Pro Met Arg His Glu Lys Thr Asn Tyr
1               5                   10
<210>14
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>14
Arg Phe Pro Pro Thr Ala Thr Ile
1               5
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>15
Thr Gln Arg Arg Asp Leu Gly
1               5
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>16
Lys Phe Pro Gly Gly Thr Val Arg Gly Leu Lys
1               5                   10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>17
Gly Phe Pro Val Ile Val Glu Glu Arg Gln Ser Thr
1               5                   10
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>18
Arg Phe Pro Gln Arg Val Asp Asn Arg Val
1               5                   10
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>19
Thr Gly Gln Ser Ile Lys Arg Ser
1               5
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>20
Leu Thr His Pro Tyr Phe
1               5
<210>21
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>21
Leu Arg Pro Pro Gln Ser
1               5
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>22
Thr Ser Lys Asn Thr Ser Ser Ser Lys Arg His
1               5                   10
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>23
Arg Tyr Tyr Cys Arg Ser Ser Asp Cys Thr Val Ser
1               5                   10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>24
Phe Arg Arg Met Glu Thr Val Pro Ala Pro
1               5                   10
<210>25
<211>277
<212>PRT
<213>人
<400>25
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
145                 150                 155                 160
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp
                165                 170                 175
Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
            180                 185                 190
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile
        195                 200                 205
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
    210                 215                 220
Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser
225                 230                 235                 240
Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
                245                 250                 255
Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
            260                 265                 270
Leu Asn Gly Ala Ala
        275
<210>26
<211>464
<212>PRT
<213>人
<400>26
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Asp Thr Gly
1               5                   10                  15
Ser Trp Ala Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly Gln Gly Thr
        115                 120                 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
    130                 135                 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145                 150                 155                 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
                165                 170                 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
            180                 185                 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
        195                 200                 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
    210                 215                 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225                 230                 235                 240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
                245                 250                 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
            260                 265                 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
        275                 280                 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
    290                 295                 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
                325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
            340                 345                 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
        355                 360                 365
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
    370                 375                 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Ser Pro Val Leu Asp
                405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
            420                 425                 430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
        435                 440                 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    450                 455                 460
<210>27
<211>233
<212>PRT
<213>人
<400>27
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Asp Thr Gly
1               5                   10                  15
Ser Trp Ala Asp Ala Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
            20                  25                  30
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
        35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
    50                  55                  60
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
65                  70                  75                  80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
                85                  90                  95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
            100                 105                 110
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
        115                 120                 125
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
    130                 135                 140
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
                165                 170                 175
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
            180                 185                 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
        195                 200                 205
His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
    210                 215                 220
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230
<210>28
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>28
Phe Leu Thr Tyr Asn Ser Tyr Glu Val Pro Thr
1               5                   10
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>29
Thr Asn Trp Tyr Leu Arg Pro Leu Asn
1               5
<210>30
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr
<210>31
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Leu Gly Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Thr Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>32
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
            20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr
<210>33
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>34
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>35
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>36
<211>98
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>X
<222>(1)..(98)
<223>Xaa
<400>36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>37
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Cys Met His Trp Val Arg Gln Val His Ala Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Leu Val Cys Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg
<210>38
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>38
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser
            20                  25                  30
Ala Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Val Val Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala
<210>39
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>40
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>41
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>42
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ser Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>43
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
    50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>44
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
    50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>45
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>46
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>47
<211>92
<212>PRT
<213>人
<400>47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90
<210>48
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>49
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>50
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>50
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>51
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>51
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<21>52
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>52
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala
            20                  25                  30
Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
<210>53
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>53
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Glu Trp Cys Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val
65                  70                  75                  80
Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala His Arg
<210>54
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>54
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
<210>55
<211>96
<212>PRT
<213>人
<400>55
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
<210>56
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>56
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala His Arg
            100
<210>57
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
            20                  25                  30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg
            100
<210>58
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg
            100
<210>59
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg
            100
<210>60
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys
<210>61
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>62
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys
<210>63
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>63
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>64
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Thr Thr
            100
<210>65
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser Pro Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Lys
<210>66
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Tyr Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ser Ser Gly Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Lys
<210>67
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
            20                  25                  30
Asp Met Asn Trp Val His Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Thr Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg
<210>68
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>68
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>69
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>70
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>70
Glu Val Gln Leu Val His Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>71
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>71
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>72
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Val Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg
<210>73
<211>35
<212>PRT
<213>人
<400>73
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Glu Tyr Val Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ala Asp
        35
<210>74
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>74
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>75
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>75
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>76
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>77
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys
<210>78
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>79
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>80
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys
<210>81
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>82
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>83
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>83
Glu Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Pro Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Val Leu His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Ile Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>84
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>85
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>86
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>86
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Ile His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>87
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>87
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>88
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>88
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Val Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>89
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>89
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Gly Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg
<210>90
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>90
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg
<210>91
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>91
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg
<210>92
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>92
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>93
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>93
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>94
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Asn Trp Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>95
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>95
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Asn Trp Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>96
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>96
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Asn Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>97
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>97
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>98
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Pro Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>99
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>99
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>100
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>100
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg
<210>101
<211>99
<212>PRT
<213>人
<400>101
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg
<210>102
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>102
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Asn Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>103
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>103
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>104
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>104
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Met Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>105
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>105
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser IIe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210>106
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>106
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>107
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>107
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Pro Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>108
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>108
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>109
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>109
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg
<210>110
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>110
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>111
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>111
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>112
<211>101
<212>PRT
<213>人
<400>112
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg
            100
<210>113
<211>87
<212>PRT
<213>人
<400>113
Arg Lys Leu Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Arg Lys Ala Ser Ser Tyr
1               5                   10                  15
Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile His Cys Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
            20                  25                  30
Gly Leu Lys Gly Trp Met Gly Gly Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Lys Thr
        35                  40                  45
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Met Ser
    50                  55                  60
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Gln Arg Ser Glu Asp Ile
65                  70                  75                  80
Asp Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
                85
<210>114
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>114
Asp Tyr Gly Met Ser
1               5
<210>115
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>115
Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>116
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>116
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg
1               5                   10
<210>117
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>117
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
1               5                   10
<210>118
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>118
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
1               5                   10
<210>119
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>119
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1               5
<210>120
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>120
Trp Val Arg Gln Ala Pro
1               5
<210>121
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>121
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
1               5                   10
<210>122
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>122
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
1               5
<210>123
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>123
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser
            20
<210>124
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>124
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>125
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His
1               5
<210>126
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>126
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Val
1               5
<210>127
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>127
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Thr
1               5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>128
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Ala Thr
1               5
<210>129
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>129
Ala Ala Trp Asp Asp Gly Leu Ser Leu Val
1               5                   10
<210>130
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>130
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val
1               5                   10
<210>131
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>131
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ser Val Arg Val
1               5                   10
<210>132
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>132
Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly Ala Tyr Val
1               5
<210>133
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>133
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Val Ser Arg Val
1               5                   10
<210>134
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>134
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Tyr Val
1               5                   10
<210>135
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>135
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Cys Pro Glu Phe Val
1               5                   10
<210>136
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>136
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Trp Phe Val
1               5                   10
<210>137
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>137
Leu Ala Trp Asp Thr Ser Pro Arg Trp Val
1               5                   10
<210>138
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>138
Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Val Val
1               5                   10
<210>139
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>139
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Arg Val
1               5                   10
<210>140
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>140
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Gln Arg Thr
1               5
<210>141
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>141
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Arg Leu Val
1               5                   10
<210>142
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>142
Met Gln Gly Thr His Trp Arg Pro Thr
1               5
<210>143
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>143
Met Gln Gly Lys His Trp Pro Leu Thr
1               5
<210>144
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>144
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Gly Phe
1               5
<210>145
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>145
Met Gln Gly Thr His Arg Arg Ala Thr
1               5
<210>146
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>146
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>147
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>147
Met Arg Gly Thr His Arg Arg Ala Thr
1               5
<210>148
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>148
Met Gln Gly Thr His Trp His Pro Thr
1               5
<210>149
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>149
Met Gln Ala Leu Gln Ser Pro Thr
1               5
<210>150
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>150
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Phe Val
1               5                   10
<210>151
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>151
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Thr
1               5
<210>152
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>152
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr
1               5
<210>153
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>153
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Phe Thr
1               5
<210>154
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>154
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Ala Thr
1               5
<210>155
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>155
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Arg Ser Val
1               5                   10
<210>156
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>156
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Leu Val
1               5
<210>157
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>157
Asp Ser Trp Asp Asn Ser Leu Val Ser Pro Val
1               5                   10
<210>158
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>158
Met Gln Ala Leu Gln Ser Pro Ala Thr
1               5
<210>159
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>159
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Val Thr
1               5
<210>160
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>160
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val
1               5                   10
<210>161
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>161
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Arg Val Asn Val
1               5                   10
<210>162
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>162
Met Gln Ala Leu Arg Thr Arg Thr
1               5
<210>163
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>163
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Phe Tyr Pro Val
1               5                   10
<210>164
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>164
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Val Thr
1               5
<210>165
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>165
Met Gln Gly Thr His Trp Arg Thr
1               5
<210>166
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>166
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Phe Tyr Val
1               5                   10
<210>167
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>167
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>168
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>168
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Leu Gly Ser Val
1               5                   10
<210>169
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>169
Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Tyr Val
1               5
<210>170
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>170
Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Leu Thr
1               5
<210>171
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>171
Val Leu Tyr Met Gly Ser Gly Ser Ala Val
1               5                   10
<210>172
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>172
Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Asn Thr
1               5
<210>173
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>173
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Cys Ala Val
1               5                   10
<210>174
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>174
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Arg Thr
1               5
<210>175
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>175
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Arg Pro Val
1               5                   10
<210>176
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>176
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Tyr Asn Val
1               5                   10
<210>177
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>177
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Arg Asn Val
1               5                   10
<210>178
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>178
Met Gln Val Leu Gln Thr Arg Thr
1               5
<210>179
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>179
Met Gln Ala Leu Gln Thr Arg Thr
1               5
<210>180
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>180
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Met
1               5
<210>181
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>181
Met Gln Ala Leu Gln Thr Leu Thr
1               5
<210>182
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>182
Met Arg Ala Leu Gln Thr Pro Thr
1               5
<210>183
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>183
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Gly Tyr Val
1               5                   10
<210>184
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>184
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Gly Phe Val
1               5                   10
<210>185
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>185
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Phe Leu Val
1               5                   10
<210>186
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>186
Met Gln Ser Ile Gln Leu Arg Thr
1               5
<210>187
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>187
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ile Val
1               5                   10
<210>188
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>188
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Thr
1               5
<210>189
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>189
Met Gln Ala Leu His Thr Arg Thr
1               5
<210>190
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>190
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ser Val
1               5
<210>191
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>191
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1               5
<210>192
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>192
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr
1               5
<210>193
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>193
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Ala Ala Thr
1               5
<210>194
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>194
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ala Thr
1               5
<210>195
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>195
Val Leu Tyr Met Gly Ser Gly Val Tyr Val
1               5                   10
<210>196
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>196
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Trp Ser Ala Val
1               5                   10
<210>197
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>197
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Arg Arg Leu Val
1               5                   10
<210>198
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>198
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>199
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>199
Met Gln Ala Leu Gln Thr Leu Thr
1               5
<210>200
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>200
Ala Ala Trp Asp Asp Gly Leu Leu Arg Val
1               5                   10
<210>201
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>201
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ala Leu Val
1               5                   10
<210>202
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>202
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Phe Gln Leu Val
1               5                   10
<210>203
<211>277
<212>PRT
<213>人
<400>203
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Thr His Pro Tyr Phe Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
145                 150                 155                 160
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp
                165                 170                 175
Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
            180                 185                 190
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile
        195                 200                 205
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
    210                 215                 220
Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser
225                 230                 235                 240
Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
                245                 250                 255
Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
            260                 265                 270
Leu Asn Gly Ala Ala
        275
<210>204
<211>266
<212>PRT
<213>人
<400>204
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
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            180                 185                 190
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
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Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser
225                 230                 235                 240
Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Lys Ala Lys
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