技术领域
[0001] 本
发明涉及诊断试剂领域，具体是肿瘤细胞诊断试剂盒。
背景技术
[0002] 在医学上，癌是指起源于上皮组织的
恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。相对应的，起源于间叶组织的恶性肿瘤统称为肉瘤。有少数恶性肿瘤不按上述原则命名，如肾母细胞瘤、恶性畸胎瘤等。一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。肿瘤是
机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因
水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新
生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、
坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无
力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。
[0003] 通过检测循环肿瘤细胞、循环肿瘤核酸等方法可以从外周血中收集到癌症的病情、基因突变情况等大量信息，这类无创的“液体活检”技术发展迅猛，其中计量循环肿瘤细胞进行癌症病人
预后在临床上已经广泛应用。目前，CTC的分析方法主要分为两大类：基于
抗原抗体反应的捕获、免疫
染色分析法和基于PCR反应的分子生物学分析法。第一类方法的代表是CellSearch系统：CellSearch系统是目前FDA唯一批准临床适用的循环肿瘤细胞检测的医疗器械，其利用抗体修饰的
磁珠将外周血中表达EpCAM蛋白的细胞抓取出来，再通过抗CK8、CK18、CK19、CD45的抗体以及DAPI对抓取的细胞进行染色，最后计数EpCAM、CK、DAPI阳性，同时CD45阴性的细胞的个数来确定血液中循环肿瘤细胞的量，并以此对药物的疗效和病人的预后进行评价。基于抗原抗体反应的方法1)需要用到抗体修饰的磁珠捕获细胞，并用萤光抗体染色，造成价格高昂。2)从原发灶转移进入血液的癌细胞需要经过上皮间质转换，造成细胞表面上皮标志物丢失，从而使的抗体修饰的磁珠难以捕获这类细胞，造成检出率低。3)多种萤光抗体的标记占用了大量的萤光通道，造成从循环肿瘤细胞中获得的信息很少。除此之外，还有大量处于实验室开发阶段和临床应用前阶段的基于RT-PCR技术的循环肿瘤细胞定性、定量方法。而基于PCR反应的分析方法也存在有很多问题：1)提取的RNA样品需要反转录后才能进行扩增。在复杂样品中提取RNA本身就是技术难度很大的问题，反转录的时候用oligo dT引物只能反转完整的全长mRNA造成反转录的效率更是低下，容易丢失大量信息。2)PCR技术用到的引物过短，造成特异性不强，在大量白细胞核酸存在的情况下
假阳性率高。因此目前还没有此类产品在临床使用。
[0004] 癌症患者主要靠超生穿刺活检和影像学检查(CT、
核磁共振、PET/CT等)进行检测。这些方法对医生、设备等医疗资源要求高，价格高昂，并且对已经手术
切除了肿瘤的早期病人，或者因部位特殊无法进行组织活检的病人来说这些检测方法并不适用。现有的检测试剂盒灵敏度低，对于每个样品的分析时间偏长。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供操作简单、成本低廉、快速、准确地检测
乳腺癌和
肺癌细胞的肿瘤细胞诊断试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 肿瘤细胞诊断试剂盒，由红细胞裂解液、细胞裂解液、无RNA酶超纯水、环介导扩增反应缓冲液、酶、引物、阳性对照样本组成，
[0008] 引物包含：FIP、BIP各1μM，F3、B3各0.2μM,LF、LB各0.8μM，共3μL；
[0009] 其中，所述FIP的基因序列为：GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA，如SEQ ID NO：1所示；
[0010] 所述BIP的基因序列为：GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG，如SEQ ID NO：2所示；
[0011] 所述F3的基因序列为：TGGTACCAGAAGCAGGGG，如SEQ ID NO：3所示；
[0012] 所述B3的基因序列为：GTTGATGTCGGCCTCCACG，如SEQ ID NO：4所示；
[0013] 所述LF的基因序列为：AGAATCTTGTCCCGCAGG，如SEQ ID NO：5所示；
[0014] 所述LB的基因序列为：CGTCTGGCTGCAGATGA，如SEQ ID NO：6所示；
[0015] 环介导扩增反应缓冲液包含：0.4mM dNTP、20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4、0.1％Triton X-100，1M beatine,1×SYBR green，共18μL。
[0016] 酶包含：8U Bst DNA Polymerase,5U AMV reverse transcriptase共2μL；
[0017] 阳性对照样本的基因序列为:
[0018]TGGTACCAGAAGCAGGGGCCTGGGCCCTCCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACCATCCAGGACCTGCGGGACAAGATTCTTGGTGCCACCATTGAGAACTCCAGGATTGTCCTGCAGATCGACAACGCCCGTCTGGCTGCAGATGACTTCCGAACCAAGTTTGAGACGGAACAGGCTCTGCGCATGAGCGTGGAGGCCGACATCAAC，如SEQ ID NO：7所示。
[0019] 作为本发明进一步的方案：酶包括DNA聚合酶与逆转录酶。
[0020] 作为本发明进一步的方案：所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞和肺癌细胞。
[0021] 与
现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0022] 本发明具有操作简单、成本低廉的优点。不需要适用抗体，降低了适用成本。本发明检测灵敏度高，能够快速、准确地检测乳腺、肺、肝等上皮细胞发育的癌症如(乳腺癌、肺癌、肝癌等)。
具体实施方式
[0023] 下面将结合本发明
实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0024] 实施例1
[0025] 肿瘤细胞诊断试剂盒使用之前，用户需自行准备：分析纯无水
乙醇、异丙醇、氯仿等试剂。
[0026] 1.外周血采集
[0027] 血液采集时间为每次
治疗前一天。静脉采集外周血9mL。需要将前5mL血液弃去，只收集后4mL，避免在针头刺破
皮肤后引入上皮细胞污染血样。
采血管为EDTA抗凝管，在血液采集3小时内需提取RNA。
[0028] 2.红细胞裂解。
[0029] 将4mL血液样品4等分后，分别与红细胞裂解液以1：5体积比混合，于
冰上静置10分钟，期间上下颠倒混合2次，待到血液透明后即可。如果10分钟后血液仍不透明，继续孵育5分钟，至透明。400g离心10分钟。弃去上清，加入2体积的红细胞裂解液，震荡混匀后，400g离心10分钟，收集沉淀。
[0030] 本发明中采用将收集的4mL
全血分为4等份后再相互独立处理分析，选取循环肿瘤细胞含量最高的一份做为最终结果，而不同于其它方法将所有
血液样本一起处理的方式。由于循环肿瘤细胞在外周血中含量很少，有时会以循环肿瘤细胞团簇的形式存在，如果将血液整体处理，容易将危害性更高的细胞团簇忽略，采取等分方法处理后可以显著提高检出率和准确度。
[0031] 本发明中采用裂解全血中红细胞后，离心获取所有非红细胞的方式，来尽量提高循环肿瘤细胞捕获效率。在现有其它方法中，都采用了基于表面抗原、大小、表面电荷、
密度差异等手段捕获循环肿瘤细胞，但由于癌细胞的异质性，造成用这些方法时不仅前处理方式复杂，还会丢失大量循环肿瘤细胞。
[0032] 3.RNA提取。
[0033] 1)加入1mL细胞裂解液，充分吹打混匀，室温下静止5分钟，充分裂解细胞。将细胞裂解液转移到1.5mL离心管中。
[0034] 2)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15秒，于室温下孵育5分钟。
[0035] 3)4℃，14000g离心15分钟，细胞裂解液上下分层。
[0036] 4)小心吸取上层液体0.4mL，转移到新的1.5mL离心管中。
[0037] 5)加入0.5mL异丙醇，上下颠倒充分混匀。室温静置10分钟。
[0038] 6)4℃，14000g离心10分钟，此时可见管底白色
羽毛状沉淀。小心吸弃上清，加入1mL，75％乙醇，7500g离心5分钟，吸弃上清。
[0039] 7)将离心管开口放置5～10分钟，挥发残余乙醇。
[0040] 8)加入10μL无RNA酶超纯水溶解沉淀。
[0041] 4.环介导扩增反应缓冲液、酶、引物、RNA样本
[0042] 将18μL环介导扩增反应缓冲液，3μL引物(引物中包含的物质的基因
序列表如SEQ ID NO：1-6所示)，2μL酶，2μL RNA样本充分混匀后置于冰浴，制得试样。其中RNA样本包括：a)步骤3所获得RNA样本，b)阳性对照样本(其基因序列表如SEQ ID NO：7所示)稀释10倍、
100倍、1000倍、10000倍、100000倍各一个，c)无RNA酶超纯水构成的阴性对照样本。
[0043] 5.扩增反应
[0044] 将步骤4混合好的试样放入萤光定量PCR仪中，进行反应。反应条件：65℃反应1小时，
荧光通道为SYBR Green，每1分钟采集一次荧光
信号。
[0045] 利用环介导等温扩增技术检测其中的CK19，Her2，ER，EML4-ALK等基因的表达量。
[0046] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附
权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0047] 此外，应当理解，虽然本
说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
