发明领域

本发明涉及一种能诱发猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的病毒的新 的减毒株。用来源于猴肾的新细胞克隆对毒性株进行减弱和复制的方法 可用于制备疫苗和诊断试剂盒，以早期诊断PRRS，并对该疾病进行有 效的预防性治疗。

现有技术

1987年，人们在北美首次发现一种猪的疾病，当时称为“神秘的猪 病”或MSD，以后又称作“猪不育和呼吸综合征”或SIRS。1990年， 在中欧首次发现相似的综合征，以后又传播到包括西班牙在内的其它欧 洲国家。开始时，欧洲称此病为“流行性猪流产和呼吸综合征”或 PEARS，最后称之为“猪生殖和呼吸综合征”或PRRS。这个名称逐渐 被广泛接受。

已知PRRS的病原体是一种包围RNA的小病毒，它是在荷兰首次分 离到的被称作Lelystad病毒。有人提出，该病毒属于动脉病毒 (Arterviridae)。该病毒在专利申请PCT WO-92/21375及欧洲专利 EP-B-05 87780(Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut) 中已有描述，而后者来源于前者。为这些申请的目的，上述病毒的分离 物被保藏于巴黎的巴斯德研究所，保藏号为I-1102。

如专利申请PCT WO-93/03760(Collins等)和欧洲专利申请 EP-A-0529584(Boehringer Ing.)中所述，北美型病毒的分离几 乎与欧洲型病毒的分离同时进行。为这些申请的目的，上述病毒的分离 物被保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为VR-2332。

欧洲型和北美型病毒有明显的不同，这不仅表现于血清学反应性而 且涉及到主要RNA片段核苷酸序列的同源程度。在欧洲专利申请EP- A-0676467(Akzo)的前两页中对二者的不同进行了详细描述，且引 用了大量的文献。在上述的专利申请中得出这样的结论，欧洲型病毒和 美洲型病毒在很久以前就已明确地分离。因此可预料，对其中一个类型 可能有效的疫苗对另外一个类型效果很小或根本无效。

从欧洲和美洲型病毒均分离到不同的毒株。每一毒株具有其独特 性，有几种毒株已成为专利申请的目标。例如，专利申请PCT WO- 93/07898(Akzo)描述了一种欧洲毒株，及由之产生的疫苗，保藏于 CNCM(巴斯德研究所)，保藏号I-1140。来源于同一优先权申请的 专利申请PCT WO-93/14196和欧洲专利申请EP-A-541418 (Rhōne-Merieux)，描述了在法国分离到的一种新的毒株，保藏于CNCM (巴斯德研究所)，序号I-1153。欧洲专利申请EP-A-0595436 (Solvay)描述了一种新的美洲毒株，其毒力强于开始时描述的毒株， 其中还描述了其疫苗。该毒株保藏于ATCC，但在专利申请中没有详述 其保藏号。最后，序号为ES-A-2074950(Cyanamid Ibērica)的 西班牙专利申请描述一种叫做“西班牙毒株”的毒株，它不同于欧洲和 美洲毒株，这种“西班牙毒株”保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心 (EACCC)保藏号为V93070108。

总之，PRRS的病原体很明显地表现出一些多样性，并且为了有效 地与该疾病作斗争，需要依感染猪的毒株类型而不同的疫苗。

在母猪中，该疾病的特征在于缺乏食欲，厌食，生殖性疾病(流产， 早产，死产或产虚弱的小猪，胚胎死亡，有或没有干尸化)。有时感染 的母猪会死亡。一种较少出现的症状是耳部、腹部或外阴部出现短暂的 蓝色；因此该疾病起初在荷兰被称作“Abortus blauw”，在英国被称为 “蓝耳”。在小猪中，这些症状是年龄依赖性的；在新生的小猪中，可 观察到呼吸困难和肌肉震颤，而在较大些的小猪中，后部的麻痹和共济 失调则更常见。在流行的高峰期，出生第1天的死亡率是有限的，但在 10天大的小猪中可达到80％。感染的育肥猪出现短暂的少食和较多的呼 吸系统的问题。

疾病的潜伏期变化很大，从5天至37天(I.B.Robertson Eurp.Comm.Seminar on PRRS，11：4-5，布鲁塞尔，1991)。有 时，该疾病的传播非常慢，但是，当一个农场感染的时候，该疾病可持 续数月(B.Thacker，Int.Symp.on SIRS，St.Paul/Minnesota， 1992)。

抗这些病毒的抗体，在感染后6天，已用免疫过氧化物酶技术(免 疫过氧化物酶单层法，以后称为IPMA)检测出来，如Wensvoort等所 描述的(The Vet.Quart 13：121-130，1991。5天后抗体的滴度可达到 1/20,000，通常能持续12个月以上。但是如V.Ohlinger等，Meredith， M.De.Pig Dis.Info.Center Cambridge，1992年12月所报道的，一些 猪在4-5个月以后血清呈阴性。这些作者可以从感染后的不同器官中 分离病毒，感染6周后，肺、血清、血浆及血细胞匀浆中病毒的滴度可 达到106 TCID50(组织培养物感染剂量的50％)。这表明病毒和抗体 一起可持续几周。此外，人们还认识到在疾病爆发中存活下来的动物对 于敏感的猪是传染源。感染后1天可检测到病毒血症，这可持续56天， 通常较之为短。

在病毒的血源性传播中，病毒可到达怀孕母猪的胎盘。已经证明， 病毒可通过胎盘引起胚胎死亡。最高的胚胎敏感性发生于怀孕的倒数第 三周(last third of gestation)中。此外，病毒可在胚胎中复制而不引起 胚胎死亡。但是，从干尸化胚胎或自溶胚胎中还没有分离到该病毒。

在小猪中，当从初乳中获得的母体抗体减少时会发生这种疾病。在 怀孕的倒数第三周(Iast third of pregnancy)中感染病毒的母猪所生下的 活猪仔，其中一些可在初次哺乳前观察到抗病毒的抗体。通常，这些动 物在出生时也可表现出病毒血症(C.Terpstra等，Vet.Q.13：131- 136，1991)。

尽管大量巨噬细胞被破坏，但是还没有明确证实诱发PRRS的病毒 的免疫抑制活性。但是经常出现与之相关的继发性感染，在养猪场中引 起严重的经济损失。

现在，可在有大量猪群的大多数国家中发现PRRS病毒。

由于直接地或间接地因PRRS病毒感染而产生的继发性病因所造成 的经济损失，如今，PRRS是影响养猪业的最重要疾病之一。

用猪的肺泡巨噬细胞(PAM)培养物制备的无活性疫苗在实验室中 得到可接受的结果，但在农场环境中的效力部分依赖于环境状况及对接 种动物进行的管理。

阻碍获得抗PRRS病毒免疫产物的问题之一是用于病毒复制的稳定 底物的利用率很有限。

直到最近，PRRS病毒仅能在猪的肺泡巨噬细胞(PAM)培养物中 扩增(Wensvoort G.等，The Vet.Quart.13：121-130，1991)。用 一定年龄的无疾病的猪来获得这些巨噬细胞有一些缺点。此外，在回收 的PAM中不能保证对病毒感染的敏感性，因为从不同动物得到的细胞底 物经常不同。这就成为导致制备恒定和同质批量抗原的主要障碍，并且 每一批量抗原均需对其进行评价以确定其敏感性。

由于所有这些原因，稳定和持续的细胞宿主利用率的降低严重地阻 碍了获得突变物的研究进程，而该突变物是基于PRRS病毒在细胞底物 中的复制和减毒变种的选择之上的。

待解决的主要问题之一是中和毒性病毒使之不能在PAM中复制， 因为病毒复制会导致PAM的破坏。

因此，病毒对来源于转化细胞系的底物的适应性将会为获得减毒突 变株和制备灭活疫苗提供适宜的手段，由此可排除PAM的依赖性和可变 性。

专利申请PCT WO 94/18311(Miles)建议将某一PRRS病毒株 在独特的称作克隆9009B的克隆中增殖，9009B来源于非洲绿猴肾细胞 系，专利申请人称为MA-104(M)系，后者来源于名为MA-104的商 品细胞系。在该专利申请中没有说明这一独特克隆的保藏，因此该专利 难以实施和重现。

发明目的

本发明的目的是PRRS病毒的新的减毒株，该减毒株使得可以以稳 定和可再现的方式得到无毒的猪疫苗，该疫苗对预防PRRS有高的有效 性。

本发明的另一目的是来源于稳定的猴肾细胞系MA-104的细胞克 隆及其制备方法，该细胞克隆能够维持PRRS病毒高滴度生长，使得能 获得特定减毒株的稳定的病毒收获物。

本发明的另一目的是对PRRS疾病有效的疫苗及其制备方法，该疫 苗可从新的减毒株及其突变株得到。

本发明的另一目的是PRRS疾病的诊断试剂盒及其制备方法，该试 剂盒可从新的减毒株或其突变株得到。 发明详述

本发明的PRRS病毒的减毒株是从一个西班牙农场的感染的猪中分 离到的毒性株经减毒后得到的。为了满足说明的充分性，该减毒株保藏 于巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)，保藏号为1 -1642。保藏日期为23/11/95。

毒性株的减毒和复制在细胞克隆中经过系列传代进行，这一细胞克 隆也是本发明的目的，作者称之为Clon-8。该克隆从一名为MA-104 的商品猴肾细胞系而来。也是为了满足说明的充分性，Clon-8于上述 日期保藏于巴斯德研究所的CNCM，保藏号为I-1643。

以前，克隆商品细胞系MA-104用于筛选和分离Clon-8。克隆 是这样进行的：把细胞悬浮在合适的生长培养基中(例如含胎牛血清(FBS) 的Earle′s基本培养基)，以不同的浓度铺放悬液，筛选并用胰酶消化克 隆，然后在培养瓶中扩展。用所描述的方法对所得到的克隆进行连续克 隆，直到获得分化良好的克隆。

去除形状不规则或难以扩增的克隆，测定所选克隆对PRRS病毒起 始毒性株感染的敏感性。由于Clon-8且对病毒复制的高敏感性(高 TCID50)和所得病毒收获物的一级性和再现性，故选择了Clon-8。

毒性株通过在Clon-8培养物中进行连续复制而减毒，优选在34 ℃进行。测定感染的病毒颗粒含量以估计其复制能力，检测细胞病变的 效果(CPE)以估计适应度。根据所得结果，病毒在Clon-8中可进行复 制，至少在20代中没有生命力的丧失，减毒的结果是提供了一种实用的 保存其抗原性的无毒病毒。

因此，本发明的PRRS病毒减毒株是以一种稳定和工业上可重复的 分式获得的，从而便于用它来获得PRRS疫苗和PRRS诊断试剂盒。

感染了毒性株或感染了减毒株的猪群间进行的对比试验清楚地表 明，减毒株对感染了它的动物无害。另外，本发明的减毒株在血清阴性 的猪中表现出了高复制效率，并且以200 TCID50的小剂量肌肉内接种 给动物时可诱导产生血清转化现象。这种方法诱导产生的抗体可至少持 续80天。

因而本发明的减毒株是制备预防猪PRRS疫苗的良好基质。可用本 领域中任何一种人们所熟知的方法来制备这种疫苗，可制成各种传统的 形式，如分散液、乳油液、脂质体组合物、冻干形式等。疫苗组合物可 用不同的佐剂完成，如免疫刺激物，乳化剂，稳定剂等。疫苗的施用可 以是肌内的或皮下的，鼻内的，气管内的，皮的，经皮的或皮内的。

疫苗的有效剂量可有很大变化，优选范围为本发明减毒株的102- 106 TCID50。

所得疫苗也可制备或多价疫苗，与另外的活的或灭活的猪病毒一 起，或与活的或灭活的细菌一起，这也是本发明的一个目的。

如本领域的技术人员所熟知的，疫苗也可以制备成包含有来源于本 发明病毒株的病毒抗原的疫苗，例如用热或化学方法等任何一种传统的 方法使含有该毒株的疫苗以完全灭活的形式存在，如含有该毒株被膜或 RNA片段的疫苗等等。

本发明的减毒株也可通过利用传统的技术用于制备诊断试剂盒，该 试剂盒包含有能用于检测血清阳性动物中抗体的抗原成分。例如，用于 检测PRRS抗体的IPMA过程包括下列步骤： a)使本发明的减毒病毒适应一种在培养微板中的稳定细胞培养物，优选 克隆Clon-8，这种方式每孔中有20-40感染颗粒进行感染。 b)用已知的固定剂把感染的细胞固定在固相载体上。 c)检测猪的血清抗体，把血清抗体在微板中培养，随后用IPMA技术对 微板中的抗体进行染色。

附图简述

作为其中的一部分，本说明书附有两页共4张图。图中，以下的描 述是阐释性的，不是限制性的。

图1是一张二维图，表明了鼻内接种本发明的减毒株后，妊娠母猪 的直肠温度的变化。

图2是一张二维图，表明了接种了本发明的减毒株的母猪所生小猪 的体重变化。

图3是一张二维图，表明了用IPMA检测的接种本发明减毒株的母 猪子代的乳液内抗体的动态图，母猪1和10的子代在出生时滴度较低， 这是由于在抽血时一些猪仔还没有吃奶。

图4是一张三维图，表明了肌内接种本发明减毒株的200，2,000 和20,000 TCID50的猪仔中体液应答的状况。

实施例

以下给出几个方法的实施例来更明确地对本发明进行阐述。这些实 施例不应被认为是对发明范围的限制。 实施例1从稳定的猴肾细胞系MA-104获得细胞克隆

用欧洲动物细胞培养物保藏中心提供的保藏号为85102918的稳定 猴肾细胞系MA-104，对筛选的PRRS毒株传代6次，传代在塑料培 养瓶中单层生长的静止的培养细胞中，在补充有10％胎牛血清(FBS) 的Earle′s MEM培养基中，37℃没有CO2补充的情况下进行。每次传代 中接种6-7天后收集病毒收获物。

为了检测病毒收获物的量，用不同感染量(此后称MOI)的毒株接 种给该细胞系。所获得病毒收获物的量很低(103-104 TCID50/ml)， 即使在四次适应传代后也不足以用于疫苗产物。

这些实验中可观察到仅仅有部分感染的细胞对毒性病毒敏感，而剩 余的细胞对感染具有不感受性，出于这一原因，克隆这一细胞系，以选 择那些全部对毒株敏感的细胞群。

克隆的筛选如下进行：

细胞系的悬液在含20％FBS的Earle′s MEM中稀释，把不同的稀 释液加到96孔微板(NUNC)中。37℃，5％CO2培养8天。在第3 天时，用显微镜观察筛选只有一个细胞的培养板，在第8天用胰蛋白酶 消化。这样获得44个克隆。此后，所得克隆在培养瓶中扩增，直到达到 5×107/ml。然后用同样的步骤对这些细胞进行第2次和第3次克隆。

第3次克隆后，将得到的44个克隆扩增到获得25ml每一克隆含6 ×106/ml的细胞悬液。整个过程所应用的培养基含20％FBS。

根据其生长和活力特征对这些克隆进行进一步筛选。 实施例2细胞克隆Clon-8的筛选

根据其生长效力对前一实施例中所得的克隆进行评估，去除那些有 繁殖问题，形态不规则或难以在37℃维持的。经过这一预选后，去除25 个克隆，选出余下的9个克隆。

所筛选的克隆用在PAM培养物中第8代传代的PRRS病毒的毒性株 悬液进行感染(如Bloemberg，M.等在Vet Microb.42，361-371， 1994中所描述的)。预先进行细胞克隆的适应过程：病毒在37℃3次传 代中进行复制，保持80-90％的融合单层与病毒悬液接触6天，然后 在-80℃冷冻，24小时后融化。

用补充有10％FBS和庆大霉素(0.4mg/ml)的Earle′s MEM作感 染培养基。抗真菌或抗酵母的化合物均不应用。这样所获得的每种病毒 收获物在相应的细胞克隆中进行滴定。对结果进行分析后，可得出这样 的结论：这9个克隆对病毒感染敏感，滴度大于等于104.2 TCID50/ml。 结果见表I。

表I所得细胞克隆对特定毒性株的敏感性 克隆或细胞系 滴度TCID50/ml 未克隆的细胞系 102 克隆1 105.75 克隆2 102.5 克隆3 105.2 克隆4 105.3 克隆8 106 克隆29 105.75 克隆30 105.38 克隆41 105.38 克隆44 104.2

如表1中所看到的，未克隆的细胞系对病毒的敏感性很低，因此用 它作抗原来获得有效的疫苗似乎是不可行的。表1也显示出一些克隆株， 尤其是Clon-8，其对病毒的敏感性比未克隆的细胞系高得多，克隆 Clon-8尤为显著，当滴度达到106 TCID50/ml的时候，可从Clon-8 的病毒收获物中获得。

根据上述的结果，选择了Clon-8。用几种方法研究了该克隆的可 靠性。在几种不同的方法中，病毒收获物的滴度有很好的重复性，其值 在105-107TCID50/ml之间。 实施例3减毒病毒株的获得

本发明减毒病毒株是通过在34℃复制Clon-8细胞培养物中特定 的毒性株而得到的。

病毒感染的Clon-8细胞单层在34℃保持直至CPE形成。CPE 的检测通常比在37℃保持的培养物中的晚24-48小时，但是，没有发 现在两个温度下形成的CPE有明显的差异。

利用Clon-8细胞单层对收获的病毒收获物进行滴定。此外，用 IPMA检测了病毒的一致性。

将病毒接种给75cm2接近融合的Clon-8细胞单层，然后在34℃ 吸附2小时。接着，把感染培养基加到单层细胞。感染培养基是调整了 的Earle′s基本培养基，补充有10℃FBS，预先加热到34℃。

把75cm2的培养瓶放置到34℃的培养箱中，每天检查直到发现清楚 地CPE。经常是在感染后第5天和第7天，当80-95％的细胞单层出 现CPE时，收集病毒的收获物。然后将病毒收获物以2000rpm进行离心， 并对悬液进行滴定以确定病毒的滴度(TCID50/ml)。

用上述的方法传代20次。在第1、5、10、15、20次传代的时 候对病毒的含量进行评价。结果表明，病毒可于34℃在Clon-8细胞 单层中复制。而无任何活力的丢失，至少传代20次是这样的(表II)。 表II 34℃病毒在Clon-8中从P.1至P.20代的增殖的评价     在Clon-8中传代     病毒含量TCID50/ml     P.1     105.5     P.5     105.7     P.10     105.3     P.15     105.6     P.20     106.2

进一步的结果证实，Clon-8细胞单层可在MOI为0.001时感染。

下面实施例中进行的实验表明，从P.20得到的强毒株对猪无害。 实施例4减毒病毒株的生物学特性和用它接种的效果

开始时应用的用于获得本发明减毒株的病毒株是一毒性株。对妊娠 母猪的主要作用为早产，产衰弱，死亡和/或干尸化的新生猪仔，被感染 的母猪也可在感染后的4-5天出现3-5天的轻微呼吸困难和抑制。

用起始毒性株的106.6 TCID50鼻内感染四只妊娠的母猪(参考号 01，02，03，06)。用两只未感染的母猪(参考号73和74)作对照。 结果如表III所示。

表III妊娠母猪接种毒性株后对子代的影响 母猪 参考号 接种毒 性病毒     所产猪仔数   存活                死亡             干尸化 断奶前死亡 的猪仔数     01     +     10     2     0     2     02     +     15     0     0     4     03     +     6     5     0     2     06     +     6     6     0     1     73     -     13     0     0     0     74     -     10     0     0     0

仅有一只感染的母猪在预定的日期生产。感染的母猪分别产了2、 0、5、6只死产的猪仔，2、4、2、1只衰弱的猪仔。衰弱的猪仔出 生后几天死亡。断奶时，每只对照母猪平均有11只猪仔存活，而每只感 染的母猪产的猪仔平均仅存活6.5只。断奶时，猪仔的平均重量为4621g (感染母猪的猪仔)和5363g(对照母猪的猪仔)。从衰弱猪仔的肺匀 浆中分离出有毒的PRRS病毒。进行感染攻击后，感染的母猪及其子代 均出现血清转化现象。

利用两种性别的猪：通过特异性试验实现本发明减毒病毒株的生物 学表征。无害试验在3个PRRS血清阴性的妊娠母猪中进行，这些猪来 源于一个从来没有流行过PRRS的小农场。在母猪怀孕的倒数第三周接 种病毒，这时对病毒最敏感。在怀孕的第78天和第93天之间鼻内施用 减毒病毒，每只母猪的剂量为106 TCID50。接种病毒后，3只母猪的生 理常数保持未变，直肠的温度在正常参数内(见图1)。三只母猪也都 在预定的日期生产。所得结果概括在表IV中。

表IV妊娠母猪接种减毒病毒后对后代的影响 母猪 参考号 接种减 毒病毒     产猪仔数   存活              死亡              干尸化 断奶前PRRS 引起的死亡数     1     +     13     0     3     0     2     +     4     1     0     0     10     +     16     0     1     0

这三只母猪分别产13、4和16只猪仔。新生猪仔的生命力被认为 正常。然而，在两只母猪的后代中发现几只干尸化的猪仔。猪仔的重量 变化在所有的个体中都是正常的(见图2)，直到观察期末(45天)都 在正常参数范围内。在任一猪仔中均未发现与PRRS病毒感染的有关的 虚弱及紊乱。此外，在新生猪仔的血液或血清样品中均未检测到PRRS 病毒。

病毒接种21-36天后，在妊娠母猪的血液和血清样品中均未检测 到PRRS病毒。所有的事实证明妊娠母猪中的减毒PRRS株无毒害作用。 很明确这是对野生型病毒感染的最敏感类型。当用传统的技术在PAM培 养物中筛检PRRS病毒存在的时候发现接种后的妊娠母猪所产新生猪仔 的血清样品为阴性。用减毒病毒接种的三只母猪产后45天体液中抗体的 IPMA滴度为1/480，这一滴度很稳定，45天之后稍微有些变化。母猪 在接种21天之后血清呈阳性，如图3中所能见到的，感染母猪所产猪仔 在初次吸乳之后出现血清阳性，这种情况至少能持续到75天龄。

在一组12只怀孕至倒数第三周的母猪中进行了另外的无毒试验，八 只母猪肌内接种39疫苗剂量(105 TCID50)剩余的四只作对照以评价 减毒株对生殖参数的影响。接种的母猪的生理参数无变化，并且这些猪 在预定日期生产。结果如表V所示。如在表中所能见到的。接种了的母 猪和作为对照的四只母猪均产下正常数目的猪仔。猪仔也有正常的生命 力。

表V接种减毒病毒对怀孕至倒数第三周的母猪的生殖参数的影响 母猪的 参考号 接种的 与预产期 的偏差(天) 存活的 猪仔数 体重低于平均 体重的猪仔数 衰弱猪仔 的数量 死产猪仔 的数目 干尸化猪 仔的数量 猪仔总数     85     是   1(+)     11     1     0     1     0     12     94     是     0     9     0     0     0     1     10     96     是   1(+)     13     2     1     0     0     13     102     是   2(+)     13     1     0     1     2     16     116     是     0     10     0     0     1     0     11     121     是   1(+)     11     0     0     1     0     12     143     是   1(-)     14     2     1     2     1     17     151     是   2(+)     8     0     0     0     0     8     76     非   2(+)     7     0     0     0     2     9     79     非     0     13     2     1     1     0     14     81     非   1(-)     9     0     1     0     0     9     83     非   1(-)     10     1     0     1     1     12     A包括B和C    F＝A+D+E

本发明的减毒株能在PRRS血清阴性的猪中进行有效的复制。这可 由这样的事实证明，肌内施用小至200 TCID50的减毒株即可复制并能 在猪内诱导血清转化。如在图4中所能见到的，在接种的动物中诱导的 抗体至少能持续存在52天。

本发明的减毒病毒并不传播给与肌内接种的八只猪仔放在一起的那 四只未接种的标记了的猪仔。病毒不传播给未接种的动物这一事实说明 减毒株适宜用作疫苗。而且，在接种的猪中没有发现白细胞减少或任何 其它临床症状，这表明当肌内施用时减毒病毒也无毒害作用。接种后11 天就有平均86％的接种猪仔出现血清阳性。

本发明的减毒病毒能在接种的猪中诱导保护性免疫应答，这能防止 PRRS毒性株感染的临床效应。因此当4周龄的接种猪仔感染毒性病毒 时，其中75％没有发现临床症状。但从另一方面来说，如表VI中所能 见到的，有80％的未接种的对照猪仔在进行实验性感染后出现直肠温度 的显著升高，而且，实验性感染后19天进行尸检，接种猪仔的肺损伤明 显低于未接种的对照组。以同样的方式实验性感染后仅在25％的接种动 物中发现毒性病毒，而未接种的对照动物中有80％能在感染后至少12 天检测到毒性病毒。

表VI感染后接种的对照的猪仔中的高热现象 出现高热的猪仔数/猪仔的总数 高热的天数 接种的猪仔(肌内) 1/4 1 未接种的猪仔 4/5 8 保藏的微生物的资料

根据布达佩斯协定，本发明的病毒毒株和细胞克隆Clon-8均保藏 于(法国)巴黎巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心(CNCM) 的国际机构。

申请人识别号  CNCM号    保藏日期

VP-046-BIS    I-1642    23/11/95

Clon-8        I-1643    23/11/95

这些保藏品是在布达佩斯协议规定的状态下为公众可得到的。这并 不能解释为允许实施本发明，因为这样将侵犯本发明申请人的权利。