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一种前列腺癌早期诊断 试剂盒

阅读：537发布：2020-05-14

专利汇可以提供一种前列腺癌早期诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种前列腺癌早期诊断试剂盒，包含三种试剂：血清前列腺癌特异抗原 (PSA)、前列腺特异性抗原基因(PCA3)、人激肽释放酶(hK2)。本发明通过实时荧光定量PCR的方法对接受前列腺穿刺活检的患者外周血中的多项分子标记进行半定量检测，筛选出PCA3，hK2，miR-141能够增加前列腺癌诊断敏感度和特异度的分子标记物，尤其位于PSA灰区的患者，PCA3，hK2与PSA的联合检测能够成为前列腺癌早期诊断的重要手段，且诊断的敏感度和特异度上均明显的高于现有的基于PSA的诊断。，下面是一种前列腺癌早期诊断试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种前列腺癌早期诊断试剂盒，其特征在于，包含三种试剂：血清前列腺癌特异抗原(PSA)、前列腺特异性抗原基因(PCA3)、人激肽释放酶(hK2)。

说明书全文

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种前列腺癌早期诊断试剂盒。

背景技术

[0002] 前列腺癌是欧美国家男性中最常见的恶性肿瘤，其发病率在男性恶性肿瘤中居世界第2位，中国人群的前列腺癌发病率相对较低，但近年来呈上升趋势。前列腺癌的主要检查方法有直肠指检(DRE)，血清前列腺癌特异抗原(PSA)以及经直肠超声引导下前列腺穿刺活检。其中直肠指检联合PSA检查是目前公认的早期疑似前列腺癌诊断的最佳方法，但是PSA检测具有敏感性高，特异性相对较低的特点，尤其是当PSA位于4-10ng/mL之间时，前列腺癌的检出率仅为25％左右，同时PSA又容易导致前列腺癌的过度诊断和过度治疗。因此迫切需要寻找前列腺癌早期诊断的新指标，以最大限度的提高前列腺癌诊断的特异度和敏感度，同时减少临床无意义的肿瘤的检出和避免过度治疗。

[0003] 目前存在大量的针对不同分子标志物的研究结果显示，新型的分子标志物尤其是不同标记物之间的联合应用，有可能成为前列腺癌早期诊断的关键。其中前列腺特异性抗原基因(PCA3)，TMPRSS2：ERG融合基因，人激肽释放酶(hK2)以及多种miRNA等在细胞学层面的研究显示具有临床应用潜能。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种前列腺癌早期诊断试剂盒。

[0005] 本发明采用如下技术方案：一种前列腺癌早期诊断试剂盒，包含三种试剂：血清前列腺癌特异抗原(PSA)、前列腺特异性抗原基因(PCA3)、人激肽释放酶(hK2)。

[0006] 本发明的有益效果在于：本发明采用PCA3，hK2与PSA的联合检测进行前列腺癌的早期诊断，尤其是对于PSA灰区的患者，具有更高的临床指导意义。相较之前依据PSA、PSAD的监测方法具有更高的敏感度和准确性。附图说明

[0007] 图1A为游离PSA比值的ROC曲线；B为PSA和PSAD的ROC曲线；C为PSA4-10ng/ml时游离PSA比值的ROC曲线；D为PSA 4-10ng/ml时PSA和PSAD值的ROC曲线。

[0008] 图2为hK2，PCA3，miR-141及PSA等分子标记物在前列腺癌组与前列腺增生组的表达的ROC曲线。

[0009] 图3为采用logistics回归建立基于3个分子标记物指标的预计概率值，去除骨转移患者PSA，hK2和PCA3以及基于3者的预测概率的ROC曲线。

[0010] 图4为PSA位于4-10ng/ml患者中PSA，hK2和PCA3以及基于3者的预测概率的ROC曲线。

具体实施方式

[0011] 下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的分析。

[0012] 实施例1：采用本发明的试剂盒，进行前列腺癌早期诊断：

[0013] 1.研究对象：本研究对象为浙江大学医学院附属第一医院2014年1月至2015年7月期间住院接受前列腺穿刺活检的病人，共计100例。

[0014] 2.采样方法：接受前列腺穿刺活检病人入院时采集外周静脉血5ml，加入EDTA抗凝管中。采用化学发光微粒子免疫检测法检测，采用ARCHITECT Total PSA Reagent Kit试剂盒检测tPSA和fPSA。

[0015] 3.临床信息收集：包括取样日期，住院号，病人姓名，病理号，年龄，联系方式，身份证号码，入院时PSA，游离PSA比值(检查在入院当天完成)，前列腺体积(腔内B超)，穿刺次数，临床症状，用药史，尿潴留史，前列腺MRI(3.0T，包含弥散相)，病理结果(包括穿刺针数，Gleason评分)，ECT结果，手术病理等信息。

[0016] 4.细胞系：人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3及DU-145，购自中国科学院上海细胞生物研究所。

[0017] 5.细胞培养：上述两种细胞用RPMI-1640培养基，然后在RPMI-1640培养基中加入10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml 链霉素，置于37℃，含5％CO2的恒温培养箱中培养。

[0018] 6.qRT-PCR检测：利用qRT-PCR技术检测2株细胞系中PCA3、Hk2、mir-141的表达水平。使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，使用PrimeScript反转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行qRT-PCR分析，结果使用磷酸甘油酸脱氢酶(GAPDH)进行标准化。

[0019] 所使用的的PCR引物如下：

[0020]基因序列
GAPDH-F CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT
U6-F TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC
PCA3-F GAGAACAGGGGAGGGAGAG
PCA3-R ACGTTCTGGGATACATGTGC
pri-mir-141-F ACCCAGTGCGATTTGTCA
pri-mir-141-R ACTGTACTGGAAGATGGACC
Hk2-F GGCTCTGGACAGGTGGTAAAGA
Hk2-R CGGTAATGCACCACCTTGGTGT
KLK3-F CGCAAGTTCACCCTCAGAAGGT
KLK3-R GACGTGATACCTTGAAGCACACC
ERG-F TAGGCGCGAGCTAAGCAGGAG
ERG-R GTAGGCACACTCAAACAACGACTGG

[0021] PCR反应条件为：95℃预变性30s；按下列参数循环40次：95℃变性3s，60℃退火30s；4℃停止反应。

[0022] PCR反应在ABI 7500Fast Real-Time PCR仪上进行相对定量检测，以GAPDH为内参，比较其在穿刺阴性和阳性病人外周血中的差异表达，采用2-△△Ct法。

[0023] 7.统计学分析：采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。配对资料比较采用Wilcoxon配对秩和检验，P<0.05认为具有显著性差异。所有实验结果均取3次或以上独立重复试验的平均值。用受试者工作特征曲线(ROC)确定最佳临界值、曲线下面积(AUC)，对筛选的分子标记物的诊断效能进行评价。结果如下：

[0024] (1)筛选出hK2，PCA3，miR-141为前列腺穿刺患者外周血中有表达差异的分子标记物。

[0025] 利用RT-PCR对100例接受前列腺穿刺活检患者的外周血中的分子标记物进行筛选，发现其中hK2，PCA3，miR-141等在前列腺癌组与前列腺增生组中的表达存在差异(P<0.05)。PSA的敏感度高于其他分子标记物，而特异度则低于PCA3。

[0026] (2)建立基于3个分子标记物指标的预计概率值；

[0027] 采用logistics回归建立PSA，PCA3，hK2三个分子标记物指标联合的预计概率值为0.789。去除骨转移患者后PSA，PCA3，hK2以及三个分子标记物指标联合的预计概率值分别为0.692，0.682，0.587以及0.756。

[0028] (3)在tPSA灰区建立联合3个分子标记物指标的预计概率值；

[0029] 在tPSA位于4-10ng/ml的灰区，联合3个指标的预测概率在诊断的敏感度和特异度均显著高于PSA。PCA3，hK2单独应用时，AUC-ROC也显著高于PSA。

[0030] 上述实施例并非是对于本发明的限制，发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

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