人类乳头瘤病毒
在单个试验中实施识别所有不同的HPV型的可靠而强大的以 DNA为基础的检测系统，一直是有挑战性的，因为不仅不同的HPV 基因组型之间存在交叉杂交的问题，而且对构成一种HPV型的精 确分类依赖于基因组序列相似性，其具有明显的生物信息局限性。 因此，当新的HPV型被定义为那些与以前的HPV型有少于90％的 的序列相似性时，更精细的分类学细分有更多问题有待解决。因此， 当相对于以前亚型DNA的序列相似性在90-98％的范围时，则定义 为一种新的HPV‘亚型’。当序列相似性在以前变种的98-100％之 间时，则定义为新的“变种”(1993，Van Rast，M.A.，et al.， Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，S.A.and Herrington， C.S.Sex.Transm.Inf.74，101-109)。该范围可以进一步扩展至根据比 较来自单个分离的病毒颗粒的单个基因组来测定变异。在这种情况 下，“基因型”可以为任何充分测序的HPV基因组，其最少通过一个 碱基与任何其它充分测序的HPV基因组区分。这包括在确定位置 的单个碱基可以四种状态G、A、T或C之一存在的所有情形；以 及在特定位置的碱基通过缺失、插入、扩增或转座至其他位置而改 变的情形。
现存的HPV检测系统在疾病风险评估中所面临的困难大致分 三方面。首先是技术系统本身的局限性。第二是患病细胞种群病理 解释的局限性。第三是在临床水平评估不同人群(不同人群在遗传 背景和起作用的协同因素方面存在差异)疾病进展的局限性。
宫颈异常的临床检测
某些型的HPV在宫颈癌中被牵连，而且促进一部分更不确定 比例的阴道、外阴、阴茎和肛门癌发生。作为宫颈移行带的组织环 是HPV致癌性的高度易感性的区域，评估其从完全细胞常态到浸 润癌的状态已经成为采用肉眼或显微镜标准，通过组织学、细胞学 和分子生物学方法的常规评价。在病毒水平以及缺陷的人细胞水平 的病毒诱导异常的早期检测，如果可以有助于确定细胞种群达到的 从正常到异常组织所经过的分子轨道，将具有重大的临床意义。然 而，尽管巴氏涂片(或宫颈抹片)已经使用了半个世纪，目前在异 常宫颈细胞学诊断和正常状态之间的可靠而早期的风险评估仍然 存在问题。主要问题围绕着确定“前癌”如多级宫颈上皮内瘤变 (CIN1、CIN2和CIN3)根据的难以定义的标准，并因此确定与 治疗选择相关的临床决策。一些临床医师认为“癌前”定义是以假 -真方式(pseudo-precise way)避免采用CIN2、CIN3和原位癌。CIN2 的显微镜诊断甚至临床意义存在巨大的异质性(2003，Schiffman，M.， J.Nat.Cancer Instit.Monog.31，14-19)。一些CIN2病变具有不好的 显微镜下表现，但仍然会被免疫系统克服而消失，然而其他病变进 展为浸润癌。因此，有些人认为CIN2是疑似诊断缓冲区，尽管这 样一个区域的界定条件仍然存在争议。尽管一些临床医师认为将 CIN2与CIN3合并实用性较差，然而其它临床医师会治疗所有CIN2 或更严重的病变。最后，文献表明1/3到2/3之间的CIN3已知的女 性会发展为浸润癌，但即使这种也是以一种不可预测的时间依赖性 方式发生的(2003，Schiffman，M.，J.Nat.Cancer.Instit.Monog.31， 14-19；1978，Kinlen，L.J.，et al.，Lancet 2，463-465；1956，Peterson，O. Am.J.Obstet.Gynec.72，1063-1071)。
医师们现在仍然面临的中心问题就是确定低度细胞学异常例 如不典型鳞状细胞(ASCUS)或者鳞状上皮内病变(SILs)是困难 的。‘实际上，ASCUS不是一个恰当的诊断而是一种对较难理解的 改变的“废纸篓”分类’(1996，Lorincz，A.T.，1996，J.Obstet.Gyncol. Res.22，629-636)。由于来自使用口服避孕药、吸烟、除HPV以外 的病原体例如沙眼衣原体和II型单纯疱疹病毒、抗氧化营养素和宫 颈炎症等的协同作用(声称其都可调节从高度鳞状上皮内病变 (HSILs)到宫颈癌的进展风险)，癌前病变的总的范围难以解释(2003， Castellsague，X.J.Nat.Cancer Inst.Monog.31，20-28)。引入Bethesda 分类系统及其在2001年的修订没有减少临床医师的混乱，因为最 初即发现将有CIN1的空洞的细胞合并入低度鳞状细胞上皮内病变 (LSILs)的新的分类并无帮助。引入Bethesda系统的结果是许多临床 医师对凹空细胞不行阴道镜检查，“但感到必须对CIN1患者做该检 查”(1995，Hatch，K.D.，，Am.J.Obstet.Gyn.172，1150-1157)。很显 然，尽管阴道镜检查专家需要多年的训练，但主观的细胞学标准仍 然会导致不一致性和不可重复性(1994，Sherman，M.E.，Am.J.Clin. Pathology，102，182-187；1988，Giles，J.A.，Br.Med.J.，296， 1099-1102)。
持续的诊断障碍即模糊诊断例如“非典型性”在某些情况可能 占诊断的20％或者更多(1993，Schiffman，M.Contemporary OB/GYN， 27-40)，这可以通过一个专门设计用来评估病理学家对‘非典型’ 涂片的独立诊断一致性的试验来阐明，发现五个专业病理学家对同 一组样品的精确一致性只有29％(1994，Sherman，M.E.，et al.，Am.J. Clin.Pathology，102，182-187)。最终结果为宫颈细胞学仍然具有较高 的假阴性率(称为低敏感度)和较高的假阳性率(称为低特异性)。 不同病理学家的细胞学解释产生的假阴性率达20％左右，假阳性率 达15％(1993，Koss，L.G.，Cancer，71，1406-1412)。假阳性结果导致 不必要的阴道镜检查、活检以及治疗，这些均增加医疗费的负担。 假阴性结果导致潜在的医疗事故法律诉讼以及相关费用。在此方面 利用HPV检测对宫颈异常早期阶段的分子诊断提供一个比细胞学 诊断主观性更少的检测。
用于HPV检测方法的局限性
HPV DNA的存在最初是通过将低严谨度DNA印迹技术应用 于来自外阴生殖器疣的样品的DNA中测定的(1975，Southern，E.M.， J.Mol.Biol.98，503-527；1993，Brown，D.R.，et al.，J.Clinical Microbiology，31，2667-2673)。然而，在临床使用中发现该技术“繁 琐、耗时且需要新鲜的组织样品”并且存在广泛的实验室间变异。 该技术被认为‘不适合于临床应用’(1995，Ferenczy，A，Int.J. Gynecol.Cancer，5，321-328)。
引入DNA印迹的变体即斑点杂交是经美国食品和药物管理局 (FDA)批准的，以VirapapTM和ViratypeTM(Life Technologies Inc， Gaithersburg，Md)上市。检测限值为3pg的HPV DNA/ml样品，约 375,000病毒基因组/ml。然而，结果显示VirapapTM试剂盒的敏感度 低于细胞学方法(1991，Bauer，H.M.，JAMA，265，472-477)。另外， 这种使用放射性核酸用于检测的试剂盒，在临床使用中是耗费人力 的、昂贵的，并且其临床适用性方面也存在广泛的争议。最后，用 于ViratypeTM的分子杂交条件产生不同的HPV型之间的交叉杂交。 因此，要准确确定样品中存在哪种HPV型，必须以高于生产商规 定的严谨度再进行一次ViratypeTM检测。
在原位细胞学水平，情况没有好转。许多利用荧光原位杂交 (FISH)进行HPV检测的早期数据是错误的，而且存在对HPV型的 错误分类(1996，Schiffman，M.；in Richart，Contemporary OB/GYN， July 1996，pp80)。据称，现在利用OmniprobeTM(Digene Diagnostics Inc，Silver Spring，Md)与石蜡包埋的切片杂交以检测HPV序列得到 的敏感度是20-50个病毒/细胞，而且Enzo PathoGene HPV原位分 型测定法(Enzo Life Sciences 60 Executive Boulevard，Farmingdale， NY)用于确定首先福尔马林固定、然后石蜡包埋的组织切片中HPV DNA的存在情况。
原位杂交检测是要求比较严格、耗费人力且耗时的。即使用最 先进的荧光原位杂交技术(FISH)，现在仍然不可能常规测定单一全 长病毒基因组或者可能整合入人类基因组单一染色体位点的病毒 基因组的小片段。常规FISH使用细菌人工染色体(达到100kb的 数量)大小的探针最好地完成。它们是全长HPV基因组的10倍大 小和HPV基因例如E6或E7的100倍以上。
免疫组化，利用针对所有相关HPV型的L1衣壳蛋白一个表位 的抗体，是另一种检测方法(2004，Griesser，H.，et al.，Analyt.Quant. Cytol.Histol.26，241-245)，但同样是耗费人力且耗时的。
由Digene Diagnostics开发的第一代HPV杂交捕获试剂盒利用 非放射性RNA探针检测病变的HPV DNA，其非放射性使得应用更 简单且更经济。杂交捕获利用信号扩增而非靶DNA扩增而获得敏 感性。然而，正如Richart指出的(Contemporary OB/GYN，July 1996)， 由于新的HPV型与其它HPV探针之间的交叉杂交，尤其是当化学 发光值突然激增(spiked)时，杂交捕获易于产生假阳性结果。另 外，第一代杂交捕获仅能检测到PCR检测的感染的1/3至1/2。从 那时起杂交捕获一直在改良，因此现在Hybrid Capture 2TM(Digene Corporation，Gaithersburg，Md)包括用于16、18、31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59和68型的13种HPV探针的混合物，US FDA批准的阈值设为1皮克HPV DNA/ml检测液，相当于125,000 个病毒基因组/ml(2001，Salomon，D.，J.Nat.Cancer Instit.93， 293-299)。Hybrid Capture 3TM(Digene Corporation，Gaithersburg，Md) 利用更复杂的生物素化捕获寡核苷酸混合物以及未标记的“封闭”寡 核苷酸，据称二者一起可消除Hybrid Capture 2TM出现的探针交叉反 应的问题。然而，Hybrid Capture 2TM尽管存在已知探针交叉杂交的 问题，仍然是唯一的FDA批准的产品(2001，Lorincz，A.&Anthony，J. Papillomavirus Report，12，145-154)。
杂交捕获已适应于测定来源于包含HPV基因组的基因的RNA 表达(US 6,355,424)。尤其，评估E6和/或E7的RNA水平相对于 E2和/或L1 RNA水平的比值。这通过生物素化DNA探针与来自在 微孔板中裂解的细胞的病毒RNA杂交而实现。如以前杂交捕获技 术的具体实施方式并如以前使用化学发光剂测定，通过抗体结合将 RNA:DNA杂交体捕获。
最敏感的HPV检测方法是聚合酶链式反应(PCR)，其可以容易 地检测到人类基因组中的单个病毒拷贝。第一个HPV PCR检测试 剂盒是来自Roche Molecular Systems的L1通用引物聚合酶链式反 应方法，具有实际较低的约100个病毒基因组的检测限值。通过 DNA印迹和PCR技术之间的直接比较评估该检测(1991，Schiffman， M.H.，J.Clin.Microbiol，29，573-577)，发现其非常耗费人力(见1995， Schiffman，M.H.，J.Clin.Microbiol，33，545-550)。
考虑到以上列出的所有问题和缺陷，关于DNA方法学筛查瘤 前病变的临床效果仍然存在争议，细胞异常敏感早期的分子预兆指 标将极具价值。
本发明的发明人已经开发了用于检测HPV并区分不同的HPV 型的新的方法、试剂盒以及集成的生物信息学平台。

一方面，本发明提供了用于检测人类乳头瘤病毒(HPV)的方法， 包括：
用修饰胞嘧啶的试剂处理病毒核酸，形成衍生的病毒核酸；
扩增所述衍生的病毒核酸的至少一部分，形成HPV特异的核 酸分子；以及
寻找HPV特异的核酸分子的存在，其中检测到所述HPV特异 的核酸分子表示存在HPV。
优选地，该方法进一步包括：
提供能够允许HPV特异的核酸分子扩增的HPV引物。
优选地，该病毒存在于样品中。样品可以为任何合适的临床、 临床产物或环境样品。典型地，该样品可以是拭子、活检、涂片 (smear)、巴氏涂片(或宫颈抹片)、血液、血浆、血清、血产品、 表面刮片(scrape)、刮取物、液体悬浮物、冻存材料、石蜡块、载玻 片、司法采集系统或者存档材料。优选地，该样品是涂片(smear)、 巴氏涂片或细胞的液体悬浮物。
优选地，所述试剂修饰胞嘧啶形成衍生核酸中的尿嘧啶。优选 地，所述试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。更优选地，所 述试剂是亚硫酸氢钠。
优选地，所述试剂将互补的双链病毒核酸每条链中的胞嘧啶修 饰为尿嘧啶，形成两个衍生的但非互补的病毒核酸分子。
优选地，所述试剂将胞嘧啶修饰为尿嘧啶，尿嘧啶随后在衍生 的核酸的扩增过程中被替代为胸腺嘧啶。优选地，用于修饰胞嘧啶 的试剂是亚硫酸氢钠。其他类似的修饰胞嘧啶而非甲基化胞嘧啶的 试剂也可以用于本发明的方法中。实例包括但不限于亚硫酸氢盐、 醋酸盐或柠檬酸盐。优选地，所述试剂是亚硫酸氢钠，一种在酸性 的水溶性条件存在下将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂。
亚硫酸氢钠(NaHSO3)易与胞嘧啶的5，6-双键反应，形成易于脱 氨基的磺化的胞嘧啶反应中间体，在水存在时产生尿嘧啶亚硫酸 盐。如有必要，在弱碱条件下可以去除亚硫酸盐基团，形成尿嘧啶。 因此，可能所有胞嘧啶可转化为尿嘧啶。然而，由于甲基化保护， 任何甲基化的胞嘧啶均不能被修饰试剂转化。
优选地，与相应的未受处理的病毒核酸相比，衍生的病毒核酸 的胞嘧啶总数下降。
优选地，扩增是通过聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反 应(LCR)、等温扩增、信号扩增或上述的联合实施的。更优选地， 扩增是通过PCR实施的。
通常，扩增形成HPV特异的核酸分子，其不构成天然HPV基 因组的一部分。
在一个优选的形式中，所述HPV特异的核酸分子对一个HPV 种属、一个HPV型或HPV亚型特异。HPV型在特定的人类种系中 可以赋予特定组织以高、中或低水平的致瘤状态。高危的HPV型 是HPV16、18、45和56，中危的HPV型是HPV31、33、35、39、 51、52、56、58、59和68，而低危株是HPV6、11、30、42、43、 44、53、54、和55。优选地，可以检测到高危的HPV16、18、45、 或56、和中危的HPV31、33、35、39、51、52、58、59和68。
应该理解，HPV特异的核酸可通过任何合适的方式检测。实例 包括，但不限于，凝胶电泳、与标记的探针杂交、采用允许随后鉴 定的标记的引物、酶联测定法或采用一旦与靶DNA杂交即产生信 号的荧光标记的引物。
第二方面，本发明提供了包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：516 中的一个或多个的HPV引物或探针。
优选地，用于检测高-中危的HPV株的HPV引物或探针包括 SEQ ID NO：333至SEQ ID NO：350中的一个或多个。
优选地，用于检测HPV的HPV引物或探针包括SEQ ID NO： 462、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：463、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：470、SEQ ID NO：485或SEQ ID NO：486。
第三方面，本发明提供了一种用于检测HPV的试剂盒，包括 与合适的试剂或稀释剂一起的根据本发明第二方面的两种或多种 HPV引物或探针。
第四方面，本发明提供了一种衍生的HPV核酸。
优选地，衍生的HPV核酸来自于高危的HPV 16、18、45或 56以及中危的HPV 31、33、35、39、51、52、58、59和68。
更优选地，衍生的HPV核酸包括SEQ ID NO：614、SEQ ID NO： 617、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：650、 SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO： 662、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：686或SEQ ID NO：689中的一种或多种，其部分包括至少 15个核苷酸，以及在严格条件下能够与下述序列杂交的核酸分子： SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO： 623、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：656、 SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO： 668、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：686、或SEQ ID NO：689。
衍生的HPV核酸的部分可以为至少15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等或更多的核苷酸。
第五方面，本发明提供了简化的HPV核酸。
优选地，所述简化的HPV核酸来自于高危的HPV 16、18、45 或56以及中危的HPV 31、33、35、39、51、52、58、59和68。
较优选的，所述简化的HPV核酸包括SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：639、 SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO： 651、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：684、 SEQ ID NO：687或SEQ ID NO：690中的一种或多种；其部分包括 至少15个核苷酸，以及在严格条件下能够与下述序列杂交的核酸 分子：SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：645、 SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO： 657、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：687或SEQ ID NO：690。
简化的HPV核酸部分可以为至少15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等个核苷酸。
第六方面，本发明提供了根据本发明第四或第五方面的衍生的 或简化的HPV核酸在获得用于检测HPV的探针或引物中的应用。
第七方面，本发明提供了一种用于检测样品中HPV存在的方 法，包括：
从样品中获取病毒核酸；
在引起所述病毒核酸中的胞嘧啶转化为尿嘧啶的条件下，用亚 硫酸氢盐处理病毒核酸以形成衍生的病毒核酸；
提供能够结合于衍生的病毒核酸区域的引物，所述引物能够允 许将预期HPV特异的核酸分子扩增为衍生的病毒核酸；
在衍生的病毒核酸上进行扩增反应；以及
寻找预期扩增的核酸产物的存在，其中检测到扩增的产物表明 样品中存在HPV。
在一个优选的形式中，所述方法进一步包括：
用另外一种可以确定样品中HPV型、亚型、变种或基因型的 试验处理存在HPV的样品。
所述另外一种试验优选为使用对特定HPV型或型群(group of types)特异的引物的扩增反应，其中存在扩增产物表示存在该HPV 型或型群。
第八方面，本发明提供用于生产HPV特异核酸的方法，包括：
用修饰胞嘧啶的试剂处理包含HPV核酸的样品，以形成衍生 的HPV核酸；以及
扩增至少部分衍生的HPV核酸，以形成简化的HPV核酸，相 比于相应的未受处理的HPV核酸，胞嘧啶的总数下降，其中所述 简化的核酸分子包括特异于HPV的核酸序列。
对于不含甲基化胞嘧啶的双链DNA，所述处理步骤得到两种 衍生的核酸，每种均含有碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。 所述两种衍生的核酸是从该双链DNA的两条单链产生的。该两种 衍生的核酸基本上不含胞嘧啶但仍然含有与原始未受处理的DNA 分子相同的碱基总数和序列长度。重要的是，所述两个衍生物并非 彼此互补，并且形成上链和下链。一或更多的链可以用作扩增目标 以产生简化的核酸分子。
典型地，对HPV特异的简化核酸序列在未受处理的HPV基因 组中并非天然存在。
在一个优选的形式中，该方法进一步包括：
检测含有可表明特定HPV型的核酸序列的HPV特异核酸。
所述HPV特异核酸可以通过任何合适的方式检测，实例包括 但不限于凝胶电泳、与标记的探针杂交、使用允许随后鉴定的标记 的引物(例如通过酶联测定法)以及使用一旦与靶DNA杂交即能 产生信号的荧光标记的引物(例如Beacon和TaqMan系统)。
优选地，检测所述HPV特异的核酸分子可通过：
提供能够结合于所述核酸分子靶区域的检测配体，并允许足够 的时间使检测配体结合于靶区域；以及
测定检测配体与所述核酸分子的结合以检测靶核酸分子的存 在。应该理解，所述核酸分子可以通过任何本领域已知的合适的方 式检测。
第九方面，本发明提供了一种用于获得HPV特异核酸分子的 方法，包括：
用修饰胞嘧啶的试剂处理来自代表性HPV型的HPV核酸，以 形成对于每种型的衍生的HPV核酸分子；
扩增来自每种型的衍生HPV核酸分子的至少部分，以形成简 化的核酸分子，相比于相应的未受处理的HPV核酸分子，胞嘧啶 总数下降；以及
通过鉴定所述简化核酸分子中的共同或独特序列获得一种或 多种型的HPV特异核酸分子。
应该理解所述方法可以从已知HPV型的核酸序列以生物信息 学方式(硅片上的研究)实施，其中原始序列中每个胞嘧啶均改变为 胸腺嘧啶以直接获得简化的核酸分子。可从简化的核酸序列确定序 列。
例如，处理步骤可以以生物信息学的方式实施，通过用尿嘧啶 取代代表性HPV基因组中的所有胞嘧啶形成每种型的衍生HPV核 酸分子。每种衍生的HPV核酸分子将具有与相应的未受处理HPV 基因组相同的碱基总数。应该理解，在扩增过程中衍生的HPV核 酸分子中每个尿嘧啶将拷贝为胸腺嘧啶。因此，形成简化核酸分子 的扩增序列将不与原始的HPV基因组序列相对应。衍生核酸的每 条链(“上”和“下”)将不互补，因此它们形成两种用于扩增的可 能模板。
当利用本方法获得对于任何特定HPV型HPV特异的核酸分子 时，则可设计探针或引物以确保在PCR或其它合适的扩增反应中扩 增感兴趣区域。很重要应该注意到的是，为了设计引物可以分析处 理的两条链和因此转化的基因组，(下文称为“衍生的”)因为处理或 转化导致序列的不对称(见下文)，故检测相同座位的“上链和下 链”需要不同的引物序列。因此，存在两种分子种群，被转化的基 因组(因其在转化后立即存在)，衍生后得到的分子种群通过常规 酶促途径(PCR)被复制。为了方便，通常针对转化的上链设计引物， 但也可以针对下链生成引物。因此，将可能对样品进行临床或科学 化验以检测特定的HPV型。
本发明还允许生成预示所有代表性HPV型的探针或引物，它 可以用来确定任何HPV基因组是否存在于特定样品中。进一步的 HPV型特异的探针可以用来实际检测或鉴定特定HPV型、亚型、 变种以及基因型实例。
整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括”或其变形应 理解为意指包括所述的元件、整体或步骤或者元件、整体或步骤群， 但不排除任何其它的元件、整体或步骤或者元件、整体或步骤群。
任何包括在本说明书中的对于文献、法令、材料、设备、文章 等的讨论仅是为本发明提供一个背景的目的。不应认为这些中的任 何一项或全部构成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关的 领域的公共常识，正如在本发明发展前其存在于澳大利亚那样。
为了更清楚地理解本发明，优选的具体实施方式将参照以下图 形和实施例加以阐述。
附图说明
图1示出了亚硫酸氢盐处理前各个病毒型HPV 33、35、39、 52、58、16、18、45和56相同的8碱基对基因组区域的上链与亚 硫酸氢盐转化后衍生物的相应序列的DNA对准比较。胞嘧啶被转 化为尿嘧啶，尿嘧啶以胸腺嘧啶表示。型之间核苷酸位置的变动以 粗体表示。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
图2示出了单独的病毒型HPV 6、11、43、44、53、55、30、 31、39、51、52、16、18和45与在产生衍生序列的亚硫酸氢盐处 理DNA样品之后的“复杂性降低”的17个碱基对基因组区域的“上” 链的DNA对准比较(alignment)。“上”和“下”链衍生物的通用 引物(consensus promer)在亚硫酸氢盐处理后会不一致；仅对一条 链的引物加以阐述。胞嘧啶被转化为尿嘧啶，且尿嘧啶以胸腺嘧啶 表示。HPV型之间核苷酸位置的变动以粗体表示。(SEQ ID NO列 于每个序列的后面)。
图3示出了各个病毒型(HPV 6、43、44、54、55、30、33、58、 18和45)的20个碱基对区域上链的DNA对准比较以及利用HGS 复杂性降低方法在衍生序列中鉴定序列相似性＞90％的区域。上链和 下链衍生物的通用引物在亚硫酸氢盐处理后会不一致；仅对一条链 的引物加以图解。胞嘧啶被转化为尿嘧啶，尿嘧啶以胸腺嘧啶表示。 HPV型之间的核苷酸位置的变动以粗体表示。(SEQ ID NO列于每 个序列的后面)。
图4示出了各个病毒型(HPV 6、43、44、54、55、30、33、58、 18和45)的20个碱基对区域上链DNA的对准比较以及相比标准寡 核苷酸可以更有效地用于杂交反应中的较短的高亲和性的INA引 物或探针序列。上链和下链衍生物的通用引物在亚硫酸氢盐处理后 会不一致；仅对一条链的引物加以图解。胞嘧啶被转化为尿嘧啶， 尿嘧啶以胸腺嘧啶表示。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
图5示出了利用针对亚硫酸氢盐处理的HPV DNA的L1区域 的上链的通用的HGS复杂性降低的引物进行PCR扩增的结果，该 HPV DNA从16名患者(编号1至16)的液基细胞学(LBC)样品提 取。
图6示出了利用针对来自HPV 16、18、45和56的高危的亚硫 酸氢盐处理的复杂性降低的衍生物的E7区域的上链的复杂性降低 的引物的多重PCR扩增。DNA从相同的编号为1至16的患者的液 基细胞学样品提取。箭头表示扩增的核酸产物的预期大小。
图7示出了利用针对来自HPV16的高危的亚硫酸氢盐处理的 复杂性降低的衍生物的E7区域的上链的HGS的复杂性降低的引物 的PCR扩增。DNA从相同编号1至16的患者样本的液基细胞学样 品提取。
图8示出了利用针对来自HPV18的高危的亚硫酸氢盐处理的 复杂性降低的衍生物的E7区域上链的HGS复杂性降低的引物的 PCR扩增。DNA从相同编号1至16的患者样本的液基细胞学样品 提取。
图9示出了利用针对来自HPV16的高危的亚硫酸氢盐处理的 复杂性降低的衍生物的E4、E6和E7区域上链的HGS复杂性降低 的引物的PCR扩增。DNA从相同编号1至16的患者样本的液基细 胞学样品提取。箭头表示扩增的核酸产物的预期大小。
图10示出了利用针对来自HPV18的高危的亚硫酸氢盐处理的 复杂性降低的衍生物的E4、E6和E7区域上链的HGS复杂性降低 的引物的PCR扩增。DNA从相同编号1至16的患者样本的液基细 胞学样品提取。箭头表示扩增的核酸产物的预期大小。
图11总结了可从不同风险型的HPV衍生物PCR扩增的三个不 同衍生区域(E4、E6和E7)，利用针对来自患者编号为A至T的液 基细胞学样品的正常或异常宫颈组织样品的“上”链的复杂性降低 的引物。从20个患者[表示为A-T]的液基细胞学样品产生了580 个PCR检测的结果并利用凝胶电泳分析其大小，在某些情况下通过 直接测序分析来验证对产物的鉴定。设计引物来确定不同HPV型 的E4、E6和E7区域的存在[表示阳性并有阴影]或不存在[阴性]。 第2列中示出了所有HPV型(无论其风险状态)L1区域一部分的 通用巢式引物组(universal nested primer set)[表示为Uni]。为了 本图的目的，高危的HPV株定义为HPV 16、18、45和56，中危 株为HPV 30、31、33、35、39、51、52、56、58、59和66，而低 危株定义为HPV6、11、42、43、44、53、54和55。第3列示出了 所有高危的HPV型(表示为“高”)的E7区域的一部分的多重巢式 引物组。第4列示出了所有中危的HPV型(表示为“中”)的E7区 域一部分的多个巢式引物组。第5列中示出了所有低危HPV型(表 示为“低”)的E7区域一部分的多个巢式引物组。凝胶上出现条带 则表示临床样品中存在指定的病毒片段。
图12图解了引物简并性对亚硫酸氢盐处理的来自患者编号为 21至42的样品得到的PCR产物的概率的影响。引物仅针对上链。 23-mer引物对的单个成员的简并性水平对PCR扩增反应效率的影 响。在PCR反应HPV-HM中，针对引物1可能的引物组合数量是 72。在PCR反应HPV-HML中，针对引物1的可能引物组合数量激 增为2304。扩增的核酸产物在PCR反应HPV-HM中可见但在PCR 反应HPV-HML中则不可见。符号G、A、T和C表示正常碱基对 形式，而D、K、W和H则为该位置不同碱基混合物的标准符号 (D＝A、G或T；K＝G或T；W＝A或T；H＝A、T或C)。(SEQ ID NO列 于每个序列的后面)。
图13示出了HPV16病毒核酸分子在其三种可能序列中的上 链；A.正常病毒序列(SEQ ID NO：613)；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍 生序列(SEQ ID NO：614)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基 因组简化序列(SEQ ID NO：615)。
图14示出了HPV 16病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：616)，B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：617)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：618)。
图15是HPV16从核苷酸位置1至核苷酸位置7904的上链基 因组概貌的示意图，其中方框表示用于扩增目的的多种巢式引物组 的位置；示出了对扩增来自HPV型组合，例如高危和中危(HM)、 高危、中危和低危(HML)；高(H)以及高和中(HM)的组合组合的DNA 有用的引物的引物组位置。
图16是HPV16从核苷酸位置1至核苷酸位置7904的下链基 因组概貌的示意图，其中方框表示用于扩增目的的多种巢式引物组 的位置。示出了对扩增来自HPV型组合，例如高危和中危(HM)、 高危、中危和低危(HML)；高危(H)以及高危和中危(HM)组合的DNA 有用的引物的引物组位置。
图17示出了来自一个患宫颈癌的个体的组织切片，箭头1指 出了含有大核的癌细胞的加黑区域。箭头2示出了正常的结缔组织。
图18示出了利用针对亚硫酸氢盐处理的HPV DNA的E7区域 上链的高-中危HGS复杂性降低引物(为了检测13种HPV型，即 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68) 的PCR扩增结果，该HPV DNA是从12个已完成细胞学分析的患 者液基细胞学(LBC)样品中提取的(表示为1到12)。
图19示出了利用来自图18中高-中危的HPV阳性患者的临床 样品#2、#4、#7和#11材料的PCR扩增结果，确定具体哪种HPV 型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68) 对图18中每个可见的扩增子负责。
图20示出了来自16个具有高度鳞状上皮内病变(HSILs)的患者 材料的存档石蜡切片的PCR扩增结果，利用针对基因组简化的HPV 上链的高-中危引物组(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59和68)。
图21A示出了针对亚硫酸氢盐转化的基因组简化DNA下链的 引物扩增来自液基细胞学样品的PCR扩增结果。该引物靶向HPV 型(高-中危型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、 59、68以及低危型HPV 6、11、42、43、44、53、54和55)。
图21B示出了针对亚硫酸氢盐转化的基因组简化DNA的上链 的引物扩增液基细胞学样品的PCR扩增结果。该引物靶向13种高- 中危HPV型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 58、59和68)。
图22示出了来自自动凝胶读取部分的一个基因型为HPV16的 HPV扩增子的DNA测序结果。峰对应于所标明的DNA碱基。
图23示出了HPV18病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：619).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：620)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：621)。
图24示出了HPV18病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：622).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：623)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：624)。
图25示出了HPV31病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：625).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：626)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：627)。
图26示出了HPV31病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：628).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：629)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：630)。
图27示出了HPV33病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：631).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：632)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：633)。
图28示出了HPV33病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：634).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：635)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：636)。
图29示出了HPV35病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：637).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：638)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：639)。
图30示出了HPV35病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：640).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：641)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：642)。
图31示出了HPV39病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：643).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：644)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：645)。
图32示出了HPV39病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：646).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：647)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：648)。
图33示出了HPV45病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：649).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：650)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：651)。
图34示出了HPV45病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：652).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：653)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：654)。
图35示出了HPV51病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：655).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：656)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：657)。
图36示出了HPV51病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：658).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：659)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：660)。
图37示出了HPV52病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：661).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：662)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：663)。
图38示出了HPV52病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：664).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：665)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：666)。
图39示出了HPV56病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：667).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：668)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：669)。
图40示出了HPV56病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：670).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：671)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：672)。
图41示出了HPV58病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：673).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：6740)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基 因组简化序列(SEQ ID NO：675)。
图42示出了HPV58病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：676).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：677)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：678)。
图43示出了HPV59病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：679).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：680)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：681)。
图44示出了HPV59病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； A.正常病毒序列(SEQ ID NO：682).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生 序列(SEQ ID NO：683)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的基因 组简化序列(SEQ ID NO：684)。
图45示出了HPV68a病毒核酸分子在其三种可能序列中的上 链；A.正常病毒序列(SEQ ID NO：685).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的 衍生序列(SEQ ID NO：686)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的 基因组简化序列(SEQ ID NO：687)。
图46示出了HPV68a病毒核酸分子在其三种可能序列中的下 链；A.正常病毒序列(SEQ ID NO：688).；B.用尿嘧啶取代胞嘧啶的 衍生序列(SEQ ID NO：689)以及C.其中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代的 基因组简化序列(SEQ ID NO：690)。

定义
如在本文中使用的，术语“基因组简化”是指基因组(或其它) 核酸从由四种碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C) 构成修饰为基本上包含碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)但 仍然具有基本上相同的碱基总数。
如在本文中使用的，术语“衍生的核酸”是指核酸基本上包含碱 基A、G、T和U(或一些其它的非A、G或T碱基或碱基样物质)， 并且具有与相应的未修饰核酸大致相同的碱基总数。用该试剂处理 的过程中，未受处理的核酸中基本上所有胞嘧啶均将转化为尿嘧啶 (或一些其它的非A、G或T碱基或碱基样物质)。应该理解，改变 的胞嘧啶，例如通过甲基化，可能不一定转化为尿嘧啶(或一些其他 非A、G或T碱基或碱基样物质)。优选地，胞嘧啶被修饰为尿嘧啶。
如在本文中使用的，术语“衍生的HPV核酸”是指一种HPV核 酸，其基本上包含碱基A、G、T和U(或一些其它的非A、G或T 碱基或碱基样物质)，并且具有与相应的未修饰的HPV核酸大致相 同的碱基总数。用该试剂处理的过程中，HPV DNA中基本上所有 胞嘧啶均将转化为尿嘧啶(或一些其它的非A、G或T碱基或碱基样 物质)。应该理解，改变的胞嘧啶，例如通过甲基化，可能不一定转 化为尿嘧啶(或一些其它的非A、G或T碱基或碱基样物质)。由于 HPV核酸通常不含有甲基化胞嘧啶(或其它的胞嘧啶改变)，故所 述处理步骤优选转化全部胞嘧啶。优选地，胞嘧啶被修饰为尿嘧啶。
如在本文中使用的，术语“转化的基因组”是指HPV基因组， 其基本上包含碱基A、G、T和U(或一些其它的非A、G或T碱基 或碱基样物质(base-like entity))，且与相应未转化的HPV基因 组具有基本上相同的碱基总数。HPV基因组中基本上所有的胞嘧啶 均被转化为尿嘧啶(或一些其它的非A、G或T碱基或碱基样物质)。
如在本文中使用的，术语“简化的核酸”是指扩增衍生的核酸后 得到的合成的核酸产物。在衍生的核酸扩增过程中，衍生的核酸中 的尿嘧啶然后被取代为胸腺嘧啶(T)，形成简化的核酸分子。得到的 产物具有与相应未修饰的核酸基本相同的总碱基数，但是基本上是 由三种碱基(A、G和T)的组合构成的。
如在本文中使用的，术语“简化的HPV核酸”是指扩增衍生的 HPV核酸后得到的合成的HPV核酸产物。在衍生的HPV核酸扩增 过程中衍生核酸中的尿嘧啶然后被取代为胸腺嘧啶(T)，形成简化的 HPV核酸分子。得到的产物具有与相应未修饰的HPV核酸基本相 同的总碱基数但是基本上是由三种碱基(A、G和T)的组合构成的。
如在本文中使用的，术语“简化的序列”是指扩增衍生的核酸后 得到的合成的核酸序列，形成简化的核酸。得到的简化序列具有与 相应未修饰的核酸序列基本相同的总碱基数但是基本上是由三种 碱基(A、G和T)的组合构成的。
如在本文中使用的，术语“简化的HPV序列”是指扩增衍生的 HPV核酸后得到的合成的核酸序列，形成简化的HPV核酸。得到 的简化序列具有与相应未修饰的HPV核酸序列基本相同的总碱基 数但是基本上是由三种碱基(A、G和T)的组合构成的。
如在本文中使用的，术语“未转化的序列”是指处理和扩增之前 的核酸序列。未转化的序列通常是天然存在的核酸序列。
如在本文中使用的，术语“未转化的HPV序列”是指处理和扩 增之前的HPV核酸序列。未转化的序列通常是天然存在的HPV核 酸序列。
如在本文中使用的，术语“修饰”是指将胞嘧啶转化为另一种核 苷酸。优选地，所述试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，形成 衍生的核酸。
如在本文中使用的，术语“修饰胞嘧啶的试剂”是指能够将胞嘧 啶转化为另一种化学物质的试剂。优选地，该试剂将胞嘧啶修饰为 尿嘧啶，尿嘧啶然后在衍生的核酸扩增过程中被取代为胸腺嘧啶。 优选地，用于修饰胞嘧啶的试剂是亚硫酸氢钠。类似地修饰胞嘧啶 而非甲基化胞嘧啶的其它试剂也可用于本发明的方法中。实例包括 但不限于亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。优选地，所述试剂是亚 硫酸氢钠，一种在酸性的水溶性条件下将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试 剂。亚硫酸氢钠(NaHSO3)易与胞嘧啶的5，6-双键反应，形成易于脱 氨基的磺化的胞嘧啶反应中间体，在水存在时产生尿嘧啶亚硫酸 盐。如有必要，可以在弱碱条件下去除亚硫酸盐基团，导致形成尿 嘧啶。因此，潜在地所有胞嘧啶均可被转化为尿嘧啶。然而，由于 甲基化保护，任何甲基化的胞嘧啶均不能被修饰试剂转化。应该理 解胞嘧啶(或任何其它碱基)可以通过酶法修饰，以获得如本发明 所教导的衍生的核酸。
可以通过两种主要的常用方法修饰核酸中的碱基：化学的和酶 促的。因此，用于本发明的修饰可以通过天然存在的酶或通过已报 道的人工构建的或选择的酶而实现。化学处理，例如亚硫酸氢盐方 法，可以通过恰当的化学步骤将胞嘧啶转化为尿嘧啶。类似地，例 如，胞嘧啶脱氨酶可以进行转化以形成衍生的核酸。据我们所知， 首个关于胞嘧啶脱氨酶的报道是1932，Schmidt，G，Z.physiol. Chem.，208，185；(还可参见1950，Wang，T.P.，Sable，H.Z.，Lampen， J.O.，J.Biol.Chem，184，17-28，Enzymatic deamination of cytosines nucleosides)。在该早期工作中，不能获得不含其它的核酸脱氨酶的 胞嘧啶脱氨酶，然而，Wang等人能够从酵母和E.coli中纯化出该 活性。因此，任何对胞嘧啶进行酶促转化以形成衍生的核酸(最终 导致在下一步复制过程中在该位置插入不同于胞嘧啶的碱基)，均 将产生简化的基因组。产生随后是简化的基因组的衍生物的化学和 酶促转化适用于任何核酸碱基，不管其为天然存在的微生物核酸中 的嘌呤或嘧啶。
如在本文中使用的，术语“HPV基因组或核酸的简化形式”是指 一种HPV基因组或核酸，其通常含有四种常见碱基G、A、T和C， 现在主要仅由三种碱基G、A和T构成，因为基因组中的大部分或 全部C已通过恰当的化学修饰以及随后的扩增步骤被转化为T。相 对基因组复杂性的基因组的简化形式是指从四碱基基础减为三碱 基组成。
如在本文中使用的，术语“碱基样物质”是指通过胞嘧啶修饰形 成的物质。碱基样物质可以在衍生核酸的扩增过程中由DNA聚合 酶识别，该聚合酶使A、G或T分布于新形成的互补DNA链上与 该衍生核酸上碱基样物质相对的位置。典型地，所述碱基样物质是 在相应未处理核酸中胞嘧啶修饰而来的尿嘧啶。碱基样物质的实例 包括任何核酸-碱基，不管其为嘌呤或嘧啶。
如在本文中使用的，术语“天然HPV基因组”是指自然界中存 在的病毒基因组。天然HPV基因组包括构成HPV核酸分子的核苷 酸碱基序列。
如在本文中使用的，术语“相对复杂性降低”涉及到探针长度， 即特定的分子条件下，在两个相同大小的基因组内实现探针对特异 基因座的相同特异性及杂交水平所需的平均探针长度增加，其中第 一个基因组是“原态”并由四个碱基G、A、T和C组成，而第二个 基因组长度完全相同但一些胞嘧啶(理想地全部胞嘧啶)被转化为 胸腺嘧啶。试验中的基因座在原始未转化的基因组以及转化的基因 组中位于相同的位置。平均，11-mer的探针将具有独特的位置，其 将与由四种碱基G、A、T和C组成的4,194,304个碱基(411等于 4,194,304)的常规基因组中的该独特位置完全地杂交。然而，一旦这 种4,194,304个碱基的常规基因组被亚硫酸氢盐或其它的恰当的途 径转化，那么现在该转化的基因组仅由三种碱基构成，而且显然复 杂性降低。然而，基因组复杂性降低的结果就是我们之前独特的 11-mer探针在简化的基因组内不再具有可与其杂交的独特位置。现 在存在许多11碱基序列其它的可能的相当的位置，其作为亚硫酸 氢盐转化的结果而从新产生。现在需要14-mer探针去寻找并杂交于 该原始基因座。尽管最初似乎与直觉相反，人们因此需要长度增加 的探针去检测现在在简化的三碱基基因组中的原始位置，因为该基 因组的更多部分看起来相同(其具有更相似的序列)。因此所述减 少的相对的基因组复杂性(或该三碱基基因组的简单性)是指人们 需要设计更长的探针以寻找原始的独特位置。
如在本文中使用的，术语“相对的基因组复杂性降低”可以通过 与未修饰的DNA相比能够作为HPV特异的探针长度增加来衡量。 该术语还包括了用于确定HPV存在的探针序列的类型。这些探针 可能含有非常规主链，例如PNA或LNA主链或者对主链的修饰性 插入，如在INA中所描述的那些。因此，认为基因组具有降低的相 对复杂性，无论所述探针是否含有额外的组分例如嵌入的假核苷 酸，如在INA中。实例包括但不限于DNA、RNA、锁核酸(LNA)、 肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇核酸(altritol nucleic acid)(ANA)、 己糖醇核酸(HNA)、嵌入性核酸(INA)、环己基(cyclohexanyl)核 酸(CNA)及其混合物和其杂交体，还包括其磷原子修饰物，例如但不 限于磷硫酰(phosphorothioate)、methyl phospholate、亚磷酰胺 (phosphoramidite)、二硫代磷酸酯(phosphorodithiate)、 phosphoroselenoates、磷酸三酯(phosphotriester)以及 phosphoboranoates。非天然存在的核苷酸包括但不限于包括在以下 物质中的核苷酸：DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、 LNA、CNA、CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、 α-L-Ribo-LNA、α-L-Xylo-LNA、β-D-Xylo-LNA、α-D-Ribo-LNA、 [3.2.1]-LNA、双环DNA、6-氨基-双环-DNA、5-epi-双环-DNA、α- 双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环 [4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡核亚硝脲(ribopyranosyl)-NA、 α-L-Lyxopyranosyl-NA、2’-R-RNA、α-L-RNA  或α-D-RNA、 β-D-RNA。另外，非含磷化合物可以用于连接于核苷酸例如但不限 于甲基亚氨基甲基、formacetate、thioformacetate以及含有酰胺的连 接基团。尤其，核酸和核酸类似物可以包含一种或多种嵌入假核苷 酸(IPN)。IPN的存在不是核酸分子复杂性描述的一部分，其主链也 不是该复杂性的一部分，例如在PNA中。
“INA”是指与WO 03/051901、WO 03/052132、WO 03/052133 和WO 03/052134(Unest A/S)中的教导一致的嵌入性核酸，其均结 合于此供参考。INA是含有一个或多个嵌入性假核苷酸(IPN)分子的 寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
“HNA”是指如由Van Aetschot等人，1995所描述的核酸。
“MNA”是指如由Hossain等人，1998所描述的核酸。
“ANA”是指由Allert等人，1999描述的核酸。
“LNA”可以为任何LNA分子，如在WO 99/14226(Exiqon)中所 描述的，优选地，LNA选自WO 99/14226的摘要中描述的分子。 更优选地，LNA是如Singh等人，1998，Koshkin等人，1998或Obika 等人，1997描述的核酸。
“PNA”指的是肽核酸，如由Nielsen等人，1991描述的。
如在本文中使用的，“相对的复杂性降低”不指碱基存在的顺 序，例如序列ATATATATATATAT(SEQ ID NO：691)与一个相同长度 的序列AAAAAAATTTTTTT(SEQ ID NO：692)之间的任何数学复 杂性差异，也不指相对基因组大小的原始重新组合数据(以及推理 的基因组复杂性)，其由Waring，M.&B ritten R.J.1966，Science，154， 791-794；和Britten，R.J and Kohne D E.，1968，Science，161，529-540 以及其中来源于Carnegie Institution of Washington Yearbook reports 的早期参考资料引入科学文献中。
一个实施例阐明了当转化过程应用于单独的病毒基因组，或存 在于既包含人类细胞又包含病毒基因组的临床样品中的病毒基因 组混合物，或其部分时，这种转化过程的结果。
正常的10个碱基基因组序列5’GGGGAAATTC3’(SEQ ID NO： 693)(‘上链’)具有互补的下链，即5’GAATTTCCCC3’(SEQ ID NO： 694)。变性以及亚硫酸氢盐处理后，“上”链变为5’GGGGAAATTU3’ (SEQ ID NO：695)，“下”链变为5’GAATTTUUUU 3’(SEQ ID NO： 696)。由于胞嘧啶被转化为尿嘧啶，且尿嘧啶在体外通过DNA聚 合酶机制识别相当于胸腺嘧啶，“上”链衍生物主要是5’ GGGGAAATTT 3’(SEQ ID NO：696)，“下”链衍生物为5’ GAATTTTTTT 3’(SEQ ID NO：697)。因此，最初的正常基因组已经 从其中它们之间的上链和下链含有5个C和5个T的基因组，转化 为衍生的聚合物种群，其中它们之间的上链和下链含有0个C和 10个T。该正常基因组已经从四碱基体降为三碱基衍生物，已经是 “降低复杂性”。此外，衍生种群中的“基因座”仅指该衍生物中的位 置坐标(coordinates)。例如，亚硫酸氢盐转化后，基因座则失去了 在任何网络水平的所有功能性生物学特征。如果以前其为调节性或 结构性编码，其现在在两条链中均为生物无用信息。因此，衍生物 种群是无功能化学聚合物的集合，现在其表示以前基因组中互补链 而现在是无信息的两条非互补的重影(ghosts)。进一步，所述衍生 物是独特的，除非出于统计学偶然事件，其不表示任何细胞(或者 病毒或类病毒)生命形式中由正常进化过程所产生的序列。
探针以及复杂性降低
在分子探针的正式意义中，我们在本文中根据探针长度增加 (IPL)定义“复杂性降低”，该探针长度增加为在特定的分子条件下， 在两个相同长度的实体内对特异基因座实现探针相同的特异性和 杂交水平所需要的，第一个是正常基因组而第二个是“简化序列”。 为了分子有效性的目的，IPL等于或大于1的整数。每个基因座在 正常基因组以及简化核酸中仍在相同的位置。
尽管似乎与直觉相反，寡核苷酸探针长度增加可能为检测现在 位于T富集的简化HPV核酸中的原始座位所必需。因此，简化HPV 核酸的复杂性降低是指可能需要针对一个座位的“上”和“下”链设 计更长的探针，以寻找位于简化HPV核酸中原始独特的位置。然 而，如下所示，利用嵌入核酸(INA)探针允许比常规寡核苷酸短得 多的探针，因此如果需要可以克服增加长度的这个要求。
根据探针长度以及针对一个座位“上”和“下”链的不同探针序 列而定义的复杂性降低的原则，是一个相对术语，其适用于不同分 子环境中不同结构或修饰的探针和引物。一个INA实例阐明了该相 对性。INA相对于标准寡核苷酸探针的显著优势是INA可以比常规 寡核苷酸制作的短得多而仍然获得相等的杂交结果，(INA长度＜ 寡核苷酸长度)。这是由于INA对互补性DNA的高亲和力，其归 功于嵌入性假核苷酸，IPN，其作为INA的结构组分。因此，如果 为了实现对未转化基因组的成功而特异的杂交，需要含一定数量的 IPN，长度为X个核苷酸的INA，在相同的分子条件下与亚硫酸氢 盐转化的基因组中的相同座位杂交，仍然需要长度＞X的INA。
注意到以下事实也特别重要，即在宿主-病原体相互作用中(其 中病毒和宿主基因组共存于同一临床样品中，但是浓度差异较大)， “复杂性降低”以及INA或其它探针的应用将新的有利条件引入杂 交试验，尤其因为INA优先杂交于AT富集的核酸序列。例如，在 野生型HPV DNA的纯溶液中，寻找并杂交于7904个碱基的HPV16 基因组中独特座位所需的病毒探针或引物的近似长度约为6-mer探 针/引物(46等于4096个碱基)。亚硫酸氢盐处理生成T富集的简化 HPV核酸后，在相同分子条件下寻找该独特位置，需要约8-mer探 针或引物(38等于6561个碱基)。
然而，当一个样品中最初存在两个长度非常不等的基因组例如 7904个碱基对的HPV基因组以及约3,000,000,000个碱基对的人基 因组，并且两个基因组均“复杂性降低”为其各自的衍生物时，则现 在针对独特病毒序列的探针或引物在溶液中杂交于其衍生物目标， 该溶液主要是T富集的人类简化核酸。如果，例如在样品中针对每 一个人类简化核酸均有一个简化的HPV核酸，则病毒探针或引物 杂交于3,000,007,904个碱基对的简化核酸。因此，为了避免从人类 序列中新出现的病毒诱饵(decoy)座位有杂交信号，现在测定独特 的病毒序列需要约14-mer的探针或引物。
除了“复杂性降低”问题涉及到探针和引物长度外，当PCR反应 中使用的简并引物的数量适度时，杂交动力学以及检测PCR产物的 能力也有重要的变化。由于HPV型之间广泛的基因组变异，现有 技术的扩增需要使用大量简并引物以从多重PCR反应生成相关的 扩增核酸产物或扩增子。然而，探针/引物集合的简并性越强，则溶 液中任何各个相关探针或引物的浓度越低。这种情形类似于对复杂 真核基因组实施的驱动子-示踪子(driver-tracer)反应中的杂交动力 学和保真度，首次在1966年由Waring，M.&Britten R.J.Science， 154，791-794以及在1968年由Britten，R.J and Kohne D E.，Science， 161，529-540引入科学文献中(以及其来源于Carnegie Institution of Washington Yearbook reports的早期参考文献)。
此外，当HPV PCR引物相对于人衍生物为高浓度时，则杂交 反应中的主要动力为该HPV引物。例如，如果样品中的病毒载量 高(例如，数量级为100,000HPV基因组/一个人类基因组)，则病 毒引物的杂交动力学比每个人类衍生物仅存在一个HPV衍生物要 快100,000倍。在前一种情况下，病毒组分在溶液中表现似乎其为 基因组的一个高度重复组分。然而，为了利用单一PCR反应来检测 临床样品中不同风险的不同HPV型，通常需要来自每种HPV型的 不同引物，使得应用简并体成为必要。净结果就是引物种群在混合 的正常基因组上的常规多重PCR反应中可以组合地交错。毫不夸 张，可以有数以千计的不同引物竞争杂交位点，净结果就是PCR 扩增失败或者扩增的核酸分布严重倾向于样品中存在的一种特殊 HPV型。这就提出了一个关于从存在常规未转化基因组的临床样品 生成数据的重要问题。
本发明的“复杂性降低”与可选地应用INA探针和引物联合克 服了许多这些现有技术问题的困难。
本文中，术语“能够特异性杂交”与术语“能够在严格条件下杂 交”可交换地使用，是指核酸具备在严格条件下与一种其它的核酸 分子的全部或部分杂交的能力。核苷酸序列，其与DNA片段的+ 或-链的至少一个螺旋(helical turn)(约10到15个核苷酸)互补 通过在严谨性条件下能够杂交是指受检(subject)核酸与至少一个 核酸区域在标准条件下发生退火，例如高温和/或低盐含量，该条件 倾向于排除非互补核苷酸序列的杂交。Maniatis，T.，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，1982， at pages 387-389中描述了一个用于核酸探针与固定的DNA杂交的 严格的试验的实例，尽管条件将根据应用而变动。
如在本文中使用的，术语“核苷酸序列”是指核苷或核苷酸的序 列。
如在本文中使用的，术语“邻接的核苷酸序列”指的是一个接一 个在连续排列中的连接的核苷酸序列。
如在本文中使用的，术语“PCR”(聚合酶链式反应)是指通过 使用DNA模板分子、两种寡核苷酸引物以及DNA聚合酶扩增DNA 片段的过程。在高温下，该DNA模板从引物解离，所述引物可以 与该模板退火。DNA聚合酶从引物位置开始复制该模板。该过程 重复约30到40次，以扩增并富集反应产物中的模板特异性分子。
引物和复杂性降低
应该注意，复杂性降低随被转化的分子种群(所述衍生物)保 持被转化状态还是受到进一步扩增而不同。在上述论及的实例中， 该衍生种群保持未扩增状态，正如其在临床样品中存在那样。回顾 一下：上链(5’GGGGAAATTC 3’)(SEQ ID NO：693)和下链(5’ GAATTTCCCC 3’)(SEQ ID NO：694)分别被转化为5’ GGGGAAATTU 3’(SEQ ID NO：695)和5’GAATTTUUUU 3’(SEQ ID NO：696)。因为胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而且尿嘧啶在被体外 DNA聚合酶机制识别方面相当于胸腺嘧啶，上链衍生物主要是5’ GGGGAAATTT 3’(SEQ ID NO：697)，下链衍生物是5’ GAATTTTTTT 3’(SEQ ID NO：698)。然而，如果该衍生物种群在体 外通过酶促途径复制，将产生四个不同的衍生种群，它们是[5’ GGGGAAATTT 3’](SEQ ID NO：697)，[5’AAATTTCCCC 3’](SEQ ID NO：699)，[5’AAAAAAATTC 3’](SEQ ID NO：700)和 [GAATTTTTTT 3’](SEQ ID NO：698)。这些衍生物的确复杂性降低 了，但与转化后即存在的初始未复制的衍生物程度不同。因此，当 PCR引物针对初始未复制的衍生链而制备，则有必要谨慎的决定希 望检测哪种扩增的核酸产物，因为选择针对上链或下链的引物将影 响结果。处理构成转化基因组结果的两种非互补衍生种群与处理复 制后存在的四种衍生种群之间的差异直观上并不明显，但对于引物 设计具有重要的意义。
最后，为了使“复杂性降低”正式化并加以定量而较早引入的更 长探针或引物的问题，当在衍生的分子种群内寻找独特序列时仅认 为相关性。然而，本发明的一个重要基础是选择HPV型之间最大 程度相似的衍生座位，如有需要允许所有的HPV型可在初次检测 中被测定。这些被选择的座位将根据选择的是上链或下链衍生物而 改变，而且相比于下链，这些座位在上链中位于不同的区域。
在衍生种群中需要更长的探针和引物的实用重要性与用于 HPV检测得到的实用优势相比显得不重要，该优势是由于本发明中 通过利用HGS亚硫酸氢盐处理转化而生成使更多序列类似的座位。 它们也通过可选地使用与常规寡核苷酸情况相比允许更短的探针 和引物分子的INA而显得不重要。此外，为了允许产生扩增的核酸 产物，对衍生种群应用巢式PCR方法要求两种引物在相同的邻近区 域结合。如果一种PCR引物与靶区域以外的诱饵座位具有序列相似 性，则不可能其引物对的其它成员也在同一非靶区域附近具有诱饵 座位。更不可能这种巢式PCR方法的内部引物在与第一轮引物相同 的非靶区域也具有诱饵座位。假性扩增的概率极端不可能。
人类乳头瘤病毒
如在本文中使用的，术语“病毒特异性核酸分子”是指一种分 子，其已经利用根据本发明的方法确定或获得，而且含有对一种病 毒或病毒型特异的一个或多个序列。
如在本文中使用的，术语“病毒的分类学水平”包括型、亚型、 变种和基因型。病毒基因组的流动性(fluidity)被识别。不同的病 毒种群对于单个核酸变化可进一步是多态的或者如果它们寄居在 正常DNA修复过程不再起作用的某些癌细胞内会经受过高或过低 的突变。
如在本文中使用的，术语“HPV特异性核酸分子”是指存在于处 理的或转化的病毒DNA中表示该病毒或病毒型的特异性核酸分 子。
如在本文中使用的，术语“HPV型”指的是任何现有的或新的 HPV种群，新的HPV种群与以前分离和表征的HPV型有少于90％ 的序列相似性(1993，Van Rast，M.A.，et al.，Papillomavirus Rep， 4，61-65；1998，Southern，S.A.and Herrington，C.S.，Sex.Transm.Inf. 74，101-109)。
如在本文中使用的，术语“HPV亚型”指的是任何现有的或新的 HPV种群，其中相对于以前的亚型，序列相似性在90-98％的范围 内(1993，Van Rast，M.A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998， Southern，S.A.and Herrington，C.S.，Sex.Transm.Inf.74，101-109)。
如在本文中使用的，术语“HPV变种”指的是任何现有的或新的 HPV种群，其中序列相似性在以前变种的98-100％之间(1993，Van Rast，M.A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；1998，Southern，S.A. and Herrington，C.S.，Sex.Transm.Inf.74，101-109)。
如在本文中使用的，术语“HPV基因型”如下：一种基因型是任 何一种完全测序的HPV基因组，其与任何其它完全测序的HPV基 因组最少有一个碱基不同，包括无论该单个碱基以G、A、T或C 存在，还是在标准比较物(即HPV16从位置1至7904)特定位置 的碱基由于缺失、插入、扩增或转座至另一个位点而改变。我们利 用现有技术的BLAST方法相对于HPV16标准比较了所有其它的 HPV基因型。
在本专利说明书中使用的所有生物信息性的HPV比较均是相 对于HPV 16基因组(利用HPV16的位置1至7904作为标准比较 物)并利用现有技术BLAST方法而进行(1996，Morgenstern，B.，et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，12098-12103)。本文中利用的作为参 考目的的标准HPV‘型’是乳头瘤病毒科的HPV16，它是一种7904 个碱基对的乳头瘤病毒(National Center for Biotechnology Information，NCBI locus NC_001526；version NC_001526.1； GI：9627100；references，Medline，91162763 and 85246220；PubMed 1848319 and 2990099)。
用于通过PCR扩增的引物
根据本发明的扩增方法学由针对基因组简化的HPV上链和/或 下链的寡核苷酸引物组组成。这种从液基细胞学以及人类患者的存 档石蜡样品产生的HPV特异产物的引物列表总结于表1。大多数引 物是针对不同HPV型的上链衍生物，但较少数针对下链衍生物 (HPVB)。
表1.利用HPV的上或下衍生链，适于检测各种HPV型的516 种正向和反向引物的实例。
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV11-E4-1   ATTATTGGGAAGTATGTTATGGTAGT   1   HPV11-E4-2   GTTTTTTTGTATTTGTATTTAGT   2   HPV11-E4-3   TACTTATATAATTATCAATAAC   3   HPV11-E4-4   AAATCACCTTACAATTACACTATAAAC   4   HPV11-E7-1   GTTATGAGTAATTAGAAGATAGT   5   HPV11-E7-2   ATTATTAAATATTGATTTGTTGT   6   HPV11-E7-3   ATACCTATAATATACTCTACTATAAC   7   HPV11-E7-4   CAAAATTTTATATAATATACCTATC   8   HPV16-E4-1   GAATATATTTTGTGTAGTTTAAAGATGATGT   9   HPV16-E4-2   GTTTTATATTTGTGTTTAGTAGT   10   HPV16-E4-3   CCTTTTAAATATACTATAAATATAATATTAC   11   HPV16-E4-4   CACACAATATACAATATACAATAC   12   HPV16E5-1   GTTTATATGATAAATTTTGATATTGT   13   HPV16E5-2   TTGTGTGTTTTTGTGTGTTTGTT   14   HPV16E5-3   ATATTAAAAATAAAAATATATAAAC   15   HPV16E5-E   ATATATAACAATTACATTATATAC   16   HPV16-E6-1   GAAAGTTATTATAGTTATGTATAGAGT   17   HPV16-E6-2   ATTAGAATGTGTGTATTGTAAGTAAT   18   HPV16-E6-3   ACTACAATATAAATATATCTCCATAC   19   HPV16-E6-4   AAACTATCATTTAATTACTCATAAC   20   HPV16-E7-1   TATGTATGGAGATATATTTATATTGT   21   HPV16-E7-2   GTTATGAGTAATTAAATGATAGTTT   22   HPV16-E7-3   TAAAACACACAATTCCTAATATAC   23   HPV16-E7-4   CCCATTAATACCTACAAAATCAAC   24   HPV18-E4-1   GGGAATATAGGTAAGTGGGAAGTAT   25   HPV18-E4-2   GATTGTAATGATTTTATGTGTAGTATT   26   HPV18-E4-3   AAATAATATATCTCTATAATAATC   27   HPV18-E4-4   TTCATTACCTACACCTATCCAATACC   28   HPV18E5-1   ATATGATAATGTAATATATATGT   29   HPV18E5-2   GTGTATGTATGTATGTGTGTTGTT   30
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV18E5-3   CATATATATACAATAATAACATAAAC   31   HPV18E5-4   CAACCTATACAATTACTATAAAAAC   32   HPV18-E6-1   GATAGTATATAGTATGTTGTATGTT   33   HPV18-E6-2   ATTTAGATTTTGTGTATGGAGATAT   34   HPV18-E6-3   ATCTTACAATATTACCTTAAATCCATAC   35   HPV18-E6-4   AAATTTCATTTTAAAACTCTAAATAC   36   HPV18-E7-1   GTATGGATTTAAGGTAATATTGTAAGAT   37   HPV18-E7-2   GTATTTAGAGTTTTAAAATGAAATTT   38   HPV18-E7-3   AACACACAAAAAACAAAATATTC   39   HPV18-E7-4   ACCATTATTACTTACTACTAAAATAC   40   HPV26E4-1   GTATTTAGTATTTGTAGTAGT   41   HPV26E4-2   TTATTGTTAAAATTGTTGAGTT   42   HPV26E4-3   AATAATAACCTCCACTTATAC   43   HPV26E4-4   AAATATACTATAAACACAATTTAATC   44   HPV26E6-1   GTTTGAATATTATTTTGTAAAATTTGT   45   HPV26E6-2   TATTGTAAGGAAATTTTATAATGGGT   46   HPV26E6-3   CTTTATTTTTCTTCTAACCCCAATAAC   47   HPV26E6-4   ATACACAACCCTTTCCACTACCCTAC   48   HPV26E7-1   GAAATATAAGTGTAAAGAATAATGT   49   HPV26E7-2   GAATAATTGGATTATGAATAATTTGAT   50   HPV26E7-3   TCTTCCATTAACATCTACTCCAAC   51   HPV26E7-4   TTACTATACAACACACTAATAAC   52   HPV30-E4-1   GTATAAAGGTATATGGGAAGTGT   53   HPV30-E4-2   GATTTTGTGTTTAGTATTTTTAGATT   54   HPV30-E4-3   CATATAACTCCACCAAAACACTATC   55   HPV30-E4-4   TCTATTTAATTCACCTTTTAAATAC   56   HPV30E6-1   GTATAGTTTATAGAAAGGGAGTGAT   57   HPV30E6-2   GTATTAAAYGGATAGTGTATTTATGGT   58   HPV30E6-3   TACACACTACATATAAACTA   59   HPV30E6-4   CCCATACAATAAATAATTATAATATC   60   HPV30-E7-1   GATAATTTATAGAAGTAGTTATAGT   61   HPV30-E7-2   TTTTGTTATTTAATTAATATATAG   62   HPV30-E7-3   CCCATCTAAATCTAATACTATAC   63   HPV30-E7-4   CTATATTATTATTACATTACTATTATC   64   HPV31-E4-1   TTTTTGAATTTGTATTTAGT   65   HPV31E4-1A   GAATTAAATATTTTTATAGTAAGT   66   HPV31-E4-2   ATTTTTTGTTGGGATTGTTATAAAGT   67   HPV31E4-2A   GTGTTATTATTTGTGTGTTTTGTT   68   HPV31-E4-3   TCAATAACCCCACAATTAACACTATC   69   HPV31E4-3A   ATAATAAAATATATATAAACAC   70   HPV31-E4-4   CTTATTTAATTTATACATACAACTAC   71   HPV31E4-4A   AAAAAATACATATATATAAATTAC   72   HPV31E6-1   TTTAGTATAAAAAAGTAGGGAGTGAT   73   HPV31E6-2   GGTATATAAAGTATATAGTATTTTGTGT   74   HPV31E6-3   AATCTTAAACATTTTATACACACTC   75   HPV31E6-4   CACACTATATCTATACCATCTAAATTC   76
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV31-E7-1   GTAATTGATTTTTATTGTTATGAGT   77   HPV31-E7-2   GTTATAGATAGTTTAGTTGGATAAGT   78   HPV31-E7-3   CTAAATCAACCATTATAATTACAATC   79   HPV31-E7-4   CCTATCTATCTATCAATTACTAC   80   HPV33-E4-1   GTGGGTGGTTAGGTAATTGTTTGTT   81   HPV33E4-1A   GTAAAAATATTATTTATTGTGT   82   HPV33-E4-2   TTAAATATTTATTATTGAAATTGT   83   HPV33E4-2A   GTGTATATTATAAGTTAATATGTGT   84   HPV33-E4-3   CCTTTTAAATACACTATAAATAC   85   HPV33E4-3A   AAAAATCCCACAAACACCCAAAACAAC   86   HPV33-E4-4   CTAATCCAATACCAAATAAATAAC   87   HPV33E4-4A   TACTCTTATTATATCATATACTATAC   88   HPV33E6-1   GAATATATAAAGTAAATATTTTGT   89   HPV33E6-2   GGTATTGTAYGATTATGTTTTAAGAT   90   HPV33E6-3   CTCTATATACAACTATTAAATCTAC   91   HPV33E6-4   CCATATACAAAATAATTATAATATC   92   HPV33-E7-1   TTTTGTATATGGAAATATATTAGAAT   93   HPV33-E7-2   TAGGTGTATTATATGTTAAAGATT   94   HPV33-E7-3   CCTCATCTAAACTATCACTTAATTAC   95   HPV33-E7-4   TAACTAATTATACTTATCCATCTAAC   96   HPV35-E4-1   GGGTGGTTAGGTAATTGTTTGTTT   97   HPV35E4-1A   GGATATATGTTTATATGATAGATT   98   HPV35-E4-2   ATTTATTGTTGAAATTGTTATATAGT   99   HPV35E4-2A   ATAGTTTTTAGTATTGTGTTGT   100   HPV35-E4-3   CAAATATAAAATAAACCCCTCTATC   101   HPV35E4-3A   CAATTACTATACTACCAAATATTATAC   102   HPV35-E4-4   ATATACTATAAATATAATTATAC   103   HPV35E4-4A   CCACCATACACACATATTACACAATAC   104   HPV35E6-1   GGTTGTTATAAAAGTAGAAGTGT   105   HPV35E6-2   AAAAGTAGAAGTGGATAGATATTG   106   HPV35E6-3   ACACAAATCATAACATACAAAATC   107   HPV35E6-4   ATACATACTCCATATAACTAACC   108   HPV35-E7-1   AAATAATGTAATAAATAGTTATGTT   109   HPV35-E7-2   GTTGTGTTTAGTTGAAAAGTAAAGAT   110   HPV35-E7-3   CCATATATATACTCTATACACACAAAC   111   HPV35-E7-4   AAACACACTATTCCAAATATAC   112   HPV39-E4-1   GTAAATGGGAAGTGTATTATAATGGT   113   HPV39-E4-2   AATTTATTGTTTTGATTTTATGTGT   114   HPV39-E4-3   AATTATTAAAATAATCCAAAAAC   115   HPV39-E4-4   TAATATTACCACAACTAAAATAC   116   HPV39E5-1   GTATATGTTTTATTGGGTTATATGAT   117   HPV39E5-2   GTATATATATATGTTGTAATGTT   118   HPV39E5-3   ATCTATACAACAACCACATAAAC   119   HPV39E5-4   CAATACTATATCATATCCATTAC   120   HPV39E6-1   TTTATAATATTTTATAAGTATT   121   HPV39E6-2   GTTTAAAAAAAGGGAGTAAT   122
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV39E6-3   CATAATTAACATACAACTAATAATTC   123   HPV39E6-4   ATTATATTTTCTAATATAATTAC   124   HPV39-E7-1   TTAAAGTTTATTTTGTAGGAAATTG   125   HPV39-E7-2   GATTTATGTTTTTATAATGAAATATAGT   126   HPV39-E7-3   CTAATAAATCCATAAACAACTAC   127   HPV39-E7-4   CATAACAAATTACTAATTTACATTTAC   128   HPV40E4-1   ATGTAGATTTTGTAAAGGAAGTAT   129   HPV40E4-2   GGATTATTTATTGTTGAGATTGT   130   HPV40E4-3   CCTATACCCRTTATTACTTTCAAAATC   131   HPV40E4-4   TCTAAAACACTTTAAACAATTAAC   132   HPV40E6-1   GATTTTGTATGAATTGTGTGATTAGTGT   133   HPV40E6-2   GTTTTAAAAATAGTTGAGGTATTGGTT   134   HPV40E6-3   CAAAAACTTATAACACTTACAAC   135   HPV40E6-4   TCCAACAATATAAACAATACCCTATC   136   HPV40E7-1   GTATTTTGAATTTGTATGTTTAAATTGT   137   HPV40E7-2   GATAGTTTAGATTTAGAAGATGAT   138   HPV40E7-3   TATATAATATACCCATCAACAACTAC   139   HPV40E7-4   CACTCTATAACTACACAATTAAAAC   140   HPV42-E4-1   GTAGAGATATTTTTTATTGGATT   141   HPV42-E4-2   GTTGGTATAATAAGTGTGTAT   142   HPV42-E4-3   ATTCTAACCCCACACAATCCAAAATC   143   HPV42-E4-4   TAACCTAACTTCCACAATAATTC   144   HPV42-E7-1   GTATATAGTGGAGAAAGAAATTGGAT   145   HPV42-E7-2   GAATAATAAATTAGATGTGTTTTGTGTT   146   HPV42-E7-3   CCAATTATTCATAACAATACAAATC   147   HPV42-E7-4   ACTTAATCATCTTCATCTAAAC   148   HPV43-E4-1   TAATATATAGTATGTGGGTAAAAGT   149   HPV43-E4-2   TTTTTGTATTTGTATTTAGTAT   150   HPV43-E4-3   ATTATACCCTCTAAAATAATAATC   151   HPV43-E4-4   ACTTCACCTTATAACTATATTATAAAC   152   HPV43E6-1   TTATACTTGTAGTTTAAGGTGGGAT   153   HPV43E6-2   TTATAGTTTGTGGGGTATAATGAT   154   HPV43E6-3   TTTTCCATAAAACTATAAACAAAC   155   HPV43E6-4   TATAACACTTACAACATCTAATAC   156   HPV43-E7-1   GTATAGTATATTGTGTAAAAGGT   157   HPV43-E7-2   TTGTTTATATTGTTGGAAATTATGT   158   HPV43-E7-3   CTTAATATCACTATCAAAACACTAC   159   HPV43-E7-4   TTTTAATATACCCAACAACAAATC   160   HPV44-E4-1   GAYGTATTTATTGTTGGGTTTGT   161   HPV44-E4-2   GGTTTTATTTATATTGTTTATTGGT   162   HPV44-E4-3   TACCTATACAATAATTATTATC   163   HPV44-E4-4   TCACCTTATAATTAAACTACAAAC   164   HPV44-E7-1   GGAAATTTTTTATTTGTAGTTTGTGTT   165   HPV44-E7-2   ATAAGGTAAGGTTAATTAATTTAGGT   166   HPV44-E7-3   CCTTTAAAATAATATAATTTCCATAC   167   HPV44-E7-4   CCTACAAAATCAAAAAATTCCAAC   168
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV45E4-1   GTGGGAAGTATAATATGGGGGT   169   HPV45E4-2   GTAATGATTTTATGTGTAGTATT   170   HPV45E4-3   TATTACTTATACTTAAACACAAAAAC   171   HPV45E4-4   TATCACCTTTTAAATATATTATAAAC   172   HPV45E6-1   ATATTATATAAAAAAGGGTGTAAT   173   HPV45E6-2   GTATATAAAAGTTTTGTGGAAAAGTGT   174   HPV45E6-3   TACACTATACATAAATCTTTAAAAAC   175   HPV45E6-4   TACATTTATAACATACAACATATAC   176   HPV45-E7-1   GTAAGAAATTGTATTGTATTTGGAATT   177   HPV45-E7-1A   GTAAGAAATTGTATTGTATTTGGAATT   178   HPV45-E7-2   GAATGAATTAGATTTTGTTGATTTG   179   HPV45-E7-2A   GAATGAATTAGATTTTGTTGATTTG   180   HPV45-E7-3   CAACTACTATAATATTCTAAAATC   181   HPV45-E7-3A   CAACTACTATAATATTCTAAAATC   182   HPV45-E7-4   AACACACAAAAAACAAAATACTC   183   HPV45-E7-4A   AACACACAAAAAACAAAATACTC   184   HPV51-E4-1   TATATGGGGTATAATAGTGGGAGGTT   185   HPV51-E4-2   GTTTTGAATATGTATTTAGTATTTGT   186   HPV51-E4-3   CTTTAATACCCTCCAATATTAATAC   187   HPV51-E4-4   CAATTTATATCACCTTTTAAATAC   188   HPV51-E7-1   TTGTGTATGGTATTATATTAGAGGT   189   HPV51-E7-2   GATGTTAAAGATTATTTGGGTT   190   HPV51-E7-3   TCCTCTAAACTATCAAATTAC   191   HPV51-E7-4   CAACCCRTCTTTCTAATAACTAATC   192   HPV52E4-1   GGTGGTTAGGTAATTGTTTGTTTTGT   193   HPV52E4-2   ATTGAAATTGTTGTTTATTTATGT   194   HPV52E4-3   CTTTATTTATACACTCAATTACAATAAC   195   HPV52E4-4   TAAATACAATACAAATTATATATAC   196   HPV52-E7-1   TTTGAAATAATTGATTTATATTGT   197   HPV52-E7-2   ATGAGTAATTAGGTGATAGT   198   HPV52-E7-3   CTATACCTTCAAAATCCTCCATTAC   199   HPV52-E7-4   TTATTACCTCTACTTCAAACCAAC   200   HPV53E4-1   TATGGGAAAATAAAGTATTTATTGTTT   201   HPV53E4-2   GATTTTGTGTTTAGTATTTTTAGATT   202   HPV53E4-3   ATTTATATTATCTATATTCCTTAC   203   HPV53E4-4   CAAATACAATCTTATAACCACTATC   204   HPV53-E7-1   TAGTGTAYGGGGTTAGTTTGGAAGT   205   HPV53-E7-2   ATTTGATTTATTAATAAGGTGT   206   HPV53-E7-3   CTATAATATATTATAAAAATATTAATAC   207   HPV53-E7-4   CAATTACTCATAACATTACAAATC   208   HPV54-E4-1   GGGAGGTGYGTATGGGTAGTAGT   209   HPV54-E4-2   GGTATTGTTGAATATATTAGATTAGTT   210   HPV54-E4-3   ATAATATCACCACTACTTATATAC   211   HPV54-E4-4   CCTAAAACATTTTAATATATTAAATTC   212   HPV54-E7-1   AGGATTTATTTGTGGTGTGGAGAT   213   HPV54-E7-2   GTATGTGTATTGTGTTTAGAATTGT   214
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV54-E7-3   ACATTATAACTTCCAACAATATAAAC   215   HPV54-E7-4   CAAAAACTATATCCTCAATTATAAC   216   HPV55-E4-1   GGAGGTTTGTATTGGTAGTAGTGTT   217   HPV55-E4-2   GTATTTATATTTAGTATTGTGT   218   HPV55-E4-3   AATAAATATTATTATTTATACTATC   219   HPV55-E4-4   AAATCACCTTATAATTAAACTACAAAC   220   HPV55-E7-1   GGTTAATTAATTTAGGTATTTTGAT   221   HPV55-E7-2   GTATTAATAGTGGAAGAAGAGAT   222   HPV55-E7-3   CCTACAAAATCAAAAAAATCCAAC   223   HPV55-E7-4   AACTAATTCATCCACCTCATCCTCTAAAC   224   HPV56E4-1   ATTATATAGATTTTGAATAAGAGGTT   225   HPV56E4-2   GAAAATGAGAGTATTTATTGTTTTGAT   226   HPV56E4-3   ATTATTAATACTTCTACTTCTACTATC   227   HPV56E4-4   AATTCACCTTTTAAATATACTACAAAC   228   HPV56E6-1   TATTTTTATATATTGGGAGTGAT   229   HPV56E6-2   TTGTGTGGATATATTTATGGAGTT   230   HPV56E6-3   CACTAATTTTAATTCAATACATAC   231   HPV56E6-4   CAATAAACATACTCTACACACTAC   232   HPV56-E7-1   GATTTATAGTGTAATGAGTAATTGGATAGT   233   HPV56-E7-1A   GATTTATAGTGTAATGAGTAATTGGATAGT   234   HPV56-E7-2   GGTTATAGTAAGTTAGATAAGT   235   HPV56-E7-2A   GGTTATAGTAAGTTAGATAAGT   236   HPV56-E7-3   TCCCCATCTATACCTTCAAATAAC   237   HPV56-E7-3A   TCCCCATCTATACCTTCAAATAAC   238   HPV56-E7-4   CCTATTTTTTTTTCTACAATTAC   239   HPV56-E7-4A   CCTATTTTTTTTTCTACAATTAC   240   HPV57E4-1   GGATTTTGGAATAGAGGTTTTGATT   241   HPV57E4-2   GTATTTGTGTTTAGTATTTAGGT   242   HPV57E4-3   TAAAATCRAACTATTACCACTACTATC   243   HPV57E4-4   TTTAACACTCCACCTACCCTTCTCTAAC   244   HPV57E6-1   GTTTTAGGAATATTTTTTTGT   245   HPV57E6-2   GTGTAGAGAGTATGGTTTGGAGT   246   HPV57E6-3   CCAATACCTATATTATCTAAATTTTAC   247   HPV57E6-4   CAACTAAAATATAAATAATCCTATC   248   HPV57E7-1   GATAATTTAGAAGAAGATAT   249   HPV57E7-2   AATTGATAGAATTAGTTGTGTAGGTT   250   HPV57E7-3   CATAAATTATTATAACTTCCACATAAAAC   251   HPV57E7-4   CCTCATCCTCRTCACTAAATACCTAAC   252   HPV58-E4-1   GTTTTATATTTATATTTAGTGATT   253   HPV58E4-1A   GTAAATTATAAGTTAATATGTGTTGT   254   HPV58-E4-2   ATTGAAATTGTTGATTTAAAGATT   255   HPV58E4-2A   GTTTTATATTGTTTTTATGTTTGTGT   256   HPV58-E4-3   TACACRATAAATAAAACTTTAAAAC   257   HPV58E4-3A   TAACTTTATTAAATTAAATATTATAC   258   HPV58-E4-4   TAAACATTTTAAACTATTTAAATC   259   HPV58E4-4A   TACCATACCACCATATACAAAAC   260
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV58E6-1   TTAAATTATAATGTTAAATTTTG   261   HPV58E6-2   GTAGATATTTTTTGGTAGGTTATTGT   262   HPV58E6-3   TTACATACTACAAATAAATTTC   263   HPV58E6-4   TATCTATACTCACTTATTTTAAATAAC   264   HPV58-E7-1   TATTTTGAATTAATTGATTTATTTTGT   265   HPV58-E7-2   ATGAGTAATTATGTGATAGTTT   266   HPV58-E7-3   ATACATATACCCATAAACAACTAC   267   HPV58-E7-4   TTATTACTATACACAACTAAAAC   268   HPV66-E4-1   TATATAGATTTTGAATAGGAGGTT   269   HPV66-E4-2   GAGTATTTATTGTTTTGATTTTGTGTT   270   HPV66-E4-3   TAATTTTATCACCACAATAAC   271   HPV66-E4-4   CACCTTTTAAATAAATTACAAAC   272   HPV66-E7-1   GTATTATAAATATTTAGTGTATGGGGT   273   HPV66-E7-2   GTTATTTGATTTATTAATAAGGTGT   274   HPV66-E7-3   TCCAATTACTCATTACATTATAAATC   275   HPV66-E7-4   TATATTATTCAACTTATCTAAC   276   HPV6-E4-1   AATAATGGGAAGTATGTTATGGTAGT   277   HPV6-E4-2   TATATAAGAAGTATTTATTTTTG   278   HPV6-E4-3   TACTATCACATCCACAACAACAAATC   279   HPV6-E4-4   CTCTAATATCTATTTCTATACACTAC   280   HPV6-E7-1   GATATTTTGATTATGTTGGATATGT   281   HPV6-E7-2   GTTGAAGAAGAAATTAAATAAGAT   282   HPV6-E7-3   TACTATCACATCCACAACAACAAATC   283   HPV6-E7-4   CTCTAATATCTATTTCTATACACTAC   284   HPV73E4-1   GGGTGGTTAGGTAATATGTTGTGT   285   HPV73E4-2   TTTGAAATTGTTAATTTATTGT   286   HPV73E4-3   CATTATATATAATACACTAAATAC   287   HPV73E4-4   ACTATTTTTATCACCTTTTAAATAC   288   HPV73E6-1   AAATTTGGATTGTGTGTTTTGTT   289   HPV73E6-2   GAAAGGATAAATTATATGGTGTATGT   290   HPV73E6-3   CATACTTTTACTTTTCCAATAAAC   291   HPV73E6-4   CCACAATTACAAATAATCTCCAAC   292   HPV73E7-1   GTATGGAAAAAAAATAATTTTGT   293   HPV73E7-2   GATTTTATATGTTAYGAGTTATTGGAT   294   HPV73E7-3   CACAATACCTAATATACCCATAAAC   295   HPV73E7-4   TAAATTTCTAAAACAATTAAAAC   296   HPV82E4-1   GTGTGGTAATGTAATAATATGTTT   297   HPV82E4-2   TTTTATTATAATTGTTGAATAGT   298   HPV82E4-3   CAATTTTAATTACACTAAAATACC   299   HPV82E4-4   CTTAAACATTTTAAACAATTTATTAC   300   HPV82E6-1   GAGTAGATGTGTATAATGTAGT   301   HPV82E6-2   GTTATATGTAGTATGTAAAAAATGTT   302   HPV82E6-3   CACCACCTTTTACTTTTCTTCAAAC   303   HPV82E6-4   TTATCTTAATAATTTTCTACAATTTAC   304   HPV82E7-1   AATTTGAAATTGATTTGTAATGT   305   HPV82E7-2   GTGATTAGTTAGTTAGATAAGT   306
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV82E7-3   CACACCACRAACACACCAAAC   307   HPV82E7-4   CTCTATACCTTCACTATCCATTAC   308   HPV83E4-1   GATTTTGTATTTAGTATTTAGGAT   309   HPV83E4-2   TTTGTTGTAATTAGTATTAGGT   310   HPV83E4-3   TTATACAAACACTATCACTACTATATC   311   HPV83E4-4   ATTCACTATATCCCTTATAAC   312   HPV83E6-1   GAATTAATAATAGTAGAAGTGTTGTT   313   HPV83E6-2   GGAGTTGTGTATTAAGTGGGATT   314   HPV83E6-3   CTCAACRACTTCAAACACATATAAC   315   HPV83E6-4   TACATAATACCCTACAATAACAAC   316   HPV83E7-1   GGTTATATAGTAATAATAGT   317   HPV83E7-2   GTAATGAATAAGGTATAGATAGT   318   HPV83E7-3   CTATATCCACTACATTCACCAAAAAATC   319   HPV83E7-4   TAAATTCCCCAATCCCAATATCTATAC   320   HPV84E4-1   ATGTATGYGATTTTGTATTTAGT   321   HPV84E4-2   ATTGTTGAAATTGTTGTATAGTTGT   322   HPV84E4-3   CAATTATTATTTATCCTTATACTAC   323   HPV84E4-4   TAAATATAAAACAAATACACTATC   324   HPV84E6-1   GGAAGGYGAAGTGTTGGTTTTTGT   325   HPV84E6-2   GGTATAATTTTTTTTATGGGGTGTGT   326   HPV84E6-3   TCCTTTTCCTAATAACACAATAACTTAC   327   HPV84E6-4   CTATCCAACTATTTTATAAATTAAC   328   HPV84E7-1   GTTGTTATTTTATAAAATAGTTGGAT   329   HPV84E7-2   GGAAGTGTTGTAATTGTAGGGTAAT   330   HPV84E7-3   CTTTCTAAAATCTTCCACTCCACAAAAC   331   HPV84E7-4   TAAACACTACTTCCACTATAAACTACTAC   332   HPV-HM-1   GATTTDKWDTGTWATGAGTAATT   333   HPV-HM-1A   GATTTDTWDTGTWATGAGTAATT   334   HPV-HM-2   RRYRRKTTAGABGADGA   335   HPV-HM-2A   RRTRRKTTAGABGADGA   336   HPV-HM-2B   RRYRRKTTAGAKGADGA   337   HPV-HM-2C   RRTRRKTTAGAKGADGA   338   HPV-HM-3   YDATACCTWCWMAWWHVDCCAT   339   HPV-HM-3A   YWATACCTWCWMAWWHRDCCAT   340   HPV-HM-3B   YWATACCTWCWAAWWHRDCCAT   341   HPV-HM-3C   YWATACCTWCWMAWWMRDCCAT   342   HPV-HM-3D   YWATACCTWCWMAWWHVDCCAT   343   HPV-HM-4A   ACHWMAAACCAHCCWHWACAHCC   344   HPV-HM-4B   ACHWMAAACCAWCCWHWACAHCC   345   HPV-HM-4C   ACHWHAAACCAHCCWHWACAHCC   346   HPV-HML-1   GRKTTDKWDTGTWRKGARTAATT   347   HPV-HML-2   RRHRRKTTWGANKWDGA   348   HPV-HML-3   YDATACCTWHWHHDWHNDCCAT   349   HPV-HML-4   ACHHHAAACCAHCCHHWACAHCC   350   HPV-Uni-1   GATGGKGATATGRTDSATRTWGGDTWTGG   351   HPV-Uni-2   TAARTATTTWGATTATWTDDRAATG   352
  引物   序列  SEQ ID NO   HPV-Uni-3   TATTWTAWCCYTAHRCHYWHTAHAACCA   353   HPV-Uni-4   AMAAAHAMHTAATTHYHMMAACAWAYACC   354   HPV-Uni-5   TAAAAHAYAAAYTAYAMWTCAWAYTCYTC   355   HR1F   TRTATGGARWDATATTRGAA   356   HR2F   TRATTTRTTAATWAGGTGT   357   HR3R   AAYAYAWHWTCWTACAAYAT   358   HR4R   AATTACTCATWACAHWAHAAATCA   359   HR5F   GAGGGDAWGGGDTGTWRTGGWTGGTTT   360   HR6F   GATRWWATATTAGATGATGA   361   HR7R   TWWACTATYTCTWHHTCTACCTA   362   HR8R   CYAHAWTCTTTCATTTTAA   363   LR1F   TATDDWTATATDTARAGKKTDAT   364   LR2F   GGGWRTGGTDWTRTTDDTRTTA   365   LR3R   HAYWATWMWWCWAYTYTT   366   LR4R   TAWWHHHYWAAYAYATTTAA   367   R1HML-1F   RGGWGKRATTGAAWDDGGTK   368   R1HML-2F   ATTRAAADTGGWDDDTATA   369   R1HML-3R   HHHYYTACAHMMHAYACA   370   R1HML-4R   AWWMWWMHWHWWAHAYMTC   371   R1HM-1F   GGGWGTRATTGAAADDGGTK   372   R1HM-2F   ATTRAAAWTGGTDDDTATA   373   R1HM-3R   HHHYYTACAHTMHACACA   374   R1HM-4R   AWAMWAMHTHWWATACMTC   375   R2HML-1F   TTDDWDTGTWRKGARTAATT   376   R2HML-2F   ATGGWDDWWDDWDWAGGTAT   377   R2HML-3R   YHAHWWACTTTCATTTTAMH   378   R2HML-4R   MWAYWACCATWHMYACTAWM   379   R2HM-1F   ATGGWKDWWTKWGWAGGTAT   380   R2HM-2F   GGGDTGTWDDGGDTGGTTT   381   R2HM-3R   ACTAYYTCHHHHTCYACCTA   382   R2HM-4R   YHAHAWACTTTCATTTTAMH   383   R2HM-5R   MWAYWACCATAHCCACTATC   384   R3HML-10R   WMWHMHWWMATWHCCATC   385   R3HML-11R   AYHWMYMHHWWWHHYYWATAYTT   386   R3HML-1F   RTTTAARGADDKDTWTGGDDT   387   R3HML-2F   RRAGTRATARDWKWDKDTGT   388   R3HML-3F   TRTDDWTATWTDTARWGKTT   389   R3HML-3R   AAMCWYTAHAWATAWHHAYA   390   R3HML-4F   TTWTTWWRRWTRTWDAK   391   R3HML-4R   MTHWAYAWYYWWAAWAA   392   R3HML-5F   ATGRTDTARTGGGTWTWTGATWAT   393   R3HML-5R   ATWATCAWAWACCCAYTAHAYCAT   394   R3HML-6F   GADGADWRTDWDATDGTDT   395   R3HML-6R   AHACHATHWHAYWHTCHTC   396   R3HML-7F   GATTGTGKDDKWATGKKWWRRT   397   R3HML-7R   AYYWMMCATWMHHMCACAATC   398
  引物   序列  SEQ ID NO   R3HML-8F   DRTDTTWAARWADARTTGT   399   R3HML-8R   ACAAYTHTWYTTWAAHAYH   400   R3HML-9F   AATKTWDDDAGTTATTTTTGGTT   401   R3HML-9R   AACCAAAAATAACTHHHWAMATT   402   R3HM-10F   TTDGTWGAWDKWRATAGTAATGT   403   R3HM-10R   ACATTACTAYTWMHWTCWACHAA   404   R3HM-11F   GATTGTGKDRTWATGKKWWRRT   405   R3HM-11R   AYYWWMMCATWAYHMCACAATC   406   R3HM-12F   RRKGADGRDGGDRATTGGA   407   R3HM-12R   TCCAATYHCCHYCHTCMYY   408   R3HM-13F   GGWRTDTTWAARWAWARTTGT   409   R3HM-13R   ACAAYTWTWYTTWAAHAYWCC   410   R3HM-14F   AATTTWDDDAGTTATTTTTGGTT   411   R3HM-14R   AACCAAAAATAACTHHHWAAATT   412   R3HM-15F   GATGGDWATKWWDKWWKW   413   R3HM-15R   WMWWMHWWMATWHCCATC   414   R3HM-16F   AARTATWRRDDWTWRDKRTARWTRDW   415   R3HM-16R   WHYAWYTAYMHYWAWHHYYWATAYTT   416   R3HM-17R   ATAYWYWAMATTHCYATTWWHATC   417   R3HM-18R   AAAYYTAATYTAMACCAHATM   418   R3HM-1F   ATTTAAAGADDTDTWTGGDDT   419   R3HM-2F   ARAGTRATARWWKWWKDTGT   420   R3HM-3F   TRTDDWTATWTDTARWGTTTA   421   R3HM-3R   TAAACWYTAHAWATAWHHAYA   422   R3HM-4F   GTDKWAARADKAGRDWAAT   423   R3HM-4R   ATTWHYCTMHTYTTWMHAC   424   R3HM-5F   TTWTTWAAAWTRTGDAGT   425   R3HM-5R   ACTHCAYAWTTTWAAWAA   426   R3HM-6F   TTRTATTKKTWTWRAATWGKWWTRTT   427   R3HM-6R   AAYAWWMCWATTYWAWAMMAATAYAA   428   R3HM-7F   TARTATRGWWTWDAKKAT   429   R3HM-7R   ATMHTMWAWWCYATAYTA   430   R3HM-8F   ATGRTRTARTGGGTWTWTGATWATGA   431   R3HM-8R   TCATWATCAWAWACCCAYATYAYCAT   432   R3HM-9F   GATGAWAGTKAWATDGTDTWT   433   R3HM-9R   AWAHACHATWTMACTWTCATC   434   R4HM-1F   TWKWRKAWAATTTDKTWTWTGA   435   R4HM-2F   TTDGATTTDGATTTTWTRRATAT   436   R4HM-3R   ACTHAHATCHTAATAAWAATA   437   R4HM-4R   HHHTYYWAWTYAYAWTTC   438   R4HM-5R   ACATAHAYATCAWAHMWW   439   R5HM-1F   TTARTGADRDTAWDGTDTATTT   440   R5HM-2F   ATWRRTATWTWTTATTATGT   441   R5HM-3R   CYAAAYTTATTWAAATCHAAYAA   442   R5HM-4R   ACCHAYYTCHAHHCCHAYACAWMCCCA   443   R5HM-5R   WMHAHTTTCWATATCATCHWA   444
  引物   序列  SEQ ID NO   R6HM-1F   GGDTWTGGDKKWATGGATTTT   445   R6HM-2F   WKTRTWTGTAARTATTTWGAT   446   R6HM-3F   GTWAGRTATTWWTDKAATWR   447   R6HM-3R   YWATTMHAWWAATAYCTWAC   448   R6HM-4F   TDTTWAGTGGDTTWATDGT   449   R6HM-4R   ACHATWAAHCCACTWAAHA   450   R6HM-5F   TARWTDTTTAATAARTTDTATTGG   451   R6HM-5R   CCAATAHAAYTTATTAAAHAWYTA   452   R6HM-6F   GGWTATAATAATGGTRTWTGTTGG   453   R6HM-6R   CCAACAWAYACCATTATTATAWCC   454   R6HM-7F   GATATWATWWKDARTATWAAT   455   R6HM-7R   ATTWATAYTHMWWATWATATC   456   R6HM-8R   TAAAAHAYAAAYTAYAAWTCAWAYTC   457   R6HM-9R   ATYCATHHHATAWAWATAWAHCAT   458   HPVB-1F   TTGWADTAAAAATTTDTKDTTWARDG   459   HPVB-2F   TTTTKWARRTTWATWKKTTAAAAW   460   HPVB-3F   KKTTKTTGRTADKTWRTDGT   461   HPVB-4F   ATWKTRTAWARTTGAAAWATAAATTGTA   462   HPVB-5F   TTGAAAWATAAATTGTARDTTAWATTTTTT   463   HPVB-6F   TTGRTTRTKTTARTAWATRTTATTRT   464   HPVB-7F   TTARTAWGGTTTATTRAAWAWTTGDG   465   HPVB-8F   TATTTKWADATARTTWGGATATTTRTA   466   HPVB-9F   TRTKWATTATRTTDTTRTTTTKWA   467   HPVB-10F   RTATARTTGDGTTTGTTTDKDRTT   468   HPVB-11F   ATTTTWADDTTWRTATADKTTTA   469   HPVB-12F   ATTTKDTTTTGDWWKDWATTTAAATG   470   HPVB-13F   KWWARWGGTTKTARTTAAAARTGRTT   471   HPVB-14F   TTTATWKWAAADWRTGATTTDTTTGT   472   HPVB-15F   TTKTTKDGTTTKTTTRTARTGTTKD   473   HPVB-16F   TATARTTTTTWADDWWTTTDGTTTG   474   HPVB-3R   ACHAYWAMHTAYCAAMAAMM   475   HPVB-4R   TACAATTTATWTTTCAAYTWTAYAMWAT   476   HPVB-5R   AAAAAATWTAAHYTACAATTTATWTTTCAA   477   HPVB-6R   AYAATAAYATWTAYTAAMAYAAYCAA   478   HPVB-7R   CHCAAWTWTTYAATAAACCWTAYTAA   479   HPVB-8R   TAYAAATATCCWAAYTATHTWMAAATA   480   HPVB-9R   TWMAAAAYAAHAAYATAATWMAYA   481   HPVB-10R   AAYHMHAAACAAACHCAAYTATAY   482   HPVB-11AR   TAAAMHTATAYWAAHHTWAAAAT   483   HPVB-11BR   ATHMMHTTACCHAAYCCHAAYAAATT   484   HPVB-11CR   TATTTTYTTWCAAATAWCHHYWTAAC   485   HPVB-12BR   ACWTAATMCAAATTAAAYTTAMW   486   HPVB-12CR   AHTHAAYAAYAWAAAYTAAAAA   487   HPVB-14R   ACAAAHAAATCAYWHTTTWMWATAAA   488   HPVB-15R   HMAACAYTAYAAAMAAACHMAAMAA   489   HPVB-16R   CAAACHAAAWWHHTWAAAAAYTATA   490
  引物   序列  SEQ ID NO   HPVB-17R   AMATAATACAATAAACMTWYAAYMAYAA   491   HPVB-18R   AAWAMHACMCCHAAATAAATWM   492   HPV59E6-1   GATTATATAAATTGTTTGATTTGAGT   493   HPV59E6-2   CAATATTGAATATTTTTTTGT   494   HPV59E6-3   CTTACATAAAATAAAATACATTTCAAAC   495   HPV59E6-4   CTCATATAACRATATCTTAATTTCAAC   496   HPV59E7-1   AAATTATGAGGAAGTTGATTTTGTGTGT   497   HPV59E7-2   GAGTTAATTATTTTTTGTTATTAGT   498   HPV59E7-3   TATATCCATAAACAACTACTATAAAAC   499   HPV59E7-4   ATCTATACCTTCCRAATCRACCATTAC   500   HPV59E4-1   GTTATTGATTGTTATGATTTTATGTGT   501   HPV59E4-2   GTATTTATTGTTGGATTTTTTGAGT   502   HPV59E4-3   CTAAATTATCACAATAATCCACTAAC   503   HPV59E4-4   TAATATTACTACAAAAAATATAC   504   HPV59E5-1   GTTTGTGTGTGTGTTGTAATGTTT   505   HPV59E5-2   GTTTTTGTAATTTGTTTATATGTGTGT   506   HPV59E5-3   TTATTATATAAACAATATTACATAAAC   507   HPV59E5-4   AAAATATACTATACAATACAATAC   508   HPV68E6-1   TTATTGTAGAAGGTAATTATAAYGGAT   509   HPV68E6-2   GGGAYGGGGTATTATTAGTTGTATGT   510   HPV68E6-3   CTCAATAATTTCAAACAACACATAC   511   HPV68E6-4   AAATCTTCRTTTTAAATTTAAATAC   512   HPV68E7-1   AATAGYGTTATATAATTTAGTGTAT   513   HPV68E7-2   GTAGTAGAAGYGTYGYGGGAGAATT   514   HPV68E7-3   ATCCCCATCTATACCTTCACAATTAAC   515   HPV68E7-4   TTATTTATCTACTATTACTTATAC   516
本发明的发明者发现用于检测高危HPV的最优引物是引物 SEQ ID NO：333至SEQ ID NO：350，这些引物是上链引物。这些引 物利用1和4进行第一轮PCR，利用2和3进行第二轮PCR。
本发明的发明者发现用于检测所有肛门生殖器HPV的最优引 物是下列下链引物：第一轮SEQ ID NO：462和SEQ ID NO：479，第 二轮SEQ ID NO：463和SEQ ID NO：478或者第一轮SEQ ID NO： 470和SEQ ID NO：485，第二轮SEQ ID NO：470和SEQ ID NO：486。
病毒引物序列已经产生，利用与不同HPV型做多重对准比较 而生成用于检测所有的HPV(表示为Uni)，高危型(表示为HR)，中 危型(表示为HM)，低危型(表示为LR)的引物。和各种这些HPV型 的组合。组合表示为高和中危HPV型(HM)、高、中和低危HPV型 (HML)。
高危、中危和低危型的HPV的构成根据地理位置和待检测的 个体的种族谱系而变化。FDA批准的Hybrid Capture 2检测利用13 种病毒型HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68，我们 共同称为高-中危。为了本发明的目的，这些中的一亚群被称为高危， 即HPV 16，18，45和58，另一亚群被称为中危31，33，35，39，51，52， 58，59和68。低危型是HPV6，11，26，30，40，42，43，44，53，54，55，57， 66，73，82，83和84。根据上述HPV病毒型的E6，E7，E4，E5基因设 计针对各种HPV型的引物。
表1中使用的名称实例，例如HPV11-E4-1表示利用E4基因区 域靶向HPV11上链的引物。-1表示特异性引物的号码。
由于为了克服简并情况，在特定位置需要使用一个以上碱基， 下列符号表示碱基插入：N＝A、G、T或C，D＝A、G或T，H＝A、T 或C，B＝G、T或C，V＝G、A或C，K＝G或T，S＝C或G；Y＝T或C，R＝A 或G，M＝A或C以及W＝A或T。
HPV检测
根据本发明的HPV检测方法(即基因组复杂性降低以及随后 的扩增技术)，可以与类型完全不同的其它检测联合用于评估细胞 种群内细胞状态改变，用于在感染细胞内以转录组、蛋白质组、代 谢物或甲基化网络紊乱为基础的风险评估，用于监测感染进展以及 用于评估治疗方案例如抗病毒治疗。
例如，测定HPV特异核酸分子的分子检测可以与以下检测联 合：
-利用模式识别和高通量自动成像技术例如用于组织切片中荧 光信号自动定量的Multi-Epitope-Ligand-Kartographie(MELK)系统 的方法。
-利用光、共聚焦、用于荧光原位杂交(FISH)的透射或电子显微 镜分析、检测细胞内染色体紊乱例如非整倍性或者异常细胞器(根 据数量、类型或形态学表现)大致水平的细胞学或组织学分析的方 法。
-利用核酸或多肽适体、Spiegelmers(镜像高亲和性寡核苷酸配 体)、多色纳米晶体(量子点生物结合物)、用于超灵敏非同位素分 子检测或者用于细胞表面或内部组分的的生物标记物、涉及 Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment(SELEX) 以及靶向不同细胞组分的高亲和性适体配体的组合化学方法的方 法。
-利用细胞的激光捕获或免疫磁性细胞富集技术，或者与流式细 胞术结合的以微珠为基础的技术，或者含有不同核酸或肽/蛋白基团 的胶体悬浮物的光学条形码的方法。
-利用旨在检测大致基因组不平衡例如重复、缺少、转座、重排 的单细胞比较基因组杂交、及其相关原位技术的方法；
-报告转录组调控的方法，例如robogenomic微阵列技术包括基 因表达序列分析(SAGE)、全基因表达分析、(TOGA)、随机排列的 可寻址的高密度光纤传感排列(randomly ordered addressable high density fiber optic sensor arrays)、微珠上的大规模平行测序技术 (MPSS)。
-利用多种技术报告蛋白质组调控的方法，包括通过蛋白微阵列 的细胞分析、基质辅助激光解析电离-飞行时间(MALDI-TOF)方法、 傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)、LC MS-MS和快速蒸发冷 却质谱(RapEvap MS)。
-利用多光子检测(MPD)技术的方法，其中检测水平接近 zeptomole(10-21)的敏感性。
-利用甲基化组技术以探测来自临床样品的细胞甲基化组，确定 细胞种群在从正常到宫颈癌的特定轨道中的位置，优选确定受病毒 感染影响的细胞或被募集至感染或炎症位置的免疫细胞内基因组 座位的甲基化特征的改变。
以前已经评估了上述技术中的一些(2001，Miklos and Maleszka， Proteomics，1，30-41)。
数据收集、整合以及处理系统
用于与本发明相关材料的数据收集以及数据处理系统可以与 临床患者数据联合并使用专门算法的方法分析。自动平台处理和数 据收集可以自动保存，收集的数据与信息学设施和软件工具结合， 该设施和软件与基因本体论(GO)结合，与如通过国家医学图书馆的 医学主题词条目(MeSH)辞典、在线人类孟德尔遗传(OMIM)所例示 的疾病本体论结合，或者与知识数据库例如人类基因组突变数据库 (HGMD)或PubMed结合。与最新人类基因组装配结合并提供进入 例如Genbank和RefSeq等来源的信息路径及下载的软件流水线， 可以与报告细胞基因组状态的方法组合，或由于HPV存在于体内 别处而被细胞影响。
整合HPV数据及相关生物信息学数据的数据库设施可以，例 如，利用松散结合的模块结构，其有利于更好的操作软件及管理数 据库。关系数据库管理系统(RDBMS)，(例如Postgresql version 7.3) 是开放的资源，且很强大，作为整合系统的一部分的实例来评估并 更好地预测HPV环境中的临床结局。涉及基于网络的图形用户界 面(GUI)的其它特征允许整合细胞学和组织学分析与分子HPV数据 以及可获得的多种形式的治疗学和药学数据。增强的数字图像分析 技术、病理学家的远程图像共享以及自动化可视系统的整合，设想 为自动化分子试剂盒平台的一个完整的部分。
细胞取样
HPV检测试验可以实施于来自人体任何部位的样品，包括来自 胚泡前阶段、胚胎组织、围产期材料、尸体或法医来源的样品，优 选地，它们来自于子宫颈阴道区域例如宫颈以及阴道，但也可以来 自皮肤来源。优选地，它们来自宫颈转化区。样品收集可以利用 CervexBrush、Therapak Corp、Irwindale、CA、USA；Digene宫颈 取样器、宫颈刷Digene Corp.Gaitherburg，MD，USA；塑料压舌板/刷 子组合；Cooper Instruments，Hollywood，FL，USA；或者利用涤纶拭子 或任何合适的材料从肛门-生殖器区域获得的样品或者通过任何标 准活检程序例如针吸活组织检查。所述样品可以置于各种介质中例 如来自TriPath Imaging Burlington，NC，USA的PreserveCyte，Cytyc Corp.MA，USA或AutoCyte PREP。优选地，对液基细胞学进行初 步检测，但是二维平面例如石蜡切片和载玻片也同样合适。
试剂盒
本发明可以多种试剂盒或试剂盒组合的形式来实施，并根据人 工、半自动或完全自动化平台例示。在一个优选形式中， MethyEasyTM或高通量MethylEasyTM试剂盒(Human Genetic Signatures Pty Ltd，Australia)利用自动化平台例如EpMotion在96或 384孔板中允许核酸的转化。
人类乳头瘤病毒
成熟的人类乳头瘤病毒DNA包被在由两种病毒编码蛋白组成 的20面体衣壳荚膜内。HPV16的双链环状DNA基因组长度为7904 个碱基对，普通的中危型在HPV51的7808个碱基对和HPV52的 7942个碱基对之间变化。下面以病毒基因组的区域在环状分子中发 生的顺序介绍。该病毒含有一个非编码区域命名为URR，随后是称 为E6、E7、E1、E2、E4、E5、L2和L1的编码区。一些病毒型可 能缺乏功能性E5区。E4区产生多重蛋白产物，其引起细胞质角蛋 白网络的紊乱，导致细胞质“晕轮效应”(称为凹空细胞)。不同的 HPV型是epitheliotopic，感染后可引起凹空细胞、角化不良、多核 化、象核扩大以及低度鳞状上皮内病变(LSILs)的异常，所有这些变 化仅适用于宫颈。在宫颈癌中，病毒感染和染色体异常相关，但对 瘤变中观察到的多参数变化及其与病毒感染、病毒基因表达、病毒 整合、细胞分化和基因组异常的相关性了解的很少(1998，Southern， S.A.et al.，Sex Transm Inf.，74，101-109)。正是因为这个原因，检测 不同病毒型及其在不同遗传背景中的不同效应显得相当重要。
另外，尽管现有技术中接受将HPV型分为皮肤型和粘膜型和 分为高危、中危和低危类，这些分类甚至在HPV的皮肤型和粘膜 型亚类中表现出一些漏洞(fraying)和重叠。例如，HPV7与皮肤 疣和口腔病变相关。HPV26在泛发性疣病和肛门生殖器病变的背景 下被分离出来。另外，尽管HPV6和HPV11已经分类为低危型， 但从Buschke-Lowenstein肿瘤以及喉癌、外阴癌以及尖锐湿疣中分 离出了HPV6和HPV11(1986，Boshart，M.et al.，J.Virology，58， 963-966；1992，Rubben，A.，et al.，J Gen Virol.，73，3147-3153)。
病毒整合入宿主基因组引起E1和L1基因区域之间的线性化并 保留了URR、E6和E7区，但引起象E1、L1和L2的基因区域缺 失以及E2的失活或缺失。宫颈癌中通常保留E6和E7区域，然而 缺乏E2蛋白表达。E2损伤与预后较差以及存活缩短相关。
患者样品
家庭医生利用Cytyc Corporation USA提供的宫颈取样设备从 子宫颈表面收集细胞样品。患者已经同意取样品作为常规癌症筛检 项目的一部分或者作为前期宫颈疾病的监测性检查。医生将细胞从 收集设备转移到甲醇/水溶液中，以保存细胞，并运送到实验室进行 检测。利用常规形态学制备评估该细胞样品由于癌前或病毒感染而 发生的变化。细胞样品的一个单独等分用于本说明书中列出的DNA 检测。
DNA提取
病毒DNA可以从任何合适的来源获得。实例包括，但不限于， 细胞培养物、肉汤培养物、环境样品、临床样品、体液、液体样品、 固体样品例如组织。来自样品的病毒DNA可以通过标准程序获得。 一个恰当的提取实例如下：将感兴趣的样品置于400μl的7M盐酸 胍、5mM EDTA、100mMTris/HCl pH6.4、1％Triton-X-100、50mM 蛋白酶K(Sigma)、100μg/ml酵母tRNA中。用一次性1.5ml研棒 彻底均质化样品，在60℃放置48小时。孵育后，样品经过5轮干 冰5分钟/95℃5分钟的冻/融循环。然后涡旋振荡该样品并在微量 离心机中离心2分钟使细胞碎片成团。将上清液移入干净管中，稀 释以降低盐浓度，然后酚：氯仿抽提，乙醇沉淀并重悬于50μl 10mM Tris/0.1mM EDTA中。
令人惊讶的是，本发明的发明者发现没有必要将病毒DNA与 其它来源的核酸分开。该处理步骤可以用于大量不同DNA类型的 混合物，然而病毒特异性核酸仍然可以通过本发明鉴定。据估计， 在复杂的DNA混合物中检测的限值为标准PCR检测的限值，可以 低至一个拷贝的靶病毒核酸分子。
亚硫酸氢盐处理
以下列出了一个有效的亚硫酸氢盐处理核酸的示例性试验方 案，该方案可保留基本上全部处理的DNA。本文中该方法也称为 人类遗传印记(Human Genetic Signatures(HGS))法。应该理解样 品或试剂的体积或量可以变化。
优选的亚硫酸氢盐处理方法可以在US 10/428310或 PCT/AU2004/000549中找到，二者均结合于此供参考。
向2μg DNA(如果需要可以用合适的限制性内切酶预消化) 中，加入2μl(1/10体积)的3M NaOH(6g/50ml水，新鲜制备)终 体积为20μl。该步骤将双链DNA分子变性为单链形式，因为亚硫 酸氢盐试剂优选与单链分子反应。该混合物在37℃孵育15分钟。 在室温以上的温度孵育可以用来提高变性效率。
孵育后，依次加入208μl 2M焦亚硫酸钠(7.6g/20ml水，和 416ml 10N NaOH；BDH AnalaR#10356.4D；新鲜制备)和12μl 10 mM对苯二酚(0.055g/50ml水，BDH AnalR#103122E；新鲜制 备)。对苯二酚是一种还原剂，有助于将氧化状态的试剂还原。还可 以使用其它还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(对苯 二酚)或其它合适的还原剂。样品用200μl的矿物油覆盖。矿物油 覆盖防止试剂的挥发和氧化，但并非必需。随后样品55℃孵育过 夜。可替换地，该样品可以在热循环仪中循环如下：孵育约4小时 或过夜如下：第一步，在PCR仪中55℃循环2小时；第二步，95℃ /2分钟。第一步可以在约37℃至约90℃之间的任何温度实施，时 间可从5分钟变化至8小时。第二步可以在约70℃至约99℃之间 的任何温度实施，时间可从1秒钟变化至60分钟或者更长。
用焦亚硫酸钠处理后，将油去除，如果DNA浓度低，加入1μl tRNA(20mg/ml)或2μl糖原。这些添加剂是可选的，可以用来通 过与靶DNA共沉淀而提高所获得的DNA的产量，尤其是DNA存 在浓度较低时。当核酸量＜0.5μg时，通常需要使用添加剂作为载 体以更加有效地沉淀核酸。
异丙醇提纯处理进行如下：将800μl水加入样品中，混匀，然 后加入1ml异丙醇。水或缓冲液将反应管中的亚硫酸氢盐浓度降低 到盐不与感兴趣的靶核酸一起沉淀的水平。稀释度通常为约1/4至 1/1000，只要将盐浓度稀释至低于如本文中所披露的预期范围。
将样品重新混匀，并置于4℃至少5分钟。样品在微量离心机 中离心10-15分钟，沉淀用70％ETOH洗涤2次，每次均涡旋振荡。 该洗涤处理除去任何与核酸一起沉淀的残余盐。
将沉淀干燥然后重悬于合适体积(例如50μl)的T/E(10mM Tris/0.1mM EDTA)pH 7.0-12.5中。已经发现pH 10.5的缓冲液尤其 有效。如悬浮核酸所需要的，将样品在37℃至95℃孵育1分钟至 96小时。
在WO 2005021778(结合于此供参考)中可以找到另一个亚硫 酸氢盐处理的实例，其提供将胞嘧啶转化为尿嘧啶的方法和材料。 在一些具体实施方式中，将核酸例如gDNA与亚硫酸氢盐以及多胺 催化剂(例如三胺或四胺)反应。可选地，该亚硫酸氢盐包括亚硫 酸氢镁。在其它具体实施方式中，核酸与亚硫酸氢镁反应，可选地 在多胺催化剂和/或季胺催化剂的存在下进行。还提供了可以用于实 施本发明的方法的试剂盒。可以理解，处理步骤中的这些方法也适 合于本发明。
扩增
PCR扩增在25μl反应混合物中进行，包括2μl亚硫酸氢盐处 理的基因组DNA，利用Promega PCR master mix以及6ng/μl的每 种引物。链特异性巢式引物用于扩增。第一轮PCR扩增利用PCR 引物1和4进行(见下)。第1轮扩增后，将1μl扩增的物质转移 至含PCR引物2和3的第2轮PCR预先混合液中，并如前所述进 行扩增。PCR产物样品在ThermoHybaid PX2热循环仪中扩增，条 件如下：95℃4分钟，1个循环；随后是30个循环，95℃1分钟，50℃ 2分钟以及72℃2分钟；72℃10分钟，1个循环。
整个巢式PCR试验方案的示意图表示如下：
→                                                     ←
               →                     ←
PCR#1                                                 PCR#4
PCR#2                                                 PCR#3
多重扩增
将1μl亚硫酸氢盐处理的DNA加入25μl 20反应体积的下列 组分中：x1 Qiagen多重master mix、5-100ng每种第一轮INA或寡 核苷酸引物1.5-4.0mM MgSO4、400μM每种dNTP和0.5-2单位 聚合酶混合物。所述组分随后在热盖热循环仪中进行如下循环。典 型地，在每个扩增反应中可以存在多达200种单独的引物序列：
第1步：94℃15分钟，1个循环
第2步：94℃1分钟；50℃3分钟35个循环；68℃3分钟。
第3步：68℃10分钟1个循环
随后进行第二轮扩增，将1μl第一轮扩增的等分物转移入含有 酶反应混合物和恰当的第二轮引物的第二轮反应管中，然后循环如 上述进行。
HGS“复杂性降低”的引物和探针
任何合适的PCR引物或探针均可用于本发明。引物或探针通 常具有与待扩增序列互补的序列。，引物或探针典型地是寡核苷酸， 但可以是核苷酸类似物例如INA。针对“上”和“下”链的引物序 列不同。
引物和探针
引物或探针可以是任何合适的核酸分子或核酸类似物。实例包 括但不限于DNA、RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿 卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、嵌入性核酸(INA)、肌醇核 酸(CNA)及其混合物和其杂交体，以及其磷原子修饰物，例如但不 限于磷硫酰类、磷酸甲酯类(methyl phospholate)、亚磷酰胺类、二 硫代磷酸酯类、磷硒酸酯类(phosphoroselenoates)、磷酸三酯类和 磷硼酸酯类(phosphoboranoates)。非天然存在的核苷酸包括但不限 于DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CNA、 CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-Ribo-LNA、 α-L-Xylo-LNA、β-D-Xylo-LNA、α-D-Ribo-LNA、[3.2.1]-LNA、双 环DNA、6-氨基-双环-DNA、5-epi-双环-DNA、α-双环-DNA、三环 -DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、 β-D-吡核亚硝脲-NA、α-L-Lyxopyranosyl-NA、2’-R-RNA、α-L-RNA 或α-D-RNA、β-D-RNA。另外，非含磷化合物可以用于连接到核苷 酸例如但不限于甲基亚氨基甲基、甲酰醋酸酯(formacetate)、硫 代甲酰醋酸酯(thioformacetate以及含有酰胺的连接基团。尤其， 核酸和核酸类似物可能包含一种或多种嵌入性假核苷酸。
探针或引物可以是包含一个或多个内部IPN形成INA的DNA 或DNA寡核苷酸。
检测方法
存在许多可能的检测系统确定预期样品的状态。应该理解，任 何用于检测核酸分子的已知的系统或方法均可用于本发明。检测系 统包括但不限于：
I.恰当标记的DNA杂交于微阵列型设备，其可以选择 10-＞200,000个单一组分。该阵列可以由位于任何合适的固态表面例 如玻璃、塑料、云母、尼龙、珠子、磁珠、荧光珠或薄膜上的INAs， PNAs或核苷酸或修饰的核苷酸阵列构成；
II.Southern blot类型的检测系统；
III.标准的PCR检测系统例如琼脂糖凝胶、荧光阅读例如 Genescan分析、Sandwich杂交分析、DNA染色剂例如溴化乙锭、 Syber绿、抗体检测、ELISA微板阅读仪型设备、荧光技设备；
IV.特异性或多种基因组扩增片段或其上的任何变异的实时 PCR定量。
V.WO 2004/065625中列出的任何检测系统，例如荧光珠、 酶结合物、放射性珠等。
VI.任何其它的利用扩增步骤例如连接酶链反应或等温DNA 扩增技术例如链置换扩增(SDA)的检测系统。
VII.多光子检测系统。
VIII.在凝胶中电泳和可视化。
IX.任何采用或可能被采用的用于检测核酸的检测平台
电泳
根据E-gel系统用户指南(www.invitrogen.doc)进行样品电泳。
嵌入性核酸
嵌入性核酸(INA)为非天然存在的多聚核苷酸，其以序列特异 性与核酸(DNA和RNA)杂交。在基于探针或引物的杂交分析中， INA是核酸探针和引物替换物/代替物的候选者，因为其表现出多种 合乎需要的性质。INA是聚合物，其杂交于核酸形成比相应的天然 存在的核酸/核酸复合物热力学上更加稳定的杂交体。它们不是已知 可降解肽或核酸的酶的底物。因此，相比天然存在的核酸片段，INA 在生物样品中应该更稳定，而且具有更长的贮存期限。与核酸杂交 非常依赖于离子强度不同，INA与核酸的杂交完全与离子强度无关 而且在低离子强度(对于天然存在的核酸与核酸杂交非常不利的条 件下)下更有利。INA的结合强度依赖于分子中设计的嵌入基团的 数量以及来自双链结构中以特异性方式聚集的碱基之间氢键的相 互作用。与DNA识别DNA相比，INA识别DNA序列鉴别更有效。
优选地，INA是(S)-1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-O-(1-芘甲 基)-丙三醇的亚磷酰胺。
INA以商购的方式通过对标准寡核苷酸合成步骤的改造而合 成。INA的完整定义及其合成可以在WO 03/051901，WO 03/052132， WO 03/052133and WO 03/052134(Unest A/S)中找到，均结合于此供 参考。
INA探针和引物与标准核酸探针和引物之间的确存在许多差 异。这些差异可以很方便的分为生物、结构以及理化差异。如上面 以及下面论及的，当在通常采用核酸的应用中尝试利用INA探针和 引物时，这些生物、结构以及理化差异可能导致不可预测的结果。 在化学领域中，经常观察到不同组合物的这种非等效性。
关于生物差异，核酸是在活物生命中作为遗传传递和表达物质 而发挥重要作用的生物材料，它们在体内的性质已经了解的相当充 分。然而INA是最近开发的完全人造分子，由化学家思考设计、利 用有机合成化学制备。其不具备已知的生物功能。
结构上，INA也与核酸显著不同。尽管二者均可利用常规核酸 碱基(A、C、G、T、以及U)，这些分子的组合物在结构上不同。 RNA、DNA和INA的主链由重复的核糖磷酸二酯以及2-脱氧核糖 单位构成。INA与DNA或RNA的区别在于具有一个或多个大的扁 平分子，借助连接分子连接于聚合物。该扁平分子嵌入双链结构中 与INA相对的互补DNA链的碱基之间。
INA与DNA或RNA之间的物理/化学差异也很大。INA比结 合于相同靶序列的核酸探针或引物更快地结合于互补的DNA。与 DNA或RNA片段不同，INA与RNA结合很弱，除非嵌入基团位 于末端位置。由于嵌入基团与互补DNA链上的碱基之间的强烈相 互作用，INA/DNA复合体的稳定性高于类似的DNA/DNA或 RNA/DNA复合体的稳定性。
与其它核酸例如DNA或RNA片段或者PNA不同，INA不显 示自我聚集或结合的性质。
总之，由于INA以序列特异性杂交于核酸，INA是开发基于探 针或引物的化验分析有用的候选物，尤其适合于试剂盒和筛查化验 分析。然而，INA探针和引物并非核酸探针和引物的等价物。因此， 任何可增加基于探针或引物的化验分析的特异性、敏感性以及可靠 性的方法、试剂盒或组合物在含DNA样品的检测、分析和定量中 均有用。INA具有实现该目的的必要特征。
实施例
为了重申我们在硅片上进行生物信息学分析的基础，用来做参 考的标准HPV型是乳头瘤病毒属乳多空病毒科家族的HPV16，最 初是在国际病毒分科学委员会ICTV上这样命名的(1993，Van Rast， M.A.，et al.，Papillomavirus Rep，4，61-65；see also，1998 Southern，S.A. and Herrington，C.S.Sex.Transm.Inf.74，101-109)，尽管对乳多空病 毒科的分类学改进在现有技术中可替换使用。为了避免不清楚，我 们采用完全测序的7904个碱基对的HPV16基因组作为标准比较物 (国家生物技术信息中心，NCBI locus NC_001526；NC_001526.1版； GI：9627100；参考，Medline，91162763和85246220；PubMed 1848319和2990099)。
另外，我们分别使用NCBI编号为NC-001526、NC-001357、 NC-001590和NC-001594的完全测序的所谓高危HPV型16、18、 45和56基因组。
我们分别使用NCBI编号为NC-001527、NC-001528、 NC-001529、NC-001535、NC-001533、NC-001592、NC-001443和 NC-001695的完全测序的所谓中危HPV型31、33、35、39、51、 52、58和66。
我们分别使用NCBI编号为NC-000904、NC-001525、 NC-001585、NC-001534、NC-005349、NC-001689、NC-001593、 NC-001676和NC-001692的完全测序的所谓低危HPV型6、11、 30、42、43、44、53、54和55。
如我们已经证实的，通过常规DNA检查在不同临床样品中检 测人类乳头瘤病毒DNA受到大量技术、方法学以及临床问题的阻 碍。本发明提供了一种现有技术中遇到的多种困难的解决方法，因 为亚硫酸氢盐转化HPV DNA降低了HPV衍生序列集合的复杂性。 这种复杂性降低允许在一个样品内更加有效地初筛不同HPV型， 因此更加恰当和准确地与临床数据结合。
图1至4描述了硅片上的研究的基本原理，其允许用于检测最 初是HPV基因组的部分但现在是其转化的衍射物的引物和探针的 优化设计。图5至10示出了利用“通用”引物或引物组合(多重PCR 反应中)，利用来自16个不同患者的临床样品，从不同致癌风险型 的不同HPV型的不同区域产生的PCR扩增的核酸产物。图11将这 些结果列表。图12图解了引物简并性对PCR反应的影响以及本发 明的优势。图13和14图解了HPV 16上链和下链正常的、衍生的 和基因组简化的序列。图15和16图解了HPV序列上链和下链上 存在优选引物部位的直视观(helicopter view)。图17示出了一个临 床样品的切片，显示有宫颈癌细胞，周围是正常间质细胞。图18 和19图解了临床样品分型的两个阶段，前一个图显示在液基细胞 学样品中存在高-中危HPV，后图则显示在同一样品中的精确病毒 型。图20示出了鉴定来自存档石蜡切片而非液基样品的高-中危 HPV型(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和68)的结果。图21证实HPV分型不仅可以利用针对基因组简化 的上链还可以利用针对基因组简化的下链的引物而完成。而且，在 表1至4中还提供了与现在FDA批准的Hybrid Capture2的方法比 较，本发明的引物序列、一些预期扩增子大小的实例以及在数以百 计的临床样品中HPV分型的结果。
图23至46示出了高危HPV18、45或56以及中危HPV 31、 33、35、39、51、52、58、59和68上链和下链的天然(A)、衍生(B) 以及简化的(C)HPV核酸序列。本发明涉及B和C序列。
图1示出了用亚硫酸氢盐处理的复杂性降低前后各个病毒型 HPV 33、35、39、52、58、16、18、45和56的相同的8个碱基对 基因组区域的多个DNA对准比较。考虑的区域是位于L1基因内的 6600-6607位置(利用HPV16的标准坐标定位)。不同HPV型的核苷 酸序列在位置6590、6593和6956上有变化，这些位置为C或T(粗 体)。然而，HPV DNA化学转化后，现在所有这些HPV型在“上” 链位置6590至6597之间具有相同的DNA序列(即TTATAATA)SEQ ID NO：518)，因此可以合成一个引物或探针(以及一个附近的恰当 引物一起)将从一对引物扩增该区域。利用单一引物而非简并引物 的能力是增加准确性并产生特异性扩增产物的关键，当病毒型用于 临床诊断目的以及随后的治疗方案时这是一个重要的问题。使用第 二个附近序列允许利用一批非简并引物扩增本图解中列出的所有 病毒型(即HPV型33、35、39、52、58、16、18、45和56)。
应该强调，现有技术在HPV PCR领域的主要不足是无法避免 使用简并引物，在不同病毒型之间碱基是不同的位置其必然含有碱 基的混合物。因此，为了扩增未经亚硫酸氢盐处理样品的序列，图 1中的PCR引物必须为序列YCAYAAYA(SEQ ID NO：701)(其中， 该位置Y＝C或T)。相反，对于亚硫酸氢盐处理的HPV衍生物，引 物TTATAATA(SEQ ID NO：518)对所有病毒型都一样匹配。简并引 物法的主要问题是在常规4碱基基因组中，引物非常迅速变得如此 简并，以致于其或者不能产生扩增产物，或者由于对非靶DNA序 列的非特异杂交而产生多种产物或弥散条带(smears)。
图2示出了各个HPV型6、11、43、44、53、55、30、31、 39、51、52、16、18和45与DNA样品用亚硫酸氢盐处理后“复杂 性降低”之间的17个碱基对基因组区域的DNA对准比较。该区域 也存在于L1基因中但在6581-6597的位置。不同HPV型的核苷酸 序列在位置6581、6584、6590、6593和6596有变化(如通过HPV16 位置编码所确定的)。亚硫酸氢盐处理前的通用引物是 NGCNCAGGGHCAHAAYA(SEQ ID NO：702)(标准的符号表示；N ＝G、A、T或C；H＝A、T或C；D＝G、A或T；Y＝A或C)。亚硫 酸氢盐处理后的通用引物是DGTDTAGGGYTATAATA(SEQ ID NO： 703)。可以看出，来自亚硫酸氢盐处理的衍生物的引物简并比基于 未转化的基因组序列的引物低的多。在未转化的通用引物中，共存 在288个引物组合，而在转化的衍生物中仅需要18个引物组合。 另外，来自未转化序列的引物在每个位置具有多达4个碱基的简并 性，而转化的衍生物在任何位置则仅具有最多3个碱基的简并性。
常规PCR引物通常在互补链上的长度为20至30个核苷酸并 且位于待扩增区域的两个末端中任一个。短于此长度的引物通常具 有较低的解链温度，尤其是当引物为简并引物时，这使得PCR扩增 成问题。利用本文中描述的亚硫酸氢盐降低复杂性的技术，则可能 定位各个HPV型之间接近100％序列相似性的区域，保证可靠的扩 增，无需如同常规简并引物组中那样在引物组引物中包括大量的错 配碱基。
图3示出了HPV型(HPV 6、43、44、54、55、30、33、58、 18和45)的L1区域“上”链上从位置6225至6243的20碱基对区域 的DNA对准比较。该区域在亚硫酸氢盐处理前表现出75％的序列 相似性，亚硫酸氢盐处理后表现出大于90％的序列相似性。通用引 物GATGGYGAYATGGTDGAYAY(SEQ ID NO：704)具有48种可 能的引物组合，但复杂性降低后，该HGS复杂性降低的通用引物 GATGGTGATATGGTDGATAT(SEQ ID NO：705)仅需要3种引物组 合。通过利用嵌入性核酸作为杂交反应中的引物和探针可以实现更 进一步的改进。这些改进在图4中加以描述。
图4示出了如图3中各个HPV型(6、43、44、54、55、30、33、 58、18和45)从位置6225至6243的相同20个碱基对区域的DNA 对准比较和相比标准寡核苷酸可以更有效地杂交反应中的高亲和 性INA引物和探针序列。由于INA引物长度上比标准寡核苷酸短 得多，上述20个碱基序列的前14个碱基可以INA形式构建。亚硫 酸氢盐处理之前，具有适当位置的IPN的14个碱基的INA在14 个碱基上具有85％的序列相似性，该数字在亚硫酸氢盐处理后将上 升为在同样的14个碱基对上具有100％的序列相似性。该HGS复 杂性降低的引物或探针(GATGGTGATATGGT)(SEQ ID NO：706)无 论如何不具有简并性。
INA相对于标准寡核苷酸引物和探针的显著优势在于，首先由 于INA对互补DNA非常高的亲和力，INA可以制得比常规寡核苷 酸短得多。实际上，已经证实小至12-14个碱基的INA可以在PCR 扩增反应中产生可靠的信号。另外，由于引物长度缩短而在第一轮 扩增中丧失的特异性在第二轮中可以克服。第二，INA对互补DNA 具有非常高的亲和力，对于位于内部的嵌入假核苷酸(IPNs)，稳定 作用达10级，对于末端位置IPN则达11级。此外，IPN在AT富 集的环境中最大化稳定DNA，当应用于亚硫酸氢盐处理的DNA时， 这一点尤其有利。IPN通常以突出于或末端插入INA分子中，因此， 通过结合INA与亚硫酸氢盐转化法，可能减小引物的长度。这可实 现PCR扩增引物与各个HPV型的衍生物的完美匹配的产生，从而 保证图4中见到的可靠扩增。
我们在实施例中逐步地说明了通常的分子检测方法，从在不同 HPV型的L1区域中应用通用引物开始。该说明仅针对“上”链。然 而，应该理解，可以利用下链获得相似的实例。
临床样品中任何型的任何HPV DNA均可检测吗？
图5示出了凝胶电泳后PCR扩增产物的可视化，利用针对亚 硫酸氢盐处理的HPV DNA的L1区域的HGS复杂性降低引物，该 HPV DNA从16个女性患者的液基细胞学(LBC)样品中提取的。来 自全部患者的DNA扩增产物大小相同，而且已经测序确定是来自 待查区域的正确扩增的核酸产物。产生图5至12中数据所用的所 有引物长度示于表2中，用于图5的复杂性降低的“通用”引物也在 表1中给出。
表2从选自三种主要风险型的不同HPV衍生物得到的扩增的 核酸产物的预期片段的碱基对长度。
  HPV风险分类PCR产物条带大小(bp)   高   大小   中   大小   低   大小   HPV16   205   HPV31   216   HPV6   353   HIPV18   231   HPV33   234   HPV11   268   HPV45   217   HPV35   351   HPV30   302   HPV56   272   HPV39   230   HPV42   228   HPV51   251   HPV43   251   HPV52   259   HPV44   246   HPV58   182   HPV53   207   HPV54   248   HPV55   303   HPV66   255
图5的数据表明，来自16个患者中的11个的LBC样品(患者 #1、#2、#3、#4、#6、#9、#11、#13、#14、#15和#16)对于一种 HPV病毒衍生物的部分为阳性。考虑到这些患者样品为HPV阳性， 那么这些衍生物代表哪些不同型的病毒基因组？
确定高危类的HPV型的存在或缺失-阳性患者样品中是否存在 任何高危HPV型？
图6示出了利用针对E7区域的HGS复杂性降低的引物进行多 重PCR反应，其中该引物是一种从高危HPV16、HPV18、HPV45 和HPV56基因组制备的混合物。这些引物将报告是否存在来自这4 种高危型的序列，但不能报告其可能为哪种特异型。数据显示在患 者#3、#4、#6、#9、#11、#13、#14和#16的样品中存在阳性扩增。 这8个患者因此携带至少一种高危HPV型。由于该测定是多重的， 因此下一步即是利用特异于每种高危HPV型的引物作进一步的 PCR扩增。应该注意，阴性病例为PCR反应提供了良好的对照。 来自患者#5、#7、#8、#10和#12的样品应该不能产生扩增产物(因 为其在初筛中它们显示没有病毒)，而且这的确是事实。
患者携带四种高危HPV型中的哪些？
我们首先利用针对E7区域的HGS复杂性降低的PCR引物以 及凝胶电泳分析检测高危HPV16型的存在。仅来自患者#11和#16 的样品是阳性的，表明它们携带高危HPV16株基因组的至少一部 分(图7)。
以类似的方式，我们利用针对E7区域的HGS复杂性降低的 PCR引物以及凝胶电泳分析检测高危HPV18型的存在。来自患者 #3、#6、#9、#11、#13和#16的样品是阳性的，表明它们携带高危 HPV18株基因组的至少一部分(图8)。因此，来自患者#11和#16 的样品既携带HPV16又携带HPV18基因组的部分，表明其感染了 至少两种高危HPV型。
这些方法适用于确定样品中是否存在这些高危HPV型的所有 基因组区域(如果整个病毒以全长游离基因被复制或者其全部整合 入宿主基因组，则将是这种情况)，或者病毒基因组经历了缺失并 作为缺失体复制或者仅部分病毒整合入人类染色体中。
为了确定除E7以外高危HPV型的其它区域是否存在于不同的 患者样品中，利用针对HPV16的E4、E6和E7区域的HGS复杂性 降低的引物进行PCR扩增并通过凝胶电泳分析(图9，上、中和下 条带)。患者#11和#16携带所有这三种被检测的区域，即E4、E6 和E7，而患者#4仅携带E6。因为来自患者#11和#16的样品最初 为L1阳性，因此很显然这两名患者携带L1，E4，E6和E7区域，而 患者#4仅携带L1和E4区域。
类似地，我们确定在高危HPV18型中是否存在基因组区域E4、 E6和E7。图10显示患者#11和#16携带HPV18所有这三种区域， 患者#3和#9携带E6和E7，而不携带E4；患者#6和#13仅携带E7 片段。因为来自这些患者的样品最初均为L1阳性，因此可以理解 患者#11和#16携带L1、E4、E6和E7区域；患者#3、#9和#11携 带L1、E6和E7区域；而患者#6和#13仅携带L1和E7。
因此，患者#11和#16感染两种高危HPV型：HPV16和HPV18， 而且它们携带全部四种经检测的基因组区段。
利用其它患者的进一步分析显示数据产生的流动性和一致性。 20个患者(表示为#A至#T)的数据在图11中列出，其中病毒风险 类型、基因组片段类型以及检测的一致性方面的变化很明显。
首先，患者#B、#C、#D、#E、#F、#G、#H、#I、#K、#N和 #R对最初的“通用”的复杂性降低引物是阴性的，表示为[neg]，而 且如所预期的，对随后利用高-、中-和低危引物的所有进一步的28 种PCR测定均是阴性的。
患者#A为HPV阳性，在列1中表示为[pos]，但该样品不含有 被检测28种不同PCR扩增中任何一种HPV高-、中-或低危型。该 患者可能携带不包含在我们检测组中的21种不同HPV型的80种 左右的HPV风险型中的一种。
患者#J、#Q和#T对高-和中-危HPV是阳性的，随后发现仅携 带来自高-和中-危HPV型的基因组片段。因此，患者#J携带高危 HPV16的E7片段以及中危HPV31、33和35型的片段。
患者#L和#M最初仅对中危HPV是阳性，随后的化验分析显 示仅有一种中危HPV33型。
患者#O最初仅对中-和低-危HPV型是阳性，随后发现仅携带 中危HPV39和低危HPV42和53型的序列。
患者#P和#S最初对全部三种风险类型均为阳性，随后更细致 的分析显示全部三种风险类型。
应该理解上述实例仅是为了说明一些可能的检测范围。例如， 为了开始分析任何HPV型而非仅是通用L1片段，我们可能利用覆 盖整个HPV衍生物的多重复杂性降低的引物组。以这种方式，如 果最初的PCR扩增为阴性则不存在模糊性。
此外，在对引物简并性问题的分析中，揭示了困扰现有技术中 在序列扩增方面的一个主要问题(图12)。PCR α是针对高-和中- 危型的对来自患者#s 21-42样品的PCR，而PCR β则是对相同样品 针对高-、中-和低危型。图12示出了增加引物简并性对PCR扩增 效率的影响。可以看到，增加PCR反应β中的引物#1的简并性是 完全不能PCR扩增任何序列。该引物群现在如此简并以至于仅产生 了一些弥散条带。这是引物现在结合于衍生物中多种不太特异的诱 饵座位并延伸的结果。
HPV序列转化的细节以及引物的性质
图13和14图解了HPV序列逐步地转化结果以及合适的引物 的产生。每一种HPV型具有两条互补链，表示为上和下，每种将 分别图解。
图13示出了HPV16病毒核酸分子在其三种可能序列中的上链； 正常病毒序列；用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生序列以及其中尿嘧啶被 胸腺嘧啶取代的基因组简化的序列。含有全部四种常规碱基的正常 序列以5’ACTACAATAATTCATG(SEQ ID NO：706)开始。当胞嘧啶 被转化为尿嘧啶形成衍生链时，序列仍然含有四种碱基，但现在一 种是尿嘧啶，变成5’AUTAUAATAATTUATG(SEQ ID NO：707)。 当发生扩增时，尿嘧啶被胸腺嘧啶取代，序列变成5’ ATTATAATAATTTATG(SEQ ID NO：708)并命名为基因组简化的， 因为它仅含有三种碱基A、T和G。衍生分子的形成以及随后的简 化被命名为4到3。应该理解如果病毒序列任何部分的胞嘧啶甲基 化，则该位置特殊的修饰碱基将不被转化为尿嘧啶。
图14示出了HPV 16病毒核酸分子在其三种可能序列中的下链； 正常病毒序列；用尿嘧啶取代胞嘧啶的衍生序列以及其中尿嘧啶被 胸腺嘧啶取代的基因组简化的序列。下链以5’ TGATGTTATTAAGTAC(SEQ ID NO：709)开始，衍生物变为以5’ TGATGTTATTAAGTAU(SEQ ID NO：710)开始，最后是基因组简化 序列，以5’TGATGTTATTAAGTAT(SEQ ID NO：711)开始，等。
尽管最初上链和下链是互补的，现在可以理解其基因组简化形 式非常不同且不互补。因此，用于扩增这两条链区域的引物存在于 两种基因组简化概貌(landscape)的不同部分。这一点在不同上链 和下链的直视图中图解。
图15是HPV16从核苷酸位置#1至核苷酸位置#7904的上链 基因组概貌的示意图，其中方框表示用于扩增目的的不同巢式引物 组的位置。指出了对于扩增来自HPV型组合，例如高危和中危(表 示为HM)、高危、中危和低危(表示为HML)；高(表示为H)以及高 和中(表示为HM)，的DNA有用的引物的引物组位置。。例如， 对于扩增的目的，发现上链的一些区域比其它区域更加有用。应该 理解利用本发明简化HPV基因组，可以鉴定其它感兴趣的区域及 用途。
图16是HPV16从核苷酸位置#1至核苷酸位置#7904的下链 基因组概貌的示意图，其中方框表示用于扩增目的的不同巢式引物 组的位置。指出了对于扩增来自HPV型组合的DNA有用的引物的 引物组位置。对于扩增目的有用的下链区域与上链的那些区域不 同。例如，发现下链的一些区域比其它区域对于扩增更加有用。应 该理解利用本发明简化HPV基因组，可以鉴定其它感兴趣的区域 及用途。
临床样品和利用Hybrid Capture 2的FDA批准的诊断方法与 HGS“衍生的”及“基因组简化的”的扩增技术之间的比较
目前，唯一一个经FDA批准的用于不同HPV型存在的诊断性 检测利用13种HPV型，如之前所述。我们发现根据本发明的基因 组简化的方法优于商业上可获得的方法。图17至21、表1至4以 及我们对高通量高危HPV DNA检测及分型试剂盒的描述进一步表 述了本发明。
在以下部分，许多临床样品已经经过了细胞学检查，因此细胞 学资料可以与分子学资料相关联以确定该竞争技术的敏感性和特 异性。
从细胞学开始，图17示出了一个宫颈癌患者的组织切片，箭 头1指出了带大核的癌细胞的加黑区域。箭头2示出了正常结缔组 织。如果细胞学上没有可见的异常，则细胞学描述称为正常；低度 鳞状上皮内病变(LSIL；CIN1)；高度鳞状上皮内病变(HSIL)；CIN2， CIN3(宫颈上皮内瘤变)，如一些病理学家的早期经典描述，或者为 ASC-US(性质未定的不典型鳞状细胞)。
图18和19图解了如何对高水平HPV型进行分型，也就是临 床样品中是否存在13种HPV型中的任何一种，而且如果存在(如 通过凝胶上扩增子的可视化揭示任何一个样品是否为阳性)如何深 入探询哪种特异HPV型实际存在。在12个患者实施了这些步骤， 所有12个患者均进行了细胞学检查，还对某些人的医学病症进行 了手术治疗。
图18示出了利用针对亚硫酸氢盐处理的HPV DNA的E7区域 “上”链的高-中危HGS复杂性降低的引物(用于检测13种HPV型， 即HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68) 的PCR扩增结果，该HPV DNA是从12个完成了细胞学分析的患 者(表示为#s1至12)的液基细胞学(LBC)样品中提取的。在患者 #2、4、7和11观察到阳性结果，其中三个如细胞学上测定的认为 有高度病变。细胞学正常的其余个体即患者#1、3、5、8、10、12 中均未发现任何高-中危HPV，接受了HSIL治疗的两个患者#6和 9也未发现任何高-中危HPV。
为了确定高-中危HPV型检测阳性的4个患者中存在哪种HPV 型，进行了进一步的基因分型。
图19示出了利用来自图18中对高-中危HPV阳性患者的#2、 #4、#7和#11临床样品材料的PCR扩增结果，确定具体哪种HPV 型(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68) 是造成图18中每种可见的扩增子的原因。如通过图解的四块凝胶 中扩增子可视化可以发现，患者#2具有HPV31，患者#4和#7具有 HPV16，而患者#11具有HPV18和HPV35。
尽管液基细胞学取样在HPV检测中正变为常规，多种检测还 是在取自泌尿生殖区的、固定的、切片、存在于载玻片上通常已经 存档的样品上实施的。为了确定该HGS基因组简化法是如何在这 种存档材料上的实施的，对从有高度鳞状上皮内病变的患者取得的 样品进行了扩增。
图20示出了来自16个有高度鳞状上皮内病变(HSIL)的患者材 料的存档石蜡切片的PCR扩增结果，利用针对基因组简化的HPV 上链的高-中危引物组(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59和68)。利用该方法16个患者中有15个(94％)是阳 性，与文献中HSIL中HPV存在一致。
最后，因为本文中描述的大多数结果是利用HPV的上链生成 引物的，因此有必要证明下链在HPV检测系统中也同样有用。这 在图21中说明。
被设计用于检测下链HPV DNA序列的引物既可检测高-中危 型组(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和 68)又能检测低危型(HPV 6、11、42、43、44、53、54和55)，得到 的引物组以更通用的方式选出肛门生殖器HPV型。因此，这些引 物在样品A3和A4中检测到HPV存在，而上链高-中引物则未能检 测到。这表明存在一种考虑不归为高-中危分级中的HPV型。
图21A示出了利用针对亚硫酸氢盐转化的基因组简化DNA下 链制备的引物从液基细胞学样品进行PCR扩增的结果。该引物针对 13种HPV型(高-中危型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、68和低危型HPV 6、11、42、43、44、53、54 和55)。在检测的60个样品中40个发现扩增子(67％)，表明存在 肛门生殖器HPV感染。
图21B示出了利用针对亚硫酸氢盐转化的基因组简化DNA上 链制备的引物从液基细胞学样品进行PCR扩增的结果。该引物针对 13种HPV型(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 58、59和68)。在检测的60个样品中28个可见扩增子(47％)，表 明存在高-中危型HPV感染。
相同样品的Hybrid Capture 2检测HPV与HGS检测比较
利用本发明的结果更详细的示于表3和表4中，表明数百个检 测的临床样品不仅通过竞争性方法进行检测，而且还具有对用于检 测的材料的细胞学描述。
表3A、B、C.三组不同的液基细胞学临床样品最初利用Hybrid Capture 2的Digene方法检测，随后利用HGS扩增法检测不同HPV 型的存在。
表3A
 ID#   对照   HM HPV   HM-E7基因型   HC2 HR  RFU   细胞学   1   POS   NEG   NEG   阴性   2   POS   NEG   NEG   阴性   3   POS   NEG   NEG   阴性   4   POS   NEG   NEG   NEG   阴性   5   POS   NEG   NEG   NEG   阴性   6   POS   NEG   NEG   阴性   7   POS   NEG   NEG   阴性   8   POS   POS   POS   低度
  ID#   对照   HM HPV   HM-E7基因型   HC2 HR   RFU  细胞学   9   POS   POS   POS  高度   10   POS   NEG   NEG  阴性   11   POS   NEG   NEG  阴性   12   POS   NEG   NEG  阴性   13   POS   NEG   NEG  阴性   14   POS   NEG   POS   323  阴性   15   POS   POS   POS   4103  低度   16   POS   POS   POS   428708  低度   17   POS   POS   56   NEG  未做   18   POS   POS   56   POS   377  未做   19   POS   POS   POS   301  低度   20   POS   POS   POS   7562  低度   21   POS   NEG   NEG  阴性   22   POS   POS   POS   890  低度   23   POS   POS   59   NEG  阴性   24   POS   NEG   NEG  低度   25   POS   POS   POS   39404  低度   26   POS   POS   POS   67964  阴性   27   POS   NEG   NEG  阴性   28   POS   NEG   NEG  阴性   30   POS   NEG   NEG  阴性   31   POS   NEG   NEG  阴性   32   POS   POS   POS   412424  低度   33   POS   POS   16，31   NEG  阴性   34   POS   NEG   NEG  阴性   35   POS   NEG   36   POS   POS   POS  阴性   *37   POS   POS   16，33，52   NEG  阴性   38   POS   POS   16，52   NEG  阴性   39   POS   POS   POS   510642  低度   40   POS   POS   POS   580914  低度   41   POS   NEG   NEG  阴性   42   POS   NEG   NEG  阴性   43   POS   POS   NEG   POS   7939  低度   44   POS   NEG   NEG  阴性   45   POS   NEG   NEG  阴性   46   POS   POS   NEG   NEG  低度CIN  1   47   POS   NEG   NEG  阴性   48   POS   NEG   POS   341  阴性   49   POS   NEG   NEG  阴性
 ID#   对照   HM HPV   HM-E7基因型   HC2HR   RFU   细胞学  50   POS   NEG   NEG   低度  51   POS   NEG   NEG   阴性  52   POS   NEG   NEG   阴性  53   POS   NEG   NEG   阴性  54   POS   POS   16，31，51   POS   211637   低度？？  55   POS   NEG   NEG   阴性  56   POS   NEG   NEG   阴性  57   POS   NEG   POS   783   阴性Bx  58   POS   NEG   NEG   阴性  59   POS   NEG   NEG   Unsat Neg  60   POS   NEG   POS   1081   阴性  61   POS   POS   51   POS   3542   高度  62   POS   NEG   NEG   阴性  63   POS   NEG   NEG   阴性  64   POS   POS   NEG   NEG   未做  65   POS   POS   56   POS   140824   低度  66   POS   POS   16   NEG   Hx CIN 2  67   POS   NEG   NEG   阴性  68   POS   NEG   NEG   阴性  69   POS   NEG   NEG   阴性  70   POS   POS   POS   12222   CIN 1   HPV  71   POS   NEG   POS   1657   阴性  72   POS   NEG   NEG   阴性  73   POS   NEG   NEG   阴性  74   POS   NEG   NEG   阴性  75   POS   POS   POS   79295   低度  *拭样
表3B
 ID#   对照   HM-HPV  HM E7基因型   HC2 LR  HC HR   76   POS   POS   31，56   -   +   77   POS   POS   52   -   +   78   POS   NEG   -   -   79   POS   POS   31   -   -   80   POS   POS   39，59，68   +   +   81   POS   NEG   -   -   82   POS   POS   18   -   +   83   POS   POS   31   +   -   84   POS   POS   51   -   +   85   POS   NEG   -   -   86   NEG   POS   -   -
  ID#   对照   HM-HPV   HM E7基因型   HC2LR  HC HR   87   POS   NEG   -   -   88   POS   POS   31   -   -   89   POS   POS   31   -   -   90   POS   NEG   -   -   91   POS   NEG   -   -   92   POS   NEG   -   -   93   POS   POS   59   -   +   94   POS   POS   16，51   +   +   95   POS   POS   39   +   +   96   POS   NEG   -   -   97   POS   POS   -   -   98   POS   POS   -   -   99   POS   NEG   -   -   100   POS   NEG   -   -   101   POS   NEG   -   -   102   POS   POS   18   -   -   103   POS   NEG   -   -   104   POS   POS   33   -   -   105   POS   NEG   -   -   106   POS   POS   -   -   107   POS   POS   56   -   +   108   POS   NEG   -   -   109   POS   POS   31   -   -   110   POS   POS   16，31，51，52   -   +   111   POS   POS   52，59   -   +   112   POS   POS   56   -   +   113   POS   NEG   -   -   114   POS   NEG   -   -   115   POS   NEG   -   -   116   POS   NEG   -   -   117   POS   NEG   -   -   118   POS   NEG   -   -   119   POS   POS   45   -   -   120   POS   POS   16，45，68   -   +   121   POS   NEG   -   -   122   POS   POS   39，68   -   -   123   POS   POS   39，68   -   +   124   POS   NEG   +   -   125   POS   NEG   -   -   126   POS   NEG   -   -   127   POS   NEG   -   -   128   POS   POS   31   -   -   129   POS   NEG   -   -   130   POS   POS   31   +   -   131   POS   NEG   -   -   132   POS   NEG   +   -
  ID#   对照   HM-HPV  HM E7基因型  HC2 LR  HC HR   133   POS   NEG   -   -   134   POS   NEG   -   -   135   POS   POS   68   -   -   136   POS   NEG   -   -   137   POS   NEG   -   -   138   POS   POS   16   -   +   139   POS   NEG   -   -   140   POS   NEG   -   -   141   POS   NEG   -   -   142   POS   NEG   -   -   143   POS   POS   45   -   -   144   POS   POS   16，45   +   +
表3C
  ID#   对照   HM-HPV   HM-E7   基因型   LR-E7   基因型   HC2-HR   RFU   HC2-LR   RFU   细胞学   172   POS   NEG   NEG   55   NEG   65   正常   173   POS   NEG   NEG   153   NEG   101   正常   174   NEG   POS   NEG   292   NEG   105   正常   175   POS   POS   59   POS   768212   NEG   58   LSIL   176   POS   NEG   NEG   152   NEG   78   正常   177   POS   NEG   未检测   POS   734   NEG   46   正常   178   POS   NEG   NEG   64   NEG   84   LSIL   179   POS   POS   45   POS   204963   NEG   54   LSIL   180   POS   NEG   18   POS   103404   NEG   42   正常   181   POS   NEG   NEG   68   NEG   46   正常   182   POS   POS   16   POS   754   POS   29164   LSIL   183   NEG   POS   NEG   42   POS   568   POS   45548   LSIL   184   POS   NEG   NEG   168   NEG   58   正常   185   NEG   NEG   NEG   62   NEG   40   正常   186   POS   POS   18   POS   3153   NEG   55   HSIL   187   POS   NEG   NEG   71   NEG   47   正常   188   POS   NEG   NEG   66   NEG   36   正常
  ID#   对照   HM-HPV   HM-E7   基因型   LR-E7   基因型   HC2-HR   RFU   HC2-LR   RFU   细胞学   189   POS   NEG   NEG   55   NEG   55   正常   190   POS   NEG   NEG   34   NEG   34   正常   191   POS   NEG   NEG   96   NEG   82   ASCUS   192   POS   POS   33   POS   132844   POS   156190   LSIL   193   POS   NEG   NEG   115   NEG   63   正常   194   POS   POS   51，58，68   POS   153881   POS   52619   LSIL   195   POS   NEG   NEG   43   NEG   47   正常   196   POS   NEG   NEG   112   NEG   60   ASCUS   197   POS   NEG   NEG   135   NEG   143   正常   198   NEG   NEG   NEG   80   NEG   48   正常   199   POS   POS   52   POS   237578   NEG   103   LSIL   200   NEG   POS   33，58   POS   55052   NEG   80   LSIL   201   POS   NEG   NEG   57   NEG   69   正常   202   POS   POS   51   POS   105731   NEG   81   正常   203   POS   POS   51，56   POS   712162   NEG   167   LSIL   204   POS   NEG   NEG   115   NEG   185   正常   205   POS   NEG   NEG   92   NEG   36   正常   206   POS   NEG   NEG   60   NEG   82   正常   207   POS   NEG   NEG   NEG   NEG   105   NEG   55   LSIL   208   NEG   POS   51   POS   336180   NEG   154   LSIL   209   POS   POS   16，35   POS   142232   NEG   150   LSIL   210   NEG   NEG   NEG   83   NEG   37   正常   211   POS   POS   56   POS   514728   NEG   49   LSIL   212   POS   NEG   NEG   56   NEG   52   正常   213   POS   NEG   NEG   122   NEG   38   正常   214   POS   POS   68   POS   2536   NEG   48   LSIL
  ID#   对照   HM-HPV   HM-E7   基因型   LR-E7   基因型   HC2-HR   RFU   HC2-LR   RFU   细胞学   215   POS   NEG   NEG   42   NEG   60   正常   216   POS   POS   未检测   POS   2304   POS   31290   LSIL   217   POS   POS   56   POS   13416   NEG   28   LSIL   218   POS   POS   16，31   POS   197601   NEG   99   LSIL   219   NEG   NEG   NEG   51   NEG   53   正常   220   POS   NEG   未检测   POS   1128   NEG   126   正常   221   POS   NEG   NEG   116   NEG   100   正常   222   POS   POS   56   POS   456079   NEG   60   LSIL   223   POS   NEG   NEG   125   POS   114103   ASCUS   224   NEG   NEG   NEG   105   NEG   65   ASCUS   225   POS   NEG   NEG   65   NEG   73   正常   226   POS   NEG   NEG   64   NEG   60   正常   227   POS   POS   56   POS   85613   POS   217685   LSIL   228   POS   POS   52   POS   97012   POS   846   正常   229   POS   POS   52   POS   72556   POS   3114   ASCUS   230   POS   NEG   NEG   160   NEG   112   正常   231   POS   NEG   NEG   154   NEG   52   正常   232   POS   POS   NEG   53   POS   2628   NEG   86   LSIL   233   POS   NEG   NEG   86   NEG   58   正常   234   POS   POS   16   POS   96880   NEG   66   ASCUS   235   POS   POS   16，51   POS   568895   NEG   69   LSIL   236   POS   POS   56   POS   95587   NEG   47   正常   237   POS   NEG   NEG   117   NEG   113   正常   238   POS   POS   16   POS   27156   NEG   82   LSIL   239   POS   NEG   未检测   POS   678   NEG   30   正常   240   POS   NEG   NEG   90   NEG   82   正常
  ID#   对照   HM-HPV   HM-E7   基因型   LR-E7   基因型   HC2-HR   RFU   HC2-LR   RFU   细胞学   241   POS   NEG   未检测   POS   3130   NEG   88   ASCUS   242   POS   POS   59   POS   95149   NEG   65   LSIL   243   ND   ND   NEG   56   NEG   184   正常   244   POS   POS   56   POS   22698   POS   81756   LSIL   245   POS   POS   18，39   POS   519145   POS   53404   LSIL   246   POS   POS   52，68   POS   454883   POS   4884   LSIL   247   POS   NEG   NEG   74   NEG   74   ASCUS   248   POS   NEG   NEG   98   NEG   36   正常   249   POS   POS   NEG   30，66   POS   6376   NEG   44   LSIL   250   POS   NEG   NEG   82   NEG   44   正常   251   POS   NEG   NEG   43   POS   693   正常   252   POS   NEG   NEG   150   NEG   60   正常   253   POS   NEG   NEG   75   NEG   71   正常   254   POS   NEG   NEG   127   NEG   51   正常   255   NEG   NEG   NEG   64   NEG   68   正常   256   POS   POS   33，52，58   POS   356051   NEG   61   LSIL   257   POS   NEG   NEG   53   NEG   57   正常   258   POS   NEG   NEG   267   NEG   111   正常   259   POS   NEG   NEG   47   POS   1223   正常   260   POS   NEG   NEG   110   NEG   32   ASCUS   261   POS   NEG   NEG   144   NEG   40   正常   262   POS   NEG   NEG   55   NEG   67   ASCUS   263   POS   NEG   NEG   133   NEG   59   正常   264   POS   NEG   NEG   NEG   NEG   94   NEG   52   LSIL   265   POS   NEG   NEG   93   NEG   63   正常   266   NEG   POS   16.31   POS   1800   NEG   52   HSIL
  ID#   对照   HM-HPV   HM-E7   基因型   LR-E7   基因型   HC2-HR   RFU   HC2-LR   RFU   细胞学   267   POS   NEG   NEG   48   NEG   66   正常   268   ND   NEG   113   NEG   177   正常   269   ND   POS   1166   NEG   46   正常   270   ND   NEG   79   NEG   49   正常   271   POS   NEG   未检测   POS   1052   NEG   36   正常
表3具有3个部分A、B和C，反映该分析中使用的不同来源 的可弃性材料。三组不同的液基细胞学临床样品最初利用Hybrid Capture2的Digene方法进行检测，随后利用HGS扩增法检测不同 HPV型的存在。
表3A采用在澳大利亚检查的患者的可弃性样品。列1给出了 HGS的标识号；列2是一个对照，其确定样品中是否存在任何基因 组DNA；列3描述了样品是否对任何高-中危HPV型(HPV 16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)为阳性；列4提 供了发现的高-中危HPV型的状态；列5示出了利用Hybrid Capture2 检测获得的结果；列6提供了Hybrid Capture2检测特征性的相对荧 光单位，其中相对荧光单位与内部标准比较，确定阳性或阴性信号 的判定值，列7列出了样品的细胞学特征(如果可得到)。最后*37 示出了拭样样品而非LBC。
两种方法之间的比较是惊人的。许多被认为阴性的Hybrid Capture2检测，通过HGS基因组简化的HGS检测发现实际上为阳 性，而且HGS检测鉴定了存在的HPV型。因此，Hybrid Capture2 检测产生的高比例的“假阴性”。这些个体患者检测之后带着错误的 安全感离开门诊，相信他们未感染病毒，而实际上他们是携带者。 另外，尽管某些个体的细胞学也可能为阴性，然而HGS检测明确 地将存在的HPV分型。
另外，许多Hybrid Capture2检测在荧光的基础上被认为是阳性 的经过HGS检测发现实际上是阴性。因为HGS检测如此敏感，许 多通过Hybrid Capture2检测发现是阳性的经过HGS检测确定实际 上是“假阳性”。通过Hybrid Capture2检测的这类患者会因为是潜 在的宫颈癌受害者而带着焦虑离开门诊，而事实上没有病毒存在。
表3B采用来自香港患者的可弃性液基细胞学样品。除了 Hybrid Capture2检测既在低危也在高危型实施，各列均类似。而且， HGS基因组简化检测揭示两种类型的检测之间的许多不一致，即使 这些样品来自于两个完全不同的地理位置且主要为不同的人种群 体。
表3C也是来自香港的基础样品材料，同样的，在高比例病例 中，HGS检测与Hybrid Capture2检测有高比例的情况不一致。列1 和2代表ID#和人类基因组DNA存在的阳性对照；列3显示了高- 中危HPV型的存在或缺失；列4代表高-中危E7基因型；列5示 出了低危E7基因型；列6代表HC2高危型call，列7为该样品相 应的相对荧光单位；列8和9示出了HC2低危型call和该样品相应 的相对荧光单位；列10利用标准描述符说明了该特定样品的细胞 学。
表4.利用针对HPV病毒E7、E5和E4区域的引物对各种HPV 型的液基细胞学临床样品进行基因分型
  HR-HPV   E7基因型   E6基因型   E5基因型   E4基因型   POS   31，56   31   POS   52   52   POS   (31)   POS   39，59，68   59   59   POS   18
  HR-HPV   E7基因型   E6基因型   E5基因型   E4基因型   POS   (31)   POS   51   51   51？   POS   (31)   POS   (31)   POS   59   POS   16，51   POS   39   39   39   39   POS   18   POS   33   POS   56   56   56   POS   31   POS   16，31，51，52   31.52   31，52   POS   52，59   59   POS   56   56   56   POS   45   POS   16，45，68   16，45   16   45？   POS   39，68   39   POS   39，68   POS   (31)   POS   (31)   POS   68   POS   16   16   16   POS   45   POS   16，45   45   45？   POS   33，52，58   33，58   33，58   POS   52，58   52   52   POS   18，33，52，56，   58   52，56，58   52，56   POS   18，56，58，68   58   POS   56，59，68   56，59   56   POS   33，51，52，58   POS   33，51，5258   51，58   51？   POS   33，52，58   33   33
表4表明针对HPV E7区域的引物是非常有用的引物组(相对 于针对该病毒的E5，E6和E4区域的引物而言)。
表4示出了利用针对HPV病毒E7，E6，E5和E4区域的引物 对不同HPV型的液基细胞学临床样品的基因分型的结果。列1中 列出了HPV型的存在，列2-5中示出了利用针对病毒E7、E6、E5 和E4区域的不同引物组的扩增子存在或缺失。很显然，E7引物检 测到存在的特定HPV型，但许多情况下，E6、E5和E4不能能检 测到。因此，E7是可使用的极好区域。原因在于HPV感染细胞后 经常缺失其部分基因组，而E7是相比其它，具有更高概率保留的 区域。
来自HPV的扩增DNA
来自人宫颈区的临床样品或液基细胞学样品，通常含有异源人 类细胞种群以及广泛的微生物菌群。扩增来自这种异源起源的HPV 序列(在我们检测的所有病例中)，可产生大小正确的扩增子，如 在凝胶上从其迁移而估计的。然而，指示扩增子的确来自HPV而 非来自于偶然地具有与凝胶上的可见条带相同分子量的来源，最好 的指标就是从凝胶上切下特定条带，对其内的DNA进行直接测序 分析。我们已经开展这种分析而且确定DNA序列的确对应于 HPV16的序列。图22中示出了这样的分析的结果。
高通量HPV分析
本发明可以利用96孔板以高通量方式逐步进行，在96孔板中 许多样品可同时被检测HPV。这可以通过潜在的商品化试剂盒的说 明加以阐释如下。
表5.HPV高通量DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒的内容物
  组分名称   含量   部分编号   裂解缓冲液   1×23ml   蛋白酶K   2×1ml   试剂1   1×20.8ml   试剂2   1×8g   试剂3   1×25ml   试剂4   1×7ml   对照样品1   1×40μl   对照样品2   1×20μl   对照引物3A&3B   2×40μl
  组分名称   含量   部分编号   板1：孵育板   1×96孔   板2：转化板   1×96孔   板3：纯化板   1×96孔   板4：洗涤板   1×96孔   板5：洗脱板   1×96孔   密封遮盖   36×8遮盖条带   板6：高危HPV板   2×96孔   板7：HPV分型板   8×96孔   板8：对照板   2×96孔
NB.单个高危分型引物组可从人类遗传印记(可在 查询)获得。
注意：对照样品/引物1、2、3A和3B一旦接收应该储存于-20℃。
需要的材料和仪器(不提供)
需要真空岐管或离心机，如下：
用于96孔板的真空岐管带有提供至少
-10inHg(4.9psi)压力的泵。(室内测定利用Biorad Aurum Manifold进行，但其它的岐管也适用)。
或者
带有适合高清除率96孔模式板转头的离心机(室内检测采用 Eppendorf 5810进行)。
■适合96孔模式0.2ml低孔板的热盖PCR热循环仪
■适合384孔模式(用于HPV分型)的热盖PCR热循环仪
■80％异丙醇(分子生物学级)
■水(分子生物学级)
■NaOH片(分析级)
■2x PCR master-mix(Promega Cat#M7505 1000rxn)
■E-Gel系统Mother E-BaseTM设备(Invitrogen EB-M03)
■E-gels 96高通量2％琼脂糖(Invitrogen Cat#G7008-02)
■E-gel低范围标记物(Invitrogen Cat#12373031)
■试剂容器x5
标准实验室仪器(不提供)
■多道移液器，最大体积1ml(200μl-1000μl)
■多道移液器，最大体积200μL(20μl-200μl)
■多道移液器，最大体积10μL(1μl-10μl)
■不含棉绒纸的组织
■计时器
■气溶胶屏障枪头(10μl-1000μl)
■透照器
■凝胶成像系统
■Glison P1000
■Gilson P200
■Gilson P20
方法
如果首次使用HPV高通量DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒，我们 强烈建议在实施亚硫酸氢盐转化法之前阅读用户指南上的详细方 法。
使用HPV高通量DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒去除了在转化前 对基因组DNA进行预先消化的需要。
不要减少加入DNA样品中的亚硫酸氢盐试剂的量。室内检测 表明减少亚硫酸氢盐试剂对反应有害。
该试剂盒最优的起始DNA浓度是从1ng至4μg的基因组 DNA。
样品制备
■用手剧烈振荡液基样品(PreservCyt(R))小瓶，以重悬任何沉 积的细胞并保证溶液是均质的。
■将4ml重悬的细胞转移入15ml Costar离心管中。如果培养 基少于4ml，将全部材料转移入15ml Costar离心管中，并用无菌 蒸馏水将体积补充至4ml。为了准确测定最少需要体积为1ml的样 品。
■将该管在甩平式吊桶转头中以3000xg离心15分钟。
■小心倾倒并丢弃上清液，而不打散成团的细胞物质。
■在200μl裂解缓冲液中重悬该成团细胞，并彻底混合直至溶 液均质的。
■加入20μl蛋白酶K，并在孵育板的每个孔中进行孵育。
■将80μl样品转移入孵育板中(板1)，用密封盖盖上，于55℃ 孵育1小时。
制备方法
■将全部体积的试剂1加入试剂2的瓶中，轻轻颠倒混匀。注 意：一旦混合，试剂1和2可以在4℃于暗处稳定达1个月，而试 剂1、2、3和4从生产日开始可以在室温稳定1年。
■每次制备新鲜NaOH溶液(例如，将1g NaOH加入到8.3ml 水中)并向转化板(板2)的每个孔中加5μl。
■将5μl对照样品1加入15μl水(分子生物学级)中并与检测 样品一起平行处理。
■将20μl细胞裂解液转移入转化板(板2)中并轻轻混匀。
■用提供的封口膜密封该转化板(板2)并在37℃烤箱中孵育15 分钟。孵育后，除去膜之前将板短暂离心以沉淀膜上的任何凝结物。
■用提供的密封盖密封该孵育板(板1)并储存于-20℃。
■确保试剂3尚未形成固体沉淀物。如果已经形成，加热该溶 液(不能高于80℃)并混匀。
离心方法
■利用多道移液器向转化板(板2)的每个孔中加入220μl混合 的试剂1和试剂2，然后通过轻轻吹打混匀，并用提供的8条密封 盖密封该板。
■在55℃烤箱中孵育该转化板(板2)3小时。
亚硫酸氢盐处理可以在短至1小时内完成，然而，减少孵育时 间可以造成扩增子内局部未转化。因此推荐孵育时间应不短于3小 时。
■孵育后，向转化板(板2)的每个孔中加入240μl试剂3(参考 Important Protocol Preparation)。
■将纯化板(板3)置于洗涤板(板4)的上面。
■将样品从转化板(板2)转移入纯化板(板3)的相应孔中，并 用提供的封口膜覆盖。
■将纯化板(板3)/洗涤板(板4)组合放入离心机中，室温下 1000rcf离心4-5分钟。
■弃去洗涤板(板4)中的流出物然后重新置于纯化板(板3) 下方。向纯化板(板3)的每个孔中加入0.8ml 80％的异丙醇(分子生 物学级)。
■室温下1,000rcf离心1分钟。
■取出洗涤板(板4)，弃去流出物然后置回原处并在室温下 1,000rcf离心2分钟。
■将纯化板(板3)置于洗脱板(板5)的上方，确保纯化板(板 3)的尖端位于洗脱板(板5)的恰当孔内。
■利用多道移液器向纯化板(板3)的每个样品孔中加入50μl试 剂4，加样器尖端位置接近膜表面而不接触膜。
■室温下孵育1-2分钟。
■将纯化板(板3)/洗脱板(板5)组合在室温下1,000rcf离心1 分钟。
■取下洗脱板(板5)并用提供的密封盖密封。
■在热盖PCR仪中于95℃孵育该板30分钟。
DNA样品现在已经被转化，并准备好PCR扩增。孵育后，将 该板短暂离心以除去密封盖上的凝结物。
内对照的PCR反应
提供了基因组DNA和对照PCR引物以实现简单的故障排除。 提供对照样品1(紫色)和2(绿色)作为操作过程对照。对照样 品1是未处理的DNA，提供的材料足够8次转化反应。对照样品2 是亚硫酸氢盐处理的DNA，提供的材料足够20次PCR扩增。对照 引物3A(黄色)和3B(红)是PCR引物，可以用来检查回收DNA 的完整性(提供足够20次PCR扩增的量)。
“巢式”PCR引物用来进一步提高检测敏感性，其通过高通量 DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒来实现。对照引物是常规亚硫酸氢盐 PCR引物，已被优化用于两轮PCR扩增。不建议将这些引物用于 单轮PCR，因为在多数情况下琼脂糖凝胶电泳后观察不到可见的扩 增条带。
注意：该方法是基于使用热盖热循环仪。如果没有热盖热循环 仪，则用矿物油覆盖反应。
对照反应：
■对照样品1(紫色)包含未处理的基因组DNA(50ng/μl)
■对照样品2(绿色)包含亚硫酸氢盐处理的人类DNA(20 ng/μl)
■对照引物3A(黄色)包含第一轮PCR的引物
■对照引物3B(红色)包含第二轮PCR的引物
对照PCR
对照引物3A(第一轮PCR的引物)和对照引物3B(第二轮PCR 的引物)是确证的“巢式”引物，提供的量足够达到20个对照PCR反 应。提供的这些引物样品有利于故障排除过程(如有需要)，而且 可能用来评估修饰的DNA的质量。
注意：第二轮PCR反应可以与第一轮PCR反应平行制备，冷 冻至需要时为止。
高危PCR扩增
第一轮扩增
■对于每个反应，在提供的高危PCR板中加入12.5μl PCR Master Mix(例如Promega Master Mix)和9.5μl水(分子生物学级)。 如果设置96个样品，则在一个合适的管中混合1.25ml Master mix， 850μl水以及200μl的引物混合物，并充分混匀。然后利用多道移 液器将23μl反应混合物加入提供的高危HPV板(板6)的每个孔 中。
■将2μl对照引物3A加入恰当孔到对照孔H10和H11中。
■将所需的来自洗脱板(板5)的2μl修饰DNA加入提供的 高危HPV板(板6)并将2μl的对照样品2加入孔H11中，然后将 剩余部分储存于-20℃用于随后的HPV分型(高危板的设计见下 文)。
■运行下列PCR程序。
  95℃/3min   1个循环   95℃/1min   42℃/2min   60℃/2min   30个循环   60℃/10min   1个循环
第二轮扩增
■将第一轮扩增的DNA 2μl加入第二轮混合物中，其制备与 第一轮扩增完全相同。
■运行下列PCR程序
  95℃/3min   1个循环   95℃/1min   42℃/2min   60℃/2min   30个循环   60℃/10min   1个循环
电泳
■从铝箔包装中取出96孔2％E-gel，并拔出红色的96孔梳。
■用多道移液器向凝胶的每个孔中加入10μl无菌水。
■向标记孔中加入10μl DNA标记物。
■用多道移液器将10μl扩增产物转移入E-gel的每个孔中。
■将E-base设置为5-7分钟并按pwr/prg。
■用UV透照器和凝胶成像软件记录结果。
HPV分型
第一轮扩增
高危分型板(板8)含有针对下列高危HPV型：16、18、31、33、 35、39、45、51、52、56、58、59和68的株特异性引物。洗脱板 (板5)中剩余的足量DNA用于对每个样品进行全部高危株的分 型。
■从-20℃冰箱中去除洗脱板(板5)。
■任何通过高危通用扩增为阳性的样品现在可以利用株特异 性引物分型(分型板设置见下文)。
■对于每个反应，将12.5μl的PCR Master Mix(例如Promega Master Mix)和8.5μl水加入到提供的PCR板的每个孔中。如果有6 个样品待分型，将1187.5μl的Master Mix和807.5μl的水加入合适 的管中，充分混匀，然后向HPV分型板(板7)的每个孔中加入21μl， 如下文所指出的。
■将2μl合适的引物组加入每个孔中，如下文所指出的。
■如果以384孔的形式进行分型，而且有24个样品待分型， 则将4.5ml Master Mix和3.42ml水加入合适的管中，充分混匀， 然后向384孔板的每个孔中加入21μl，如下文所指出的。将2μl 恰当的引物组加入每个孔中，如下文所指出的。
■将2μl高危阳性样品(来自洗脱板，板5)加入到分型板的合 适的孔中。
■对每个样品设置足够多的管以及一个“无模板”(阴性)对照。
■运行下列PCR程序。
  95℃/3min   1个循环   95℃/1min   45℃/2min   65℃/2min   30个循环   65℃/10min   1个循环
第二轮扩增
■将2μl第一轮扩增的DNA加入第二轮反应混合物中，其制 备与第一轮扩增完全相同。
■运行下列PCR程序
  95℃/3min   1个循环   95℃/1min   45℃/2min   65℃/2min   30个循环   65℃/10min   1个循环
电泳
■从铝箔包装中取出96孔2％E-gel，并拔出红色的96孔梳。
■用多道移液器向凝胶的每个孔中加入10μl无菌水。
■向标记孔中加入10μl DNA标记物。
■用多道移液器将10μl扩增产物转移入E-gel的每个孔中。
■将E-base设置为5-7分钟并按键运行。
■用UV透照器和凝胶成像软件记录结果。
■样品现在已经被分型。
故障排除
 问题   可能的解决方法  任何样品均未得到PCR产物   PCR失败-确认所有组分均加入管中且   PCR循环正确。   确证聚合酶在其保存有效期内且其仍   保留活性。  除对照样品2外，任何样品均未得到  PCR产物   修饰失败-检查NaOH溶液是新鲜的且   混合的试剂#1和试剂2不长于4周。   确保遵循修饰和清洗方法中的所有步   骤。   DNA在修饰过程中被降解-检查在该   步骤中使用的全部试剂和管为分子生   物学级质量(即无DNase)。   修饰不完全。将样品再放入95℃15分   钟。   样品DNA在修饰前被降解-检查DNA   被正确地储存和处理。  仅在对照反应中存在PCR产物   检查DNA浓度不是过稀。   检查是将PCR级水而非模板加入阴性   对照中。  PCR产物存在于所有泳道中包括‘无  模板’(阴性)对照中   确保PCR在隔开的区域进行，并采用   专用试剂和仪器以防止交叉污染。
亚硫酸氢盐处理的不同来源的HPV DNA，当利用基因组简化 的引物扩增时，如果引物为寡核苷酸或修饰的核酸例如INA，而且 如果该样品来自人类临床材料或另一个极端即来自环境来源，则提 供了一个非常卓越的在样品内寻找任何型HPV的检测系统。本发 明的开发是用于被任为是人类癌症病因的临床相关病毒(HPV)。
根据本发明的检测分析的实际意义可以有所变化。尽管上面详 细描述的原则已经利用PCR扩增证实，仍然可以借助于本领域中已 知的任何方法进行读数。随着目前对微阵列检测系统的重视，人们 能够利用基因组简化的DNA检测多种不同HPV，因为亚硫酸氢盐 处理降低了基因组复杂性，因此允许用更少量检测子(特征)在微 阵列上检测更多的HPV型。
概括而言，HGS基因组简化的引物方法产生一致的数据集，其 已经与大量患者的临床表型相关。
本领域的技术人员应该理解，如在特定的具体实施方式中示出 的，在不背离广泛描述的本发明的精神或范围的前提下，可以对本 发明作多种变更和/或修改。因此认为本发明的具体实施方式在所有 方面均为说明性的而非限制性的。