发明领域

本申请涉及提高放射性治疗和放射性诊断化合物的放射稳定性的 稳定剂，及含有它们的制剂。具体而言，它涉及用于靶向的放射性诊 断及放射性治疗化合物的制备和稳定化的稳定剂，和在优选实施方案 中，涉及靶向胃泌素释放肽受体(GRP-受体)的放射性诊断和放射性治 疗化合物的制备及稳定化。

                    发明背景

被设计用作放射性诊断剂的放射性标记的化合物通常是用γ-发 射同位素作为放射性标记制备的。这些γ光子迅速穿透水和肌体组织 且可延伸若干厘米的组织或空气。通常，这种放射性诊断化合物不对 使用这些药剂成像的器官系统引起严重损害。这是因为发出的γ光子 没有质量或电荷且注入的放射性物质的量被限制到获得诊断显像所需 的量，通常约3-50mCi，这取决于所用的同位素和成像剂。该量小到 足以获得有效成像而对患者没有显著的辐射剂量。放射性核素如99mTc、 111In、123I、67Ga和64Cu已经用于该目的。

相比之下，被设计用作放射治疗剂的放射性标记化合物通常是用 Auger-、β-或α-发射同位素标记的，其任选也发出γ光子。放射 性核素如90Y、177Lu、149Pm、153Sm、109Pd、67Cu、166Ho、131I、32P、186/188Re、 105Rh、211At、225Ac、47Sc、213Bi及其它可有效用于放疗。镧系同位素的 +3金属离子特别令人感兴趣，且包括177Lu(相对较低能量的β-发射 体)、149Pm、153Sm(中等能量)和166Ho(高能量)。90Y也可形成+3金属离 子，且具有与镧系相似的配位化学。镧系配位化学已经得到很好的发 展且对于本领域技术人员而言是熟知的。

自用这些放射性同位素标记的化合物发出的电离辐射具有适量的 能量以破坏放射性标记化合物定位处部位的细胞和组织。所发出的辐 射可直接损害靶组织中的细胞成分，或可引起组织中的水形成自由基。 这些自由基反应性非常高，且可损害蛋白和DNA。

下面描述从水的放射分解形成的某些直接产物。

H2O→H2O++e-

H2O+→H++OH*

H2O+e-→H2O-→H*+OH-

在形成的产物(例如，H+、OH-、H*和OH*)中，羟基自由基[OH*]特 别具有破坏性。该自由基还可自身结合形成过氧化氢，其是一种强氧 化剂。

OH*+OH*→H2O2(强氧化剂)

此外，电离辐射与溶解氧的相互作用可产生反应性十分高的种类， 如超氧化物自由基。这些自由基对有机分子的反应性是十分高的(见， 例如，Garrison，W.M.，Chem.Rev.1987，87，381-398)。

这种反应性种类在放射性治疗或放射性诊断化合物所针对部位(例 如，肿瘤、骨转移、血细胞或其它靶器官或器官系统)的产生将(如果 以足量产生)具有细胞抑制或细胞毒性作用。成功放疗的重要因素是 对靶组织(例如，肿瘤细胞等)释放足够的放射剂量，从而引起细胞 毒性或杀肿瘤作用，而不引起显著或不可耐受的副作用。同样，就放 射性诊断而言，重要因素是对靶组织释放足量辐射，从而使它成像， 而不引起显著或不可耐受的副作用。

α粒子在一个或两个细胞直径内散逸大量能量，它们在组织中的 穿透范围仅为～50μm。这可引起强烈的局部损害，特别是如果放射 性标记的化合物已经被内化到细胞核中。同样，用Auger-电子发射体 如111In标记的放射性治疗化合物所具有的范围非常短，且可在所需作 用部位具有有力的生物学作用。自治疗性β-发射同位素如177Lu或90Y发射在组织中具有稍长的范围，但所产生的绝大多数损害同样在距定 位部位几毫米或厘米内发生。

然而，放射性治疗同位素发射的潜在破坏性不限于它们的细胞靶。 就放射性治疗和放射性诊断化合物而言，使用前，对放射性标记化合 物自身的放射分解损害可能成为放射性标记的放射性治疗或放射性诊 断化合物的制备、纯化、保存和/或运输过程中的重要问题。

这种放射分解损害可引起，例如，放射性同位素的释放[例如，放 射性碘标记抗体的脱卤或被设计用于抓住放射性金属的螯合部分的分 解]，或它可损害将靶向药剂释放给其预定靶所需的靶向分子。两种损 害类型都是我们十分不希望的，因为它们可潜在引起未结合同位素， 例如游离放射性碘或未螯合的放射性金属向甲状腺、骨和其它器官的 释放，或由于对靶向分子，如靶向肽的受体-结合区或放射性标记抗体 的放射分解损害而引起靶向能力的降低或消失。不与其靶组织结合的 放射性可导致不良的副作用。

例如，DOTA-Gly-ACA-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (ACA＝3-氨基-3-脱氧胆酸)和DOTA-Gly-Abz4-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-Met-NH2(Abz4＝4-氨基苯甲酸)，分别在图1和2中所示的两 个螯合配体，已经显示出可特异性靶向胃泌素释放肽(GRP)受体。在下 列实施例中，分别将这些描述为化合物A和化合物B。其它GRP受体- 结合配体在Hoffman等人的美国专利US 6,200,546，公开的美国申请 U.S.2002/0054855，和2003年1月13日提交的同时待审申请系列 号No.10/341,577中描述，其全部内容引入此处作为参考。

当用诊断和放射性治疗的放射性核素如111In和177Lu放射性标记 时，化合物A和B已经显示出对GRP受体具有高度亲和性，无论在体 外还是体内。然而，如果在没有相伴或随后加入一种或多种放射稳定 剂(保护免受放射分解损害的化合物)的情况下制备这些放射性标记 的络合物，这些化合物可经历放射性标记诱导的显著放射分解损害。 这个结果并不令人惊讶，因为β-粒子与水相互作用产生的羟基和超氧 化物自由基是高度氧化性的。对这些肽中蛋氨酸(Met)残基的放射分解 损害是最容易的分解方式，可能产生蛋氨酸亚砜衍生物。

细胞结合结果显示所得被放射分解损害的衍生物缺乏GRP-受体 结合活性(IC50值大于微摩尔)。因此，发现可用于防止放射性诊断和 放射性治疗化合物中蛋氨酸氧化及其它放射分解途径的放射分解抑制 剂是很重要的。

防止这种放射分解损害是放射性诊断和放射性治疗化合物配制中 的主要挑战。就该目的而言，通常使用被称作自由基清除剂或抗氧剂 的化合物。这些是与例如羟基自由基和超氧化物快速反应的化合物， 由此防止它们与目标放射性药物或用于其制备的试剂反应。

在该领域进行了广泛研究。绝大多数集中于防止放射性诊断制剂中 的放射分解损害，且若干自由基清除剂已被建议用于这种用途。然而， 在此处所述研究中已经发现，被其他人报道有效的稳定剂提供的放射 稳定作用不足以保护177Lu-A和177Lu-B(分别为化合物A和B的镥络合 物)免受放射分解损害，特别是当使用高浓度和大量放射性时。

例如，Cyr和Pearson[使用亲水性硫醚和亲水性6-羟基苯并二氢 呋喃对放射性药物组合物的稳定化.Cyr，John E.；Pearson，Daniel A.(Diatide，Inc.，USA).PCT Int.Appl.(2002)，WO 200260491 A2 20020808]指出用125I，131I，211At，47Sc，67Cu，72Ga，90Y，153Sm，159Gd， 165Dy，166Ho，175Yb，177Lu，212Bi，213Bi，68Ga，99mTc，111In和123I放射性 标记的诊断和治疗性放射药物组合物可通过加入亲水性硫醚稳定，且 氨基酸蛋氨酸-一种亲水性硫醚，特别用于该目的。

因此进行研究：将L-蛋氨酸(5mg/mL)加入到177Lu-A中，评价它作 为自由基清除剂的能力。将在下面更详细描述，反相HPLC显示5天后， 177Lu-A几乎完全分解，表明所用放射性稳定剂不足以防止放射分解损 害。体外结合结果表明这种分解可显著降低这样损害的化合物的效能 和靶向能力，及因此降低放射性治疗功效。为了获得所需放射性治疗 作用，需要注入更多放射性，由此增加对正常器官的潜在毒性。

为了鉴定可用于结合GRP受体的放射性诊断和放射性治疗化合物 的放射性稳定的适宜抗氧化自由基清除剂，进行了若干研究。在络合 物形成后加入一种或多种潜在的放射性稳定剂(一种双瓶的制剂)或 可在与放射性金属络合前将它们直接加入到反应混合物中(或两者皆 可)。理想地，放射性稳定剂应能直接加入到制剂中，而不会显著降 低产物的放射化学纯度(RCP)，这种制剂具有成为单瓶试剂盒的可能 性。

这些研究鉴定出来的自由基清除剂在制备用于各种放射性诊断和 放射性治疗应用的化合物的制剂中具有广泛用途，且可用于使多种放 射性同位素，例如，99mTc，186/188Re，111In，90Y，177Lu，213Bi，225Ac，166Ho及其它放射性标记的化合物稳定。本申请中的实施例的主要焦点是 GRP-结合肽的放射性稳定化，且特别是，这些分子中蛋氨酸残基的放 射性保护。然而，所鉴定的稳定剂应对多种放射性标记的肽、类肽、 小分子、蛋白、抗体、和抗体片段等具有广泛应用性。它们用于对具 有对放射分解损害特别敏感的残基(例如，色氨酸(吲哚环的氧化)、 酪氨酸(氧化二聚，或其它氧化)、组氨酸、半胱氨酸(巯基的氧化)和 较小程度的丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、和天冬氨酸)的任何化合物的 放射性保护。还可保护含敏感官能团(吲哚、咪唑、噻唑、呋喃、噻 吩和其它杂环)的肽或药物中常用的稀有氨基酸。

                       发明概述

本发明的目的是提供稳定剂和稳定剂组合物，其可减缓或防止对靶 向的放射性治疗和放射性诊断的放射性标记化合物，特别是用放射性 金属标记的化合物的放射分解损害，由此保存该化合物的靶向能力和 特异性。本发明还提供含有这些稳定剂的制剂。如下面实施例所述， 已经鉴定了许多稳定剂，单独或组合，抑制对放射性标记化合物的放 射分解损害。此时特别优选四种方法。在第一种方法中，在放射性标 记反应后，立即将含有下列成分混合物的放射分解稳定溶液加入到放 射性标记的化合物中：龙胆酸、抗坏血酸、人血清白蛋白、苄醇、pH 约4.5-约8.5的生理学可接受的缓冲液或盐溶液、和一种或多种选自 蛋氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸或半胱氨酸的氨基酸。

该生理学可接受的缓冲液或盐溶液优选选自约0.02M-约0.2M体积 摩尔浓度的磷酸盐、柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液或生理学可接受的氯化 钠溶液或其混合物。试剂苄醇是该制剂中的关键组分且起两个作用。 就具有有限溶解性的化合物而言，它的其中一个目的是使放射性诊断 或放射性治疗靶向化合物在反应溶液中溶解，而无需加入有机溶剂。 它的第二个目的是提供抑菌作用。这是很重要的，因为希望含本发明 放射性稳定剂的溶液具有较长的重构后稳定性，因此抑菌剂的存在是 很关键的，以维持无菌。氨基酸蛋氨酸、硒代蛋氨酸、半胱氨酸和硒 代半胱氨酸在防止对用该放射性稳定组合稳定的靶向分子中蛋氨酰残 基的放射分解损害中发挥特殊作用。

在第二种方法中，稳定化是通过使用具有下列通式的二硫代氨基甲 酸盐实现的：

其中R1和R2各自独立是H；C1-C8烷基；-OR3，其中R3是C1-C8烷 基；或苄基(Bn)(未被取代或任选被水增溶基团(water solubilizing group)取代)，

或其中R1R2N结合＝1-吡咯烷基-、哌啶子基-、吗啉基-、1-哌嗪基- 且M＝H+、Na+、K+、NH4+、M-甲基葡糖胺、或其它药学可接受的+1离子。

可选择性地，可使用下面所示形式的化合物，其中M是+2氧化态 生理学可接受的金属，如Mg2+或Ca2+，且R1和R2具有上面所述的 相同定义。

这些试剂可在放射性标记的络合物的制备过程中直接加入到反应 混合物中，或在络合完成后加入，或两者皆可。

当直接加入到反应混合物中或在络合物形成后加入时，化合物1- 吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)证实作为稳定剂是最有效的。这些 结果是没有预想到的，因为在这些研究之前，还没有报道过将该化合 物用作放射性药物的稳定剂。二硫代氨基甲酸盐，且特别是PDTC具有 清除反应混合物中外来痕量金属的附加优点。

在第三种方法中，制剂所含的稳定剂是其中硒处于+2氧化态的水 溶性有机硒化合物。特别优选的是氨基酸化合物硒代蛋氨酸、硒代半 胱氨酸和它们的酯和酰胺衍生物及其二肽和三肽，可在放射性标记的 络合物制备过程中将它们直接加入到反应混合物中，或在络合物制备 后加入。将这些稳定剂放在标记时的小瓶中或放在单独的小瓶中的灵 活性可延伸本发明的应用用于制造放射性诊断或放射性治疗试剂盒。

使用这些硒化合物结合抗坏血酸钠或其它药学可接受形式的抗坏 血酸及其衍生物是十分有效的。

最优选在络合完成后加入抗坏血酸盐。可选择性地，它可被用作上 述稳定制剂的组分。第四种方法包括使用水溶性含硫的化合物，其中 硫为+2氧化态。优选的硫醇化合物包括半胱氨酸衍生物、巯基乙醇和 二硫苏糖醇。这些试剂是特别优选的，这是由于它们能将蛋氨酸残基 的氧化形式(例如，蛋氨酸氧化物残基)还原回成蛋氨酰残基，由此 修复由于放射分解所致的氧化损害。使用这些硫醇化合物，将这些稳 定试剂与抗坏血酸钠或其它药学可接受形式的抗坏血酸及其衍生物联 合使用十分有效。最优选在络合完成后加入抗坏血酸盐。

该稳定剂和稳定剂组合可用于提高含肽、非-肽小分子、放射性标 记蛋白、放射性标记抗体及其片段的靶向的放射性药物的放射分解稳 定性。这些稳定剂对于此处所述结合GRP的化合物类特别有效。

                    附图简述

图1显示化合物A的结构。

图2显示化合物B的结构。

图3举例说明在25mCi/mL[共50mCi]的放射性浓度和室温下， 177Lu-A与2.5mg/mL L-蛋氨酸的混合物5天的HPLC分析结果。图3A 是用于制备177Lu-A的反应混合物的放射色谱图，其最初以＞98％的产率 形成。图3B是室温下5天后，[177Lu-A]，25mCi/mL，的放射色谱图， 证实所需化合物的完全放射分解破坏。很明显，所加入的放射性稳定 剂对于所需的放射性保护水平而言是不够的。

图4是显示当用形成络合物后加入的放射分解保护溶液1∶1稀释 时，177Lu-B(104mCi)具有＞99％RCP达5天的HPLC示踪[放射性检测]。

图5是显示如果在形成络合物后加入1mL放射分解保护溶液，在 55mCi/2mL浓度下，177Lu-A具有＞95％ RCP达5天的HPLC示踪[放射 性检测]。

图6A和图6B显示177Lu-A的蛋氨酸亚砜衍生物的结构(图6A)和 111In-B的蛋氨酸亚砜衍生物的结构(图6B)。

图7A和图7B显示稳定剂研究177Lu-A(图7A)和177Lu-B(图7B)。 当在10mM Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水，pH7.0[PBS]中以6.6mg/mL氨 基酸浓度加入到177Lu-A(图7A)和177Lu-B(图7B)，放射性浓度为～20 mCi/mL，并室温保存48小时后，根据比较不同氨基酸的放射性稳定作 用的研究显示的放射性示踪。每个小瓶中加入共3.5mCi 177Lu。实验 过程的完整描述在实施例1中给出。

图8显示在有2.5mg/mL L-蛋氨酸存在时，在25mCi/mL放射性浓 度(共50mCi)和室温下，177Lu-A5天内的放射稳定性的HPLC示踪[放 射性检测]。该研究的详细内容在实施例2中给出。

图9显示在含L-蛋氨酸的放射分解保护溶液中，在50mCi/2mL的 浓度下177Lu-B稳定性的HPLC示踪[放射性检测]。该研究的详细内容 在实施例4中给出。

图10A-C显示在177Lu-B反应过程中，比较在反应缓冲液中有或没 有1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐且含有锌作为污染金属的样品的放 射色谱图和UV色谱图。该研究的实验过程在实施例20中给出。

                       发明详述

在下列描述中，将详尽说明本发明的各个方面。为解释的目的，给 出具体的构型和细节以透彻理解本发明。然而，在没有具体细节的情 况下也可实施本发明对于本领域技术人员也是显而易见的。

此外，可省略或简化熟知的特征，从而不致使本发明难以理解。

                    1.金属螯合剂

在某些放射性药物中，同位素是非-金属，如123I，131I或18F，且与 分子的剩余部分直接偶联或与连接基结合。然而，如果所用放射性同 位素是金属，它通常被掺入到金属螯合剂中。术语“金属螯合剂”是 指与金属原子形成络合物的分子。就放射性诊断和放射性治疗应用而 言，通常优选所述络合物在生理学条件下是稳定的。即，该金属在体 内保持与螯合剂主链络合。在优选实施方案中，金属螯合剂是与放射 性核素金属络合形成金属络合物的分子，所述金属络合物在生理学条 件下稳定且还具有至少一个用于与如下所定义的靶向分子、间隔区、 或连接基团缀合的反应性官能团。金属螯合剂M可以是本领域已知的 用于络合医药上有用的金属离子或放射性核素的任何金属螯合剂。该 金属螯合剂可以或可以不与金属放射性核素络合。此外，该金属螯合 剂可包括任选的间隔区如单一的氨基酸(例如，Gly)，其不与金属络合， 但在金属螯合剂与连接基之间建立物理间隔。

本发明的金属螯合剂可包括，例如，线形、大环、三联吡啶、和 N3S、N2S2或N4螯合剂(还见，U.S.4,647,447，U.S.4,957,939，U.S. 4,963,344，U.S.5,367,080，U.S.5,364,613，U.S.5,021,556，U.S. 5,075,099，U.S.5,886,142，其公开的内容全部引入此处作为参 考)，及本领域已知的其它螯合剂，包括但不限于，HYNIC，DTPA，EDTA， DOTA，TETA，和双氨基双硫醇(BAT)螯合剂(还见，U.S.5,720,934)。 例如，大环螯合剂，且特别是N4螯合剂在美国专利No.4,885,363； 5,846,519；5,474,756；6,143,274；6,093,382；5,608,110； 5,665,329；5,656,254；和5,688,487中描述，其公开的内容全部引 入此处作为参考。某些N3S螯合剂在PCT/CA94/00395，PCT/CA94/00479, PCT/CA95/00249和美国专利No.5,662,885；5,976,495；和 5,780,006中描述，其公开的内容全部引入此处作为参考。螯合剂还 可包括螯合配体巯基-乙酰基-甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(MAG3)的衍 生物，其包含N3S和N2S2系统如MAMA(一酰胺一胺二硫醇)、DADS(N2S二胺二硫醇)、CODADS等。这些配体系统和多种其它物质在Liu和 Edwards， Chem Rev.1999，99，2235-2268；Caravan等人， Chem.Rev. 1999，99，2293-2352；及其中的参考文献中描述，其公开的内容全 部引入此处作为参考。

金属螯合剂还可包括已知为锝和铼二肟的硼酸加合物的络合物，如 在美国专利5,183,653；5,387,409；和5,118,797中描述的那些，其 公开的内容全部引入此处作为参考。

优选螯合剂的例子包括，但不限于，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的衍 生物，1，4，7，10-四氮杂环十四烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)，1-取代 1，4，7，-三羧甲基1，4，7，10-四氮杂环十二烷三乙酸(DO 3A)，1-1-(1- 羧基-3-(对-硝苯基)丙基-1，4，7，10四氮杂环十二烷三乙酸盐 (PA-DOTA)和MeO-DOTA的衍生物，乙二胺四乙酸(EDTA)，和 1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)，3，3，9，9-四甲 基-4，8-二氮杂十一烷-2，10-二酮二肟(PnAO)的衍生物；和3，3，9，9- 四甲基-5-氧杂-4，8-二氮杂十一烷-2，10-二酮二肟(氧杂PnAO)的衍 生物。其它螯合配体是亚乙基双-(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍 生物，包括5-Cl-EHPG，5-Br-EHPG，5-Me-EHPG，5-t-Bu-EHPG，和 5-sec-Bu-EHPG；苯并二乙烯三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包 括二苯并-DTPA，苯基-DTPA，二苯基-DTPA，苯基-DTPA，和二苄基 -DTPA；双-2(羟苄基)-亚乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；含至 少3个碳原子，更优选至少6个碳原子和至少2个杂原子(O和/或N) 的大环化合物类，该大环化合物可由1个环、或在杂环元素处连接在 一起的2个或3个环组成，例如苯并-DOTA，二苯并-DOTA，和苯 并-NOTA，其中NOTA是1，4，7-三氮杂环壬烷N，N’，N”-三乙酸，苯 并-TETA，苯并-DOTMA，其中DOTMA是1，4，7，10-四氮杂环十四 烷-1，4，7，10-四(甲基四乙酸)，和苯并-TETMA，其中TETMA是 1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-丙二胺四 乙酸(PDTA)和三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物； 1，5，10-N，N’，N”-三(2，3-二羟苯甲酰基)-tricatecholate(LICAM)和 1，3，5-N，N’，N”-三(2，3-二羟苯甲酰基)氨甲基苯(MECAM)的衍生物。本 发明预期的代表性螯合剂及螯合基团的例子在WO 98/18496，WO 86/06605，WO 91/03200，WO 95/28179，WO 96/23526，WO 97/36619， PCT/US98/01473，PCT/US98/20182，和U.S.4,899,755，U.S. 5,474,756，U.S.5,846,519及U.S.6,143,274中描述，每篇均全部 引入此处作为参考。

特别优选的金属螯合剂包括下面列出的式1，2和3a及3b的那些 (对于111In，90Y，和放射性镧系，如177Lu，153Sm和166Ho)和式4，5和6 的那些(对于放射性99mTc，186Re和188Re)。这些和其它金属螯合基团在 美国专利No.6,093,382和5,608,110中描述，它们全部引入作为参 考。此外，式3的螯合基团在，例如，美国专利No.6,143,274中描 述；式5的螯合基团在，例如，美国专利No.5,627,286和6,093,382 中描述，式6的螯合基团在，例如，美国专利No.5,662,885；5,780,006； 和5,976,495中描述，全部引入此处作为参考。具体的式6金属螯合 剂包括N，N-二甲基Gly-Ser-Cys；N，N-二甲基Gly-Thr-Cys；N，N-二 乙基Gly-Ser-Cys；N，N-二苄基Gly-Ser-Cys；及其它变体。事实上 不与金属放射性核素络合的间隔区如额外的单一氨基酸Gly，可与这 些金属螯合剂相连(例如，N，N-二甲基Gly-Ser-Cys-Gly；N，N-二甲基 Gly-Thr-Cys-Gly；N，N-二乙基Gly-Ser-Cys-Gly；N，N-二苄基 Gly-Ser-Cys-Gly)。其它有用的金属螯合剂，如美国专利No. 6,334,996中公开的所有那些，也引入此处作为参考(例如，二甲基 gly-L-叔-丁基gly-L-Cys-Gly；二甲基gly-D-叔-丁基 gly-L-Cys-Gly；二甲基gly-L-叔-丁基gly-L-Cys等)。

此外，硫保护基团如Acm(乙酰氨基甲基)，三苯甲基或其它已知的 烷基、芳基、酰基、烷酰基、芳酰基、巯酰基和有机巯基可与这些金 属螯合剂的半胱氨酸相连。

具体而言，有用的金属螯合剂包括：

在上式1和2中，R是氢或烷基，优选甲基。在式3b中，R1和R2 是在美国专利US6,143,274中定义的，其全部引入此处作为参考。在 上式5中，X是CH2或O，Y是C1-C10支链或直链烷基；Y是芳基、芳氧 基、芳氨基、芳氨酰基；Y是芳烷基-其中与芳基相连的烷基是C1-C10 支链或直链烷基，C1-C10支链或直链羟基或多羟烷基或多烷氧烷基或多 羟基-多烷氧烷基，J是C(＝O)-，OC(＝O)-，SO2-，NC(＝O)-，NC(＝S)-， N(Y)，NC(＝NCH3)-，NC(＝NH)-，N＝N-，来源于合成的或天然存在的氨 基酸的均聚酰胺或杂聚胺；所有的n是1-100。J还可以空缺。这些结 构的其它变体在例如美国专利No.6,093,382中描述。在式6中，基 团S-NHCOCH3可被SH或S-Z替代，其中Z是任何已知的硫保护基团， 如上述那些。式7举例说明用作金属螯合剂的叔-丁基化合物的其中一 个实施方案。上述每篇专利、申请和参考文献公开的内容全部引入此 处作为参考。

在优选实施方案中，金属螯合剂包括环状或无环的聚氨基羧酸如 DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)，DTPA(二亚乙基 三胺五乙酸)，DTPA-双甲基酰胺，DTPA-双吗啉酰胺，DO3A N-[[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]， HP-DO3A，DO3A-一酰胺及其衍生物。

这些螯合配体可通过经由多个氮和氧原子与它结合而包封放射性 金属，由此防止游离(未结合)放射性金属释放到体内。这是很重要 的，因为在体内3+放射性金属自它们螯合物的离解可导致肝脏、骨和 脾脏中摄取放射性金属[Brechbiel MW，Gansow OA，“用于90Y放射性 免疫疗法的主链-取代的DTPA配体”，Biocon j.Chem.1991；2： 187-194；Li，WP，Ma DS，Higginbotham C，Hoffman T，Ketring AR， Cutler CS，Jurisson，SS，“评价镧系螯合物体内稳定性的体外模 型的开发”Nucl.Med.Biol.2001；28(2)：145-154；Kasokat T， Urich K.Arzneim.-Forsch，“马根维显溶液在大鼠中脱螯合的量化” 1992；42(6)：869-76]。除非特异性靶向这些器官，否则这些非-特异 性吸收是十分不希望的，因为它导致非-靶组织的非-特异性辐射，其 可导致如骨髓辐射所致造血抑制这类问题。

                    2.放射性同位素

闪烁扫描法或放疗所用的优选放射性核素包括99mTc，67Ga，68Ga， 47Sc，51Cr，167Tm，141Ce，111In，123I，125I，131I，18F，11C，15N，168Yb，175Yb， 140La，90Y，88Y，86Y，153Sm，166Ho，165Dy，166Dy，62Cu，64Cu，67Cu，97Ru，103Ru， 186Re，188Re，203Pb，211Bi，212Bi，213Bi，214Bi，225Ac，211At，105Rh，109Pd， 117mSn，149Pm，161Tb，177Lu，198Au，199Au及其氧化物或氮化物。同位素的 选择将基于所需治疗或诊断应用而定。例如，为了诊断目的(例如， 诊断和监测原发性肿瘤和转移瘤的治疗进展)，优选的放射性核素包 括64Cu，67Ga，68Ga，99mTc，和111In，99mTc和111In是特别优选的。为了 治疗目的(例如，为与前列腺、乳腺、肺等癌症有关的原发性肿瘤和转 移瘤提供放疗)，优选的放射性核素包括64Cu，90Y，105Rh，111In，117mSn， 149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，175Yb，177Lu，186/188Re和199Au，，177Lu和 90Y是特别优选的。99mTc特别有效且是优选的诊断性放射性核素，这是 因为它的低成本、可获得性、成像性质、和高比放射性。99mTc的核及 放射性使该同位素成为理想的闪烁扫描成像剂。该同位素具有140keV 的单光子能量和约6小时的放射性半衰期，且很容易从99Mo-99mTc发生 器得到。111In也是特别优选的诊断性同位素，因为该+3金属离子具有 与放射性治疗的+3镧系元素非常相似的化学，因此可制备诊断/治疗 性111In/177Lu对。用177Lu，90Y或其它治疗放射性核素标记的肽可为与 前列腺、乳腺、肺等癌症相关的原发性肿瘤和转移瘤提供放疗，且111In 类似物可用于检测这类肿瘤的存在。用于特定放疗应用的适宜核素的 选择取决于许多因素，包括：

a.物理半衰期-其应当足够长，从而可自放射性金属和缀合物合成 并纯化放射性治疗构建体，释放所述构建体到注入部位，在注入前没 有显著的放射性衰变。优选，放射性核素应具有约0.5-8天的物理半 衰期。

b.从放射性核素发射出的能量-作为粒子发射体(如α发射体和 β发射体)的放射性核素是特别有用的，因为它们发射出高能粒子， 使它们的能量在短距离内沉积，由此产生高度局限性的损害。β-发射 放射性核素是特别优选的，因为源于这些同位素的β粒子发射的能量 在5-约150个细胞直径内沉积。自这些核素制备的放射性治疗剂能够 杀死相对靠近它们的定位部位的患病细胞，但不能移动较长距离去损 害相邻的正常组织如骨髓。

c.比放射性(即放射性核素的放射性/质量)-具有高比放射性的放 射性核素(例如发生器产生的90-Y，111-In，177-Lu)是特别优选的。 放射性核素的比放射性由它的生产方法，用于生产它的特定靶，和该 同位素的性质决定。

                      3.连接基团

术语“连接基”和“连接基团”在此处同义使用，是指将靶向分子 与金属螯合剂偶联，而不会不利影响靶向分子的靶向功能或金属螯合 剂的金属螯合功能的任何化学基团。连接基团可任选存在于本发明稳 定的放射性药物制剂中。

适宜的连接基团包括单独的肽(即，连接在一起的氨基酸)，非-肽 基团(例如，烃链)或氨基酸序列和非-肽间隔区的组合。

在其中一个实施方案中，连接基团包括L-谷氨酰胺和烃链，或其 组合。

在另一实施方案中，连接基团包括由一系列氨基酸组成的纯肽连接 基团(例如，二甘氨酸，三甘氨酸，gly-gly-glu，gly-ser-gly等)， 其中多聚链中靶向分子N-末端残基与金属螯合剂之间的总原子数≤12 个原子。

在另一实施方案中，连接基团包括烃链[即，R1-(CH2)n-R2]其中n 是0-10，优选n＝3-9，R1是可用作为共价连接配体主链或预先形成的 金属螯合剂或金属螯合主链的位点的基团(例如，H2N-，HS-，-COOH)； 且R2是用于共价偶联靶向分子的基团(例如，偶联至靶向肽的N-末端 NH2-基团(例如，R2是被活化的COOH基团))。将配体(即，螯合剂) 或优选的金属螯合物与生物分子缀合的若干化学方法已在文献中充分 描述[Wilbur，1992；Parker，1990；Hermanson，1996；Frizberg等 人，1995]。一种或多种这些方法可用于将未络合的配体(螯合剂)或 放射性金属螯合物与连接基连接或将连接基与靶向分子连接。这些方 法包括酸酐、醛、芳基异硫氰酸酯、活化酯、或N-羟基琥珀酰亚胺的 形成[Wilbur，1992；Parker，1990；Hermanson，1996；Frizberg等 人，1995]。

          3A.含至少一个非-α氨基酸的连接基团

在本发明优选实施方案中，连接基团为式N-O-P且包括至少一个非 -α氨基酸。因此，在该连接基N-O-P的实施方案中，

N是0(其中0是指空缺)，α或非-α氨基酸或其它连 接基团；

O是α或非-α氨基酸；且

P是0，α或非-α氨基酸或其它连接基团，

其中N，O或P中至少一个是非-α氨基酸。

因此，在其中一个实施例中，N＝Gly，O＝非-α氨基酸，且P＝0。

α氨基酸是本领域熟知的，且包括天然存在及合成的氨基酸。非 -α氨基酸也包括天然存在或合成的那些。优选的非-α氨基酸包括：

8-氨基-3，6-二氧杂辛酸

N-4-氨乙基-N-1-乙酸；和

具有式NH2-(CH2CH2O)n-CH2CO2H或NH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2CO2H的聚 乙二醇衍生物，其中n＝2-100。

3B.含至少一个取代胆汁酸的连接基团

在本发明另一实施方案中，连接基为式N-O-P且含有至少一个取代 胆汁酸。因此，在该连接基N-O-P的实施方案中，

N为0(其中0是指空缺)，α氨基酸，取代胆汁酸或 其它连接基团；

O是α氨基酸或取代胆汁酸；且

P是0，α氨基酸，取代胆汁酸或其它连接基团，

其中N，O或P中至少一个是取代酸。

胆汁酸是在胆汁(肝脏的分泌物)中发现的且是具有羟基和终止于 羧基的5个碳原子侧链的甾族化合物。在取代胆汁酸中，胆汁酸的至 少一个原子如氢原子被另一原子、分子或化学基团取代。例如，取代 的胆汁酸包括在7位和12位被氢、羟基或酮官能团任选取代的具有 3-氨基、24-羧基官能团的那些。

本发明中其它有效的取代胆汁酸包括取代胆酸及其衍生物。具体的 取代胆酸衍生物包括：

(3β，5β)-3-氨基胆烷-24-酸；

(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羟基胆烷-24-酸；

(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羟基胆烷-24-酸；

Lys-(3，6，9)-三氧杂十一烷-1，11-二羰基-3，7-二脱 氧-3-氨基胆酸)；

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基-12-氧代胆烷-24-酸；和

(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羟基胆烷-24-酸。

3C.含至少一个具有环状基团的非-α氨基酸的连接基团

在本发明另一实施方案中，连接基N-O-P含有至少一个具有环状基 团的非-α氨基酸。因此，在该连接基N-O-P的实施方案中，

N是0(其中0是指空缺)、α氨基酸、具有环状基团的非-α氨 基酸或其它连接基团；

O是α氨基酸或具有环状基团的非-α氨基酸；且

P是0、α氨基酸、具有环状基团的非-α氨基酸、或其它连接 基团，

其中N，O或P中至少一个是具有环状基团的非-α氨基酸。

具有环状基团的非-α氨基酸包括含取代苯基、联苯基、环己基 或其它胺和羧基的环状脂族或杂环部分。这种的例子包括：

4-氨基苯甲酸

4-氨甲基苯甲酸

反式-4-氨甲基环己烷羧酸

4-(2-氨基乙氧基)苯甲酸

六氢异烟酸

2-氨甲基苯甲酸

4-氨基-3-硝基苯甲酸

4-(3-羧甲基-2-酮-1-苯并咪唑基-哌啶

6-(哌嗪-1-基)-4-(3H)-喹唑酮-3-乙酸

(2S，5S)-5-氨基-1，2，4，5，6，7-六氢-5-氨基-1，2，4，5，6，7-六氢氮杂 并[3，2，1-hi]吲哚-4-酮-2-羧酸

(4S，7R)-4-氨基-6-氮杂-5-氧代-9-硫杂二环[4.3.0]壬烷-7-羧酸

3-羧甲基-1-苯基-1，3，8-三氮杂螺[4.5]癸-4-酮

N1-哌嗪乙酸

N-4-氨乙基-N-1-哌嗪乙酸

(3S)-3-氨基-1-羧甲基己内酰胺

(2S，6S，9)-6-氨基-2-羧甲基-3，8-二氮杂双环-[4，3，0]-壬烷-1，4- 二酮

                     4.靶向分子

与和给定靶细胞群有关的受体或其它接受部分特异性结合或反应 性缔合或复合的任何分子均可被用作本发明放射性药物制剂中的靶向 分子。该细胞反应性分子，其任选经由连接基团与金属螯合剂相连， 可以是与所要结合或定位的细胞群结合、复合或反应的任何分子。该 细胞反应性分子将放射性药物释放到与该分子反应的特定靶细胞群。 靶向分子可以是非-肽，如甾族化合物、碳水化合物、或小的非-肽分 子。该靶向分子还可以是抗体，如，单克隆或多克隆抗体，其片段， 或蛋白，包括，例如，膜联蛋白衍生物、抗-CEA、Tositumomab、HUA33、 Epratuzumab、cG250、人血清白蛋白、Ibritumomab Tiuxetan等。优 选靶向分子是肽、肽模拟物或类肽。最优选靶向分子是肽(“靶向肽”)。

在优选实施方案中，本发明放射性药物制剂中所用的靶向分子是 生物活性肽。在更优选的实施方案中，靶向分子是结合目标受体或酶 的肽。例如，靶向分子可以是肽激素，如促黄体生成激素释放激素 (LHRH)，如在文献(例如，促黄体生成激素释放激素的放射性金属-结 合类似物PCT/US96/08695；PCT/US97/12084(WO 98/02192))中描述的； 胰岛素；催产素；促生长素抑制素；神经激肽-1(NK-1)；血管活性 肠肽(VIP)包括文献中描述的线形和环状形式[例如，血管活性肠肽的 环状和线性类似物的比较，D.R.Bolin，J.M.Cottrell，R.Garippa， N.Rinaldi，R.Senda，B.Simkio，M.O’Donnell.肽：化学、结构 和生物学，Pravin T.P.Kaumaya，和Roberts S.Hodges(Eds). Mayflower Scientific LTD.，1996，pgs 174-175]；胃泌素释放肽 (GRP)；铃蟾肽和其它已知的激素肽，及其类似物和衍生物。

其它有效的靶向分子包括促生长素抑制素的类似物，其例如是兰 瑞肽(Nal-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2)、奥曲肽 (Nal-Cys-Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-ol)和Maltose-(Phe-Cys- Thr-DTrp-Lys-Val-Cys-Thr-ol)。这些类似物在文献中描述[例如， 含N-末端修饰的有效促生长素抑制素类似物，S.H.Kim，J.Z.Dong， T.D.Gordon，H.L.Kimball，S.C.Moreau，J.-P.Moreau，B.A. Morgan，W.A.Murphy和J.E.Taylor；肽：化学、结构和生物学， Pravin T.P.Kaumaya和Roberts S.Hodges(Eds).，Mayflower Scientific LTD.，1996，pgs 241-243.]。

其它有效的靶向分子包括P物质激动剂[例如，G.Bitan，G.Byk， Y.Mahriki，M.Hanani，D.Halle，Z.Selinger，C.Gilon，肽： 化学、结构和生物学，Pravin T.P.Kaumaya和Roberts S.Hodges (Eds)，Mayflower Scientific LTD.，1996，697-698页；G蛋白拮 抗剂，与受体竞争G蛋白结合的一种新的疏水肽，Hidehi to Mukai， Eisuke Munekata，Tsutomu Higashijima，J.Biol.Chem.1992，267， 16237-16243]；NPY(Y1)[例如，偏好Y1-受体的神经肽Y的新类似物， Richard M.Soll，Michaela，C.Dinger，Ingrid Lundell，Dan Larhammer，Annette G.Beck-Sickinger，Eur.J.Biochem.2001， 268，2828-2837；作为潜在肿瘤成像剂的99mTc-标记的神经肽Y类似 物，Michael Langer，Roberto La Bella，Elisa Garcia-Garayoa， Annette  G.Beck-Sickinger，Bioconjugate  Chem.2001，12， 1028-1034；用于肿瘤-特异性化疗的新的肽缀合物，Michael Langer， Felix Kratz，Barbara Rothen-Rutishauser，Heidi Wnderli-Allenspach，Annette G.Beck-Sickinger，J.Med.Chem. 2001，44，1341-1348]；催产素；内皮缩血管肽A和内皮缩血管肽B； 缓激肽；表皮生长因子(EGF)；白介素-1[IL-1家族蛋白的肽片段的 抗-IL-1活性，I.Z.Siemion，A.Kluczyk，Zbigtniew Wieczorek， Peptides 1998，19，373-382]；和缩胆囊肽(CCK-B)[使用八肽 DTPA-CCK类似物在甲状腺髓样癌患者中进行缩胆囊肽受体成像，Eur. J.Nucl Med.200，27，1312-1317]。其它有效的靶向分子包括：转 铁蛋白、血小板-衍生的生长因子、肿瘤生长因子(“TGF”)，如TGF-α 和TGF-β、痘苗病毒生长因子(“VGF”)、胰岛素-样生长因子I和II、 硬骨鱼紧张肽II肽和类似物、地普奥肽、伐普肽、胰岛素样生长因子 (IGF)、在血管生成中被正向调节的肽靶向受体如VEGF受体(例如，KDR， NP-1等)、含RGD的肽、黑素细胞-刺激激素(MSH)肽、神经降压素、 降钙素、来源于抗肿瘤抗体互补决定区的肽、谷胱甘肽、YIGSR(白细 胞-avid肽，例如，P483H，其含有血小板因子-4(PF-4)的肝素-结合 区和富含赖氨酸的序列)、心房利钠肽(ANP)、β-淀粉样蛋白肽、δ-阿 片样物质拮抗剂(如ITIPP(psi))、膜联蛋白-V、IL-1/IL-1ra、IL-2、 IL-6、IL-8、白三烯B4(LTB4)、趋化性肽(如N-甲酰基-蛋氨酰-亮氨 酰-苯丙氨酸-赖氨酸(fMLFK))、GP IIb/IIIa受体拮抗剂(如，DMP444)、 表皮生长因子、人嗜中性白细胞弹性蛋白酶抑制剂(EPI-HNE-2，HNE2， 和HNE4)、纤溶酶抑制剂、抗微生物肽、apticide(P280)、P274、凝 血酶敏感素受体(包括类似物如TP-1300)、bitistatin、垂体腺苷酸 环化酶I型受体(PAC1)，和这些的类似物和衍生物。

靶向分子的概述可在下列文献中找到，例如：肽和它们的受体作 为肿瘤标记的作用，Jean-Claude Reubi，药物中的胃肠激素，899-939 页；核药物中的肽放射性药物，D.Blok，R.I.J.Feitsma，P.Vermeij， E.J.K.Pauwels，Eur.J.Nucl Med.1999，26，1511-1519；和 用于使肿瘤成像的在肿瘤细胞中过量表达的受体的放射性标记肽和其 它配体，John G.McAfee，Ronald D.Neumann，Nuclear Medicine and Biology，1996，23，673-676(促生长素抑制素、VIP、CCK、GRP、P 物质、促生长激素神经肽、MSH、LHRH、精氨酸-加压素、内皮缩血管 肽)。前面段落中所有上述文献全部引入此处作为参考。

其它靶向分子参考文献包括下列：作为体内多受体肿瘤靶向的分 子基础的乳腺癌中共同-表达的肽受体，Jean Claude Reubi，Mathias Gugger，Beatrice Waser.Eur.J.Nucl Med.2002，29，855-862， (包括NPY，GRP)；促黄体生成激素释放激素的放射性金属-结合类似 物PCT/US96/08695(LHRH)；PCT/US97/12084(WO 98/02192)(LHRH)； PCT/EP90/01169(肽的放疗)；WO 91/01144(肽的放疗)；和 PCT/EP00/01553(用于肿瘤的治疗和诊断的分子)，所有全部引入此处 作为参考。

此外，可使用靶向分子的类似物。这些类似物包括靶向所需位点 受体的亲合力大于或等于靶向分子本身的分子。靶向肽类似物包括靶 向肽的突变蛋白、反肽和反-倒位-肽。本领域技术人员将认识到这些 类似物还可包含修饰，该修饰包括在这些修饰不会不利地改变靶向分 子生物学活性的范围内，一个或若干个氨基酸的置换、和/或缺失和/ 或添加。靶向肽中的置换可通过用它们的同义氨基酸替换一个或多个 氨基酸而进行。小组内的同义氨基酸被定义为具有充足物理化学性质 从而使小组成员之间的置换保持分子生物学功能的氨基酸。此处所用 同义氨基酸包括这些氨基酸的合成衍生物(如，氨基酸的D-形式和其 它合成衍生物)，和，氨基酸的D-形式和其它合成衍生物)。本申请 中的氨基酸通过3个字母或1个字母的缩写形式互换使用，这是本领 域技术人员熟知的。因此，例如，T或Thr代表苏氨酸，K或Lys代表 赖氨酸，P或Pro代表脯氨酸，R或Arg代表精氨酸。

氨基酸的缺失或插入还可被引入到靶向肽的限定序列中，条件是 它们不会改变所述序列的生物学功能。优选这种插入或缺失应限于1， 2，3，4或5个氨基酸且不应除去或物理阻碍或替换对功能性构象至 关重要的氨基酸。靶向肽或多肽的突变蛋白可具有与原始靶向肽序列 同源的序列，其中在一个或多个氨基酸位置上存在氨基酸的置换、缺 失或插入。突变蛋白可具有原始靶向肽至少40％、优选至少50％、更 优选60-70％、最优选80-90％的生物学活性。然而，它们也可具有大 于原始靶向肽的生物学活性，且因此并非必需与原始靶向肽的生物学 功能完全相同。靶向肽的类似物还包括在肽主链的酰胺键中掺入改变 的肽模拟物或假肽，包括硫代酰胺、亚甲基胺、和E-烯烃。且以靶向 肽或其类似物的结构为基础、其中氨基酸被N-取代的肼羰基化合物替 代的分子(也称作氮杂氨基酸)也包括在此处所用术语类似物中。

使用靶向肽时，它可经由N或C末端或经由连到赖氨酸的ε氮、 鸟氨酸的γ氮或或天门冬氨酸或谷氨酸的第二个羧基与连接基相连。

在优选实施方案中，靶向分子是胃泌素释放肽(GRP)受体靶向分 子。GRP受体-靶向分子是与GRP受体家族的一个或多个成员特异性结 合或反应性缔合或复合的分子。换句话说，它是对GRP受体家族具有 结合亲和性的分子。在特别优选的实施方案中，靶向分子是GRP受体 靶向肽(例如，对GRP受体家族的一个或多个成员具有结合亲和性的 肽、其等价物、类似物或衍生物)。

GRP受体靶向分子可以采用激动剂或拮抗剂的形式。GRP受体靶向 分子激动剂已知可在以高亲和性结合后“激活”细胞，且可被该细胞 内化。相反，已知GRP受体靶向分子拮抗剂仅与细胞上的GRP受体结 合，而不刺激被该细胞内化且不会“激活”该细胞。在优选实施方案 中，GRP受体靶向分子是激动剂且更优选它是肽激动剂。

在本发明更优选的实施方案中，GRP激动剂是铃蟾肽(BBN)类似物 和/或其衍生物。BBN衍生物或其类似物优选包含相同的BBN结合区的 一级结构(即，BBN(7-14)[SEQ ID NO：1])或类似的一级结构，具有特 定的氨基酸置换，其将以较之单独的BBN更好或相似的结合亲和性与 GRP受体特异性结合(即，Kd＜25nM)。适宜的化合物包括肽、肽模拟物 及其类似物和衍生物。L-蛋氨酸(Met)在BBN-14位上的存在通常赋予 激动性，而BBN-14位上缺乏该残基通常赋予拮抗性[Hoffken，1994]。

现有技术已经证实了BBN(8-14)结合区中有一些并且选择性数目 的特定氨基酸置换(例如，D-Ala11替代L-Gly11或D-Trp8替代L-Trp8)， 其可在不降低亲和性的条件下进行[Leban等人，1994；Qin等人，1994； Jensen等人1993]。此外，某些氨基酸链或其它基团与BBN-8位上N- 末端胺基团(即，Trp8残基)的连接可显著降低BBN类似物与GRP受体 的结合亲和性[Davis等人，1992；Hoffken，1994；Moody等人，1996； Coy等人，1988；Cai等人1994]。少数情况下，可在不降低结合亲和 性的条件下附加其它氨基酸或化学部分。

BBN受体靶向分子的类似物包括以大于或等于BBN的亲合力靶向 针对GRP受体的分子、以及GRP或BBN的突变蛋白、反肽、反-倒位- 肽。本领域技术人员将认识到这些类似物还可在这些修饰不会不利地 改变此处所述肽的生物学活性的范围内包含修饰，该修饰包括一个或 若干氨基酸的置换和/或缺失和/或添加。这些置换可通过用同义氨基 酸替代一个或多个氨基酸而进行。

本发明的稳定剂还可用于不具有显著靶向或连接基团的化合物， 且其中单独的金属/螯合剂组合提供对所需器官或器官系统的靶向。例 如，这里所述的稳定剂在化合物如166Ho-DOTMP，188Re-HEDTMP， 153Sm-EDTMP，99mTc-MDP等的稳定中具有潜在效用，它们所有都针对骨。

                5.化合物的标记和给药

在本发明稳定的缀合物内掺入放射性同位素可通过配位化学领域 公知的各种方法实现。例如，当需要掺入例如111In或177Lu时，可使 用实施例中给出的方法。当金属是99mTc，用于诊断成像的优选放射性 核素时，下列一般过程可用于形成锝络合物。肽-螯合剂缀合物溶液是 通过最初将缀合物溶于稀酸、碱、盐或缓冲液的水溶液中，或醇如乙 醇的水溶液中而形成的。然后任选将该溶液脱气以除去溶解的氧。当 肽中存在-SH基团时，巯基保护基团如Acm(乙酰氨基甲基)、三苯甲基 或其它巯基保护基团可任选用于保护巯基不被氧化。用适宜试剂，例 如氢氧化钠除去巯基保护基团，然后用有机酸如乙酸中和。可选择性 地，可在锝螯合过程中原位除去巯基保护基团。在标记步骤中，将从 钼发生器获得的高锝酸钠加入到含有足量还原剂如氯化亚锡的缀合物 溶液中，从而还原锝，并将其室温静置或加热。可将标记的缀合物从 污染物99mTcO4-和胶态99mTcO2中色谱分离出来，例如用C-18 Sep Pak 柱[Millipore Corporation]或使用本领域技术人员熟知方法的HPLC。

在可选择性方法中，标记可通过转螯合(transchelation)反应 进行。在该方法中，锝源是被还原且在与所选螯合剂反应前与不稳定 配体络合的锝溶液，由此促进配体与所选螯合剂的交换。用于转螯合 的适宜配体的例子包括酒石酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐和葡萄糖庚 酸盐(heptagluconate)。应了解可使用上述技术标记缀合物，或可 选择性地，螯合剂本身可被标记且随后与肽偶联形成缀合物：一种被 称作“预标记的螯合物”的方法。Re和Tc均位于周期表VIIB行，且 它们是化学同族元素。因此，就绝大部分而言，这两种金属与显示较 高体外和体内稳定性的配体结构的络合化学是相同的[Eckelman， 1995]且相似的螯合剂和过程可用于用Re标记。许多99mTc或186/188Re络合物，它们被用于和肽及蛋白形成稳定的放射性金属络合物，螯合 +5氧化态的这些金属[Lister-James等人，1997]。这种氧化态可选择 性将99mTc-或186/188Re置于已经与生物分子缀合、从多种99mTc(V)和/或 186/188Re(V)弱螯合物(例如，99mTc-葡庚糖酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐 等)构建的配体结构中[Eckelman，1995；Lister-James等人，1997； Pollak等人，1996]。

                   6.诊断和治疗用途

本发明稳定的放射性药物和放射性药物制剂可用于使所选组织成 像或将放疗释放到所选组织。在优选实施方案中，通过在放射性诊断 和放射性治疗领域中建立的过程，它们可用于治疗和/或检测癌症，包 括肿瘤[Bushbaum，1995；Fischman等人，1993；Schubiger等人， 1996；Lowbertz等人，1994；Krenning等人，1994]。

事实上，实施例中稳定的放射性药物制剂能够靶向表达GRP受体 的组织，包括肿瘤，由此使这些组织成像或将放疗释放到这些组织。 因为GRP受体已被证实在许多癌症类型，如前列腺、乳腺和小细胞肺 癌中过量表达，因此针对这类受体的放射性诊断或放射性治疗剂具有 广泛用于诊断或治疗这种癌症的潜能。本发明稳定的放射性药物的诊 断应用可作为第一线诊断筛选疾病状态的存在，例如肿瘤细胞，使用 闪烁扫描成像，可作为在放射导向手术(RIGS)领域中使用手持式放射 检测器械靶向特定组织(例如，肿瘤组织)的药剂，可作为在给予配 对放射性治疗化合物前获得放射剂量测定数据的手段，和作为评价例 如受体群随治疗时间改变的手段。

本发明稳定的放射性药物的治疗应用可以是用作疾病如癌症治 疗中单一疗法的药剂，可作为其中这些放射性标记的药剂可与辅助化 疗联合使用的联合疗法，且可作为配对治疗剂。配对的概念是指单一 未标记的化合物，其既可作为诊断剂又可作为治疗剂，这取决于用于 结合适宜螯合物所选择的放射性同位素。如果该螯合剂不能适应所需 金属，则可进行适当取代，从而适应不同金属而维持药理学，这样一 来，诊断化合物的体内行为可用于预测放射性治疗化合物的行为。

可将本发明稳定的化合物和制剂单独给予患者或作为含其它组 分如赋形剂、稀释剂和载体的组合物的一部分给予患者，其全部为本 领域所熟知。可将该化合物静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、肿瘤内 或置入到例如脑中的切除腔而给予患者。本发明提供的稳定的放射性 标记的闪烁扫描成像剂具有适量放射性。在形成99mTc放射性络合物时， 通常优选在含约0.01毫居里(mCi)-100mCi/mL浓度放射性的溶液中 形成放射性络合物。通常，所给予的单位剂量具有约0.01mCi-约100 mCi，优选1mCi-30mCi的放射性。以单位剂量注入的溶液为约0.01 mL-约10mL。就111In-标记的络合物而言，诊断应用时所给予的单位 剂量通常为约0.01mCi-约10mCi，优选3-6mCi，放射性治疗应用 时为10mCi-约2居里，优选30mCi-800mCi。就177Lu-标记的络 合物而言，所给予的单位剂量通常为约10mCi-约200mCi，优选约100- 约200mCi。适于给药的标记的缀合物的量取决于所选缀合物的分布， 意思是迅速清除的缀合物可能需要以较之不那么迅速清除的缀合物更 高的剂量给药。体内分布和定位可在给药后的适宜时间，通过标准的 闪烁扫描技术追踪；通常在30分钟-180分钟之间，这取决于在靶位 点的累积率相对于在非-靶组织的清除率。例如，将本发明稳定的诊断 性放射性核素-标记化合物注入到患者中后，相对于掺入到成像剂中的 核素的γ射线能量校准的γ照相机可用于使药剂吸收区成像并量化存 在于该位点中的放射性量。体内位点的成像可在几分钟内发生。然而， 如果需要，成像可在将放射性标记的化合物注入到患者中后几小时或 几天进行。在绝大多数情况下，足量的给药剂量将在约0.1小时内在 待成像区域中累积，从而允许进行闪烁照相。使用放射性标记的抗体 和抗体片段，适宜的成像时间可长达给药后约1周。

本发明存在许多优点。按照本发明制备的化合物可形成稳定的、 很好定义的111In或177Lu标记的化合物。本发明类似的稳定化合物和 制剂的制备还可通过对各放射性金属使用适宜的螯合剂结构，形成稳 定的、很好定义的、用153Sm，90Y，166Ho，105Rh，199Au，149Pm，99mTc，186/188Re或其它放射性金属标记的产物。稳定的放射性标记的GRP受体靶向肽 选择性结合表达GRP受体的肿瘤细胞，且如果使用激动剂，所述靶向 肽变成内化的，且长时间保留在肿瘤细胞中。因获得的高放射稳定性， 放射性制剂不会经历显著分解，且因此可在例如中心放射性标记实验 室中制备，然后运送到远处，而不会导致大量分解和靶向能力丧失。

                       7.放疗法

放射性同位素疗法包括以足以损害或破坏靶向组织的量给予放射 性标记的化合物。给予化合物后(例如，通过静脉内、皮下或腹膜内注 射)，稳定的放射性标记的药物优先在患病部位定位(例如，表达GRP 受体家族成员的肿瘤组织)。一旦定位，放射性标记的化合物以在所给 予同位素放射性衰变过程中释放的能量损害或破坏患病组织。

成功放疗的设计包括几个重要因素：

1.选择适宜靶向基团，从而将放射性释放到患病部位；

2.选择适当放射性核素，从而释放充足能量损害该患病部 位，而基本上不会损害相邻正常组织；和

3.选择靶向基团和放射性核素的适当组合，而不会不利地 影响该缀合物在患病部位定位的能力。就放射性金属而言，这常包括 与放射性核素紧密配位的螯合基团，与将所述螯合物与靶向基团偶联 的连接基结合，影响化合物的总体生物分布从而实现在靶组织中最大 吸收且在正常的非-靶器官中最小吸收。

4.选择适宜的放射性稳定剂，这样一来一旦形成，放射性 治疗化合物不会在给药前经历显著的放射分解。

通过适当选择稳定剂、靶向基团、放射性核素、金属螯合物[如果 存在]和任选的连接基，本发明提供满足上述所有标准的稳定的放射性 治疗剂。

就放疗应用而言，可使用此处公开的用于治疗性放射性核素的任 何螯合剂。然而，DOTA螯合物形式[Tweedle MF，Gaughan GT，Hagan JT，“1-取代-1，4，7-三羧甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷和类似物” 美国专利4,885,363，1989年12月5日]是特别优选的，因为预期DOTA 螯合物较之DTPA或其它线形螯合物在体内丢失的结合放射性核素较 少。通过连接基将DOTA-型大环与靶向基团偶联的一般方法(例如，通 过激活DOTA的其中一个羧酸而形成活性酯，然后其与连接基上的氨基 反应，形成稳定的酰胺键)是本领域技术人员已知的(见，例如，Tweedle 等人，美国专利4,885,363；镧系放射性同位素的当前和潜在的治疗 应用，Cutler，C等人，Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals (2000)，15(6)，531-545；使用放射性肽进行肿瘤定位和治疗的 受体靶向，Heppeler，A等人，Current Medicinal Chemistry(2000)， 7(9)，971-994；与抗体缀合的双功能chelatones的制备方法， Budsky，F等人，Radioisotopy(1990)，31(4)，70-80))。偶联还可 在聚氮杂环主链上被修饰的DOTA-型大环上进行。

用于使所选放射性核素稳定的适宜稳定剂或稳定剂组合的选择和 用量也取决于所选同位素的性质，一般而言，发射高能α或β辐射的 核素将较之发射低能辐射的那些需要更多放射稳定剂。

许多镧系元素均包括具有核性质的放射性同位素，使它们适合用 作放射性治疗剂，它们发射β粒子。其中一些在下表中列出。   同位素   半衰期   (天)   最大b-能量   (MeV)   γ能量   (keV)   b-粒子的近   似范围   (细胞直径)  149-Pm   2.21   1.1   286   60  153-Sm   1.93   0.69   103   30  166-Dy   3.40   0.40   82.5   15  166-Ho   1.12   1.8   80.6   117  175-Yb   4.19   0.47   396   17  177-Lu   6.71   0.50   208   20  90-Y   2.67   2.28   -   150  111-In   2.810   Auger电子发   射体   173，247   ＜5μm

Pm：钷，Sm：钐，Dy：镝，Ho：钬，Yb：镱，Lu：镥，Y：钇，In：铟

制备放射性金属，如β-发射镧系放射性同位素的方法是本领域技 术人员已知的，且已经在别处描述[例如，Cutler C S，Smith CJ， Ehrhardt GJ.；Tyler TT，Jurisson SS，Deutsch E.“镧系放射性 同位素的现有和潜在治疗应用”Cancer Biother.Radiopharm.2000； 15(6)：531-545]。这些同位素中有许多均可以相对较低的成本高产率 生产，且生产出的许多(例如，90Y，149Pm，177Lu)都接近没有载体的比 放射性(即，绝大部分原子都是放射性的)。因为非-放射性原子可与它 们的放射性类似物竞争结合靶组织上的受体，因此使用基本上是同位 素纯(即，没有它们的非放射性同族元素)的同位素则十分有利，从而 将尽可能高剂量放射性释放到靶组织。

本发明含镥和钇β-发射同位素(177Lu和90Y)的稳定放射性治疗衍 生物是特别优选的。

                   8.剂量和添加剂

本发明稳定的放射性药物化合物的适宜给药方案是本领域技术人 员已知的。可使用许多方法给予该稳定的化合物，包括但不限于，单 一或多次IV或IP注射，使用足以使靶向组织成像或在放疗时损害或 除去靶向组织的放射性量，但不对非-靶(正常组织)引起实质性损害。 闪烁扫描成像所需的用量和剂量在前讨论。放疗所需用量和剂量也由 于不同构建体而不同，这取决于所用同位素的能量和半衰期、药剂吸 收和自肌体清除的程度和肿瘤的质量。通常，剂量可为约30-200mCi 的单一剂量直至高达约3居里的累积剂量。

除本申请中所述稳定剂外，本发明的放射性药物组合物可包括生 理学可接受的缓冲液、非-水溶剂、填充剂和其它冻干助剂或增溶剂。 它们可以是液体制剂[冷冻或在室温下]，或被冻干(冷冻干燥)。

除了放射性核素外，包含制备本发明稳定的放射性药物所需的所 有组分的单一、或多个-小瓶的试剂盒是本发明的组成部分。

在优选实施方案中，制备稳定化合物的单一-小瓶试剂盒优选包含 螯合剂/任选的连接基/靶向肽分子，任选的亚锡盐来源或其它药学可 接受的还原剂(如果需要还原，例如，当使用锝或铼时)，并用药学可 接受的酸或碱适当缓冲，调节pH到约3-约9。所用还原剂的量和类型 主要取决于待形成的交换络合物的性质。适宜条件是本领域技术人员 熟知的。在其中一个实施方案中，试剂盒内容物为冻干形式。根据所 用放射性同位素的不同，这种单一小瓶试剂盒可任选含有不稳定的或 交换配体如乙酸盐，葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、甘露糖醇、苹果酸盐、 柠檬酸或酒石酸且还可含有反应调节剂如二亚乙基三胺-五乙酸 (DPTA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，或α，β或γ-环糊精和衍生物，其用于 改进终产物的放射化学纯度和稳定性。该试剂盒还可包含填充剂如甘 露糖醇，它们被设计辅助冷冻干燥过程，以及本领域技术人员已知的 其它添加剂。所选稳定剂或稳定剂组合应含有足量稳定剂，从而防止 产物随着重构产品的有效保存期限而大量分解。

多个-小瓶的试剂盒优选包含相同的大体组分，但在重构放射性药 物时使用不止一个小瓶。例如，一个小瓶可含有在加入高锝酸盐后形 成不稳定的Tc(V)或Re(V)络合物所需的所有成分(例如，亚锡源或其 它还原剂)。将高锝酸盐加入到该小瓶中，且在等待适宜的时间后，将 该小瓶的内容物加入到含螯合剂和靶向肽、以及适于调节pH至其最佳 值的缓冲液和足以防止放射分解损害的稳定剂的第二个小瓶中。反应 约5-60分钟后，形成本发明的络合物。将该多个-小瓶试剂盒中的两 个小瓶的内含物冷冻干燥十分有利。如上所述，反应调节剂、交换配 体、稳定剂、填充剂等可存在于其中一个或两个小瓶中。

                     9.放射性稳定剂

本发明的稳定制剂中要求存在一种或多种所述放射性稳定剂。这 些稳定剂的目的是减缓或防止对未标记和放射性标记的放射性药物的 放射分解损害。虽然某些放射性稳定剂是已知的，但还没有文献揭示 出放射性诊断或放射性治疗的GRP-受体结合化合物需要放射性稳定 剂。然而，已发现需要稳定剂，特别是随着制剂中的放射性量增加， 和当使用β-发射的放射性治疗同位素时。如下面实施例所述，已经鉴 定出许多稳定剂，单独或组合时，可抑制对放射性标记化合物的放射 分解损害。在此时，4种方法是解决该问题的最优选方案。

在第一种方法中，在放射性标记反应后立即将含下列成分混合物 的放射分解稳定溶液加入到放射性标记的化合物中：龙胆酸，抗坏血 酸，人血清白蛋白，苄醇，pH约4.5-约8.5的生理学可接受的缓冲 液或盐溶液，且在优选实施方案中，选自蛋氨酸，硒代蛋氨酸，硒代 半胱氨酸，或半胱氨酸的一种或多种氨基酸。

生理学可接受的缓冲液或盐溶液优选选自磷酸盐、柠檬酸盐或醋 酸盐缓冲液或生理学可接受的氯化钠溶液或其混合物，摩尔浓度为约 0.02M-约0.2M。

在优选实施方案中，使用下列浓度：龙胆酸(2-20mg/mL，最优 选约10mg/mL)，抗坏血酸(10-100mg/mL，最优选约50mg/mL)，人 血清白蛋白(0.1-0.5％，最优选约0.2％(w/v))，苄醇(20-100 μL/mL，最优选约90μL/mL)，pH 4.5-8.0，最优选约pH 5.0的柠檬 酸盐缓冲液(0.05molar)，和D-或L-蛋氨酸，L-硒代蛋氨酸，或L- 半胱氨酸(2mg/mL)。

还可使用所述试剂的生理学可接受盐(例如，抗坏血酸钠或龙胆 酸钠)。可使用D-，L-和DL-形式的氨基酸。事实上，此处特定的氨 基酸包括该氨基酸D-，L-和DL-形式的使用。

试剂苄醇是该制剂中的关键组分且用于两个目的。就具有有限溶 解性的化合物而言，它的其中一个目的是使放射性诊断或放射性治疗 靶向化合物在反应溶液中溶解，而无需加入有机溶剂。它的第二个目 的是提供抑制细菌的作用。这是很重要的，因为期望含本发明放射性 稳定剂的溶液具有较长的重构后稳定性，因此需要存在抑菌剂，以维 持无菌。在优选实施方案中，氨基酸-蛋氨酸，硒代蛋氨酸，半胱氨酸， 和硒代半胱氨酸也是该制剂中的重要组分且在防止对用本放射性稳定 组合稳定的靶分子中蛋氨酰残基的放射分解损害方面起特殊作用。

在第二种方法中，稳定是通过使用具有下列通式的二硫代氨基甲 酸盐实现的：

其中R1和R2各自独立是H；C1-C8烷基；-OR3，其中R3是C1-C8 烷基；或苄基(Bn)(未被取代或任选被水增溶基团取代)，

或其中R1R2N结合是1-吡咯烷基-，哌啶子基-，吗啉基-，1-哌 嗪基-且M可以是H+，Na+，K+，NH4+，N-甲基葡糖胺或其它药学可接 受的+1离子。可选择性地，可使用下面所示形式的化合物，其中M是 生理学可接受的+2氧化态金属，如Mg2+或Ca2+，且R1和R2具有与上 述相同的定义。

可在放射性标记的络合物制备过程中将这些试剂直接加入到反应 混合物中，或在络合完成后加入，或两者皆可。

当直接加入到反应混合物中或在络合物形成后加入时，化合物1- 吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)证实作为稳定剂是最有效的。使用 该化合物作为单一试剂在177Lu-A和177Lu-B的放射性保护中是有效的 (与上述许多研究不同，其中不得不使用试剂的组合)。这些结果是没 有想到的，因为在这些研究之前，没有报道过该化合物用作放射性药 物的稳定剂。如实施例20所示，二硫代氨基甲酸盐如PDTC还提供防 止污染金属干扰标记反应的其它益处。

在第三种方法中，制剂所含的稳定剂是水溶性有机硒化合物，其 中硒为2+氧化态。特别优选的是氨基酸化合物硒代蛋氨酸和硒代半胱 氨酸及它们的酯和酰胺衍生物及其二肽和三肽，它们可在放射性标记 络合物制备前或过程中直接加入到反应混合物中，或在络合物制备后 加入。在标记时的小瓶中或在单独的小瓶中具有这些稳定剂的灵活性 可扩展本发明的应用用于制造放射性诊断或放射性治疗试剂盒。

使用这些硒化合物，将这些试剂与抗坏血酸钠或其它药学可接受 形式的抗坏血酸及其衍生物联合使用十分有效。最优选在络合完成后 加入抗坏血酸盐。实施例22描述了用该试剂组合进行放射性稳定化。 可选择性地，它可被用作上述稳定制剂的组分。如果硒化合物是氨基 酸衍生物如硒代蛋氨酸或硒代半胱氨酸，那么可使用该氨基酸衍生物 的D-，L-和DL异构体。

第四种方法包括水溶性含硫化合物的使用，其中硫为+2氧化态。 优选的硫醇化合物包括半胱氨酸衍生物、巯基乙醇和二硫苏糖醇。这 些试剂是特别优选的是由于它们将蛋氨酸残基的氧化形式(例如，蛋 氨酸氧化物残基)还原回成蛋氨酰残基，由此修复由于放射分解所致 氧化损害的能力。使用这些硫醇化合物，将这些稳定试剂与抗坏血酸 钠或其它药学可接受形式的抗坏血酸及其衍生物联合使用十分有效。 最优选在络合完成后加入抗坏血酸盐。如果硫醇化合物是氨基酸衍生 物如半胱氨酸或半胱氨酸乙酯，那么可使用该氨基酸衍生物的D-，L- 和DL异构体。

在下列实施例中，描述了含有上述四类试剂的实例的稳定制剂的 应用。应理解该四类试剂可分开或联合使用，这根据为所要稳定的放 射性诊断或放射性治疗化合物提供适宜的放射稳定性所需而定。虽然 所提供的实施例主要集中在靶向针对GRP受体家族的含蛋氨酸化合物 的稳定上，但预期本发明范围更广泛得多。这些氧化稳定方法可用于 例如保护来源于肽、单克隆抗体、单克隆抗体片段、适体、寡核苷酸 和小分子的其它放射性诊断剂或放射性治疗剂免被氧化降解(不必仅 仅是蛋氨酸氧化)。

评价潜在稳定剂防止或减缓化合物A的177Lu络合物(被称作 177Lu-A)和化合物B的177Lu络合物(被称作177Lu-B)、它们的铟-标 记的类似物111In-A和111In-B和该类其它化合物分解的能力。以不同 方式评价潜在的清除剂：通过将它们直接加入到用于形成177Lu或111In络合物的反应混合物中，或在放射性金属络合物形成后加入稳定剂(或 两者皆可)。鉴定出了若干有效的稳定剂和稳定剂组合。

表1：作为稳定剂测试的化合物和它们的结构

进行了若干研究。这些研究的目的是找到稳定剂/靶向Lu-络合物 组合，它们在＞20mCi/mL的放射性浓度下，随时间并不显示出显著的 可检测的放射性降解，且在优选实施方案中，找到能够在室温下提供 5天保存期(放射性药物必须制备和运输的合理周期)而没有显著的可 检测的放射性降解的稳定剂和稳定剂组合。选择提供这种稳定性的那 些用于进一步的评价。在所试验的化合物中，L-半胱氨酸和半胱氨酸 衍生物L-半胱氨酸乙酯或L-半胱氨酸甲酯，D-，L-，和DL-蛋氨酸，L- 硒代蛋氨酸，龙胆酸(钠盐)，抗坏血酸(钠盐)和1-吡咯烷二硫代氨 基甲酸铵盐(PDTC)显示出当用作独立的稳定剂时，在该方面最有效。

实践中，含稳定剂混合物的放射分解保护溶液证实特别有效。通 过这类混合物稳定的制剂在室温下维持了极佳的放射化学纯度(RCP) 值(＞95％RCP)长达5天。可在放射性络合物形成后立即加入该稳定混合 物，即两个-小瓶试剂盒的第二个小瓶。该放射分解保护溶液中的试剂 如表2所示：

表2：放射分解保护溶液   试剂   在放射分解保护溶液中的浓度   龙胆酸   10mg/mL   抗坏血酸   50mg/mL   人血清白蛋白   0.2％(w/v)   苄醇   90μL/mL   pH 5.0柠檬酸盐缓冲液   0.05molar   D-DL-或L-蛋氨酸，L-硒代蛋   氨酸，或L-半胱氨酸   2mg/mL

放射分解保护溶液中的稳定性：图4显示用1mL上述放射分解保 护溶液室温温育1mL含104mCi 177Lu-B的反应混合物时所得结果，其 中该放射分解保护溶液含2mg/mL DL-蛋氨酸，10mg/mL龙胆酸，50 mg/mL抗坏血酸，0.2％ HSA和90μl苄醇于0.05M柠檬酸盐缓冲液， pH 5.3中。

在类似研究中，如果放射分解保护溶液中蛋氨酸的浓度升至 3mg/mL且所有其它试剂保持在它们先前的水平，则对于177Lu-A实现了 有效的放射性稳定(RCP＞95％)。当稳定混合物中的蛋氨酸被蛋氨酸，L- 半胱氨酸或L-硒代蛋氨酸替代时，177Lu-A也稳定达5天。

图5数据显示当用下列混合物室温温育55mCi的177Lu-A 5天时 所得结果：1.5mg/mL L-半胱氨酸；5mg/mL龙胆酸；25mg/mL抗坏 血酸；1mg/mL HSA，45μL苄醇于0.05M柠檬酸盐缓冲液，pH 5.3 中。

与使用L-半胱氨酸发现那些相似的结果也可使用含L-硒代蛋氨 酸或L-或D-蛋氨酸替代半胱氨酸的放射分解保护溶液获得。在小鼠 中对含这些成分的稳定溶液进行初步耐受性研究-没有记载急性不良 作用。

试剂在放射分解保护溶液中的作用：研究表明该稳定混合物中的 蛋氨酸，L-硒代蛋氨酸，L-硒代半胱氨酸或L-半胱氨酸在制剂中起特 定殊用，这些试剂似乎可帮助防止GRP受体-结合肽中存在的蛋氨酸残 基氧化形成含蛋氨酸亚砜残基的类似物(见，例如，图6A或图6B)。 因为这些肽的氧化蛋氨酸形式(Met＝O衍生物)无生物活性且具有大大 降低的靶向能力，因此防止这种氧化是至关重要的。

近来已经报道过蛋氨酸是放射性诊断化合物的稳定剂。然而，在 本申请中(参见下文)，确定使用较高放射性水平时，单独的蛋氨酸 不足以保护化合物免受放射分解损害，虽然观察到一定的放射性稳定 作用(见，例如，图3)。然而，加入上述含蛋氨酸的放射分解保护溶 液可产生仅使用蛋氨酸时所不存在的较强保护作用。

含+2氧化态硒的有机化合物：还没有报道过含+2氧化态硒的有 机化合物，包括硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸作为放射性药物的放射性 保护剂，也没有报道过半胱氨酸或其它含+2氧化态硫醇的有机化合物 作为放射性药物的放射性保护剂。发现这些化合物本身是放射性保护 剂，且加入到本文所述的放射分解稳定溶液中时具有重要性质。

半胱氨酸衍生物：L-半胱氨酸，当加入到放射分解稳定溶液中时， 似乎可帮助防止GRP受体-结合肽中存在的蛋氨酸残基氧化。已经评价 了L-半胱氨酸和若干半胱氨酸衍生物(本身，而不是作为稳定混合物 的一部分)实现这种稳定的能力。所有均提供某种程度的放射性保护， 因此预期化合物胱胺二盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、L-半胱 氨酸乙酯盐酸盐、L-半胱氨酸二乙酯二盐酸盐、L-半胱氨酸甲酯盐酸 盐、L-半胱氨酸二甲酯二盐酸盐、L-半胱亚磺酸一水合物具有作为单 独的稳定剂和稳定混合物(如此处所述那些)中的组分的效用。

同样，确定了某些含巯基的化合物，即半胱氨酸、2-巯基乙醇和 二硫苏糖醇(DTT)不仅能防止放射分解诱导的对GRP肽中存在的蛋氨 酸残基的氧化，而且可事实上逆转该过程。因为这些肽的氧化蛋氨酸 形式不是生物活性的，且没有靶向能力，因此这是一种有益的发现(没 有在文献中描述过用于放射性诊断剂或放射性治疗剂的放射性保护)。 这些试剂也是稳定混合物(如此处所述那些)中的潜在化合物。

二硫代氨基甲酸盐：实施例提供证据证实：当在络合物形成后加 入到放射性标记肽中时，二硫代氨基甲酸盐，特别是1-吡咯烷二硫代 氨基甲酸的铵盐，作为单一试剂而没有其它稳定剂，可提供极佳的稳 定性(2个小瓶的试剂盒)。还没有报道过将1-吡咯烷二硫代氨基甲 酸(PDTC)和其它二硫代氨基甲酸盐用作放射性诊断或放射性治疗应用 中的放射性保护剂。PDTC的结构在下面表示。

1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)的结构

还评价了两种其它的二硫代氨基甲酸盐，即N，N-二甲基二硫代氨 基甲酸钠盐和N，N-二乙基二硫代氨基甲酸钠盐且发现其具有放射性 稳定作用，但上面的化合物更优。

如果在络合物形成过程中直接加入到制剂中，该化合物也是十分 有效的。在其是有效的放射性稳定剂的浓度下，它不会干扰络合物形 成。这是个明显的优点，因为可制成单一-小瓶制剂，即一个小瓶中含 所有组分。

二硫代氨基甲酸盐如PDTC还具有清除反应混合物中外来痕量金 属的附加优点。长时间以来已知许多放射性同位素(例如，90Y，111In) 可含有污染性非-放射性金属如Fe，Zn或Cu，它们可与放射性金属竞 争螯合。因为放疗所用的放射性金属的摩尔浓度常常非常低，因此即 使少量污染金属也可对标记反应十分有害。这在配体浓度必须保持最 小从而获得尽可能高的比放射性[即，mCi放射性/mmole配体]的制剂 中特别如此。

例如，如果将PDTC加入到反应混合物中，它可抑制外来金属的干 扰，即使大大过量加入污染金属。该结果是令人吃惊且没有想到的。

预期下面所示通式的任何化合物均具有潜在效用。

其中R1和R2各自独立是-H，-C1-C8烷基，-OR，苯基，或苄基 (Bn)(未被取代或任选被水增溶基团取代)或其中结合的R1R2N＝1-吡 咯烷基-，哌啶子基-，吗啉基-，1-哌嗪基-[任选被水增溶基团取代] 且M＝H+，Na+，K+，NH4+或其它药学可接受的盐形式。

优选的R1、R2组合是：

-Me，-Me；

-Me，-OMe；

-Et，-Et；

-Et，-OEt

-Et，-n-Bu；

-Me，-CH2CH2NMe2；

-Me，-CH2CH2NMe3+；

-Me，-CH2COOMe)，

-Bn，-Bn

预期上述化合物的氧化二聚体[R1R2NC(S)S]2也是有效的。

还预期了下面葡甲胺和葡糖胺化合物的使用。它们具有水溶性的 优点。

可选择性地，可使用下面所示形式的化合物，其中M是生理学可 接受的+2氧化态金属，如Mg2+或Ca2+，且R1和R2具有与上述相同的 定义。

可在放射性标记的络合物制备过程中将这些试剂直接加入到反应 混合物中，或在络合完成后加入，或两者皆可。

化合物PDTC及其药理学可接受的盐是特别优选的。

将稳定剂直接加入到反应混合物中的制剂：在上述绝大多数研究 中，在放射性络合物形成后加入稳定剂。进行一系列研究，其中在螯 合过程中将不同的潜在稳定剂直接加入到反应混合物中。如果可找到 适宜的化合物，这种方法十分优选。

使用该方法评价了下列稳定剂：1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐、 2-羟基苯并噻唑、2，1，3-苯并噻二唑5-硫-D-葡萄糖、胱胺二盐酸盐、 L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、L-半胱氨酸乙酯盐酸盐、L-半胱氨酸二 乙酯二盐酸盐、L-半胱氨酸甲酯盐酸盐、L-半胱氨酸二甲酯二盐酸盐、 L-半胱亚磺酸一水合物、L-抗坏血酸钠(抗坏血酸)、2，5-二羟基苯甲 酸钠盐水合物(龙胆酸)、盐酸硫胺素、还原型L-谷胱甘肽、2-乙基-4- 吡啶硫代酰胺(乙硫异烟胺)、二聚硫氰酸三钠盐九水合物、二甲基二 硫代氨基甲酸钠水合物、二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物、3-羟基 肉桂酸、4-羟基安替比林和乙酰基水杨酸。

发现用于直接加入到制剂中的最佳稳定剂是下列：1-吡咯烷二硫 代氨基甲酸铵盐、D-，L-或D，L-蛋氨酸、三聚硫氰酸三钠盐、L-半 胱氨酸或L-硒代蛋氨酸。这些中，L-硒代蛋氨酸和1-吡咯烷二硫代氨 基甲酸(铵盐)或其药学可接受的盐是最优选的。

因为氨基酸的立体化学对稳定作用并不至关重要，因此先前提到 的所有氨基酸的D-，L-和D，L-混合物都是有效的，如同其药学可接受 的盐。这些氨基酸的简单衍生物，包括但不限于，N-烷基化、N-乙酰 化、C-末端酰胺化或酯化，也是有效的。预期含一个或多个这些氨基 酸的简单二肽、三肽、四肽和五肽也可用于使放射性诊断或放射性治 疗制剂稳定。

本发明的说明书中使用下列缩写词：

乙腈(ACN)

乙醇(EtOH)

龙胆酸(GA)

甘氨酸(Gly)

高压液相色谱(HPLC)

组氨酸(His)

人血清白蛋白(HSA)

次磷酸(HPA)

铟(In)

镥(Lu)

巯基乙醇(ME)

L-或D-蛋氨酸(Met)

磷酸盐缓冲盐水(PBS)

3，4-吡啶二羧酸(钠盐)(PDCA)

1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)

放射化学纯度(RCP)

L-硒代蛋氨酸(Se-Met)

锝(Tc)

三氟乙酸(TFA)

三(羧乙基)膦(TCEP)

三苯甲基(Trt)

色氨酸(Trp)

                         实施例

材料：

三氟乙酸(TFA)，1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)，2-羟基苯 并噻唑，2，1，3-苯并噻二唑，5-硫-D-葡萄糖，胱胺二盐酸盐，L-半 胱氨酸盐酸盐一水合物，L-半胱氨酸乙酯盐酸盐，L-半胱氨酸二乙酯 二盐酸盐，L-半胱氨酸甲酯盐酸盐，L-半胱氨酸二甲酯二盐酸盐，L- 半胱亚磺酸一水合物，L-抗坏血酸钠(抗坏血酸)，2，5-二羟基苯甲酸 钠盐水合物(龙胆酸)，盐酸硫胺素，还原型L-谷胱甘肽，2-乙基-4- 吡啶硫代酰胺(乙硫异烟胺)，三聚硫氰酸三钠盐九水合物，二甲基二 硫代氨基甲酸钠水合物，二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物，3-羟基 肉桂酸，4-羟基安替比林和乙酰基水杨酸是从Sigma-Aldrich Chemical Company购买的。冰醋酸(超纯)是从J.T.Baker.购买的。 乙腈和无水醋酸钠(超纯)是从EM Science购买的。D-蛋氨酸是从 Avocado Research Chemicals Ltd购买的。L-硒代蛋氨酸是从 Calbiochem购买的。甲醇、柠檬酸(无水的)和柠檬酸钠是从Fisher Scientific Company购买的。人血清白蛋白(HSA)是从Sigma购买的。 所有试剂都如收到时使用。高-比放射性177LuCl3(溶于0.05N HCl中) 是从the University of Missouri Research Reactor，Columbia， Missouri获得的。111InCl3(溶于0.05N HCl中)是从PerkinElmer或 Mallinckrodt获得的。

化合物A(或化合物A)是未金属化的配体 DOTA-Gly-ACA-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(ACA＝3-氨基 -3-脱氧胆酸)。化合物B(或化合物B)是未金属化的配体 DOTA-Gly-Abz4-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(Abz4＝4-氨 基苯甲酸)。从这些化合物制备的放射性标记的络合物此处以同位素- 化合物字母形式表示，即，177Lu-A是 DOTA-Gly-ACA-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2的177Lu络合物) 且177Lu-B是DOTA-Gly-Abz4-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 的177Lu络合物。化合物A和B的合成在2003年1月13日提交的、申 请人的同时待审专利申请系列号No.10/341,577中描述，其全部引入 此处作为参考。

分析方法：

HPLC方法1使用HP-1100 HPLC系统(Agilent)，带有可变波长检 测器(λ＝280nm)和Canberra放射性-检测器、YMC Basic S-5柱(4.6mm ×150mm，5μm)，流动相A：柠檬酸钠水溶液(0.02M，pH 3.0)，和 B：20％甲醇溶于乙腈的溶液。流动相流速为1mL/分。梯度从32％B开 始，30分钟内斜升至34％B，5分钟内从34％-40％B，5分钟内回到32 ％B，然后保持5分钟用于再次-平衡。注入体积为20μL。

HPLC方法2包括使用HP-1100 HPLC系统，带有可变波长检测器 (λ＝280nm)和Canberra放射性-检测器、YMC Basic S-5柱(4.6mm× 150mm，5μm)，流动相A：0.1％ TFA和0.1％乙腈溶于水的溶液，和B：0.1％ TFA溶于乙腈的溶液。流动相流速为1mL/分，梯度从29％B开始，20 分钟内达到32％B，2分钟内回到29％B，然后保持5分钟用于再次-平 衡。注入体积为20μL。

HPLC方法3包括使用HP-1100 HPLC系统，带有可变波长检测器 (λ＝280nm)和Canberra放射性-检测器、C18柱(4.6mm×250mm，5μm， VYDAC，cat#218TP54)，流动相A：0.1％TFA水溶液，B：0.1％TFA溶于 乙腈的溶液。流动相流速为1mL/分，梯度从29％B开始，20分钟内达 到32％B，3分钟内回到29％B，然后保持8分钟用于再次-平衡。注入 体积为20μL。

HPLC方法4包括使用HP-1100 HPLC系统，带有可变波长检测器 (λ＝280nm)和Canberra放射性-检测器，C18柱(4.6mm×250mm，5μm， VYDAC，Cat#218TP54)，流动相A：0.1％TFA水溶液，B：0.1％TFA溶于 乙腈的溶液。流动相流速为1mL/分。梯度从21％B开始，20分钟内达 到24％B，3分钟内回到21％B，然后保持8分钟用于再次-平衡。注入 体积为20μL。

HPLC方法5包括使用HP-1100 HPLC系统，带有可变波长检测器 (λ＝280nm)和Canberra放射性-检测器、Stellar Phases Rigel C18 柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相A：0.1％ TFA和0.1％ ACN溶于水 的溶液，B：0.1％TFA溶于ACN的溶液。流动相流速为1mL/分。梯度从 20％B开始，20分钟内斜升至24％B，2分钟内回到20％B，然后保持3 分钟用于再次-平衡。注入体积为10λL。

                    实施例1

当加入到预-形成的177Lu-GRP结合化合物177Lu-A或177Lu-B中时，各种 氨基酸的放射性保护作用的比较

实施例1显示对于单独加入到177Lu-A或177Lu-B的溶液中，然后 室温温育48小时的一系列氨基酸获得的结果，以及未稳定化对照的结 果。在这些反应中，氨基酸浓度为6.6mg/mL，177Lu-A和177Lu-B具有～ 20mCi/mL的浓度，且每次反应中使用3.5mCi 177Lu。

各氨基酸L-蛋氨酸，L-硒代蛋氨酸，L-半胱氨酸HCl.H2O，L-色 氨酸，L-组氨酸，和甘氨酸的溶液是在10mM Dulbecco’s磷酸盐-缓 冲盐水，pH7.0[PBS]中以10mg/mL浓度制备的。

177Lu-A和177Lu-B是通过向反应小瓶中加入300μL 0.2M NaOAc(pH 5.0)，40μg化合物A或B和20mCi的177LuCl3而制备的。100℃温 育该混合物5分钟，然后冷却至室温。然后通过加入10μL 10％ Na2EDTA.2H2O溶于水的溶液而清除(螯合)反应溶液中的游离(未络合 的)177Lu。将50μL反应溶液等分试样(～3.5mCi)与100μL的上述氨基 酸溶液其中一种或PBS对照在2-mL自动取样小瓶中混合。各样品的最 终放射性浓度为～20mCi/mL。将该样品保存在自动取样室中，使用 HPLC方法3(177Lu-A)或HPLC方法4(177Lu-B)分析它们经48小时的稳 定性。该研究在第48-小时时间点的色谱图在图7中表示。

在没有稳定剂的对照反应中，室温下放射化学纯度(RCP)在24小 时内从＞95％降至1.3％。相比之下，当加入蛋氨酸、L-硒代蛋氨酸或 半胱氨酸时，RCP保持大于90％达48小时。

下面表3显示在本研究中，t＝0、24和48小时，对于177Lu-A所 有样品获得的RCP值。

表3：氨基酸作为177Lu-A的放射性保护剂的评价。通过向～20mCi/mL 放射性浓度的177Lu-A中加入不同的各种氨基酸(6.6mg/mL)，接着室温 保存长达48小时(共3.5mCi)进行的稳定性比较。   加入的稳定   剂   0-1h   24-h   48-h   Met＝O   (％)   RCP   (％)   Met＝O   (％)   RCP   (％)   Met＝O   (％)   RCP   (％)   蛋氨酸   0   100   0.7   99.3   5.1   94   Se-Met   0   100   0.9   99.1   0.1   99.9   半胱氨酸   0   100   1.2   98.8   5.7   94.3   色氨酸   4.5   95.5   46.8   51.4   81.8   18.2   甘氨酸   3.6   96.4   24.2   14.6   13.8   0   组氨酸   7.5   92.5   44   4.6   29.5   0   对照(PBS)   4.5   76.5   1.8   1.3   0   0

*仅列出了RCP和蛋氨酸氧化(Met＝O)形式的177Lu-A的百分比；剩 余放射性为未鉴定的降解剂形式。这些结果证实所试验的氨基酸使 177Lu-A和177Lu-B稳定的能力变化广泛。在本研究所试验的氨基酸中， 蛋氨酸，L-硒代蛋氨酸或L-半胱氨酸针对177Lu-标记肽的放射分解提 供最高程度的保护。在本研究中，发现色氨酸-先前被报道为有效稳定 剂的化合物令人惊讶地不能保护靶向肽中存在的蛋氨酸残基免受氧 化，而半胱氨酸，蛋氨酸和硒代蛋氨酸是有效的。

                     实施例2

L-蛋氨酸对177Lu-A放射性保护的放射性保护作用的进一步评价(50 mCi/2mL)

以实施例1的结果为基础，研究在络合物形成后加入时，L-蛋氨 酸保护177Lu-A的能力。与上述实施例1相比，在本反应中，使用5mCi 177Lu-A，而不是3.5mCi。

177Lu-A是通过向1mL 0.2M NaOAc，pH 5.0中加入～70μg化合物 A和50mCi 177LuCl3(肽与镥的摩尔比为3∶1)而形成的。100℃加热该 混合物5分钟，然后在水浴中冷却至室温，将1mL 5mg/mL L-蛋氨酸 水溶液和1mg Na2EDTA.2H2O加入到反应小瓶中。图8中的色谱图和下 面表4中的数据证实当使用HPLC方法3通过反相HPLC分析时，室温 下5天内观察到的放射化学纯度的变化。表4概括了图8所示结果。 表4：室温温育5天内，通过加入2.5mg/mL L-蛋氨酸[Met]稳定的 177Lu-A(50mCi，2mL)(％RCP)：   稳定剂   ％ RCP  t＝0-5天   0-d   1-d   2-d   5-d   5mg Met   96.1   53.5   26.9   0

在实施例1中，2.5mg/mL浓度的蛋氨酸能够使3.5mCi 177Lu-A对 抗放射分解而稳定5天。然而，实施例2的结果显示当放射性量增加 至50mCi时，蛋氨酸不能使相同的络合物稳定。当仅使用L-蛋氨酸作 为稳定剂时，5天内观察到络合物几乎完全分解。现在的实践指示使 用100mCi或更多放射性标记肽用于放射性治疗应用，很明显需要更有 效的稳定剂或稳定剂组合。

使用L-半胱氨酸，硒代蛋氨酸，抗坏血酸钠，龙胆酸和HSA进行 相似的研究。单独使用均不能对所试验的高放射性水平提供充足的稳 定化。

                     实施例3

当加入到预-形成的177Lu-A中时，各种试剂放射性保护作用的评价 (3.5mCi)

本实验中试验的潜在放射分解保护剂的列表如下：

1. 抗坏血酸(钠盐形式)

2. 龙胆酸(钠盐形式)

3. 人血清白蛋白(HSA)

4. 3，4-吡啶二羧酸(钠盐)(PDCA)

5. 10％乙醇水溶液

6. 2％次磷酸(HPA)

7. 2％巯基乙醇(ME)

8. 三(羧乙基)膦(TCEP)

9. 对照(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.0)

试剂1-5先前已报道过作为放射性药物的稳定剂可能有效。试剂 6-8的化合物被试验确定它们作为还原剂用于因放射分解形成的任何 蛋氨酸亚砜残基的能力。试剂9用于未稳定化的对照。

177Lu-A是通过将300μL 0.2M NaOAc(pH 5.0)，40μg化合物A 和20mCi 177LuCl3加入到反应小瓶中而制备的。100℃温育该混合物5 分钟，然后冷却至室温。游离177Lu是通过加入10μL 10％ Na2EDTA·2H2O清除的。将50μL反应溶液等分试样(～3.5mCi)和100μL 10mg/mL 上述其中一种试剂溶于10mM，pH7.0 PBS的溶液加入到2-mL自动取样 小瓶中。可选择性地，就试剂5-7而言，调节溶液使其含有10％乙醇、 2％次磷酸或2％巯基乙醇。终放射性浓度为约20mCi/mL。将样品保存在 自动取样室中，分析它们随时间的稳定性。所得结果在下面表5中表 示。

表5：室温温育时，在～20mCi/mL放射性浓度和6.6mg/mL浓度的潜在 非-氨基酸放射分解保护剂(或另外指明*)条件下，177Lu-A随时间变 化的稳定性   0-h   24-h   48-h   Met＝O   (％)   RCP   (％)   Met＝O   (％)   RCP   (％)   Met＝O   (％)   RCP   (％)   抗坏血酸   2.5   97.5   11.8   72.1   14.2   24.9   龙胆酸   2.4   97.6   9.2   90.8   17.2   82.8   HSA   4.4   95.6   13   20   6.2   2.5   PDCA   3.4   86.6   5   14.1   N/A   N/A   10％乙醇   1.4   98.6   7.2   92.8   13.5   80.6   TCEP**   7.2   96.1   0   23.4   0   6.2   ％HPA***   0   0   0   0   0   0   2％ ME   0.1   91.5   9.3   81.8   13.8   76.2   对照(PBS)   2.5   92.5   0   0   0   0

*乙醇、次磷酸(HPA)和巯基乙醇(ME)为液体形式

**TCEP＝三羧乙基膦

**2％次磷酸溶液是在0.1M，pH7.8磷酸缓冲液中制备的，达到5.5 的终pH。

PBS＝磷酸盐缓冲盐水，pH7.0

上面表5表示在络合物形成后加入到177Lu-A中时，测定若干混合 物放射性稳定作用的比较研究的结果。研究了这些添加剂防止RCP降 低的能力和抑制177Lu-A中蛋氨酸残基氧化的能力。

发现在所用试验条件下，所试验的8种试剂[抗坏血酸(钠盐)，龙 胆酸(钠盐)，人血清白蛋白(HSA)，三(羧乙基)膦(TCEP)，3，4-吡啶 二羧酸(钠盐)(PDCA)，2％次磷酸(HPA)，2％巯基乙醇(ME)，或10％ 乙醇水溶液]均不能提供适宜的放射性稳定性(RCP＞90％)达48小时。该 结果是没有预料到的，因为龙胆酸，抗坏血酸，HAS和3，4-吡啶二羧 酸都已经被其他人报道过可为其它放射性药物的放射分解提供令人满 意的保护。虽然与PBS对照相比，观察到了某些放射性保护，但先前 报道的稳定剂抗坏血酸，龙胆酸和HSA不足以维持RCP值大于90％的 稳定性达48小时。试剂3，4-吡啶二羧酸，先前被报道为有效的放射 性稳定剂，被发现严重干扰标记反应。巯基乙醇和乙醇提供某种程度 的放射性稳定化，但同样，发现48小时后RCP值＜90％。TCEP和HPA 在所用条件下无效。

                         实施例4

含蛋氨酸的放射分解保护溶液对177Lu-A和177Lu-B的RCP(50mCi)的作用

在实施例1-3所述研究中，发现没有单一一种所试验的试剂作为 可为177Lu-GRP结合肽在高放射性水平下的放射分解提供保护的放射性 保护剂完全有效，特别是为末端蛋氨酸残基的氧化提供保护。

制备的放射分解保护溶液含有10mg/mL龙胆酸；50mg/mL抗坏 血酸钠盐；2mg/mL HSA；2.98mg/mL L-蛋氨酸，0.9％(v∶v)苄醇和 1mg/mL Na2EDTA.2H2O，溶于0.05M，pH 5.3柠檬酸盐缓冲液中。向 7-mL小瓶中加入0.2M NaOAc缓冲液(1.0mL，pH 5.0)，化合物A或 化合物B(～70μg)和50mCi 177LuCl3。100℃温育该混合物5分钟， 然后在水浴中冷却至室温。立即加入1-mL放射分解保护溶液的等分试 样。将反应小瓶保存在自动取样室中，并使用HPLC方法3和4，通过 反相HPLC分析随时间的稳定性。对于177Lu-B获得的结果在图9的色 谱图中表示。

对于177Lu-A获得相似结果(见下面表6)。

表6：室温温育5天内，177Lu-A或177Lu-B(50mCi/2mL)在含L-蛋氨酸的 放射分解保护溶液中的稳定性比较(％RCP)   ％ RCP   0-d   1-d   2-d   5-d  177Lu-A   100   100   100   100  177Lu-B   99.8   99.3   99.6   99.8

这些结果证实当把含龙胆酸，抗坏血酸，苄醇，蛋氨酸和HSA于 柠檬酸盐缓冲液中的放射分解保护溶液加入到177Lu-A或177Lu-B中时， 获得极佳的放射稳定性，5天内RCP没有显著降低。该结果是没有预 料到的，因为没有一种试剂本身能在室温下提供至少5天的稳定性， 即120小时后的放射化学纯度＞99％。基于各试剂的功效不能预测出由 含蛋氨酸的放射分解保护溶液所提供的放射稳定性。

                      实施例5

含L-硒代蛋氨酸的放射分解保护溶液对177Lu-A和177Lu-B(50mCi/2mL) 的RCP的作用

按照实施例4所述，制备50mCi水平的177Lu-A和177Lu-B。将反 应混合物冷却至室温后立即加入1mL放射分解保护溶液，含10mg/mL 龙胆酸；50mg/mL抗坏血酸钠盐；2mg/mL HSA；3.92mg/mL L-硒 代蛋氨酸，0.9％(v∶v)苄醇和1mg/mL Na2EDTA.2H2O，溶于0.05M， pH 5.3柠檬酸盐缓冲液中。将反应小瓶保存在自动取样室中，并使用 HPLC方法3[177Lu-A]或4[177Lu-B]，通过RP-HPLC分析随时间的稳定性。 结果在下面表7中表示。

表7：室温温育5天内，177Lu-A或177Lu-B在含L-硒代蛋氨酸的放射分 解保护溶液中的稳定性(％ RCP)   ％RCP   络合物   0-d   1-d   2-d   3-d   5-d  177Lu-A   97.6   98.2   97.5   97.8   99.4  177Lu-B   95.8   95.7   96.2   96.7   98.4

这些结果是没有预料到的，因为没有一种试剂本身能在室温下提 供至少5天的稳定性，即120小时后放射化学纯度＞98％。基于各试剂 的功效不能预测含硒代蛋氨酸的放射分解保护溶液所提供的放射稳定 性。

                        实施例6

含L-半胱氨酸的放射分解保护溶液对177Lu-A和177Lu-B(50mCi/2mL)的 RCP的作用

按照实施例4所述制备50mCi水平的177Lu-A和177Lu-B。将反应混 合物冷却至室温后立即加入1mL放射分解保护溶液，含10mg/mL龙胆 酸；50mg/mL抗坏血酸钠盐，2mg/mL HSA，(2mg/mL或3.52mg/mL)L- 半胱氨酸，0.9％(v/v)苄醇和1mg/mL Na2EDTA.2H2O，溶于0.05M， pH 5.3柠檬酸盐缓冲液中。将反应小瓶保存在自动取样室中，并使用 HPLC方法3[177Lu-A]或4[177Lu-B]通过RP-HPLC分析随时间的稳定性。 对于177Lu-A获得的结果在下面表8中表示。对于177Lu-B获得类似的 结果。

表8：室温温育5天内，177Lu-A(50mCi/2mL)在含1.0或1.75mg/mL L- 半胱氨酸的放射分解保护溶液中的稳定性(％RCP)   ％ RCP   L-半胱氨   酸浓度   (mg/mL)   0-d   1-d   2-d   3-d   5-d   1.0   100   99.9   98.4   97.5   96.9   1.75   100   99.9   98.9   95.8   93.3

这些结果是没有预料到的，因为没有一种试剂本身能在室温下提 供至少5天的稳定性，即120小时后放射化学纯度＞93％。基于各试剂 的功效不能预测含半胱氨酸的放射分解保护溶液所提供的放射稳定 性。

                     实施例7

放射分解保护溶液对177Lu-A(50mCi/2mL)的RCP的作用

按照实施例4所述，制备50mCi水平的177Lu-A。将反应混合物冷 却至室温后，立即加入1mL放射分解保护溶液，含10mg/mL龙胆酸； 50mg/mL抗坏血酸钠盐；2mg/mL HSA；0.9％(v∶v)苄醇和1mg/mL Na2EDTA.2H2O，溶于0.05M，pH 5.3柠檬酸盐缓冲液中。将反应小瓶 保存在自动取样室中，通过RP-HPLC分析随时间的稳定性。结果在下 面表9中表示。

表9：室温温育5天内，177Lu-A(50mCi/2mL)在放射分解保护溶液中 的稳定性(％ RCP)   ％ RCP   L-半胱氨   酸浓度   (mg/mL)   0-d   1-d   2-d   3-d   5-d   0   100/100   94.9/99.2   93.6/97.3   ND/95.1   90.4/92.9

ND＝没有测定

实施例4-7所示结果证实，向实施例7所述的放射分解保护溶液 中加入蛋氨酸(实施例4)，硒代蛋氨酸(实施例5)或半胱氨酸(实 施例6)可提供超过没有加入这些氨基酸制备的放射分解保护溶液的 附加益处。

                       实施例8

当在放射性标记后加入时，HSA或AA对177Lu-B放射稳定性的作用：

在本实施例中，在非常高的浓度(50-100mg/mL)下，单独试验了 放射分解稳定溶液中两种试剂-HSA和抗坏血酸的作用，两者的放射性 保护能力都是已知的。再次发现作为单独的试剂它们不足以维持 177Lu-B的RCP值＞95％超过24小时。177Lu-B配制如下：向5-mL玻璃小 瓶中加入1mL 0.2M NaOAc缓冲液(pH 4.8)，12μL(50mCi)177LuCl3和30μL 5mg/mL化合物B溶于0.01N HCl的溶液，100℃下加热该 小瓶5分钟。在水浴中冷却后，通过加入1mL下面其中一种稳定溶液 而1∶1稀释该反应混合物。然后将样品保存在自动取样器中(其维持在 高于室温～6℃的平均温度下)并通过RP-HPLC分析长达120小时。

使用HSA和抗坏血酸进行研究：在该研究中，评价并比较了3种 不同的稳定溶液(a，b，或c)。

a)将人血清白蛋白(HSA)溶于含1mg/mL Na2EDTA·2H2O的N2-吹 洗的0.05M，pH 5.0柠檬酸盐缓冲液中，浓度为100mg/mL

b)将抗坏血酸钠(AA)99+％溶于含1mg/mL Na2EDTA·2H2O的N2- 吹洗的0.05M，pH 5.0柠檬酸盐缓冲液中，浓度为100mg/mL

c)将抗坏血酸钠99+％溶于含0.9％苄醇和1mg/mL Na2EDTA·2H2O的N2-吹洗的0.05M，pH 5.0柠檬酸盐缓冲液中，浓度为50mg/mL

所得RCP结果在表10中表示。

表10：与稳定溶液a-c 1∶1混合的177Lu-B的稳定性，a)终浓度50mg/mL 的HAS，b)终浓度50mg/mL或c)25mg/mL的AA。终177Lu-B浓度为 25mCi/mL：   用所示稳定溶液   1∶1稀释的177Lu-B   (％ RCP)   0-h   3-h   6-h   9-h   12-h   24-h   48-h   72-h   120-h   稳定溶液a   100mg/mL HSA   100   88.3   59.6   39.1   24.0   2.9   0   0   0   稳定溶液b   100mg/mL AA   99.9   99.9   99.7   99.1   98.7   96.1   93.6   92.0   91.7   稳定溶液c   50mg/mL AA+BA   99.9   99.9   99.8   99.1   98.1   96.0   92.5   92.8   92.2

上面实施例8的结果表明单独的HSA或单独的抗坏血酸不能维持 RCP＞95％超过24小时。

实施例1-8的结果表明如果在标记后加入，含龙胆酸，抗坏血酸， 人血清白蛋白，苄醇和半胱氨酸，硒代蛋氨酸，或蛋氨酸和(乙醇于 0.05M柠檬酸盐缓冲液中)的放射分解保护溶液可使177Lu-A或177Lu-B稳定，且这种混合物可提供较之任一试剂分开加入时更好的放射稳定 性。

这种方法需要2个-小瓶的试剂盒，一个小瓶含制备放射性标记产 物所需的试剂，另一个小瓶含放射分解保护溶液，其在络合物形成后 加入。因此进行了若干研究，以尝试并找到单一-小瓶的试剂盒，其中 形成177Lu-A或177Lu-B所需的试剂和使所得络合物对抗放射分解稳定 所需的试剂合并到单一小瓶中。

                        实施例9

当在有L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，龙胆酸，抗坏血酸，L-硒代蛋氨 酸或D-蛋氨酸(1mg/mL)存在(单独地，作为稳定剂)的条件下制备 时，177Lu-A的制备、标记效率和稳定性

在本研究中，通过将1.0mg/mL各试剂直接加入到含少量放射性 (3.5mCi)的放射性标记反应物中而单独试验稳定缓冲液中的各试剂 (半胱氨酸，龙胆酸，抗坏血酸，硒代蛋氨酸和蛋氨酸)。均没有干扰 标记反应，但只有硒代蛋氨酸和蛋氨酸在所用低放射性水平下，随时 间显示良好的保护。1mg/mL浓度的各稳定剂是在醋酸钠(NaOAc)缓冲 液(0.2M，pH 4.8)中制备的。向铅屏4-mL小瓶中加入200μL各NaOAc- 稳定剂溶液、2.72-3.64mCi 177LuCl3和4.6-6μg化合物A(溶于水中)。 所有样品中化合物A与镥的比例为3∶1。将反应混合物加热至100℃ 5 分钟，然后在室温水浴中冷却5分钟。向各样品中加入10μL 2％ Na2EDTA.2H2O水溶液，然后各自分成2份100-μL等分试样。其中一份 等分试样通过HPLC(方法1)分析，然后室温保存在密封铅容器中24 小时。另一份等分试样冷冻(-10℃)保存24小时。在t＝24h时分析各 样品。所得放射化学纯度(RCP)百分比数据在表11中列出。

表11：在有L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，龙胆酸，抗坏血酸，L-硒 代蛋氨酸或D-蛋氨酸(1mg/mL)存在(单独地，作为稳定剂)的条件下 制备时，177Lu-A(2.7-3.7mCi)的RCP数据   (1mg/mL)   稳定剂   mCi  177Lu   化合物A   浓度   (μg/mL)   RCP ％   t＝0h   t＝24h   (室温)   t＝24h   (冷冻)   L-半胱氨酸   3.64   25.4   100   83.3   82.1   龙胆酸   2.76   23.0   100   64.9   84.3   抗坏血酸   3.19   30.0   98.7   ND   ND   L-Se-Met   2.72   23.0   100   100   99.2   D-蛋氨酸   2.76   23.0   100   100   100

ND＝没有测定

结果证实5种稳定剂均不会干扰标记反应，且均在所用1mg/mL 浓度下，在反应过程中提供稳定性。然而，无论是室温还是冷冻，在 24小时保存期限内，在该浓度下，L-硒代蛋氨酸和D-蛋氨酸较之所试 验的其它物质是更好的稳定剂。没有采集使用抗坏血酸保存的样品的 数据。

                       实施例10

在有L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，龙胆酸，抗坏血酸，L-硒代蛋氨酸 或D-蛋氨酸(2.5mg/mL)存在(单独地，作为稳定剂)的条件下制备 时，177Lu-A的制备、标记效率和稳定性

在实施例10和11中，通过向含少量放射性(3.5mCi)的放射性标 记反应物中直接加入2.5mg/mL(实施例10)或5.0mg/mL(实施例11) 各试剂，单独试验稳定缓冲液中的试剂(半胱氨酸，龙胆酸，抗坏血酸， 硒代蛋氨酸或蛋氨酸)。当稳定剂的量增加至2.5mg/mL和5mg/mL， 以降低较高放射性水平下放射分解损害的可能性时，再次发现龙胆酸， 抗坏血酸和半胱氨酸不能提供24小时的适宜放射性保护，甚至在放射 性量低于5mCi时。在醋酸钠(NaOAc)缓冲液(0.2M，pH 4.8)中制备各 稳定剂，浓度为2.5mg/mL。向铅屏4mL小瓶中加入200μL各NaOAc- 稳定剂溶液、3.58mCi 177LuCl3(avg)和5.08μg化合物A(溶于水中)。 所有样品的化合物A与镥的比例为3∶1。将反应混合物加热至100℃ 5 分钟，然后冷却，用Na2EDTA·2H2O处理，并如实施例9所述再分并保 存。所得放射化学纯度(RCP)百分比数据在表12中列出。

表12：在有L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，龙胆酸，抗坏血酸，L-硒 代蛋氨酸或D-蛋氨酸(2.5mg/mL)存在作为稳定剂的条件下制备时， 177Lu-A的RCP数据   (2.5mg/mL)   稳定剂   mCi  177Lu   化合物A   浓度   (μg/mL)   RCP ％   t＝0h   t＝24h   (室温)   t＝24h   (冷冻)   L-半胱氨酸   3.6   24.8   100   88.3   51.0   龙胆酸   3.6   24.8   100   78.6   82.8   抗坏血酸   3.6   24.8   ND   88.1   78.4   L-硒代-蛋   氨酸   3.6   24.8   95.7   95.6   94.7   D-蛋氨酸   3.6   24.8   100   99.6   100

ND＝没有测定

结果证实在2.5mg/mL浓度下，L-半胱氨酸，龙胆酸和D-蛋氨酸 不会干扰标记反应并可在反应过程中提供稳定性。L-硒代蛋氨酸稍会 干扰或在反应过程中提供较低的稳定性。无论是室温还是冷冻，在24 小时保存期限内，在该浓度下，L-硒代蛋氨酸和D-蛋氨酸是更好的稳 定剂。没有采集使用抗坏血酸、t＝0样品的数据。

                        实施例11

在有L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，龙胆酸，抗坏血酸，L-硒代蛋氨酸 或D-蛋氨酸(5mg/mL)存在作为稳定剂的条件下制备时，177Lu-A的制 备、标记效率和稳定性

在醋酸钠(NaOAc)缓冲液(0.2M，pH 4.8)中制备各稳定剂，浓度 为5mg/mL。向铅屏4mL小瓶中加入200μL各稳定剂溶液、3.55mCi 177LuCl3(avg)和5.44μg化合物A(溶于水中)。使用各稳定剂制备各 样品的第二组平行测定品。向这些中加入4.37mCi 177LuCl3(avg)和 6.7μg(avg)化合物A(溶于水中)。所有样品的化合物A与镥的比例 为3∶1。将反应混合物加热至100℃ 5分钟，然后在室温水浴中冷却5 分钟。向各样品中加入10μL 2％ Na2EDTA·2H2O水溶液，然后各自通过 HPLC分析(第一组平行测定品用方法1，第二组平行测定品用方法2)。 保存第二组平行测定品并在t＝24h时再次分析。所得放射化学纯度 (RCP)百分比数据在表13中列出。

表13：在有作为稳定剂的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，龙胆酸，抗 坏血酸，L-硒代蛋氨酸或D-蛋氨酸(5mg/mL)存在的条件下制备时， 177Lu-A的RCP数据   (5mg/mL)   稳定剂   平行测定1   RCP ％   t＝0h   平行测定2   RCP ％   t＝0h   平行测定2   RCP ％   t＝24h   L-半胱氨酸   93.3   91.0   67.4   龙胆酸   93.9   96.6   75.2   抗坏血酸   87.6   30.2   24.5   L-硒代蛋氨酸   57.5   60.6   57.1   D-蛋氨酸   100   97.6   80.7

结果证实在5mg/mL浓度下，D-蛋氨酸不会干扰标记反应并在反应 过程中提供稳定性。L-半胱氨酸，龙胆酸，抗坏血酸和L-硒代蛋氨酸 或者干扰标记反应或在反应过程中提供较低的稳定性。除抗坏血酸外， t＝0h时间点时平行测定之间的再现性对各稳定剂是适当的。抗坏血酸 和L-硒代蛋氨酸在24小时保存期内(比较它们t＝0h时的RCP％值) 提供较之L-半胱氨酸，龙胆酸或D-蛋氨酸更好的稳定性。

                         实施例12

络合物制备后，使用2-乙基-4-吡啶硫代酰胺(乙硫异烟胺)，三聚 硫氰酸三钠盐九水合物，二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物或二乙基二 硫代氨基甲酸钠三水合物作为稳定剂稳定时，177Lu-A的稳定性

在本研究中检测含-C＝S部分的化合物[二硫代氨基甲酸盐和乙硫 异烟胺]。在络合物制备后加入时，化合物乙硫异烟胺，三聚硫氰酸和 二甲基二硫代氨基甲酸及其二乙基类似物均可提供良好的放射稳定 性。

在水中制备各稳定剂，浓度为10mg/mL。将乙硫异烟胺溶于EtOH中。向铅屏的4mL小瓶中加入500μL NaOAc缓冲液(0.2M，pH 4.8)， 19.6mCi 177LuCl3和30μg化合物A(溶于水中)。化合物A与镥的比例 为3∶1。将反应混合物加热至100℃ 5分钟，然后在室温水浴中冷却5 分钟。冷却后，加入20μL 2％ Na2EDTA·2H2O的水溶液，然后将4份 100-μL样品等分试样(各2.78mCi 177Lu avg)转移到单独的自动取样 小瓶中。向等分试样中加入100μL其中一种稳定剂溶液(1mg稳定剂)。 通过HPLC(方法2)分析各等分试样(t＝0h)并室温保存48小时。在 t＝24h和48h时再次分析所有样品。所得放射化学纯度(RCP)百分比数 据在表14中列出。

表14：络合物制备后，使用2-乙基-4-吡啶硫代酰胺(乙硫异烟胺)， 三聚硫氰酸三钠盐九水合物，二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物或二乙 基二硫代氨基甲酸钠三水合物作为稳定剂稳定时，177Lu-A的RCP数据 (13.9mCi/mL)   稳定剂(5mg/mL)   RCP ％   t＝0h   RCP ％   t＝24h   RCP ％   t＝48h   乙硫异烟胺   97.4   97.0   94.7   三聚硫氰酸三钠盐九水合物   96.9   95.9   100   二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物   97.3   97.1   96.6   二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物   97.8   97.1   96.2

结果证实，在5-mg/mL浓度下，各稳定剂为13.9mCi/mL放射性浓 度的177Lu-A提供稳定性长达48小时保存期。

                         实施例13

在有作为稳定剂的2-乙基-4-吡啶硫代酰胺(乙硫异烟胺)，三聚硫 氰酸三钠盐九水合物，二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物或二乙基二硫 代氨基甲酸钠三水合物存在的条件下制备时，177Lu-A的制备、标记效 率和稳定性

在实施例12中，在放射性标记后加入含-C＝S部分的化合物[二硫 代氨基甲酸盐和乙硫异烟胺]并发现是有效的放射性稳定剂。在实施例 13中，在放射性标记前或放射性标记时，将这些化合物直接加入到反 应混合物中。

10mg/mL三聚硫氰酸三钠盐九水合物，二甲基二硫代氨基甲酸钠 水合物和二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物的溶液是通过将它们溶于 水中制备的。乙硫异烟胺是通过将它溶于EtOH中制备的，浓度为 10mg/mL。向各铅屏的4-mL小瓶中加入200μL NaOAc缓冲液(0.2M， pH4.8)，100μL稳定剂溶液(1mg稳定剂)，5.25mCi 177LuCl3(avg)和 8.7μg(avg)化合物A(溶于水中)。另一份样品是通过向其中仅加入 100μL乙醇(没有稳定剂)制备的，用作对照样品。所有样品的化合 物A与镥的比例为3∶1。将反应混合物加热至100℃ 5分钟，然后在 室温水浴中冷却5分钟。向各样品中加入10μL 2％ Na2EDTA·2H2O水溶 液，然后各自通过HPLC(方法2)分析，并在室温下保存长达96小时。 所得放射化学纯度(RCP)百分比数据在表15中列出。

表15：在有作为稳定剂的2-乙基-4-吡啶硫代酰胺(乙硫异烟胺)， 三聚硫氰酸三钠盐九水合物，二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物或二乙 基二硫代氨基甲酸钠三水合物存在的条件下制备时，177Lu-A的RCP数 据   稳定剂(～3.33mg/mL)   RCP ％   t＝0h   RCP ％   t＝24h   RCP ％   t＝96h   乙醇(没有稳定剂)   100   59.3   ---   乙硫异烟胺   100   98.1   94.6   三聚硫氰酸三钠盐九水合物   100   100   0   二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物   69.3   1.5   ---   二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物   52.8   0   ---

结果证实，在3.33-mg/mL的稳定剂浓度下，乙醇、乙硫异烟胺和 三聚硫氰酸三钠盐九水合物不会烦扰标记反应且均在反应过程中提供 稳定性。二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物和二乙基二硫代氨基甲酸钠 三水合物干扰反应或在反应过程中提供较低的稳定性。乙硫异烟胺和 三聚硫氰酸三钠盐九水合物分别提供长达24小时和96小时保存期的 稳定性。就三聚硫氰酸三钠盐九水合物而言，在24-96小时之间观察 到稳定性降低可能是由于化合物量不充以维持稳定性。在实施例12 中，更高浓度的该化合物确实维持稳定性达48小时。

                          实施例14

在有作为稳定剂的盐酸硫胺素，L-谷胱甘肽，3-羟基肉桂酸，4-羟基 安替比林，乙酰基水杨酸，2-羟基苯并噻唑或2，1，3-苯并噻二唑存在 的条件下制备时，177Lu-A的制备、标记效率和溶液稳定性

10mg/mL盐酸硫胺素和L-谷胱甘肽的溶液是通过将它们溶于水中 制备的。10mg/mL 3-羟基肉桂酸，4-羟基安替比林和乙酰基水杨酸的 溶液是通过将它们溶于50％ EtOH/水中制备的。10mg/mL 2-羟基苯并 噻唑和2，1，3-苯并噻二唑的溶液是通过将它们溶于EtOH中制备的。 向各铅屏的4mL小瓶中加入200μL NaOAc缓冲液(0.2M，pH 4.8)， 100μL稳定剂溶液(1mg稳定剂)，5.28mCi 177LuCl3(avg)和9.6μg(avg) 化合物A(溶于水中)。所有样品的化合物A与镥的比例为3∶1。按照实 施例13所述加热反应混合物、冷却、用Na2EDTA·2H2O处理并通过HPLC 分析，然后室温保存72小时，在该时间再次分析所有样品。所得放射 化学纯度(RCP)百分比数据在表16中列出。

表16：在有作为稳定剂的盐酸硫胺素，L-谷胱甘肽，3-羟基肉桂酸， 4-羟基安替比林，乙酰基水杨酸，2-羟基苯并噻唑或2，1，3-苯并噻二 唑存在的条件下制备并保存时，177Lu-A的RCP数据   稳定剂(3.33mg/mL)   RCP(％)   t＝0h   RCP(％)   t＝72h   盐酸硫胺素   97.0   0   L-谷胱甘肽   91.1   0   3-羟基肉桂酸   96.6   0   4-羟基安替比林   99.9   0   乙酰基水杨酸   73.0   0   2-羟基苯并噻唑   96.2   9.6   2，1，3-苯并噻二唑   98.6   3.1

结果证实，在3.33-mg/mL浓度下，盐酸硫胺素，3-羟基肉桂酸，4- 羟基安替比林，2-羟基苯并噻唑和2，1，3-苯并噻二唑不会显著干扰 177Lu-A标记反应且它们可在标记反应过程中提供有效的放射稳定性。 L-谷胱甘肽和乙酰基水杨酸或者干扰标记反应或在所试验条件下，在 反应过程中提供较低的稳定性。所试验的稳定剂均不能提供长达72 小时保存期的显著稳定性。

                      实施例15

在下列实验中，将二硫代氨基甲酸盐——1-吡咯烷二硫代氨基甲 酸铵盐(其先前未被评价为放射性诊断或放射性治疗化合物的放射性 稳定剂)直接加入到放射性标记混合物中。令人吃惊的是，与实施例 12和13中试验的二硫代氨基甲酸盐不同，PDTC可提供极佳的最初RCP 和标记后的稳定性。该结果是非常料想不到的。扩展了该化合物的研 究(实施例18)，其中发现在20mg/mL下，可获得100％ RCP长达48 小时。

使用2-乙基-4-吡啶硫代酰胺(乙硫异烟胺)，1-吡咯烷二硫代氨基甲 酸铵盐和5-硫-D-葡萄糖(5mg/mL)作为稳定剂时177Lu-A的制备、标记 效率测定和溶液稳定性

5mg/mL 1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)和5-硫-D-葡萄糖 的溶液是在醋酸钠缓冲液(0.2M，pH 4.8)中制备的。5mg/mL乙硫异 烟胺的溶液是在25％ EtOH/NaOAc缓冲液中制备的。向铅屏的4-mL小 瓶中加入200μL各NaOAc-稳定剂溶液，4.65-5.64mCi 177LuCl3和 7.1-8.5μg化合物A(溶于水中)。所有样品的化合物A与镥的比例 为3∶1。按照实施例13所述加热反应混合物、冷却、用Na2EDTA·2H2O处理并通过HPLC分析，然后室温保存24小时，在该时间再次分析所 有样品。所得RCP数据在表17中列出。

表17：当在有作为稳定剂的2-乙基-4-吡啶硫代酰胺(乙硫异烟胺)，1- 吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)或5-硫-D-葡萄糖(5mg/mL)存在的 条件下制备时，177Lu-A的RCP数据   稳定剂(5mg/mL)   mCi  177Lu   化合物A   浓度   (μg/mL)   RCP ％   t＝0h   RCP％   t＝24h   乙硫异烟胺   5.45   42.5   80.8   77.5   1-吡咯烷二硫代氨基   甲酸铵盐(PDTC)   5.64   42.5   100   99.9   5-硫-D-葡萄糖   4.65   35.5   81.3   38.0

结果证实PDTC不会干扰177Lu-A标记反应并在5-mg/mL浓度下， 在反应过程中提供稳定性。相比之下，乙硫异烟胺(溶于25％ EtOH/NaOAc中)和5-硫-D-葡萄糖或者干扰标记反应或在所试验条件 下在反应过程中提供较低的稳定性。在24小时保存期内，乙硫异烟胺 和PDTC较之5-硫-D-葡萄糖(比较它们t＝0h时的RCP ％值)是更好的 稳定剂。

                          实施例16

络合物形成后，使用胱胺二盐酸盐，L-半胱氨酸乙酯盐酸盐，L-半胱 氨酸二乙酯二盐酸盐，L-半胱氨酸甲酯盐酸盐，L-半胱氨酸二甲酯二 盐酸盐或L-半胱亚磺酸一水合物(5mg/mL)作为稳定剂稳定时，177Lu-A的稳定性

在本研究中，试验含硫化合物。半胱氨酸已被用作许多含可氧化 残基药物的抗氧剂。然而，发现如果直接加入到用于制备177Lu-A的反 应混合物中(实施例11)，则单独的半胱氨酸干扰放射性标记，如果 在177Lu络合物形成后加入，则部分有效。令人吃惊的是，半胱氨酸甲 酯和乙酯，它们先前未报道过作为放射性药物中的稳定剂，在试验条 件下提供更好的放射性稳定。

各稳定剂的溶液(10mg/mL)是在水中制备的。向铅屏的4mL小瓶 中加入300μL NaOAc缓冲液(0.2M，pH 4.8)，29.6mCi 177LuCl3和41.4 μg化合物A(溶于水中)。化合物A与镥的比例为3∶1。按照实施例 13所述加热反应混合物、冷却、用Na2EDTA·2H2O处理并通过HPLC分 析。将7份50-μL等分试样(各3.34mCi 177Lu avg)转移到各HPLC小 瓶中。向其中1份等分试样中加入50μL水用作对照样品(没有稳定 剂)。向其它6份等分试样中加入50μL各稳定剂溶液(0.5mg稳定剂)， 然后各自通过HPLC(方法2)分析。室温保存24小时后，再次分析对照 样品和L-半胱乙酯盐酸盐和L-半胱氨酸甲酯盐酸盐样品。所得RCP 数据在表18中列出。

表18：络合物制备后，使用胱胺二盐酸盐，L-半胱氨酸乙酯盐酸盐，L- 半胱氨酸二乙酯二盐酸盐，L-半胱氨酸甲酯盐酸盐，L-半胱氨酸二甲 酯二盐酸盐或L-半胱亚磺酸一水合物(5mg/mL)作为稳定剂稳定时， 177Lu-A的RCP数据   稳定剂(5mg/mL)   制备后的分   析时间   RCP   (％)   t＝0h   RCP   (％)   t＝24h   无(对照样品)   0hr   93.2   0   胱胺二盐酸盐   1hr   66.2   ---   L-半胱氨酸乙酯盐酸盐   1.5hrs   91.5   73.2   L-半胱氨酸甲酯盐酸盐   2.5hrs   90.4   74.4   L-半胱氨酸二乙酯二盐酸盐   2hrs   61.5   ---   L-半胱氨酸二甲酯二盐酸盐   3hrs   70.1   ---   L-半胱亚磺酸一水合物   3.5hrs   75.0   ---

结果证实在5-mg/mL浓度下，L-半胱氨酸乙酯盐酸盐和L-半胱氨 酸甲酯盐酸盐为177Lu提供较之所试验的其它稳定剂溶液更好的放射稳 定性。

                        实施例17

使用L-半胱氨酸乙酯盐酸盐和L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(5mg/mL)作为 稳定剂时，177Lu-A的制备、标记效率测定和溶液稳定性

L-半胱氨酸乙酯盐酸盐和L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的溶液(5mg/mL) 是通过将它们溶于NaOAc缓冲液(0.2M，pH 4.8)中制备的。向铅屏的 4-mL小瓶中加入200μL各NaOAc-稳定剂溶液、4.80mCi 177LuCl3和 7.26μg化合物A(溶于水中)。所有样品的化合物A与镥的比例为3∶1。 按照实施例13所述，将反应混合物加热、冷却、用Na2EDTA·2H2O处理 并通过HPLC分析，然后各自室温保存72小时。在t＝0，24，48和 72h时，通过HPLC(方法2)分析各样品。所得RCP数据在表19中列 出。

表19：在有作为稳定剂的L-半胱氨酸乙酯盐酸盐或L-半胱氨酸甲酯盐 酸盐(5mg/mL)存在的条件下制备时，177Lu-A的RCP数据   稳定剂(5mg/mL)   RCP ％   t＝0h   RCP ％   t＝24h   RCP ％   t＝48h   RCP ％   t＝72h   L-半胱氨酸乙酯盐酸盐   100   96.5   93.5   87.4   L-半胱氨酸甲酯盐酸盐   100   97.1   93.7   87.2

结果证实，在5-mg/mL浓度下，两种稳定剂均可提供适宜的177Lu-A稳定性长达24小时。

                         实施例18

在有1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(0-20mg/mL)存在的条件下制备时 177Lu-A的制备、标记效率和溶液稳定性

通过将1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)溶于醋酸钠(NaOAc) 缓冲溶液(0.2M，pH 4.8)中制备其20-，10-，5-和1mg/mL浓度的溶 液。向铅屏300-μL样品小瓶中各加入50-μL PDTC-NaOAc缓冲溶液的 等分试样，包括仅有NaOAc缓冲液的等分试样，用作对照样品。向各 缓冲液等分试样中加入9.95mCi 177LuCl3(avg)和17.2μg化合物A(溶 于水中)。各样品的化合物A∶Lu(总Lu)的摩尔比为3∶1。在反应过程 中，各样品中化合物A的浓度为287-μg/mL且放射性浓度为 167-mCi/mL。将该样品加热至100℃ 5分钟，然后在室温水浴中冷却 5分钟。向各样品中加入10μL 2％ EDTA水溶液，然后在48小时内通 过HPLC(方法3)分析各样品。在t＝0时，放射性浓度为143mCi/mL。 下表表示所得结果。

表20：在0-20mg/mL的1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)存在的条 件下制备时，177Lu-A的RCP数据   RCP(％)   PDTC浓度   0-h   3-h   6-h   12-h   24-h   48-h   (无-仅NaOAc)对照   100   30.7   0   0   ---   ---   20mg/mL(1mg)   100   100   100   100   100   100   10mg/mL(0.5mg)   100   100   100   100   100   100   5mg/mL(0.25mg)   100   100   100   100   0   ---   1mg/mL(0.05mg)   100   100   17.2   0   0   ---

这些结果是在没有任何其它稳定剂存在的条件下获得的，且表明 PDTC可提供异常的放射性稳定化。由于在标记反应过程中存在稳定 剂，因此表明使用该试剂的单一-小瓶制剂应是可行的。此外，该实验 证实稳定剂的量增加可延长稳定性的持续时间。

                         实施例19

在有1-吡咯烷二硫代羧酸铵盐(PDTC)，硒代蛋氨酸(Se-Met)，半胱 氨酸(Cvs)或半胱氨酸乙酯(CEE)存在的条件下制备时177Lu-B的制 备、标记效率和溶液稳定性：

PDTC：在该研究中，177Lu-B配制如下：向5-mL玻璃小瓶中加入5mg PDTC溶于1mL 0.2M NaOAc缓冲液(pH 4.8)中的溶液，15μL(44 mCi)177LuCl3和30μL 5mg/mL化合物B溶于0.01N HCl中的溶液。将 反应小瓶密封并在100℃下加热5分钟。水浴冷却后，加入含0.9％苄 醇和1mg/mL Na2EDTA·2H2O的1mL制菌0.9％ NaCl注射液。在温度高于 室温～6℃的自动取样器中保存该样品，并通过RP-HPLC分析长达24 小时。下表表示所得结果。

L-硒代蛋氨酸：如上所述制备、稀释并分析177Lu-B，但使用5mg L-Se-Met代替PDTC，加热时间为10分钟，所用放射性量为52mCi。

L-半胱氨酸乙酯，HCl：如上所述制备、稀释并分析177Lu-B，但 使用5mg L-CEE，盐酸盐代替PDTC，加热时间为8分钟，所用放射性量 为50mCi。

L-半胱氨酸.HCl.H2O：如上所述制备、稀释并分析177Lu-B，但使用 5mg L-Cys HCl.H2O代替PDTC，加热时间为8分钟，所用放射性量为 53mCi。

表21：在有PDTC，L-硒代蛋氨酸，L-半胱氨酸乙酯或L-半胱氨 酸.HCl.H2O存在的条件下制备时，177Lu-B的RCP数据   被配制含有5mg下列稳定   化合物的177Lu-B   (％ RCP)   0-h   3-h   6-h   9-h   12-h   24-h   在24hr内RCP   下降   PDTC   95.0   94.7   94.0   1   L-硒代蛋氨酸   95.0   94.6   94.4   93.3   92.6   90.6   4.4   L-半胱氨酸乙酯.HCl   98.4   96.9   94.7   92.8   92.2   85.1   13.3   L-半胱氨酸.HCl.H2O   99.1   94.7   87.3   79.4   73.6   50.9   48.2

这些数据表明在所试验的条件下，与没有加入稳定剂的历史对照 相比，所有化合物均可提供某些放射性稳定作用，且PDTC和L-硒代 蛋氨酸是所试验化合物中最有效的。没有预料到可将PDTC直接加入到 用于制备Lu和铟络合物的反应混合物中[没有给出数据]而不会抑制 络合物的形成。化合物如二乙基二硫代氨基甲酸盐、二甲基二硫代氨 基甲酸盐和其它，当加入到Tc制剂中时，发现可形成其中放射性金属 与二硫代氨基甲酸盐配体配位的络合物(例如，TcNOEt)。同样，公 开了二硫代氨基甲酸盐配体的铟络合物的若干报道。

                         实施例20

反应缓冲液中有和没有1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐的条件下，污染 金属(锌)在177Lu-B反应过程中的作用的测定

在用PDTC进行研究的过程中，发现向含177LuCl3的反应混合物中 加入它可提供非常预想不到的益处。有时，177LuCl3同位素溶液被干扰 放射性标记的非-放射性金属污染。这些金属(其可包括，例如Zn，Cu， Ca和Fe等)，可与177Lu竞争螯合剂，由此通过消耗配体导致配体与 177Lu不能螯合而降低反应产率。在有和没有加入锌及PDTC存在的条件 下，对177LuA的标记产率进行的研究清楚表明，向含加入锌的反应混 合物中加入PDTC可防止该污染金属的干扰。

10-mg/mL的1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐溶液是通过将它溶于 醋酸钠缓冲液(0.2M，pH 4.8)中制备的。向铅屏300-μL样品小瓶 中加入86.5μL NaOAc缓冲溶液、13.7mCi 177LuCl3，0.6525μg锌(6.52μL 100-μg/mL锌等离子体标准溶液)和15μg化合物B(溶于水中)。其被 标记为‘样品1’。向另一铅屏300-μL样品小瓶中加入86.5μL 10-μg/mL 1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐/NaOAc缓冲溶液、13.8mCi 177LuCl3， 0.6525μg锌和15μg化合物B。其被标记为‘样品2’。各样品中化 合物B的浓度为150μg/mL且各样品的化合物B∶177Lu∶锌的摩尔比为 3∶1∶3。将该样品加热至100℃ 5分钟，然后在室温水浴中冷却5分钟。 向各样品中加入10μL 2％ Na2EDTA·2H2O水溶液，然后使用HPLC方法 5，通过HPLC分析各样品。图10显示所得结果。

图10A显示化合物B的HPLC色谱图(UV)，其在所用系统中具有 15.4分钟的保留时间。

图10B显示样品1(对照反应；没有PDTC)的放射色谱图(上面)和 UV色谱图(下面)；其是在化合物B与177Lu在有锌存在的条件下反应后 获得的。所得RCP为0％。形成的主要产物是化合物B的锌络合物，其 具有17.3分钟的保留时间。剩余非常少量的化合物B，且形成非常少 量的177Lu-B。

图10C显示样品2的放射色谱图(上面)和UV色谱图(下面)，其是 在化合物B与177Lu在有锌和PDTC存在的条件下反应后获得的。所得 RCP＝100％。

图10A-10C所示结果证实1-吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐对于清除 反应混合物中的外来痕量金属有效，因为当把PDTC加入到含过量锌的 标记反应中时，所得放射化学纯度显著提高。

                          实施例21

用硒代蛋氨酸(2.5mg/mL)作为稳定剂时，111In-B的制备、标记效率测 定和溶液稳定性

L-硒代蛋氨酸的溶液(20mg/mL)是通过将它溶于NaOAc缓冲液 (0.2M，pH 4.0)中制备的。向铅屏2-mL小瓶中加入111μL NaOAc缓冲液(0.2M，pH 4.0)，25μL硒代蛋氨酸溶液(0.5mg Se-Met)，4 μL化合物B(20μg溶于0.01N HCl中)和1.0mCi 111InCl3溶于60μL 0.05N HCl中的溶液。进行含上述所有试剂的对照反应，但用NaOAc缓冲液替代Se-Met溶液。100℃加热该反应混合物15分钟，然后在室 温水浴中冷却1分钟。向各样品中加入200μL稳定溶液(0.2％ HSA，5％ 抗坏血酸，0.9％苄醇，20mM Se-Met，溶于50mM柠檬酸盐缓冲液， pH 5.3中)和2μL 1％ Na2EDTA·2H2O水溶液，然后室温保存各样品长达 6小时，并如下所述通过HPLC分析各样品。所得RCP数据在表21中 列出。HPLC条件：Vydac C18柱，4.6×250mm，5μM，流速1.5mL/ 分，30℃。溶剂A：0.1％ TFA水溶液；溶剂B：0.085％ TFA溶于乙腈 的溶液。梯度：80％A/20％B恒溶剂20分钟，在5分钟内升至40％A/60％B， 保持5分钟，在5分钟内回到80％A/20％B。

表22：在有硒代蛋氨酸(2.5mg/mL)存在的条件下制备时，111In-B的RCP 数据   加入的稳定剂   RCP，％   t＝0   t＝6h   无(仅有NaOAc缓冲液)   94.7   93.2   2.5mg/mL Se-Met   98.3   96.6

这些结果证实硒代蛋氨酸可用于111InB的放射性稳定，因为其中 加入硒代蛋氨酸的反应混合物的放射化学纯度高于在不含稳定剂的对 照反应中获得的放射化学纯度。

                          实施例22

使用硒代蛋氨酸和抗坏血酸钠作为稳定剂时，177Lu-B的制备、标记效 率测定和溶液稳定性

在本研究中，177Lu-B配制如下：向5-mL玻璃小瓶中加入2.94mg L- 硒代蛋氨酸溶于1mL 0.2M NaOAc缓冲液(pH 4.8)中的溶液，25μL (110.5mCi)177LuCl3和30μL 5mg/mL化合物B溶于0.01N HCl中的 溶液。将反应小瓶密封并在100℃下加热10分钟。在水浴中将反应 小瓶冷却至室温后，加入4mL含0.9％苄醇，50mg/mL抗坏血酸钠 和1mg/mL Na2EDTA·2H2O的制菌0.9％ NaCl注射液。将样品保存在温 度高于室温～6℃的自动取样器中，并通过RP-HPLC分析长达120小 时。表23显示所得结果。

表23：当在有L-硒代蛋氨酸(2.94mg/mL)存在的条件下制备时， 177Lu-B的RCP数据   重构后的时间(小时)   RCP(％)   0   99.5   2   99.6   3   99.5   6   99.0   9   99.4   12   99.2   24   99.4   120(5天)   99.8

这些结果表明极佳的标记效率和极佳的重构后稳定性均可使用上 述条件获得，即在络合物形成过程中将2.94mg Se-Met加入到反应混 合物中，接着在络合物形成后立即加入4mL含抗坏血酸钠和苄醇的生 理盐水溶液。在室温保存5天内，没有观察到降解。当把硒代蛋氨酸 的量降至1.0mg时，获得相似结果。

                        实施例23

苄醇对177Lu-B回收的作用的测定

两种放射分解保护溶液制备如下：

稳定剂溶液A：用9份标准生理盐水溶液[没有苄醇]稀释1份含 0.25mg/ml Na2-EDTA的500mg/ml L-抗坏血酸，pH 5.7。

稳定剂溶液B：用9份含0.9％(w/v)苄醇的抑菌生理盐水稀释1 份含0.25mg/ml Na2-EDTA的500mg/ml L-抗坏血酸，pH 5.7。

将100μL含1mg/mL L-硒代蛋氨酸和13μg化合物B的0.2M NaOAc缓冲液，pH 4.8的等分试样加入到2个2-mL的样品小瓶中的每一个 中，分别标记为样品1和样品2。将约10mCi 177LuCl3加入到各小瓶 中，然后在温控加热区中，100℃加热样品10分钟。然后取出它们并 在室温水浴中冷却5分钟。冷却后，将400μL溶液A加入到样品1中， 将400μL溶液B加入到样品2中。

使用方法3，通过HPLC分析两份样品，并室温静置24小时。在该 时间结束时，重复RCP分析，然后取出各小瓶中的全部溶液。使用剂 量校准器测定各小瓶中剩余的放射性量和取出的放射性量。按照从小 瓶中回收的mCi/总放射性[溶液和小瓶]×100来从计算各小瓶中回收 的放射性百分比。所观察到的结果在表24中表示。

表24：在有和没有苄醇存在的条件下，177Lu-B的RCP和回收率％的比 较   RCP(％)   t＝0   RCP(％)   t＝24hr   回收率(％)  小瓶中剩余％*   样品-01   [无苄醇]   ～100％   ～100％   85.3％  14.7％   样品-02   [有苄醇]   ～100％   ～100％   96.7％  3.3％

*玻璃小瓶中剩余的放射性％，不可取出的

这些结果证实在稳定剂溶液中加入苄醇可显著提高放射性自小瓶 的回收。这是十分重要的，因为如果大量放射性不能从小瓶中取出， 那么额外的放射性必须被加入以弥补这种损耗。具有尽可能高的回收 率十分有利。

                        实施例24

使用+2硫络合物将放射性标记肽中蛋氨酸氧化物残基转化为蛋氨酰 残基的评价

评价+2氧化态硫化合物，特别是硫醇将蛋氨酸氧化物残基转化为 还原蛋氨酰基形式的能力。为了进行该研究，合成化合物B的蛋氨酸 氧化形式。该氧化的化合物被称作化合物C。将化合物C放射性标记 形成177Lu-C，其与各种+2硫衍生物混合，室温保存并随时间而分析， 以测定肽中有多少蛋氨酸氧化物已经转化为蛋氨酸。

所试验的溶液是：

1. 2％巯基乙醇[ME]，溶于0.1M，pH 5.0柠檬酸盐缓冲液中

2. 20mg/ml L-半胱氨酸.HCl.H2O[Cys]，溶于0.1M，pH 5.0柠檬 酸盐缓冲液中，终pH为～3.5

3. 20mg/ml DL-二硫苏糖醇[DTT]，溶于0.1M，pH 5.0柠檬酸盐缓 冲液中，终pH为～5.0

4. 20mg/ml L-蛋氨酸[Met]，溶于0.1M，pH5.0柠檬酸盐缓冲液 中

5. 20mg/ml L-硒代蛋氨酸[Se-Met]，溶于0.1M，pH 5.0柠檬酸 盐缓冲液中

巯基乙醇，半胱氨酸和二硫苏糖醇是硫醇，蛋氨酸是硫醚，硒代 蛋氨酸是有机2+硒化合物。后两种溶液用作对照。

177Lu-C的制备：在2-mL玻璃小瓶中，加入200μl 0.2M，pH 4.8 NaOAc缓冲液、30μg化合物C[溶于30uL 0.01N HCl中]和5.6mCi 177LuCl3。85℃温育10分钟后，水浴冷却反应小瓶至室温，然后加入 20μl 2％ EDTA，以攻击剩余的任何游离Lu-177。

样品制备：将该反应溶液的等分试样[40μl，0.75mCi]与100μl 上述其中一种溶液的等分试样混合，例如20mg/ml Cys；DTT；Met； Se-Met；或2％ ME。随时间室温保存该溶液并在第1和3天通过 RP-HPLC分析。所得结果在下面表25中表示。

表25：在有Cys，DTT，ME，Met，或Se-Met存在的条件下室温保存1-3 天后，177Lu-C转化[还原]成177Lu-B的百分比(％)   1天内的转化％   3天内的转化％   L-半胱氨酸(Cys)   5.6   12.8   DL-二硫苏糖醇(DTT)   14.1   18.9   巯基乙醇(ME)   9.7   17.1   L-蛋氨酸(Met)   0   0   L-硒代蛋氨酸   (Se-Met)   0   0

该结果十分重要，因为其表明Cys，DTT和ME，所有含巯基的化 合物均能够将放射性标记肽中的氧化蛋氨酰残基还原回成它的还原 [蛋氨酰基]形式。在用于制备177Lu-A或177Lu-B的制剂中，很明显加 入Cys，DTT或ME(或其它硫醇)可通过逆转所发生的任何蛋氨酸氧化 而保护这些化合物免受氧化。

               相关申请的交互参考

本申请要求2003年7月24日提交的美国临时申请No.60/489,850 的优先权，其全部引入此处作为参考。