寡核苷酸螯合物方法
阅读：850发布：2020-05-12
专利汇可以提供寡核苷酸螯合物方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 描述了药物组合物和用寡核苷酸 螯合物 治疗 病毒感染 、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、阿尔茨海默病、 朊病毒 病和杜馨氏肌肉营养不良症的方法。，下面是寡核苷酸螯合物方法专利的具体信息内容。
1.一种药物制剂，其包含抗病毒寡核苷酸螯合物用于治疗病毒感染。
2.一种药物制剂，其包含抗胆固醇寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症。
3.一种药物制剂，其包含抗甘油三酯寡核苷酸螯合物用于治疗高甘油三酯血症。
4.一种药物制剂，其包含抗阿尔茨海默寡核苷酸螯合物用于治疗阿尔茨海默病。
5.一种药物制剂，其包含抗朊病毒寡核苷酸螯合物用于治疗朊病毒病。
6.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物是用二价金属阳离子制备的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物是用钙制备的。
8.如权利要求1至6中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物是用镁制备的。
9.如权利要求1至6中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物是用铁(2+)、锰、铜或锌制备的。
10.如权利要求1至9中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含两种或两种以上不同二价金属阳离子。
11.如权利要求1至10中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含钙和镁。
12.如权利要求1至11中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个双链寡核苷酸。
13.如权利要求1至12中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有至少一个硫代磷酸酯键的寡核苷酸。
14.如权利要求1至13中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸。
15.如权利要求1至14中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有一个2’修饰的核糖的寡核苷酸。
16.如权利要求1至15中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个每个核糖都被2’O-甲基化的寡核苷酸。
17.如权利要求1至16中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有至少一个5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
18.如权利要求1至17中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个其中每个胞嘧啶都是5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
19.如权利要求1至18中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物含有至少一个完全硫代磷酸酯化并且所有核糖都具有2’O甲基修饰并且所有胞嘧啶都以5'甲基胞嘧啶形式存在的寡核苷酸。
20.如权利要求1至11中任一项所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO:1-6或10-18的寡核苷酸。
21.一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO:20的螯合物用于治疗高胆固醇血症。
22.一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO:19的螯合物用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症。
23.一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO:7的螯合物用于治疗丙型肝炎感染。
24.如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于皮下施用。
25.如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于静脉内输注。
26.如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于选自由以下方式组成的组的施用：眼内、口服、肠道、吸入、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉内注射和局部。
27.如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成通过气雾剂进行施用。
28.如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的病毒是乙型肝炎病毒。
29.如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的所述病毒是嗜肝DNA病毒。
30.如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的所述病毒是肝炎δ病毒。
31.如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的所述病毒是流感病毒。
32.如权利要求1所述的药物制剂，其中引起所述感染的所述病毒选自由以下病毒组成的组：逆转录病毒科的成员、HIV-1、HIV-2、疱疹病毒科的成员、HSV-1、HSV-2、巨细胞病毒、痘病毒科的成员、副粘病毒科的成员、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、布尼亚病毒科的成员、汉坦病毒、丝状病毒科的成员、埃博拉病毒、马尔堡病毒、黄病毒科的成员、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、正粘病毒科的成员、披膜病毒科的成员、冠状病毒科的成员、弹状病毒科的成员和砂粒病毒科的成员。
33.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含SEQ ID NO:2。
34.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含SEQ ID NO:18。
35.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述寡核苷酸螯合物包含SEQ ID NO:11。
36.抗病毒寡核苷酸螯合物用于治疗病毒感染的用途。
37.抗胆固醇寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症的用途。
38.抗甘油三酯寡核苷酸螯合物用于治疗高甘油三酯血症的用途。
39.抗阿尔茨海默寡核苷酸螯合物用于治疗阿尔茨海默病的用途。
40.抗朊病毒寡核苷酸螯合物用于治疗朊病毒病的用途。
41.如权利要求36至40中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物是用二价金属阳离子制备的。
42.如权利要求36至41中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物是用钙制备的。
43.如权利要求36至42中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物是用镁制备的。
44.如权利要求36至43中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物是用铁(2+)、锰、铜或锌制备的。
45.如权利要求36至44中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含两种或两种以上不同二价金属阳离子。
46.如权利要求36至45中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含钙和镁。
47.如权利要求36至46中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个双链寡核苷酸。
48.如权利要求36至47中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有至少一个硫代磷酸酯键的寡核苷酸。
49.如权利要求36至48中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸。
50.如权利要求36至49中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有一个2’修饰的核糖的寡核苷酸。
51.如权利要求36至50中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个每个核糖都被2’O-甲基化的寡核苷酸。
52.如权利要求36至51中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有至少一个5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
53.如权利要求36至52中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个所有胞嘧啶都是5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
54.如权利要求36至53中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含至少一个完全硫代磷酸酯化并且所有核糖都具有2’O甲基修饰并且所有胞嘧啶都以5'甲基胞嘧啶形式存在的寡核苷酸。
55.如权利要求36至40中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含选自SEQ ID NO:1-6或10-18的寡核苷酸。
56.包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症的用途。
57.包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸螯合物用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症的用途。
58.包含SEQ ID NO:7的寡核苷酸螯合物用于治疗丙型肝炎感染的用途。
59.如权利要求36至58中任一项所述的用途，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于皮下施用。
60.如权利要求36至58中任一项所述的用途，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于静脉内输注。
61.如权利要求36至58中任一项所述的用途，其中将所述ON螯合物配制成用于选自由以下方式组成的组的施用：眼内、口服、肠道、吸入、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉内注射和局部。
62.如权利要求36至58中任一项所述的用途，其中将所述寡核苷酸螯合物配制成用于通过气雾剂进行施用。
63.如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒是乙型肝炎病毒。
64.如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒是嗜肝DNA病毒。
65.如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒是肝炎δ病毒。
66.如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒是流感病毒。
67.如权利要求36所述的用途，其中引起所述感染的所述病毒选自由以下病毒组成的组：逆转录病毒科的成员、HIV-1、HIV-2、疱疹病毒科的成员、HSV-1、HSV-2、巨细胞病毒、痘病毒科的成员、副粘病毒科的成员、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、布尼亚病毒科的成员、汉坦病毒、丝状病毒科的成员、埃博拉病毒、马尔堡病毒、黄病毒科的成员、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、正粘病毒科的成员、披膜病毒科的成员、冠状病毒科的成员、弹状病毒科的成员和砂粒病毒科的成员。
68.如权利要求36所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含由SEQ ID NO:2组成的寡核苷酸。
69.如权利要求36所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含由SEQ ID NO:18组成的寡核苷酸。
70.如权利要求36所述的用途，其中所述寡核苷酸螯合物包含由SEQ ID NO:11组成的寡核苷酸。
寡核苷酸螯合物方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年5月18日提交的美国临时申请号61/648,694的优先权，所述临时申请号的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及牵涉施用或使用寡核苷酸(ON)螯合物的疾病治疗方法。这些疾病可以包括病毒感染、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、朊病毒病或杜馨氏肌肉营养不良症(Duchene’s muscular dystrophy)。
背景技术
[0004] ON螯合物是分子间通过二价或多价金属阳离子连接的两个或两个以上ON。ON螯合物中和ON的可能造成这些化合物的施用相关副作用的固有螯合性质。施用ON螯合物是对受试者施用ON的新方法，其中减轻了与非螯合ON(它们是以本领域常用的钠盐形式施用的ON)有关的施用相关副作用。这些副作用可能包括伴随静脉内输注的发抖、发热和寒战或伴随皮下施用的注射部位硬化、炎症和疼痛。此外，通过将ON制备为螯合络合物，可以改善它们的药动学特性，与国际申请公布号WO 2012/021985和美国申请公布号2012/0046348(所述公布号以全文引用方式并入本文)中描述的非螯合ON相比用相似的剂量可提供更高的治疗性能。
[0005] 因此希望提供通过序列相关或序列无关的机制起作用的ON螯合物，它将对包括病毒感染、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、阿尔茨海默病或朊病毒病在内的许多疾病病况有治疗作用并且引起对ON来说常见的施用相关副作用减少或消除。
[0006] 因此，本领域需要提供一种用于治疗上述疾病病况的方法，这种方法包括对需要治疗的受试者施用包含ON螯合物的药物组合物。
发明内容
[0007] 概述
[0009] 根据本说明书，现在提供配制为螯合物的寡核苷酸用于治疗可以通过用所述寡核苷酸治疗进行影响的任何疾病病况的用途。
[0010] 根据本说明书，现在提供配制为螯合物的寡核苷酸在制造用于治疗可以通过用所述寡核苷酸治疗进行影响的任何疾病病况的药剂中的用途。
[0011] 提供一种治疗病毒感染的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗病毒ON螯合物的步骤。
[0012] 提供抗病毒ON螯合物用于治疗病毒感染的用途。
[0013] 提供抗病毒ON螯合物在制造用于治疗病毒感染的药剂中的用途。
[0014] 在一个实施方案中，所述抗病毒寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO:1-6或10-18的寡核苷酸。
[0015] 提供一种治疗高胆固醇血症的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗胆固醇ON螯合物的步骤。
[0016] 在一个实施方案中，所述抗胆固醇寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO:1、2、3、5、6、10、11、12、15、16或17的寡核苷酸。
[0017] 提供一种治疗高甘油三酯血症的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗甘油三酯ON螯合物的步骤。
[0018] 在一个实施方案中，抗胆固醇寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO:1、2、3、5、6、10、11、12、15、16或17的寡核苷酸。
[0019] 提供一种治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗阿尔茨海默ON螯合物的步骤。
[0020] 提供一种治疗朊病毒病的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用抗朊病毒ON螯合物的步骤。
[0021] 提供一种治疗由mRNA成熟期间不正确剪接引起的疾病的方法，所述疾病包括杜馨氏肌肉营养不良症(DMD)，所述方法包括施用设计成纠正DMD中的不正确剪接的ON螯合物的步骤。
[0022] 提供抗病毒ON螯合物用于治疗病毒感染的用途。
[0023] 提供抗病毒ON螯合物在制造用于治疗病毒的药剂中的用途。在一个实施方案中，所述抗病毒寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO:1-6或10-18的寡核苷酸。
[0024] 提供抗胆固醇ON螯合物用于治疗高胆固醇血症的用途。
[0025] 提供抗胆固醇ON螯合物在制造用于治疗高胆固醇血症的药剂中的用途。
[0026] 在一个实施方案中，所述抗胆固醇寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO:1、2、3、5、6、10、11、12、15、16或17的寡核苷酸。
[0027] 提供抗甘油三酯ON螯合物用于治疗高甘油三酯血症的用途。
[0028] 提供抗甘油三酯ON螯合物在制造用于治疗高甘油三酯血症的药剂中的用途。
[0029] 在一个实施方案中，所述抗甘油三酯寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQ ID NO:1、2、3、5、6、10、11、12、15、16或17的寡核苷酸。
[0030] 提供抗阿尔茨海默ON螯合物用于治疗阿尔茨海默病的用途。
[0031] 提供抗阿尔茨海默ON螯合物在制造用于治疗阿尔茨海默病的药剂中的用途。
[0032] 提供抗朊病毒ON螯合物用于治疗朊病毒病的用途。
[0033] 提供抗朊病毒ON螯合物在制造用于治疗朊病毒病的药剂中的用途。
[0034] 提供设计成纠正DMD中的不正确剪接的ON螯合物用于治疗由mRNA成熟期间的不正确剪接引起的疾病的用途，所述疾病包括杜馨氏肌肉营养不良症(DMD)。
[0035] 提供设计成纠正DMD中的不正确剪接的ON螯合物在制造用于治疗由mRNA成熟期间的不正确剪接引起的疾病的药剂中的用途，所述疾病包括杜馨氏肌肉营养不良症(DMD)。
[0036] 提供一种用于治疗高胆固醇血症的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸螯合物。
[0037] 提供包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症的用途。
[0038] 提供包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸螯合物在制造用于治疗高胆固醇血症的药剂中的用途。
[0039] 提供一种用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸螯合物。
[0040] 提供包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸螯合物用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症的用途。
[0041] 提供包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸螯合物在制造用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症的药剂中的用途。
[0042] 提供一种用于治疗丙型肝炎感染的方法，所述方法包括施用包含SEQID NO:7的寡核苷酸螯合物。
[0043] 提供包含SEQ ID NO:7的寡核苷酸螯合物用于治疗丙型肝炎感染的用途。
[0044] 提供包含SEQ ID NO:7的寡核苷酸螯合物在制造用于治疗丙型肝炎感染的药剂中的用途。
[0045] 提供一种药物制剂，其包含抗病毒寡核苷酸螯合物用于治疗病毒感染。
[0046] 提供一种药物制剂，其包含抗胆固醇寡核苷酸螯合物用于治疗高胆固醇血症。
[0047] 提供一种药物制剂，其包含抗甘油三酯寡核苷酸螯合物用于治疗高甘油三酯血症。
[0048] 提供一种药物制剂，其包含抗阿尔茨海默寡核苷酸螯合物用于治疗阿尔茨海默病。
[0049] 提供一种药物制剂，其包含抗朊病毒寡核苷酸螯合物用于治疗朊病毒病。
[0050] 提供一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO:20的螯合物用于治疗高胆固醇血症。
[0051] 提供一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO:19的螯合物用于治疗杜馨氏肌肉营养不良症。
[0052] 提供一种药物制剂，其包含含有SEQ ID NO:7的螯合物用于治疗丙型肝炎感染。
[0053] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物是用二价金属阳离子制备的。
[0054] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物是用钙制备的。
[0055] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物是用镁制备的。
[0057] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含两种或两种以上不同二价金属阳离子。
[0058] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含钙和镁。
[0059] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个双链寡核苷酸。
[0060] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有至少一个硫代磷酸酯键的寡核苷酸。
[0061] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸。
[0062] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有一个2’修饰的核糖的寡核苷酸。
[0063] 在再一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个每个核糖都被2’O-甲基化的寡核苷酸。
[0064] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个具有至少一个5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
[0065] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个其中每个胞嘧啶都是5'甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
[0066] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物含有至少一个完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸并且所有核糖具有2’O甲基修饰并且所有胞嘧啶以5'甲基胞嘧啶形式存在。
[0067] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含至少一个选自SEQID NO:1-6或10-18的寡核苷酸。
[0068] 在另一个实施方案中，将所述寡核苷酸螯合物配制成用于皮下施用。
[0069] 在另一个实施方案中，将所述寡核苷酸螯合物配制成用于静脉内输注。
[0070] 在另一个实施方案中，将所述寡核苷酸螯合物配制成用于选自由以下方式组成的组的施用：眼内、口服、肠道、吸入、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉内注射和局部。
[0071] 在另一个实施方案中，将所述寡核苷酸螯合物配制成用于通过气雾剂进行施用。
[0072] 在另一个实施方案中，引起感染的病毒是乙型肝炎病毒。
[0073] 在另一个实施方案中，引起感染的病毒是嗜肝DNA病毒。
[0074] 在又一个实施方案中，引起感染的病毒是肝炎δ病毒。
[0075] 在另一个实施方案中，引起感染的病毒是流感病毒。
[0076] 在另一个实施方案中，引起感染的病毒选自由以下病毒组成的组：逆转录病毒科的成员、HIV-1、HIV-2、疱疹病毒科的成员、HSV-1、HSV-2、巨细胞病毒、痘病毒科的成员、副粘病毒科的成员、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、布尼亚病毒科的成员、汉坦病毒、丝状病毒科的成员、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、黄病毒科的成员、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、正粘病毒科的成员、披膜病毒科的成员、冠状病毒科的成员、弹状病毒科的成员和砂粒病毒科的成员。
[0077] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含SEQ ID NO:2(REP2055)。
[0078] 在另一个实施方案中，所述寡核苷酸螯合物包含SEQ ID NO:18(REP2139)。
[0080] 现在参考附图：
[0081] 图1说明ON的共同理化特征。A)通过高效液相色谱法共同分离REP2006和具有定义序列的21聚体硫代磷酸酯化ON。B)通过质谱法鉴别所述21聚体ON中的物质。C)通过质谱法鉴别所述REP 2006ON中的物质。
[0082] 图2A说明不依赖于ON序列的ON的一般化学特征。与其序列无关，任何ON作为同时具有疏水和亲水活性的聚合物存在。硫代磷酸酯化(在这个图中的化学结构中描绘)用来提高ON聚合物的疏水性但是不影响亲水性。图2B示意性表示二价和三价金属阳离子的ON螯合性质。金属阳离子(由实心圈表示)通过磷酸二酯键中的两个或三个非桥接氧或硫原子之间的金属离子桥(由省略号表示)分子间连接ON聚合物的亲水性表面。
[0083] 图3说明在不同ON和二价金属阳离子浓度下存在二价或多价金属阳离子时的ON的溶液特性模型。A)低二价/三价金属阳离子，低ON浓度产生二聚体或低阶ON螯合物。B)提高二价/三价金属阳离子浓度在溶液中形成更完全的ON螯合物。C)在二价或三价金属存在下进一步提高ON浓度能够随着金属浓度提高产生较高阶ON螯合物。由于亲水性表面仍然暴露于含水环境而维持溶解度，因此(A)至(C)中的所有螯合物均可溶于水溶液。D)在足够的ON和金属浓度下，所有亲水性表面现将限制在ON螯合物内，仅使疏水表面暴露于含水环境。这导致ON螯合物的沉淀。
[0084] 图4说明荧光-ON螯合物的溶液特性对荧光偏振的影响。随着金属浓度提高，ON螯合物形成的大小(和质量)也增加(参见图3)并且因此在溶液中翻滚更缓慢。络合物在溶液中的这种较慢的翻滚导致荧光偏振升高和mP值升高。
具体实施方式
[0085] 如国际申请公布号WO 2012/021985和美国申请公布号2012/0046348所述(所述公布号的内容以全文引用方式并入本文)，ON在含有任何二价简单金属阳离子(例如但不2+ 2+ 2+
限于，Ca 、Mg 和Fe )的水溶液中都不以盐的形式存在，而是以ON的螯合络合物形式存在。这些络合物由ON二聚 体或较高阶分子组织组成，其中ON是通过二价金属离子桥连接于它们的磷酸二酯骨架(参见图2B)。在特定的ON和金属阳离子浓度下，这些螯合络合物是稳定并且可溶于水溶液中，并且使ON螯合物中的任何二价阳离子有效地隔离溶液相互作用。这种螯合物形成也可能在带有3+电荷或更高电荷的简单金属阳离子情况下发生(如图2B中描绘的)。因此ON起多价金属阳离子螯合剂(chelaters)的作用并且不与多价金属阳离子形成盐。
限于，Ca 、Mg 和Fe )的水溶液中都不以盐的形式存在，而是以ON的螯合络合物形式存在。这些络合物由ON二聚 体或较高阶分子组织组成，其中ON是通过二价金属离子桥连接于它们的磷酸二酯骨架(参见图2B)。在特定的ON和金属阳离子浓度下，这些螯合络合物是稳定并且可溶于水溶液中，并且使ON螯合物中的任何二价阳离子有效地隔离溶液相互作用。这种螯合物形成也可能在带有3+电荷或更高电荷的简单金属阳离子情况下发生(如图2B中描绘的)。因此ON起多价金属阳离子螯合剂(chelaters)的作用并且不与多价金属阳离子形成盐。
[0086] ON螯合物可以含有各种多价金属阳离子，包括钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜、锌、镉、汞和铅。进一步显示这些多价金属阳离子的螯合导致形成由两个或两个以上通过金属阳离子连接的ON构成的ON螯合物并且在长度大于6个核苷酸的ON的情况下和在具有磷酸二酯或硫代磷酸酯键的存在下发生。ON可以任选每个键都被硫代磷酸酯化。螯合也在于核糖上含有2’修饰(如2’O甲基)或含有诸如5'甲基胞嘧啶或4-硫代尿嘧啶等修饰碱基的ON的情况下发生。这些2’修饰可以存在于一个或多个或所有核糖上并且修饰的碱基可以存在于一个或多个碱基上或普遍存在于每个碱基上(即所有胞嘧啶都以5'甲基胞嘧啶的形式存在)。此外，ON螯合物可以包含含有多个修饰如每个键都被硫代磷酸酯化、每个核糖都被2’修饰和每个碱基都被修饰的ON。下文进一步定义与ON螯合物形成相容的ON修饰。此外，金属阳离子的螯合与存在的核苷酸序列无关，而是依赖于所有ON共同的理化特征(参见图2A)。
[0087] 虽然ON螯合物的形成可以用任何二价金属阳离子实现，但是意图用作药物的ON螯合物应该优选仅含有钙和或镁，但是也可以含有痕量的铁、锰、铜或锌，并且不应该包括钴、钡、镍、镉、汞、铅或任何这里未列出的其他二价金属。
[0088] 重要的是，ON螯合物的形成不发生在诸如Na+、K+或NH4+等单价阳离子上并且因此不可能发生在任何单价阳离子上。因此，术语“ON盐”更准确地仅限于ON与单价阳离子或与不与ON形成螯合物的阳离子的盐。
[0089] 至少一部分已知的ON与血液中蛋白质组分的瞬时相互作用可能是由ON与诸如白蛋白等金属结合蛋白和钙依赖性凝血级联的蛋白质的相互作用介导的。因此以螯合络合物形式施用ON(这显著降低或消除它们与二价金属结合蛋白相互作用的倾向)可以减少这些蛋白质在血液中的相互作用并且使伴随ON施用的副作用(如瞬时抗凝血)较少并且与非螯合ON相比还可能提高到达靶器官(例如肝脏、肺或脾脏)的ON剂量分数。在本公开 之前，这种蛋白质相互作用减少对治疗活性的影响是未知的并且从未描述过。
[0090] 荧光偏振是用于研究分子间相互作用的常见方法。在这种技术中，用荧光标记物(例如FITC)标记待测物(即任何ON)。在溶液中，待测物分子由于布朗运动而在溶液中自由翻滚，这使得用恰当波长的光激发待测物时偏振荧光发射很弱。使用足够分子量的配体(至少和待测物一样大小)，待测物和配体之间的相互作用带来对所述络合物在溶液中翻滚的实质性抑制。由于抑制了溶液中的这种翻滚，因此在激发时荧光发射被显著偏振。因此使用这种技术，可以在溶液中测量相互作用而对任何一个结合配偶体都没有物理限制。荧光偏振报告为无量纲的mP，它与反应中的结合型待测物分子的分数成正比。例如，如果非常小的比例的待测物分子被特定配体结合，那么荧光偏振将会极少并且因此mP值也小。另一个极端，如果大部分待测物分子被特定配体结合(或用较高浓度的配体)，将有相当大的荧光偏振并且因此mP值也大。用这种方式，可以通过在固定量的荧光标记待测物的存在下改变配体浓度来产生特定待测物-配体相互作用的结合等势线。
[0091] 本文中使用不同的荧光标记ON来研究它们在多价金属阳离子存在下的络合物形成。虽然通过荧光偏振监测络合物形成需要这些ON被荧光标记，但是这种标记固定在ON的3’端上，以便不干扰所讨论的ON的含氮碱基或磷酸二酯骨架。此外，为了进一步排除溶液中的正常ON行为的任何扰动，荧光标记物通过刚性的3碳接头与ON保持远离。因此本文中使用荧光偏振用荧光标记ON观察到的任何ON络合物形成都是未标记ON(无论是否形成络合物)溶液行为的准确表现。
[0092] 本领域中的标准清楚地用ON钠盐教导了对需要治疗的受试者施用ON的做法。这通过在临床试验中施用众多钠盐形式的ON示范过，它们包括Fomivirisen(ISIS 2922)、Mipomersen(ISIS 301012)、Trecovirsen(GEM91)、Custirsen(OGX-011/ISIS 112989)、Genasense(G3139)、Aprinocarsem (ISIS 3531/LY 900003)、PRO-51(GSK 2402968) 和ALN-RSV01(Geary 等，2002,Clin.Pharmacokinetics,41:255-260；Yu 等，2009,Clin.Pharmacokinetics,48:39-50；Sereni 等，1999,J.Clin.Pharmacol.,39:47-54；Chi 等，2005,J.Nat.Canc.Inst.,97:1287-1296；Marshall 等，2004,Ann.Oncol.,15:1274-1283；
Grossman等，2004,Neuro-Oncol,6:32-40；Goemans 等，2011NEJM 364:1513-1522)。目前没有公开数据教导使用钙或镁或任何其他二价金属的任何肠胃外施用途径的寡核苷酸制剂。
Grossman等，2004,Neuro-Oncol,6:32-40；Goemans 等，2011NEJM 364:1513-1522)。目前没有公开数据教导使用钙或镁或任何其他二价金属的任何肠胃外施用途径的寡核苷酸制剂。
[0093] 与钠盐ON的施用有关的许多副作用都可以归因于它们的螯合效应。ON的抗凝血至少部分是由血清钙被ON螯合从而削弱钙依赖性凝血级联引起的。血清钙的螯合以及它能够导致的潜在血清低血钙还与通过IV施用来施用ON观察到的副作用一致，所述副作用包括发热、发抖、虚弱和动脉血压下降(后者伴随快速IV输注或注射)。伴随皮下注射ON观察到的注射部位反应(硬化、炎症、脆弱和疼痛)至少部分归因于在注射部位的ON对钙和可能的其他二价阳离子(如镁)或多价阳离子的局部螯合。已显示施用螯合络合物形式的ON可减轻许多这些副作用(参见WO 2012/021985)。
[0094] 术语寡核苷酸(ON)是指核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物。这个术语包括由修饰的核碱基(包括5'甲基胞嘧啶和4’硫代尿嘧啶)、糖和共价核苷间(骨架)键联构成的ON以及具有功能类似的非天然存在的部分的ON。由于所希望的特性，例如降低的免疫反应性、增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力以及增加的在核酸酶的存在下的稳定性，这类修饰或取代的ON可能比天然形式优选。ON也可以是双链的。
[0095] ON可以包括各种修饰，例如，稳定化修饰，并且因此可以在磷酸二酯键和/或在糖上和/或在碱基上包括至少一个修饰。例如，ON可以包括(但不限于)一个或多个修饰，或者被完全修饰以便含有具有所述修饰的所有键或糖或碱基。修饰的键可以包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和/或甲基膦酸酯键。虽然修饰的键是有用的，但是ON可以包括磷酸二酯键。其它有用的修饰包括(但不限于)在糖的2’位的修饰，包括2’-O-烷基修饰，如2’-O-甲基修饰、2’O-甲氧基乙基(2’MOE)、2’-氨基修饰、2’-卤代修饰，如2’-氟；和/或非环核苷酸类似物。其他2’修饰也是本领域已知的并且可以使用，如锁核酸。具体来讲，ON到处都具有修饰的键或者每个键都被修饰，例如，硫代磷酸酯化；具有3’-和/或
5’-帽子；包括末端3’-5’键；所述ON是或者包括由通过接头连接的两个或两个以上ON组成的多联体。碱基修饰可以包括胞嘧啶碱基的5'甲基化(5’甲基胞嘧啶或在核苷酸的环境中，5’甲基胞苷)和/或尿嘧啶碱基的4’硫化(4’硫脲嘧啶或在核苷酸的环境中，4’硫代尿苷)。当合成条件在化学上相容时，如具有带有硫代磷酸酯键、2’核糖修饰(如2’O-甲基化)和修饰碱基(如5'甲基胞嘧啶)，可以合并不 同化学相容的修饰的键。ON可以用所有这些不同修饰进一步完全修饰(例如每个键都被硫代磷酸酯化、每个核糖都被2’修饰以及每个碱基都被修饰)。
5’-帽子；包括末端3’-5’键；所述ON是或者包括由通过接头连接的两个或两个以上ON组成的多联体。碱基修饰可以包括胞嘧啶碱基的5'甲基化(5’甲基胞嘧啶或在核苷酸的环境中，5’甲基胞苷)和/或尿嘧啶碱基的4’硫化(4’硫脲嘧啶或在核苷酸的环境中，4’硫代尿苷)。当合成条件在化学上相容时，如具有带有硫代磷酸酯键、2’核糖修饰(如2’O-甲基化)和修饰碱基(如5'甲基胞嘧啶)，可以合并不 同化学相容的修饰的键。ON可以用所有这些不同修饰进一步完全修饰(例如每个键都被硫代磷酸酯化、每个核糖都被2’修饰以及每个碱基都被修饰)。
[0096] 在本说明书中，术语“抗病毒ON”是指借助于其特定的生化活性(无论是序列相关或序列无关的)能够直接或间接抑制病毒复制的一些方面或直接或间接增强宿主通过免疫或其他机制清除感染的能力的任何ON。
[0097] 在本公开中，术语“抗病毒ON螯合物”是指在溶液中分子间通过多价金属阳离子连接的两个或两个以上抗病毒ON的络合物。所述抗病毒ON螯合物可以包含两个或两个以上具有不同序列的ON。
[0098] 在本公开中，术语“抗胆固醇ON”是指借助于其特定的生化活性(无论是序列相关或序列无关的)能够直接或间接降低受试者的异常升高的总血清胆固醇和或低/极低密度脂蛋白血清水平的任何ON。
[0099] 在本公开中，术语“抗胆固醇ON螯合物”是指分子间通过多价金属阳离子连接的两个或两个以上抗胆固醇ON的络合物。所述抗胆固醇ON螯合物可以包含两个或两个以上具有不同序列的ON。
[0100] 在本公开中，术语“抗甘油三酯ON”是指借助于其特定的生化活性(无论是序列相关或序列无关的)能够直接或间接降低受试者的异常升高的血清甘油三酯水平的任何ON。
[0101] 在本公开中，术语“抗甘油三酯ON螯合物”是指分子间通过多价金属阳离子连接的两个或两个以上抗甘油三酯ON的络合物。所述抗甘油三酯ON螯合物可以包含两个或两个以上具有不同序列的ON。
[0102] 在本公开中，术语“抗阿尔茨海默ON”是指借助于其特定的生化活性(无论是序列相关或序列无关的)具有以下能力的任何ON：
[0103] A.直接或间接终止、延缓或逆转淀粉状蛋白-β在脑内的积累或表达；
[0104] B.直接或间接终止、延缓或逆转阿尔茨海默斑在脑内的形成或生长；和/或[0105] C.直接或间接终止、延缓或逆转与阿尔茨海默病发展有关的神经功能障碍。
[0106] 在本说明书中，术语“抗阿尔茨海默ON螯合物”是指分子间通过多价金属阳离子连接的两个或两个以上抗阿尔茨海默ON的络合物。
[0107] 在本说明书中，术语“抗朊病毒ON”是指借助于其特定的生化活性(无论是序列相关或序列无关的)具有以下能力的任何ON：
[0108] A.直接或间接终止、延缓或逆转朊蛋白在外周或脑内的形成；和/或
[0109] B.直接或间接终止、延缓或逆转与朊病毒病有关的神经功能障碍。
[0110] 在本说明书中，术语“抗朊病毒ON螯合物”是指分子间通过多价金属阳离子连接的两个或两个以上抗朊病毒ON的络合物。所述抗朊病毒ON螯合物可以包含两个或两个以上具有不同序列的ON。
[0111] 在本申请中，术语“简并ON”意指在每个位置上都具有摆动碱基(N)的单链ON，如NNNNNNNNNN。每个碱基都合成为摆动碱基，以使这个ON实际上作为一群具有相同长度和理化性质的不同随机生成的序列存在。例如，对于长度为40个碱基的简并ON，在所述群中的40 -25 23
任何特定序列理论上仅表示总分数的1/4 或8.3X 10 。假定1摩尔＝6.022X10 个分子，1摩尔40聚体ON的质量实际上大约为12-14kg(取决于存在的序列和修饰)，任何具有有效存在的特定序列的ON在任何制剂中不出现多于一次。因此在这种制剂中观察到的任何螯合物形成或生物活性必定是由于ON的非序列相关(或与所述序列无关)的理化性质，因为不能期望具有定义序列的任何特定ON(在所述制剂中是独特的)贡献来源于其特定核苷酸序列的任何活性。
任何特定序列理论上仅表示总分数的1/4 或8.3X 10 。假定1摩尔＝6.022X10 个分子，1摩尔40聚体ON的质量实际上大约为12-14kg(取决于存在的序列和修饰)，任何具有有效存在的特定序列的ON在任何制剂中不出现多于一次。因此在这种制剂中观察到的任何螯合物形成或生物活性必定是由于ON的非序列相关(或与所述序列无关)的理化性质，因为不能期望具有定义序列的任何特定ON(在所述制剂中是独特的)贡献来源于其特定核苷酸序列的任何活性。
[0112] 作为这个概念的再一个示例，实施例I通过高压液相色谱法和质谱法比较REP2006(具有简并的完全硫代磷酸酯化的序列的40聚体ON)与具有定义序列(也完全被硫代磷酸酯化)的21聚体ON的表征，并明确显示具有相似大小和化学修饰(即硫代磷酸酯化)的任何ON将具有不受存在的核苷酸序列影响的高度相似的(如果不相同)理化特征(参见图1A-C)。
[0113] 在本申请中，术语“核酸聚合物”或NAP意图用来鉴别不包含序列特异性功能的任何单链ON。NAP的生化活性不依赖于ON的Toll样受体识别、与靶核酸的杂交或需要来源于存在的核苷酸的特定顺序的特定二级三级ON结构的适体相互作用。NAP可以包括如上所述的碱基和或键和或糖修饰。
[0114] ON可以通过序列相关或序列无关的众多机制来发挥它们的作用。序列相关的机制是其活性需要特定的核酸序列并且其中所述活性因存在的核苷酸序列中的一个或多个改变而降低的那些机制。这个特定的序列可能 涵盖ON的整个长度或只有它的一部分(序列基序)。序列相关的ON的实例包括：
[0115] 1.反义ON(单链或双链(例如小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA))与疾病病况(即病毒感染或胆固醇的调节)中涉及的信使RNA(mRNA)(即病毒mRNA或宿主mRNA)的特定部分互补并且当引入细胞时，它们通过RNA酶H或RNA诱导的沉默络合物(RISC)引导这些目标mRNA降解。
[0116] 2.空间阻断(Stearic blocking)ON是与mRNA的特定部分互补但被工程改造成不活化RNA酶H的单链反义ON。这些ON与它们的靶mRNA的杂交产生对通常作用于所述mRNA的蛋白质提供位阻(stearic hindrance)的双链结构。这些ON可以用于阻断特定mRNA的翻译或者用于干扰特定mRNA的转录后剪接和成熟。这些ON可被工程改造成通过遍及其中或在存在于ON中的每个核糖上的2’核糖修饰(如2’O甲基化)来阻断RNA酶H的活化(因为RNA酶H的活化与这些ON的作用机制不是一个整体)。
[0117] 3.适体是采取能够进行特异性蛋白质相互作用(即与病毒蛋白质或宿主蛋白质)的特定三维构象并且不容易与宿主DNA或RNA相互作用的ON。适体也可以包括镜像异构体，它使用L-核苷酸以赋予所述ON对核酸酶降解的抗性。
[0119] 5.微型RNA(miRNA)结合并阻断疾病病况(即病毒复制或胆固醇调节)中涉及的天然存在miRNA的功能。
[0120] 反义ON可以应用于各种疾病病况，如通过催化病毒mRNA的降解而靶向病毒活性(例如ALN-RSV01；Zamora等，2011,Am.J.Respir.Crit.Care Med.183:531-538)或通过催TM化ApoB100mRNA的降解而靶向LDL和VLDL的产生(例如mipomersen[Kynamro ]；Raal等，
2010,Lancet 375:998-1006)。反义ON也可以用于纠正基因转录产物的错误剪接，基因转录产物的错误剪接可以产生异常的蛋白质，如纠正发生在杜馨氏肌肉营养不良症中的肌萎缩蛋白基因转录产物的错误剪接(例如PRO-051，Goemans等，2011,NEJM 364:1513-1522)。
2010,Lancet 375:998-1006)。反义ON也可以用于纠正基因转录产物的错误剪接，基因转录产物的错误剪接可以产生异常的蛋白质，如纠正发生在杜馨氏肌肉营养不良症中的肌萎缩蛋白基因转录产物的错误剪接(例如PRO-051，Goemans等，2011,NEJM 364:1513-1522)。
[0121] miRNA可以应用于各种疾病病况，如与细胞内的天然存在miR-122杂交并催化其降解，所述miR-122在LDL和VLDL产生的调节以及丙型肝炎的产生中均涉及到(例如miravirsen：Janssen等2013年3月27日NEJM，在印刷之前的电子出版)。
[0123] 任何ON，无论它在生理环境中如何发挥其生物学效应，都预期会在所述寡核苷酸进入血液循环中时形成二价阳离子介导的相互作用，在血液循环中包含一些游离的二价或三价阳离子，但是其中大部分血清二价金属是与蛋白质结合的(例如钙与诸如白蛋白、凝血酶和纤维蛋白原等钙结合蛋白结合)。因此，在体内环境中大部分二价金属介导的寡聚物相互作用很可能是与蛋白质发生的，而不是与另一个寡核苷酸(在螯合物中)。因为已经证明众多ON在按照其设计(无论作为单链反义、siRNA、shRNA抑或miRNA)在体内施用时具有可预测的功能，所以这些钙介导的蛋白质相互作用虽然具有ON的耐受性方面的影响(如国际申请公布号WO2012/021985和美国申请公布号2012/0046348中所述)，但是似乎是可逆的，以便不妨碍ON的器官积累、ON的胞内运输和这些ON与其体内核酸靶标的相互作用。能够合理地预测这些相互作用的可逆性是与这些二价金属介导的寡聚物-蛋白质相互作用有关。因为施用寡核苷酸螯合物可能会干扰这些蛋白质相互作用(如美国申请公布号2012/0046348中所述)，所以本领域技术人员将合理地预测，施用ON螯合物会改变ON的药动学特性(和器官积累)，特别是已知在肾脏、肝脏、肺和脾脏中积累并且在本领域中公认与ON-蛋白质相互作用有关的硫代磷酸酯化ON(PS-ON)。
[0124] 此外，如美国申请公布号2012/0046348中所述的ON螯合物的制备涉及在不存在任何蛋白质以及存在比通常存在于血液循环中的浓度高的浓度的二价金属阳离子的情况下的ON相互作用，并且根据如美国申请公布号2012/0046348中所描述教导的技术可以合理地预测，这些ON螯合物会丧失其通常与血液中的蛋白质相互作用的能力(所有ON必须通过血液循环转移，无论其在体内的最终命运如何)。因此，虽然施用ON螯合物会防止或减轻ON在体内的螯合特性并且因此减轻源于寡聚物螯合效应的副作用，但是在本发明提供能够实现的公开内容之前用于制备ON螯合物制剂 (它们是在体外和非生理环境中形成的)的ON在以螯合物形式施用(与以钠盐形式对受试者施用时的ON活性相比)是否会保留其特异性器官积累和功能是不可预测或不明显的。因为ON螯合物不是在体内形成的，所以可能不能解离和或转运到细胞内和或接纳正确的蛋白质和或在体内发生其他生化相互作用以发挥其功能(例如与互补DNA或RNA链退火或与蛋白质中的两亲螺旋相互作用或与特定的蛋白质形成序列特异性适体相互作用)。此外，与以简单ON盐形式施用时的相同ON相比，施用预先形成的ON螯合物可能会导致宿主受试者体内的需要部位中的积累减少。因此，在本文中的公开内容之前，并不清楚当引入生理环境中时或当对受试者施用时任何特定的ON螯合物会保留其非螯合ON盐前体(progenitor)的生化功能。
[0125] 此外，因为在溶液中与二价金属形成螯合物的螯合性质和能力是任何ON所固有的，所以当以螯合物形式施用时任何特定的ON保留生物活性的验证将提供明确的证据和教导，即当以螯合物形式施用时任何ON的生物活性将被保留，而无论其特定的作用方式或靶标疾病如何。
[0126] 若干基于抗病毒ON的药物目前正在开发用于治疗病毒感染，包括用于治疗HBV的NAP REP 9AC(REP 2055或SEQ ID NO:2，REP 9AC’(REP2139或SEQ ID NO:18)和REP9AC-m(REP 2148或SEQ ID NO:11)，用于治疗HCV的miravirsen和用于治疗呼吸道合胞病毒(RSV)的ALN-RSV01。这些ON各有不同的作用机制：基于核酸的聚合物阻断HBV病毒进入并且还阻止HBV表面抗原蛋白(HBsAg)释放进入血液(一种抑制免疫功能的蛋白质)，miravirsen(一种miRNA)阻断微型RNA mir-122的作用，已知mir-122在HCV复制中发挥作用，以及ALN-RSV01(一种siRNA)阻断RSV衣壳蛋白的合成，从而防止RSV病毒粒子产生。所有这些ON药物可在受试者中非常有效地引起其预期作用：REP 9AC/REP 9AC’对于从血液中清除HBsAg非常有效，miravirsen对于抑制mir-122功能非常有效，而ALN-RSV-01对于阻断衣壳蛋白质生产非常有效。然而，在肠胃外施用这些基于ON的化合物的任何情况下，当通过静脉内输注施用时，它们与诸如发热、寒战、发抖等施用相关的副作用有关，或者当通过皮下施用进行施用时与注射部位的疼痛、炎症或硬化有关。
[0127] 已经证明若干ON在治疗人患者的高胆固醇血症和高甘油三酯血症中有效。它们TM是mipomersen(Kynamro )，一种靶向Apo B100合成的第二 代反义寡核苷酸；PCS-GalNAc，一种靶向PCSK9和NAP的糖缀合siRNA(参见实施例V)。
[0128] 还在动物中在体外和体内证明了NAP能够阻止朊病毒病的发展(Kocisko等，2006,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50:1034-1044)。
[0129] 使用寡核苷酸来纠正疾病病况中的异常RNA剪接也是各种疾病病况中公认的治疗干预(Du和Gatti,2009,Curr.Op.Mol.Ther.,11:116-123)。在杜馨氏肌肉营养不良症的情况下，寡核苷酸PRO-051被设计成在成熟期间结合肌萎缩蛋白RNA并且诱导跳过成熟mRNA中的外显子51，从而恢复患病肌纤维中的正常肌萎缩蛋白产生(Goemans等，2011,NEJM 364:1513-1522)。然而，传统的PRO-051施用伴随有注射部位反应，这至少部分是由于美国申请公布号2012/0046348中所述的ON的螯合介导的性质。
[0130] 为了使其施用相关的副作用最小化，希望任何这些基于ON的药物被制备为ON螯合物，前提是它们能够保留其生化功能。本公开证明ON可以被制备成螯合物并且仍然保留其生化功能。制剂中的ON螯合物可以来源于具有抗病毒活性的任何ON，其实例在表1中提供。
[0131] 表1
[0132] 可以制备成螯合物的ON的实例。
[0133]
[0134]
[0135] LNA＝锁核酸，PS＝硫代磷酸酯，2’OMe＝2’O甲基，2’MOE＝2’甲氧基乙基，5’MeC＝5’甲基胞嘧啶
[0136] 此外，以上组合物可以包含生理学和/或药学上可接受的载剂、佐剂、媒介物和/或赋形剂。载剂的特征可能取决于施用途径。术语“药学上可接受的载剂、佐剂、媒介物和/或赋形剂”是指可以对受试者施用，并入本文中描述的组合物中并且不破坏其药理学活性的载剂、佐剂、媒介物或赋形剂。可用于本文中描述的药物组合物中的药学上可接受的载剂、佐剂和媒介物包括但不限于以下：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(“SEDDS”)、在药物剂型中使用的表面活性剂如Tweens或其他类似聚合递送基质、血清蛋白质如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇、羊毛脂、癸酸钠或十四烷基麦芽糖苷(TDM)、TDM衍生物或其他烷基化糖。环糊精如α-、β-和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物如羟基烷基环糊精(包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精)，或其它溶解的衍生物也可以用来增强本文所描述的组合物的递送。
[0137] 本文中描述的组合物可以包含如下所述的其他治疗剂，并且可以例如根据如药物制剂领域中熟知的那些技术通过使用传统的固体或液体媒介物或稀释剂以及适合于所要施用方式的类型的药物添加剂来(例如，赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)来配制。
[0138] 本文中描述的组合物可以通过任何合适的手段施用，例如，口服，诸如以液体混悬液、片剂、胶囊、颗粒或散剂形式；舌下；口腔；肠胃外，诸如通过皮下、静脉内、肌内、鞘内注射或输注技术(例如，以无菌可注射水性或非水性溶液或混悬液形式)；鼻腔，诸如通过吸入喷雾；局部，诸如以乳膏或软膏形式；或直肠，诸如以栓剂或灌肠剂形式；以包含药学上可接受的无毒媒介物或稀释剂的剂量单位制剂。本组合物可以例如以适于即时释放或延缓释放的形式施用。即时释放或延缓释放可以通过使用合适的药物组合物来实现，或者，特别是在延缓释放的情况下，通过使用诸如皮下植入物或渗透泵等装置来实现。因此，以上组合物可能适合通过以下途径中的任一者来施用：眼内、口服、肠道、吸入、皮下注射、肌内注 射、腹膜内注射、鞘内注射或输注、气管内、静脉内注射或者输注，或局部。
[0139] 用于口服施用的示例性组合物包括混悬液和即时释放片剂，所述混悬液可包含例如用于赋予整体性的微晶纤维素，作为助悬剂的海藻酸或海藻酸钠，作为粘度增强剂的甲基纤维素，和甜味剂或调味剂，诸如本领域已知者；并且所述即时释放片剂可包含例如微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其他赋形剂、粘合剂、增积剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂，诸如本领域已知者。本组合物也可以通过舌下和/或口腔施用来经由口腔递送。模制片剂、压制片剂或冻干片剂是可以使用的示例性形式。示例性的组合物包括用诸如甘露醇、乳糖、蔗糖和/或环糊精等速溶稀释剂配制本组合物的那些。这些制剂中还可以包含诸如纤维素(avicel)或聚乙二醇(PEG)等高分子量赋形剂。这些制剂还可以包含赋形剂以帮助粘膜粘附，如羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酸酐共聚物(例如，Gantrez)和诸如聚丙烯酸共聚物等控制释放的药剂(例如，Carbopol 934)。为便于制造和使用，还可以添加润滑剂、助流剂、调味剂、着色剂和稳定剂。
[0140] 本文中描述的化合物的有效量可以由本领域的一般技术人员确定，并且包括示例性的剂量，对于成年人是每天每公斤体重约0.1至50mg活性化合物，这可以以单次剂量或以分开的个别剂量的形式施用，如每天1至5次，或者在一周特定施用期间以施用多次的剂量施用。应理解的是，对于任何特定的受试者来说，特定的剂量水平和给药频率可能相异，并且将取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性、那种化合物的代谢稳定性和作用时长、受试者的物种、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、施用方式和时间、排泄率和清除率、药物组合和特定病状的严重程度。治疗的优选受试者包括动物，最优选地是哺乳动物物种如人，和家畜如犬、猫等。
[0141] 通过参考以下实施例将更容易地理解本公开。
[0142] 实施例I
[0143] ON螯合物的形成
[0144] 图1A详细说明通过HPLC(使用疏水柱)分离同时共同注射到柱子中的两种ON制剂。其中的第一个称为内标物并且是具有特定的定义序列的 21聚体硫代磷酸酯化ON，第二个是REP 2006(40聚体简并硫代磷酸酯化ON)。这两种物质仅根据其理化性质(即大小和疏水性)分离成不同的定义峰；每个这些ON中存在的核苷酸序列对其理化性质没有重要影响并且因此对其分离没有影响。因此，内标物与REP 2006相比作为具有较小保持时间的严格定义的峰流出柱子，只是由于这两种ON聚合物的大小不同。注意到在REP 2006峰任何一侧的肩峰是由于在较长ON的制备中通常存在的失败序列。虽然REP 2006的序列性质不均一，但是它像21聚体特定序列那样通过HPLC解析为相似地定义明确的峰，这说明REP2006制剂中的所有物质的共同理化性质，即使存在极大数目的不同序列。在通过HPLC分离REP 2006和21聚体峰之后，它们可以进行质谱(MS)分析以鉴定在这些定义峰内存在的物质(图1B和1C)。
[0145] 在图1B中，21聚体被解析成具有7402.6Da的MW的单一物质，与具有定义的序列的这种PS-ON一致。然而，REP 2006的MS分析(图1C)显示存在极大数目的物质，它们的质量范围具有几乎完美的正态分布，与其完全简并的性质一致。这个质量范围从C40(最小的物质)到A40(最大的物质)并且这些物质的出现率(prevalence)极小，随着这些物质质量接近质量范围的中心，物质的数目升高(峰强度)。这是因为越来越大的数目的不同序列将导致相似的质量。REP 2006中存在的所有不同ON物质在HPLC分离期间在疏水柱上具有相同保持时间的这一事实明确表明具有相同大小并且带有相同化学修饰(即硫代磷酸酯化)的所有ON将具有高度相似(如果不相同)的理化性质，并且因此，可以认为在不依赖于存在于特定ON分子中的核苷酸序列的任何应用或性质中功能相似。因此，用任何特定简并ON(例如REP 2003、REP 2004，参见表2)观察到的任何ON螯合物形成不能依赖于存在的ON序列并且必须取决于任何ON的保守理化性质。
[0146] 通过如上所述的荧光偏振(FP)研究了ON铵盐与各种二价金属阳离子的相互作用。在ON合成期间，使用良好建立的试剂和合成方案在3’端通过刚性的3碳接头将每个ON缀合到异硫氰酸荧光素(FITC)上。这些ON从合成中裂解并且作为铵盐留下。表2中描述这个实施例中使用的ON。
[0147] 表2
[0148] 实施例I中使用的单链ON
[0149]
[0150]
[0151] N＝简并序列(随机加入A、G、C或T)
[0152] PS＝在每个键都硫代磷酸酯化
[0153] 2’O Me＝在每个核糖上都2’O甲基化
[0154] 使用的3’FITC标记的ON是REP 2032-FL(6聚体硫代磷酸酯化简并寡脱氧核苷酸)、REP 2003-FL(10聚体硫代磷酸酯化简并DNA ON)、REP2004-FL(20聚体硫代磷酸酯化简并寡脱氧核苷酸)、REP 2006-FL(40聚体硫代磷酸酯化简并DNA ON)、REP 2031-FL(40聚体聚胞苷硫代磷酸酯化DNA ON；SEQ ID NO:1)、REP 2107-FL(每个核糖都被2’O甲基化修饰的40聚体硫代磷酸酯化简并RNA ON)、REP 2086-FL(每个核糖都被2’O甲基化修饰的40聚体简并磷酸二酯RNA ON)、REP 2055-FL(具有序列[AC]20的硫代磷酸酯化DNA ON；SEQ ID NO:2)、REP 2057(具有序列[AG]20的硫代磷酸酯化DNA ON；SEQ ID NO:3)和REP
2139-FL(具有序列[2’OMeA-2’OMe,5’MeC]20的硫代磷酸酯化RNA ON，它的每个核糖都被
2’O甲基修饰并且每个胞嘧啶都被5’甲基化；SEQ ID NO:18)。这些ON各自被制备成在1mM TRIS中的0.5mM储备液(pH 7.2)。这些储备液用于在FP缓冲液(10mM TRIS，80mM NaCl，
1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇和0.1％ -20)中制备3nM荧光ON溶液。存在的EDTA
用于除去FP测定之前溶液中存在的任何二价金属。每种这些缓冲溶液还包含80mMNaCl以评价在摩尔过量的单价阳离子存在下的ON络合物形成。向溶液中的每种荧光ON添加各种量的ACS级二价(2+)金属氯化物盐(如表3中所述)。二聚体或高阶ON螯合物的形成是通过荧光偏振的升高(通过无量纲单位“mP”定量)监测的，因此ON螯合物形成增加导致质量有较大改变(参见图3)。引起的这些ON螯合物在溶液中的翻滚减慢导致发射荧光的偏振增加(参见图4)。这些实验的结果在表3中提供。
2139-FL(具有序列[2’OMeA-2’OMe,5’MeC]20的硫代磷酸酯化RNA ON，它的每个核糖都被
2’O甲基修饰并且每个胞嘧啶都被5’甲基化；SEQ ID NO:18)。这些ON各自被制备成在1mM TRIS中的0.5mM储备液(pH 7.2)。这些储备液用于在FP缓冲液(10mM TRIS，80mM NaCl，
1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇和0.1％ -20)中制备3nM荧光ON溶液。存在的EDTA
用于除去FP测定之前溶液中存在的任何二价金属。每种这些缓冲溶液还包含80mMNaCl以评价在摩尔过量的单价阳离子存在下的ON络合物形成。向溶液中的每种荧光ON添加各种量的ACS级二价(2+)金属氯化物盐(如表3中所述)。二聚体或高阶ON螯合物的形成是通过荧光偏振的升高(通过无量纲单位“mP”定量)监测的，因此ON螯合物形成增加导致质量有较大改变(参见图3)。引起的这些ON螯合物在溶液中的翻滚减慢导致发射荧光的偏振增加(参见图4)。这些实验的结果在表3中提供。
[0155]
[0156] 在各种情况下，在所有二价阳离子存在下所有ON都观察到荧光偏振有显著升高，表明与二价金属阳离子形成ON螯合物。这些结果证明以下结论：
[0157] ·ON在钙和镁存在下形成二聚体和高阶络合物。预期与所有其他二价金属阳离子形成这些络合物。这些ON络合物的形成涉及ON与这些二价金属阳离子的相互作用。
[0158] ·ON络合物的形成不可能是由于含氮碱基之间通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)相互作用的杂交，因为所测试的ON的简并性质。此外，REP 2031(SEQ ID NO:1)、REP 2055(SEQ ID NO:2)、REP 2057(SEQ ID NO:3)或REP 2139(SEQ ID NO:18)不能在使用的实验条件下自身杂交。
[0159] ·ON络合物的形成是稳定的并且可溶于水溶液，并且因为这些络合物似乎将所讨论的二价金属并入成为形成的络合物的一部分，所以这些ON络合物具有从形成所述ON络合物的溶液中螯合所讨论的二价金属的作用。
[0160] ·这些金属的螯合以及ON螯合物的形成不依赖于特定的核苷酸序列，这可以通过用简并ON观察到的螯合所证明，并且还在包含磷酸二酯键或2’核糖部分修饰或碱基修饰在内的核苷酸修饰(例如5'甲基胞嘧啶)的情况下发生。
[0161] ·这些金属与这个实施例中的6-40个核苷酸长度的ON发生螯合，这表明能够与任何长度或大于40个核苷酸长度的ON形成ON螯合物。
[0162] 实施例II
[0163] 与双链ON形成ON螯合物
[0164] 双链ON是按照WO 2012/021985中的描述由在水溶液中通过沃森-克里克相互作用彼此杂交的两个单链互补ON形成的。因为双链ON仍然具有暴露在形成的DNA螺旋外面的磷酸二酯骨架，所以它们应该能够在二价阳离子存在下形成螯合物。为了验证这个假设，通过杂交REP 2055-FL(40聚体聚AC；SEQ ID NO:2)与REP 2033-FL(40聚体聚TG；SEQ ID NO:6)以及REP 2057-FL(40聚体聚AG；SEQ ID NO:3)与REP 2056-FL(40聚体聚TC；SEQ ID NO:5)制备了两个不同双链DNA ON。因为ON杂交得到双链体，所以引起的质量增加可以通过相对于用于制备所述络合物的单链 ON的荧光偏振增加来检测。将单链ON(REP 2055-FL(SEQ ID NO:2)、Rep2033-FL(SEQ ID NO:6)、Rep 2057-FL(SEQ ID NO:3)和REP 2056-FL(SEQ ID NO:5))各自在1X FP缓冲液中稀释至20nM。上面鉴定的两个互补对的杂交也在1X FP缓冲液(每个ON 10nM)中进行并且通过荧光偏振的增加来确认杂交。随后将双链构建体暴露于100mM CaCl2或100mM MgCl2。ON螯合物形成是通过荧光偏振的进一步增加来监测的(参见表4)。这个实验的结果证实两个ON互补对成功杂交成双链ON，如通过荧光偏振的增加所证明。此外，向这些双链ON中添加CaCl2或MgCl2引起荧光偏振进一步增加，表明这些双链ON也能够在二价金属阳离子存在下形成螯合物。这些结果还有力地表明双链ON可以与任何二价阳离子形成ON螯合物并且也预期具有从溶液中隔离(sequestering)二价阳离子的作用。
[0165]
[0166] 实施例III
[0167] ON螯合物在不同包膜病毒中的体外抗病毒活性
[0168] 进行实验以验证ON螯合物在来自不同病毒科的以下三种不同包膜病毒中的抗病毒活性：单纯疱疹病毒-2(HSV-2)MS病毒株(疱疹病毒科)、甲型流感病毒(INFA)香港病毒株(正粘病毒科)和呼吸道合胞病毒(RSV)Long病毒株(副粘病毒科)。对于每种病毒，通过测量每种病毒对其宿主细胞的病毒细胞病变效应的抑制来比较在体外具有已知抗病毒活性的ON与其钙螯合物的功效。对于HSV-2和RSV，使用Vero细胞，并且对于INFA，使用MDCK细胞。对于HSV-2抗病毒评价，使用空斑减少测定，并且对于INFA和RSV，使用细胞病变效应(CPE)测定。
[0169] 对于所述空斑减少测定，使用Vero生长培养基将Vero细胞以75,000个细胞/孔接种在24孔板中。将板在37℃和5％CO2下孵育过夜。次日，吸出培养基并且在200μL体积测定培养基(包含2％FBS的Vero生长培养基)中添加大约100个空斑形成单位(pfu)的HSV。在37℃和5％CO2下1小时使病毒吸附在细胞上。通过在包含0.5％甲基纤维素的测定培养基中稀释化合物来制备化合物。孵育期之后，向板的孔中加入1mL每种药物稀释物，每种药物三个孔(不吸出病毒接种物)。将板孵育两天以允许空斑形成。随后从孔中吸出培养基并且将细胞固定，使用包含结晶紫的20％甲醇染色。通过显微检查计算空斑数并且将数据作为病毒对照的百分比作图。
[0170] 对于CPE测定，在测试化合物的存在下混合病毒和细胞并且孵育需要的测定持续时间(HSV-2为5天，INFA和RSV为7天)。预先滴定每种病毒以使对照孔显示由病毒复制引起的85至95％的细胞活力损失。因此，当化合物阻止病毒复制时观察到抗病毒作用或细胞保护作用。评价样品的抗病毒功效，其中使用12个通过连续稀释制备的浓度重复三次测量来测定IC50值，并且重复两次测量来测定细胞毒性(如果可检测)。为了这个研究的目的，每个测定中的FBS浓度是0.5％。在测定结束时，用基于四唑的可溶性染料MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)染色测定板以测定细胞活力。MTS被代谢活跃细胞的线粒体酶代谢，得到可溶性甲臜产物，从而允许快速定量分析细胞活力和化合物细胞毒性。这种试剂是稳定的单一溶液，它不需要在使用之前制备。在测定结束时，每个孔添加10-25uL MTS试剂(基于体积10％最终浓度) 并且随后在37℃、5％CO2下将微量滴定板孵育4-6小时以评价细胞活力。使用封口膜(Adhesive plate sealer)替代盖子，将密封的板翻转若干次以混合可溶性甲臜产物并且用Molecular Devices Vmax或SpectraMax Plus微孔板读取仪在490/650nm下读取板的分光光度检测数据。评价抗病毒活性的化合物包括REP 2055钙螯合物和REP 2139钙螯合物(参见表5)。REP 2055(具有序列[AC]20的40聚体硫代磷酸酯化DNA ON；SEQ ID NO:2)和REP2139(具有序列[2’OMeA-2’OMe,5’MeC]20的40聚体硫代磷酸酯化RNA ON；SED ID NO:18)是对包膜病毒具有广谱抗病毒活性的NAP(Bernstein等，2008Antimicrobial Agents Chemother.,52:2727-2733；Cardin 等，2009,Virology J.6:214；Vaillant 等，2006,Antimicrobial Agents Chemother.,50:1393-1401；Guzman 等，2007,Antiviral Therapy,12:1147-1156；Lee等，Virology,372:107-117；Matsumura等，2009,Gastroenterology,137:673-681和美国专利8,008,269、8,008,270和8,067,385)。抗病毒活性唯一需要的NAP修饰是ON中的每个键的硫代磷酸酯化。包括2’核糖修饰(如2’O甲基化)和碱基修饰(如5’甲基胞嘧啶和/或4’硫代尿嘧啶)在内的其它修饰对NAP的抗病毒活性的影响可以忽略，但是可以用于优化人患者体内的耐受性。REP 2055和REP 2139按照国际申请公布号WO 2012/021985和美国申请公布号2012/0046348制备为钙螯合物，其中比率是每100mg ON使用30mg CaCl2。
[0171] 表5
[0172] ON螯合物的体外抗病毒活性
[0173]
[0174]
[0175] 在研究的所有三种病毒中，确定了REP 2055钙螯合物和REP 2139钙螯合物的抗病毒活性。这证明对HSV-2、RSV和INFA具有广谱抗病毒活性的NAP ON可以制备为螯合络合物并且仍然在这些病毒中显示抗病毒活性。此外，因为作为ON螯合物施用时这些ON的抗病毒活性保留，所以作为ON螯合物施用其他种类的ON(反义、siRNA、miRNA等)也可能对这些ON的生物活性没有显著影响。这可能是由于实际上特定的蛋白质相互作用(在NAP或适体或CpG ON的情况下)或核酸相互作用(在反义、siRNA或miRNA的情况下)具有比发生在ON螯合物中的ON/多价金属阳离子相互作用高得多的亲和力。结合ON螯合物与非螯合ON盐相比改善的毒理学性质，这些实验表明螯合的抗病毒ON可能是比其非螯合对应物更合乎需要的抗病毒药物。此外，预期由基于核酸的聚合物制备的ON螯合物通常将会对包膜病毒具有广谱抗病毒活性，大体如美国专利8,008,269、8,008,270和8,067,385所公开的。
[0176] 实施例IV
[0177] ON螯合物是对人患者的慢性HBV感染有效的抗病毒剂。
[0178] 对已存在慢性HBV感染的患者每周施用一次摩尔剂量相当的按照如上所述的本领域标准制备成简单钠盐溶液的REP 2055和制备成钙螯合物的REP 2139(按照国际申请公布号WO 2012/021985和美国申请公布号2012/0046348每100mg REP 2139用30mg CaCl2来制备)。当使用类似的给药方案给予相当的摩尔剂量时，通过血液中HBV表面抗原蛋白TM(HBsAg)水平的降低(如通过Abbott Architect 平台所测量)评估施用钠盐NAP(REP
2055)与钙螯合物NAP(REP 2139-Ca)的抗病毒作用。REP 2055和REP 2139-Ca的抗病毒作用中在表6中提供。
2055)与钙螯合物NAP(REP 2139-Ca)的抗病毒作用。REP 2055和REP 2139-Ca的抗病毒作用中在表6中提供。
[0179] 表6
[0180] REP 2055和REP 2139-Ca同等地清除患有慢性HBV感染患者的血清HBsAg[0181]
[0182]
[0183] *通过Abbott ArchitectTM HBsAg定量检测进行测定
[0184] REP 2055和REP 2139-Ca在相当的摩尔剂量下对于阻断SVP从HBV感染细胞中的释放是同等有效的，这种阻断通常是所有NAP针对HBV感染的治疗相关作用机制。这种活性明确地需要NAP胞内运输到肝细胞中以实现这种功能。当在类似的单药治疗方案中给予时，REP 2055和REP2139-Ca在HBV感染患者中实现相当的HBsAg降低或清除，这证明这两种不同NAP具有相当的抗病毒活性并且REP 2139配制为钙螯合物对其器官积累、胞内运输或生化活性没有明显影响。
[0185] 这些结果证明，ON螯合物虽然具有改善ON耐受性的能力(可能通过阻断一些蛋白质相互作用)，但是也能够以不影响ON的器官积累(在上述实施例的肝脏中)或胞内运输(在上述实施例中进入肝细胞)的方式解离，这对特别是NAP的生化活性以及通常许多ON是必需的。根据美国申请公布号2012/0046348的教导，ON螯合物阻止一些ON耐受性方面中涉及的蛋白质相互作用(如美国申请公布号2012/0046348中所教导)而仍然使其器官积累、胞内运输和生化活性不变的能力是本领域技术人员不可预测的。
[0186] 这些结果明确地证明ON螯合物用于治疗慢性HBV感染的有效性。其他在体内或在人受试者中对HBV有活性或对其他病毒感染有效的ON可以制备成钙螯合物并且具有本文中提供的公开内容的益处，可以可靠地 预期它们保留其治疗功效而同时在化合物施用期间或总体上在整个治疗方案期间具有改善的耐受性。本文中公开了一个发现，即ON螯合物不改变治疗活性需要保留特定的器官积累、细胞内区域化和生化相互作用的ON在人患者中的作用，这一发现还提供了明确的教导，即可以配制成螯合物的任何ON都可用于达成其设计的治疗效果，与其作用机制无关，无论是反义、siRNA、miRNA、shRNA或NAP都是如此，并且将具有降低美国申请公布号2012/0046348中所教导的施用相关副作用的额外益处。
[0187] 此外，因为NAP已经显示通过阻断HBV表面抗原释放来对HBV起作用，所以它们也会对丁型肝炎病毒有活性，丁型肝炎病毒是其产生依赖于HBV表面抗原的无关病毒。因此，预期NAP螯合物也会对肝炎δ病毒感染有活性。
[0188] 重要的是，在以上实施例中对患者施用的ON螯合物显示施用相关副作用有明确的改善：REP 2139钙螯合物的IV输注可以在两个小时内完成并且只有在非常罕见的案例中伴随有轻微的发抖或寒战。相比之下，以与REP 2139-Ca相当的摩尔剂量作为简单钠盐对人患者施用REP 2055需要10小时以上来完成IV输注并且仍然几乎总是伴随有中度发热、寒战和发抖。此外，用REP 2139钙螯合物在人患者中每天皮下注射施用五周而没有注射部位反应同时引起血清HBsAg下降是可能的。使用这种施用途径皮下施用简单的ON钠盐而不出现注射部位反应是不可能的。
[0189] 这些观察结果证明抗病毒ON螯合物是对受试者施用抗病毒ON并且不损失抗病毒活性同时大大改善施用相关的副作用的有用方法。
[0190] 这些观察结果进一步证明任何NAP或反义ON(包括典型的反义、siRNA、miRNA或shRNA ON)都可以配制成ON螯合物而不干扰ON应有的生物效应并且还不影响ON特定的生物分布或胞内运输。
[0191] 实施例V
[0192] NAPS降低体内血清甘油三酯和胆固醇
[0193] 为了考察NAP是否能够预防饲喂高果糖(HF)饮食仓鼠的高胆固醇血症和高甘油三酯血症的发病，通过腹膜内注射一周3次持续4周对HF饮食的动物施用REP 2031，REP2031是40聚体完全硫代磷酸酯化寡脱氧胞苷酸(SEQ ID NO:1)。监测若干与高胆固醇血症和肥胖有关的参数(参见表9)
[0194] 表9
[0195] REP 2031在HF饲喂仓鼠中的作用
[0196]
[0197] 这些结果显示施用REP 2031使得与HF饮食有关的甘油三酯和胆固醇的升高受到抑制。因此ON在高胆固醇血症的预防中具有治疗活性。
[0198] 对已存在高胆固醇血症和或高甘油三酯血症的人患者每周一次施用制备成钙螯合物的REP 2055。使用公认的实验室程序和测试方法监测REP2055施用对总血清胆固醇、LDL和甘油三酯的作用。REP 2055治疗对血清胆固醇动力学的作用在表10中展示。
[0199] 表10
[0200] REP 2055治疗对人患者的高脂血症的作用
[0201]
[0202] LDL＝低密度脂蛋白，治疗前＝治疗前基线，治疗＝REP 2055治疗达到的最低水平
[0203] 在胆固醇和甘油三酯升高的患者(患者1-3)中，REP 2055治疗使得总的和LDL胆固醇以及血清甘油三酯降低。在胆固醇正常但是甘油三酯轻微至中等升高的患者(患者4和5)中，REP 2055治疗对总的和LDL胆固醇水平没有显著影响但是仍然导致血清甘油三酯降低。这些数据显示NAPREP 2055能够降低总的和LDL胆固醇以及甘油三酯或使它们正常化。
[0204] 在以上实施例中，各自具有不同的序列但是具有相同理化性质的两种不同的NAP(REP 2031[SEQ ID NO:1]和REP 2055[SEQ ID NO:2])在体内对于降低血清胆固醇和甘油三酯能够获得类似的效果。这些结果明确地证 明NAP对于降低血清胆固醇和甘油三酯的活性与序列无关并且显示本文中描述的任何NAP都预期具有与本文中所示的REP 2013和REP 2055类似的作用。
[0205] 因为NAP的抗病毒活性、抗甘油三酯、抗胆固醇和抗朊病毒活性是来源于硫代磷酸酯化寡核苷酸的相同的序列无关的性质，所以当配制成螯合物时，NAP保留对病毒感染的抗病毒活性的本公开为NAP作为ON螯合物施用时也将保留其抗甘油三酯、抗胆固醇和抗朊病毒活性提供了明确的证据。
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