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寡核苷酸螯合物的用途

阅读：545发布：2020-05-11

专利汇可以提供寡核苷酸螯合物的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及寡核苷酸螯合物的用途。本公开描述了无论大小或修饰，任何寡核苷酸(ON)与多种二价2+金属阳离子的广泛有效的螯合。该螯合作用对二价(或更高价)的阳离子具有特异性，并且导致不表现得像盐的寡核苷酸螯合物的形成。本文描述了一种使用任何ON和二价金属阳离子制备的ON螯合物的新型组合物以及在施用寡核苷酸过程中通过使用ON螯合物阻抑抗凝和或皮下注射部位反应和或改善寡核苷酸耐受性的方法。，下面是寡核苷酸螯合物的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种寡核苷酸螯合物在制备以下的药物中的用途，所述螯合物包含由二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应、或用于当对受试者通过IV输注施用时改善寡核苷酸的耐受性。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物是钙螯合物。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物是镁螯合物。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物是混合的镁/钙螯合物。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种双链寡核苷酸。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种具有至少一个硫代磷酸键的寡核苷酸。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种完全硫代磷酸化的寡核苷酸。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种具有一个2’修饰核糖的寡核苷酸。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种每个核糖均经2’O-甲基化的寡核苷酸。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种由SEQ ID NO:3至14组成的寡核苷酸。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种包含至少一个5-甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种由包含至少一个5-甲基胞嘧啶的SEQ ID NO:6组成的寡核苷酸。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物包含至少一种由其中每一个胞嘧啶均是5-甲基胞嘧啶的SEQ ID NO:3-12组成的寡核苷酸。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述螯合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
15.一种二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应，所述药物配制为对受试者皮下施用，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸。
16.一种二价镁阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、或用于当对受试者通过IV输注施用时改善寡核苷酸的耐受性，所述药物配制为对受试者静脉施用，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价镁阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸。
17.一种二价镁和钙阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、或用于当对受试者通过IV输注施用时改善寡核苷酸的耐受性，所述药物配制为对受试者静脉施用，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价镁和钙阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸。
18.一种二价锌阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、或用于当对受试者通过IV输注施用时改善寡核苷酸的耐受性，所述药物配制为对受试者静脉施用，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价锌阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸。
19.两种或更多种不同的二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、或用于当对受试者通过IV输注施用时改善寡核苷酸的耐受性，所述药物配制为对受试者静脉施用，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由两种或更多种二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸。
20.一种二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价镁阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸并且其中所述螯合物包含至少一种双链寡核苷酸。
21.一种二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸并且其中所述螯合物包含至少一种具有一个2’修饰核糖的寡核苷酸。
22.一种二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸并且其中所述螯合物包含至少一种每个核糖均经
2’O-甲基化的寡核苷酸。
23.一种二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸并且其中所述螯合物包含至少一种由SEQ ID NO:3至
14组成的寡核苷酸。
24.一种二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸并且其中所述螯合物包含至少一种包含至少一个
5-甲基胞嘧啶的寡核苷酸。
25.一种二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸并且其中所述螯合物包含至少一种由进一步包含至少一个5-甲基胞嘧啶的SEQ ID NO:6组成的寡核苷酸。
26.一种二价阳离子在制备以下的药物中的用途，所述药物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用、用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的皮下注射部位反应，其中，所述药物包含寡核苷酸螯合物，所述寡核苷酸螯合物包含由二价阳离子通过它们的磷酸二酯键连接的至少两种寡核苷酸并且其中所述螯合物包含至少一种由其中每一个胞嘧啶均是5-甲基胞嘧啶的SEQ ID NO:3-12组成的寡核苷酸。

说明书全文

寡核苷酸螯合物的用途

[0001] 本申请为申请号为201180035946.6，发明名称为“寡核苷酸螯合物”，申请日为2011年8月18日的PCT申请PCT/CA2011/000956进入中国国家阶段申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及寡核苷酸螯合物、其组合物和将寡核苷酸(ON)配制为螯合物的方法以及这些ON螯合物对施用ON的用途。

背景技术

[0003] 盐是由酸和碱的相互作用(中和)产生的离子化合物。盐由阳离子和阴离子组-成，所述阳离子和阴离子相互作用以便保持电中性状态。阴离子可以是无机的(例如Cl)-
或有机的例如乙酸根(CH3COO)。由于在含水环境中阴离子和阳离子对呈解离状态，含溶解的盐(电解质)的水溶液能够导电。寡核苷酸是聚阴离子并且之前已被认为仅表现为盐，其中其阳离子相对物以解离状态存在于溶液中。

[0004] 对人患者施用ON通常伴随着与存在的核苷酸序列无关的一些广泛的副作用。这些包括血液的抗凝(凝血酶原时间或PTT时间的提高)(Kandmimlla
等 ,1998,Bioorgan.Med.Chem.Let.,8:2103；Sheeban 等 ,Blood,1998,92:1617；Nicklin等 ,1197，Nucleosides&Nucleotides，16:1145；Kwoh，2008，Antisense Drug Tech. 第
2版,第374页)和皮下施用时的注射部位反应或ISR(硬化、炎症、触痛和疼痛)(Webb
等 ,1997,Lancet,349:9059；Schrieber 等 ,2001,Gastroenterol.,120:1339；Seawell等 ,2002,J.Pharmacol.Exp.Therap.,303:1334；Kwoh,2008,Antisense Drug Tech. 第 2版,第383页；Raal等,2010,Lancet,375:998)。抗凝作用被认为是由与凝血级联反应的蛋白质的非序列特异性相互作用介导的。因为ON已经显示出具有免疫刺激特性(通过Toll样受体或TLR-介导的细胞因子诱导)，ISR通常归因于对皮下(SC)注射时需要以小体积(通常为1cc)施用高浓度ON，这被认为在注射部位导致局部炎症。

[0005] 近年来随着基于核酸的治疗的出现，在临床研发中基于ON的化合物的增长数量也得到增加。历史上大多数ON给药方案已采用必须经胃肠道外给予的一周多次剂量或一周单次剂量，因为ON的口服生物利用度差。因为ON的静脉输注通常由反应性(发热、寒战、虚弱)进行剂量和速率限制并且将是慢性剂量方案中的逻辑需求，最近ON的临床应用已使用皮下(SC)施用途径。这引起最小的全身给药副作用但通常伴随着不同严重程度的注射部位反应(如上所述)，这也限制了通过这种施用途径可实现的给药。

[0006] 因此，提供IV或SC途径施用过程中将减轻反应性的ON制剂将是有用和可取的。此外，虽然认为施用ON的抗凝作用是最小的，但其对消除ON的副作用以为人和非人受试者提供更大的范围的安全性同样是有用的。

[0007] 因此，需要提供一种改善的ON制剂。

发明内容

[0008] 根据目前的描述，现在提供一种包含由多价阳离子连接的两个或更多个寡核苷酸的寡核苷酸螯合物。

[0009] 进一步提供用于皮下施用的寡核苷酸制剂，该寡核苷酸制剂包含如本文所述的寡核苷酸螯合物。

[0010] 还公开了一种包含本文所述的寡核苷酸螯合物或寡核苷酸制剂以及载体的药物组合物。

[0011] 进一步公开了一种减少与对受试者施用寡核苷酸相关的肝或肾功能障碍的方法，所述方法包括如下步骤：对受试者施用作为如本文所述的螯合物的寡核苷酸、如本文所公开的寡核苷酸制剂或如本文所公开的药物组合物。

[0012] 本文公开了通过施用作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的ON、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来阻抑、抑制或减少由ON引起的血液抗凝的方法。

[0013] 本文还公开了通过制备作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的ON、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来改善通过IV输注施用的任何ON的耐受性的方法。

[0014] 本文公开了用于阻抑或减少施用作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的ON、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物时的注射部位反应的方法。特别地，通过皮下施用所述ON。

[0015] 本文公开了通过提供作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的ON、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来阻抑金属与通过任何途径施用的任何ON螯合的方法。

[0016] 本文公开了通过施用作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的ON、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来减少任何ON的血清半衰期的方法。

[0017] 本文公开了通过施用作为钙螯合物或其他适当的金属螯合物的ON、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来减少血清蛋白质与任何ON相互作用的方法。特别地，通过IV输注对受试者施用该寡核苷酸螯合物、制剂或组合物。

[0018] 本文还公开了一种寡核苷酸制剂，其中在寡核苷酸使用时给寡核苷酸提供来自下列任何一种的二价金属阳离子源作为ON螯合物：钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜和/或锌。因此本文描述了包含钙的寡核苷酸制剂；包含镁的寡核苷酸制剂；包含钴的寡核苷酸制剂；包含铁(2+)的寡核苷酸制剂；包含锰的寡核苷酸制剂；包含铜的寡核苷酸制剂；包含锌的寡核苷酸制剂。

[0019] 本文公开了单独或组合使用以下任何金属阳离子制备ON金属螯合物的方法：钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜和/或锌。

[0020] 还公开了一种制备如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括将任何寡核苷酸钠盐溶解在药学上可接受的水性赋形剂中，并且逐渐地将二价金属盐溶液加入到溶解的寡核苷酸中，以使该寡核苷酸螯合物保持溶解性。

[0021] 本文公开了一种在受试者体内使用寡核苷酸钠盐螯合以下二价金属阳离子的方法：钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜、锌、镉、汞、铅、铍、锶、镭和/或任何其他金属、过渡金属、后过渡金属、能够以2+或3+电荷状态存在的镧系元素或锕系元素。

[0022] 本文还公开了一种通过制备作为钙螯合物或其他适当的ON金属螯合物的ON、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物来改善任何ON在溶液中的稳定性的方法。特别地，公开了一种使寡核苷酸在水溶液中稳定的方法。

[0023] 本文涵盖多价阳离子是二价阳离子。

[0024] 本文涵盖二价阳离子是呈2+电荷状态的碱土金属。

[0025] 本文涵盖二价阳离子是呈2+电荷状态的过渡或后过渡金属。

[0026] 本文涵盖二价阳离子是呈2+电荷状态的镧系金属。

[0027] 本文涵盖二价阳离子是呈2+电荷状态的锕系金属。

[0028] 二价阳离子可以是，单独或组合的：钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜和/或锌。

[0029] 特别地，本文所述的螯合物可以包含两种或更多种不同的二价金属阳离子。

[0030] 在进一步的实施方案中，该螯合物包含至少一种双链寡核苷酸。

[0031] 在另一个实施方案中，该螯合物包含至少一种具有一个硫代磷酸键的寡核苷酸。

[0032] 该螯合物还可以包含至少一种完全硫代磷酸化的寡核苷酸。

[0033] 该螯合物还可以包含至少一种具有一个2’修饰核糖的寡核苷酸。

[0034] 该螯合物还可以包含至少一种每个核糖经2’O-甲基化的寡核苷酸。

[0035] 在一个实施方案中，该螯合物或制剂适于皮下施用，适于至少以下施用途径：眼内、口服、肠溶、吸入、皮肤注射、肌内注射、腹腔内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉注射、静脉输注和局部施用。特别地，吸入施用可以是气雾剂。

[0036] 进一步涵盖寡核苷酸由SEQ ID NO:3至14组成。

[0037] 进一步涵盖在添加金属盐之前溶解的寡核苷酸浓度是0.01-100mg/ml。

[0038] 特别地，加入到溶解的寡核苷酸中的金属盐的比例可以是每100mg寡核苷酸为0.1-40mg二价盐。

[0039] 进一步涵盖寡核苷酸终浓度是0.1-100mg/ml。

[0040] 在进一步的实施方案中，该金属盐是以下中的至少一种：盐酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐、延胡索酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、异抗坏血酸盐和丙酸盐。

[0041] 在另一个实施方案中，该金属盐溶液包含以下中的至少一种：钙、镁、钴、铁(2+)、锰、铜和/或锌。

[0042] 本文还涵盖螯合物是钙螯合物；镁螯合物；或混合的镁/钙螯合物。

[0043] 还提供了如本文所述的多价阳离子在制备寡核苷酸螯合物中的用途。

[0044] 另外提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于阻抑或减少对受试者施用寡核苷酸的抗凝作用的用途。

[0045] 提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于阻抑或减少所述皮下施用寡核苷酸的受试者中的皮下注射部位反应的用途。

[0046] 还提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于改善通过IV输注施用时受试者中寡核苷酸的耐受性的用途。

[0047] 还提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于减少对受试者通过IV输注施用时寡核苷酸的血清蛋白质相互作用的用途。

[0048] 进一步提供如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于减少受试者中的寡核苷酸的血清半衰期的用途。

[0049] 还提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于减少与在受试者中施用寡核苷酸相关的肝或肾功能障碍的用途。

[0050] 还提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制剂或本文所述的药物组合物用于使寡核苷酸在水溶液中稳定的用途。

[0051] 表述“抗凝”意指正常血凝集或血块形成的抑制。

[0052] 表述“螯合”意指通过另一种分子从游离溶液反应中掩蔽或移除反离子(负或正)，所述另一种分子能够与反离子结合形成螯合的络合物。

[0053] 表述“二价金属阳离子”是指以2+电荷状态自然存在并且包括碱土金属(根据IUPAC命名法的第2族元素)、过渡金属、后过渡金属、类金属或镧系元素的任何金属阳离子。

[0054] 表述“三价金属阳离子”是指以3+电荷状态自然存在并且包括过渡金属、后过渡金属、类金属、镧系元素或锕系元素的任何金属阳离子。附图说明

[0055] 现在将参照附图：

[0056] 图1示出ON的一般生理化学特征。A)通过高效液相色谱共分离REP2006和具有确定序列的21mer硫代磷酸ON。B)通过质谱鉴定21mer ON中的种类。C)通过质谱鉴定REP 2006 ON中的种类。

[0057] 图2示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-钙螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化钙与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-钙螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0058] 图3示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-镁螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL，SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化镁与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-镁螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0059] 图4示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-钴螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL，SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化钴与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-钴螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0060] 图5示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-铁螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化铁与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-铁螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0061] 图6示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-锰螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化锰与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-锰螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0062] 图7示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-钡螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化钡与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-钡螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0063] 图8示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-镍螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(RE P2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化镍与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-镍螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0064] 图9示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-铜螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化铜与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-铜螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0065] 图10示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-锌螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化锌与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-锌螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0066] 图11示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-镉螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化镉与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-镉螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0067] 图12示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-汞螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化汞与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-汞螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0068] 图13示出通过荧光标记的简并硫代磷酸ON形成ON-铅螯合物，所述荧光标记的简并硫代磷酸ON为：A)各种大小6mer(REP 2032-FL)、10mer(REP 2003-FL)、20mer(REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’O甲基核糖(REP 2107-FL)或2’O甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL；
SEQ ID NO:4)的荧光标记的简并ON。通过使用简并寡核苷酸证明ON螯合物形成的非序列依赖性质，但也使用序列特异性寡核苷酸(REP 2031；SEQ ID NO:4)得到证明。通过在溶液中将递增浓度的ACS级氯化铅与FITC-标记的寡核苷酸结合并且通过如实施例1所述的荧光偏振的增长监测寡核苷酸螯合物的形成证明ON-铅螯合物的形成。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0069] 图14A示出不依赖ON序列的ON的一般化学性质。无论序列如何，任何ON作为聚合物存在，其同时具有疏水和亲水活性。硫代磷酸化(该图中的化学结构所示)用于增加该ON聚合物的疏水性，但不影响亲水性。图14B将二价和三价金属阳离子的寡核苷酸螯合的性质概念化。金属阳离子(以灰色实心圆圈表示)通过磷酸二酯键中两个或三个非桥氧或硫原子之间的金属离子桥(以椭圆表示)连接ON聚合物的亲水性表面。

[0070] 图15示出在二价金属阳离子存在下的不同ON和二价金属阳离子浓度的ON的溶液行为的模型。A)低二价/三价金属阳离子、低ON浓度产生二聚体或低阶ON螯合物。B)增加二价/三价金属阳离子浓度在溶液中产生更完全的ON螯合物形成。C)在二价或三价金属存在下随着金属浓度的增加进一步增加ON浓度能够产生更高阶的ON螯合物。(A)至(C)中所有螯合物在水溶液中是可溶的，由于其具有仍暴露在含水环境的亲水性表面因此保持溶解度。D)在足够的ON和金属浓度时，现在所有亲水性表面被限制在该ON螯合物内，仅留下暴露在含水环境的疏水性表面。这导致ON螯合物的沉淀。

[0071] 图16示出荧光-ON螯合物的溶液行为对荧光偏振的影响。随着金属浓度的增加，ON螯合物形成的大小(和质量)也增加(见图15)并且因此在溶液中翻滚更慢。该络合物在溶液中的这种较慢翻滚导致荧光偏振增加和mP值增加。

[0072] 图17示出如通过荧光偏振所测量，用氯化钙或硫酸钙形成ON螯合物。A)用REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和REP 2056-FL(SEQ ID NO:7)形成ON螯合物。B)用REP
2033-FL(SEQ ID NO:5)和REP 2029-FL(SEQ ID NO:2)形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0073] 图18示出如通过荧光偏振所测量，用氯化钙或硫酸钙形成ON螯合物。A)用REP2028-FL没有形成ON螯合物和用REP 2057-FL(SEQ ID NO:8)形成ON螯合物。B)用REP
2120-FL和REP 2030-FL形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0074] 图19示出如通过荧光偏振所测量，用氯化钙或硫酸钙形成ON螯合物。A)用REP 2129-FL(SEQ ID NO:12)和REP 2126-FL(SEQ ID NO:9)形成ON螯合物。B)用REP
2128-FL(SEQ ID NO:11)和REP 2127-FL(SEQ ID NO:10)形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0075] 图20示出如通过荧光偏振所测量，用氯化钙或硫酸钙形成ON螯合物。A)用REP2139-FL(SEQ ID NO:13)和REP 2006-FL形成ON螯合物。B)用REP 2045-FL和REP 2007-FL形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0076] 图21示出如通过荧光偏振所测量，用氯化镁或硫酸镁形成ON螯合物。A)用REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和REP 2056-FL(SEQ ID NO:7)形成ON螯合物。B)用REP
2033-FL(SEQ ID NO:5)和REP 2029-FL(SEQ ID NO:12)形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0077] 图22示出如通过荧光偏振所测量，用氯化镁或硫酸镁形成ON螯合物。A)用REP2028-FL(SEQ ID NO:11)没有形成ON螯合物，且用REP2057-FL(SEQ ID NO:8)形成ON螯合物。B)用REP 2120-FL和REP2030-FL(SEQ ID NO:3)形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0078] 图23示出如通过荧光偏振所测量，用氯化镁或硫酸镁形成ON螯合物。A)用REP 2129-FL(SEQ ID NO:12)和REP 2126-FL(SEQ ID NO:9)形成ON螯合物。B)用REP
2128-FL(SEQ ID NO:11)和REP 2127-FL(SEQ ID NO:10)形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0079] 图24示出如通过荧光偏振所测量，用氯化镁或硫酸镁形成ON螯合物。A)用REP2139-FL(SEQ ID NO:13)和REP 2006-FL形成ON螯合物。B)用REP 2045-FL和REP 2007-FL形成ON螯合物。值表示重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0080] 图25示出如通过荧光偏振所测量，在氯化钙或氯化镁存在下形成两种不同的双链ON螯合物。通过REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和REP2033-FL(SEQ ID NO:5)杂交以及REP 2057-FL(SEQ ID NO:8)和REP2056-FL(SEQ ID NO:7)杂交制备双链ON。值表示三次重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0081] 图26示出仅在二价金属阳离子(Mg2+和Ca2+)存在下而不是在一价阳离子(Na+、K++或NH4)存在时，形成不同的ON螯合物。值表示三次重复测量的平均值+/-标准偏差。

[0082] 图27示出向人血液添加不同大小(REP 2004，REP 2006)和不同化学成分(REP2006，REP 2107)的各种浓度的ON的抗凝作用。通过使用简并寡核苷酸(REP 2004，REP
2006，REP2107)证明该相互作用的非序列依赖方式，但也使用序列特异性的寡核苷酸(REP
2031；SEQ ID NO:4)得到证明。采用公认的临床实验室测试方法，通过测量凝血酶原时间(PTT)并将其与血液中生理盐水存在下的PTT进行比较来监测这些化合物存在下的血液抗凝。存在和不存在药物时的PTT的比值产生归一化比值(NR)。NR为1表明正常血液凝集活性并且NR大于1表明血液凝集活性已减弱(抗凝)。

[0083] 图28示出通过添加CaCl2阻抑寡核苷酸的抗凝作用。将REP2055(具有序列(AC)20的40mer硫代磷酸；SEQ ID NO:6)以2.5mM添加至血液，该浓度诱导显著的血液抗凝。将REP 2055与CaCl2的各种组合相结合并且使用公认的临床实验室测试方法测定添加的每种浓度的CaCl2的作用。使用公认的测试方法，通过测量凝血酶原时间(PTT)并将其与血液中生理盐水存在下的PTT进行比较来监测这些化合物存在下的血液抗凝。存在和不存在药物时的PTT的比值产生归一化比值(NR)。NR为1表明正常血液凝集活性并且NR大于1表明血液凝集活性已减弱(抗凝)。

[0084] 图29示出在患有慢性肝病的患者中长期ON治疗对总血清钙的钙螯合作用。未接受矿物质补充剂的患者如(A)所示，而接受补充剂同时经历ON治疗的患者如(B)所示。

具体实施方式

[0085] 本文提供了以下证明，ON螯合不同的二价金属阳离子，包括钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜、锌、镉、汞和铅。进一步证明这些二价阳离子的螯合导致形成由通过金属阳离子连接的两个或更多个ON组成的ON螯合物，并且例如，但不限于，在长度在6和80之间的核苷酸的ON，并且在磷酸二酯或硫代磷酸寡核苷酸存在下发生。螯合还同样伴随在核糖含有2’修饰的或不含修饰的寡核苷酸发生。此外，金属阳离子的螯合不依赖于所存在的核苷酸的序列，但依赖于所有寡核苷酸共同的生理化学特征(见图14A)。

[0086] 本文提出如下发现，在含有任何简单的二价金属阳离子(例如但不限于，Ca2+、2+ 2+
Mg 、Fe )的水溶液中寡核苷酸不是作为盐存在，而是作为ON的螯合的络合物存在。这些络合物由寡核苷酸二聚物或更高阶分子组织组成，其中ON通过二价金属离子桥在其磷酸二酯主链相连(见图14B)。在具体的ON和金属阳离子浓度时，这些螯合的络合物在水溶液中是稳定的和可溶的，并且有效地从溶液相互作用中掩蔽ON螯合物中的任何二价阳离子。
这种螯合物形成同样有可能用带3+或更多电荷的简单金属阳离子发生(如图14B所示)。
因此ON用作二价阳离子螯合剂并且不与二价阳离子形成盐。

[0087] 重要地是，寡核苷酸螯合物的形成不用一价阳离子例如Na+、K+或NH4+发生，并且因此不大可能用任何一价阳离子发生。因此，术语“寡核苷酸盐”明确地仅限于具有一价阳离子或具有不与寡核苷酸形成螯合物的阳离子的寡核苷酸盐，并且不正确地用于描述以具有二价金属阳离子(或甚至三价金属阳离子)的溶液或粉末形式存在的寡核苷酸。

[0088] 本领域中的标准清晰地教导了仅作为钠盐的ON的施用。这通过在临床试验中施用大量作为钠盐的寡核苷酸进行例证，其中包括Fominirisen(ISIS 2922)、
Mipomersen(ISIS 301012)、Trecovirsen(GEM 91)、Custirsen(OGX-011/ISIS 112989)、Genasense(G3139) 和 Aprinocarsem(ISIS3531/LY 900003)(Geary 等，2002,Clin.Pharmacokinetics,41:255-260；Yu 等，2009,Clin.Pharmacokinetics,48:39-50；
Sereni 等，1999,J.Clin.Pharmacol.,39:47-54；Chi 等，2005,J.Nat.Canc.
Inst.,97:1287-1296；Marshall 等，2004,Ann.Oncol.,15:1274-1283；Grossman 等，
2004,Neuro-Oncol,6:32-40)。

[0089] 本文还提供如下证明，如通过由加入氯化钙来恢复血液中正常的游离钙而逆转寡核苷酸诱导的抗凝所表明，由寡核苷酸引起的血液的抗凝是由寡核苷酸对钙的螯合而导致的。

[0090] 本文还提供如下证明，如通过注射制备为钙螯合物的ON抑制注射部位反应(ISR)所表明，用皮下注射寡核苷酸所观察的注射部位反应(硬化、炎症、触痛和疼痛)至少部分是由于钙和可能其他二价阳离子(例如镁)在注射部位被寡核苷酸局部螯合。

[0091] 荧光偏振是一种常见的用于检验分子间相互作用的方法。在该技术中，用荧光标签(例如FITC)标记诱饵(即任何ON)。在溶液中，由于布朗运动诱饵分子自由地翻滚，这导致当诱饵受到正确波长的光激发时的差偏振荧光发射。使用足够分子量(至少与诱饵的大小相同)的配体，诱饵和配体间的相互作用引入大量络合物在溶液中翻滚的抑制。由于这种溶液中抑制的翻滚，荧光发射在激发后变得显著偏振。因此使用这种技术，可以在溶液中测量相互作用而对任何结合配偶体无物理限制。将荧光偏振报道为无量纲mP，其与反应中所结合的诱饵分子的分数成正比。例如，若很少部分的诱饵分子由特定的配体结合，则将存在很小的荧光偏振，并从而有很小的mP值。在谱的另一端，若大部分诱饵分子由特定的配体(或与更高浓度的配体)结合，则将存在大量的荧光偏振，并从而有大的mP值。以这种方式，可通过在固定量的荧光标记的诱饵存在下改变配体的浓度来产生特定诱饵-配体相互作用的结合等温线。

[0092] 本文采用不同的荧光标记的ON以检验在一价和二价阳离子存在下其络合物的形成。虽然通过荧光偏振监测络合物的形成要求这些ON经荧光标记，但是将标记在3’端附着于ON以便不干扰ON的含氮碱基或磷酸二酯主链是有问题的。此外通过刚性3 碳连接基团使荧光标签远离ON，以进一步排除溶液中正常ON行为的任何扰动。因此采用含荧光标记ON的使用荧光偏振在本文观察的任何ON络合物的形成是未标记ON(无论络合或未络合)的溶液行为的准确代表。

[0093] 术语寡核苷酸(ON)指核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)和/或其类似物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)键组成的寡核苷酸以及具有类似地发挥作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。由于其理想的特性，例如，增强的细胞摄取、对靶核酸增强的亲和力和核酸酶存在下增强的稳定性，与其天然形式相比，这种修饰的或取代的寡核苷酸通常是优选的。

[0094] 在本申请中，术语“简并寡核苷酸”意指在每一个位置具有一个摆动(wobble)(N)，例如NNNNNNNNNN的单链寡核苷酸。将每一个碱基合成为一个摆动，如此这种ON实际上以不同的随机产生的相同长度和生理化学性质的序列的群存在。例如，对于40个碱基长度40 -25
的ON简并物，群中任何特定序列将理论上代表总部分的1/4 或8.3×10 。鉴于1摩尔
23
=6.022×10 个分子，并且迄今没有合成已超过2毫摩尔的简并物的事实，所以具有存在的特定序列的任何寡核苷酸在任何制剂中有效地存在不超过1次。因此在这种制剂中观察的任何络合物的形成必须是由于寡核苷酸的非序列依赖(或不依赖于序列)的生理化学性质，因为具有确定序列的任何特定的寡核苷酸(在制备中是唯一的)不能预期有助于来自其具体核苷酸序列的任何活性。

[0095] 作为这个概念的进一步说明，实施例1通过高效液相色谱和质谱将REP2006(具有简并硫代磷酸化序列的40mer ON)与确定序列的21mer的特征相比较，并且清晰地显示具有相似大小和化学修饰(即硫代磷酸化)的任何ON将具有高度相似(若不相同)的不受所存在的核苷酸序列影响的生理化学性质。

[0096] 寡核苷酸可以包括各种修饰，例如，稳定化修饰，因此并且可以包括在磷酸二酯键和/或在糖和/或在碱基上的至少一种修饰。例如，寡核苷酸可以包括但不限于，一个或多个硫代磷酸键、二硫代磷酸键和/或甲基磷酸键。不同的化学相容的修饰键可以组合，例如，其中合成条件是化学相容的修饰。虽然修饰的键是有用的，但是寡核苷酸可以包括其中寡核苷酸聚合物的一般生理化学性质基本不受影响的磷酸二酯键。另外有用的修饰包括但不限于，在糖的2’-位的修饰，例如2’-O烷基修饰(例如2’-O-甲基修饰)、2’-氨基修饰、2’-卤代修饰(例如2’-氟代)；无环核苷酸类似物。本领域还已知其他修饰，并且可以用于例如锁核苷酸。特别地，整个寡核苷酸具有修饰的键，例如，硫代磷酸；具有3’-和/或5’-帽；包括末端3’-5’键；寡核苷酸是或者包括由被连接基团接合的两个或更多个寡核苷酸序列组成的多联体。

[0097] 还提供了一种药物ON组合物，其使用治疗有效量的药理学上可接受的如本文所述的寡核苷酸螯合物来防止寡核苷酸诱导的抗凝，该螯合物使用以下任何金属阳离子制备：钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。

[0098] 还提供了一种药物ON组合物，其防止伴随皮下施用的注射部位反应，所述皮下施用含有治疗有效量的药理学上可接受的如本文所述的ON螯合物，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备：钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。

[0099] 还提供了一种药物ON组合物，其改善IV输注的耐受性，所述IV输注含有治疗有效量的药理学上可接受的ON螯合物，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备：钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。

[0100] 还提供了一种药物ON组合物，其使用治疗有效量的药理学上可接受的ON螯合物防止寡核苷酸诱导的钙、镁、铁、锰、铜或锌的缺乏，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备：钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。

[0101] 还提供了一种药物ON组合物，其具有改善的储存稳定性，其含有治疗有效量的药理学上可接受的ON螯合物，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备：钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。

[0102] 还提供了一种药物ON组合物，其具有降低的血清半衰期或减少的与血清蛋白质的相互作用，其含有治疗有效量的药理学上可接受的ON螯合物，该ON螯合物使用以下任何金属阳离子制备：钙、镁、钴、锰、铁、铜和/或锌。该ON螯合物也可以使用如上所述的两种或更多种不同的阳离子制备。特别地，该药物组合物被批准用于对人或非人动物(例如非人灵长类动物)施用。

[0103] 此外，上述组合物可以包括生理上和/或药学上可接受的载体、佐剂、媒介物和/或赋形剂。载体的特征可取决于施用途径。术语“药学上可接受的载体、佐剂、媒介物和/或赋形剂”是指可以对受试者施用，并入本发明的组合物中，并且不破坏其药理学活性的载体、佐剂、媒介物和/或赋形剂。可用于本文所述的药物组合物中的药学上可接受的载体、佐剂、媒介物和赋形剂包括但不限于下列：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化递药系统(“SEDDS”)、以药物剂型使用的表面活性剂(例如吐温或其他相似的聚合递送基质)、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂、环糊精(例如α-、β-和γ-环糊精)或化学修饰的衍生物(例如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-β-环糊精的)或其他溶解的衍生物也可以用于增强本发明组合物的递送。

[0104] 本文描述的组合物可以含有如下所述的其他治疗剂，并且可以，例如，根据药物配制领域的技术人员熟知的技术，通过采用常规的固体或液体媒介物或稀释剂，以及适用于预期施用方式的类型的药物添加剂(例如，赋形剂、黏合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)进行配制。

[0105] 本文描述的组合物可以通过任何合适的方式施用，例如，口服，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂或粉末的形式；舌下；口含；胃肠外，例如通过皮下、静脉内、肌内或胸骨内(intrastemal)注射或输注技术(例如，作为无菌可注射水或非水溶液或悬浮液)；经鼻,例如通过吸入喷雾；局部，例如乳膏或软膏形式；或直肠，例如栓剂形式；以含有无毒、药学上可接受的媒介物或稀释剂的剂量单位制剂。本发明组合物可以，例如，以适合即时释放或延长释放的形式施用。即时释放或延长释放可以通过使用合适的药物组合物实现，或，特别是在延长释放的情况下，通过使用装置(例如皮下植入物或渗透泵)实现。因此，上述组合物可以适于通过以下任何途径施用：眼内、口服、肠溶、吸入、皮肤注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射、鞘内注射或输注、气管内、静脉注射或输注或局部施用。

[0106] 用于口服施用的示例性组合物包括悬浮液，其可含有例如，用于提供大量藻酸或藻酸钠作为悬浮剂的微晶纤维素、作为增稠剂的甲基纤维素和甜味剂或调味剂例如本领域已知的那些；并且即时释放片剂可以含有，例如，微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其他赋形剂、黏合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂，例如本领域已知的那些。本发明的组合物也可以经由舌下和/或口含施用通过口腔递送。模制片、压制片或冻干片是可以使用的示例性形式。示例性组合物包括用快速溶解的稀释剂例如甘露糖醇、乳糖、蔗糖和/或环糊精配制本发明的组合物的那些。在这种制剂中也可以包括高分子量的赋形剂例如纤维素(avicel)或聚乙二醇(PEG)。这种制剂也可以包括有助于使粘膜附着的赋形剂，例如羟基丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酸酐共聚物(例如，Gantrez)和控制释放的试剂，例如聚丙烯酸共聚物(例如，Carbopol934)。为了方便加工和使用，还可以添加润滑剂、助流剂、调味剂、着色剂和稳定剂。

[0107] 本文描述的化合物的有效量可以由本领域的普通技术人员确定，并且包括用于成人的示例性剂量即每天约0.1-500mg/kg体重的活性化合物，可以以单剂量或单次分剂量施用，例如每天从1至5次。应理解，对任何特定受试者的具体剂量水平和剂量频率可以改变并且将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和活动长度、种类、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用的方式和时间、排泄和清除的速率、药物组合以及特定病症的严重程度。对于治疗的优选的受试者包括经受血管生成依赖性或血管生成相关病状的动物，更优选地哺乳动物例如人和家养动物例如狗、猫等。

[0108] 该药物组合物也可以含有其他增强活性的活性因子和/或活性剂。用于施用的药物组合物和制剂可以包括皮肤药贴、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉末和气雾剂。常规的药物载体、水溶液、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或需要的。其他制剂包括其中ON与局部递送剂(例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂)混合的那些。优选的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰基磷酰基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、负(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如，二油酰基四甲氨丙基DOTAP、二油酰基磷酰基乙醇胺DOTMA)和其他的递送剂或分子。ON可以包封在脂质体内或可以形成络合物，其中特别是阳离子脂质体。可替代地，ON可以络合至脂质，特别是阳离子脂质。优选的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-10烷基酯(例如肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。

[0109] 通过参照以下的实施例，将会更容易理解本公开。

[0110] 实施例Ⅰ

[0111] 简并ON的表征

[0112] 图1A详述了同时注入柱中的两种寡核苷酸制剂通过HPLC（使用疏水柱）的分离。这些中的第一种被称为内标，并且是具有具体确定序列的21mer硫代磷酸寡核苷酸，第二种是REP 2006（40mer简并硫代磷酸寡核苷酸）。仅基于其生理化学特性（即大小和疏水性）将这两个种类分离为不同的确定的峰；存在于这些ON每一个中的核苷酸序列对其生理化学特性无重大影响，并且因此对其分离无影响。因此，仅由于这两种ON聚合物大小的不同，与REP 2006比较，该内标作为具有较小保留时间的严格确定的峰从柱中洗脱。请注意REP 2006峰的任何一侧的肩是由于在生成较长的寡核苷酸中典型的失效序列。尽管REP
2006的不均匀序列性质，它由HPLC解析为充分确定类似作为21mer特定序列的峰，其说明了REP2006制剂中所有种类的共同的生理化学性质，尽管存在非常大量的不同序列。REP
2006和21-mer峰经HPLC分离后，这些可以进行质谱分析（MS）以鉴定存在于这些确定峰内的种类（图1B和1C）。

[0113] 在图1B中，21mer被解析为MW为7402.6Da的单一种类，与具有确定序列的该PS-ON一致。但是，REP 2006的MS分析（图1C）揭示存在非常大量的种类其质量范围具有近乎完美的正态分布，与其完全地简并性质一致。这个质量范围是从C40（最小的种类）到A40（最大的种类）并且这些种类的普遍随着种类数量的增加（峰强度）非常小，因为它们的质量接近质量范围的中心。这是因为越来越大量的不同序列将导致相似的质量。在HPLC分离过程中存在于REP 2006的所有不同的ON种类在疏水柱上具有相同保留时间的事实清晰地证明相同大小和相同化学修饰（即硫代磷酸化）的所有ON将具有高度相似的（若不完全相同）生理化学性质并且因此，可以认为不依赖存在于特定ON分子中的核苷酸的序列关于任何应用或属性中功能相似。因此，用任何特定简并ON（例如REP 2003，REP 2004）观察的任何ON螯合物形成不可能依赖于存在的寡核苷酸的序列并且必须依赖于任何ON的保守生理化学性质。

[0114] 实施例Ⅱ

[0115] ON与不同二价金属阳离子形成螯合物

[0116] 通过如上所述的荧光偏振（FP）检验寡核苷酸铵盐与各种二价金属阳离子的相互作用。在寡核苷酸合成过程中，使用完善的试剂和合成方案通过刚性3碳连接基团在3’端将每一种寡核苷酸缀合至异硫氰酸荧光素（FITC）。这些寡核苷酸从合成中裂解并且作为铵盐离开。在该实施例中使用的寡核苷酸在表1中描述。

[0117] 表1

[0118] 实施例1中使用的ON

[0119]

[0120] N= 简并序列（A、G、C或T的随机结合）

[0121] PS= 每一个键均硫代磷酸化

[0122] 2’O Me= 每一个核糖均2’-O甲基化

[0123] 使用的3’FITC标记的寡核苷酸是REP 2032-FL(6mer硫代磷酸化简并寡脱氧核苷酸)、REP 2003-FL(10mer硫代磷酸化简并寡脱氧核苷酸)、REP 2004-FL(20mer硫代磷酸化简并寡脱氧核苷酸)、REP 2006-FL(40mer硫代磷酸化简并寡脱氧核苷酸)、REP2031-FL(40mer聚胞嘧啶硫代磷酸化寡脱氧核苷酸；SEQ ID NO:4)、REP 2107-FL(每个核糖经2’O甲基化修饰的40mer硫代磷酸化简并寡核苷酸)和REP 2086-FL(每个核糖经2’O甲基化修饰的40mer简并磷酸二酯寡核苷酸)。这些ON的每一种制备为1mM TRIS（pH7.2）中的0.5mM储备液。这些储备液用于制备FP缓冲液（10mM TRIS、80mM NaCl、1mM EDTA、
10mMβ-巯基乙醇和0.1%吐温 20）中的3nM荧光ON溶液。存在EDTA以在FP测量前移
除存在于溶液中的任何二价金属。这些缓冲溶液的每一种还含有80mM NaCl以评估在摩尔过量的一价阳离子存在下ON络合物的形成（在图1-12中每个图将此这报道为0mM金属氯化物浓度）。向溶液中的每种荧光ON添加各种量的ACS级二价（2+）金属盐酸盐。这些盐包括氯化钙、氯化镁、氯化钴、氯化铁、氯化锰、氯化钡、氯化镍、氯化铜、氯化锌、氯化镉、氯化汞和氯化铅。通过荧光偏振的增长（由无量纲单位“mP”量化）监测二聚体或更高阶ON螯合物的形成，以便ON络合物的形成增加导致质量较大的变化。所产生的这些ON螯合物的较慢翻滚导致发射荧光的偏振增加（见图16）。这些试验的结果提供于图2-13中。在每一种情况下，在所有二价阳离子存在下用所有ON观察到荧光偏振的显著增加但在高摩尔过量的Na+（以NaCl提供）存在下没有观察到，表明仅与二价金属阳离子形成ON螯合物。这些结果证明如下：

[0124] 在80mM NaCl存在下ON不显示出任何可检测的二聚体或任何其他更高阶ON络合物的形成。

[0125] 在以2+电荷状态存在的下列二价金属阳离子的存在下，ON形成二聚体和更高阶络合物：钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜、锌、镉、汞和铅。这些ON络合物的形成涉及ON与这些二价金属阳离子的相互作用。

[0126] ON络合物的形成不可能是由于由所测试的ON的简并性质而引起的通过传统的Watson-Crick相互作用的含氮碱基之间的杂交。另外，在采用的实验条件下，REP 2031（SEQ ID NO:4）不能自杂交。

[0127] ON络合物的形成在水溶液中是稳定的和可溶的，并且因为这些络合物似乎并入所讨论的二价金属作为所形成络合物的一部分，所以这些ON络合物具有从形成ON络合物的溶液中螯合所讨论的二价金属的作用。

[0128] 这些金属的螯合和ON螯合物的形成不依赖于特定核苷酸序列，如用简并寡核苷酸所观察的螯合所证明，并且同样不依赖于涉及磷酸二酯键或2’核糖部分的修饰的核苷酸修饰。

[0129] 这些金属的螯合用长度6-40个核苷酸的寡核苷酸发生。

[0130] 这些金属的螯合在存在或不存在硫代磷酸化或2’核糖修饰下发生。

[0131] 在该实施例中用大量二价金属阳离子与所有ON的ON螯合物的广泛形成同样强烈暗示以下：

[0132] 因为二价阳离子催化ON络合物形成并且一价阳离子不能，并且因为ON络合物的形成不是通过如上所述的碱基杂交发生，所以ON螯合物的形成必须涉及在容易共享能够填充阳离子中的空电子轨道的电子的位置两种ON之间的“金属离子桥”的一些形式。在磷酸二酯键中对“电子共享”最适合的位置是非桥接氧（或在硫代磷酸化情况下是硫）原子（见图14B）。

[0133] 双链ON，不管是DNA还是RNA均预期显示出相同的螯合物形成并且因此具有从溶液中螯合金属阳离子的相同倾向。

[0134] 这些金属桥必须涉及分子间相互作用，因为分子内相互作用不会导致任何显著增长的荧光偏振（见图15A-C和16）。

[0135] 可溶的ON螯合物在ON和二价金属阳离子的不会形成螯合物沉淀的任何浓度时存在（见图14D）。

[0136] ON不能与二价金属阳离子形成盐并且在水溶液中不表现为盐。这与一价阳离子（在该实施例中由钠例证，但也适用于其他一价阳离子例如钾、锂或铵）相反，一价阳离子与ON形成盐并且在溶液中表现为盐（电解质）。此外，尽管在该实施例中使用的所有ON是铵盐，但在水溶液中，该铵盐离子可能从ON中解离（正如预期为盐）并且对由二价阳离子形成ON螯合物不提供抑制。这进一步通过以下观察得到加强，额外的一价盐（在这种情况下是80mM NaCl）似乎不干扰与二价阳离子形成ON螯合物。

[0137] ON螯合物的形成可以预期用任何金属、过渡金属、呈2+电荷状态的镧系元素或锕系元素发生并且也可能用以3+或更高电荷状态（例如铬）存在的金属阳离子发生。

[0138] 长度大于40mer或携带其他修饰或具有任何特定确定的核苷酸序列的ON还可以预期与二价金属阳离子形成ON螯合物，只要它们含有能够以与传统磷酸二酯键中的非桥氧（或硫）原子相同的方式共享电子的键。

[0139] ON盐（例如钠盐）可以用于在人或非人患者体内螯合二价金属例如但不限于：镉、汞、铅。另外，由寡核苷酸钠盐螯合任何一个特定二价金属阳离子（例如铁）可以通过将ON钠盐配制为与另一种二价金属阳离子（例如钙）的ON螯合物来阻抑。

[0140] 除了盐酸盐以外的金属盐也可以允许ON螯合物的形成。以钙盐为例，与ON螯合物的形成相容的其他钙盐可包括但不限于葡萄糖酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙、苹果酸钙、天冬氨酸钙、富马酸钙、抗坏血酸钙、苯甲酸钙、异抗坏血酸钙和/或丙酸钙。

[0141] 实施例III

[0142] ON与不同钙盐和镁盐形成螯合物

[0143] 为了进一步证明ON螯合物形成的普遍性质并且还证明不同二价金属阳离子的盐在ON螯合物形成中的用途，使用两种不同形式的钙盐和镁盐制备具有不同的特定序列ON的不同ON螯合物。使用的盐是氯化钙、硫酸钙、氯化镁和硫酸镁。使用的ON列于下表2中。FP反应条件除了省去了EDTA外与与实施例1中的那些相同，以证明在不存在任何EDTA-介导的作用下ON螯合物的形成。

[0144] 表2

[0145] 实施例2中使用的ON

[0146]

[0147] N= 简并序列（A、G、C或T的随机并入）

[0148] PS= 每一个键均硫代磷酸化

[0149] 2’O Me= 每一个核糖均2’-O甲基化

[0150] NA= 不适用(序列是简并的)

[0151] 这些实验的结果示于图17-24中，并且证明测试的所有ON能与钙和镁的不同盐形成ON络合物。对于一般观察的两个例外是REP 2028-FL（40mer poly G，SEQ ID NO:1；图18A和22A）和REP 2029-FL（40mer polyA，SEQ ID NO:2；图17B和21B）。这两种ON是聚嘌呤并且，特别是在polyG的情况下，已知形成热力学稳定的分子内相互作用（在poly G结构的情况下，被称为“G-四分体(G-quartets)”），这导致这些ON形成紧密的分子内络合物，其中磷酸二酯主链在该络合物内可能部分折叠或不再能够参与溶液相互作用（像螯合物形成）。REP 2029-FL（SEQ ID NO:2）能够微弱地形成螯合物这可能是由于用该ON发生弱的“A-四分体”的相互作用。因此，本文中未涵盖的是仅包含形成热力学稳定的分子内相互作用的polyA和poly G和适体的ON。本文涵盖的ON不完全是poly A或poly G ON和/或
七聚物(haptamer)。

[0152] 实施例Ⅱ的结果显示不同形式的镁盐和钙盐可以用于制备ON螯合物并且进一步说明如下：

[0153] 实施例Ⅱ中所有ON（除REP 2006-FL）含有特定序列，其不含有能够形成发夹的任何回文序列，并且这些序列都不是自互补的(self-complimentary)。因此，观察的任何ON螯合物的形成都不归因于杂交事件。

[0154] REP 2028-FL（SEQ ID NO:1）和REP 2029-FL（SEQ ID NO:2）形成ON螯合物的能力差说明对于ON螯合物的形成需要松散的磷酸二酯主链，再次表明磷酸二酯主链为连接两种或更多种ON以形成ON螯合物所需的ON的化学特征。

[0155] 不管其他存在的修饰例如硫代磷酸化、2’核糖修饰或锁核酸修饰，含有磷酸二酯主链的任何ON预期能够形成螯合物。

[0156] 可以用与长度高达80mer的ON形成ON螯合物，并且大于80mer的ON在二价金属阳离子存在下也显示相同的行为。

[0157] 实施例Ⅳ

[0158] 用双链ON形成ON螯合物

[0159] 由在水溶液中通过Watson-Crick相互作用相互杂交的两个单链互补的寡核苷酸形成双链寡核苷酸。由于双链ON仍具有暴露在形成的DNA螺旋外侧的磷酸二酯主链，它们应能够在二价阳离子存在下形成螯合物。为了测试该假设，通过使REP 2055-FL（40mer poly AC；SEQ ID NO:6）和REP 2033-FL（40mer poly TG；SEQ ID NO:5）杂交以及使REP2057-FL（40mer poly AG；SEQ ID NO:8）和REP 2056-FL（40mer poly TC；SEQ ID NO:7）杂交制备两种不同的双链DNA寡核苷酸。由于ON杂交得到双链体，可通过相对于用于制备络合物的单链ON的荧光偏振的增加来检测所产生的质量增加。将单链ON（REP 2055-FL（SEQ ID NO:6）、Rep2033-FL（SEQ ID NO:5）、Rep 2057-FL（SEQ ID NO:8）和REP 2056-FL（SEQ ID NO:7）每种在1×FP缓冲液中稀释至20nmM。如以上所鉴定的两个互补对的杂交也在1×FP缓冲液（每种ON为10nM）中进行，并且通过荧光偏振的增加证实杂交。然后将该双链构建体暴露至100mM CaCl2或100mM MgCl2中。通过荧光偏振的进一步增加监测ON螯合物的形成（见图25）。这个实验的结果证实了ON的两个互补对成功杂交成双链ON，如荧光偏振的增加所证。此外，向这些双链ON中添加CaCl2或MgCl2均导致荧光偏振的进一步增加，表明这些双链ON也可以在二价金属阳离子的存在下形成螯合物。这些结果同样强烈地暗示双链ON可以与任何二价阳离子形成ON螯合物并且同样预期具有从溶液中掩蔽所述二价阳离子的作用。

[0160] 实施例Ⅴ

[0161] 多种一价阳离子不能与ON形成螯合物

[0162] 为了更具体地证明ON螯合物的形成在一价阳离子下的存在下不能发生并且其形成特别需要二价阳离子，在仅含有阳离子一次源的FP缓冲液中观察用许多ON的ON络合物形成（见实施例2）。制备仅含下列盐的一种的1×FP缓冲液：氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化钙或氯化镁，所有在80mM浓度时，以便在FP缓冲液中阳离子的浓度是相当的。在不同FP缓冲液中，将如实施例2中描述的荧光标记的ON稀释至10nM，并且通过荧光偏振监测ON螯合2+ 2+
物的形成（见图26）。在测试的每种ON的情况下，仅用阳离子Mg 和Ca 而不用测试任何+ + +
的一价阳离子（Na、K或NH4）观察到螯合物的形成。如实施例Ⅲ中所观察的，REP 2029-FL（SEQ ID NO:2）和REP 2028-FL（SEQ ID NO:1）分别在钙或镁存在下仅显示出中度或无络合物形成。这进一步证实了ON仅能与二价阳离子形成螯合物，而ON仅可作为盐与一价盐存在。

[0163] 实施例Ⅵ

[0164] 评估在WFI中制备的ON螯合物中金属的含量

[0165] 为了证明ON螯合物制剂对所有ON的广泛应用，使用ON和2+金属氯化物盐制备若干不同的ON螯合物，如表3所示。在这些制剂中使用的所有ON是钠盐，其已经脱盐以除去来自NaCl的钠并且在最终冻干的ON中仅留下对ON盐形成不可或缺的钠。通过首先将规定量的ON钠盐溶解至50mg/ml浓度并且将规定量的二价金属氯化物盐加入至该ON溶液中来在注射用水（WFI）中制备ON螯合物。通过电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）分析二价金属氯化物添加/ON螯合物形成之前的ON溶液的钠和相关金属。ON螯合物形成后，使用5000MWCO再生纤维素过滤器通过超滤使样品脱盐。之前已证实该过滤器允许游离盐的渗透但不允许ON或附着在ON的阳离子渗透。通过ICP-OES分析保留溶液（含有ON螯合物）的钠和金属含量并且通过离子色谱分析氯含量以证实存在的二价金属被螯合在ON上并且不是来自存在于保留溶液中的二价金属盐（表4）。

[0166] 表3

[0167] 多种ON螯合物的制备

[0168]

[0169] N= 简并碱基（A、G、T或C的随机分布）

[0170] PS= 每一个键均硫代磷酸化

[0171] 2’O Me=2’-O甲基化核糖

[0172] 5MeC=5’甲基胞苷

[0173] 表4

[0174] 在多种ON螯合物溶液中金属含量的验证

[0175]

[0176]

[0177] 这些结果证实在长度从20-60mer变化、序列从完全简并ON到三种特定序列（poly C、poly AC和poly AG）变化的ON中并且在有或没有硫代磷酸化修饰、有或没有2’核糖修饰和含有硫代磷酸化和2’核糖修饰ON中，由钙、镁或铁（2+）离子部分置换钠。将2’O甲基核糖修饰的ON配制成螯合物的能力预期同样延伸至含有任何其他2’核糖修饰例如但不限于2’氟和2’O甲氧乙基的ON。另外，它们证明用二价金属含量最小的增加实现显著的钠置换，这与图15中描述的ON螯合物的结构一致。这些结果也说明可用于制备ON螯合物的钙、镁、铁（2+）的各种组合和混合的钙/镁盐溶液，并且显示了任何二价金属盐溶液或二价金属盐溶液的混合物可以类似地用于制备ON螯合物。

[0178] 因此，可以从完全硫代磷酸化或未硫代磷酸化、含有任何数量的硫代磷酸化键、含有至少一种2’核糖修饰或完全2’核糖修饰或不含有2’核糖修饰的ON中制备ON螯合物。ON可以是RNA或DNA或含RNA和DNA的混合物。用于制备ON螯合物的金属盐包括但不限
于钙盐、镁盐、铁盐、任何其他二价金属盐。

[0179] 实施例Ⅶ

[0180] 在生理盐水中稳定的ON螯合物的制备

[0181] 在实施例Ⅱ和Ⅲ中已经证明了用不同二价金属形成和制备的ON螯合物的广泛保守的性质，在生理盐水中（其对向受试者施用ON螯合物是一个更加适当的赋形剂）检验稳定的、可溶的ON钙螯合物的制备。对于这个实验，使用生理盐水中REP 2006的钠盐的200mg/ml溶液作为ON的来源。钙的来源是WFI中10%CaCl2溶液（100mg/ml CaCl2）。根据以下的方案在室温下使用不同的钙和REP 2006浓度在1ml溶液中制备各种REP 2006钙螯合物（见表5）:1）将REP 2006加入到小瓶中，2）加入生理盐水并且混合并且3）加入CaCl2并且混合。观察到这些REP 2006钙螯合物溶液在36天内出现沉淀（见表6）。

[0182] 表5

[0183] 制备各种REP 2006钙螯合物的条件

[0184]

[0185]

[0186] 表6

[0187] 在各种ON和钙浓度下在REP 2006钙螯合物中沉淀的形成

[0188]

[0189] - 澄清、透明溶液

[0190] + 小瓶底部有非常少量的白色沉淀

[0191] ++ 良好的胶体沉淀，半透明

[0192] +++ 良好的胶体沉淀，不透明

[0193] ++++ 沉淀主要在管底但存在残留胶体

[0194] +++++ 沉淀在管底，剩余溶液澄清且透明

[0195] 如通过轻轻地反转小瓶时在小瓶中和粘性溶液行为中有更明显的新月形物(meniscus)所证明，在所有情况中，与不存在钙的REP 2006溶液（在所有测试的浓度时）相比，REP 2006钙螯合物的溶液显示降低的表面张力和增加的粘度。该溶液行为与大量可溶性的多聚体络合物（螯合物）的形成相一致，如图15A-C所示。即使在这些小瓶中已经形成沉淀，剩余的溶液仍显示出该表面张力和粘度增加的特征。这可能是在这些溶液中形成的沉淀已采用如图15D所示的饱和的（和不溶的）ON螯合物结构，其中残留的未沉淀的ON和钙仍在溶液中形成可溶的螯合物。这些行为预期通常代表任何ON螯合物的行为，不管ON长度、化学成分、结构（单链或双链）或存在二价金属。此外，这些实验还证明虽然较高浓度的ON和钙可最初形成完全可溶的络合物，但是这些可能是动态不稳定的并且慢慢地从可溶的螯合物（如图15A-C所示）过渡为不溶的螯合物（图15D）。因此可能理想的是在例如表5所示的ON和金属浓度时制备ON螯合物，表5所述的浓度具有在溶液中是稳定的可溶的ON螯合物。对于不同的ON和金属组合，产生随时间在溶液中保持可溶的可溶ON螯合物的最佳的ON和金属浓度可以由表5中所示的REP2006和钙的那些浓度改变。

[0196] 实施例Ⅵ和Ⅶ描述了在可用于制备ON螯合物的不同的赋形剂中ON和二价金属盐浓度的各种组合，并且描述了ON和二价金属盐或二价金属盐混合物的组合，其产生在生理盐水中迅速地沉淀、缓慢地沉淀或在延长的时间段保持完全可溶的ON螯合物溶液。这对使用具有任何这些稳定性特征的ON螯合物溶液是有利的。

[0197] 因此，可以使用任何ON盐（包括但不限于ON钠盐或ON铵盐或混合的ON钠/铵盐）来制备ON螯合物。理想地，将ON盐溶解在水性赋形剂中，所述水性赋形剂包括但不限于注射用水或生理盐水。用于形成ON螯合物的二价金属的来源可以是盐酸盐、硫酸盐或任何其他药学上可接受的盐，包括但不限于葡糖酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐、延胡索酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、异抗坏血酸盐和/或丙酸盐。该盐可以包含以下任何二价金属阳离子：钙、镁、铁（2+）、锰、铜和/或锌。另外，可使用一种以上的金属盐的混合。所述金属盐可以直接以粉末形式使用，但在相同的赋形剂中优选地制备为水溶液，因为将ON溶解于其中。金属盐可在任何浓度制备直至所述赋形剂中所述金属盐的溶解性的最大限度。通过缓慢地向ON溶液中加入金属盐溶液并伴随持续混合以防止在盐溶液添加过程中ON螯合物沉淀的聚集来优选地制备ON螯合物。根据使用的ON和金属盐的浓度，ON螯合物溶液随着时间的推移可以缓慢地形成ON螯合物沉淀或保持完全可溶（见实施例Ⅶ）。

[0198] 实施例Ⅷ

[0199] 由ON引起的血清钙的螯合导致血液抗凝

[0200] 之前已经描述了特定ON的抗凝作用但在本公开中证明了ON螯合物的抗凝作用，制备非FITC标记的ON为高纯度钠盐以便是生物相容的。这些ON是REP 2004、REP 2006、REP 2107和REP 2031（SEQ ID NO:4），这些是在实施例1中描述的那些ON的未标记形式。将这些各种浓度的ON（在500μl生理盐水中）加入到收集在柠檬酸盐管中的5mL新鲜人全血中。使用公认的临床试验方法评估在这些ON存在下凝血酶原时间（对血液的凝集状态是一个公认的度量）并且与值相同体积的生理盐水存在下凝血酶原时间相比较。对凝集的相对作用以比值表示（PPT寡:PPT生理盐水）并且报道为归一化比值（NR）。NR为1表明正常的凝固状态并且NR大于1表明血液是抗凝的。这些试验的结果示于图27。对于所有评估的ON，存在抗凝的剂量依赖性增加。

[0201] REP 2055（SEQ ID NO:6）是具有序列（AC）20的40mer硫代磷酸化ON。如上所述评估2.5mM REP 2055的钠盐的添加对血液凝固状态的作用。为了测定抗凝作用是否是由于钙从血液中的螯合，观察各种量的钙补充剂（以氯化钙的形式）对REP 2055（SEQ ID NO:6）-诱导的抗凝的作用。该实验的结果示于图28中。正如图27中的结果所预期的，2.5mMREP 2055（SEQ ID NO:6）诱导了显著的血液抗凝。这种抗凝通过钙的补充有效地阻抑并且可以在氯化钙浓度大于2.25mM时完全逆转。这些结果强烈表明寡核苷酸的抗凝作用是由导致如上述实施例所述的钙螯合的ON施用后在血液中形成的ON螯合物介导的。此外，这些结果进一步鉴定了一种防止由ON引起的血液抗凝的方法，该方法通过将ON制备为钙螯合物来消除待施用的ON的螯合作用。钙螯合的消除还可以用ON螯合物实现，该ON螯合物使用另一种二价金属盐包括但不限于：镁、锰、铁（2+）、铜和/或锌制备。这些阻抑寡核苷酸介导的抗凝的方法可以预期通过静脉或其他施用途径向人或非人受试者施用的寡核苷酸是有效的。

[0202] 该实验的结果同样质疑了ON与血清蛋白质相互作用的性质。之前关于ON抗凝的性质的假设是ON直接与凝血级联反应的蛋白质相互作用，但是我们注意到这些蛋白质大多数是钙结合蛋白或参与钙依赖性凝血级联反应的蛋白质（Sheerhan和Lan，1998，Blood，92：1617）。通过添加钙消除ON的血液抗凝的事实和ON作为钙螯合剂的事实表明如下：

[0203] ●参与抗凝的ON蛋白质结合是必须的但对于抗凝不是充分的—通过由ON引起的螯合从钙依赖性蛋白质中移除钙可能是ON发挥抗凝活性的机制。

[0204] ●ON蛋白质与凝血级联反应的组分相互作用其自身可能是钙依赖性的。

[0205] 白蛋白，一种主要的血蛋白，也结合钙并且是血清钙调节机制的一部分。已知白蛋白与ON相互作用并且可能在血液中ON的循环半衰期发挥重要的作用。从上述抗凝实验的结果看，似乎血液中的大多数蛋白质相互作用可在很大程度上由ON的钙螯合功能来催化。因此为了减少血清蛋白质相互作用，其也可能具有减少ON的循环半衰期并且改善其胃肠道外施用的耐受性的作用，可以对受试者施用作为ON螯合物的ON。这些络合物可以由钙盐制备，但也可以由其他适当的金属盐制备，以便当施用时消除ON螯合钙的倾向。这种络合物的螯合活性已消除并且因此将预期具有显著地减少的与血清蛋白质的相互作用。这种减少的血清蛋白质相互作用的优点将是改善的所施用ON（作为螯合物）的耐受性和血液中游离ON的较短的半衰期。

[0206] 实施例IX

[0207] 用长期ON治疗在人受试者中低钙血症的研发和防止

[0208] 为进一步检验在上述实施例中描述的由ON引起的二价金属阳离子的螯合是否在人受试者中具有生物相关性，在患有慢性肝疾病患者中检验长期施用ON对血清钙的作用。这些受试者特别适合于检验ON螯合的生物作用（如果有的话），因为它们已经显示出患有维生素D缺乏症，其通常伴随着矿物质代谢紊乱和骨矿物质密度降低(Arteh等,2010,Dig.Dis.Sci.,55:2624-2628和George等 ,2009World J Gasteroenterol.,15:3516-3522)。
因此，如果长期施用的ON的螯合作用正在改变人受试者中二价金属的体内平衡（如钙），这种改变的作用将在这些患者中更加容易地观察到，因为如果这种改变发生则它们将很难阻碍任何血清金属的不平衡。通过缓慢IV输注，用生理盐水中的ON REP 2055（SEQ ID NO：
6）（作为GMP级钠盐）对具有慢性乙型肝炎感染的患者（诊断为慢性肝疾病）每周一次进行治疗。通过公认的临床实验室方法，在受试者中监测总血清钙的水平。在12周的治疗中头两名接受ON治疗的受试者发展显著的低钙血症（图29A）。这种低钙血症的严重程度有所不同，但在以后的13周的治疗过程中仍持续。随后给予接受用REP 2055（SEQ ID NO：6）的长期ON治疗的受试者矿物质补充剂（提供钙、镁和锌）以对抗ON治疗的螯合作用。在ON治疗时接受矿物质补充剂的受试者没有发展低钙血症（图29B）。这些结果证明ON的螯合活性确实在人受试者中发生。这可以直接用血清钙观察，但也可以用其他生物相关的二价金属阳离子（如镁、锌和铜）发生。另外，由ON螯合作用引起的金属缺乏可以通过矿物质补充剂来纠正并且也可以通过施用作为螯合物的ON来减少。

[0209] 因为ON已经显示出在人受试者中螯合二价金属阳离子，非螯合的ON的施用可用于螯合受试者中的有害重金属，例如汞、镉、铅或甚至铬（6+）。这种方法将涉及施用适当赋形剂中的药学上可接受的ON盐，优选地通过静脉施用但也可以通过其他胃肠道外途径，该ON设计为缺乏序列依赖功能（例如但不限于实施例Ⅲ中描述的特定序列ON）。肝脏功能正常的患者将预期能够阻碍将发生的钙螯合，然而可提供矿物质补充剂（如实施例Ⅸ中）以确保防止生物学上重要的二价阳离子的血清损耗。这种未螯合的ON将掩蔽存在于血液中的重金属，立即减少或消除这些金属的有害作用并且同样可能加速其从所讨论的受试者中消除。

[0210] 因为同样已经证明双链ON也可以形成ON螯合物（并且因此还掩蔽二价金属），预期施用任何双链核酸（例如siRNA）也预期具有如上述实施例中描述的单链ON的至少一些螯合作用。因此，在施用前制备作为螯合物的双链ON是有利的。

[0211] 实施例X

[0212] ON螯合物可以阻抑皮下施用的寡核苷酸的注射部位反应

[0213] 伴随人患者中皮下施用的寡核苷酸的注射部位反应（ISR）是常见的，甚至是用高度修饰的寡核苷酸以减少其免疫刺激特性。因为皮下施用涉及高浓寡核苷酸（通常>100mg/ml）的注射，位于注射部位周围的螯合作用（最可能是钙但也可能是其他二价金属例如镁）必须是大量的并且有助于经常观察的ISR。为了测试该假设，向人患者通过皮下施用途径施用REP2055（SEQ ID NO:6）或REP 2139（SEQ ID NO:13，所有核糖经2’O甲基化并且所有胞嘧啶碱基经5’甲基化的REP 2055类似物）。在生理盐水中将这两种溶液无菌地制备为钠盐或是作为钙螯合物（见表7和8并且按照实施例Ⅷ中的程序）。为了控制患者到患者变化，评估每种ON的两种制剂在相同人受试者中的注射反应性。在施用REP 2055（SEQ ID NO:6）后12小时以及施用REP 2139（SEQ ID NO:13）后72小时，监测受试者每个注射部位的ISR。该实验的结果提供于表7和8。

[0214] 表7

[0215] 通过制备为钙螯合物（1cc团注，20mg CaCl2/100mg ON）REP 2055（SEQ ID NO:6）的注射部位反应的阻抑

[0216]

[0217] 表8

[0218] 通过配制为钙螯合物（2cc团注，30mg CaCl2/100mg ON）制备的REP2139（SEQ ID NO:13）的注射部位反应的阻抑

[0219]

[0220] 这些结果证明施用作为钙螯合物的ON基本减少或消除了两种不同皮下施用的ON的ISR。这些结果进一步证明由ON引起的钙（和可能其他二价金属）的螯合在通常与皮下施用ON相关的ISR的表现中起重要的作用。此外，这些结果确定了通过进行施用作为螯合物的所述ON来防止任何皮下施用的ON的ISR的方法。在这些实施例中，钙用作用于形成螯合物的媒介物，但是ISR的减轻也预期伴随ON螯合物发生，该ON螯合物已用钙以外的另一种适当的二价金属制备。任何ON金属螯合物将预期具有其螯合消除的钙的倾向，其将是改善施用作为螯合物的ON的SC耐受性的潜在机制。根据本文实施例中公开的ON螯合物形成的广泛的保守性质，ON螯合物阻抑寡核苷酸诱导的ISR的能力预期对任何特定序列的任何ON和或修饰和或单链或双链ON是有效的。在该实施例中使用钙作为示例性二价金属，其他钙盐可以用于制备ON螯合物并且预期产生对伴随皮下施用的寡核苷酸介导的ISR具有相同阻抑作用的ON螯合物，所述钙盐包括但不限于葡萄糖酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙、苹果酸钙、天冬氨酸钙、富马酸钙、抗坏血酸钙、苯甲酸钙、异抗坏血酸钙和/或丙酸钙。ON螯合物可以用其他二价金属阳离子制备例如但不限于：镁、锰、铁、铜、锌。

[0221] 在ON螯合物的制备中，理想的是使用非二价原子的其他阳离子，但其可以类似地防止寡核苷酸的螯合作用。用这些阳离子制备的ON螯合物也可以用于制剂中以阻抑由ON引起的抗凝或阻抑伴随皮下施用ON时的注射部位反应或防止ON施用后生物学上重要的二价金属的掩蔽。这种反离子可包括但不限于：3+或更高电荷状态或有机阳离子的原子。

[0222] 在ON螯合物的制备中，优选的是使用二价阳离子的混合物（即与钙盐和镁盐）制备ON螯合物。这种混合的ON螯合物更容易制备并且比用单一的二价阳离子制备的螯合物具有较大的溶解度，并且因此将较好地适用于高浓度应用。

[0223] 假定使用多种ON序列的以上实施例，具有多种修饰和呈单链或双链状态和使用多种二价金属，不管其他修饰，ON螯合络合物的形成可以被认为是具有磷酸二酯主链（是否硫代磷酸化）的任何及所有ON的普遍特征。因此，在血液或皮下空间ON螯合物的形成是当ON作为盐（通常为钠盐）施用时任何ON施用的正常特征，这导致二价金属阳离子的掩蔽，即使在接受所讨论的ON的特定受试者群体中该螯合的二次作用可能是无症状的。重要的是，有一些ON的例子(PRO-051/GSK2402968-Goemans等,2011 New England J.Med.,364:1513-1522 和 ISIS 301012(mipomersen)–Viser 等 ,2010,Curr.Opin.Lipidol.21:319-323)其清晰地显示出伴随皮下施用（作为钠盐）的ISR反应，这与在实施例IX中观察的ISR类似并且因此诊断为施用后ON螯合物形成。即使这两种ON具有不同的序列和不同的2′核糖修饰，但是它们都具有磷酸二酯主链（在两种情况下为硫代磷酸化），并且因此可以形成ON螯合物并且从局部环境（在这种情况下是皮下空间）掩蔽二价金属。此外，即使ON螯合必须发生，已显示出这两种ON能够发挥其生物作用，因此在生物系统中ON螯合物不干扰ON的生物活性。

[0224] 在本领域中广泛接受的并且充分证明的是所有硫代磷酸化ON（不论碱基序列）通常在肾脏和肝脏中达到最高的药物浓度。从历史上看，长期施用许多不同的硫代磷酸化ON已与轻度肝或肾功能障碍相关。虽然还未清晰地阐明这些功能障碍的原因，但是假定一般ON的保守的螯合作用，可能的是伴随长期ON施用的肝脏和肾脏中二价金属的螯合是显著的，因为由于存在高浓度的ON，螯合活性在这些器官中可能是最显著。施用作为螯合物的ON将不会改变器官生物分布（或影响如上述所示的生物活性），但可能有助于防止在肝脏和肾脏中的金属缺乏，所述金属缺乏对这些器官的正常功能有影响。

[0225] 鉴于ON螯合物导致在溶液中形成多聚体ON络合物，这些络合物可能具有强得多的核酸酶降解抗性和可能的水解抗性，并且硫代磷酸ON也可能更耐氧化。因此，作为螯合物的任何ON的储存可能极大地增加其在水溶液中的稳定性，而在对受试者施用时不显著改变其生物活性。

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