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改善的用于合成模制分子的方法

阅读:396发布:2022-08-13

专利汇可以提供改善的用于合成模制分子的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及合成连接于指导了其合成的模板上的模制分子的方法。所述方法涉及模板、 支架 功能实体以及连接于构件的功能实体(其又连接于模板)。支架功能实体和构件功能实体均提供有互补的二聚化结构域,当所述互补结构域彼此相互作用时,允许这些功能实体紧密靠近。所述方法可用于产生模制分子文库,该文库可进行 生物 学活性选择。,下面是改善的用于合成模制分子的方法专利的具体信息内容。

1.合成模制分子的方法,包括步骤:
a)提供至少一个包括一个或多个密码子的模板,
b)提供连接于第一拉链寡核苷酸的第一功能实体,所述第一拉链寡核苷酸能够可逆地与第二拉链寡核苷酸相互作用,
c)提供一个或多个构件,每个构件包含通过接头与反密码子连接的再一功能实体,其中反密码子与模板的密码子互补,
其中所述再一功能实体与第二拉链寡核苷酸连接,所述第二拉链寡核苷酸能够可逆地与连接于步骤b)中提供的第一功能实体的第一拉链寡核苷酸相互作用,并且其中所述再一功能实体能够与步骤b)中提供的第一功能实体在化学上连接,d)使步骤a)、b)和c)中提供的组分在允许i)构件反密码子与模板的密码子特异性杂交以及ii)与不同功能实体连接的两个拉链寡核苷酸二聚化的条件下相互接触,e)允许步骤c)中提供的所述一个或多个构件的再一功能实体与步骤b)中提供的第一功能实体形成化学连接,和
f)获得连接于指导了其合成的模板的模制分子。
2.根据权利要求1的方法,其中在步骤f)中获得连接于指导了其合成的模板的模制分子之前,重复步骤d)和e)一次或多次。
3.根据权利要求1的方法,其中第一功能实体共价连接于模板。
4.根据权利要求1的方法,其中第一功能实体与模板杂交。
5.根据权利要求1的方法,其中第一功能实体形成构件的一部分,所述构件还包括:
与模板密码子互补的反密码子,
连接反密码子和第一功能实体的接头,和
与第一功能实体连接的第一拉链寡核苷酸。
6.根据权利要求3的方法,其中第一功能实体形成构件的一部分,所述构件还包括:
与模板密码子互补的反密码子,
连接反密码子和第一功能实体的接头,和
与第一功能实体连接的第一拉链寡核苷酸。
7.根据权利要求4的方法,其中第一功能实体形成构件的一部分,所述构件还包括:
与模板密码子互补的反密码子,
连接反密码子和第一功能实体的接头,和
与第一功能实体连接的第一拉链寡核苷酸。
8.根据权利要求1的方法,其中第一功能实体的拉链寡核苷酸存在于模板中。
9.根据权利要求3的方法,其中第一功能实体的拉链寡核苷酸存在于模板中。
10.根据权利要求5的方法,其中第一功能实体的拉链寡核苷酸存在于模板中。
11.根据权利要求1的方法,其中拉链寡核苷酸包含互补的核酸序列。
12.根据权利要求3的方法,其中拉链寡核苷酸包含互补的核酸序列。
13.根据权利要求4的方法,其中拉链寡核苷酸包含互补的核酸序列。
14.根据权利要求1的方法,其中第一功能实体进一步连接于与模板所带有的核酸序列互补的核酸序列。
15.根据权利要求3的方法,其中第一功能实体进一步连接于与模板所带有的核酸序列互补的核酸序列。
16.根据权利要求4的方法,其中第一功能实体进一步连接于与模板所带有的核酸序列互补的核酸序列。
17.根据权利要求1的方法,其中拉链寡核苷酸形成构件的接头的一部分。
18.根据权利要求5的方法,其中拉链寡核苷酸形成构件的接头的一部分。
19.根据权利要求8的方法,其中拉链寡核苷酸靠近功能实体。
20.根据权利要求17的方法,其中拉链寡核苷酸靠近功能实体。
21.根据权利要求17的方法,其中拉链寡核苷酸离所述第一或再一功能实体间隔不多于2个核苷酸。
22.根据权利要求19的方法,其中拉链寡核苷酸离所述第一或再一功能实体间隔不多于2个核苷酸。
23.根据权利要求21的方法,其中拉链寡核苷酸和第一功能实体间隔不多于2个核苷酸。
24.根据权利要求1的方法,其中所述第一功能实体距离第一拉链寡核苷酸的核苷酸数和所述再一功能实体距离第二拉链寡核苷酸的核苷酸数相同。
25.根据权利要求1的方法,其中拉链寡核苷酸包含3到20个核苷酸。
26.根据权利要求25的方法,其中拉链寡核苷酸包含4到16个核苷酸。
27.根据权利要求26的方法,其中拉链寡核苷酸包含5到10个核苷酸。
28.根据权利要求1的方法,其中构件中反密码子和拉链寡核苷酸之间的接头是单键。
29.根据权利要求5的方法,其中构件中反密码子和拉链寡核苷酸之间的接头是单键。
30.根据权利要求1的方法,其中密码子:反密码子杂交体的退火温度高于杂交的拉链寡核苷酸的退火温度。
31.根据权利要求30的方法,其中退火温度间的差异为10℃或以上。
32.根据权利要求30的方法,其中退火温度间的差异为25℃或以上。
33.根据权利要求1的方法,其中允许构件反密码子与模板的密码子特异性杂交的条件与允许两个拉链寡核苷酸最佳二聚化的条件不同。
34.根据权利要求33的方法,其中允许构件反密码子与模板密码子特异性杂交的条件包括密码子和/或反密码子的浓度,该浓度高于在两个拉链寡核苷酸二聚化所用的密码子和/或反密码子浓度。
35.根据权利要求34的方法,其中密码子与反密码子杂交期间的浓度与两个拉链寡核苷酸二聚化所用的浓度相比高至少10倍。
36.根据权利要求1的方法,其中根据步骤d)的接触通过使温度在杂交的拉链寡核苷酸退火温度之上和之下交替而进行。
37.根据权利要求36的方法,其中所述温度交替进行多次。
38.根据权利要求36的方法,其中最高温度低于密码子:反密码子杂交体的退火温度。
39.权利要求1的方法,其中模板密码子具有3到30个核苷酸。
40.权利要求1的方法,其中至少两个模板密码子是彼此紧靠地顺次排列的,而且被间隔基团隔开。
41.权利要求40的方法,其中模板包括更多的密码子。
42.权利要求41的方法,其中每一个更多的密码子被间隔核苷酸序列隔开。
43.权利要求40的方法,其中每个间隔核苷酸序列标识相应密码子的位置
44.权利要求40的方法,其中间隔核苷酸序列含有具有高亲和的区域,确保模板和反密码子的杂交在框内进行。
45.权利要求40的方法,其中间隔核苷酸序列能调整密码子:反密码子的退火温度。
46.权利要求1的方法,其中模板密码子数为2-100个。
47.权利要求46的方法,其中模板密码子数为3-15个。
48.权利要求1的方法,其中构件的功能实体是掺入模制分子中的功能实体的前体。
49.权利要求48的方法,其中作为模制分子合成过程中功能实体掺入模制分子中的结果,功能实体的结构发生改变。
50.权利要求1的方法,其中所述一个或多个构件的功能实体具有1到10个反应基团。
51.权利要求50的方法,其中以仅仅一个反应基团为特点的构件用于产生多聚物的末位。
52.权利要求50的方法,其中具有两个反应基团的构件用于产生多聚物的干部。
53.权利要求50的方法,其中具有两个反应基团的构件用于产生能够与进一步的功能实体反应的支架
54.权利要求50的方法,其中具有两个或多个反应基团的功能实体用于和支架进行反应,所述支架是包含数个反应基团的核心结构的形式,其中所述反应导致形成不同的模制分子。
55.权利要求54的方法,其中反应基团的反应得到填充基团或催化剂的帮助。
56.权利要求1的方法,其中所述一个或多个构件的反密码子、接头和第二拉链寡核苷酸形成毗邻的线性寡核苷酸。
57.权利要求1的方法,其中构件反密码子在功能实体彼此通过化学反应连接之前与模板退火。
58.权利要求1的方法,其中单独地添加各个构件,并使之与模板接触。
59.权利要求2的方法,其中在第一个反应循环中构件与模板接触导致形成密码子:反密码子杂交体,该密码子:反密码子杂交体的退火温度比随后添加的进一步的构件在第二或进一步的反应循环中与模板接触时形成的密码子:反密码子杂交体的退火温度更低。
60.权利要求59的方法,其中在第二或进一步的反应循环中密码子:反密码子杂交体的退火温度导致维持仅第二或进一步轮的构件与模板接触,而多数以前合成轮的构件的反密码子或者未反应构件的反密码子变成单链或从模板上离开。
61.权利要求2的方法,其中在构件的功能实体转移到第一功能实体上之后,及在随后的反应循环期间,构件的反密码子保持退火到模板上,其中所述的第一功能实体是支架。
62.权利要求2的方法,其中在重复步骤d)和e)之前,从模板上除去已反应的构件的反密码子。
63.权利要求1的方法,包括如下进一步的步骤:将模制分子转移到模板上的锚点或互补于模板的核苷酸序列上,以建立模板和模制分子间的化学连接,该化学连接允许进行模制分子的变性富集或变性模制后修饰的再进一步步骤。
64.权利要求63的方法,其中化学连接是共价化学键。
65.权利要求63的方法,其中互补核苷酸序列和模板之间形成的杂交体的退火温度比任何构件反密码子和模板之间形成的杂交体的退火温度更高。
66.权利要求65的方法,其中在模制分子富集期间使用严谨条件,导致从模板清除用过的构件。
67.权利要求1的方法,其中第一功能实体是与两个或多个功能实体反应的支架。
68.权利要求67的方法,其中支架与从构件发射出的功能实体反应。
69.权利要求67的方法,其中支架包含两个或多个反应基团。
70.权利要求67的方法,其中支架在模制分子的合成中自始至终保持与模板连接。
71.权利要求1的方法,其中是支架的第一功能实体形成构件的一部分,该构件的反密码子与模板的侧翼位置退火,该侧翼位置不位于模板密码子之间。
72.权利要求1的方法,其中模板包括两个或多个密码子,且通过其反密码子连接于所述两个或多个密码子的所述构件具有能够以有秩序的方式二聚化的相同的互补拉链寡核苷酸。
73.权利要求72的方法,其中密码子和反密码子的杂交以及拉链寡核苷酸的二聚化在分开的步骤中发生,其中反密码子与模板密码子特异性杂交的条件与拉链寡核苷酸二聚化的条件不同。
74.权利要求73的方法,其中拉链寡核苷酸二聚化的步骤在确保密码子和反密码子保持连接的条件和允许不同构件上的功能实体之间反应的条件下进行。
75.权利要求1的方法,其中密码子是以主链上的核酸基形式存在的系列核苷酸,其中所述核酸碱基选自天然核酸碱基和遵守Watson-Crick氢键规则的非天然核酸碱基。
76.权利要求75的方法,其中核酸碱基选自腺嘌呤、嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧
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啶、嘌呤、黄嘌呤、二基嘌呤、8--N-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N,
4 6 6 3 6
N-桥亚乙基胞嘧啶、N,N-桥亚乙基-2,6-二氨基-嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C-C)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑基嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和次黄嘌呤核苷。
77.权利要求75的方法,其中主链含有糖部分和核苷间接头。
78.权利要求77的方法,其中主链是选自核糖、2′-脱氧核糖、2′-O-甲基-核糖、
2′-氟-核糖以及2′-4′-O-亚甲基-核糖(LNA)的戊糖。
79.权利要求78的方法,其中核酸碱基连接在戊糖的1′位。
80.权利要求77的方法,其中当主链的糖部分为戊糖时,核苷之间的接头连接在前单体的3′端与后一单体的5′端。
81.权利要求80的方法,其中核苷之间的接头是磷酸二酯键。
82.权利要求80的方法,其中核苷之间的接头是选自硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、磷酸三酯键以及二硫代磷酸酯键的键。
83.权利要求1的方法,其中将模板固定在固体支持物上。
84.权利要求83的方法,其中固体支持物是珠子。
85.权利要求83的方法,其中在模板中掺入生物素基团,而且固体支持物是包被了链霉抗生物素蛋白的基质材料。
86.权利要求1的方法,其中第一功能实体通过选择性可断裂的接头与模板相联,该接头使得模板指导的合成的分子能够在预定的时间从模板上分离。
87.权利要求86的方法,其中第一功能实体是支架。
88.产生不同双功能复合物的文库的方法,所述方法包括步骤:使多个模板经历根据权利要求1-87任一项的方法,由此产生不同双功能复合物的文库,每一个复合物包含连接于指导了模制分子合成的模板或互补模板的模制分子。
3
89.权利要求88的方法,其中所述文库中不同双功能复合物的数目是至少10 个。
6
90.权利要求88的方法,其中所述文库中不同双功能复合物的数目是至少10 个。
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91.权利要求88的方法,其中所述文库中不同双功能复合物的数目是至少10 个。
92.权利要求88的方法,其中在权利要求1步骤a)中提供多个不同模板,并且在权利要求1步骤c)中提供多个不同构件。
93.权利要求88的方法,其中使所述多个不同模板同时经历权利要求1-75任一项的方法。
94.权利要求88的方法,其中文库的模制分子通过顺序地将模板与待用于模制分子合成的构件小组接触来合成。
95.权利要求88的方法,其中每个模板包含许多编码区,而且每个编码区限定了一个或多个独特的密码子。
96.权利要求95的方法,其中编码区位于线性序列中,各编码区彼此紧邻。
97.权利要求96的方法,其中编码区被间隔序列隔开。
98.权利要求95的方法,其中模板是支链的。
99.权利要求95的方法,其中每个模板具有2至50个编码区。
100.权利要求95的方法,其中每个模板具有3至30个编码区。
101.权利要求95的方法,其中每个模板具有4至15个编码区。
102.权利要求99的方法,其中各编码区内独特密码子的数目相同。
103.权利要求99的方法,其中各编码区包含不同数目的独特密码子。
104.权利要求99的方法,其中各编码区包含一个独特密码子。
105.权利要求88的方法,其包括将双功能复合物文库进行富集处理的进一步的步骤,所述富集包括步骤:
i)将文库暴露于富集文库中具有预定活性的复合物的条件之下,
ii)扩增经富集的文库中的复合物,
iii)获得经富集的文库,该文库具有更高比率的含具有预定活性的模制分子的复合物。
106.权利要求105的方法,其中富集的文库中复合物的扩增包括如下步骤:使复合物文库与扩增手段接触,扩增模板或互补模板,并利用扩增产物作为模板实施权利要求1-87任一项的方法。
107.权利要求105的方法,其中将步骤i)和ii)重复2-5次。
108.权利要求107的方法,其中在每一个重复循环完成之后鉴定产生的复合物。
109.权利要求107的方法,其中在最后一个重复循环后鉴定复合物。
110.权利要求108的方法,其中富集处理后的鉴定包括模板序列的确定和/或具有预定活性的模制分子和/或整个复合物的结构确定。
111.权利要求105的方法,其中文库复合物的富集通过筛选对靶分子具亲和力或效应的复合物来获得。
112.权利要求111的方法,其中靶分子选自可溶性受体、细胞表面受体、酶抑制剂和表面表位。
113.权利要求111的方法,其中靶分子选自受体、酶、激素、转录因子、离子通道和DNA。
114.权利要求113的方法,其中靶分子选自受体和酶。
115.权利要求114的方法,其中靶分子选自G蛋白偶联受体和蛋白酶。
116.权利要求1的方法,其包括如下进一步步骤:将模制分子与选自受体、酶、激素、转录因子、离子通道和DNA的靶分子接触,并鉴定作为靶分子激动剂或拮抗剂接触靶分子的模制分子。
117.双功能复合物,其包含与指导了其合成的模板连接的模制分子,其中所述模板进一步与能够以有秩序的方式可逆地二聚化的至少两个拉链寡核苷酸连接,所述双功能复合物能够通过权利要求1-87任一项的方法获得,其中所述模制分子不是多核苷酸。
118.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是β-肽。
119.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是γ-肽。
120.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是ω-肽。
121.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是环己烷和环戊烷主链修饰的β-肽。
122.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是vinylogous多肽。
123.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是具有辅基的肽。
124.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是脂肪族多环化合物。
125.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是芳香族多环化合物。
126.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是多杂环化合物。
127.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是单官能、双官能或三官能的非芳族环。
128.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是单环、双环或三环
129.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是单官能、双官能或三官能非芳族杂环。
130.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是单环、双环或三环杂环。
131.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是桥接多环杂环。
132.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是单官能、双官能或三官能芳族碳环。
133.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是单环、双环或三环芳族碳环。
134.根据权利要求117的双功能复合物,其中模制分子是单官能、双官能或三官能芳族杂环。
135.根据权利要求117的双功能复合物,其中所述模制分子是类固醇。
136.双功能复合物,其包含与指导了其合成的模板连接的模制分子,其中所述模板进一步与能够以有秩序的方式可逆地二聚化的至少两个拉链寡核苷酸连接,所述双功能复合物能够通过权利要求1-87任一项的方法获得,其中所述模制分子选自α-肽、β-肽、γ-肽、ω-肽;单-取代的肽、双-取代的肽、三-取代的肽;L-型肽、D-型肽;
环己烷主链修饰的β-肽、环戊烷主链修饰的β-肽;vinylogous多肽;糖多肽;聚酰胺;
vinylogous氨磺酰肽;聚磺酰胺类;具有辅基的缀合肽;聚酯;多糖;聚氨基甲酸酯类;聚碳酸酯类;聚脲类;聚-肽基膦酸酯;azatides;寡聚N-取代的甘氨酸形式的类肽;聚醚;
ethoxyformacetal寡聚物;聚-硫醚;聚乙二醇(PEG);聚乙烯类;聚二硫化物;聚亚芳基硫化物;PNA;LNA;吗啉代;寡聚吡咯啉;聚肟类;聚亚胺;聚乙烯亚胺;聚醋酸酯类;聚苯乙烯;聚乙炔;聚乙烯化合物;脂肪;磷脂;糖酯;脂肪族多环化合物;芳香族多环化合物;
多杂环化合物;蛋白聚糖;聚氧烷;聚异氰化物;聚异氰酸酯;聚甲基丙烯酸酯类;单官能开链烃、双官能开链烃、三官能开链烃、寡聚官能开链烃;单官能非芳族碳环、双官能非芳族碳环、三官能非芳族碳环、寡聚官能非芳族碳环;单环烃、双环烃、三环烃、多环烃;桥接多环烃;单官能非芳族杂环、双官能非芳族杂环、三官能非芳族杂环、寡聚官能非芳族杂环;
单环杂环、双环杂环、三环杂环、多环杂环、桥接多环杂环;单官能芳族碳环、双官能芳族碳环、三官能芳族碳环、寡聚官能芳族碳环;单环芳族碳环、双环芳族碳环、三环芳族碳环、多环芳族碳环;单官能芳族杂环、双官能芳族杂环、三官能芳族杂环、寡聚官能芳族杂环;螯合物;fullerenes;以及类固醇。
137.不同的根据权利要求117或136的双功能复合物的文库。
138.根据权利要求137的文库,其中各双功能复合物包含不同的模制分子。
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139.根据权利要求137的文库,其中文库中不同双功能复合物的数目为至少10 个。
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140.根据权利要求137的文库,其中文库中不同双功能复合物的数目为至少10 个。
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141.根据权利要求137的文库,其中文库中不同双功能复合物的数目为至少10 个。

说明书全文

改善的用于合成模制分子的方法

[0001] 发明的技术领域
[0002] 本发明涉及合成模制分子(templated molecules)的方法。所述方法意味着高度局部浓度的旨在参与键形成的反应基团,从而提高键形成的概率。本发明也涉及文库,即众多的模制分子,其中每个模制分子连接于指导其合成的模板。
[0003] 背景
[0004] 产生携带新特性的分子仍然是具有挑战性的工作。最近,已提出许多将允许更为有效地产生和筛选更大数目的分子的方法。采取的方法包括编码和/或模制不同于天然生物多聚物例如肽、RNA和DNA的分子。这些方法允许研究人员在短时间内产生并筛选巨大数目的分子。这将产生携带期望特性的更好的分子。
[0005] 生物学的中心法则描述了从DNA到RNA再到蛋白的单向信息流。最近,已建立了诸如噬菌体展示、质粒表面肽、核糖体展示和mRNA-蛋白融合的方法,这允许信息从蛋白/肽平向RNA或DNA转移。这能够将分子进化的效用施加到置于富集过程的巨大数目的肽,之后,通过使用从肽到DNA的信息流,然后扩增所述DNA,扩增富集的分子库(富集了特定的特点,例如与受体蛋白结合)。
[0006] 最近,已建立了允许编码多肽及其它生化多聚物的方法。这种方法的一个实例在US 5,723,598中披露,其涉及生化多聚物的鉴定,该多聚物参与和靶的预选结合交互作用以形成结合反应复合体。所述现有技术的方法涵盖了双功能分子文库的产生。双功能分子的一部分是生化多聚物,而另一部分是标识寡核苷酸,包括编码和鉴定生化多聚物的核苷酸序列。在产生双功能分子文库之后,进行有关针对靶的亲和的分离,并且通过PCR扩增双功能分子的标识寡核苷酸部分。最后,对PCR扩增子进行序列分 析并解码,以鉴定生化多聚物。然而,该方法不允许文库成员的一锅扩增。此外,核苷酸序列只有在费力的测序过程之后才能起到鉴定生化分子的作用。因而从标识序列到生化多聚物的信息流受到限制。 [0007] Halpin和Harbury已在WO 00/23458中提出了对上文刚刚说明的方法的改善,其中形成的分子不仅被鉴定而且被核酸标签指导。所述方法是建立在传统的包括两个或多个合成步骤的合成组合文库的分离-和-组合(split-and-combine)策略的基础上的。使用
众多核酸模板,各自在一端具有化学反应位点,并且散布在链中各处的是众多的密码子区,每个所述密码子区又规定不同的密码子。由第一密码子区鉴定的每一条链独立地在化学反应位点与特殊选择的试剂反应。随后,汇集所有的链,并基于第二密码子区进行第二次分
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离。所述分离-和-组合法进行合适的次数,以产生具有典型地10 至10 个不同化合物的
文库。所述分离-和-组合法繁琐并且只产生相对小的文库。
[0008] Gartner ZJ和Liu DR(J.Am.Chem.Soc.2001,123,6961-6963)公开了利用DNA序列特异性地指导化学反应的方法。已证明DNA模制合成提供的近位效应可用于促进化学反应。当不止一个化学实体要参与形成所编码的分子时,需要有与模板反应位点间隔一个或多个密码子的构件。典型地,构件和模板反应位点之间的距离等于若干个核苷酸如30个核苷酸,这意味着相对于由与邻接于反应位点的密码子退火的构件所携带的化学实体,离模板反应位点最大距离处的反应被提升得更少。
[0009] 本发明目的在于提出提高反应物局部浓度的解决办法以提升反应概率。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供了合成模制分子的方法,所述方法包括步骤:
[0012] a)提供至少一个包括一个或多个密码子的模板,
[0013] b)提供连接于拉链结构域的第一功能实体(functional entity),所述拉链结构域包括分子对的第一部件,它能够可逆地与该分子对的第二部件相互作用,
[0014] c)提供一个或多个构件(building block),各自包含反密码子、另一功能实体以及连接所述反密码子和功能实体的接头,其中反密码子与模板密码子互补,而功能实体连接于包括所述分子对第二部件的拉链结构域,并且能够与第一功能实体化学上连接,
[0015] d)使步骤a)、b)和c)中的组分在允许反密码子与模板的密码子特异性杂交以及分子对的两部件二聚化的条件下相互接触
[0016] e)使构件的功能实体与第一功能实体形成化学连接,
[0017] f)任选地断裂一个或多个接头,条件是至少一个接头仍然连接着功能实体和模板,
[0018] g)获得连接于指导了其合成的模板的模制分子。
[0019] 模板在优选的实施方案中包括两个或多个密码子,例如3到15个密码子。在本发明的一方面的第一功能实体可以是支架(scaffold),可接着连接于两个或多个功能实体。所述方法可只进行一次,以使支架功能实体和期望量的功能实体相连接,或者可重复步骤d)到g)一次或多次,以顺次添加持有待连接于功能实体或新生模制分子的功能实体的构
件。
[0020] 当进行多步骤合成时,步骤d)到g)的重复是利用根据步骤g)的连接于指导了其合成的模板的模制分子作为根据步骤d)的接触步骤中连接于拉链结构域的第一功能实体
进行的。
[0021] 拉链结构域可表征为能够以有秩序的方式可逆二聚化的两个相互作用的部分,从而使得与它们连接的反应基团密切接近。在优选的方面需要可逆性,以允许具有相同二聚化结构域的不同功能实体在不同的时间与连接于反应位点的互补拉链结构域相互作用。许多类型的分子部分可作为拉链结构域使用,其中这里接着的是合适的拉链结构域对的非详尽性列表:i)DNA/DNA、DNA/RNA、LNA/DNA、PNA/RNA、核苷酸和核苷酸类似物的多种组合;
ii)肽/肽,如性和酸性亮酸拉链(两个α-螺旋的卷曲螺旋结构),抗体/抗原;iii)
核酸-肽,例如锌指DNA结合结构域/dsDNA;iv)肽/小有机分子,如链霉抗生物素蛋白/
++
生物素;v)小有机分子/小有机分子,例如次氮基三乙酸(NTA)/次氮基三乙酸(NTA)-Zn ;
vi)带正电荷部分/带负电荷部分,例如聚谷氨酸/聚赖氨酸。拉链盒可根据它假定要 增
强的反应的条件选择。例如,如果反应在中等温度和合理的高盐浓度下进行,则可以使用DNA/DNA拉链盒。通过改变拉链盒(互补的DNA链)的长度,人们可设计具有期望的稳定性
和动力学的拉链盒。其它类型的拉链盒将会非常地依赖于pH。例如,谷氨酸盐/赖氨酸对的相互作用强度和动力学将取决于pH,因为例如聚谷氨酸盐在高pH时将带高度的负电荷,而在低pH时根本不带电荷。
[0022] 功能实体在本发明的一方面通过一个或多个共价键连接于模板。不过,可能适当的是第一功能实体连接于与模板所持有的核酸序列互补的核酸序列,以使得支架能够通过杂交连接到模板上。以这种方式,模板有可能编码若干不同的支架。在本发明优选的实施方案中,第一功能实体是支架,即通常是通过添加从一个或多个构件发射出的功能基团而被修饰的化学部分。支架可以是单个反应基团,或者包括两个或多个反应基团的化学结构。通常,支架在模制分子的合成中自始至终保持与模板连接。
[0023] 通常,当拉链结构域包括核酸时,持有第一功能实体的构件的极性与持有另一功能实体的构件的极性相比是相反的,也就是说,如果第一功能实体连接在寡核苷酸的5′端,则另一功能实体优选连接在构件寡核苷酸的3′端,或者反之亦然。在某些方面,当模制分子的形成包括不止一种构件时,优选支架构件与模板的侧翼位置退火,也就是不位于编码构件的密码子之间。
[0024] 拉链结构域可以以促使功能实体靠近的任何方式相对于第一功能实体放置。在一个方面,拉链结构域存在于模板之中。在一种设置中,拉链结构域位于编码支架寡聚物的密码子和编码构件的密码子之间。在本发明的另一个方面,拉链结构域是构件结构的接头的一部分。优选地,拉链结构域靠近功能实体。更优选拉链结构域离功能实体间隔不多于2个核酸单体。在最优选的实施方案中,构件功能实体和第一功能实体的拉链结构域距离各自的实体有相同数目的核酸单体,以提供高的功能实体局部浓度。构件功能实体和第一功能实体的拉链结构域各自离功能实体的距离优选为0个核苷酸单体。换言之,优选旨在形成连接的两功能实体连接于拉链结构域的末端核苷酸。
[0025] 期望的拉链结构域核酸单体数目很大程度地主要取决于合成期间所用的温度和严谨条件。如果首选低严谨度和/或相对的低温,则核酸单体的数目可低至3。不过,拉链结构域序列中低的核酸单体数目可能增加与例如模板或构件杂交的险。因此,一般而言优选使用至少4个核酸单体。根据本发明优选的实施方案,拉链结构域序列包括3到20个
核酸单体。在又一更为优选的实施方案中,拉链结构域序列包括4到16个核酸单体。最为优选的是包括5到10个核酸单体的拉链结构域序列。
[0026] 反密码子和拉链结构域之间的连键可以是单键或者长达数 ,例如在1和之间的化学部分。连键可具有任何合适的化学性质,不过,一般优选连键是寡核苷
酸。在优选的实施方案中,连键为单键,即反密码子与拉链结构域毗连。
[0027] 在本发明优选的方面,密码子:反密码子杂交体的退火温度高于拉链结构域杂交体的退火温度,以确保即使拉链结构域的相互作用消除时,构件仍保持与模板连接。当根据步骤d)的接触步骤是通过使温度在拉链结构域的退火温度上下交替进行的时候,上述方面是特别优选的。当交替进行多次时,交替的效果得以提高。为避免构件自模板释放,最高温度优选低于密码子:反密码子杂交体的退火温度。
[0028] 根据本发明优选的方面,当模板包括两个或多个密码子时,连接于这些密码子的构件具有基本上相同的拉链结构域序列。温度的交替则将会吸引不同的功能实体通过构件退火到支架上。从而,有可能使多种功能实体与支架密切靠近。
[0029] 密码子:反密码子杂交体和二聚化拉链结构域的退火温度之间的差异合适地在10℃或以上。更优选退火温度之间的差异在25℃或以上。
[0030] 在本发明一方面,密码子和反密码子的杂交以及拉链结构域的二聚化在分开的步骤中发生,即允许反密码子与模板密码子特异性杂交的条件与允许分子对的双方最佳二聚化的条件截然不同。分开步骤保障了各步骤的最佳条件。在第二步的二聚化步骤中,优选使用确保密码子和反密码子保持连接的条件和有利于功能实体之间的反应的条件。
[0031] 反密码子与密码子特异性杂交期间的条件适当地包括密码子和/或反 密码子的浓度,其高于分子对的双方二聚化期间所用的密码子和/或反密码子的浓度。浓度的差异增强密码子:反密码子杂合体在功能实体反应之前就已形成的概率,从而确保遗传信息的转移。适当地,密码子与反密码子杂交期间的浓度与拉链结构域的双方二聚化所用的浓度相比高至少10倍。拉链结构域二聚化期间稀释的条件也有利于模板指导的反应,而不是
出现在介质中的随机的反应基团之间的交叉反应,因为相对于介质中一般的反应基团的浓度,编码的反应基团的局部浓度被提高了。
[0032] 在本发明的一方面,所述方法被用于产生连接于指导了该分子合成的模板(或者备选地,是互补模板)的模制分子文库。作为实例,可通过具有不止一个可能的密码子:反密码子相互作用而产生文库。这可通过拥有带不同功能实体但相似反密码子的若干构件进行。不过,为获得连接在支架上的功能实体的身份与模板密码子之间一对一的关系,通常优选各构件携带标识功能实体的特定反密码子。
[0033] 文库优选包括带有不同的独特密码子和/或独特密码子次序的多种模板。通常提供具有与模板的独特密码子相应的反密码子的多种构件。在本发明的一个方面,为每一种独特的密码子提供一特定构件。在另一个方面,有些密码子不与构件匹配,或者备选地被不带功能实体的寡核苷酸序列封闭。
[0034] 以下就特定的非限制性实例举例说明原理。这个实例中的反密码子大约长20个核苷酸(并具有大约60℃的针对其互补序列的解链温度),而拉链结构域长大约5个核苷
酸(并具有低得多的解链温度,例如17℃左右)。使构件和多种模板在中等温度下(如
55℃)一起温育,允许反密码子找到并与相应的密码子结合。在该温度下,反密码子与密码子有效且特异性地相互作用,而拉链盒并不有效互作。洗掉过量未结合的构件。然后通过将温度降至例如10℃,以及可能地改变除温度以外的条件,起始相邻功能实体反应基团之间的反应。在10℃时常规构件的拉链结构域将与支架功能实体拉链结构域的互补序列相互作用,从而使得反应基团极为密切靠近(见图14)。这显著提高了反应基团的局部浓度,结果,反应基团发生反应。然后再次将温度升至中等温度(55℃),并且拉链盒解链,导致功能 实体的分离。当温度随后降至大约10℃时,另一个构件可使其拉链结构域与支架拉链结构域杂交,之后其功能实体可与支架反应。
[0035] 拉链结构域
[0036] 拉链盒是在某些环境条件下彼此具有亲和力的分子亲合对。分子亲合对的基本特性在于这两部分能够相互作用以组装为分子亲合对。在生物技术领域,公知有许多可用作为分子亲合对的相互作用的分子部件。实例包括但不限于蛋白-蛋白相互作用、蛋白-多糖相互作用、RNA-蛋白相互作用、DNA-DNA相互作用、DNA-RNA相互作用、RNA-RNA相互作用、生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用、酶-配体相互作用、抗体-配体相互作用、蛋白--配体相互作用等。
[0037] 分子亲合部件之间的相互作用可产生或强或弱的键合。如果在亲合对的两方之间形成共价键,则部件间的结合可视为是强的,而氢键的建立、疏水结构域间的相互作用以及金属螯合作用一般产生弱键合。一般优选相对弱的键合。在本发明优选的方面,亲合对的第一部件能够与亲合对的第二部件可逆地相互作用,以根据介质变化的条件保障部件的连接或脱离。
[0038] 在本发明优选的方面,分子亲和对是建立在核苷酸间的相互作用的基础上的,也就是亲和对的第一部件是核苷酸序列,而亲和对的第二部件是能够与所述亲和对第一部件杂交的核苷酸序列。亲和对的第一部件可以是模板或构件的一部分,并且可包括具有连接在主链上的选自天然存在的核酸碱基(nuleobase)即腺嘌呤、胞嘧啶、嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核酸碱基的寡核苷酸,例如(脱)核糖磷酸单位的重复序列。亲和对的第二部件可以是具有互补于并被第一部件特异性识别的核酸碱基的寡核苷酸,也就是如果第一部件含胞嘧啶,则第二部件含鸟嘌呤,并且反之亦然,并且如果第一部件含胸腺嘧啶或尿嘧啶,则第二部件含腺嘌呤。不过在本发明的一个方面,优选亲和对的第二部件的至少有些核酸碱基是非特异性碱基配对的核酸碱基。非特异性碱基配对的核酸碱基是当连接到主链上时能够与上文提及的5个天然存在的核酸碱基中的至少2个配对的碱基。优选地,两个或多个天然核酸碱基与所述非特异性碱基配对的核酸碱基之间的碱基配对基本上等能发生,也就是形成的键具有相同数量级的强 度。术语“非特异性碱基配对的核酸碱基”在文中与术语“通用碱基”交换使用。
[0039] 在天然tRNA中,发现了核酸碱基次黄苷。次黄苷具有与3种核酸碱基即胞嘧啶、胸腺嘧啶和腺嘌呤非特异性杂交的能力。已经形成了具有同样的与天然核酸碱基非特异性碱基配对能力的其它合成化合物,且其中包括下文描述的化合物:
[0040] 通用碱基的实例
[0041]
[0042] 次黄嘌呤 5-硝基吲哚 3-硝基吡咯 N8-8氮杂-7脱氮腺嘌呤
[0043]
[0044] MICS 5MICS PIM
[0045]
[0046] dP dK 烟杯伞素
[0047] 模板
[0048] 模板的密码子可以是具有特异性地被另一实体识别的能力的任何生化实体。不过,优选密码子是核苷酸序列。核苷酸序列在主链上携带系列核酸碱基。密码子的核酸碱基可以是能够被互补实体特异性识别的任何化学实体。核酸碱基通常选自天然核酸碱基
(腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶),而且可以使用其它遵守Watson-Crick氢键规则的其它核酸碱基,例如US 6,037,120中披露的合成核酸碱基。
[0049] 密码子可以是单个核苷酸。在文库的产生中,这将允许将四种不同的功能实体掺入到模板指导的分子中。不过,为获得更高的多样性,密码子优选包括至少两个更优选至少2 3
3个核苷酸。理论上,这将会分别提供4 和4 个不同的功能实体。密码子通常不会包括多于100个核苷酸。优选使密码子具有3到30个核苷酸的序列。
[0050] 至少两个模板密码子是顺次排列的,即彼此紧靠着,而且可以被间隔基团隔开。根据欲形成的模板指导的分子,模板可以包括更多的密码子。每一个更多的密码子可能被合适的间隔基团隔开。优选的,所有或者至少大多数模板密码子是顺次排列的,并且每一个密码子通过间隔基团与相邻的密码子隔开。一般地,优选模板上具有不止两个密码子,以允许合成更为复杂的模板指导的分子。在本发明优选的方面,模板密码子的数目是2到100。更为优选的是包括3到15个密码子的模板。
[0051] 间隔序列可用于多种目的。在本发明的一种设置中,间隔基团标识密码子的位置。通常,密码子上游或下游的间隔基团包含允许确定密码子位置的信息。间隔基团也可以或者额外提供具有高亲和力的区域。所述高亲合区将确保模板和反密码子的杂交在框内进
行。而且,间隔序列调整退火温度至期望水平。
[0052] 具高亲和力的间隔序列可通过掺入与同族核酸碱基形成3个氢键的一个或多个核酸碱基提供。具有这种性质的核酸碱基的实例是鸟嘌呤。备选地,或者附加地,可对间隔序列进行主链修饰。有多种主链修饰提供更高的亲和力,例如核糖成分的2′-O-甲基取
代、肽核酸(PNA)以及核糖成分的2′-4′-O-亚甲基环化,也称之为LNA(封闭核酸)。
[0053] 模板可以包括侧翼区。侧翼区之一在本发明的一方面可起将模板固定在固体支持物如微阵列表面的作用。在本发明的另一个方面,侧翼区可包括信号基团,例如荧光团或放射性基团,以允许直接检测模板的存在。侧翼区也可作为扩增反应如PCR的引发位点。
[0054] 通过在模板中掺入生物素基团,并随后偶联于链霉抗生物素蛋白涂敷的固体支持物,也可以将模板固定在固体支持物如珠子或基质材料上。多种其它固定方法是技术人员公知的,包括将模板偶联于抗体,并将该偶联物固定到涂敷有合适抗原的固体支持物上。在优选的方面,模板的引发位点可用于参与扩增反应和作为固定手段的双重目的。固定可通过例如用包括互补于引发位点的寡核苷酸序列的固体支持物处理包括引发位点的模板来实现。
[0055] 在一个方面,第一功能实体共价连接在模板上。反应基团的共价连接通常需要模板指导的分子在所述反应基团上或其附近形成。最终的模板指导的分子因而共价连接于指导和编码了其合成的模板上。如果形成包括根据本发明制备的多种复合物的文库,则可使用高度严谨的选择操作条件,而没有从模板中分离模板指导的分子的风险。
[0056] 在本发明的另一个方面,第一功能实体非共价地连接于模板。通常,所述非共价连接涉及氢键和疏水相互作用。特别地,非共价连接涉及寡核苷酸或其部分之间的杂交反应。在优选的实施方案中,功能实体与互补于模板核苷酸序列的核苷酸序列连接。连接了反应基团的互补序列可起锚点的作用,即使新生的模板指导的分子结合在模板上。通常地,锚点互补序列具有比每一个构件更高的退火温度,以确保即使是在分离构件的条件下锚点的连接。
[0057] 第一功能实体如支架,可通过选择性可断裂的接头与模板相联,该接头使得模板指导的分子能够在实验人员决定的时间上从模板上分离。第一功能实体通常包括反应基团。该反应基团可以是新生模板指导的分子的一部分,其可能以修饰的形式出现在最终的模制分子中。反应基团也可以是支架的一部分,例如包括不止一个反应基团的分子实体。此外,反应基团可以是需要在开始本发明的方法之前激活的原形式。
[0058] 在本发明涉及产生文库的方面,可能期望将第一功能实体与互补于模板上的(另一)密码子的反密码子偶联,从而有可能具有不止一类的存在于介质中的功能实体。备选地,包括反应基团的功能实体或支架可以变化不同。
[0059] 当模板是线性的时候,分子亲合对的第一部件通常位于活性密码子和功能实体或共价连接于或通过杂交连接于模板的模制分子之间,以确保反应基团之间更近地靠近。更优选地,分子亲合对的第一部件安置得相对于模板反应基团更近。
[0060] 分子亲合对的第二部件位于构件中。如果构件所连接的密码子接近于模板反应基团,或以另外的方式表达,构件的反密码子可以至少部分地与分子亲合对的第二部件相同,则分子亲合对的第二部件可以省略。具有旨在与模板反应基团远端的密码子相互作用的反密码子的构件,例如支架,包括作为接头一部分的分子亲合对的第二部件。术语“远端”应理解为活性密码子(即与构件反密码子杂交的密码子)相对于模板反应基团留有一个或多个失活密码子的间隔的情形。
[0061] 构件接头中的分子亲合对的第二部件优选安置得靠近功能实体,以增进构件反应基团和模板反应基团之间的接近性。更优选分子亲合对的第二部件离携带功能实体的核苷酸有0到两个核苷酸的距离。
[0062] 杂交条件
[0063] 构建寡核苷酸期望的设计是本领域技术人员能力之内的事。当期望特定的退火温度时,提出适当的核酸单体组分及其长度是标准操作。适当的设计的构建可由软件辅助,例如Vector NTI Suite或互联网址http://www.nwfsc.noaa.gov/protocols/oligoTMcalc.html上的公共数据库
[0064] 允许密码子和反密码子特异性杂交的条件受到许多因素包括温度、盐浓度、缓冲液类型以及酸度的影响。选择合适的条件以确保模板和构件之间的接触在杂交条件下进行是本领域技术人员能力之内的事。两条单链寡核苷酸形成双链体的温度称之为退火温度或解链温度。解链曲线通常不陡,说明退火在一温度范围内发生。解链曲线的二阶导数在文中用以表示解链温度。
[0065] 功能实体
[0066] 构件功能实体行使作为最终掺入模制分子中的结构实体的前体的功能。因此,当在本申请权利要求书中声称将功能实体转移到新生模板指导的分子中时,应当理解并非原始功能实体的所有原子必需都在最终形成的模板指导的分子中发现。并且,作为连接中涉及的反应的结果,在出现在新生模制分子中时,功能实体的结构可以改变。特别是,导致功能实体释放的断裂可能产生反应基团,其在随后的步骤中可参与形成新生模制分子和功能实体之间的连接。
[0067] 构件功能实体包括至少一个能够参与反应的反应基团,所述反应导致构件功能实体与携带模板反应基团的模板部分或杂交于模板的互补元件之间的连接。连接由功能实体的一个或多个反应基团帮助。出现在功能实体上的反应基团的数目适当地为1到10。以仅仅一个反应基团为特点的构件通常(i.a.)用于多聚物的末位,而具有两个反应基团的构件适用于形成多聚物的干部或能够进一步反应的支架。旨在形成连接的两个或多个反应基团,典型地存在于支架上。支架可以是核心结构,其构成用于创建多种变体的基础。由支架形成的变体典型地通过支架反应基团与其它构件反应基团的反应,任选地通过填充基团或催化剂介导,在建立实体间连接的条件下形成。待与支架连接的功能实体可含有一个、两个或数个能够形成连接的反应基团。
[0068] 构件的反应基团可能能够与另一构件、新生模制分子或模板反应位点的反应基团形成直接连接。在本发明的某些实施方案中,间接连接利用桥接填充基团形成。应当理解并非功能实体的所有原子必需保持在形成的(新生)模制分子中。而是,功能实体应视为最终的模制分子结构的前体。
[0069] 根据步骤f)的任选的断裂可以以任何合适的方式进行。在本发明的一方面,断裂涉及使用试剂和/或酶。断裂导致另一功能实体转移到新生模板指导的分子上,或者将新生模板指导的分子转移到构件的功能实体上。在有些情况下,作为接头断裂的结果引入新的化学基团可能是有利的。新的化学基团可在随后的循环中或者直接地或者在被激活后用于进一步的反应。在其它情况下,期望断裂后没有接头痕迹的残留。
[0070] 在另一个方面,连接和断裂作为同时发生的反应进行,即构件的功能实体或新生模板指导的分子是反应的离去基团。一般而言,优选设计系统使连接和断裂同时发生,因为这将会减少步骤的数目和复杂性。也可以设计同时连接和断裂,从而没有接头痕迹残留,或者引入用于进一步反应的化学基团,如上文所述的那样。
[0071] 对于根据本发明的方法重要的是,在断裂步骤之后至少一个接头保持完整。所述至少一个接头将把新生模板指导的分子和指导了其合成的模板连接起来。如果所述方
法基本上涉及功能实体向支架或进化中的多聚物的转移,最终的架构分子(scaffolded
molecule)或多聚物可用选择性可断裂接头连接。设计选择性可断裂接头使得它在导致功能实体向新生模板指导的分子转移的条件下不被断裂。
[0072] 构件
[0073] 根据本发明的方法中所用的构件可根据构件所涉及的特定实体设计。作为实例,反密码子可用聚乙二醇(PEG)接头连接于分子亲合对的第二部件,而功能实体可直接连接于分子亲合对的第二部件。在另一个且优选的实例中,反密码子、接头和分子亲合对的第二部件是毗邻的线性寡核苷酸。
[0074] 功能实体优选在末端核苷酸处或者寡核苷酸下游1或2个核苷酸的核苷酸处与接头连接。功能实体的连接可在任何可用于连接的实体处进行,即功能实体可在核酸碱基或主链处与寡核苷酸的核苷酸连接。一般而言,优选在核苷间键的磷酸根或核酸碱基处连接功能实体。
[0075] 在本发明的一方面,功能实体的反应基团连接在接头寡核苷酸上。反应基团优选是能够通过各自的反应基团间的直接反应或者通过利用合适的填充基团,与新生模板指导的分子建立连接的一类反应基团。偶联功能实体和接头的反应基团优选与建立连接的同时发生断裂。功能实体可在有些情况下含有能够在随后的循环中参与形成连接的第二反应基团。第二反应基团可以是需要在能够参与形成连接之前活化的一类反应基团。
[0076] 寡核苷酸接头可通过间隔成分而离开功能实体。可设计间隔子从而由反应基团提供的构象空间就与新生的模板指导的分子的反应基团反应而言最佳化。
[0077] 包括反密码子的构件的设计可旨在获得对于所有或某些构件:模板杂交体的特定范围内的退火温度,以确保反密码子在功能实体彼此通过化学反应连接之前与模板退火。当构件以基本上相同的亲和力与模板退火时,有必要在每个循环中添加构件,即构件与模板的接触涉及各个构件的单独添加。
[0078] 在本发明的一方面,设计构件使待在第一个循环添加到模板的构件具有比随后的构件更低的退火温度。通过在第二或随后的步骤中使用比以前的步骤更高的连接步骤温度,有可能仅使目的构件退火到模板上,而多数以前用过的或未反应的构件将会是单链的。
任选地,可在每个循环之间使用回收步骤,以富集可用于退火到随后的构件上的单链模板的数目。回收步骤可包括将生物素掺入到构件寡核苷酸中,并利用链霉抗生物素蛋白涂敷的珠子在高于退火温度的温度下从模板上分离构件,如文中别处所描述的那样。
[0079] 在断裂步骤之后,分离分子亲合对的部件,以允许随后的构件与拉链结构域的第一部件相互作用。任选地,断裂步骤可在分离开分子亲合对之后进行。如果分子亲合对是双链寡核苷酸,则亲合对的部件可通过提高严谨度如通过升高温度分离。在备选方案中,由构件携带的亲合对的第二部件可如下文所述通过酶促或化学降解。
[0080] 在构件反应(例如通过将功能实体转移到支架上)之后,反密码子可能在随后的循环期间保持退火到模板上。不过,在重复步骤d)到g)之前,一般优选从模板上除去已反应的不含新生模板指导的分子的构件的反密码子。退火的反密码子的缺失使得在接头中掺入通用碱基以获得接头和失活的先前已用密码子之间的亲合性成为可能。
[0081] 反密码子可使用多种技术除去,例如通过提高严谨度(典型地是通过升高温度)从模板中分离;部分或完全酶促消化;或化学降解。利用提高严谨度的方法是应用最为简单的。不过,如果可发生再退火或期望选择性除去反密码子,则可考虑使用酶促或化学方法或它们的混合。
[0082] 除去已用构件、未反应的构件和过量构件的方法包括掺入生物素或相似的小分子,并利用生物素和涂敷的珠子上的抗生物素蛋白或链霉抗生物 素蛋白之间的粘附性取出所述构件。更具体地,生物素在构件的合成期间掺入其中。在转移或者备选地在本发明的断裂步骤之后,混合物用涂敷有链霉抗生物素蛋白的珠子在允许链霉抗生物素蛋白偶联于生物素的条件下处理。随后,将温度升至高于构件:模板杂交体的退火温度,并使混合物经历提高的重力,例如通过在离心机中旋转。则上清将包括从构件上释放的模板。生物素-链霉抗生物素蛋白偶联的替代方法是形成S-S桥。作为实例,包括反密码子的寡核苷
酸提供有-SH基,例如C6S-S硫醇修饰剂(Glen Research# 10-1936-90)的还原产物。构
件的-SH基可在氧化条件下偶联于固体支持物上的另一个-SH基,并且如果固体材料是珠
子,可通过离心一起除去构件连同固体支持物,或者如果固体支持物是柱子的固相基质,则可通过洗脱除去构件。
[0083] 对于某些应用,选择性降解含反密码子的寡核苷酸可能是有利的。存在多种方法用于降解DNA:RNA双链体的RNA部分。从而,模板可作为单链寡核苷酸提供,而反密码子可以是同源RNA单链。则所述DNA:RNA双链体可用选自RNAseH、RNAseA、RNAse 1的酶降
解。在备选方法中,RNA:DNA双链体的RNA部分可通过在弱碱条件下(pH 9-10)或用含水
Pb(Ac)2处理而化学上降解。
[0084] 如果核苷间接头包括硫代磷酸酯,则接头可用碘断裂。因此,根据这个方法,其上已杂交了在核苷间接头上包括硫代磷酸酯的DNA或RNA反密码子的寡核苷酸模板如DNA或RNA模板可用含水碘或碘乙醇处理以断裂反密码子。
[0085] 根据另一个方法,如果DNA单体含尿嘧啶核酸碱基,则可通过首先用尿嘧啶糖基化酶处理双链体以除去尿嘧啶成分,并随后用弱酸处理,在双链体中断裂一条链。而另一方法涉及在核苷间接头中引入膦酸甲酯,并用哌啶断裂接头,例如通过用100mM浓度的哌啶在37℃处理1小时。
[0086] 多种从模板中除去反密码子的方法可用于反密码子的选择性降解。当新生模板指导的分子以及构件是由模板编码的时候,选择性降解的优势尤为明显。在一个方面,支架是由模板编码的,而构件是相继掺入的。通过使用任何上述方法,有可能选择性地除去构件,包括反密码子和接头,而 用于识别编码支架的密码子的反密码子仍然连接在模板上。
[0087] 模制分子
[0088] 当遵循最终产生的模制分子通过互补元件(可能也可能不包括反密码子)连接于模板的策略时,亲和力相对弱,因为只有氢键和疏水相互作用将部件紧固在一起。因此,在本发明的一方面,最终含模制分子的互补元件可通过比模板的其它密码子:反密码子杂合体具有更高退火温度的互补元件:模板杂合体连接在模板上。备选地,而且在某些应用中优选地,模制分子通过共价连接与指导了其合成的模板连接。共价连接可能是附加于氢键之外的,或者共价连接可能是替代氢键的。共价连接的存在允许复合物更为苛刻的化学处理。
在本发明的一个方面,共价连接是选择性可断裂的,以保证模制分子从互补模板的分离。 [0089] 根据本发明的方法可以,作为进一步的步骤,包括将模制分子转移到模板上的锚点或互补于模板的序列上,以建立模板和模制分子间的有效化学连接。模制分子与模板或互补于模板的序列的有效偶联可期望允许对所制造分子的变性富集条件或变性模制后修
饰。锚点可能涉及模制分子上反应基团以及模板上反应伴侣的存在,藉此这些反应基团之间的反应将会建立共价链接。备选地,锚点可存在于与模板杂交的互补序列中。在优选的实施方案中,互补序列比一个或多个构件(特别是末端构件)具有更高的退火温度,以使得能够在富集期间使用更高的严谨度,以及任选地,能够清除用过的构件。
[0090] 文库
[0091] 本发明也涉及双功能复合物文库。所述文库由许多不同的复合物组成,例如至少3 6 9 12 15
10、10、10、10 或10 个不同的复合物。此多种不同的复合物通过最初提供多种不同模
板以及多种构件产生。构件的每个反密码子被改造从而能够与至少一个模板的至少一个密码子相互作用。多种不同模板被同时置于文中上述的方法中。所述方法的扩增部分可能重复期望的次数以进化模制分子。扩增的每次重复通过使模板与新的一小组另外的构件接触起始。
[0092] 本发明多种不同的模板按照通用策略被方便地构建。根据该策略,在 模板上提供了许多编码区。之后,每个编码区限定了一个或多个独特的密码子。从而,特定模板包括给定数目的独特密码子。作为整体考虑,此多种模板可以表征为包括可能的独特密码子的不同组合的总量或其任何子集的文库。编码区适当地位于线性序列中,使得各编码区彼此紧邻,任选地,被间隔序列隔开。在有些实施方案中,使用支链模板可能是有利的,以确保反应基团靠近、在反应基团附近引入催化剂或引入第三反应物。
[0093] 模板的独特密码子优选由核酸单体如核苷酸的序列组成。每个密码子优选是独特的,意思是在相同编码区内没有其它密码子具有完全相同的序列和核酸单体长度。优选地,独特密码子在所述多种模板的任何地方都没有相应的序列。为避免个体模板之间的杂交,也期望设计每一个独特密码子从而其互补序列不存在于任何其它模板上。
[0094] 编码区的数目可根据尤其是期望的最终模制化合物的数目、可用的构件以及想象的模制化合物的结构等进行选择。根据本发明,编码区的数目优选至少3个,以获得期望的多样性。编码区数目的上限尚未阐明;不过相信超过100的数目可能引起实践问题。通常地,优选使用具有2至50个编码区的模板,更优选3至30个,并且更为优选的是4至15个。
[0095] 在每个编码区内,独特密码子的数目可根据多样性的需求进行选择。各编码区内独特密码子的数目可以类似或不同。独特密码子的数目可低至1。当在进化的模制分子中需要特定的分子实体时,这可以是一种选择。独特密码子数目的上限可选择得相当高,只要反密码子寡核苷酸与模板上其互补物的特异性杂交发生即可。上限的实例可以是10,000,但可以根据需要选择低于此限或者高于此限。
[0096] 作为相对小的文库的实例,对于具有4个编码区、其中各编码区限定30个独特的6
密码子的模板可获得大约10 个不同的复合物。如果每个独特密码子只能在模板中存在一次,需要提供至少120个不同的构件。多种模板和构件可用于产生4-mer的化合物,例如α或β肽。由具有5个编码区以及各编码区内100个独特密码子的模板起始,可制备具有
10
10 个复合物的更大文库。
[0097] 文库可用于许多应用,包括寻找可用于治疗或诊断方法的化合物以及 植物保护化合物,象杀虫剂、杀真菌剂等。文库可包括根据本发明的任何数目的复合物。
[0098] 鉴定可用于例如治疗用途的最具活性的化合物的一种方法是对文库进行富集处理。根据本发明的一个方面,对包含模制分子的复合物文库就预定活性而言的富集包括步骤:
[0099] i)建立包含模制分子的复合物第一文库,所述文库可根据本发明的任一方法获得,
[0100] ii)将文库暴露于富集文库中具有预定活性的复合物的条件之下,
[0101] iii)扩增经富集的文库中的复合物,
[0102] iv)任选地,重复步骤ii)到iii),和
[0103] v)获得经富集的具有更高比率的含具有预定活性的模制分子的复合物的文库。 [0104] 扩增步骤正常地是优选的,尽管不总是必要的。特别地,当进行若干个富集循环时,有利的是进行扩增以获得足够的复合物。在本发明优选的方面,富集的文库中复合物的扩增包括如下步骤:使复合物文库与扩增手段接触,扩增模板或互补模板,并利用扩增产物作为模板实施根据本发明的方法。扩增手段可以是任何适于模板扩增的核酸扩增手段,例1 15
如PCR。优选地,复合物的扩增构成了10 到10 倍的扩增。
[0105] 为允许进行多次富集循环,步骤ii)和iii)重复至少2、3、5次,例如至少10次,例如至少15次。复合物可在完成每个循环后鉴定,或者可以只在最后一个循环后鉴定。对于中间的鉴定没有明确的需求,因为如果为模板或其互补物提供合适的引物区,就可进行扩增而无需知晓模板序列或互补于该模板的序列。富集处理后的鉴定包括模板序列的确定和/或模制分子和/或具有预定活性的整个复合体的结构确定。
[0106] 优选地,富集文库的条件包括使结合伴侣与目的模制分子接触。所述结合伴侣可以在溶液中,或者可以直接或间接地固定在支持物上。富集通常利用亲和或活性测定实施。在本发明的一个方面,富集通过筛选对靶分子或靶实体具亲和力或效应的复合物进行。在另一个方面,富集通过选择催化活性进行。备选地,富集文库的条件包括电泳分离、凝胶过滤、免疫 沉淀、等电聚焦、离心和固定中的任何一种或多种。
[0107] 富集处理可涉及细胞。从而,在一个实施方案中,富集文库的条件包括提供能够内在化模制分子或者与具有期望预定活性的模制分子进行相互作用的细胞。
[0108] 当复合物文库已被富集为包括表现出预定活性的复合物的小库时,期望单独地获得每一种复合物。模制分子可通过断裂一个或多个构件的接头,以将模制分子从模板上释放下来而从复合物中获得。
[0109] 核苷酸
[0110] 本发明所用的核苷酸可以在寡核苷酸中连接在一起。各核苷酸单体正常地由两部分组成,即核酸碱基部分和主链。主链在有些情况下可以再分为糖部分和核苷之间的接头。 [0111] 核酸碱基部分可选自天然存在的核酸碱基以及非天然存在的核酸碱基。对本领域技术人员清楚的是以前曾被认为是“非天然存在的”多种核酸碱基后来已在自然界中发现。因而,“核酸碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环,而且包括其杂环类似物及互变异构体。
核酸碱基举例说明性的实例有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二
6 4 4
氨基嘌呤、8-氧-N-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N,N-桥亚乙基胞嘧啶
4 4 6 6 3 6
(N,N-ethanocytosin)、N,N-桥亚乙基-2,6-二氨基-嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C-C)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑基嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷以及在Benner等的美国专利No.5,432,272中描述的“非天然存在的”核酸碱基。术语“核酸碱基”旨在涵盖这些实例中的每一种和全部,及其类似物和互变异构体。尤其令人感兴趣的核酸碱基有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶,它们被认为是天然存在的与人类治疗和诊断应用有关的核酸碱基。
[0112] 合适的特定核酸碱基对的实例示于下文:
[0113] 天然碱基对
[0114]
[0115] 合成碱基对
[0116]
[0117] 合成的嘌呤碱基
[0118]
[0119] 合适的主链单元的实例示于下文(B代表核酸碱基):
[0120]
[0121] 主链的糖部分适当地为戊糖,但可以是PNA合适的一部分或六元环。可能的戊糖的合适实例包括核糖、2′-脱氧核糖、2′-O-甲基-核糖、2′-氟-核糖以及
2′-4′-O-亚甲基-核糖(LNA)。所述核酸碱基适当地连接在戊糖实体的1′位。
[0122] 当主链的糖部分为戊糖如核糖或2′-脱氧核糖时,核苷之间的接头连接在前单体的3′端与后一单体的5′端。核苷之间的键可以是天然存在的磷酸二酯键或其衍生物。
此类衍生物的实例包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯以及二硫代磷酸酯。此外,核苷之间的接头可以是 本领域公知的许多不含磷的接头中的任何一种。
[0123] 优选的核酸单体包括形成通过磷酸二酯键连接的DNA以及RNA家族的一部分的天然存在的核苷。DNA家族的成员包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。RNA家族的成员包括腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷和肌苷。肌苷为非特异性配对的核苷,并且如上文所讨论的那样可用作为通用碱基,因为肌苷能够近乎等能地与A、T和C配对。
[0124] 每个密码子被一反密码子互补。反密码子具有和与之互补的密码子特异性接合的能力。密码子和互补反密码子之间的亲和力通过符合众所周知的Watson-Crick碱基配对系统的氢键实现。因此,反密码子可由与密码子本身同类的核酸单体构成。
[0125] 官能团
[0126] 功能实体可包括一个或多个官能团,即最终形成模制分子一部分的基团。模制分子可单独或者联合地包括一个或多个如下官能团:
[0127] 1.羟基
[0128] 2.伯胺、仲胺、叔胺
[0129] 3.羧酸
[0130] 4.磷酸盐/酯、膦酸盐/酯
[0131] 5.磺酸盐/酯、磺酰胺类
[0132] 6.酰胺类
[0133] 7.氨基甲酸酯类
[0134] 8.酸盐/酯
[0135] 9.尿素类
[0136] 10.烷、烯烃、炔烃
[0137] 11.酸酐
[0138] 12.
[0139] 13.
[0140] 14.硝酸盐/酯(nitatrates)、亚硝酸盐/酯
[0141] 15.亚胺
[0142] 16.苯基及其它芳族基团。
[0143] 17.吡啶、嘧啶、嘌呤、吲哚、咪唑以及杂环碱基
[0144] 18.杂环类
[0145] 19.多环化合物
[0146] 20.黄素类
[0147] 21.卤化物
[0148] 22.金属
[0149] 23.螯合物
[0150] 24.以机制为基础的抑制剂
[0151] 25.小分子催化剂
[0152] 26.糊精、糖类
[0153] 27.荧光素、罗丹明及其它荧光团
[0154] 28.多肽(polyketides)、肽、各种多聚物
[0155] 29.酶和核酶及其它生物学催化剂
[0156] 30.用于官能团聚合后/激活后偶联的官能团
[0157] 31.药物,例如紫杉酚部分、无环鸟苷部分、“天然产物”
[0158] 32.超分子结构,例如纳米簇
[0159] 33.脂肪
[0160] 34.寡核苷酸、寡核苷酸类似物(例如,PNA、LNA、吗啉代(morpholinos))
[0161] 35.氢
[0162] 反应基团
[0163] 反应基团尤其涉及形成功能实体的一部分,并且能够直接或经由合适的桥接分子实体参与形成连接的反应的基团。反应基团的实例列举如下:
[0164] 1.N-羧基酐(N-carboxyanhydrides,NCA)
[0165] 2.N-硫代羧基酐(N-thiocarboxyanhydrides,NTA)
[0166] 3.胺
[0167] 4.羧酸
[0168] 5.酮
[0169] 6.醛
[0170] 7.羟基
[0171] 8.硫醇
[0172] 9.酯
[0173] 10.硫酯
[0174] 11.双键共轭体系
[0175] 12.烷基卤化物
[0176] 13.肼类
[0177] 14.N-羟基琥珀酰亚胺酯
[0178] 15.环氧化物
[0179] 16.haloacetyls
[0180] 17.UDP-活化的糖类
[0181] 18.硫化物
[0182] 19.氰酸盐
[0183] 20.羰基咪唑
[0184] 21.噻嗪酮类(thiazinanones)
[0185] 22.膦类
[0186] 23.羟胺类
[0187] 24.磺酸盐/酯
[0188] 25.活化的核苷酸
[0189] 26.氯乙烯
[0190] 27.烯烃、奎宁类
[0191] 模制分子
[0192] 根据本发明,事实上任何分子可利用本文公开的一般方法模制合成。能够被合成的化合物的实例包括但不限于下文所列的化合物:α-、β-、γ-和ω-肽;单-、双-和三-取代的肽;L-和D-型肽;环己烷和环戊烷主链修饰的β-肽;vinylogous多肽;糖多
肽;聚酰胺;vinylogous氨磺酰肽;聚磺酰胺类;缀合肽(即具有辅基);聚酯;多糖;聚氨基甲酸酯类;聚碳酸酯类;聚脲类;聚-肽基膦酸酯;azatides;类肽(寡聚N-取代的甘氨酸);聚醚;ethoxyformacetal寡聚物;聚-硫醚;聚乙二醇(PEG);聚乙烯类;聚二硫化物;
聚亚芳基硫化物;多核苷酸;PNA;LNA;吗啉代;寡聚吡咯啉酮;聚肟类;聚亚胺;聚乙烯亚胺;聚醋酸酯类;聚苯乙烯;聚乙炔;聚乙烯化合物;脂肪;磷脂;糖酯;多环化合物(脂肪族);多环化合物(芳香族);多杂环化合物;蛋白聚糖;聚氧烷;聚异氰化物;聚异氰酸酯;聚甲基丙烯酸酯类;单官能、双官能、三官能及寡聚官能开链烃;单官能、双官能、三官能及寡聚官能非芳族碳环;单环、双环、三环及多环烃;桥接多环烃;单官能、双官能、三官能及寡聚官能非芳族杂环;单环、双环、三环及多环杂环;桥接多环杂环;单官能、双官能、三官能及寡聚官能芳族碳环;单环、双环、三环及多环芳族碳环;单官能、双官能、三官能及寡聚官能芳族杂环;单环、双环、三环及多环杂环;螯合物;fullerenes;类固醇;环孢菌素类似物;以及上述分子部分的任何组合。
[0193] 富集
[0194] 包括模制分子的复合物文库就期望活性(例如与特定靶结合、催化活性或活性测定中的特殊效应)而言的选择或筛选(通常称之为富集)可根据任何标准方案实施。例如,亲和选择可根据用于噬菌体展示、多核糖体展示或者mRNA-蛋白融合物展示肽的原理实施。催化活性的选择可通过在过渡态类似物亲和柱上的亲和选择(Baca等,Proc.Natl.Acad.Sci USA.1997;94(19):10063-8)或者通过基于功能的选择策略(Pedersen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998,95(18):10523-8)实施。期望特征的筛选可根据基于标准微量滴定板的测定法或通过FACS分选测定法实施。
[0195] 一般地,亲和选择包括将靶或结合伴侣固定于固相支持物例如柱子上。随后,在允许部分复合物与靶结合的条件下将根据本发明制造的复合物添加到柱子上。将未与靶结合的复合物从柱子上洗脱掉并排出。连接在靶上的复合物部分可利用与模制分子结合的模板扩增。
[0196] 扩增方法的选择取决于密码子和反密码子的选择。天然寡核苷酸能够 通过现有技术的任何方法扩增。这些方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR);以及例如基于核酸序列的扩增(例如Compton,Nature 350,91-92(1991))、扩增的反义RNA(例如van Gelder等,PNAS 85:77652-77656(1988));自持性序列复制系统(例如Gnatelli等,PNAS 87:1874-1878(1990));例如在Schmidt等NAR 25:4797-4802(1997)中描述的聚合酶非依赖
性扩增以及体内扩增携带克隆的DNA片断的质粒。也可以使用连接酶介导的扩增法,例如LCR(连接酶链式反应)。
[0197] 对于非天然核苷酸,有效扩增方法的选择较少。由于非天然核苷酸根据定义能够由包括聚合酶在内的某些酶掺入,有可能通过在各延伸循环期间添加聚合酶进行人工聚合酶链式反应。
[0198] 对于含核苷酸类似物的寡核苷酸,存在较少的扩增方法。人们可以使用非酶介导的扩增策略(Schmidt等,NAR 25:4797-4802(1997))。对于主链修饰的寡核苷酸类似物例如PNA和LNA,可使用该扩增法。在扩增之前或期间,可对模板或互补模板进行突变或重组,以便为下一轮的选择或筛选创造更大的多样性。
[0199] 在扩增复合物的模板部分之后,利用扩增产物作为模板实施根据本发明的方法。得到的是简化的或者富集的连接于模板分子的模板复合物文库。
[0200] 如果认为有必要进一步富集文库,可重复所述选择和扩增步骤。当重复所述选择和扩增步骤时,涉及靶和复合物的结合步骤优选在更为严格的条件下进行,以确保仅复合物的一部分粘附到靶上。
[0201] 富集循环可进行2到15次或者甚至更多次,而每个循环的富集达10到1000倍。14
在一种方法中,起始文库数量为10 个复合物。在每循环100倍浓度富集的7个循环后,在理论上应当能够获得对靶具有最高亲和力的复合物。不过,更有可能最终的循环呈递小的目的复合物库,这尚需通过其它途径检测。
[0202] 在最后一轮选择后,通常期望对各个模板进行测序,以确定各个模板分子的组成。如果模板含有天然核苷酸,标准程序是任选地PCR扩增所分离的模板(如果模板是RNA分
子,有必要在PCR扩增前利用反转录酶 产生cDNA),然后将DNA片断克隆到例如质粒中,
转化这些质粒,然后对含有一个和多个串连DNA序列的各质粒克隆进行测序。在这种情况下,实用的是在模板中央编码序列的两侧翼序列中均设计限制性位点(即在引物结合位点中)。这将允许容易地对分离的核苷酸进行克隆。序列分析可通过标准双脱氧链终止法进行,或者通过更加经典的方法,例如Maxam-Gilbert序列分析。
[0203] 如果模板含有非天然核苷酸,通过介由微生物宿主的转移克隆个体序列可能是不行的。不过,使用每个珠子携带一种寡核苷酸序列的珠子群,有可能在体外克隆,随后连接在特定珠子上的所有核苷酸可任选地进行扩增然后测序(Brenner等,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,1665-1670)。备选地,可充分稀释分离物群,然后分成小份置于微量滴定板中,从而孔中平均含有例如0.1个模板。通过例如PCR扩增单个模板,现在将有可能利用标准方法进行序列分析。当然,这需要所述非天然核苷酸是PCR中所用的热稳定聚合酶的底物。
[0204] 如果使用需要更短寡核苷酸的备选方法,则可能期望对起始模板进行设计以在模板的编码/模制区的任一侧都含有限制性位点。从而,在最后一轮选择后,模板可被限制性断裂,以获得编码模制分子的短寡核苷酸,然后这些短寡核苷酸可应用于多种分析操作。 [0205] 也有可能通过使用具有随机但是预定序列的寡核苷酸的DNA阵列对分离物进行序列分析。
[0206] 也可能期望作为库对分离物群进行序列分析,例如如果序列预期是相互对齐的话,例如由于起始文库是由以具有已知(相对高)的期望活性的多聚物序列为基础的简并
序列组成的。因此,在选择前就预期所有分离物具有与起始模板序列相似的序列。因而,分离物群可作为整体测序,获得作为整体的该群的保守序列。
[0207] 本发明也涉及允许选择能够与不同靶结合的小分子的方法。模板展示分子技术包含直接选择和扩增的内在功能。所选分子的结合应当是选择性的,原因在于它们仅与特定的靶配位,由此防止或诱发特定的生物学效应。最后,这些结合分子应当有可能作为例如治疗制剂或者作为诊断制剂使 用。
[0208] 模板展示分子文库可容易地与筛选、选择或测定组合,以评估分子配体的结合对靶的功能的影响。在更为具体的实施方案中,模板展示法提供了分离和鉴定与超分子、超高分子、高分子和低分子结构(例如核酸和蛋白质,包括酶、受体、抗体及糖蛋白)、信号分子(例如cAMP、肌醇三磷酸、肽、前列腺素)以及表面(例如金属、塑料、合成物、玻璃、陶瓷、橡胶皮肤、组织)结合的分子配体的快速方法。
[0209] 具体地,本上下文的选择或分离(partitioning)是指结合于靶分子的模板展示分子复合物即复合物-靶对,能够藉以与未结合靶分子的模板展示分子分开的任何方法。
选择可通过本领域公知的多种方法完成。
[0210] 可实施选择策略,从而允许针对几乎任何靶的选择。重要的是,该选择策略中没有步骤需要靶或文库分子的任何详细的结构信息。全部过程是通过文库分子对给定靶的特异性识别/配位中所涉及的结合亲和力驱动的。不过,在有些应用中,如果需要,也可以包括类似于利用噬菌体展示对催化活性进行选择的功能(Soumillion等(1994)J.Mol.
Biol.237:415-22;Pedersen等(1998)PNAS.18:10523-10528)。多种选择方法的实例在下文描述。
[0211] 这种内在的模板展示分子选择方法非常适于优化,其中进行始于结合分子的选择而止于优化的结合分子的系列选择步骤。使用多种机器人系统,各步骤中的单个操作有可能自动化。这是因为存在事件的相继流,并且其中各事件可独立进行。在最优选的设置中,向完全自动化的系统提供合适的模板展示分子文库和靶分子,其最终产生优化的结合分子。甚至更为优选地,在整个操作期间这个方法应当无需任何机器人系统之外的外部操作而运行。
[0212] 所述模板展示的分子文库将包含能够潜在地与任何已知或未知的靶相配的分子。靶上的结合区可以是酶的催化位点、受体的结合口袋(例如GPCR)、涉及蛋白-蛋白相互作用的蛋白表面区域(尤其是热点区)以及DNA上的特定位点(例如大沟)。模板展示分子
技术将主要地鉴定与靶分子相配的分子。靶的天然功能可能被刺激(激动)或降低(拮
抗)或者不受 模板展示分子结合的影响。这将取决于精确的结合模式以及模板展示分子
在靶上占据的特定结合位点。不过,已知不同蛋白上的功能位点(例如蛋白-蛋白相互作
用或催化位点)比蛋白上其它更为中性的表面区域更倾向于结合分子。另外,这些功能位点正常地含有似乎主要负责结合能的更小区域,即所谓的热点区(Wells等(1993)Recent Prog.Hormone Res.48;253-262)。这种现象将增加直接选择影响某一靶的生物学功能的小分子的可能性。
[0213] 本发明的模板展示分子技术将允许类似于其它展示法例如噬菌体展示的选择程序(Smith(1985)Science 228:1315-1317)。噬菌体展示选择已成功地用于肽(Wells
& Lowman.(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2,597-604)、蛋 白 (Marks 等 (1992)J.Biol.Chem.267:16007-16010)和抗体(Winter等(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455)。相
似的选择程序也用于其它类型的展示系统例如核糖体展示(Mattheakis等(1994)Proc.
Natl.Acad.Sci.91:9022-9026)和mRNA展示(Roberts等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:
12297-302)。
[0214] 模制分子(展示的分子)和DNA复制单元(编码模板)间的连接允许使用多种选择策略鉴定结合分子。本发明允许针对实质上任何已知靶鉴定结合分子的广泛策略。另外,通过分离针对未知抗原(表位)的结合分子并使用这些结合分子用于鉴定和验证,该技术
也将允许发现新的未知靶。
[0215] 正如将被理解的那样,从模板展示分子文库中选择结合分子可以以任何形式进行,以鉴定最佳的结合分子。针对纯化的靶的典型的选择操作将包括如下主要步骤:产生模板展示分子文库:利用合适的固定方法固定靶分子;添加文库,以允许模板展示分子的结合;除去未结合的模板展示分子;洗脱结合于固定的靶的模板展示分子;扩增富集的模板展示分子,以通过序列分析鉴定或者输入用于下一轮的选择。大致步骤示意性地示于图12中。
[0216] 在优选的实施方案中,利用模板展示分子文库的标准选择方案是使用生物淘选法。在该技术中,靶(例如蛋白或肽偶联物)被固定在固相支持 物上,而潜在地与靶配位的模板展示分子是被选择并富集的那些。不过,该选择操作需要集合的模板展示分子能够与未结合的那些即溶液中的那些分开。有许多本领域普通技术人员公知的可实现这点的方法。
[0217] 亲和富集循环的第一步是将对固定的靶表现出低亲和力的模板展示分子洗掉,留下连接在靶上的强结合的模板展示分子。富集的群在严谨洗涤之后仍与靶结合,然后用例如酸、离液性盐、加热洗脱,用已知配体竞争性洗脱或者蛋白水解释放靶/模板分子。洗脱的模板展示分子适于进行PCR,导致很多数量级的扩增,也就是,在第一轮选择中富集的每单个模板展示分子以大为增加的拷贝数参与下一轮的选择。在典型的3至10轮富集之后,得到极大地富集了与靶结合最为强烈的模板展示分子的分子群。之后定量地测定仍与固定的靶结合的模板展示分子的比例。然后对变体模板序列单个地进行序列分析。
[0218] 当怀疑靶是否吸附到管上(例如从SDS-PAGE凝胶上洗脱的未折叠的靶)时,将靶(肽、蛋白、DNA或其它抗原)固定在珠子上可能是有益的。衍生化的珠子然后只需通过在台式离心机中沉淀珠子就可用于从模板展示分子中进行选择。备选地,珠子可用于制备亲和柱,并将模板展示分子文库悬液通过柱子再循环。有许多反应基质可用于固定靶分子,包括例如连接到-NH2基和-SH基上。磁珠实质上是上述的一种变体;将靶连接到磁珠上,其然后在选择中使用。可获得具有-NH2基或-COOH基连接位点(其可用于偶联)的活化的
珠子。靶也可以印迹到硝酸纤维素或PVDF上。当使用印迹策略时,重要的是确保所用的印迹条在固定靶后封阻(例如用BSA或相似蛋白)。
[0219] 在另一个优选的实施方案中,选择或分离也可利用例如但不限于如下方法进行:免疫沉淀或间接免疫沉淀,其中靶分子与模板展示结合分子一起捕获;亲和柱层析,其中将靶固定在柱上,而使模板展示文库流过,以捕获靶结合分子;凝胶移位(琼脂糖或聚丙烯酰胺),其中所选的模板展示分子与靶一起在凝胶中迁移;FACS分选以定与模板展示分子配位的细胞;CsCl梯度离心以分离靶分子连同模板展示结合分子;质谱法以鉴定标记了模板展示分子的靶分子等。一般而言,模板展示分子/靶复合物 可与未与靶结合的模板展示分子相分离的任何方法都是可用的。
[0220] 表1:利用模板展示技术可能用于鉴定结合分子的选择方法的实例
[0221]
[0222] 模板展示分子的洗脱可以不同的方式进行。结合分子可通过变性、酸或离液性盐而从靶分子上释放,然后转移到另一瓶中用于扩增。备选地,洗脱可以是更为特异性的,以降低背景。洗脱可利用蛋白水解,以断裂靶和固定表面之间或者展示分子和模板之间的接头实现。并且,洗脱可通过用已知配体的竞争实现。备选地,可在选择反应结束时在洗涤孔中直接进行PCR反应。
[0223] 本发明可能的一个特点是结合分子无需可从靶中洗脱而具有可选择性的事实,因为只需要编码的模板DNA用于进一步的扩增或克隆,而并非结合分子本身。已知有些选择操作能够如此紧密地与最热切的配体结合,以致于非常难于洗脱。不过,本发明的方法可成功地实施,产生热切的配体,即使是共价结合的配体。
[0224] 备选的选择方案包括已知配体作为文库中各展示分子的片断。所述已知配体将通过与靶分子上限定的部分配位而指导选择,并将选择集中在与同一区域结合的分子上。这对于提高具有期望生物学功能但具有太低效力的配体的亲和力尤其有用。
[0225] 本发明另一方面涉及增加单个所选结合分子或所选结合分子混合物的多样性或复杂性的方法。在最初的选择后,可改变富集分子以进一步增加展示分子的化学多样性或复杂性。这可利用本领域公知的许多方法进行。例如,使用合成的随机寡核苷酸、短粗刺状的寡核苷酸或随机突变。随机化可被集中以允许偏好密码子或定位于模板核苷酸序列的预定部分 或亚序列。其它优选的方法是以与用于蛋白同源基因的DNA改组相似的方式重组
编码结合分子的模板(Stemmer(1994)Nature 370:389-91)。该方法可用于重组初始的文库或者更优选地重组富集的编码模板。
[0226] 在本发明的另一个实施方案中,当需要针对只可能在细胞表面表达的特定抗原例如离子通道或跨膜受体的结合分子时,细胞颗粒本身可用作为选择剂。在这类方法中,缺乏特定靶的细胞应当用来进行一轮或多轮的负选择或者大量过量地存在于选择过程中。此时,将无关的模板展示分子除去。例如,对于针对表达在全细胞上的受体的正选择,负选择应当针对未转化的细胞。该方法也称之为减法选择,并且已成功地用于抗体文库的噬菌体展示(Hoogenboom等(1998)Immunotech.4:1-20)。
[0227] 选择方法的特定实例可包括针对细胞表面受体的选择,该受体从膜上内在化,从而受体连同所选的结合分子可进入细胞质或细胞核。根据特定选择的结合分子的解离速率常数,这些分子在摄取后主要地存在于胞质或核中。
[0228] 本领域技术人员将会认可选择过程可在任何设置中进行,其中靶用作为诱饵,而模板展示分子能够配合到其上。
[0229] 本发明的选择方法可与二次选择或筛选联合,以鉴定在结合后能够改变靶分子功能的分子配体。因而,本文所述的方法可用于分离或产生与任何蛋白或核酸结合并改变其功能的结合分子。本发明的方法被认为可用于鉴定、分离或产生将影响靶酶的催化活性的结合分子,也就是抑制催化作用或改变底物结合,影响蛋白受体的功能,即抑制与受体的结合或者改变与受体结合的特异性;影响蛋白多聚物的形成,即破坏蛋白亚基的四级结构;以及改变蛋白的运输性质,即破坏蛋白对小分子或离子的运输。
[0230] 本发明的又一方面涉及允许选择过程中的功能也包括在内的方法。例如,当已进行针对某一靶的富集,产生许多不同的命中目标时,则这些命中目标可直接测试功能(例如细胞信号传导)。这能够利用例如荧光激活细胞分选(FACS)进行。
[0231] 改变的表型可以用广泛种类的方法检测。一般地,改变的表型利用例如细胞形态的显微镜分析、标准细胞存活率测定(包括升高的细胞死亡和 升高的细胞存活率)、标准标记测定例如用于特定细胞或分子存在水平的荧光指示分析法(包括FACS或其它染料染色技术)、杀死细胞后生物化学检测靶化合物的表达等来检测。在有些情况下,特定的信号传导路径可利用多种报告基因构建体探测。
[0232] 可与模板展示分子技术联合的二次选择法尤其包括选择或筛选酶抑制、改变或底物结合、功能丧失、结构破坏等。本领域普通技术人员能够在各种备选的选择或筛选方法中选择与本文所述的方法相容的。
[0233] 本发明的结合分子可被选择除结合之外的其它性质,例如在选择期间,终产物对期望的工作环境下某些条件的稳定性可作为选择标准包括在内。如果期望在某一蛋白酶存下稳定的结合分子,则该蛋白酶可以是选择期间所用的缓冲介质的一部分。类似地,选择也可在血清或细胞提取物或任何类型的介质中进行。正如将被理解的那样,当使用该模板展示方法时,应当避免破坏或降解模板的条件,以允许扩增。可将其它期望的性质直接掺入到展示分子中,如本领域技术人员将会理解的那样。例如,通过使用具有高疏水性的构件,膜亲和力可作为性质包括在内。
[0234] 通过模板展示分子技术选择的分子可通过多种合成方法产生。化学合成是可以实现的,因为所选结合分子的结构很容易从编码模板的核酸序列获得。所选分子的化学合成是可能的,也是因为除了将其组装在一起的化学反应,构成结合分子的构件也是已知的。 [0235] 在优选的实施方案中,合成所选的结合分子,并在多种合适的体外和体内测试中测试,以验证所选候选物的生物学效应和效力。这可以以多种方式进行,正如本领域技术人员将会理解的那样,并且可能取决于所述生物活性分子的组成。
[0236] 靶的鉴定和确认
[0237] 在另一个方面,本发明提供了鉴定或分离参与病理学过程或其它生物学事件的靶的方法。在这个方面,靶分子再次优选为蛋白或核酸,但其中也可包括碳水化合物以及能够实现特异分子配体结合的各种分子。原则上,模板展示分子技术可用于选择见于细胞、组织或体内的抗原上的特定 表位。这些表位可能属于参与重要生物学事件的靶。另外,这些表位可能也参与该靶的生物学功能。
[0238] 抗体和肽文库的噬菌体展示已无数次成功地用于鉴定新的细胞抗原(例如Pasqualini 等 (1996)Nature 380:364-366;Pasqualini 等 (2000)Cancer Res.60:
722-727;Scheffer 等 (2002)Br J Cancer 86:954-962;Kupsch 等 (1999)Clin Cancer Res.5:925-931;Tseng-Law等(1999)Exp.Hemato.27:936-945;Gevorkian等(1998)Clin.Immunol.Immunopathol.86:305-309)。尤为有效的曾是对怀疑表达细胞特异性抗原的细胞的直接选择。重要的是,当选择细胞表面抗原时,模板分子可维持在细胞外侧。这将提高模板分子在从细胞表面释放后保持完整的概率。
[0239] 模板展示分子的体内选择具有巨大的潜力。通过体内模板展示分子文库选择,有可能分离到能够特异导向正常组织及其它病理组织(如肿瘤)的分子。该原理已利用肽文库的噬菌体展示阐释了(Pasqualini &Ruoslathi(1996)Nature 280:364-366)。该系统也已用在人类中以鉴定定位于不同器官的肽基序(Arap等(2002)Nat.Med.2:121-127)。类
似的选择方法可用于模板展示文库。被噬菌体颗粒有效保护的噬菌体展示中的编码DNA
允许体内选择。因此,模板的体内稳定性对于扩增和鉴定将很重要。模板可以以类似于
稳定aptamers用于体内应用的方式利用多种核苷酸衍生物来稳定(Nolte(1996)Nature
Biotechnol.14:1116-1121;Pagratis等(1997)Nature Biotechnol.15:68-72)。不过,有理由相信模板结构将会由于用于编码展示分子的修饰碱基而稳定抵抗降解。其它类型的保护也是可能的,其中模板分子利用多种方法从溶液中防护起来。这可包括例如脂质体、PEG化、结合蛋白或其它种类的保护。模板分子也可整合到保护模板免受外部操作影响的另一设计的结构中。例如,可设计接头掺入到囊泡中,以将模板置于囊泡内侧,而展示分子置于外侧。这种排布将保护模板分子免受外部操作影响,而同时允许暴露展示分子以容许选择。 [0240] 多数抗体具有大的凹型结合区,这在某种程度上需要抗原上突出的表位。并且,抗体分子是大的高分子(150KDa),这将在空间上减少许多不同抗原(如细胞表面上的)的接
近。模板展示技术应当能够接近并识别无 法接近抗体的表位。小结合分子将能够结合到活性位点、沟及抗原上的其它区域。编码模板元件也比抗体更小,这将提高模板-结合分子的物理接近。另外,模板展示分子文库的多样性和复杂性与肽文库相比将会大得多。这将提高发现能够与由于不足的化学而无法接近肽的表位配位的分子的概率。综上所述,模板展示分子技术具有鉴定用抗体或肽不可能鉴定到的新抗原的潜力。本领域普通技术人员将会认可各类细胞可用于选择操作。也将会理解新抗原的选择可利用早先所述的减法方法进行。
[0241] 本发明的另一个方面涉及确认鉴定的靶的方法。如果它们改变靶的生物学应答,鉴定的结合分子可直接应用。这可在体外利用任何直接的或基于细胞的测定法或者直接在体内任何表型应答的研究中进行。该方法的长处在于使用相同的分子用于鉴定和确认多种靶。最有利的是,结合分子也可直接用作为治疗制剂。
[0242] 在另一个优选的实施方案中,利用模板展示分子拉出靶分子。这可以例如通过针对表达在细菌噬菌体上的cDNA文库的选择实现(文库对文库)。通过混合模板展示分子文库和cDNA文库,将有可能发现模板展示分子文库中的小分子与来自cDNA文库的蛋白之间
的结合对。一种可能性是混合噬菌体展示文库和模板展示文库,并对噬菌体或模板文库进行选择。然后将所选的文库涂板,以定位噬菌体克隆,而编码噬菌体和模板展示分子的DNA则可利用PCR予以鉴定。也可使用cDNA之外的其它类型的文库,例如核酸、碳水化合物、合成多聚物。
[0243] 在本发明的另一个实施方案中,模板展示分子技术可用于解释体内和体外药物代谢。这可包括I期(活化)和II期(解毒)反应。主要的反应类型是氧化、还原和水解。其它酶催化偶联。这些酶可在选择过程中用作为靶,以消除倾向于与这些酶配位的展示分子。对应于这些展示分子的模板随后在制备模板展示分子文库时可用于竞争或消除这些分子。
[0244] 然后这些获得的文库将不含具有与I-II期中涉及的酶结合倾向的分子,并可能尽快清除。例如,可对各种单独的酶或细胞色素P450酶、黄素单加氧酶、单胺氧化酶、酯酶、酰胺酶、水解酶、还原酶、脱氢酶、氧化酶、UDP-葡糖醛酸基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶以及其它相关酶的任 意组合进行选择,以鉴定倾向于与这些代谢酶配位的这些结合分子。抑制剂由于其结合亲和力很容易选择,而底物需要至少微摩尔级的亲和力才能鉴定。
[0245] 本发明另一个有意义的实施方案是直接选择被被动或主动运输穿过上皮质膜或其它膜的分子的可能性。一种可能的选择测定是利用CaCO-2细胞,一种人类结肠上皮细
胞系,其通常被认可为胃肠道中上皮屏障的一个良好的模型。CaCO-2测定包括在组织培养孔插入物中培养人类结肠上皮细胞系,使所得的单层在顶部和底部间室之间形成生物学屏障。将模板展示分子文库置于细胞单层的任一侧,收集能够透过细胞单层的分子并扩增。该过程可重复直至鉴定到活性分子。这种测定的其它细胞系或设置是有可能的,并且对本领域技术人员是显而易见的。
[0246] 本发明的另一方面涉及选择所选分子稳定性的方法。这可通过将富集的结合分子库置于将有可能降解或改变结合分子结构的环境中来进行。各种条件可以是某些蛋白酶或蛋白酶混合物、细胞提取物,以及来自例如胃肠道的各种体液。其它条件可以是各种盐或酸环境,或者升高的温度。另一种可能是产生已知配体的文库,并对该文库进行稳定性测试和选择,以鉴定在如上所述的某些条件下稳定的分子。
[0247] 治疗用途
[0248] 本发明的模板展示技术可用于封阻或刺激多种靶。治疗上相关的靶是已知或怀疑参与发生故障并因此导致疾病的调控过程的物质。此类过程的实例有受体-配体相互作用、转录-DNA相互作用、以及涉及粘附分子的细胞-细胞相互作用、辅因子-酶相互作用、以及胞内信号传导中的蛋白-蛋白相互作用。靶分子意味着任何期望分子配体的任何目的化合物。因而,例如,靶可以包括但不限于化学化合物、化学化合物混合物、空间定位的化合物阵列、生物学大分子例如DNA或mRNA、细菌噬菌体肽展示文库、核糖体肽展示文库、由生物学材料例如细菌、植物、真菌或动物(例如哺乳动物)细胞或组织制备的提取物、蛋白、融合蛋白、肽、酶、受体、受体配体、激素、抗原、抗体、药物、染料、生长因子、脂肪、底物、毒素、 病毒等。靶的其它实例包括但不限于例如全细胞、全组织、相关或无关蛋白的混合物、病毒或细菌菌株的混合物等。
[0249] 治疗性药物靶可根据功能分成不同的类别:受体、酶、激素、转录因子、离子通道、核受体、DNA(Drews,J.(2000)Science 287:1960-1964)。其中,受体、核受体以及代谢酶构成了绝大多数已知的既有药物靶。具体的,G蛋白偶联受体(GPCR)连同用于药理学干预的蛋白酶构成了最重要的药物靶类别之一。尽管上述实例集中于最相关的靶,对于本领域技术人员来说清楚的是,任何其它治疗靶可能是目的靶。
[0250] 使用模板展示分子技术的本发明可用于鉴定所有这些类别的药物靶的激动剂或拮抗剂,取决于各靶拥有的特定性质。多数靶有可能以纯化的形式获得,用于直接的选择操作。其它靶必须在它们处于其天然环境中时使用,例如包埋的细胞表面受体。在那些情况下,利用模板展示分子文库的选择可利用早先所述的减法选择进行。
[0251] 本发明的模板展示分子技术的一种特定的应用是产生能够作为拮抗剂起作用的分子,其中的分子阻断受体与一个或多个配体之间的相互作用。另一种应用包括细胞靶向。
例如,产生的识别特定表面蛋白或受体的分子将能够与某些细胞类型结合。此类分子可能额外携带另一种治疗制剂,以提高效力和降低副作用(例如癌症治疗)。涉及抗病毒剂的
应用也包括在内。例如,产生的与病毒颗粒上的表位强烈结合的分子,可能可用作为抗病毒剂。本发明的模板展示分子技术的另一种特定的应用是产生能够作为激动剂起作用的分
子,其中所述分子刺激或激活受体以引发细胞信号传导路径。
[0252] 附图简要说明
[0253] 下列附图在本说明书中提及:
[0254] 图1再现了展示与共同的模板退火的两个寡核苷酸的氨基官能团交联的PAGE凝胶。
[0255] 图2再现了显示与共同的模板退火并且以0、1、2和30个碱基对的间隔交联的两个寡核苷酸的PAGE凝胶。
[0256] 图3再现了展示分别以胺和羧酸终止的两个寡核苷酸交联的PAGE凝胶。
[0257] 图4再现了显示不同pH分布对交联效率影响的PAGE凝胶。
[0258] 图5再现了显示不同pH分布对交联效率影响的PAGE凝胶。
[0259] 图6再现了展示在pH9时的交联效率的PAGE凝胶。
[0260] 图7再现了展示在pH10时的交联效率的PAGE凝胶。
[0261] 图8再现了分析当使用10mer拉链盒时模板不存在的影响的PAGE凝胶。
[0262] 图9再现了分析更高的温育温度对交联效率影响的PAGE凝胶。
[0263] 图10显示了展示5mer拉链盒对交联效率影响的PAGE凝胶图像。
[0264] 图11显示了展示当使用10mer拉链盒时不同温度对交联效率影响的PAGE凝胶图像。
[0265] 图12显示了实验所用一般原理的示意图。
[0266] 图13显示了在(A)架构分子(scaffolded molecule)和(B)聚合分子的合成中使用二聚化结构域的示意图。
[0267] 图14显示了一般原理的优选实施方案。
[0268] 图15显示了两相同的功能实体向支架分子转移的LC-层析图。
[0269] 图16公开了实施例中所用的两组寡聚物设置。
[0270] 图17显示了实施例15中实验A和B的结果。
[0271] 图18显示了实施例16中报道的实验D、E和F的结果。
[0272] 图19公开了实施例17中报道的实验A和B的结果。
[0273] 图20公开了实施例17的结果。
[0274] 图21显示了实施例18中进行的实验的结果。
[0275] 图22显示了实施例19中公开的实验的结果。
[0276] 图23显示了实施例20中报道的实验A到B的结果。
[0277] 图24公开了实施例21中报道的实验E到H的结果。
[0278] 图25显示了实施例21的结果。
[0279] 在图13中,显示了在(A)架构分子和(B)聚合分子的合成中使用二聚化结构域的示意图。当模制合成架构分子时(在该实例中含有4个同类的 反应基团Y),方便的是使用具有相同拉链盒(″b″)的4个构件,以及具有互补于(″b″)的拉链盒(″a″)的一
个构件(携带4个反应基团Y)。当模制合成聚合分子时,人们可在拉链之间进行交替,即第一构件携带拉链盒(″a″),阵列中的第二构件携带与(″a″)二聚化的(″b″),第三
构件携带(″a″)等。
[0280] 图14所示的优选实施方案通过两个拉链盒的二聚化使得X和Y更紧密靠近,提高了反应基团X和Y的局部浓度。在该实例中,显示了3个构件,各自携带一个拉链盒,其中两个具有同样的序列(″a″)而一个是互补序列(″b″)。首先,构件在中温下(此时拉
链盒之间的相互作用可忽略)与模板退火。然后将温度降至更低的温度,此时两互补拉链结构域((第一构件的)″a″和(第二构件的)″b″)彼此退火。这使得X和Y紧密靠
近,并且X和Y可反应形成YX。在该实例中,X和Y之间的反应包括X从第一构件转移到携
带Y的第二构件上。当温度上升到中温时,拉链盒解离。当温度随后降低时,第二构件的拉链结构域可与第三构件(其携带反应基团X)的拉链盒退火。结果,现在这个X可转移到第
二构件上,作为增加的接近性的结果,由此提高了X和Y之间的反应性
[0281] 实施例
[0282] 用于实施例1到11的一般方法和材料
[0283] 为了检测当两个寡聚物与同一模板上的相邻位点退火时分别偶联于寡核苷酸的两个反应基团之间的反应效率,使用下文紧跟着所示的一般设置。两个寡聚物含有由羧酸或胺衍生的末端核苷酸(X、Y和Z),如示意结构下面所描述的那样。在两寡聚物末端的反应基团反应(“交联”)之后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析交联效率,由于两寡聚物作为交联的结果偶联在一起,因此更慢地迁移过柱。
[0284]
[0285] 间隔:0、1、2、30nt(分别为Ah7、8、9、11)
[0286] 构件:
[0287] ·Ah 1:5’-GCTACTCGTACGAGX
[0288] ·Ah 3:5’-GCTACTCGTACGAGY
[0289] ·Ah 5:5’-GCTACTCGTACGAGZ
[0290] ·Ah 2:5’-XCACTTGCAGACAGC
[0291] ·Ah 4:5’-YCACTTGCAGACAGC
[0292] ·Ah 6:5’-ZCACTTGCAGACAGC
[0293] ·Ah 14:5’-GCTACTCGTACGAG
[0294] ·Ah 23:5’-GCTACTGGCATCGGX
[0295] ·Ah 24:5’-GCTACTGGCATCGGY
[0296] ·Ah 27:5’-YCACTTGCAGACAGC
[0297] 在涉及拉链盒的实施例中,使用了如下的序列
[0298] ·AH36:5’-CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCGAA-TGTGTCCAGTTACX
[0299] ·AH37:5’-ZGTAACTGGACTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCT-GTCGAGCATCCAGCT [0300] ·AH51:5’-ZGTAACACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCT-GTCGAGCATCCAGCT [0301] ·AH67:5’-ZCATTGACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTG-ACCTGTCGAGCATCCAGCT [0302] ·AH69:5’-AGZAACACCTGTGTAAGCTGCCTG下CAGTCGGTACTG-ACCTGTCGAGCATCCAGCT [0303] ·AH66:5′-ZTTGTAACTGGACTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACC-TGTCGAGCATCCAGCT
[0304] ·AH65:5’-CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCG-AATGTGTCAGTTACTTX [0305] 拉链盒序列以下划线标出。
[0306] ●X=羧基-dT
[0307] ●Y=氨基修饰剂C2dT
[0308] ●Z=氨基修饰剂C6dT
[0309]
[0310] 寡核苷酸按照常规的亚磷酰胺法制备。X利用商业上可获得的羧基-dT亚磷酰胺(来自Glen research的10-1035-90)掺入。以Y和Z终止的寡核苷酸可利用通用程序从
相应的以X终止的寡核苷酸制备:
[0311] 模板:
[0312] Ah 28:5’-GCTGTCTGCAAGTGAACCGATGCCAGTAGC
[0313] Ah 38:5’-AGCTGGATGCTCGACAGGTCCCGATGCAATCCAGAGGTCG
[0314] Ah7:5’-GCTGTCTGCAAGTGAACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG-生物素-3’ [0315] Ah 8:5’-GCTGTCTGCAAGTGACACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG- 生 物素-3’
[0316] Ah 9:5’-GCTGTCTGCAAGTGACGACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG- 生 物素-3’
[0317] Ah 11:5’-
[0318] GCTGTCTGCAAGTGACGACTGATCCAGTGACATGCGTACCATCGAACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG-生物素-3’
[0319] 模板通过常规的亚磷酰胺合成制备。
[0320] 缓冲液:
[0321] 缓冲液A(100mM Hepes pH=7,5,1M NaCl)
[0322] 缓冲液B:(100mM NaPO4pH=6,1M NaCl)
[0323] 缓冲液C:(100mM酸钠pH=9,1M NaCl)
[0324] 缓冲液D:(100mM硼酸钠pH=10,1M NaCl)
[0325] 缓冲液E:(500mM NaPO4pH=7,1M NaCl)
[0326] 缓冲液F:(500mM NaPO4pH=8,1M NaCl)
[0327] DNA寡核苷酸的退火
[0328] 在相关缓冲液中混合寡聚物,并在80℃加热,然后冷却到28℃(-2℃/30秒)。32
[0329] 用 P的5′-标记.
[0330] 混合200pmol寡核苷酸、2μl10×磷酸化缓冲液(Promega cat#4103)、1μl T4多32
核苷酸激酶(Promega cat#4103)、1μlγ- P ATP,添H2O至20μl。于37℃温育10-30分
钟。
[0331] PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)
[0332] 样品与甲酰胺染料(98%甲酰胺,10mM EDTA,pH 8,0.025%二甲苯蓝,0.025%溴酚蓝)1∶1混合,于80℃温育2分钟,然后在变性10%聚丙烯酰胺凝胶上跑样。凝胶显影利用放射自显影(Kodak,BioMax胶片)。
[0333] 实施例1
[0334] 混合2μl缓冲液A、2μl相关寡聚物1(2pmol/μl)、2μl相关寡聚物2(2pmol/μl)、4μl相关寡聚物3(2pmol/μl)(见下文表I)。
[0335] 表I:
[0336]实验 寡聚物1(32P标记的) 寡聚物2 寡聚物3
A Ah 3 Ah 4 Ah 7
B Ah 5 Ah 6 Ah 7
C Ah 5 Ah 6 无
D Ah 5 Ah 6 Ah 8
E Ah 5 Ah 6 Ah 9
F Ah 14 Ah 6 Ah 7
[0337] 如上文所述退火。添加1μl 100mM、1μl 10mM或者0.1μl 10mMTSAT(Tris-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸,Pierce cat#33063,溶于DMSO)。于25℃温育大约1小时,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0338] 结果示于图1。
[0339] 实施例2
[0340] 混合2μl缓冲液A、2μl相关寡聚物1(0.2pmol/μl)、1μl相关寡聚物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、4μl H2O(见下文表II)。
[0341] 表II:
[0342]实验 寡聚物1(32P标记的) 寡聚物2 寡聚物3
G Ah 5 Ah 6 无
H Ah 5 Ah 6 Ah 7
I Ah 5 Ah 6 Ah 8
J Ah 5 Ah 6 Ah 9
K Ah 5 Ah 6 Ah 11
[0343] 如上文所述退火。添加1μl 100mM、10mM或1mM TSAT(Tris-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸,Pierce cat#33063,溶于DMSO)。于25℃温育大约5小时,然后跑样10%尿素聚丙烯酰胺凝胶,如上文所述。
[0344] 结果示于图2。
[0345] 实施例3
[0346] 混合2μl缓冲液A、2μl相关寡聚物1(0.2pmol/μl)、1μl相关寡聚物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、4μl H2O(见下文表III)。
[0347] 表III:
[0348]实验 寡聚物1(32P标记的) 寡聚物2 寡聚物3
L Ah 1 Ah 6 无
M Ah 1 Ah 6 Ah 7
N Ah 1 Ah 6 Ah 8
O Ah 1 Ah 6 Ah 9
P Ah 1 Ah 6 Ah 11
[0349] 退火如上文所述。添加1μl 1M、100mM、10mM或1mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,Fluka#03450)和1μl 100mMNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(Aldrich cat#13,067-2)。于25℃温育大约5小时,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,如上文所述。
[0350] 结果示于图3。
[0351] 实施例4
[0352] 混合2μl缓冲液A、B、C、D、E或F、2μl相关寡聚物1(0.2pmol/μl)、1μl相关寡聚物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、4μl H2O(见下文表IV)。
[0353] 表IV:
[0354]实验 寡聚物1(32P标记的) 寡聚物2 寡聚物3
Q Ah 1 Ah 6 Ah 7
R Ah 5 Ah 6 Ah 7
[0355] 如上文所述退火。实验Q添加1μl 100mM EDC和1μl 100mMNHS。实验R添加1μl 100mM TSAT。于25℃温育大约1.5小时,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分
析。
[0356] 结果示于图4。
[0357] 实施例5
[0358] 混合2μl缓冲液A或D、2μl相关寡聚物1(0.2pmol/μl)、1μl相关寡聚物2(10pmol/μl)、2μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、2μl H2O(见下文表V)。
[0359] 表V:
[0360]实验 寡聚物1(32P标记的) 寡聚物2 寡聚物3
S Ah 5 Ah 6 Ah 7
T Ah 14 Ah 6 Ah 7
[0361] 如上文所述退火。添加1μl 100mM TSAT。于25℃温育大约1.5小时,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0362] 结果示于图5。
[0363] 实施例6
[0364] 混合2μl缓冲液A、B或D、1μl相关寡聚物1(2pmol/μl)、1μl相关寡聚物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、5μl H2O(见下文表VI)。
[0365] 表VI:
[0366]实验 寡聚物1(32P标记的) 寡聚物2 寡聚物3
UA(缓冲液A) Ah 23 Ah 27 Ah 28
VA(缓冲液A) Ah 23 Ah 27 无
UB(缓冲液B) Ah 23 Ah 27 Ah 28
VB(缓冲液B) Ah 23 Ah 27 无
X(缓冲液D) Ah 24 Ah 27 Ah 28
Y(缓冲液D) Ah 24 Ah 27 无
[0367] 如上文所述退火。实验U和V添加1μl 100mM EDC和1μl 100mMNHS,于24℃温育大约1小时,接着添加2μl缓冲液C,然后于24℃温育30分钟。实验X和Y添加2μl
50mM TSAT。于24℃温育大约1.5小时,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,如上文所述。
[0368] 结果示于图6。
[0369] 实施例7
[0370] 混合2μl第一缓冲液(见下文)、1μl Ah 23(2pmol/μl)、1μl Ah 27(10pmol/μl)、1μl Ah 28(10pmol/μl)、5μl H2O。如上文所述退火,然后添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC,于24℃温育30分钟,然后添加3μl第二缓冲液(见下文)。于24℃温育40
分钟,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0371] 表VII:
[0372]实验 第一缓冲液 第二缓冲液
7-1 缓冲液A 缓冲液A
7-2 缓冲液A 缓冲液C
7-3 缓冲液A 缓冲液D
7-4 缓冲液B 缓冲液D
7-5 缓冲液B 缓冲液C
[0373] 结果示于图7。
[0374] 实施例8
[0375] 混合物8-1:混合2μl缓冲液B、5μl Ah 36(0.4pmol/μl)、1μl Ah 37(2pmol/μl)、1μl Ah 38(2pmol/μl)、1μl H2O。
[0376] 混合物8-2:混合2μl缓冲液B、5μl Ah 36(0.4pmol/μl)、1μl Ah 37(2pmol/μl)、2μl H2O。
[0377] 通过加热至80℃,然后冷却到44℃(-2℃/30秒)而退火。
[0378] 添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在所示温度下(见下文)温育45分钟,然后添加2μl缓冲液D。温育大约2小时,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0379] 温育温度:
[0380] 45℃、48.2℃、53.0℃、58.5℃、63.1℃、65.6℃
[0381] 结果示于图8。
[0382] 实施例9
[0383] 混合物9-1:混合2μl缓冲液B、1μl Ah 36(2pmol/μl)、1μl Ah 51(2pmol/μl)、1μl Ah 38(2pmol/μl)、5μl H2O。
[0384] 混合物9-2:混合2μl缓冲液B、1μl Ah 36(2pmol/μl)、1μl Ah 51(2pmol/μl)、6μl H2O。
[0385] 通过加热至80℃,然后冷却到35℃(-2℃/30秒)(对于温度1到6),或者加热至80℃,然后冷却到15℃(-2℃/30秒)(对于温度7到12)而退火。
[0386] 添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在所示温度下(见下文)温育1小时,然后添加2μl缓冲液D。温育1小时,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,如上文
所述。
[0387] 温育温度:
[0388] 1)34.9 ℃,2)36.3 ℃,3)40.3 ℃,4)45.7 ℃,5)51.0 ℃,6)55.77,7)14.9 ℃,8)17.8℃,9)22.7℃,10)28.3℃,11)31.0℃,12)36℃
[0389] 混合物9-3:混合2μl缓冲液B、0.5μl Ah 36(2pmol/μl)、1μl Ah 51(2pmol/μl)、1μl Ah 38(2pmol/μl)、5.5μl H2O。
[0390] 混合物9-4:混合2μl缓冲液B、0.5μl Ah 36(2pmol/μl)、1μl Ah 51(2pmol/μl)、6.5μl H2O。
[0391] 通过在80℃加热,然后冷却到5℃(-2℃/30秒)退火。
[0392] 添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在不同温度下(见下文)温育1小时,然后添加2μl缓冲液D。温育1小时,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0393] 温育温度:
[0394] 1)5.9℃,2)9.9℃,3)12.6℃,4)18.3℃,5)23.3℃,6)27.9℃7)35.6℃,8)45.9℃ [0395] 结果示于图9,A和B。
[0396] 实施例10
[0397] 混合2μl缓冲液A、1μl相关寡聚物1(2pmol/μl)、1μl相关寡聚物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、5μl H2O(见下表)。如上文所述退火。
[0398] 添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在不同温度1)7.7℃,2)15.4℃,3)21.0℃,4)26.2℃温育大约2小时,以及5)10℃温育1秒,然后35℃温育1秒。重复99次。通过
10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0399] 表VIII:
[0400]实验 寡聚物1(32P) 寡聚物2 寡聚物3
10-1 Ah 36 无 Ah 38
10-2 Ah 36 无 无
10-3 Ah 36 Ah 51 Ah 38
10-4 Ah 36 Ah 51 无
10-5 Ah 36 Ah 67 Ah 38
10-6 Ah 36 Ah 67 无
10-7 Ah 36 Ah 69 Ah 38
10-8 Ah 36 Ah 69 无
[0401] 结果示于图10A和图10B。
[0402] 实施例11
[0403] 混合2.5μl缓冲液A、1μl相关寡聚物1(2pmol/μl)、1μl相关寡聚物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、4.5μl H2O(见下表)。通过加热至80℃,然后冷却到30℃或55℃退火。
[0404] 添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在30℃或55℃温育。然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0405] 表IX:
[0406]实验 寡聚物1(32P标记的) 寡聚物2 寡聚物3
11-1 Ah 36 Ah 37 Ah 38
11-2 Ah 36 Ah 37 无
11-3 Ah 65 Ah 66 Ah 38
11-4 Ah 65 Ah 66 无
11-5 Ah 36 Ah 66 Ah 38
11-6 Ah 36 Ah 66 无
11-7 Ah 65 Ah 37 Ah 38
11-8 Ah 65 Ah 37 无
[0407] 结果示于图11。
[0408] 实施例1到11的结果的讨论
[0409] 接头长度和反应基团之间的间距对交联效率的影响
[0410] 我们首先检测了改变连接胺和核苷酸的接头的长度的影响。寡聚物Ah3和Ah5分别含有与核苷酸的碱基隔离7个和11个键的胺(称之为氨基修饰剂C2dT和氨基修饰剂
C6dT,见上文的式子)。这些寡聚物紧接着寡聚物Ah 4或Ah6(分别携带氨基修饰剂C2dT
和氨基修饰剂C6dT) 退火,也就是两寡聚物之间间隔0个碱基对。
[0411] 如图1泳道A和B中所看到的,对于每个氨基修饰剂交联效率大致相等。
[0412] 在所有后续实验中,寡聚物Ah5(含有氨基修饰剂C6dT)用作为反应基团胺。
[0413] 接着,两个寡聚物与模板退火,这两个寡聚物之间间隔0、1、2及30个碱基对,并检查交联效率。首先,研究了利用TSAT(Tris-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸,Pierce cat#33063,溶于DMSO)的交联。当使用寡聚物Ah5和Ah6时,间隔0碱基对的交联反应效率最高(图1,泳道B;图2,H部分),间隔1个碱基对的效率较低(图1,泳道D;图2,I部分),而且间隔2和30个碱基对的效率极低(图1,泳道E和F;图2,J和K部分)。
[0414] 其次,检查了胺和羧酸的交联。在这个实验中,加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺),以使两个反应基团交联。当使用寡聚物Ah1和Ah6时,零碱基对的最短间隔的交联效率再一次最高(图3,M部分),对于
1个碱基对的间隔交联效率相对较高(图3,N部分),而对于2和30个碱基对的间隔,交联
效率分别为中度和可忽略的(图3,O和P部分)。
[0415] TSAT和EDC浓度的优化
[0416] 利用寡聚物Ah5和Ah 6测试了TSAT浓度的重要性。浓度为1或10mM的TSAT导致比0.1mM和100mM TSAT更为有效的交联(图1和2)。当使用最高的TSAT浓度(100mM)
时所获得的较低的交联效率可通过两个TSAT分子与每一个相邻的胺反应来解释。
[0417] 接着,检查了EDC浓度对携带胺的寡聚物(Ah6)和携带羧酸的寡聚物(Ah1)交联的重要性。以前,已发现大约10mM的NHS浓度当与EDC一起使用时提供最高的交联效率。
如图3所示,100mM EDC与0.1mM、1mM和10mM EDC相比产生最高的交联效率。
[0418] 用于TSAT和EDC/NHS交联反应的pH的优化
[0419] 接着,我们测试不同pH分布对使用EDC/NHS或TSAT试剂的交联效率的影响。
[0420] pH 10提供了两个胺最为有效的TSAT交联(图4,R部分;图5,S部分)。该研究中使用寡聚物Ah5和Ah6。在实验6(图6)中,使用pH 10以及携带胺的寡聚物Ah24和
Ah27之间零碱基对的间隔得到80%的交联效率。在其它实验中,将互补元件(与模板退火的寡聚物区域)和反应基团(胺或羧酸)隔开的接头大得多(例如图11和12),此时交联
效率低得多。
[0421] 接着利用寡聚物Ah1和Ah6检查不同pH分布对使用EDC/NHS的交联效率的影响。介导最有效的交联的恒定pH是pH 7.5(图4,Q部分)。不过,更好的交联效率在pH最初
保持在pH 6,然后上升至pH 9(图6)或10(图7)时获得。在后两种实验中,利用寡聚物
Ah23和Ah27。在那些条件下,交联效率几乎为100%。请注意,在这些实验中,连接反应基团和互补元件的接头相对较短(例如Ah27为11个键)。
[0422] 当使用拉链盒序列时的交联效率的检查
[0423] 我们接着利用携带反应基团(胺或羧酸)的寡聚物检查了交联效率,其中连接反应基团和退火区的接头大约为25个核苷酸。
[0424] 在第一个实验中,利用Ah36(携带羧酸)和Ah67(携带胺)。所用的模板(Ah38)紧邻着与这两个寡聚物退火,即间距零碱基对。
[0425] 在该实验条件下,观察到小于5%的交联效率,并且仅仅是在最高测试温度时(图10,A和B,泳道5)。为提高交联效率,我们分别在寡聚物Ah67和Ah36的5′和3′端(携
带反应基团的相同末端)引入了所谓的拉链盒序列。拉链盒是互补的序列,因而可使得两个寡聚物的反应基团更为亲密地靠近。测试了两个不同长度的拉链盒,即10′mer的拉链盒(Ah37/Ah66,Ah37形成10个碱基对的DNA双链体)和5′mer的拉链盒(形成5个碱
基对的DNA双链体)。见图12。而且,测试了不同设计的拉链盒,例如反应基团紧邻拉链盒连接(Ah36、Ah37、Ah51),或者放置在 拉链盒上游两个核苷酸处(Ah65,Ah66)或者置于拉链盒中间(Ah67)的寡聚物。
[0426] 我们首先测试5′mer的拉链盒对交联效率的影响。正如所观察到的那样,5′mer的拉链盒显著提高交联效率(图10,A和B,比较泳道3和5)。注意在所有测试温度下模板是交联绝对必要的。最高交联效率在温度在10℃和35℃之间上下循环99次时获得(图
10B)。高效率也在温度恒定保持在21℃或26℃时获得(图10A和B,泳道3)。交联效率在
高于26℃时不再升高(图9,A和B)。
[0427] 我们接着测试了在10′mer的拉链盒形式下的交联效率。寡聚物Ah36和Ah37与Ah38模板退火,并在多种温度下检查交联效率。在不存在模板时观察到令人惊讶的高度交联(图8,45℃和48.2℃)。但是,在高于58.5℃的温度时,在不存在模板时未观察到交联。 [0428] 接着,测试了反应基团相对于拉链盒的不同定位。如图10,A和B,泳道7所示,当一个或多个反应基团位于拉链盒中间(即反应基团连接于参与DNA双螺旋形成的核苷酸;
Ah67)时,交联效率显著下降。
[0429] 也在10′mer拉链盒的环境下测试了反应基团相对于拉链盒的定位。在这种环境下,当两个反应基团都距拉链盒有两个核苷酸(Ah65,Ah66)时,交联效率稍有下降(图11,对比泳道1和3)。当测试Ah65、Ah66、Ah36和Ah37的不同组合时(即当反应基团紧挨着拉链盒,或者在其上游两个核苷酸放置时),交联效率无显著变化。注意模板在10′mer拉链盒的环境中的所有温度下并非是绝对必要的。这种温度非依赖性在较低的温度下尤为突出(例如图11,30℃)。
[0430] 实施例12:三胺支架构件
[0431] 含具有羧酸部分的经修饰核酸碱基的寡聚物利用常规的亚磷酰胺法合成:
[0432] (SEQ ID NO)5’-GAC CTG TCG AGC ATC CAG CTT CAT GGG AAT TCC TCGTCC ACA ATG XT
[0433] X利用商业上可获得的羧基-dT亚磷酰胺(10-1035-90,来自Glenresearch)掺入。下划线的核酸碱基代表拉链区。
[0434] 反应的示意方案:
[0435]
[0436] 将所述含具有羧酸部分的经修饰核酸碱基的寡聚物(1nmol)与水(100μL)、hepes缓冲液(40μL 200mM,pH=7.5)、NHS(20μL 100mM溶液)、EDC(20μL新鲜制备的
1M溶液)和四(氨基甲基)甲烷四氢氯化物(20μL100mM溶液)混合。将反应混合物室温
放置o/n。通过真空蒸发使体积降至60μL。通过添加NH3浓缩物(20μL)跟着进行HPLC
纯化可获得纯的寡聚物。利用如下梯度大约6分钟后有可能分离到峰:0-3分钟100%A,
然后3-10分钟15%A和85%B,然后10-15分钟100%B,然后15-20分钟100%A。A=
10mM TEAA中的2%乙腈,而B=10mM TEAA中的80%乙腈。
[0437] 实施例13:将功能实体连接到硫寡聚物上的一般操作
[0438] 如下含修饰的核酸碱基(具有S-三苯基甲基保护的硫部分)的寡聚物利用常规的亚磷酰胺法合成:
[0439] (SEQ ID NO)5’-WCA TTG ACC TGT CTG CCB TGT CAG TCG GTA CTG TGGTAA CGC GGA TCG ACC T
[0440] (SEQ ID NO)5’-WCA TTG ACC TGA ACC ATG BTA AGC TGC CTG TCA GTCGGT ACT ACG ACT ACG TTC AGG CAA GA
[0441] W利用商业上可获得的硫醇修饰剂亚磷酰胺(10-1926-90,来自Glen research)掺入。B是利用商业上可获得的亚磷酰胺(10-1953-95,来自Glenresearch)掺入的内部生物素。以下划线标出的核酸碱基表示拉链区。
[0442] S-三苯甲基保护的硫寡聚物(10nmol)在真空中蒸发,并重悬于TEAA缓冲液(200μL 0.1M溶液,pH=6.4)中。添加AgNO3(30μL 1M溶液),并将混合物室温下放置
1-2小时。添加DTT(46μL 1M溶液),并静置5-10分钟。将反应混合物离心(20,000G 20
分钟)并收集上清。固体用另外的TEAA缓冲液(100μL 0.1M溶液,pH=6.4)抽提。纯
的硫寡聚物通过常规的乙醇沉淀获得。
[0443] 加载反应的示意方案:
[0444]
[0445] 各硫寡聚物(1nmol)在真空中干燥,并用二甲基甲酰胺(50μL 0.1M溶液)中的包含如下功能实体的化学实体处理:
[0446]
[0447] 并室温放置o/n。将构件离心(20.000G 10分钟),并取出上清。添加二甲基甲酰胺(1mL),并将构件离心(20.000G 10分钟)。除去二甲基甲酰胺,并将荷载的硫寡聚物重悬于TEAA缓冲液(25μL 0.1M溶液,pH=6.4)中,并通过HPLC分析。
[0448] 实施例14:编码的架构分子(scaffolded molecule)的合成
[0449]
[0450] 将 模 板 寡 聚 物 5 ′ -BTCTTGCCTGAACGTAGTCGTAGGTCGATCCGCGTTACCAGAGCTGGATGCTC GACAGGTCCCGATGCAATCCAGAGGTCG(SEQ ID NO)(1nmol)与实施例13中制备的两个构件以及实施例12中制备的支架构件(1nmol)在hepes缓冲液(20μL100mMhepes
和1M NaCl溶液,pH=7.5)和水(添加至终体积100μL)中混合。构件通过加热至50℃并
冷却(-2℃/30秒)至30℃与模板退火。混合物以波动的温度(10℃1秒然后35℃1秒)
静置o/n。寡聚物复合物通过添加链霉抗生物素蛋白珠子(100μL,用2×1mL 100mM hepes缓冲液和1M NaCl,pH=7.5预洗涤)而连接于链霉抗生物素蛋白。珠子用hepes缓冲液
(1mL)洗涤。三胺架构构件通过添加水(200μL),接着加热至70℃而从结合链霉抗生物素蛋白的复合物中分离。将水转移并在真空中蒸发,重悬于TEAA缓冲液(45μL 0.1M溶液)
中,并通过HPLC分析产物形成(见图15)。
[0451] HPLC层析证明了两个功能实体向支架构件的转移。顶部的层析显示了参照支架构件。底部的层析显示了在一个(峰在7.94分钟)及两个(峰在10.76分钟)相同官能
实体部分转移后链霉抗生物素蛋白纯化的支架构件。使用如下梯度:0-3分钟100%A,然后3-10分钟15%A和85%B,然后10-15分钟100%B。A=10mM TEAA中的2%乙腈,而
B=10mMTEAA中的80%乙腈。
[0452] 由于功能实体的亲脂性,在HPLC层析中观察到具有两个功能实体的架构分子与具有一个的相比更长的保留时间。具有两个相同功能实体的 架构分子的模制合成效率为大约25%(在图15中10.76分钟的峰)。
[0453] 用于实施例15到21的一般方法和材料:
[0454] 为了检查当两个寡聚物与同一模板退火时,分别偶联于一个寡核苷酸的两个反应基团之间的反应效率,利用了图16所示的两组设置(设置A和设置B)。两个寡聚物含有由羧酸或胺衍生化的末端核苷酸。在两寡聚物末端上的反应基团反应(“交联”)之后,可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析交联效率,由于两寡聚物作为这种交联的结果偶联在一起,因此更慢地迁移过柱。
[0455] DNA寡聚物:
[0456] X=羧基-dT
[0457] Z=氨基修饰剂C6
[0458] 6=氨基修饰剂5cat.Nr.10-1905
[0459] 拉链盒序列以下划线标出。注意当构件拉链盒与模板中的拉链盒相互作用时,拉链盒双链体的长度比下划线标出的长一个核苷酸。
[0460] AH36:5’-
[0461] CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCGAATGTGTCCAGT-TACX
[0462] AH51:5’-
[0463] ZGTAACACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATC-CAGCT
[0464] AH82:5’ZGTAACACCTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT
[0465] AH 201:5’-TCTGGATTGCATCGGGAGTTACX
[0466] AH133:5’-
[0467] ZGTAACTCCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATC-CAGCT
[0468] AH134:5’-
[0469] ZGTAACTGCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATC-CAGCT
[0470] AH135:5’-
[0471] ZGTAACTGGTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATC-CAGCT
[0472] AH 142:5’-
[0473] CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTGACTGTCCGTCGAATGTGTCCAGTTACX
[0474] AH 156:5’-ZGACCTGTCGAGCATCCAGCT
[0475] AH 202:5’-TCTGGATTGCATCGGGTTACX
[0476] AH 203:5’-TCTGGATTGCATCGGTTTTTX
[0477] AH 236:5’-6GTAACACCTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT
[0478] AH 240:5’-CGACCTCTGGATTGCATCGGGCACGGTTACX
[0479] AH 249:5’-ZCTGGACAGCTCGTAGGTCGTTTTTTTTTTT
[0480] AH 251:5’-ZGACCTGTCGAGCATCCAGCT
[0481] AH 252:5’-XGACCTGTCGAGCATCCAGCT
[0482] AH 255:5’-CGACCTCTGGATTGCATCGGTGTTACZ
[0483] AH 258:5’-ACGACTACGTTCAGGCAAGAGTTACZ
[0484] AH 260:5’-XCTGGACAGCTCGTAGGTCGTTTTTTTTTTT
[0485] AH 261:5’-CGACCTCTGGATTGCATCGGZ
[0486] AH 262:5’-CGACCTCTGGATTGCATCGGTTACZ
[0487] AH 270:5’-6GTAACGACCTGTCGAGCATCCAGCT
[0488] AH 271:5’-6GTAACTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT
[0489] AH 272:5’-ACGACTACGTTCAGGCAAGAGTTACX
[0490] AH 273:5’-ACGACTACGTTCAGGCAAGAGCGTTACX
[0491] AH 274:5’-ACGACTACGTTCAGGCAAGAGCACGGTTACX
[0492] AH 275:5’-CGACCTCTGGATTGCATCGGGCGTTACX
[0493] AH 276:5’-CTGGTAACGCGGATCGACCTGCACGGTTACX
[0494] AH 277:5’-CTGGTAACGCGGATCGACCTGCGTTACX
[0495] 寡核苷酸按照常规的亚磷酰胺法制备。X代表商业上可获得的羧基-dT亚磷酰胺(10-1035-90,来自Glen research)。Z代表氨基修饰剂C6dT(10-1039,来自Glen
Research)。6代表氨基修饰剂5(10-1905,来自GlenResearch)。
[0496] 模板:
[0497] 拉链盒序列以下划线标出。
[0498] AH38:5’-AGCTGGATGCTCGACAGGTCCCGATGCAATCCAGAGGTCG
[0499] AH140:5’-
[0500] AGCTGGATGCTCGACAGGTCAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG
[0501] AH 154:5’-
[0502] AGCTGGATGCTCGACAGGTCAAGTAACAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG
[0503] AH 250:5’-
[0504] CGACCTACGAGCTGTCCAGAAGTAACAGGTCGATCC
[0505] AH 256:5’-
[0506] AGCTGGATGCTCGACAGGTCAAGTAACACCAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG
[0507] AH 263:5’-
[0508] CGACCTACGAGCTGTCCAGAAGTAACAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCTGGTCACGTGGATCCTTGA
[0509] AH 278:5’-
[0510] AGCTGGATGCTCGACAGGTCGAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG
[0511] AH 279:5’-
[0512] CGACCTACGAGCTGTCCAGAAGTAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGGTCACGTGGATCCTTGA
[0513] 模板通过常规的亚磷酰胺合成制备。
[0514] 缓冲液:
[0515] 缓冲液A(100mM Hepes pH=7.5;1M NaCl)
[0516] 缓冲液B(20mM Hepes pH=7.5;200mM NaCl)
[0517] 用32P的5′-标记:
[0518] 混合5pmol寡核苷酸、2μl 10×磷酸化缓冲液(Promega cat#4103)、1μl T4多32
核苷酸激酶(Promega cat#4103)、1μl γ- P ATP,添H2O至20μl。于37℃温育10-30分钟。
[0519] PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)
[0520] 样品与甲酰胺染料(98%甲酰胺,10mM EDTA,pH 8,0.025%二甲苯蓝,0.025%溴酚蓝)1∶1混合,于80℃温育2分钟,然后在变性10%聚丙烯酰胺凝胶上跑样。凝胶显影利用放射自显影(Kodak,BioMax胶片)。
[0521] 实施例15
[0522] 为了检查在设置B的环境中浓度对退火效率、反应效率和模板依赖性的影响,我们进行了如下实验,其包括i)在高构件和模板浓度下的退火和反应(实验A和B),ii)在高浓度下退火,接着稀释100倍,并在此低浓度下反应(E和F),和iii)在低浓度下退火和反应(C和D)。为检查模板非依赖性反应发生的程度,我们也包括了对照复合物,它由竞争性模板和携带反应基团(胺)的竞争性寡聚物组成。
[0523] 实验
[0524] 混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表X),并加H2O至50μl。
[0525] 表X:
[0526]实 寡聚物1 (32P标记的) 寡聚物2 (BB0) 寡聚物3(模板) 寡聚物4(竞争性 寡聚物5 (竞争性验 (BB1) 寡聚物) 模板)
A Ah202(1pmol) Ah156 (5pmol) Ah 154 (5pmol) Ah249(500pmol) Ah250 (500pmol)
B Ah202(1pmol) Ah156 (5pmol) Ah154 (5pmol) Ah249(500pmol)
C Ah 202(0.01pmol) A h Ah 256(0.05 Ah249(5pmol) Ah257 (5pmol)
251(0.05pmol) pmol)
D Ah 202(0.01pmol) A h Ah 256(0.05 Ah249(5pmol)
251(0.05pmol) pmol)
E Ah202(1pmol) Ah251 (5pmol) Ah154 (5pmol)
F Ah202(1pmol) Ah251 (5pmol) Ah154 (5pmol) Ah249(500pmol) Ah263 (500pmol)[0527] 对于A-D退火从80℃到20℃(-1℃/30秒),而对于E和F,从80℃到20℃(-1℃/1
分钟)退火。E和F退火之后在缓冲液B中稀释100倍。 然后添加溶于H2O的5μl 500mM
DMT-MM(根据Kunishima等Tetrahedron(2001),57,1551制备)。在各种温度下温育o/n,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0528] 结果示于图17(实验A和B)以及图18(实验C、D、E和F)。
[0529] 结论:
[0530] 模制非依赖性反应通常在20℃时观察到。这种假象推测不是由模板中的拉链盒介导的,因为即使当竞争性模板(携带拉链盒)不包括在温育混合物中时也观察到这种现
象(见例如图17,实验B,泳道1)。在高浓度退火,接着稀释并在所得的低浓度下反应则消除了模板非依赖性反应,但维持了构件寡聚物在反应步骤前在模板上的有效退火(将实验E和F的有效交联和模板非依赖性反应的缺乏与不太吸引人的实验A、B、C和D对比)。
[0531] 实施例16
[0532] 为了检查在设置B中当构件在位置3处退火时拉链盒的作用,利用两个不同的构件寡聚物进行了实验,其中一个具有6-mer的拉链盒(构件寡聚物的6个核苷酸与模板上
的互补拉链盒退火),另一个不具有拉链盒。
[0533] 实验
[0534] 混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XI),并加H2O至50μl。
[0535] 表XI:
[0536])



性 ) )
争竞( 4 lomp5( lomp5(
物聚 942 062
寡 hA hA
)板 )lomp5 )lomp5
模( 3物聚寡 0.0( 652 hA 0.0( 652 hA
)lo )lo
)0BB( 2物 mp50.0( 651 mp50.0( 252
聚寡 hA hA

)1
BB()

记标 )lo )lo
23 P( 1 mp10.0(2 mp10.0(1
物聚 02 h 62 h
寡 A A

实 A B
[0537] 从80℃到20℃(-1℃/30秒)退火。然后添加溶于H2O的5μl 500mM DMT-MM(根据Kunishima等Tetrahedron(2001),57,1551制备)。在各种温度下温育o/n,然后通过
10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0538] 结果示于图19。
[0539] 结论:
[0540] 实验A使用携带6-mer拉链盒的构件,并且观察到大约30%的交联效率(实验A,泳道2-4)。当使用不带拉链盒的构件时(实验B),未观察到交联(泳道3-4的斑点是胶片
上的假象,而并不代表交联)。没有观察到交联,并且即使是在20℃时也没有观察到反应(很可能是因为构件不携带拉链盒)。
[0541] 实施例17
[0542] 我们利用长度为5、6或7个核苷酸的拉链盒,利用在位置3处退火的构件检查了设置B中的交联效率。
[0543] 实验
[0544] 混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XII),并加H2O至50μl。
[0545] 表XII:
[0546]实 验 寡聚物1(32P标记的) 寡聚物2 (BB0) 寡聚物3(模寡聚物4 (竞争性寡聚寡聚物5(竞争性模板)(BB1) 板) 物)
A Ah262(1pmol) Ah252 (5pmol) Ah154(5pmol)
B Ah262(1pmol) Ah252 (5pmol) Ah154(5pmol) Ah 260(500pmol) Ah 263(500pmol)
C Ah202(1pmol) Ah251 (5pmol) Ah154(5pmol)
D Ah202(1pmol) Ah251 (5pmol) Ah154(5pmol) Ah249(500pmol) Ah 263(500pmol)
E Ah255(1pmol) Ah252 (5pmol) Ah154(5pmol)
F Ah255(1pmol) Ah 252 (5pmol) Ah154(5pmol) Ah 260(500pmol) Ah 263(500pmol)[0547] 从80℃到20℃(-1℃/分)退火。在缓冲液B+50mM DMT-MM(根据Kunishima等
Tetrahedron(2001),57,1551制备)中稀释100倍。在各种温度下温育o/n,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0548] 结果示于图20。
[0549] 结论:
[0550] 长度为5、6或7个核苷酸的拉链盒在温度范围24-28℃内介导有效的交联(图20,A、C、E部分)。在这些条件下(其中在高浓度退火且在低浓度交联),未观察到竞争性复合物的交联(图20,B、D和F部分)。
[0551] 实施例18
[0552] 在本实验中,我们分析了设置A中多种接头长度的交联效率(所述接头连接反密码子和拉链盒)。
[0553] 实验
[0554] 混合10μl缓冲液A、各种浓度的相关寡聚物(见下表XIII),并加H2O至50μl。 [0555] 表XIII:
[0556]实验 寡聚物1(32P标记的)(BB1) 寡聚物2(BB0) 寡聚物3(模板)
1 Ah 202(1pmol) Ah 270(10pmol) Ah 140(5pmol)
2 Ah 202(1pmol) Ah 270(10pmol) Ah 278(5pmol)
3 Ah 275(1pmol) Ah 271(10pmol) Ah 140(5pmol)
4 Ah 275(1pmol) Ah 271(10pmol) Ah 278(5pmol)
5 Ah 240(1pmol) Ah 236(10pmol) Ah 140(5pmol)
6 Ah 240(1pmol) Ah 236(10pmol) Ah 278(5pmol)
7 Ah 240(1pmol) Ah 236(10pmol)
8 Ah 272(1pmol) Ah 270(10pmol) Ah 140(5pmol)
9 Ah 272(1pmol) Ah 270(10pmol) Ah 278(5pmol)
10 Ah 273(1pmol) Ah 271(10pmol) Ah 140(5pmol)
11 Ah 273(1pmol) Ah 271(10pmol) Ah 278(5pmol)
12 Ah 274(1pmol) Ah 236(10pmol) Ah 140(5pmol)
13 Ah 274(1pmol) Ah 236(10pmol) Ah 278(5pmol)
14 Ah 274(1pmol) Ah 236(10pmol)
15 Ah 155(1pmol) Ah 270(10pmol) Ah 140(5pmol)
16 Ah 155(1pmol) Ah 270(10pmol) Ah 278(5pmol)
17 Ah 277(1pmol) Ah 271(10pmol) Ah 140(5pmol)
18 Ah 277(1pmol) Ah 271(10pmol) Ah 278(5pmol)
19 Ah 276(1pmol) Ah 236(10pmol) Ah 140(5pmol)
20 Ah 276(1pmol) Ah 236(10pmol) Ah 278(5pmol)
21 Ah 276(1pmol) Ah 236(10pmol)
[0557] 从80℃到20℃(-1℃/分)退火。添加5μl 500mM DMT-MM(根据Kunishima等Tetrahedron(2001),57,1551制备)。于10℃温育5秒,然后35℃温育1秒。重复o/n,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0558] 结果示于图21。
[0559] 结论:
[0560] 检查了两个方面:i)接头长度对交联效率的影响(检查了0、2和5个核苷酸的接头长度),ii)两反应构件之间的间距的重要性。图21中,泳道1-6涉及与位置3退火的构
件寡聚物;泳道7涉及同样的构件,不过泳道7中不存在模板。泳道8-13涉及与位置2退
火的构件寡聚物;泳道14涉及同样的构件寡聚物,不过没有模板存在。泳道15-20涉及与位置1退火的构件寡聚物;泳道21涉及同样的寡聚物,并且没有模板存在。泳道1、3、5、8、
10、12、15、17、19使用其中结合的构件寡聚物之间的间距比泳道2、4、6、9、11、13、16、18和
20的实验中所用模板大一个核苷酸的模板。
[0561] 就交联效率而言的最佳接头长度在所有位置均为0(图21,泳道1、2有关位置3;泳道8、9有关位置2;泳道15、16有关位置)。在与位置1和0结合的构件之间隔开0或1
个核苷酸,对两构件之间的交联效率没有影响(图21,例如对比泳道1和2)。在所有3个
位置观察到非常高的交联效率。利用5个核苷酸的拉链盒,当构件寡聚物在位置3、2和1
退火并且接头长度为0核苷酸时,反应效率大约分别为50%、95%和95%(图21,泳道1、2和8、9以及15、16)。
[0562] 实施例19
[0563] 在本实施例的实验5、8、14和17中,我们分析了设置B中多种接头长度的交联效率。
[0564] 实验
[0565] 混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XIV),并加H2O至50μl。
[0566] 表XIV:
[0567]实验 寡聚物1(32P标记的)(BB1) 寡聚物2(BB0) 寡聚物3(模板)
1 Ah 240(5pmol)
2 Ah 240(5pmol) Ah 82(10pmol) Ah 136(10pmol)
3 Ah 240(5pmol) Ah 82(10pmol) Ah 140(10pmol)
4 Ah 240(5pmol) Ah 82(10pmol)
5 Ah 240(5pmol) Ah 156(10pmol) Ah 154(10pmol)
6 Ah 240(5pmol) Ah 156(10pmol)
7 Ah 202(5pmol)
8 Ah 202(5pmol) Ah 156(10pmol) Ah 154(10pmol)
9 Ah 203(5pmol) Ah 156(10pmol)
10 Ah 203(5pmol)
11 Ah 203(5pmol) Ah 156(10pmol) Ah 154(10pmol)
12 Ah 203(5pmol) Ah 156(10pmol)
13 Ah 36(5pmol)
14 Ah 36(5pmol) Ah 156(10pmol) Ah 154(10pmol)
15 Ah 36(5pmol) Ah 156(10pmol)
16 Ah 142(5pmol)
17 Ah 142(5pmol) Ah 156(10pmol) Ah 154(10pmol)
18 Ah 142(5pmol) Ah 156(10pmol)
[0568] 从80℃到20℃(-1℃/分)退火。添加5μl 500mM DMT-MM(根据Kunishima等Tetrahedron(2001),57,1551制备)。于10℃温育5秒,然后35℃温育1秒。重复o/n,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0569] 结果示于图22。
[0570] 结论:
[0571] 本实验测量了寡聚物设置B中结合于位置3的构件寡聚物之间的反应效率。0、5、30和50个核苷酸的接头长度分别介导大约90%(泳道8)、50%(泳道5)、20-40%(泳道
14)和20-40%(泳道17)的反应效率。换言之,0核苷酸的接头长度对于设置B是最佳的,
就如在设置A中也观察到的那样。在设置B中,位置2和位置1的反应效率达到大约75%
和90%(数据未显示)。
[0572] 实施例20
[0573] 我们利用5、6、7或8个核苷酸的拉链盒长度,在可观察到模板非依赖性反应的条件下(即退火和反应都在高的模板和构件浓度下进行),测试了多种温度下的模板非依赖性反应的程度。
[0574] 实验
[0575] 混合2μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XV),并加H2O至10μl。
[0576] 表XV:
[0577]实验 寡聚物1(32P标记的)(BB1) 寡聚物2(BB0) 寡聚物3(模板)
A Ah 36(2pmol) Ah 51(10pmol) Ah 38(10pmol)
B Ah 36(2pmol) Ah 51(10pmol)
C Ah 36(2pmol) Ah 133(10pmol) Ah 38(10pmol)
D Ah 36(2pmol) Ah 133(10pmol)
E Ah 36(2pmol) Ah 134(10pmol) Ah 38(10pmol)
F Ah 36(2pmol) Ah 134(10pmol)
G Ah 36(2pmol) Ah 135(10pmol) Ah 38(10pmol)
H Ah 36(2pmol) Ah 135(10pmol)
[0578] 从80℃到20℃(-1℃/分)退火。添加1μl 500mM DMT-MM(根据Kunishima等Tetrahedron(2001),57,1551制备)。在多种温度下温育o/n,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0579] 结果示于图23和24。
[0580] 结论:
[0581] 利用5-mer的拉链盒(实验A和B),在9.9℃和50.8℃之间的温度上未观察到模板非依赖性反应(图23,泳道1-12)。利用长度为6、7或8个核苷酸的拉链盒,分别在
5-28℃、5-32℃和5-35℃的温度范围内观察到模板非依赖性反应。因此当进行不能由实验人员(如通过添加试剂)起始的模控反应(templated reactions)时,推荐在不导致模板
非依赖性反应的温度下(例如,对于5、6、7和8个核苷酸的拉链盒长度,分别为25℃、30℃、
34℃和37℃)进行退火和反应。
[0582] 当进行能够由实验人员(例如通过添加试剂或UV照射)起始的反应时,复合物可在较低的温度下形成,以确保高度的拉链盒-拉链盒复合体 形成,之后,过量的构件寡聚物可通过洗涤去掉,然后可起始反应。由于洗涤后构件寡聚物较低的浓度,模板非依赖性反应将会非常微不足道。
[0583] 实施例21
[0584] 在多步骤程序中(其中向模板支架复合物添加构件寡聚物和反应,一次进行一个),重要的是寡聚物(前一步骤所用的,并且仍结合在模板上)不妨碍后添加的构件寡聚物的反应。
[0585] 这里我们检查了设置A和设置B中结合于位置2和位置0处的构件寡聚物之间的交联效率是否受到结合于位置3的构件寡聚物的影响。
[0586] 实验
[0587] 混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XVI),并加H2O至50μl。
[0588] 表XVI:
[0589]实 验 寡聚物1 (32P标记的) 寡聚物1+ 寡 聚 物 2 寡聚物3(模寡聚物4 (竞争性 寡寡聚物5 (竞争性 (BB1) (BB0) 板) 聚物) 模板)
A Ah258(1pmol) Ah202 (10pmol)Ah252 (10pmol)Ah154(5pmol)
B Ah258(1pmol) Ah252 (10pmol)Ah154(5pmol)
C Ah258(1pmol) Ah202 (10pmol)Ah252 (10pmol) Ah 154(5pmol) Ah 260(10 pmol) Ah279 (5pmol)
D Ah258(1pmol) Ah252 (10pmol) Ah 154(5pmol) Ah 260(10 pmol) Ah279 (5pmol)
E Ah272(1pmol) Ah255 (10pmol)Ah270 (10pmol)Ah 140(5pmol)
F Ah272(1pmol) Ah270 (10pmol)Ah 140(5pmol)
[0590] 在不含BB1时从80℃到20℃(-1℃/分)退火。添加BB1,并再次从55℃到30℃退火(-1℃/分)。在缓冲液B+50mM DMT-MM(根据Kunishima等Tetrahedron(2001),57,
1551制备)中稀释100倍。对于A到D,于30℃温育o/n,而对于E和F,于10℃温育5秒
然后35℃温育1秒,重复o/n,然后通过10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0591] 结果示于图25。
[0592] 结论:
[0593] 被占据的位置3不妨碍结合于位置2和0的构件的交联(图25,对比泳道A和泳道B、泳道C和泳道D、泳道E和F)。
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