抑制龋齿病原菌特异性抗体制剂
专利汇可以提供抑制龋齿病原菌特异性抗体制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种通过对健康妊娠母 牛 接种含变异链球菌 抗原 的 疫苗 ，并从免疫接种乳牛分泌的初乳及牛奶中制备抗变异链球菌特异性 抗体 ，制备多种形式制剂，应用于 预防 和 治疗 龋齿的方法，其特征是，通过已知的细菌疫苗技术，制备变异链球菌灭活细菌冻干粉的多价抗原性疫苗，在健康母牛分娩前、后分次肌肉注射，收集免疫乳牛分泌的初乳及牛奶，通过去脂、滤除 酪蛋白 、 超滤 浓缩等程序制备抗变异链球菌的特异性免疫球蛋白，应用于预防和治疗龋齿。，下面是抑制龋齿病原菌特异性抗体制剂专利的具体信息内容。
1.一种通过对健康妊娠母牛接种含变异链球菌抗原的疫苗，并从免疫接种乳牛分泌的初乳 及牛奶中制备抗变异链球菌特异性抗体，制备多种形式制剂，应用于预防和治疗龋齿的 方法，其特征是，通过已知的细菌疫苗技术，制备变异链球菌灭活细菌冻干粉的多价抗 原性疫苗，在健康母牛分娩前、后分次肌肉注射，收集免疫乳牛分泌的初乳及牛奶，通 过去脂、滤除酪旦白、超滤浓缩等程序制备抗变异链球菌的特异性免疫球旦白，应用 于预防和治疗龋齿。
2.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明所选用的，用来制备接种疫 苗的细菌种类是变异链球菌(Streptocaccus mutans，MS)，其细菌种类包括但不限于 变异链球菌AHT(S.mutans)，变异链球菌BHT(S.mutans)，变异链球菌10449(S.mutans 10449)，变异链球菌6715(S.mutans 6715)，这些变异链球菌是引起龋齿的主要细菌。
3.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，所有变异链球菌采用静止培养方法 进行培养，每个培养容器在37℃培养48小时，然后加热至56℃持续两小时，以杀死培 养的细菌，用已灭活的细菌样本接种在细菌培养基上，于37℃温度下孵育24小时，检 测细菌是否完全灭活，只有细菌完全被灭活并且细菌培养试验阴性时，才能进行下一步 骤，消毒的培养物用蒸馏水洗五次，然后在离心机上高速离心收集培养物，离心速度为 4000转/分，已经清洗、高温灭活的细菌培养物浸泡在-90℃的液氮中冷冻后，送入冷冻 干燥装置制备干粉。
4.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，采用不同种类变异链球菌制备的细 菌干粉，被等量称重，这些不同种类的细菌干粉混合，用一定量生理盐水溶液溶解、搅 拌、混匀，制备浓缩的变异链球菌抗原溶液，用生理盐水反复稀释，直至浓度达到下列 标准，采用分光光度计测量，在660埃的波长下，光密度计数在0.5～0.7％光吸收读数， 最终的稀释浓度在2.times.10.sup.8 cells/ml，在0℃下贮存，上述配制程序应 在免疫接种前完成。
5.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，从浓缩液中制备最终浓度的稀释液 在临近免疫接种前制备，常规的程序是应该溶解足够数量的抗原，制备多个小瓶，以接 种多头母牛，为了证实抗原溶液的无菌性，在免疫接种前24小时从冷冻贮存处取出， 抗原浓度用无菌生理盐水调整至最终浓度(2.times.10.sup.8 cells/ml)，并分装 至不同的消毒容器内，取1ml的样品在37℃温度下孵育24小时，以最终检验其灭活程 度，只有完全灭活的抗原溶液才能使用，在接种后瓶中剩余的疫苗应该被丢弃。
6.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，按本发明上述方法制备变异链球菌 疫苗，免疫接种每头乳牛的剂量是5ml变异链球菌抗原溶液(在2.times.10.sup.8 cell/ml浓度下)，注射部位在臀部肌肉最丰厚处，第一次注射在预期分娩日前3～4周， 以后每隔2周注射一次，在整个产奶期始终重复注射。
7.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，选择变异链球菌接种的乳牛，必须 是经过各种常规的兽医学检查并证明健康、无疾病的妊娠母牛，结核菌素试验和其他已 知的传染病检测应该正常，任何有疾病可能性的乳牛的初乳及牛奶都不应该被用来制备 本发明的制剂，而且，在妊娠母牛被免疫接种后，应定期检测其血清样本，直至在其血 清中出现高滴度的变异链球菌抗体后，才能收集其初乳和牛奶作为制备本发明制剂的原 料，其变异链球菌抗体滴度测定方法可以采用任何已知的测定病原菌抗体滴度的方法， 例如ELISA方法等，为了更准确测定其变异链球菌抗体水平，必要时可以用未进行免疫 接种孕牛的血清作为对照。
8.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，从上述被免疫接种乳牛初乳和牛奶 中制备特异性免疫球旦白的方法是，将初乳或牛奶用蒸馏水按1∶3的比例进行稀释，用 离心方式从溶液中去除脂肪，通过酸化、加热稀释液的方式凝集和沉淀酪旦白，用离心 或过滤方式移除已凝集的酪旦白，然后用超微滤膜进行浓缩，无菌过滤，冷冻干燥或喷 雾干燥制成液体状制剂或干粉状制剂，另一种变通的方法也同样可以制备相似纯度的特 异性抗体，即在脱脂初乳或脱脂牛初中滴入酸剂使其酸化后加热及粗过滤，以去除酪旦 白，随后用氯化钠溶液稀释，收集上清液，初步过滤，然后浓缩、中和，最后进行无菌 过滤或冷冻干燥或喷雾干燥得到相似纯度产品。
9.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，采用本发明方法制备的抗变异链球 菌特异性抗体，可以制备成多种形式的药物制剂、营养制剂或强化食品形式，应用于预 防和治疗龋齿，这些制剂或食品包括但不限于：用适当的溶液配制成漱口液，用无糖的 辅料和辅剂调制成口香糖、糖果、冰琪淋等包含上述特异性抗体的食品，制备成标准形 式的口腔清洁粉或牙齿贴膜，或制备成奶粉、茶、咖啡或其他形式饮料，以及其它任何 形式的可以将上述特异性抗体施用至牙齿表面的制剂。
10.按照权利要求1所述的方法，本发明方法制备的抗变异链球菌特异性抗体制剂，既 可以单独应用，也可以与其他药物成份、营养成份联合应用，以达到预防和治疗龋齿的 目的，这些成份包括但不限于木糖醇、氟化物以及其他抗龋齿的成份，在联合应用时， 可以与联合使用的成份制备成混合制剂。
所属技术领域
本发明涉及一种有效抑制或减少龋齿发生的抗变异链球菌特异性抗体制剂，更具体地 说，本发明涉及一种通过对健康妊娠母牛接种含变异链球菌抗原的疫苗，并从已免疫接种 乳牛分泌的初乳及牛奶中制备抗变异链球菌的特异性抗体，制备多种形式制剂，应用于预 防和治疗龋齿。
发明技术背景
现代研究证实，细菌的存在是龋齿发生的主要条件，口腔内有大量的细菌生存，其中 一些细菌尤其是变异链球菌，具有产生有害牙齿的化学物质的能力，龋齿发生取决于牙龈 表面上的小孔底部或正在长出的牙的吻合缝隙被某些菌群所覆盖，如果在菌群中繁殖产生 变异链球菌(Streptococcus mutans，MS)，就会形成龋牙斑。变异链球菌(MS)阳性患者 龋齿发生是一个多原因的过程，普遍认为主要是食物中含有的糖类物质经过咀嚼吞咽，一 部分残留于口腔内，被致龋菌所利用，产生对牙齿具有腐蚀性的物质，从而破坏牙体硬组 织，进而导致龋齿的发生。实验证明，应用特异性抗体对抗该类菌群(MS)，能明显抑制细 菌菌群的生长，尽管变异链球菌存在于大多数人的口腔中，但是通常存在着一定的抵抗因 素，限制其增长，一旦口腔中存在适合细菌繁殖的环境，该细菌菌群就会快速生长，但是 一旦应用某些特异性免疫球旦白，不管是口服形式或者注射途径，均能起到明显抑制其生 长的效果。
Michalek等人已经证明一种由免疫初乳分离的抗变异链球菌抗体能抑制牙齿表面被变 异链球菌感染，在动物实验中证实，添加上述抗变异链球菌抗体到小白鼠的生龋饮食中， 可以保护牙齿不生龋齿。临床试验证实，与对照组相比较，用上述特异性抗体溶液早晚漱 口一分钟，连续使用两星期，显著减少了年轻人的牙斑中变异链球菌比例，但是这份研究 报告并未给出具体的实施方案，制备工艺及应用技术。
中国发明专利(申请号96199507)公布的技术中，提及免疫接种母牛并制备抗中耳炎 病原菌特异性抗体，尽管其中提到对龋齿的治疗，但是并没有包含变异链球菌抗体，也未 提到对龋齿预防和治疗的具体方法。
本发明所要解决的技术问题是，制备一种成本低廉、含特异性对抗变异链球菌抗体的 制剂，用来抑制或减少龋齿的发生、发展。
发明内容
上述细菌菌种可以从美国细菌培养收集中心(American Culture Collection)获得， 也可以从相关已建立菌种的大学、研究所获得，所获的细菌菌种按规定方法进行培养，控 制菌群的纯度，在确定所获菌种纯度后，可以接种单个菌属在500ml的标准细菌培养基内， 按照规定的方法进行培养。
本发明的技术特征是，所有变异链球菌采用静止培养方法进行培养，每个培养容器在 37℃培养48小时，然后加热至56℃持续两小时，以杀死培养的细菌，用已灭活的细菌样本 接种在细菌培养基上，于37℃温度下孵育24小时，检测细菌是否完全灭活，只有细菌完全 被灭活并且细菌培养试验阴性时，才能进行下一步骤，消毒的培养物用蒸馏水洗五次，然 后在离心机上高速离心收集培养物，离心速度为4000转/分，已经清洗、高温灭活的细菌 培养物浸泡在-90℃的液氮中冷冻后，送入冷冻干燥装置制备干粉。
本发明的技术特征是，采用不同种类变异链球菌制备的细菌干粉，被等量称重，这些 不同种类的细菌干粉混合，用一定量生理盐水溶液溶解、搅拌、混匀，制备浓缩的变异链 球菌抗原溶液，用生理盐水反复稀释，直至浓度达到下列标准，采用分光光度计测量，在 660埃的波长下，光密度计数在0.5～0.7％光吸收读数，最终的稀释浓度在2.times.10.sup. 8cells/ml，在0℃下贮存，上述配制程序应在免疫接种前完成。例如，分别制备变异链 球菌AHT，BHT，10449和6715菌种的细菌干粉，每种菌种细菌干粉称重1克，共计准备细 菌干粉4克，将不同菌种的干粉混合，并用500ml灭菌生理盐水混合制备悬浮液，在500ml 的悬浮液中含有4克变异链球菌干粉，每毫升溶液内含有8毫克的抗原，从上述高浓度悬 浮液中取出1ml样本反复稀释，直至在分光光度计660埃的波长上光密度读数为0.5～0.7 ％的光吸收读数上，最终浓度大约在2.times.10.sup.8 cells/ml，制备的抗原悬浮液 装在多个无菌小瓶内，并在0℃低温下贮存。
本发明的技术特征是，从浓缩液中制备最终浓度的稀释液在临近免疫接种前制备，常 规的程序是应该溶解足够数量的抗原，制备多个小瓶，以接种多头母牛，为了证实抗原溶 液的无菌性，在免疫接种前24小时从冷冻贮存处取出，抗原浓度用无菌生理盐水调整至最 终浓度(2.times.10.sup.8cells/ml)，并分装至不同的消毒容器内，取1ml的样品在 37℃温度下孵育24小时，以最终检验其灭活程度，只有完全灭活的抗原溶液才能使用，在 接种后瓶中乘余的疫苗应该被丢弃。
本发明的技术特征是，按本发明上述方法制备变异链球菌疫苗，免疫接种每头乳牛的 剂量是5ml变异链球菌抗原溶液(在2.times.10.sup.8 cell/ml浓度下)，注射部位 在臀部肌肉最丰厚处，第一次注射在预期分娩日前3～4周，以后每隔2周注射一次，在整 个产奶期始终重复注射。
本发明的技术特征是，选择变异链球菌接种的乳牛，必须是经过各种常规的兽医学检 查并证明健康、无疾病的妊娠母牛，结核菌素试验和其他已知的传染病检测应该正常，任 何有疾病可能性的乳牛的初乳及牛奶都不应该被用来制备本发明的制剂，而且，在妊娠母 牛被免疫接种后，应定期检测其血清样本，直至在其血清中出现高滴度的变异链球菌抗体 后，才能收集其初乳和牛奶作为制备本发明制剂的原料，其变异链球菌抗体滴度测定方法 可以采用任何已知的测定病原菌抗体滴度的方法，例如ELISA方法等，为了更准确测定其 变异链球菌抗体水平，必要时可以用未进行免疫接种孕牛的血清作为对照。
本发明的技术特征是，从上述被免疫接种乳牛初乳和牛奶中制备特异性免疫球旦白的 方法是，将初乳或牛奶用蒸馏水按1∶3的比例进行稀释，用离心方式从溶液中去除脂肪， 通过酸化、加热稀释液的方式凝集和沉淀酪旦白，用离心或过滤方式移除包凝集的酪旦白， 然后用超微滤膜进行浓缩，无菌过滤，冷冻干燥或喷雾干燥制成液体状制剂或干粉状制剂。 另一种变通的方法也同样可以制备相似纯度的特异性抗体，即在脱脂初乳或脱脂牛初中滴 入酸剂使其酸化后加热及粗过滤，以去除酪旦白，随后用氯化钠溶液稀释，收集上清液， 初步过滤，然后浓缩、中和，最后进行无菌过滤或冷冻干燥或喷雾干燥得到相似纯度产品。
本发明的技术特征是，采用本发明方法制备的抗变异链球菌特异性抗体，可以制备成 多种形式的药物制剂、营养制剂或强化食品形式，应用于预防和治疗龋齿，这些制剂或食 品包括但不限于：用适当的溶液配制成漱口液，用无糖的辅料和辅剂调制成口香糖、糖果、 冰琪淋等包含上述特异性抗体的食品，制备成标准形式的口腔清洁粉或牙齿贴膜，或制备 成奶粉、茶、咖啡或其他形式饮料，以及其它任何形式的可以将上述特异性抗体施用至牙 齿表面的制剂。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的抗变异链球菌特异性抗体制剂，既可以单独 应用，也可以与其他药物成份、营养成份联合应用，以达到预防和治疗龋齿的目的，这些 成份包括但不限于木糖醇、氟化物以及其他抗龋齿的成份，在联合应用时，可以与联合使 用的成份制备成混合制剂。
本发明的有益效果是，与现有技术相比，本发明应用免疫学和生物工程技术方法制备 的抗变异链球菌免疫球旦白，能有效对抗口腔中变异链球菌，抑制或减少龋齿的发生和发 展，方法简单、效果显著、成本低廉，有推广价值。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
制备变异链球菌疫苗
收集变异链球菌AHT，BHT，10449和6715菌种，分别接种于标准细菌培养基内，在 37℃温度下培养38小时，用离心机以4000转/分速度离心收集细菌，用双蒸馏水清洗五次， 用0.1m的磷酸缓冲液稀释至最终浓度为2.times.10.sup.8 cells/ml，用60℃持续30 分钟灭活细菌，放置在4℃冰箱中冷藏。量取4份等量的不同菌种(变异链球菌AHT，BHT， 10449和6715)灭活细菌溶液，混合制备复合抗原溶液。
实施例2
免疫接种变异链球菌疫苗
选择健康妊娠母牛，按已知的兽医学方法进行全面健康检查，采用实施例1制备的疫 苗，在预定分娩日前三周，于妊娠母牛臀部肌肉注射5ml疫苗，以后每周重复注射一次， 每次注射部位、注射剂量相同，注射后次日开始从接种母牛血清中检测抗变异链球菌抗体 滴度，直至抗体滴度比对照组抗体滴度明显升高时，才确定使用其初乳和牛奶作为原料。
实施例3
制备抗变异链球菌抗体
取免疫乳牛分娩后10小时内的冰冻牛初乳13升，在5℃～10℃下化冻，用离心机以 3000转/分速度离心20分钟脱脂，用700ml 1N HCL酸化初乳，调节PH至4.8，于40℃温 度加热30分钟，于4℃静置贮存过夜，用泵抽上清液通过尼龙布过滤器进入贮存容器，滤 除酪旦白，用0.9％氯化钠溶液稀释到26升。用稀释上清液通过中空纤维柱过滤，中空纤 维柱孔径为0.4μm，表面积为3m2，纤维直径1.2mm，用100升0.9％浓度的氯化钠溶液滤过， 使用压力超过大气压0.2～0.6巴，在进行第一次粗滤同时，产生的滤液再通过由三个中空 纤维柱组成的系统进行第二次粗滤，每个柱的分离极限为10,000D，表面积为1.4M2，在此 系统中，第一次粗滤的滤液得到初步浓缩，然后用100升0.9％浓度的氯化钠溶液透析过滤， 最后再浓缩到2.3升。所得到特异性免疫球旦白含量为6％，用已知方法过滤消毒，用冷冻 干燥方法制备干粉。
实施例4
测定抗变异链球菌抗体滴度
取实施例3制备的抗变异链球菌抗体干粉，用ELISA方法测定变异链球菌抗体滴度， 以未免疫接种的母牛初乳作为对照，结果显示，本发明方法制备的抗变异链球菌制剂中抗 变异链球菌抗体的滴度高于对照组近一百倍。
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