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RANK+巨噬细胞在用于制备治疗自然流产保胎药物中的用途

阅读：935发布：2020-05-22

专利汇可以提供RANK+巨噬细胞在用于制备治疗自然流产保胎药物中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属医药技术领域，涉及RANK+巨噬细胞的用途，具体涉及RANK+巨噬细胞用于制备自然流产保胎治疗药物中的用途。本发明经体外实验和体内动物试验显示，早孕期母-胎界面RANKL/RANK 信号可明显诱导蜕膜巨噬细胞向M2表型分化，进而诱导母-胎界面Th2免疫偏移，利于正常妊娠的建立和维持；过继转输RANK+巨噬细胞可显著逆转因巨噬细胞功能异常所致的孕鼠胚胎吸收，可进一步用于制备自然流产的保胎治疗药物。，下面是RANK+巨噬细胞在用于制备治疗自然流产保胎药物中的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1. 在用于制备治疗自然流产药物中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，过继转输可诱导向M2耐受表型分化和Th2免疫偏移。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，过继转输可改善因数量和功能异常所致的胚胎吸收。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，采用过继转输的方法用于制定自然流产治疗干预策略。
5. 中RANK表达水平用于评估功能状态及评估自然流产病因中的用途。
6.按权利要求5所述的用途，其特征在于，不明原因自然流产患者中RANK表达水平显著降低，且偏向M1表型。

说明书全文

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RANK+巨噬细胞在用于制备治疗自然流产保胎药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明属医药技术领域，涉及RANK+巨噬细胞的用途，具体涉及RANK+巨噬细胞用于治疗自然流产保胎中的用途。经体外实验和体内动物试验显示，早孕期母-胎界面RANKL/RANK 信号可明显诱导蜕膜巨噬细胞向M2表型分化，进而诱导母-胎界面Th2免疫偏移，利于正常妊娠的建立和维持。过继转输RANK+巨噬细胞可明显逆转因巨噬细胞功能异常所致的小鼠胚胎吸收，进一步可用于自然流产的保胎治疗。

背景技术

[0002] 研究表明，正常妊娠类似于成功的同种异体移植，母体不仅不排斥携带父系抗原的胚胎，而且通过精细的母-胎对话建立独特的母-胎界面免疫耐受微环境，允许胎儿在子宫内生长发育直至分娩。母-胎界面主要由胚胎来源的滋养细胞(Trophoblasts,Tros)与母体来源的蜕膜基质细胞(Decidual Stromal Cells，DSCs)和蜕膜免疫细胞(Decidual Immune Cells,DICs)共同组成。母体来源的细胞，特别是胎儿来源的滋养细胞，与这些细胞交互对话所产生的各种细胞因子及激素等共同构筑母-胎界面特殊的免疫耐受微环境，从而得以维持生理性妊娠。正常母-胎交互对话是建立和维持成功妊娠的关键。母-胎免疫调节是母-胎对话的核心内容，一旦出现异常母-胎交互对话，必将导致滋养细胞功能异常及母体对胚胎的免疫排斥，表现为早期妊娠失败(如反复自然流产，RSA)和中晚期妊娠并发症(如胎儿宫内生长受限、子痫前期等)，严重危害母婴健康。

[0003] 近年统计资料表明，自然流产发病率高达15％。即便是在辅助生育技术飞速发展的今天，仍不能克服因母-胎免疫调节紊乱所造成的妊娠失败。研究显示，流产次数越多，再次妊娠时流产发生率越高，如2次自然流产后，第3次妊娠时自然流产的风险约为30％；3次以上自然流产后，再次妊娠时自然流产风险高达45％；其中免疫因素所致复发性自然流产(RSA)约占总RSA的63％，因此，母-胎免疫调节紊乱是RSA发生和发展的重要原因。然而迄今为止，母-胎界面发生的这些异常生物学事件导致RSA的分子机制仍不明确，因此母-胎交互对话异常致妊娠相关疾病的研究面临着重大挑战与机遇，基于这些机制研究的RSA早期预警和干预策略有待建立。

[0004] 研究显示，母-胎界面存在大量巨噬细胞(macrophage， )，占蜕膜免疫细胞的近20％，蜕膜 (decidual )参与胚胎植入、螺旋动脉重塑、胎盘发育、宫颈成熟和分娩等妊娠生理过程。主要为免疫调节表型，对同种异体胎儿表现为免疫耐受状态；原因可能在于：1) 分泌高水平的IL-10；2)70％以上的表达CD209；3) 分泌PGE2，促进抑制效应；4)GM-CSF和IL-10可促进表达M2表型分子(如CD163、CD206和CD209)；然而母-胎界面局部表型及功能在生理性妊娠中的调节作用，及其功能异常诱发早期妊娠失败(即自然流产)的分子机制迄今远不清楚。

[0005] NF-κB受体活化因子的配体RANKL(又被称为TNFSF11、OPGL或TRANCE)、受体RANK(又被称为TNFRSF11A或CD265)及其诱饵受体(decoy receptor)骨保护蛋白OPG(又被称为TNFRSF11B)是调控破骨细胞的分化及骨代谢的最基本分子。RANKL免疫调节作用存在复杂性和两面性。一方面，它促进树突状细胞存活，诱导T细胞活化；另一方面在黏膜(如皮肤和肠道)局部，它又能通过作用粘膜屏障中DC表面RANK，诱导调节性T细胞扩增，从而诱导黏膜组织对外来抗原(如食物等)呈现免疫耐受状态。这一差异作用可能与黏膜组织局部微环境有关，但具体机制仍有待阐明。本发明的前期研究发现DSCs共表达RANKL和其受体RANK。RANKL通过促进趋化因子CCL2的表达进一步促进DSCs增殖，从而利于子宫内膜蜕膜化。

[0006] 基于现有技术的现状，本申请的发明人拟通过实验研究RANKL/RANK信号在母-胎界面分化发育和母-胎免疫调节中的作用，进一步评估过继转输RANK+ 在治疗因功能异常所致自然流产中的潜在价值，提供RANK+ 在用于制备治疗自然流产保胎药物中的用途和方法，为自然流产的临床治疗提供新的干预策略和新思路。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供RANK+巨噬细胞在用于制备治疗自然流产保胎药物中的用途，尤其涉及RANK+ 在用于制备治疗自然流产保胎药物中的用途。

[0008] 本发明中通过体外研究RANKL/RANK信号在调节母-胎界面分化发育和母-胎免疫中的作用，进一步通过体内试验评估过继转输RANK+ 在治疗因功能异常所致的自然流产中的价值；提供了RANK+ 用于制备自然流产保胎治疗药物的用途。

[0009] 本发明的实验结果结果显示：1)母-胎界面Tros和DSCs均高表达RANKL，高表达其受体RANK；RANK+ 更趋向于M2耐受表型，Tros和DSCs通过表达RANKL，作用于表面受体RANK，可进一步诱导M2表型分化和Th2型免疫偏移，利于正常妊娠的建立和维持；2)相对于正常野生型孕鼠，RANKL敲除(RANKL-/-)孕鼠的胚胎吸收率显著升高，提示RANKL/RANK信号异常减弱可诱导小鼠自然流产；3)耗竭孕鼠水平导致孕鼠胚胎吸收率大幅度升高，但是过继转输RANK+ 后，孕鼠的胚胎吸收率明显得到改善，提示该RANK+ 可进一步用于制备自然流产的保胎治疗药物。

[0010] 具体而言，本发明公开了一种通过过继转输RANK+ 诱导母-胎界面向M2表型分化和Th2型免疫偏移，进而发挥改善因异常引起的孕鼠胚胎吸收，所述RANK+巨噬细胞可用于制备治疗自然流产的药物。

[0011] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0012] 收集正常早孕的绒毛和蜕膜组织，结果显示早孕期母-胎界面Tros和DSCs均高表+达RANKL(如图1所示)，的RANKL表达水平明显高于外周血单核细胞，且RANK 更趋向于M2表型(CD163highCD206highCD209highIL-10high)(如图2所示)，体外实验显示，Tros和DSCs过表达RANKL后可促进向M2表型分化(CD163、CD206、CD209和IL-10水平均升高；
CD86、IL-12等均降低)；尾静脉过继转输RANK+ 可到达孕鼠子宫，并促进子宫向M2表型分化(如图3所示)；进一步研究发现Tros和DSCs过表达RANKL可诱导Th2免疫偏移(Th2细胞升高，Th1细胞降低)；同样过继转输RANK+ 可诱导孕鼠子宫Th2免疫偏移(如图4所示)；
比较正常和不明原因复发性自然流产(流产大于等于3次)患者绒毛和蜕膜组织发现，流产患者Tros和DSCs的RANKL表达水平显著降低；流产患者的RANK水平亦降低，且偏向M1表型(如图5所示)；相对于正常野生型孕鼠，RANKL-/-孕鼠的胚胎吸收率显著升高(如图6所示)；腹腔注射Clodronate Liposomes(购自FormuMax)耗竭孕鼠水平导致孕鼠胚胎吸收率大幅度升高；通过流式分选获得脾脏CD45+F4/80+RANK+ (流式抗体均购自Biolegend)，过继转输RANK+ (2*105细胞/只)后孕鼠的胚胎吸收率明显得到改善(如图7所示)。

[0013] 本发明提供了RANK+巨噬细胞用于自然流产保胎治疗药物的用途；尤其是经体外实验和动物实验证实，过继转输RANK+ 可诱导母-胎界面向M2表型分化和Th2型免疫偏移，进而改善因异常引起的孕鼠胚胎吸收，所述的RANK+巨噬细胞可用于制备自然流产的保胎治疗药物。附图说明

[0014] 图1是RANKL在正常早孕期绒毛Tros和蜕膜DSCs中的表达，

[0015] 其中，Villi：正常早孕绒毛组织，

[0016] Decidua：正常早孕蜕膜组织，

[0017] DSCs：蜕膜基质细胞，

[0018] Tros：滋养细胞，

[0019] DSCs+Tros：蜕膜基质细胞和滋养细胞共培养，

[0020] Original magnification:×200，***P<0.001。

[0021] 图2是高表达RANK，

[0022] 其中，NK：自然杀伤细胞，NKT：自然杀伤性T细胞，巨噬细胞

[0023] pMo：外周血单核细胞，

[0024] 蜕膜巨噬细胞，

[0025] MFI:平均荧光密度；*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001；NS:无显著差异。

[0026] 图3是母-胎界面RANKL/RANK信号促进向M2型分化，

[0027] 其中，Ctrl-D+J：与对照组DSCs和JEG-3细胞(一种滋养细胞肿瘤细胞系)共培养的[0028] RANKL+-D+J：与过表达RANKL的DSCs和JEG-3细胞共培养的

[0029] RANKL+：过继转输RANKL+ (2*105细胞/只)，

[0030] RANKL-：过继转输RANKL- (2*105细胞/只)，*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001；NS:无显著差异。

[0031] 图4是经母-胎界面RANKL/RANK信号刺激的进一步诱导 T细胞向Th2分化，

[0032] 其中， -CD4+T：和 T细胞共培养，

[0033] D+T+ -CD4+T：蜕膜基质细胞、滋养细胞和共培养后，进一步与 T细胞共培养

[0034] rhOPG：重组人OPG蛋白(100ng/ml)，

[0035] α-RANKL：抗人RANKL中和性抗体，*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001。

[0036] 图5是比较正常和不明原因反复自然流产患者母-胎界面的RANKL和RANK表达，[0037] 其中，Normal：正常早孕妇女，

[0038] Abortion：不明原因反复自然流产患者，**P<0.01and***P<0.001。

[0039] 图6是RANKL-/-孕鼠胚胎吸收率显著升高，

[0040] 其中，WT：野生型孕鼠

[0041] RANKL-/-：RANKL-/-孕鼠

[0042] 吸收胚胎因伴有缺血、出血和坏死，其体积明显小于正常存活胚胎，此外吸收胚胎与存活胚胎的色泽表现亦有明显差别，前者为黑褐色(如图红色箭头所示)而后者为粉红色。据此计数吸收胚胎数和存活胚胎数。胚胎吸收率R(Embryo-resobing rate％)：R＝Re/(Re+F)×100％。Re为吸收胚胎数，F为存活胚胎数，***P<0.001。

[0043] 图7是RANK+ 过继转输改善耗竭所致胚胎吸收，

[0044] 其中，Ctrl：PBS处理的对照组孕鼠，

[0045] 腹腔注射Clodronate Liposomes后耗竭的孕鼠，

[0046] RANKL+ 过继转输RANKL+ (2*105细胞/只)，

[0047] RANKL- 过继转输RANKL- (2*105细胞/只)，*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001。

具体实施方式

[0048] 实施例1 分析RANKL和RANK在母-胎界面的表达水平

[0049] 1)正常早孕期母-胎界面Tros和DSCs高表达RANKL

[0050] 首先采用免疫组织化学染色法检测，发现正常早孕期母-胎界面Tros和DSCs均高表达RANKL(RANKL和RANK免疫组化抗体均来自R&D公司)(如图1A所示)；随后原代分离培养获得Tros和DSCs，利用ELISA检测(ELISA 试剂盒来自R&D公司)发现Tros和DSCs均能分泌可溶性RANKL(如图1B，1C所示)，且两种细胞共培养时可溶性RANKL的分泌水平最高(如图1C所示)；

[0051] 2) 高表达RANK，且RANK+ 更趋向于M2表型

[0052] 收集正常早孕蜕膜组织，原代分离获得蜕膜免疫细胞(DIC)，结果发现，蜕膜NK、NKT和均高表达RANK(流式抗体均来自Biolgend公司)(如图2A所示)。相对于外周血单核细胞，的RANKL表达水平更高(如图2B，2C所示)。此外，相对于RANK— RANK+更趋向于M2表型(CD163highCD206highCD209highIL-10high)(如图2C所示)。

[0053] 实施例2 过继转输RANK+ 诱导孕鼠子宫向M2耐受表型分化体内实验[0054] 通过质粒转染(转染试剂来自Invitrogen公司)，构建RANKL过表达的DSCs和JEG-3细胞，将其与共培养后发现Tros和DSCs过表达RANKL后可促进向M2表型分化(CD163、CD206、CD209和IL-10水平均升高；CD86、IL-12等均降低)(流式抗体均购自Biolegend)(如图3A，3B所示)，继而，如图3C所示，利用流式分选获得脾脏CD45+F4/80+RANK+和CD45+F4/80+RANK- (流式抗体均购自Biolegend)，用PKH-67染料(绿色荧光，sigma公司)分别标记上述两种细胞，健康C57B/L6小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)合笼后，见阴栓为孕D0天，分别在D1和D4天腹腔注射Clodronate Liposomes(购自FormuMax)200ul和100ul来耗竭孕鼠于D5天分别给孕鼠尾静脉过继转输PKH-67-RANK+ (2*105细胞/只)或PKH-67-RANK- (2*105细胞/只)，结果显示，过继转输的PKH-67-RANK+ 或PKH-67-RANK- 均能到达孕鼠子宫，但是到达孕鼠子宫的PKH-67-RANK+ 转输组细胞更多(如图3D所示)，此外，相对于PKH-67-RANK- 组，PKH-67-RANK+ 转输组孕鼠子宫偏向M2表型(CD206和CD209水平均升高；CD80和CD86均降低)。

[0055] 实施例3 过继转输RANK+ 诱导孕鼠子宫Th2免疫偏移体内实验

[0056] 分别将与或不与Tros和DSCs共培养的与蜕膜naiveT细胞进行共培养(如图4A所示)，结果显示，经Tros和DSCs来源的RANKL训导后的可进一步诱导 T细胞向Th2表型分化(IL-4、IL-10和GATA-3表达升高；相反，TNF-α、IFN-γ和T-bet水平降低)(ELSIA试剂盒来自R&D公司)(如图4B-4E所示)，同上法发现，相对于PKH-67-RANK- 组，PKH-67-RANK+ 转输组孕鼠子宫CD4+T细胞偏向Th2分化(GATA-3表达升高；相反T-bet水平降低)(流式抗体均购自Biolegend)(如图4F所示)。

[0057] 实施例4 不明原因复发性自然流产患者母-胎界面RANKL和RANK异常低表达[0058] 分别收集正常和不明原因复发性自然流产(流产大于等于3次)患者绒毛和蜕膜组织后进行免疫组化染色发现，流产患者Tros和DSCs的RANKL表达水平显著降低(如图5A所示)；流产患者的RANK水平亦降低(如图5B，5C所示)，且偏向M1表型(如图5D，5E所示)。

[0059] 实施例5 过继转输RANK+ 改善因耗竭所致的孕鼠胚胎吸收体内实验[0060] 1)RANKL-/-孕鼠的胚胎吸收率显著升高

[0061] 比较正常野生型孕鼠和RANKL-/-(RANKL-/-购自美国Jackson实验室)孕鼠的胚胎吸收率，结果显示，相对于正常野生型孕鼠，RANKL-/-孕鼠的胚胎吸收率显著升高(如图6所示，红色箭头为吸收胚胎，余为正常胚胎)；

[0062] 2)过继转输RANK+ 可改善因耗竭所致的孕鼠胚胎吸收

[0063] 同上法借助腹腔注射Clodronate Liposomes耗竭孕鼠 (耗竭效率如图7A，7B所示)，发现孕鼠耗竭后胚胎吸收率大幅度升高(如图7C，7D所示)；通过流式分选获得脾脏CD45+F4/80+RANK+ (流式抗体均购自Biolegend)，过继转输RANK+ (2*105细胞/只)后孕鼠的胚胎吸收率明显得到改善(如图7E所示)。

[0064] 本发明经体外和体内试验结果证实，母-胎界面RANKL/RANK信号可促进向M2分化和Th2免疫偏移，利于正常妊娠建立和维持；过继转输RANK+ 可改善因数量和功能异常所致的孕鼠胚胎吸收。

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