先兆子痫发生在妊娠后半期并且与重要的母亲和胎儿发病和死亡 有关。目前，没有有效的筛选试验来诊断或评价发生这种疾病和相关高 血压病症的风险。结果是妊娠女性直到发生该病症相关并发症(包括血 压升高和蛋白尿)后很久才接受有效的监测或治疗。此外，由于在妊娠 早期阶段护理人员没有可排除妊娠女性具有风险的有效手段，因此很少 或没有发生这些病症之风险的妊娠女性必须在她们整个妊娠期间经受 不必要的症状检验。
如本文所述，申请人假设由于先兆子痫持续伴随母体肾脏的功能和 形态学紊乱，因此患先兆子痫的妊娠女性的尿中血管发生因子水平被改 变，并将提供更有效和更少侵入性的筛选方法以鉴定或辅助鉴定患高血 压病症包括先兆子痫的妊娠女性。
本文所用的“先兆子痫”根据公认的标准定义为在每个体间隔4到 6小时有两次，血压至少140/90mmHg并且在24小时尿蛋白质排泄中 尿中排泄至少0.3g蛋白质(或试条试验中至少+1或更大)。本文所用 的“重度先兆子痫”也根据公认标准定义为间隔6小时至少两次血压至 少160/110mmHg并且在24小时尿蛋白排泄中大于5克蛋白质或在试 条试验上持续+3蛋白尿。重度先兆子痫可包括HELLP综合征(溶血、 肝脏酶升高、血小板计数低)。重度先兆子痫的其它要素可包括根据美 国人口统计小于10％百分比中的宫内发育迟缓(IUGR)，持续性神经 症状(头痛、视觉障碍)、上腹痛、少尿(少于500mL/24h)、血清肌酸 酐大于1.0mg/dL、肝脏酶升高(大于正常两倍)、血小板减少(＜100,000 个细胞/μL)。
本文描述的是与以下相关的方法和组合物，检测和/或监测妊娠女性 尿样中血管发生因子尤其是VEGF、PlGF和sFlt-1的水平，以及这种 水平与在妊娠女性妊娠过程中特定点处妊娠女性将发生高血压病症比 如先兆子痫的可能性之间的关系。“妊娠过程”指很多妊娠阶段或时期， 包括贯穿每个三月期以及从一个三月期向下一个三月期过渡期间的妊 娠。“妊娠过程”包括正常妊娠和发生高血压病症的妊娠的妊娠期。“正 常妊娠”指没有并发症并且该女性不发生高血压病症的妊娠。
在公开的方法中，妊娠女性可诊断为具有任何以下高血压病症或者 发生任何这些病症的风险增加：先兆子痫、子痫、轻度先兆子痫、慢性 高血压、EPH妊娠中毒、妊娠高血压、并发先兆子痫(包括慢性高血 压、慢性肾病或狼疮基础上发生的先兆子痫)、HELLP综合征(溶血、 肝脏酶升高、血小板计数低)或肾病。虽然本发明参考妊娠女性进行描 述，但是本文描述的方法还可以用于评价非妊娠女性在妊娠期间发生高 血压病症的风险。
本文描述的方法和组合物能通过检测和/或监测妊娠女性尿样中血 管发生标志物水平来实现评价和/或监测妊娠女性发生高血压病症的风 险。如本文所述，这可通过在妊娠期间不同阶段获取尿样并分析其血管 发生因子水平来实施。所得值还可与已知标准相比较。本文所用的“适 当标准”指从参照对象中所得尿中血管发生标志物的水平。可从正常妊 娠的妊娠女性尿样或从证实患有高血压病症比如先兆子痫的妊娠女性 尿样中确定适当的标准浓度(参照对象)。形成适当标准基础的样品来 自参照对象，当获取样品时，所述参照对象的妊娠周与获取试验样品时 试验对象所处妊娠周相对应。可以在从试验对象获取尿样的同时获取并 分析参照样品。作为替代，采用统计学研究和常规试验可前瞻性或回顾 性确定标准表达水平以评价试验对象尿样。本领域一般技术人员采用公 知方法可确定标准表达水平。
可经本发明方法评价的尿样包含足够水平的感兴趣血管发生因子 用于经本文所述评价技术来检测。具体而言，尿样必须具有可检测水平 的任一种VEGF、PlGF和sFlt-1，所用评价技术适用于此。如果当分析 时样品中含有可检测水平的感兴趣血管发生标志物，可在收集后立即或 晚些时间分析尿样。例如可在-70℃冷冻尿样和/或在用稳定或保存感兴趣 血管发生标志物的试剂预处理的容器中混合、合并或保存。在一个优选实 施方案中，从早晨第一次小便中收集尿样。
本文所用的术语“血管发生标志物”指一种或多种分子比如VEGF、 PlGF和sFlt-1，其可单独或组合使用于检测或辅助检测发生高血压病症 的风险；监测高血压病症相关的妊娠并发症进程；和/或监测治疗高血 压病症相关的妊娠并发症的有效性。
本文所用的术语“多肽”指不限定具体长度的氨基酸聚合物。因此， 肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义内。
可通过检测已转录分子表达或其相应蛋白质的多种公知方法的任 何一种评价可用于本发明方法的血管发生标志物水平。这种方法的非限 定性实例包括检测分泌蛋白的免疫学法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或 活性分析、核酸杂交方法、核酸逆转录法和核酸扩增法。在一个实施方 案中，采用ELISA分析评价血管发生标志物水平。
在某些实施方案中，本发明包括在测量血管发生标志物水平之前采 用一种或多种稳定剂处理妊娠女性的尿样和/或采用一种或多种稳定剂 预处理用于收集这种尿样的容器。术语“稳定剂”指一种或多种能用于 防止血管发生标志物降解的分子比如多肽或核酸。在一个实施方案中， 稳定剂是蛋白酶抑制剂，包括任何以下物质：4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟 (AEBSF)和Pefabloc SC、抗蛋白酶(Antipain)和抗蛋白酶二盐酸盐、 抑酶肽(Aprotinin)、苯甲脒(Benzamidine)和盐酸苯甲脒、苯丁抑制素 (Bestatin)、抑糜酶素(Chymostatin)、E-64(L-反式-环氧琥珀酰-亮氨 酰胺-(4-胍基)-丁烷或N-[N-(L-反式-羧基环氧乙烷-2-羰基)-L-亮氨酰]-精胺 (N-[N-(L-trans-carboxyoxiran-2-carbonul)-L-leucyl]-agmatine)、乙二胺 四乙酸及其钠盐(EDTA-Na2)、亮抑酶肽(Leupeptin)、乙基马来酰亚胺、 胃酶抑素(Pepstatin)和胃酶抑素A、膦酰二肽(phosphoramidon)、叠 氮化钠、胰蛋白酶抑制剂或ε-氨基己酸。
申请人已证明患有高血压病症的妊娠女性尿中sFlt-1显著增加并且 尿PlGF显著降低。本发明特征在于：测量尿样中PlGF和sFlt-1浓度 并运用这些对立生长因子的比率来从具有其它形式高血压病症包括伴 随或不伴随慢性高血压的轻度先兆子痫的妊娠女性以及正常血压对照 中区分出具有重度先兆子痫的妊娠女性。本发明的方法还可用于评价妊 娠女性发生特定高血压病症并发症包括先兆子痫的风险。这样的并发症 可包括剖腹产分娩、血清尿酸增加、收缩压和舒张压增加、试条蛋白尿、 孕次(gravidity)、分娩时胎儿体重、胎盘剥离、IUGR、溶血、血小板 减少、肝脏酶升高和HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板计数 低)。
在某些实施方案中，可使用公式分析血管发生标志物的浓度或水平 的测定结果。所得值提供有关妊娠女性将发生高血压病症比如先兆子痫 可能性的信息。本文所用的术语“公式”指任何数学表达式、运算法则 或其它量度，其可用于评价感兴趣的血管发生标志物水平是否指示妊娠 女性具有高血压病症和/或高血压病症的特定并发症或者有发生这些疾 病的风险。
在一个实施方案中，使用公式计算妊娠女性的uFP。对于本发明的 目的，术语“uFP”指log[sFlt-1/PlFG×100]。在本发明的一个方面， uFP超过1.4是风险增加的先兆指标，妊娠女性将需要治疗以防止发生 或恶化高血压病症相关症状。在本发明的另一个方面，uFP超过2.1指 示妊娠女性具有重度先兆子痫或处于发生重度先兆子痫的风险。在本发 明的又一方面，uFP超过2.1指示妊娠女性有剖腹产分娩的风险。
在一些实施方案中，本发明提供涉及本发明方法和/或组合物的试剂 盒。试剂可以是标记化合物或能检测对应尿样中本发明血管发生标志物 的多肽以及用于检测多肽量的工具(例如结合该多肽的抗体)。用于和 可用于本发明方法中血管发生标志物相对应多肽相结合的适当试剂包 括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可 包括，例如：(1)第一抗体(例如，附着于固体支持物)，其结合对应 本发明血管发生标志物的多肽；和，任选地，(2)第二种不同抗体，其 或与所述多肽相结合或与第一抗体相结合并且与可检测标记相偶联。
采用适当的样品来比较待测样品中所得结果。
所述试剂盒还可以包含其它的成分比如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳 定剂。试剂盒还可以进一步包含检测可检测标记必需的成分(例如酶或 底物)。
试剂盒的每个成分可被包封于单独容器内并且所有各种容器可包 含在单个包装中，还附带说明书来解释采用试剂盒进行分析的结果。可 采用稳定剂预处理所述容器和/或稳定剂可以是试剂盒的成分。
本发明还涉及评价患重度先兆子痫的女性中是否发生肾小球损伤 可以解释尿样中血管发生标志物的释放增加。最近报道的研究支持这样 的观点：胎盘形成缺陷导致胎盘缺血随后全身性释放损伤母亲血管内皮 的细胞毒性产物。申请人假定血管发生中的这种紊乱还间接作用于母亲 的全身脉管系统，包括肾脏中(19，20，21，22，23)。由于肾小球内皮增 生是先兆子痫的常见形态学损害，申请人关注尿样中血管发生标志物的 水平增加是否因为由于肾小球损伤而导致这些标志物在尿中的分泌增 加，或者尿排泄增加是否反映了胎盘或全身性血管合成的增加。申请人 发现血清中血管发生因子水平不是一贯地与尿中该因子水平相关联。他 们还发现患有重度先兆子痫的女性在临床明显的疾病时VEGF和sFlt-1 的排泄分数增加，无论由蛋白尿程度所反映的肾小球完整性是否丧失。
本文所用的不定冠词和定冠词指至少一个该冠词的语法对象。
本文所用的术语“包括”意思是指短语“包括但不限于”，并且可 与“包括但不限于”互换使用。
本文所用的术语“比如”意思是指短语“比如但不限于”，并且可 与“比如但不限于”互换使用。
虽然所提供的详细描述参考VEGF、PlGF和sFlt-1，本领域技术人 员将清楚知道本描述还可应用于每种生长因子的家族成员、类似物、天 然存在的等位基因变体、异构体、前体和/或变体。
除非另外指出，本发明的实施将运用在本领域技术范围内的细胞生 物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规技 术。这些技术被描述于文献中。
实施例
在此一般性描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发 明，包括这些实施例仅仅是为了举例说明本发明某些方面的目的，而不 是意图限制本发明。
实施例1
患高血压病症的妊娠女性中sFlt-1水平增加和PlGF水平降低
参与者
采用2004年2月到8月之间Yale New Haven医院接纳的68名女性 的尿样。在耶鲁大学人类调查委员会(Human Investigation Committee of Yale University)批准的规则下收集样品。从所有参与者那里得到书面知 情同意书。基于月经日期和/或妊娠20周之前的超声检查确认胎龄。所有 请求加入研究的女性同意参加。申请人要求从允许进入产房以及分娩前高 低风险病房(the antepartum High and Low Risk Units)的妊娠女性中招 收并预期招收到患者。所招收患者都没有被排除在最后分析之外。
测试以下组的女性：重度先兆子痫(sPE，n＝17)、不满足重度先兆 子痫标准与妊娠相关的高血压/蛋白尿病症(pHTN，n＝21)、健康妊娠 对照(P-CTR，n＝16)、和健康非妊娠育龄期女性(NP-CTR，n＝14)。 本文所用的“先兆子痫”根据公认标准定义为在每个体间隔4到6小时 有两次，舒张血压至少140/90mmHg并且在24小时尿蛋白质排泄中尿 中排泄至少0.3g蛋白质(或试条试验中蛋白尿至少+1)。本文所用的“重 度先兆子痫(sPE)”被定义为HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血 小板计数低)，在6小时间隔中至少2次血压＞160/110mmHg、在24小 时尿蛋白排泄中蛋白质＞5克、或在试条试验上持续+3蛋白尿。该定义 的其它要素包括根据美国人口统计小于10％百分比中的宫内发育迟缓 (IUGR)，持续性神经症状(头痛、视觉障碍)、上腹痛、少尿(少于 500mL/24h)、血清肌酸酐＞1.0mg/dL、肝脏酶升高(大于正常两倍)、 血小板减少(＜100,000个细胞/μL)。“慢性高血压(crHTN)”指妊娠前 或妊娠20周之前血压持续升高＞140/90mmHg。“蛋白尿”被定义为24 小时尿收集物中蛋白质＞300mg。为了评价胎盘高血压病症的组织学变 化，申请人咨询了不了解本研究结果的临床病理学家产生的病理学报 告。38名高血压患者的病理学报告中有29名可以使用，并且对以下内 容进行摘要：真皮炎的存在性、体积＞3cc的梗塞、与先兆子痫一致的病 理学变化的征兆(蜕膜血管没有滋养层浸润或生理性转化的征兆)、和/ 或剥离的征兆(含铁血黄素沉积和/或绒毛间血栓)。
68名参加研究的患者中，17名满足sPE标准。在加入时，申请人 仅仅了解女性是否高血压或该女性是否达到sPE标准。由于不能预见高 血压状态的性质，pHTN(n＝21)组是不一致的，由具有crHTN(n＝10)、 轻度先兆子痫(n＝9)或高血压蛋白尿肾病(n＝2，狼疮和肾病综合征) 在先病史的女性组成。
与sPE女性相比较，pHTN组年龄显著较大(Student- Newman-Keuls，p＝0.021)(图1)。取样时各组之间的胎龄(GA)没有 差异。相似地，在我们的研究对象中，孕次、已产子女数或母亲体重没 有差异。与P-CTR相比，sPE和pHTN组的高血压女性的血压显著更 高(平均动脉压：sPE：122，pHTN：115，P-CTR：77mmHg，p＜0.001)。 更高比例的sPE女性表现出神经症状(图1)。
发生在高血压组的临床实验室和胎盘组织学变化支持临床诊断(图 2)。
当用快速尿试条试验筛选时，sPE女性患有更严重程度的蛋白尿。 然而，当分析实验室24小时尿蛋白质排泄时，不能证实sPE和pHTN 组之间有差异。与pHTN女性相比，sPE患者的乳酸脱氢酶-LDH(血 管内溶血的标志)、尿酸水平更高，并且血小板计数更低。妊娠期间由 sPE并发剥离(含铁血黄素沉积和/或绒毛间血栓)的组织学征兆更常见 (p＝0.003，Fisher′s精确检验)。
样品收集
标准采用无菌容器收集随机尿样(5-10mL/样品)。加入研究时，所 有sPE女性安置导尿管(Foley catheter)以允许准确监测尿输出量。没 有导尿管时，采用其它无菌技术(“直导管straight cath”或“清洁收集 clean catch”)收集尿样。“直导管”技术是用直导管以无菌方式收集尿 样的“入和出”方法。“清洁收集”技术是收集尿样同时尽可能避免细 菌污染生殖器菌群。60％的sPE女性在开始硫酸镁发作预防之后加入研 究。硫酸镁发作预防是临床先兆子痫患者的标准护理，由于用硫酸镁处 理已显示能预防这些患者的发病。9名女性在开始发作预防性治疗之前 以及之后2-12小时收集尿样。平行进行尿样的生化分析。收集之后样 品在3000×g和4℃下离心20分钟，等分试样并立即保存在-80℃直到采 用特异性免疫分析检测sFlt-1、VEGF和PlGF水平。
免疫分析方法
根据制造商说明书(R&D Systems，Minneapolis，MN)进行人游离 VEGF、sFlt-1和PlGF的ELISA分析。在预先用抗游离VEGF、sFlt-1 或PlGF的捕获抗体包被的96孔板中分析样品，一式两份。孵育操作后 洗涤并根据操作说明在450nm读数。分析中VEGF、sFlt-1和PlGF的 最小可检测剂量分别是5、5和7pg/mL。分析间和分析内变异系数在 3％-10％变化。由于蛋白尿可能经历日内变异，因此基于采用源于已知 浓度的标准曲线由相同份试样测定肌酸酐和蛋白质浓度来计算数据并 将数据标准化。由肌酸酐和/或总蛋白质浓度将血管发生因子的水平标 准化。
统计学分析
采用Kolmogorov-Smirnov法将所有数据组进行正态性检验并且报 告为平均值和95％置信区间(95％CI)(对于正态分布数据)或者中值 加范围(偏斜数据)。VEGF、sFlt-1和PlGF浓度以算术平均数表示并 且在数据对数变换之前(Kruskall-Wallis ANOVA)或之后(单因素 ANOVA)完成统计学分析。采用Student′s t-检验或Mann-Whitney秩 和检验进行两组间比较。用Fisher′s精确检验或卡方检验比较比例关系。 我们应用单变量分析和多变量分析以及线性回归模型来识别作为自变量 的母体或实验室特征与作为因变量的sFlt-1/PlGF比率之间的显著相关 性。采用Pearson或Spearman积差相关法测量所选自变量之间的共线性 以及因变量和自变量之间的其它相关性。采用MedCalc(Broekstraat， Belgium)统计学软件进行接受者工作曲线(ROC)分析。统计学显著性 判断设置在p＜0.05。
尿中VEGF、sFlt-1和PlGF水平
在取样时尿中VEGF、sFlt-1、PlGF和GA水平之间没有相关性 (VEGF：r＝0.09，sFlt-1：r＝0.02，PlGF：r＝-0.03，p＞0.05)。下图3表示尿 中血管发生因子水平(以非对数形式)。
与NP-CTR相比，患sPE女性的尿中VEGF水平较高(Student- Newman-Keuls，p＝0.023)。妊娠组之间尿中VEGF没有显著变化(单因 素ANOVA，p＝0.536)。与NP-CTR组相比，健康妊娠女性尿中PlGF浓 度显著增加(Student-Newman-Keuls，p＜0.001)。与NP-CTR相比，正 常妊娠与尿中显著更高的PlGF水平有关(p＜0.001)。与健康妊娠对照 相比，pHTN和sPE女性尿中PlGF输出量显著降低(p＜0.001)。最后， 与pHTN(p＝0.016)和P-CTR(p＜0.001)相比，已经确定sPE女性尿 中sFlt-1水平显著更高。与P-CTR组相比，pHTN女性尿中sFlt-1输 出量更高(p＝0.001)。P-CTR和NP-CTR健康对照之间尿中sFlt-1水 平没有显著性差异(p＝0.594)。
实施例2
尿样中sFlt-1和VEGF的降解
进行试验以检验尿中血管发生因子的稳定性。测试来自先兆子痫患 者的8个尿样(i)如本文所述作为尿样或(ii)在室温下24小时后。 下图4显示采用Bland-Altman一致性方法分析这两种样品的ELISA数据 之间的一致性。该分析对所述两次测量(偏差)之间差异值对其平均值进 行作图分析，以评估如果这两种技术之间的差异很重要，这两种方法是否 可以互换使用以及差异之间的变异性是否随测量值范围的增加而增加。结 果证明sFlt-1的免疫反应性损失最大(图4A：平均：57.5pg/mL)，随 后是VEGF(图4B：平均：41.1pg/mL)。对于PlGF(图4C)，负偏差 (-8.8pg/mL)提示室温24小时后测量值稍微增加，提示其它因素比如 样品蒸发还可能影响结果。图4D举例说明免疫反应性从之前作为100％ 水平而发生的相对变化。结果提示sFlt-1的免疫反应性统计学降低(对 于sFlt-1，带符号秩检验p＝0.023)，VEGF不变(p＞0.05)，以及PlGF 显著增加(带符号秩检验p＝0.023)。
实施例3
尿中sFlt-1/PlGF比
如本文发现，正常妊娠特征表现为尿中PlGF排泄增加，而高血压 状态特征表现为sFlt-1增加，但尿中PlGF降低。下图5A-5B显示代表 性ELISA试验，证实这样的高血压状态对以下的影响：(A)妊娠女性 sFlt-1水平和(B)妊娠女性PlGF水平。考虑到这点，申请人推断尿中 sFlt-1/PlGF(uFP)比率将是个体尿中血管发生标志物稳态平衡的更好 指标。采用以下公式计算该比率指标：uFP＝log[sFlt/PlGF×100]。下图 5C-5D显示(C)用于从本文提供的ELISA数据计算uFP的展开表和 (D)比较sPE患者与P-CTR的平均(+SD)uFP。这些计算的结果证 实，与pHTN(Student-Newman-Keuls，p＝0.008)、P-CTR(p＜0.001)或 NP-CTR(p＜0.001)比较，sPE女性中uFP显著升高(图6)。与P-CTR (p＜0.001)和NP-CTR(p＜0.001)比较，pHTN组uFP值也显著升高。
对uFP进行ROC分析。通过这个分析，已经确定在区分sPE女性 和正常血压对照中，截断值＞2.1具有88.2％灵敏度和100％特异性(曲 线下面积，[95％CI]：0.974[0.849-0.994])(图7)。从正常血压对照中 聚类sPE女性时，uFP明显比单独蛋白尿更好(曲线下面积[95％CI]： 0.809[0.635-0.924]，p＝0.03)。
在开始治疗之前和之后可获得尿样时通过比较一组9名女性中的 uFP比率，还研究了输注硫酸镁的可能作用。已经确定在对硫酸镁发作 预防的反应中uFP在2到12小时没有显著变化(成对t-检验，p＝0.854)。
为了调查uFP比率和几种母亲和临床实验室因素之间的可能相关 性，申请人建立模型，以uFP比率作为因变量，相对以母亲年龄、孕次、 已产子女数、GA、IUGR、收缩压和舒张压、蛋白尿、神经症状(0＝ 无；1＝有)、肝功能检验(AST、ALT)、血小板计数、分娩方式(剖腹 分娩[CD]对比自然阴道分娩[SVD])、尿酸、血清LDH、和剥离的组织 病理学征兆(0＝无；1＝有)作为自变量。这些变量输入多元线性回归模 型中。发现尿酸和CD分娩最好地完成模型(r＝0.628)并且与uFP相 关(对于CS，p＝0.002，对于尿酸，p＝0.005)。最后保留在我们模型中 的2个参数(CD和尿酸)之间没有显著的共线性(r＝0.143，p＝0.391)。
在单变量分析中，确定了uFP和母亲血清尿酸之间的显著相关性 (Pearson r＝0.458，p＝0.003)(图8)，以及uFP和经CD分娩之间的显 著相关性(Spearman r＝0.514，p＜0.001)。与自然分娩的女性相比，CD 分娩女性的uFP比率显著升高(平均[95％CI]CS：2.6[2.4-2.8]对比SVD： 1.8[1.8-2.3]，p＝0.007)。还进一步确定uFP比超过2.1的女性经CD分娩 的风险增加(OR[95％CI]：6.57[1.51-28.53]。其它与疾病严重程度一致 的变量与uFP显著相关：收缩压和舒张压、试条蛋白尿(p＜0.001)、孕 次、分娩时胎儿体重、胎盘剥离征兆、已产子女数和IUGR(p＜0.05)。
实施例4
母亲血清和尿中血管发生因子浓度
参与者和样品收集
对于该研究，申请人研究了从2004年2月到2005年1月之间Yale New Haven Hospital接纳的64名女性中获得的时间匹配的成对血清-尿 样品。在耶鲁大学人类调查委员会批准的规则下收集样品。所有参与者 在加入之前提供知情同意书。所有请求加入研究的女性同意参加。之前 报告了14名女性的尿免疫学分析结果，但没有报告血清免疫学分析结果。 基于月经日期和/或妊娠20周之前的超声检查确认胎龄(GA)。从已评价 或允许进入产房和分娩前高低风险病房的女性中招收对象。基于调查者之 一的可获得性(CSB)，潜在地请求我们的对象加入。加入研究的女性没有 人被排除在最后分析之外。
申请人将患者分成以下几组：重度先兆子痫(sPE，n＝27)、不满足 重度先兆子痫标准的轻度先兆子痫高血压和蛋白尿女性(mPE，n＝15)、 健康妊娠对照女性(P-CTR，n＝13)、和健康非妊娠育龄女性(NP-CTR， n＝9)。轻度先兆子痫根据公认标准定义为在每个体间隔4到6小时有两 次，舒张压至少140/90mmHg并且在24小时尿蛋白质排泄中尿中排泄 至少0.3g蛋白质(或试条试验中至少1+或更大)。sPE被定义为HELLP 综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板计数低)，在6小时间隔中至少2 次血压＞160/110mmHg，在24小时尿蛋白排泄中蛋白质＞5克，以及或 在试条试验中持续+3蛋白尿。sPE定义的其它要素包括，宫内发育迟缓 (IUGR)＜10个百分点，持续性神经症状(头痛、视觉障碍)、上腹痛、 少尿(少于500mL/24h)、血清肌酸酐＞1.0mg/dL、肝脏酶升高(大于两 倍正常值)、血小板减少(＜100,000个细胞/μL)。慢性高血压(crHTN) 被定义为妊娠前或妊娠20周之前BP持续升高＞140/90mmHg。蛋白尿 被定义为24小时尿收集期间蛋白质＞300mg。
标准采用无菌容器收集随机尿样(5到10mL)。加入研究时，所有 sPE女性安置导尿管以允许准确监测尿排出量。没有导尿管时，采用其 它技术(膀胱导管插入术或“清洁收集”方法)收集尿样。同样在无菌 条件下收集从mPE、P-CTR和NP-CTR女性获得的样品(导尿管、膀 胱导管插入术或“清洁收集”技术)。70％sPE女性在开始硫酸镁发作 预防之前加入。在收集尿的同时通过静脉穿刺收集血样并允许血样凝 结。在允许时、引产术或剖腹分娩之前收集样品。血清和尿样品在3000×g 和4℃下离心20分钟，等分上清液并立即贮藏在-80℃直到采用特异性 免疫分析测量sFlt-1、VEGF和PlGF水平。
VEGF、sFlt-1和PlGF的免疫学分析方法
根据制造商说明书(R&D Systems，Minneapolis，MN)进行人未结 合的VEGF、sFlt-1和PlGF的ELISA分析。在预先用抗游离VEGF、 sFlt-1或PlGF的捕获抗体包被的96孔板中分析血清和尿样品，一式两 份。孵育操作后洗涤并根据操作说明在450nm读数。分析中VEGF、 sFlt-1和PlGF的最小可检测浓度分别是2、5和7pg/mL。采用Softmax 软件Pro 3.1.1(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)报告我们的数据并 进行作图。如果样品孔的光密度超过零标准(空白孔)，所述软件报告 正值。如果样品孔的光密度低于零标准，则报告负值并由计算机自动转 变成零。当在任何分析中有不可检测水平(值低于零标准)的情况时， 血清VEGF是仅有的分析物。分析间和分析内变异系数从3％到10％变 化。采用VERSAmaxTM酶标仪和Softmax Pro 3.1.1软件以570nm 波长校正在450nm读出分析板。
白蛋白免疫分析方法
用捕获抗体(10μg/ml山羊抗人白蛋白抗体(Bethyl Laboratories) 包被微滴定板(Immuno MaxiSorp，Nalge Nunc，Rochester，NY)。洗涤 板子、封闭板子、并与尿(1∶1000稀释或1∶100对于NP患者)或血清 样品(稀释1∶150,000)或6.25至400ng/ml范围的人白蛋白校准物 (Bethyl Laboratories)一起孵育板子。用偶联辣根过氧化物酶的山羊 抗人白蛋白抗体(1∶150,000稀释，Bethyl Laboratories)和3，3’，5，5’- 四甲基联苯胺(Vector Laboratories，Burlingame，CA)作为底物完成检 测。用2M硫酸终止颜色反应并以650nm波长校正在450nm处读板。 分析内变异系数小于5％。分析的灵敏度是1ng/ml。
其它生化评估
采用比色分析(Stanbio Laboratory，Boerne，TX)根据源于已知浓 度的标准曲线在用于免疫分析的相同份试样中测量血清和尿中肌酸酐 水平。还采用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)/硫酸铜试剂(BCA试 剂盒，Pierce，Rockford，II)测量总蛋白质水平。尿中血管发生因子、 蛋白质或白蛋白水平用尿中肌酸酐浓度进行标准化。
统计学分析
采用Kolmogorov-Smirnov法将所有数据组进行正态性检验并且报 告为平均值和95％置信区间(95％CI)或均值标准误差(SEM)(对于 正态分布数据)或中值加范围(偏斜数据)。在数据对数转换之后完成 血管发生因子排泄分数的统计学分析。采用单因素方差分析或适当时用 Kruskall-Wallis ANOVA进行成对多重比较步骤。采用Student′s t-检验 或Mann-Whitney秩和检验进行两组间比较。用Fisher′s精确检验比较 比例关系。采用Pearson积差相关法测量所选自变量之间的共线性以及因 变量和自变量之间的其它相关性。对于每种血管发生因子，采用下式计算 排泄分数指标：[Ua]×[Sc]/[Sa]×[Uc]，其中[Ua]和[Sa]分别代表尿和血 清中血管发生因子的浓度，以及[Uc]和[Sc]代表尿和血清中肌酸酐浓度。 对白蛋白和总蛋白质进行相似的计算。申请人以p＜0.05判断统计学显著 性。
血管发生因子、蛋白质、尿中随机总蛋白质/肌酸酐比率、白蛋白和肌 酸酐在血清-尿中的水平
图9显示免疫分析结果。组间血清和尿中VEGF、sFlt-1和PlGF 浓度具有显著性差异。与mPE女性相比，sPE女性血清蛋白质浓度显 著更低(Kruskal-Wallis ANOVA，p＜0.05)但尿中并非如此(p＝0.495)。 尿中随机总蛋白质/肌酸酐比率长期被提倡为24-小时尿中总蛋白质排泄 的强预测因子(25)。与其它研究组相比，sPE女性而非mPE女性尿中 随机总蛋白质比肌酸酐比率显著增加(Kruskal-Wallis ANOVA， p＝0.007)。
血清白蛋白分析结果证实组间没有显著性差异(图9)。然而，根据 随机尿样分析，组间白蛋白尿具有显著性差异(p＜0.001)。mPE组 (r＝0.477，p＝0.080)或sPE组(r＝0.143，p＝0.472)蛋白尿和白蛋白尿 之间没有显著相关性。与具有mPE的女性(单因素ANOVA，p＝0.04) 和P-CTR女性(p＝0.005)相比，具有sPE的女性血清肌酸酐浓度显著 更高。
血清-尿中VEGF水平
妊娠的特征表现为血清VEGF水平降低(NP-CTR对P-CTR， p＜0.001)(图9)。与P-CTR相比，sPE女性具有显著更低的血清游离 VEGF浓度(ANOVA Kruskal-Wallis，p＜0.05)，而与mPE女性相比并 非如此(p＞0.05)(图10A)。NP-CTR、P-CTR和mPE女性中尿中VEGF 浓度没有差异(单因素ANOVA，p＝0.371)。相比而言，sPE女性尿中 VEGF浓度超过mPE组的两倍(p＝0.01)(图10B)。对于sPE组，白 蛋白尿和尿中VEGF水平之间没有显著相关性(r＝0.083，p＝0.860)。mPE 中蛋白尿和尿中VEGF浓度之间具有显著相关性(r＝0.713，p＝0.003)， 而sPE组并非如此(r＝-0.021，p＝0.918)，这表明sPE深深改变血清和 尿中这种血管发生因子的浓度，而与蛋白尿无关。
血清-尿中sFlt-1水平
妊娠与血清sFlt-1水平增加相关(ANOVA Kruskal-Wallis，NP-CTR 对P-CTR，p＜0.001)(图11A)。与健康妊娠对照相比，临床诊断时mPE 和sPE组中平均血清sFlt-1水平都显著提高(p＜0.05)。由于sPE女性 血清中sFlt-1浓度比mPE高47％，可区分sPE和mPE(sPE对mPE， p＜0.05)。妊娠本身不影响尿中sFlt-1浓度(NP-CTR对P-CTR，p＞0.05) (图11B)。然而，与P-CTR组相比，mPE对象尿中sFlt-1水平显著更 高(ANOVA Kruskal-Wallis，p＝0.007)。尿中sFlt-1浓度随疾病严重程 度而变化(sPE对mPE，p＜0.05)。sPE组内白蛋白尿和尿中sFlt-1水平 之间没有显著相关性(r＝0.324，p＝0.873)。mPE组(r＝0.137，p＝0.628) 或sPE组(r＝0.336，p＝0.087)蛋白尿和尿中sFlt-1浓度之间没有显著相 关性。总之，先兆子痫女性血清和尿中sFlt-1浓度显著提高。这种紊乱 随高血压病症的严重程度而变化。
血清-尿中PlGF水平
在正常妊娠期间血清和尿中PlGF浓度显著提高(ANOVA Kruskal-Wallis，P-CTR对NP-CTR，p＜0.05)(图12A和12B)。此外， 与P-CTR相比，sPE女性和mPE血清PlGF水平低五倍(sPE对P-CTR， p＜0.05)(mPE对P-CTR，p＜0.05)。与mPE相比，sPE女性血清PlGF 水平显著更低(sPE对mPE，p＜0.05)(图12A)。相似地，对于尿中PlGF 浓度保持该比率(sPE对P-CTR，p＝0.004)。先兆子痫女性尿中PlGF 浓度没有显著性差异(sPE对mPE，p＝0.733)。对于sPE组，白蛋白尿 和尿中PlGF水平之间没有显著相关性(r＝-0.091，p＝0.653)。sPE中蛋 白尿和尿中PlGF浓度之间是相反的并且具有显著相关性(Pearson r＝-0.6，p＝0.002)。总之，与mPE和P-CTR女性相比，sPE女性具有显 著更低的血清PlGF水平。在先兆子痫女性中尿中PlGF水平也更低， 但不随高血压疾病严重程度而变化。
血管发生因子、白蛋白和蛋白质的排泄分数
为了评价重度先兆子痫女性中是否发生肾小球损伤可以解释尿样 中血管发生标志物的释放增加，申请人分析了每种已鉴定血管发生标志 物的排泄分数与以高概率反映肾小球滤过能力受损的白蛋白尿、非特异 性蛋白尿之间的关系。还对每个研究组进行了血管发生标志物的排泄分 数与尿中随机总蛋白质比肌酸酐比率之间的相关性分析。物质的排泄分 数代表排泄于尿中的该物质与肾小球滤过部分相比的比例。一般相对于 肌酸酐清除率来报告，因为肌酸酐既不被吸收又不被显著分泌，因此抵 消了尿浓度/稀释的任何作用。与NP-CTR相比，健康妊娠女性排泄显 著更多的VEGF(ANOVA p＜0.001)(图9)。与P-CTR相比，pHTN不 影响VEGF排泄分数(p＝0.346)。然而，与pHTN(p＝0.007)或P-CTR (p＜0.001)女性相比，sPE显著增加VEGF排泄分数。
妊娠的特征表现为sFlt-1排泄分数显著降低(P-CTR对NP-CTR， p＜0.001)。pHTN不影响sFlt-1排泄分数(P-CTR对pHTN，p＝0.43)； 而与P-CTR(p＜0.001)和pHTN(p＜0.001)相比，sPE逆转妊娠诱导 的变化而引起sFlt-1排泄分数增加(图4)。
PlGF排泄分数遵从与sFlt-1排泄分数相似的模型。与NP-CTR相比， P-CTR女性的PlGF排泄分数降低(P-CTR对NP-CTR，p＜0.001)。相似 地，pHTN不进一步影响PlGF排泄分数(P-CTR对pHTN，p＝0.125)；而 sPE女性患者中这种作用被部分地逆转(sPE对pHTN，p＜0.001)。
妊娠的特征不表现为健康对照中白蛋白排泄分数增加(NP-CTR对 P-CTR，p＝0.385)。而且，与pHTN和P-CTR组相比，sPE中白蛋白排泄 分数显著增加(单因素ANOVA，p＜0.001)。
与健康妊娠(NP-CTR对P-CTR，p＞0.05)或pHTN(P-CTR对pHTN p＞0.05)相关的总蛋白质排泄分数没有显著变化。相反，本分析证实与 pHTN女性相比，sPE中总蛋白质排泄分数在疾病临床表现期时极显著地 增加(sPE对pHTN p＜0.001)。
白蛋白排泄分数与任何血管发生因子排泄分数之间没有显著相关性， 除了患pHTN疾病的女性以外并且仅仅对于sFlt-1(r＝0.639，p＝0.01)和 PlGF(r＝0.687，p＝0.004)。
在NP-CTR女性中蛋白尿与任何被调查的血管发生因子排泄分数之间 无相关性(Pearson，VEGF[r＝0.33，p＝0.382]，sFlt-1[r＝0.40，p＝0.296]，PlGF [r＝0.59，p＝0.09])。鉴定了在P-CTR女性中蛋白尿与sFlt-1排泄分数之间 具有显著相关性(sFlt-1[r＝0.59，p＝0.03])。在健康P-CTR女性中PlGF和 sFlt-1的排泄分数与蛋白尿不相关(p＞0.05)。然而，在pHTN女性中蛋白 尿与任何所述血管发生因子的排泄分数之间无相关性：VEGF(r＝0.42， p＝0.118)、sFlt-1(r＝0.23，p＝0.414)、或PlGF(i＝0.34，p＝0.214)。在sPE 中，蛋白尿与VEGF(r＝0.30，p＝0.127)或sFlt-1(r＝0.35，p＝0.07)排泄分 数之间无相关性。相反，蛋白尿与PlGF排泄分数之间具有显著相关性 (r＝0.50，p＝0.01)。此外，在sPE女性患者中尿中随机总蛋白质/肌酸酐比 率与PlGF(r＝0.60，p＝0.002)或sFlt-1(sFlt-1：r＝0.50，p＝0.007)排泄分数 之间具有显著相关性。
申请人观察到与健康妊娠对照相比，sPE中血清VEGF和PlGF水 平显著更低而sFlt-1显著更高。与sFlt-1和PlGF不同，所有研究组中尿 中VEGF浓度保持显著高于其血清水平。然而，甚至当考虑蛋白尿程度作 为受损肾小球完整性的反映时，申请人发现sPE与VEGF和sFlt-1排泄分 数的增加相关。相比之下，之前推测为先兆子痫标志物的PlGF(分子量 低很多的蛋白质)与蛋白尿和尿中随机总蛋白尿/肌酸酐比率相关。基于本 发明发现血清和尿中所有血管发生因子水平随高血压疾病严重程度而变 化，sPE区分自身为不同的高血压临床实体。然而，血清和尿中浓度变化 不平行发生。
申请人进一步确定sPE女性中血清游离VEGF水平降低，但是其尿 输出量却例外的增加。可通过其与血浆蛋白质比如sFlt-1的实质性结合 来解释血清水平降低。因此，可能不能通过只检测其游离形式的高度特异 性ELISA检测VEGF。随后，尿中水平和排泄分数显著增加更可能是内 在肾脏生产(intrinsic kidney production)的结果，而较少可能由于肾小 球渗漏所引起(26)。本文所述发现即尿中VEGF水平显著增加不依赖于 蛋白尿和血清VEGF水平进一步支持该理论。此外，目前还不清楚肾脏增 强VEGF生产的机制，这需要进一步研究。
总之，sPE的特征在于VEGF和sFlt-1排泄分数显著增加。这种增加 的幅度与由总蛋白质排泄分数、白蛋白尿或尿中随机总蛋白质比肌酸酐比 率反映的蛋白尿程度不相关。这表明血清水平变化和肾小球损伤不是造成 先兆子痫中尿血管发生因子输出增加的唯一机制。
相关申请参考
本申请要求2004年12月21日提交并且名称为“鉴定、诊断和跟 踪患先兆子痫女性的方法和试验”的美国临时申请No.60/637,948的权 益。所参考申请的全部教导在此引入作为参考。
参考文献
1.Roberts JM，Cooper DW.Pathogenesis and genetics of pre-eclampsia. Lancet.2001；357(9249)：53-56.
2.MacKay AP，Berg CJ，Atrash HK.Pregnancy-related mortality from preeclampsia and eclampsia.Obstet Gynecol.2001；97：533-38.
3.Buhimschi IA，Saade GR，Chwalisz K，Garfield RE.The nitric oxide pathway in pre-eclampsia：pathophysiological implications.Hum Reprod Update 1998；4：25-42.
4.Ward K，Hata A，Jeunemaitre X，Helin C，Nelson L，Namikawa C， Farrington PF，et al..A molecular variant of angiotensinogen associated with preeclampsia. Nat Genet 1993；4：59.
5.Wallukat G，Homuth V，Fischer T，Horstkamp B，Jupner A，Baur E，Nissen E，Vetter K，Dudenhausen JW，Haller H，Luft FC.Patients with preeclampsia develop agonistic antibodies against the angiotensin AT 1 receptor.J Clin Invest 1999；103：945-952.
6.Fass MM，Schinling GA，Baller JFW，Visscher CA，Bakker WW.A new animal model for human preeclampsia：ultra-low dose of endotoxin infusion in pregnant rats.Am J Obstet Gynecol 1994；171：158-64.
7.Roberts JM，Redman CW.Preeclampsia：more than pregnancy induced hypertension.Lancet 1993；341：1447-51.
8.Maynard SE，Min JY，Merchan J，Lim KH，Li J，Mondal S et al.Excess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1(sFlt1)may contribute to endothelial dysfunction，hypertension，and proteinuria in preeclampsia.J Clin Invest 2003；111：649-58.
9.Volhard F：Die doppelseitigen haematogenen Nierenerkrankungen Beril， Springer.1918.
10.Buhimschi IA，Saade GR，Chwalisz K，Garfield RE.The nitric oxide pathway in pre-eclampsia：pathophysiological implications.Hum Reprod Update. 1998；4：25-42.
11.Takacs P，Kauma SW，Sholley MM，Walsh SW，Dinsmoor MJ，Green K. Increased circulating lipid peroxides in severe preeclampsia activate NF-kappaB and upregulate ICAM-1 in vascular endothelial cells.FASEB J.2001；15：279-81.
12.Lockwood CJ，Peters JH.Increased plasma levels of ED1+ cellular fibronectin precede the clinical signs of preeclampsia.Am J Obstet Gynecol.1990；162：358- 62.
13.Levine RJ，Maynard SE，Qian C，Lim KH，England LJ，Yu KF，et al. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia.N Engl J Med 2004：12；350：672-83.
14.Maynard SE，Min JY，Merchan J，Lim KH，Li J，Mondal S et al.Excess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1(sFlt1)may contribute to endothelial dysfunction，hypertension，and proteinuria in preeclampsia.J Clin Invest 2003；111：649-58.
15.Levine RJ，Maynard SE，Qian C，Lim KH，England LJ，Yu KF，et al. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia.N Engl J Med 2004：12；350： 672-83.
16.Thadhaui R，Mutter WP，Wolf M，Levine RJ，Taylor RN，Sukhatme VP， Ecker J，Karumanchi SA.First trimester placental growth factor and soluble fms-like tyrosine kinase 1 and risk for preeclampsia.J Clin Endocrinol Metab 2004；89：770-5.
17.Sugimoto H，Hamano Y，Charytan D，Cosgrove D，Kieran M，Sudhakar A，et al.Neutralization of circulating vascular endothelial growth factor(VEGF)by anti-VEGF antibodies and soluble VEGF receptor 1(sFlt-1)induces proteinuria.J Biol Chem 2003； 278：12605-8.
18.American Collage of Obstetricians and Gynecologists.Diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia.Practice Bulletin.Washington，DC：ACOG Practice Bulletin No.33，2002.
19.Caron C，Goudemand J，Marey A，Beague D，Ducroux G，Drouvin F.Are haemostatic and fibrinolytic parameters predictors of preeclampsia in pregnancy-associated hypertension？Thromb Haemost 1991；66：410-14.
20.Spargo B，McCartney CP，Winemiller R.Glomerular capillary endotheliosis in toxemia of pregnancy.Arch Pathol 1959：68：593-9.
21.Zhou Y，McMaster M，Woo K，Janatpour M，Perry J，Karpanen T，Alitalo K， Damsky C，Fisher SJ.Vascular endothelial growth factor ligands and receptors that regulate human cytotrophoblast survival are dysregulated in severe preeclampsia and hemolysis， elevated liver enzymes，and low platelets syndrome.Am J Pathol 2002；160：1405-23.
22.Rodgers GM，Taylor RN，Roberts JM.Preeclampsia is associated with a serum factor cytotoxic to human endothelial cells.Am J Obstet Gyneco 1988；159：908-14.
23.Ahmed A，Dunk C，Ahmad S，Khaliq A.Regulation of placental vascular endothelial growth factor (VEGF)and placenta growth factor (PlGF)and soluble Flt-1 by oxygen-a review.Placenta 2000；21：S16-24.
24.American Collage of Obstetricians and Gynecologists.Diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia.Practice Bulletin.Washington，DC：ACOG Practice Bulletin No.33，2002.
25.Rodriguez-Thompson D，Lieberman.Use of a random urinary protein to creatinine ratio for the diagnosis of significant proteinuria during pregnancy.Am J Obstet Gynecol 2001；185：808-11.
26.Roes EM，Steegers EA，Thomas CM，Geurts-Moespot A，Raijmakers MT， Peters WH，Sweep CG.High levels of urinary vascular endothelial growth factor in women with severe preeelampsia.Int J Biol Markers 2004；19：72-5.
经参考并入
本文提及的所有出版物和专利经参考以其全部内容并入本文，就像每 个出版物或专利具体地和个别地指出经参考并入一样。如有冲突，以本申 请包括其中任何定义为准。
等同物
本领域技术人员应当认识到或能确定，使用不超过常规试验，有许多 等同于本发明描述的具体实施方案。这样的等同物也将被以下权利要求所 涵盖。