解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用
阅读：742发布：2020-05-24
专利汇可以提供解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性 疾病 药物中的应用，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为45,500Da至49,000Da。动物试验证明，重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖，在一定剂量下，皮下注射（3～100mg/kg），具有明显抗凝活性。实验结果显示，解聚海参糖胺聚糖的抗凝活性呈剂量依赖性，与肝素及低分子肝素比较，其随剂量增加凝血作用递增缓和。能安全、有效的用于防治血栓性疾病包括用于 预防 深部静脉血栓形成、易栓症或已有静脉血栓塞症的妊娠妇女为本品适应症、也可用于血液 透析 时预防血 凝 块 形成等。，下面是解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用专利的具体信息内容。
1.解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为45,500Da至49,000Da。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重均分子量为45,500Da至
49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖是：重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量，或者是重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖的多组分混合物。
3.解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用，其特征在于，所述所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为45,500Da～46,500Da、46,550Da～47,500Da、
47,550Da～48,500Da、或48,550Da～49,000Da。
4.解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用，其特征在于，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为46,200Da、47.138Da、48.005Da或48.730Da。
5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述血栓性疾病包括：深静脉血栓形成、易栓症或静脉血栓塞症,以及用于血液透析时预防血凝块形成。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，皮下注射（3～100mg/kg）。
7.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为一种药物组合物，包括所述解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为冻干粉针剂，所述解聚海参糖胺聚糖的重量含量为1-4%。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以解聚海参糖胺聚糖计，给静脉注射药剂量为0.3～10mg/kg患者体重/天，皮下注射给药剂量为1～20mg/kg患者体重/天。
解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种解聚海参糖胺聚糖的医药用途，具体涉及重均分子量为45,500Da～49,000Da的解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓性疾病药物中的应用，包括了治疗深部静脉血栓形成，以及用于血液透析治疗时预防血栓形成和防治手术后的血栓药物中的应用。
背景技术
[0002] 血栓形成和血栓栓塞两种病理过程所引起的疾病，临床上称为血栓性疾病。血栓性疾病严重威胁人类的生命健康，其发病率高居各种疾病之首，且近年来还有渐增之势，是当代医学研究的重点和热点之一。
[0003] 血栓形成是指在一定条件下，血液有形成分在血管内（多数为小血管）形成栓子，造成血管部分或完全堵塞，相应部位血液供应障碍的病理过程。依血栓组成成分可分为血小板血栓、红细胞血栓、纤维蛋白血栓、混合血栓等。按血管种类可分为动脉性血栓、静脉性血栓及毛细血管性血栓。
[0004] 血栓栓塞是血栓由形成部位脱落，在随血流移动的过程中部分或全部堵塞某些血管，引起相应组织和（或）器官缺血、缺氧、坏死（动脉血栓）及淤血、水肿（静脉血栓）的病理过程。以上两种病理过程所引起的疾病，在医学上称为血栓性疾病。
[0005] 防治血栓性疾病的药物按作用机制分为抗凝血药物、抗血小板药物、直接溶栓药物等，临床上均能用于预防和治疗血栓栓塞形成。其中抗凝药物是通过影响凝血因子，从而防止血栓形成或复发。抗凝药物对已经形成的血栓无溶解作用，但可以防止血栓扩展和新血栓形成，有利于促进血栓早期自溶，同时抗凝血药物对静脉血栓形成具有明显预防作用，同时抗凝血药物还可以用于配合体外循环和血液透析中防治血栓的形成使用，旨在防止手术时的血液凝固。
[0006] 血栓性疾病使用的注射药物主要有肝素及低分子肝素，口服的主要有华法林、双香豆素、新双香豆素等，降低血粘度防治血栓性疾病的药物主要有低分子右旋糖苷。其中华法林能够抑制某些凝血因子的维生素K依赖性激活，是现处方量最大的抗凝血药物，临床研究证实，华法林能够减少心房纤维性颤动患者64%的中风发生率。不过，尽管高度有效，但华法林也会带来严重甚至致死性的出血风险。此外，因药动学的个体差异性大且易受到饮食的影响，药物相互作用又很复杂，故华法林在临床实践中难以最优剂量用药，另外肝素及低分子肝素类药物类药物，临床使用易导致出血，不同体质的人使用监控性强。因此就目前临床使用的抗凝药物来说均具有一定的副作用，鉴于人口的老龄化、血栓性疾病发病率的增加，以及现有抗凝药物在临床用于栓塞性疾病预防和治疗的广泛性以及其安全隐患的严重性。
[0007] 从中药中筛选、分离更具疗效性、安全性防治血栓栓塞性疾病，是预防和治疗血栓性疾病的一种必然趋势。
发明内容
[0009] 所述解聚海参糖胺聚糖，是海参体壁中含有的一种酸性粘多糖的解聚产物，是海参所特有的；
[0010] 动物试验证明，重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖，在一定剂量下，皮下注射（3～100mg/kg），具有明显抗凝活性。
[0011] 对解聚海参糖胺聚糖的抗凝活性进一步研究，实验结果显示，解聚海参糖胺聚糖的抗凝活性呈剂量依赖性，与肝素及低分子肝素比较，其随剂量增加凝血作用递增缓和。
[0012] 因此，所述的重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖，可以用于制备防治血栓性疾病药物，所述血栓性疾病包括：深静脉血栓、易栓症或静脉血栓塞症、也可用于血液透析时预防血凝块形成等；
[0013] 所述的“重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖中”指的是，可以是重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量，也可以是重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖，为一种多组分混合物；
[0014] 优选 45,500Da～46,500Da、46,550Da～47,500Da、47,550Da ～48,500Da、或48,550Da～49,000Da任意一重均分子量；
[0015] 特别优选的，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为46,200Da、47.138Da、48.005Da、48.730Da
[0016] 要获得符合分子量要求的解聚海参糖胺聚糖组合物，可以将海参糖胺聚糖进行不同程度的降解来实现；
[0017] 本发明还涉及一种药物组合物，包括所述解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体；
[0018] 所述药物组合物为冻干粉针剂时，所述解聚海参糖胺聚糖的重量含量为1-4%，优选的重量含量为1.2-3%；
[0020] 本发明所述的解聚海参糖胺聚糖，还可以用于血栓性疾病的形成，防治深静脉血栓形成、易栓症或已有静脉血栓塞症的妊娠妇女为本品适应症、也可用于血液透析时预防血凝块形成等疾病；
[0021] 以解聚海参糖胺聚糖计，给静脉注射药剂量为0.3～10mg/kg患者体重/天，优选0.5-8mg/kg患者体重/天；具体可根据患者的年龄、病情等由医师决定；皮下注射给药剂量为1～20mg/kg患者体重/天；优选0.5～18mg/kg患者体重/天
[0022] 给药形式是皮下注射或静脉注射，抗凝作用显著不易引发出血，用于缺血性脑卒中更为有效和安全；
[0023] 所述重均分子量为45,500Da至49,000Da之间的解聚海参糖胺聚糖的制备方法，包括如下步骤：
[0024] (1)海参糖胺聚糖的提取：
[0025] 从海参总提取海参糖胺聚糖的步骤包括对海参进行浸泡过夜、淋干水分，绞碎，加水补足重量，两次酶解、沉淀获得海参多糖粗品、然后纯化、脱色得到海参糖胺聚糖。
[0027] （2）降解提取出的海参糖胺聚糖；
[0028] 将海参糖胺聚糖与酸以及双氧水混合、控温、水浴、中和、醇沉、静置、离心得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；
[0030] （3）将步骤（2）的解聚海参糖胺聚糖的粗品，在35～40℃下干燥至无乙醇，溶于3～6倍解聚海参糖胺聚糖的粗品重量的水中，上吸附柱，然后用0.06～0.10mol/l氯化钠水溶液洗脱2～9个柱体积，收集45,500Da～49,000Da分子量段的洗脱液，采用截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-38～-45℃冷冻干燥，获得所述的解聚海参糖胺聚糖，分子量为45,500Da～49,000Da，多分散度小于2，优选小于1.5，更优选小于1.4，纯度可达到98%以上；
[0031] 所述多分散度的定义如下：是本领域常用的衡量聚合物分子量分布的指数，用于表征聚合物分子量分布的宽度。多分散度在本文或其他文献中又被称多分散指数、多分散性或分布宽度指数，是重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比，即Mw／Mn。这个比值随分子量分布宽度而变化。在单分散时，Mw／Mn等于1，随着分子量分布变宽，Mw／Mn值逐渐变大。
[0032] 所述重均分子量的定义如下：重均分子量（Weight-average Molecular Weight）：所有合成高分子化合物的分子量以及大多数天然高分子化合物的分子量都是不均一的，它们是分子量不同的同系物的混合物。聚合物中用不同分子量的分子重量平均的统计平均分子量。
[0033] 所述纯度为重量纯度。
[0034] 所述的吸附柱选自凝胶吸附柱，如Sephadex-G100凝胶吸附柱、Sephadex-G50凝胶吸附柱或Sephadex-G200，所述Sephadex-G100凝胶吸附柱，可以采用美国GE公司的葡聚糖凝胶柱。
[0035] 所述的海参糖胺聚糖，从海参体壁中提取的，提取海参糖胺聚糖的方法是本领域技术人员所熟悉的，如专利号为ZL200910305363.5公开的“一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法”中报导的方法，本发明不再赘述；
[0036] 本发明采用现代科学技术将传统中药优势进一步发挥，获得了一种含有重均分子量介于45,500Da至49,000Da之间解聚海参糖胺聚糖的制剂。经大量实验研究表明，所述制剂，能安全、有效的用于防治血栓性疾病包括用于预防深部静脉血栓形成、易栓症或已有静脉血栓塞症的妊娠妇女为本品适应症、也可用于血液透析时预防血凝块形成等。附图说明
[0037] 图1本发明的解聚海参糖胺聚糖组合物纯度图。
[0038] 图2本发明的解聚海参糖胺聚糖组合物的分子量分布图谱，其中：图2A是为色谱图，图2B是分子量分布，图2C是分子量累积重量分布曲线。
具体实施方式
[0039] 实施例1
[0040] 1．海参糖胺聚糖的提取
[0041] 称取玉足海参药材2kg，水浸过夜。将海参体壁淋干水分，绞碎，称重并补水至18Kg，置60℃水浴中，pH调至7.8±0.2，加入投料重量2%的水解蛋白酶Alcalase 60ml（诺维信（沈阳）生物技术有限公司）搅拌，酶解4.5小时，84℃以上灭活6分钟，降温至
48℃±2℃，加入氢氧化钠调pH至7.8±0.2，再加投料重量0.2～0.25%的复合胰酶（无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，雪梅牌）搅拌酶解4.5小时，煮沸6分钟，冷却。4℃离心，收集上清液，加入盐酸调pH至2.4±0.2，4℃冷藏2.5小时，离心，收集上清液，加入氢氧化钠调pH至6.8±0.2，加0.8倍（v/v）乙醇，4℃静置过夜；离心，收集沉淀称重，加沉淀物重量
10倍的（v/w）蒸馏水，加热至84℃±2℃，待完全溶解后，加入氢氧化钠pH调至8.9±0.2，加入氯化钙至溶液中，氯化钙最终重量浓度达到2%（w/w），升温至92℃保持16分钟，冷却至室温，4℃离心，收集上清液，用饱和碳酸钠溶液调pH至10.8±0.2，离心，收集上清液，用
6mol/LHCl溶液调pH至5.9±0.2，加上清液0.8倍重量的乙醇，4℃冷藏过夜；
48℃±2℃，加入氢氧化钠调pH至7.8±0.2，再加投料重量0.2～0.25%的复合胰酶（无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，雪梅牌）搅拌酶解4.5小时，煮沸6分钟，冷却。4℃离心，收集上清液，加入盐酸调pH至2.4±0.2，4℃冷藏2.5小时，离心，收集上清液，加入氢氧化钠调pH至6.8±0.2，加0.8倍（v/v）乙醇，4℃静置过夜；离心，收集沉淀称重，加沉淀物重量
10倍的（v/w）蒸馏水，加热至84℃±2℃，待完全溶解后，加入氢氧化钠pH调至8.9±0.2，加入氯化钙至溶液中，氯化钙最终重量浓度达到2%（w/w），升温至92℃保持16分钟，冷却至室温，4℃离心，收集上清液，用饱和碳酸钠溶液调pH至10.8±0.2，离心，收集上清液，用
6mol/LHCl溶液调pH至5.9±0.2，加上清液0.8倍重量的乙醇，4℃冷藏过夜；
[0042] 冷藏液离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水（v/w）加热使其充分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2.0mol/L，4℃静置过夜。离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水（v/w），加热使其充分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2.0mol/L，4℃静置过夜。离心，沉淀用冷2mol/L乙酸钾溶液洗涤三次，然后依次用79%乙醇、94%乙醇、无水乙醇洗涤，待乙醇挥发尽后，79℃干燥，称重，得糖胺聚糖粗品。
[0043] 糖胺聚糖粗品加0.05mol/L、pH6.0的HAc-NaAc缓冲液溶解，获得糖胺聚糖粗品的重量浓度为2%的溶液上柱，溶液通过纤维素层析柱后，用1.5倍柱体积的0.4mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液(pH5.9±0.2)洗涤，再用1mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液(pH5.9±0.2)洗脱，根据紫外检测仪在220nm处数值的变化速度收集洗脱液，置60℃水浴中，用NaOH调pH至10.9±0.2，按体积的3%加入30％双氧水，保持4.5小时，冷却至室温，离心，收集上清液，用HCl溶液调pH至6.9±0.5，加1倍量乙醇，10℃以下静置8小时以上。10℃以下离心，收集沉淀得粗品。
[0044] 粗品用注射用水溶解成5%的溶液（按湿品计），用截留分子量1万的超滤膜浓缩至原体积的1/2，补加水至原体积，再超滤至1/2体积，再加水重复二次，收集浓缩液，置于冻干盘中，液位高度0.6-0.9cm，进冻干箱，冻干得到海参糖胺聚糖精品
[0045] 2．解聚海参糖胺聚糖的制备
[0046] 将上述的海参糖胺聚糖精品，用5%的醋酸溶解，加入重量浓度为30%的双氧水，使溶液中双氧水的重量浓度为5.2%，50℃解聚1.5小时；
[0047] 将解聚溶液用氢氧化钠中和至中性，加入解聚溶液4倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，收集沉淀，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；
[0048] 将粗品干燥，溶于粗品5倍重量的水中，过sephadex-G100柱，用0.05mol/l的氯化钠洗脱5个柱体积，收集45,500Da～46,500Da分子量段的洗脱液，截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-38～-45℃冷冻干燥，获得28g解聚海参糖胺聚糖。
[0049] 经示差折光检测器（RID-10A,岛津）分析，纯度为100.0%的纯品（见图1）。
[0050] 经凝胶柱（TSK gel G4000PWXL）色谱分析，重均分子量46,200Da，多分散度值为1.28（见图2）。
[0051] 实施例2
[0052] 海参糖胺聚糖的提取同实施例1。
[0053] 解聚海参糖胺聚糖的制备方法如下：
[0054] 将上述的海参糖胺聚糖精品，用5.1%的醋酸溶解，加入重量浓度为30%的双氧水，使溶液中双氧水的重量浓度为5.1％，，60℃解聚1小时；
[0055] 将解聚溶液用氢氧化钠中和至中性，加入解聚溶液4倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，收集沉淀，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；
[0056] 将粗品干燥，溶于粗品5倍重量的水中，过sephadex-G100柱，用0.05mol/l的氯化钠洗脱5个柱体积，收集46,550Da～47,500Da分子量段的洗脱液，截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-40～-45℃冷冻干燥，获得10g解聚海参糖胺聚糖。
[0057] 经示差折光检测器（RID-10A,岛津）分析，纯度为100.0%的纯品。
[0058] 经凝胶柱（TSK gel G4000PWXL）色谱分析，重均分子量47,138Da，多分散度值为1.24。
[0059] 实施例3
[0060] 海参糖胺聚糖的提取同实施例1。
[0061] 解聚海参糖胺聚糖的制备方法如下：
[0062] 将上述的海参糖胺聚糖精品，用4.9%的醋酸溶解，加入重量浓度为30%的双氧水，使溶液中双氧水的重量浓度为5.3％，，58℃解聚45分钟；
[0063] 将解聚溶液用氢氧化钠中和至中性，加入解聚溶液4倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，收集沉淀，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；
[0064] 将粗品干燥，溶于粗品5倍重量的水中，过sephadex-G100柱，用0.05mol/l的氯化钠洗脱5个柱体积，收集47,550Da～48,500Da分子量段的洗脱液，截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-40～-45℃冷冻干燥，获得12g解聚海参糖胺聚糖。
[0065] 经示差折光检测器（RID-10A,岛津）分析，纯度为100.0%的纯品。
[0066] 经凝胶柱（TSK gel G4000PWXL）色谱分析，重均分子量48,005Da，多分散度值为1.26。
[0067] 实施例4
[0068] 海参糖胺聚糖的提取同实施例1。
[0069] 解聚海参糖胺聚糖的制备方法如下：
[0070] 将上述的海参糖胺聚糖精品，用4.8%的醋酸溶解，加入重量浓度为30%的双氧水，使溶液中双氧水的重量浓度为5.5％，，58℃解聚分别为40分钟和37分钟；
[0071] 将解聚溶液用氢氧化钠中和至中性，加入解聚溶液4倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，收集沉淀，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品；
[0072] 将粗品干燥，溶于粗品5倍重量的水中，过sephadex-G100柱，用0.05mol/l的氯化钠洗脱5个柱体积，收集47,550Da～48,500Da分子量段的洗脱液，截留分子量5000Da滤膜（杭州庆升净化技术有限公司）超滤，-40～-45℃冷冻干燥，获得12g解聚海参糖胺聚糖。
[0073] 经示差折光检测器（RID-10A,岛津）分析，纯度为100.0%的纯品。
[0074] 经凝胶柱（TSK gel G4000PWXL）色谱分析，解聚时间为40分钟得到重均分子量48,730Da，多分散度值为1.27。解聚时间为37分钟得到重均分子量为50,000Da，多分散度值为1.25。
[0075] 实施例5
[0076] 注射用含有解聚海参糖胺聚糖的药物组合物的制备
[0077] 将11.0g实施例1的解聚海参糖胺聚糖与22g甘露醇混合，加入注射用水1000ml溶解，经过超滤、灌装、冻干，得到1000瓶注射用解聚海参糖胺聚糖的冻干粉针剂。
[0078] 实施例6
[0079] 将5.05g实施例2的解聚海参糖胺聚糖，5.05g实施例3的解聚海参糖胺聚糖与20g甘露醇混合，加入注射用水1000ml溶解，经过超滤、灌装、冻干，得到1000瓶注射用解聚海参糖胺聚糖的冻干粉针剂。
[0080] 实施例7
[0081] 解聚海参糖胺聚糖的药效学实验
[0082] 7.1体外抗凝血实验
[0083] 1试验目的
[0084] 观察解聚海参糖胺聚糖制剂的体外抗凝血作用
[0085] 2试验材料
[0086] 2.1供试样品:
[0087] 名称：解聚海参糖胺聚糖(48,005Da)；缩写：DHG；来源：实施例3的产物；配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。
[0088] 2.2试验动物
[0089] 品系：兔；来源：上海陈行实验用兔有限公司；性别：雄性；体重：1960克；动物合格证号：SCXK（沪）2007-0010
[0090] 2.3试验仪器
[0091] 血小板聚集凝血因子分析仪(型号LG-PABER北京世帝科学仪器公司)
[0092] 3实验方法
[0093] 用血小板聚集凝血因子分析仪测定各浓度样品的血浆凝结时间。实验当日，于样品池中分别加入兔血浆80μl、0.9％氯化钠溶液10μl，预热180s后，加入1％氯化钙溶液10μl，立即混匀，避免产生气泡，用血小板聚集凝血因子分析仪开始计算时间，记录各样品池凝结时间，即为空白。
[0094] 精密量取对照品溶液，用0.9％氯化钠溶液稀释成不同浓度的溶液，即为不同浓度的样品溶液（0.8μg/ml～24.0μg/ml）。
[0095] 用10μl不同浓度的样品溶液代替10μl0.9％氯化钠溶液，分别测定各浓度的样品溶液的血浆凝结时间。每个浓度平行测定4次，求平均值。
[0096] 4实验结果
[0097] 实验结果显示样品浓度在0.8μg/ml～24.0μg/ml剂量范围内，随剂量增加凝血时间延长，凝血时间延长递增趋势缓和。因此，解聚海参糖胺聚糖制剂用于抗凝血更具安全性，可控性，试验结果见表1。
[0098] 表1DHG体外抗凝血实验结果
[0099]
[0100] 7.2皮下注射解聚海参糖胺聚糖对大鼠凝血系统的影响
[0101] 1试验目的
[0102] 观察解聚海参糖胺聚糖对大鼠凝血系统的影响
[0103] 2试验材料
[0104] 2.1供试样品:
[0105] 名称：解聚海参糖胺聚糖46,200Da、47,138Da、48,005Da、48,730Da；50,000Da缩写：DHG；来源：实施例1-4的配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。
[0106] 2.2试验动物
[0107] 品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性[0108] 体重：180-200克；动物合格证号：SCXK（沪）2011-0017
[0110] 2.3试验仪器
[0111] 自动凝血分析仪Sysmex CA-1500
[0112] 3实验方法
[0113] 将SD大鼠50只，分成4个不同的给药组，阴性对照组（皮下注射生理盐水0.5ml）；配置为10mg/kg皮下注射给药，体积0.5ml。
[0114] HDS低、中、高三个剂量组，空白对照组皮下注射给药后2h腹主动脉采血测定PT、APTT、TT数值。
[0116] 4试验结果
[0117] 不同重均分子量的HDS在10mg/kg对APTT、TT、PT产生明显影响，尤其是重均分子量为分48,005Da时相对于其它分子量段的延长更为明显，APTT、TT、PT分别延长了459.68%、167.53%、27.59%，试验结果见表2-3。
[0118] 表2HDS大鼠体外凝血实验结果
[0119]
[0120] 表3HDS大鼠凝血时间延长率
[0121]
[0122] 7.3皮下注射解聚海参糖胺聚糖对大鼠凝血系统的影响
[0123] 1试验目的
[0124] 观察解聚海参糖胺聚糖对大鼠凝血系统的影响
[0125] 2试验材料
[0126] 2.1供试样品:
[0127] 名称：解聚海参糖胺聚糖48,005Da缩写：DHG；来源：实施例3的产物,配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。
[0128] 2.2试验动物
[0129] 品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性[0130] 体重：180-200克；动物合格证号：SCXK（沪）2011-0017
[0131] 饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±1℃，湿度50～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。
[0132] 2.3试验仪器
[0133] 自动凝血分析仪Sysmex CA-1500
[0134] 3实验方法
[0135] 将SD大鼠40只，分成4个不同的给药组，阴性对照组（皮下注射生理盐水0.5ml）；HDS低、中、高三个剂量组（10、20、40mg/kg）皮下注射给药，体积0.5ml。
[0136] HDS低、中、高三个剂量组，空白对照组皮下注射给药后2h腹主动脉采血测定PT、APTT、TT数值。
[0137] 各组动物在手术前10min用3%速可眠腹腔注射麻醉（0.1ml/100g体重），仰卧固定后腹腔手术，用一次性3.2%柠檬酸钠抗凝真空采血管采血。4试验结果
[0138] HDS在剂量10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg对APTT、TT、PT产生极显著影响APTT超过了150%—250%的范围，试验结果见表4、5。
[0139] 表4HDS大鼠体外凝血实验结果
[0140]
[0141] 表5HDS大鼠凝血时间延长率
[0142]
[0143] 7.4解聚海参糖胺聚糖对大鼠动静脉导管血栓形成模型的影响
[0144] 1实验目的
[0145] 观察静脉注射解聚海参糖胺聚糖后对大鼠动静脉导管血栓模型血栓质量的影响。
[0146] 2试验材料
[0147] 2.1供试样品:
[0148] 名称：解聚海参糖胺聚糖（48,005Da）；缩写：DHG;来源：实施例3的产物,配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度
[0149] 2.2对照样品：
[0150] 名称：肝素;来源：国药集团化学试剂有限公司;批号：F20091029；含量：150U/mg；配制：精密称取后以注射用生理盐水溶解并稀释至所需浓度
[0151] 2.3试验动物
[0152] 品系：SD大鼠；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别：雄性；体重：250-300克；动物合格证号：SCXK（沪）2011-0007；饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±1℃，湿度50～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。
[0153] 2.4试验仪器
[0154] BS 110s型电子天平，SARTORIUS公司生产，最小称量值0.1mg。
[0155] 3试验方法
[0156] 将SD大鼠34只，分成4个不同的给药组，阴性对照组（生理盐水1ml/kg），DHG两个剂量组（10、20mg/kg），阳性对照低分子肝素组（2mg/kg）。所有药物均为皮下注射给药，体积0.5ml。
[0157] 各组动物在手术前10min用12%的水合氯醛腹腔注射麻醉（350～400mg/kg）后，仰卧固定，切开颈部皮肤，分离左侧颈动脉和右侧颈外静脉，以一旁路管连接，管中置一7cm长4号手术丝线。分别在给药20分钟后开放血流15分钟，然后取出丝线称重，减去丝线重量，即为血栓湿重。计算出各试验组的血栓湿重平均值及标准差，用t-检验同生理盐水组进行比较。并按下式计算各试验组的血栓湿重抑制率：
[0158]
[0159] 4试验结果
[0160] 试验结果见表6。可以看到，阳性药和受试药物在给药20分钟后测试都可以显著抑制血栓的形成。受试药物对血栓形成的抑制作用与给药剂量呈正比。
[0161] 表6DHG对大鼠动静脉导管血栓形成模型的影响
[0162]
[0163] 与阴性组相比较：*P<0.05，**P<0.01。
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