调节性T细胞在制备治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠
药物方面的应用
技术领域
背景技术
[0002] Zika病毒(ZIKV)是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒。但与大多数虫媒病毒不同，Zika病毒能直接感染和(或)穿过胎盘屏障，导致组织特异性的损伤。妊娠期妇女感染Zika病毒，会导致
胎儿发育异常，包括自发性流产，胎儿宫内发育迟缓及小头畸形。妊娠是属于特殊的免疫耐受的状态。调节性T细胞(T Regulatory cells,Tregs)作为特殊的T细胞亚群，在维持免疫稳态中发挥重要的作用，参与妊娠期免疫耐受的形成。但是，目前的技术，关于调节性T细胞在治疗Zika病毒感染所致不良妊娠中的用途没有得到有效开拓，是本领域长期以来一直研究的课题。
发明内容
[0003] 本发明提供调节性T细胞在制备治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠药物方面的应用及其药效验证方法，以解决背景技术中所提出的问题。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明的
实施例提供调节性T细胞在制备治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠药物方面的应用。
[0005] 进一步的，所述治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠药物至少包括调节性T细胞。
[0006] 本发明的实施例另外还提供一种药物治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠效果的验证方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)建立Zika病毒感染孕鼠模型；(2)检测孕鼠模型的Zika病毒量；(3)病毒空斑试验过程；(4)Smad2及Smad4过表达质粒电转EL4细胞；(5)Western blot分析过程；(6)流式细胞仪分选CD4+CD25+T细胞；(7)调节性T细胞过继转移实验过程。
[0007] 进一步的，药物治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠效果的验证方法，具体包括以下步骤：
[0008] (1)建立Zika病毒感染孕鼠模型，观察脾脏及胎盘中Tregs的变化
[0009] (1-1)建立Zika病毒感染孕鼠模型，IFNAR-/-孕鼠在孕中期(E10.5)感染Zika病毒；
[0010] (1-2)监测孕鼠体重的变化，观察孕鼠的流产率、胎鼠的体重和胎鼠的大小，观察脾脏及胎盘中Tregs数量的变化；
[0011] (2)检测Zika病毒量
[0012] (2-1)收集组织或细胞，取适当重量的组织或细胞加入Trizol裂解，提取RNA，用逆转录
试剂盒，以Oligo(dT)18逆转录为cDNA，-80℃冻存；
[0013] (2-2)Zika病毒：forward，5’-CCGCTGCCCAACACAAG-3’；reverse，5’-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3’；探针，5’-/56-FAM/AGCCTACCT/ZEN/TGACAAGCAATCAGACACTCAA/3IABkFQ/-3’；
[0014] (2-3)以10倍比稀释的Zika病毒感染Vero细胞后，提取的RNA逆转录为cDNA，并以此为模板，在
荧光定量PCR仪上扩增，制定标准曲线；
[0015] (2-4)反应条件：95℃3min预变性；40个循环：95℃，15s；60℃，1min；
[0016] (2-5)对应标准曲线，计算出Zika病毒的相对量；
[0017] (3)病毒空斑试验过程
[0018] (3-1)将每孔1×105Vero细胞接种于6孔板中，待细胞融合至90％，弃去上清，将10倍梯度连续稀释的细胞培养上清加入Vero细胞培养体系中，放置于
培养箱中培养1小时，每15min晃动6孔板一次；
[0019] (3-2)1h后加入半固体培养基培养72小时；
[0020] (3-3)弃培养基，将甲醇及丙
酮1：1混合-20℃固定1h；PBS洗板3次后，加入Zika病毒单克隆
抗体4℃孵育过夜，PBS洗板3次，加入1：2000稀释的HRP-羊抗小鼠二抗，室温孵育60min，PBS洗板3次，加入AEC过
氧化物酶底物，避光反应10min后，加入去离子
水终止反应，
显微镜下观察计算；
[0021] (4)Smad2及Smad4过表达质粒电转EL4细胞
[0022] (4-1)对数生长期的EL4细胞，调整细胞
密度至5×106个/mL，加入2μg构建pcDNA3.1-Smad2和pcDNA3.1-Smad4过表达质粒，用100μL电转液吹打混匀，电转仪电转后培养72小时；
[0023] (5)Western blot分析
[0024] (5-1)收集细胞至EP管中，离心弃去上清，PBS重悬细胞，离心弃去上清；加入蛋白裂解液100μL，其中，RIPA：PMSF：
磷酸酶
抑制剂＝100：1：1，
冰上裂解20min；
[0025] (5-2)细胞经超声后，离心收集上清，检测蛋白浓度；
[0026] (5-3)加入5×上样缓冲液，沸水中煮沸10min，置于-20℃
冰箱备用；
[0027] (5-4)配制10％的分离胶，行
电泳；
[0028] (5-5)转膜后用10％
脱脂牛奶封闭PVDF膜，室温2h；
[0029] (5-6)一抗4℃孵育过夜，PBS洗3次；
[0030] (5-7)二抗稀释后，室温孵育1h；
[0031] (5-8)TBST充分洗膜后，ECL显影；
[0032] (6)流式细胞仪分选CD4+CD25+T细胞
[0033] (6-1)
磁珠分选CD4+T细胞：按制备脾脏单个核细胞悬液；每107细胞以40μl MACS buffer重悬，加入10μl混合抗体，混匀后置4～8℃孵育10min；每107细胞加入30μl MACS buffer，20μl结合抗
生物素抗体的微磁珠和10μl PE标记的抗CD25单克隆抗体，混匀后4～8℃避光孵育15min；孵育后每107细胞加入1～2ml MACS buffer洗涤，300g离心10min；500μl MACS buffer重悬细胞；在MACS
背板上固定MidiMACS磁
铁，置LS分离柱于
磁铁中，加入3ml MACS buffer润湿分离柱；将标记后的细胞悬液加入分离柱中，收集流出的细胞，再用3ml +MACS buffer洗涤3次，直至过柱液体中没有细胞，此为CD4T细胞；
[0034] (6-2)CD4+T细胞计数后，4℃，300g离心5min；每107细胞以1ml
染色缓冲液重悬，每1ml细胞悬液中加入FITC标记抗小鼠CD4单克隆抗体和APC标记抗小鼠CD25单克隆抗体，以标记细胞表面CD4和CD25分子；同时设立同型抗体参照组，以去除非特异性染色，并设定检测象限；4℃避光放置30min；
[0035] (6-3)用预冷的染色缓冲液洗涤细胞两次，4℃，300g离心10min，弃去上清；
[0036] (6-4)每107细胞以1ml染色缓冲液重悬，经FACSAria流式细胞仪分选CD4+CD25+T细胞；
[0037] (7)调节性T细胞过继转移实验过程
[0038] (7-1)细胞样本制备：按步骤(6-1)所述的方法磁珠分选孕18天的孕鼠，获取脾脏+ + 6中CD4CD25T细胞，重悬于PBS中，调整细胞浓度为1×10/ml，备用；
[0039] (7-2)尾静脉过继细胞：建立Zika病毒感染孕鼠模型，孕鼠孕10.5天感染Zika病毒，于孕12.5天尾静脉注射200μl CD4+CD25+T细胞悬液；对照组注射同等剂量PBS；
[0040] (7-3)观察妊娠结局的变化：在孕18天，颈椎脱臼法处死各组孕鼠，置于75％
乙醇中浸泡3～5min。剖腹取出子宫，计数胚胎植入位点。胚
胎体积明显缩小，并伴有出血、
坏死表现者视为流产胚胎。同时，测量胎鼠的体重和胎鼠的大小。
[0041] 本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明的调节性T细胞在制备治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠药物方面的应用及其药效验证方法，提出了用调节性T细胞制备治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠，同时通过孕鼠验证了调节性T细胞在解决Zika病毒感染所致不良妊娠方面，有望在未来解决了目前Zika病毒感染所致不良妊娠无法治疗的问题。
附图说明
[0042] 图1为本发明的实施例中Zika病毒感染孕鼠后检测调节性T细胞的数量统计图；其中，图1A为母鼠的脾脏中Tregs细胞数量统计图；图1B为鼠胎盘中Tregs细胞数量统计图。
[0043] 图2为本发明的实施例中Zika病毒感染EL-4细胞，Western blot检测Foxp3及Smads的表达图。
[0044] 图3为本发明的实施例中过表达Smad2后，Western blot检测Foxp3及Smads的表达图。
[0045] 图4为本发明的实施例中过表达Smad4后，Western blot检测Foxp3及Smads的表达图。
[0046] 图5为本发明的实施例中过继转移调节性T细胞后，检测胎鼠的大小及重量统计图。
具体实施方式
[0047] 为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
[0048] 调节性T细胞在制备治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠药物方面的应用。
[0049] 在进一步的实施例中，所述治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠药物至少包括调节性T细胞。
[0050] 本发明的实施例另外还提供一种药物治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠效果的验证方法，包括以下步骤：(1)建立Zika病毒感染孕鼠模型；(2)检测孕鼠模型的Zika病毒量；(3)病毒空斑试验过程；(4)Smad2及Smad4过表达质粒电转EL4细胞；(5)Western blot分析过程；(6)流式细胞仪分选CD4+CD25+T细胞；(7)调节性T细胞过继转移实验过程。
[0051] 在进一步的实施例中，药物治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠效果的验证方法，具体包括以下步骤：
[0052] (1)建立Zika病毒感染孕鼠模型，观察脾脏及胎盘中Tregs的变化
[0053] (1-1)建立Zika病毒感染孕鼠模型，IFNAR-/-孕鼠在孕中期(E10.5)感染Zika病毒。
[0054] (1-2)监测孕鼠体重的变化，观察孕鼠的流产率、胎鼠的体重和胎鼠的大小，观察脾脏及胎盘中Tregs数量的改变。
[0055] (2)检测Zika病毒量
[0056] (2-1)收集组织或细胞，取适当重量的组织或细胞加入Trizol裂解，提取RNA，用逆转录试剂盒，以Oligo(dT)18逆转录为cDNA，-80℃冻存。
[0057] (2-2)Zika病毒：forward，5’-CCGCTGCCCAACACAAG-3’；reverse，5’-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3’；探针，5’-/56-FAM/AGCCTACCT/ZEN/TGACAAGCAATCAGACACTCAA/3IABkFQ/-3’。
[0058] (2-3)以10倍比稀释的Zika病毒感染Vero细胞后，提取的RNA逆转录为cDNA，并以此为模板，在荧光定量PCR仪上扩增，制定标准曲线。
[0059] (2-4)反应条件：95℃3min预变性；40个循环：95℃，15s；60℃，1min。
[0060] (2-5)对应标准曲线，计算出Zika病毒的相对量。
[0061] (3)病毒空斑试验过程
[0062] (3-1)将每孔1×105Vero细胞接种于6孔板中，待细胞融合至90％，弃去上清，将10倍梯度连续稀释的细胞培养上清加入Vero细胞培养体系中，放置于培养箱中培养1小时，每15min晃动6孔板一次。
[0063] (3-2)1h后加入半固体培养基培养72小时。
[0064] (3-3)弃培养基，将甲醇及丙酮1：1混合-20℃固定1h；PBS洗板3次后，加入Zika病毒单克隆抗体4℃孵育过夜，PBS洗板3次，加入1：2000稀释的HRP-羊抗小鼠二抗，室温孵育60min，PBS洗板3次，加入AEC过氧化物酶底物，避光反应10min后，加入去离子水终止反应，显微镜下观察计算。
[0065] (4)Smad2及Smad4过表达质粒电转EL4细胞
[0066] (4-1)对数生长期的EL4细胞，调整细胞密度至5×106个/mL，加入2μg构建pcDNA3.1-Smad2和pcDNA3.1-Smad4过表达质粒，用100μL电转液吹打混匀，电转仪电转后培养72小时。
[0067] (5)Western blot分析
[0068] (5-1)收集细胞至EP管中，离心弃去上清，PBS重悬细胞，离心弃去上清；加入蛋白裂解液100μL，其中，RIPA：PMSF：磷酸酶抑制剂＝100：1：1，冰上裂解20min。
[0069] (5-2)细胞经超声后，离心收集上清，检测蛋白浓度。
[0070] (5-3)加入5×上样缓冲液，沸水中煮沸10min，置于-20℃冰箱备用。
[0071] (5-4)配制10％的分离胶，行电泳。
[0072] (5-5)转膜后用10％脱脂牛奶封闭PVDF膜，室温2h。
[0073] (5-6)一抗4℃孵育过夜，PBS洗3次。
[0074] (5-7)二抗稀释后，室温孵育1h。
[0075] (5-8)TBST充分洗膜后，ECL显影。
[0076] (6)流式细胞仪分选CD4+CD25+T细胞
[0077] (6-1)磁珠分选CD4+T细胞：
[0078] (6-1-1)制备脾脏单个核细胞悬液：包括以下过程小鼠脱颈处死，无菌取脾，去除脾脏外脂肪包膜，将脾放入铺有滤膜的小平皿中，
研磨脾组织，取细胞悬液移入15ml的试管中。4℃，1,500rpm，离心5min。弃去上清。加入1ml不完全1640重悬细胞，加入10倍体积的红裂液，上下颠倒充分混匀，静置3min。4℃，1,500rpm，离心5min，弃去上清。用5ml
基础1640洗细胞一次，4℃，1,500rpm，离心5min。以去除残余的红细胞裂解液和红细胞碎片。最后用2ml不完全1640重悬细胞，过200目滤膜一次，用3ml基础1640清洗试管和滤膜。4℃，1500rpm，离心5min，弃上清。分离过程中若出现大的细胞团
块聚集，应及时采取尼龙
膜过滤，防止大团块影响后续的试验。
[0079] (6-1-2)取1ml不完全1640重悬细胞，细胞计数。每107细胞以40μl MACS buffer重悬，加入10μl混合抗体，混匀后置4～8℃孵育10min；每107细胞加入30μl MACS buffer，20μl结合抗生物素抗体的微磁珠和10μl PE标记的抗CD25单克隆抗体，混匀后4～8℃避光孵育7
15min；孵育后每10 细胞加入1～2ml MACS buffer洗涤，300g离心10min；500μl MACS buffer重悬细胞。
[0080] (6-1-3)在MACS背板上固定MidiMACS磁铁，置LS分离柱于磁铁中，加入3ml MACS buffer润湿分离柱；将标记后的细胞悬液加入分离柱中，收集流出的细胞，再用3ml MACS buffer洗涤3次，直至过柱液体中没有细胞，此为CD4+T细胞。
[0081] (6-2)CD4+T细胞计数后，4℃，300g离心5min；每107细胞以1ml染色缓冲液重悬，每1ml细胞悬液中加入FITC标记抗小鼠CD4单克隆抗体和APC标记抗小鼠CD25单克隆抗体，以标记细胞表面CD4和CD25分子；同时设立同型抗体参照组，以去除非特异性染色，并设定检测象限；4℃避光放置30min。
[0082] (6-3)用预冷的染色缓冲液洗涤细胞两次，4℃，300g离心10min，弃去上清。
[0083] (6-4)每107细胞以1ml染色缓冲液重悬，经FACSAria流式细胞仪分选CD4+CD25+T细胞。
[0084] (7)调节性T细胞过继转移实验过程
[0085] (7-1)细胞样本制备：按步骤(6-1)所述的方法磁珠分选孕18天的孕鼠，获取脾脏中CD4+CD25+T细胞，重悬于PBS中，调整细胞浓度为1×106/ml，备用。
[0086] (7-2)尾静脉过继细胞：建立Zika病毒感染孕鼠模型，在孕10.5天孕鼠注射Zika病毒，于孕12.5天尾静脉注射200μl CD4+CD25+T细胞悬液；对照组注射同等剂量PBS。
[0087] (7-3)观察妊娠结局的变化：在孕18天，颈椎脱臼法处死各组孕鼠，置于75％乙醇中浸泡3～5min。剖腹取出子宫，计数胚胎植入位点。胚胎体积明显缩小，并伴有出血、坏死表现者视为流产胚胎。同时，测量胎鼠的体重和胎鼠的大小。
[0088] 本发明的实施例中通过上述的验证步骤所得到的验证结论如下：
[0089] 一、调节性T细胞在Zika病毒感染的小鼠体内数量下调
[0090] 将2只IFNAR-/-母鼠与1只IFNAR-/-公鼠合笼12小时后，若检出
阴道栓，则确定小鼠孕期为E0.5(embryonic day 0.5)。在E10.5，IFNAR-/-孕鼠
腹腔注射ZIKV，每天记录母鼠体重变化，于E18.5天剖杀。本发明发现感染ZIKV的孕鼠体重与未感染ZIKV的孕鼠相比较，体重从感染ZIKV第5天出现显著下降，胎鼠体重及大小均显著低于正常组。收集母鼠脾脏，获取单细胞悬液，红裂液裂解红细胞，淋巴细胞分离液分离出胎盘中的淋巴细胞，流式细胞仪进行检测，以CD4+T细胞圈
门，观察脾脏中Tregs(CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T细胞)的比例。本发明发现母鼠的脾脏中Tregs比例显著下调，如图1A所示。收集母鼠胎盘制备单细胞悬液，红裂液裂解红细胞，梯度分离胎盘中的淋巴细胞，流式细胞仪检测母胎界面中Tregs的比例，本发明发现母鼠胎盘中Tregs的比例也相应地出现下调，如图1B所示。因此，在ZIKV感染的动物模型中，Tregs的比例特异性下调。
[0091] 二、Zika病毒能抑制EL-4细胞的Foxp3及相关分子的表达
[0092] 在体外ZIKV感染EL-4细胞，提取蛋白。Western blot法检测Foxp3及相关分子的表达。与对照组相比，ZIKV能显著降低Foxp3的表达，并且能下调P-Smad2，P-Smad3及Smad4的表达，如图2所示。因此，Zika病毒在体外能抑制Foxp3及Smads
信号通路相关分子的表达。
[0093] 三、过表达Smad2能部分逆转由Zika病毒所抑制的Foxp3的表达
[0094] 将pcDNA3.1-Smad2质粒
转染EL4细胞，Smad2表达显著增加。Western blot结果显示，过表达Smad2能显著诱导P-Smad2和Foxp3表达，而ZIKV可以抑制由过表达Smad2所诱导的P-Smad2和Foxp3表达上调，如图3所示。这些数据表明ZIKV通过降低P-Smad2而非整个Smad2的表达，从而抑制Foxp3的表达。
[0095] 四、过表达Smad4能部分逆转由Zika病毒所抑制的Foxp3的表达
[0096] 将pcDNA3.1-Smad4质粒转染EL4细胞，Smad4表达显著增加。Western blot结果显示，过表达Smad4能显著诱导Foxp3表达，而不影响Smad2，P-Smad2，Smad3以及P-Smad3的表达。ZIKV可以抑制由过表达Smad4所诱导的Smad4和Foxp3表达上调，如图4所示。这些数据表明ZIKV通过降低Smad4的表达，从而抑制Foxp3的表达。
[0097] 五、过继转移调节性T细胞，能显著降低流产率
[0098] 用磁珠分选法从正常孕鼠的体内分选出CD4+CD25+T细胞，过继转移至G10.5天ZIKV感染的孕鼠体内，在G18天剖杀孕鼠。如图5A所示，来自正常孕鼠的调节性T细胞过继转移至ZIKV感染孕鼠体内，胎鼠流产率下降。用胎鼠顶臀长度乘以枕额直径衡量胎鼠大小，本发明发现过继调节性T细胞至ZIKV感染孕鼠体内，胎鼠的大小显著增加，与对照组相比，P＜0.05，差异有统计学意义(图5B)。同时，为了进一步明确调节性T细胞对ZIKV感染导致不良妊娠的影响，本发明中还检测了胎鼠的重量，如图5C所示，过继调节性T细胞能显著增加胎鼠的重量，与对照组相比，P＜0.05，差异有统计学意义。孕鼠体内这些数据表明，孕期感染ZIKV所导致的流产与调节性T细胞的减少密切相关，过继转移调节性T细胞能显著降低不良妊娠的发生率，如图5所示。
[0099] 本发明的材料来源信息：
[0100] Vero，JEG-3及EL4细胞株购自Thermo Fisher Scientific公司。
[0101] Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。
[0102] 逆转录试剂购自美国Bio-Rad公司。
[0103] SYBR Green Master Mix，TaqMan Universal Master Mix及Zika病毒探针购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
[0104] 引物由美国Sigma合成；FITC-CD4，APC-CD25及PE-Foxp3流式抗体购自美国BD公司。
[0105] CD4+CD25+T Cell Isolation Kit mouse购自美国Miltenye Biotec公司。
[0106] 抗Foxp3，GAPDH，Smad2，P-Smad2，Smad3，P-Smad3及Smad4抗体购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司。
[0107] Zika病毒单克隆抗体购自美国BioFront Technologies公司。胎牛血清购自Hyclone公司。
[0108] 胰酶及MEM购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
[0109] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
