PCV2、PRV与SIVH9亚型多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR引物及其检测方法
阅读：551发布：2020-05-21
专利汇可以提供PCV2、PRV与SIVH9亚型多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR引物及其检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时 荧光 PCR引物及其检测方法，SIV H9亚型引物的序列如下：上游引物P1：5′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；下游引物P2：5′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′；PRV引物的序列如下：上游引物P3：5′-GGCATCGGCGACTACCT-3′；下游引物P4：5′-CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3′；PCV2引物的序列如下：上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。本发明分别设计扩增SIV H9亚型、PCV2和PRV的特异性引物，通过三重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法能够同时检测SIV H9亚型、PCV2和PRV。SIV H9亚型、PCV2和PRV同时检出的极限拷贝数分别为184拷贝/μL，207拷贝/μL，193拷贝/μL。本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的 稳定性 并且本试验的最大优势在于能够同时检测SIV H9亚型、PCV2和PRV3种DNA病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的 鉴别 。，下面是PCV2、PRV与SIVH9亚型多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR引物及其检测方法专利的具体信息内容。
1.PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR Green I实时荧光PCR引物，其特征在于：
SIV H9亚型引物的序列如下：
上游引物P1：5′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；
下游引物P2：5′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′；
PRV引物的序列如下：
上游引物P3：5′-GGCATCGGCGACTACCT-3′；
下游引物P4：5′-CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3′；
PCV2引物的序列如下：
上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；
下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。
2.利用权利要求1所述引物检测PCV2、PRV与SIV H9亚型的多重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于：
所述SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
所述反应条件为：95℃预变性1min；进入循环，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸
15s，40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。
PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR
引物及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR引物及其检测方法。
背景技术
[0002] 猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)都能够不同程度的导致妊娠引起种猪不育，即公猪睾丸肿胀，精液质量下降，失去种用能力；母猪表现为不发情，返情，不孕；妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等，给养猪业造成了巨大的经济损失。对这类传染病的有效控制是保证养猪业健康发展的关键因素之一。在动物流感中，猪流感是除禽流感以外经济意义最大，而且公共卫生意义特别重要。
2009年墨西哥爆发的猪流感疫情导致数百人死亡，并且，猪流感引起的人类流感迅速在世界上传播开来。所以，猪流感的预防和控制密切关系到人类的公共卫生安全。
2009年墨西哥爆发的猪流感疫情导致数百人死亡，并且，猪流感引起的人类流感迅速在世界上传播开来。所以，猪流感的预防和控制密切关系到人类的公共卫生安全。
[0003] 目前，针对以上三种病毒病的诊断方法有很多，但这些方法具有操作复杂、费时费力、敏感度差及阴性率高等缺点；虽然临床已经使用的PCR诊断技术，有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点，但不能准确定量；而TaqMan荧光定量PCR方法能定量，但成本较高，且需要合成特异性探针。亟需研究开发成本低、简便、快速、特异、定量的检测方法。临床上，这几种病毒常常以混合感染的形式出现，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，对仪器的操作要求较高，所需时间长，亟需一种操作简单、快速的检测、准确率高的鉴别诊断方法。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是PCV2、PRV与SIV H9亚型这几种病毒常常以混合感染的形式出现，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，提供一种PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法。
[0005] 本发明的技术方案是：PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物：
[0006] SIV H9亚型引物的序列如下：
[0007] 上游引物P1：5′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；
[0008] 下游引物P2：5′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′；
[0009] PRV引物的序列如下：
[0010] 上游引物P3：5′-GGCATCGGCGACTACCT-3′；
[0011] 下游引物P4：5′CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3′；
[0012] PCV2引物的序列如下：
[0013] 上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；
[0014] 下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。
[0015] 所述引物检测PCV2、PRV与SIV H9亚型的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应，在25μl体系中加入以下成份：
[0016]
[0017] 所述反应条件为：95℃预变性1min；进入循环，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明分别设计扩增SIV H9亚型、PCV2和PRV的特异性引物，通过三重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法能够同时检测SIV H9亚型、PCV2和PRV。本发明利用TM值来区分不同的核酸片段，核酸片段的TM值主要与GC含量、序列长度和结构有关。SIV H9亚型的扩增片段基因序列长209bp，其TM值在92℃左右；PCV2扩增片段长171bp，TM值在85℃以下；PRV的扩增片段为136bp，TM值89℃左右，SIV、PCV2和PRV的TM值可以很好的区分。
[0019] 在本发明中，SIV H9亚型扩增片段的TM值、PCV2扩增片段的TM值和PRV扩增片段的TM值会在一定的温度范围变动，SIV H9亚型的TM值变化范围为91.8-92.0℃，PCV2的TM值变化范围为84.6-84.9℃，PRV的TM值变化范围为89.2-89.6℃，3种病毒的TM值相差较大，借此可以利用熔解曲线的三个特异性的峰对这3种病毒进行鉴别。
[0020] 本发明的敏感性表明，SIV H9亚型、PCV2和PRV同时检出的极限拷贝数分别为184拷贝/μL，207拷贝/μL，193拷贝/μL。本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的稳定性并且本试验的最大优势在于能够同时检测SIV H9亚型、PCV2和PRV 3种DNA病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别。
[0021] 本发明建立了检测SIV H9亚型、PCV2和PRV多重SYBR Green I荧光定量PCR方法，结果表明，该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性，为SIV H9亚型、PCV2和PRV的检测提供了一种新的方法，可作为规模化猪场SIV H9亚型、PCV2和PRV的净化检测方法，建立无SIV H9亚型、PCV2和PRV的猪群，同时也为SIV H9亚型、PCV2和PRV感染的分子流行病学调查，研究SIV H9亚型、PCV2和PRV分子发病机理，SIV H9亚型、PCV2和PRV诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。附图说明
[0022] 图1是SIV H9亚型部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段；
[0023] 图2是PCV2部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段；
[0024] 图3是PRV部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段；
[0025] 图4是复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应熔解曲线分析；
[0026] 图5是多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应特异性试验熔解曲线分析；
[0027] 图6是复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应同浓度重复性试验熔解曲线分析；
[0028] 图7是不同浓度重复性试验熔解曲线分析；
[0029] 图8是不同浓度重复性试验熔解曲线分析；
[0030] 图9是不同浓度重复性试验熔解曲线分析。
具体实施方式
[0031] PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物：
[0032] SIV H9亚型引物的序列如下：
[0033] 上游引物P1：5′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；
[0034] 下游引物P2：5′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′；
[0035] PRV引物的序列如下：
[0036] 上游引物P3：5′-GGCATCGGCGACTACCT-3′；
[0037] 下游引物P4：5′-CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3′；
[0038] PCV2引物的序列如下：
[0039] 上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；
[0040] 下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′
[0041] 所述引物检测PCV2、PRV与SIV H9亚型的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测：
[0042] 所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
[0043]
[0044] 所述反应条件为：95℃预变性1min；进入循环，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。
[0045] 具体实验操作如下：
[0046] 1材料与方法
[0047] 1.1材料
[0048] 1.1.1毒株、细胞株和菌株
[0050] 1.1.2常用溶液及培养基
[0051] LB液体培养基，4℃保存；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液，100mg/mL；X-gal，浓度为20mg/mL，用棕色瓶或用铝箔包裹的瓶保存，IPTG液，浓度为100mg/mL；贮存于-20℃备用。
[0052] 1.1.3主要仪器及试剂
[0053] 紫外凝胶成像系统购自美国ALPHA INNOTECH公司；Agilent Mx3005P型实时定量PCR扩增仪购自美国安捷伦Stratagene公司、PTC-200型PCR仪购自美国MJ公司等。
[0054] SYBR Premix Ex TaqTM II、EX TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000均购自大连宝生物工程有限公司；Protein K购自华美生物工程公司；T4 DNA连接酶、PGEM-T Easy质粒载体均购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司；RNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限公司；反转录试剂盒购自美国MBI公司。
[0055] 1.2方法
[0056] 1.2.1引物的设计和合成
[0057] 以GenBank公布PRV gH基因，SIVH9基因为参照序列(EF055887)，PCV2 ORF2基因为参照序列(AF027217)，用Primer Premier 6.0生物软件分别设计一对特异性引物，引物的序列如表1所示。
[0058] 表1荧光PCR引物序列
[0059]
[0060] 1.2.2PCV2、PRV、PPV DNA的提取
[0061] 传统的蛋白酶K提取方法：取已经检测过的含有这三种病毒的组织，剪碎、加适量的PBS研磨，取450μL研磨后的组织液，加入等体积样品裂解缓冲液[0.02mol/L Tris HCl(PH 7.5)，0.03mol/L EDTA，1％SDS]，混匀，再加入蛋白酶K(终浓度为200μg/m L)，55℃水浴1h，然后加入等体积的平衡酚，混匀，12000r/min离心5min。取上清，经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀，-20℃放置30min，12000r/min离心5min，70％乙醇洗涤2次，干燥，加入25μL超纯水溶解，贮存于-20℃备用。
[0062] 1.2.3CSFV、PRRSV、SIV H9亚型cDNA的制备
[0063] 取已经检测过的含有这三种病毒的组织，剪碎、加适量的PBS研磨，取450μL研磨后的组织液，然后按试剂盒说明提取和反转录。
[0064] 1.2.4质粒模板标准品的制备
[0065] 以提取的PCV2DNA、PRV DNA和SIV H9亚型cDNA为模板，用优化的条件扩增基因片段。在50μL反应体系中分别依次加入：EX TaqDNA聚合酶28μL，引物浓度P1/P3/P5、P2/P4/P6为0.5μm/L，模板2μL，最后用双蒸水补至50μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：95℃预变性5min后，进人循环95℃30s，56℃30s，72℃20s，30个循环后，72℃延伸10min，4℃结束反应。2.0％琼脂糖凝胶电泳。
[0066] 将扩增出目的片段按DNA凝胶回收试剂盒回收，按照载体连接试剂盒说明书将目的片段与pGEM-T Easy载体相连接，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性菌落，进行菌液PCR鉴定后，用质粒提取试剂盒说明提取质粒DNA，送宝生物工程有限公司进行测序。经测序验证的阳性质粒作为模板标准品，并分别命名为pGEM-H9、pGEM-PRV和pGEM-PCV2。1.2.5SIV H9亚型、PRV、PCV2复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系条件的优化
[0067] SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系如下：
[0068] 在25μL体系中加入以下成份：
[0069]
[0070] 反应条件为：95℃1min；95℃10s，58℃15s，72℃15s，共进行40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。
[0071] 1.2.5.1引物浓度的优化
[0072] 分别以50pmol/μL的引物浓度0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL、0.9μL进行荧光定量PCR反应，选取最佳引物浓度扩增病毒。
[0073] 1.2.5.2退火温度的优化
[0074] 三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR分别以54℃、55℃、56℃、57℃、58℃的退火温度进行反应，选择最佳的退火温度。TM
[0075] 1.2.5.3SYBR Premix Ex Taq II浓度的优化TM
[0076] 本发明中SYBR Premix Ex Taq II的浓度是5U/μL，反应体系SYBR Green ⅠTM荧光定量PCR总体积是固定，通过改变SYBR Premix Ex Taq II的添加量来筛选荧光定量PCR反应体系中SYBR Premix Ex Taq的最佳浓度。分别以10μL、11.5μL、13μL、
14.5μL、16μL、17.5μL的量进行筛选。
14.5μL、16μL、17.5μL的量进行筛选。
[0077] 1.2.6特异性检验
[0078] 按照SYBR Green Ⅰ荧光定量反应体系，分别加入SIV H9亚型cDNA、PRV DNA、PCV2DNA(约20ng)，猪细小病毒(PPV)DNA 1μL(约20ng)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)cDNA 1μL(约20ng)，同时设阴性对照，验证其特异性。
[0079] 1.2.7重复性检验
[0080] 选取SIV H9亚型、PRV、PCV2同一浓度的质粒标准品进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应重复性试验，重复反应三次；将不同浓度的质粒标准品进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应重复性试验，重复反应三次；通过每种病毒的TM值与溶解曲线分析，验证SIV H9亚型、PRV、PCV2多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的稳定性。
[0081] 1.2.8荧光定量PCR敏感性测定
[0082] 分别将SIVH9亚型、PRV、PCV2的重组质粒测OD260值，计算出每微升的拷贝数，然后进行10倍梯度稀释，并作为模板进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应，确定复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应检测每种病毒的敏感性。
[0083] 1.2.9疑似SIV H9亚型、PRV、PCV2病料样品检测及与常规PCR检测方法的比较[0084] 取采自河南省内多个地市猪场的疑似SIV H9亚型、PRV、PCV2感染的病料进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和检测，以验证该方法的实用性。
[0085] 2结果
[0086] 2.1常规质粒PCR扩增
[0087] 如图1-3SIV H9亚型、PCV2、PRV部分基因质粒PCR鉴定结果所示，分别扩增出了与预计大小相一致的209bp、171bp和136bp的片段。pGEM-H9、pGEM-PCV2和pGEM-PRV经EcoR Ⅰ酶切鉴定，得到产物与预期的条带一致。测序与国内流行的毒株相比，核苷酸同源性在100％、97.6％、99.6％以上。
[0088] 2.2质粒浓度的计算
[0089]
[0090] 测得提取的SIV H9亚型、PCV2、PRV质粒DNA浓度分别为：pGEM-H9质量浓度＝52.7μg/μL，pGEM-PCV2质量浓度＝19.9μg/μL，pGEM-PRV质量浓度＝32.4μg/μL。经
10 11
计算，pGEM-H9质粒浓度为2.96×10 拷贝/mL，pGEM-PCV2质粒浓度为2.19×10 拷贝/
10
mL，pGEM-PRV质粒浓度为6.68×10 拷贝/mL。
10 11
计算，pGEM-H9质粒浓度为2.96×10 拷贝/mL，pGEM-PCV2质粒浓度为2.19×10 拷贝/
10
mL，pGEM-PRV质粒浓度为6.68×10 拷贝/mL。
[0091] 2.3SIV H9亚型、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化结果
[0092] 2.3.1引物浓度优化结果
[0093] SIV H9亚型、PCV2、PRV引物均采用50pmoL/μL 0.5μL的量反应体系为25μL，产生特异性的单一峰值，阴性对照无特异性峰值产生。SIV H9亚型、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应的最佳引物浓度是0.5μL50pmoL/μL。
[0094] 2.3.2退火温度优化结果
[0095] SIV H9亚型、PCV2、PRV在退火温度58℃时，均产生了特异性的峰值。SIV H9亚型TM值分别为91.7℃，91.8℃，92.0℃。PCV2TM值分别为84.8℃，84.9℃，85.1℃；PRVTM值分别为89.3℃，89.3℃，89.5℃。阴性对照没有产生特异性峰值。SIV H9亚型、PCV2、PRV三重SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应的退火温度优化结果为58℃。TM
[0096] 2.3.3SYBR Premix Ex Taq II浓度的优化结果
[0097] SIV H9亚型、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应中SYBR Premix TMExTaq II添加量在14.5μL时，三者均可产生特异性的峰值，阴性对照则不产生特异性峰值。
[0098] 2.4复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系的确定
[0099] 通过优化各个反应条件，最终确定了SIV H9亚型、PCV2、PRV多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系，在25μL体系中加入以下成份：
[0100]
[0101] 该反应最终确定的反应参数为：95℃预变性1min，95℃10s，57℃15s，72℃15s，40个循环。反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/sec递增至94℃检测荧光信号，进而得出扩增产物的熔解曲线。
[0102] 2.5SIV H9亚型、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线及SIV H9亚型、PCV2、PRV TM值的确定
[0103] 按照SIV H9亚型、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件，以SIV H9亚型、PCV2、PRV的重组质粒为模板，进行荧光PCR定量PCR反应，经软件Agilent Mx3005P分析后得到熔解曲线(图4)，从图中可以看出三个特异性的峰值所对应的温度为SIV H9亚型、PCV2、PRV的TM值。通过多个批次试验数据的收集整理后，最终确定了SIV H9亚型、PCV2、PRV三种病毒的TM值，分别为：SIV H9亚型91.7-92.0℃，PCV284.8-85.1℃，PRV89.3-89.5℃；阴性对照无峰值产生。
[0104] 2.6多重复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性检验结果
[0105] 从SIV H9亚型、PCV2、PRV多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性试验结果(图5)可以看出，对照组中PRRSV、PPV及阴性对照均无特异性峰值产生。只有试验组中的SIV H9亚型、PCV2、PRV复合荧光PCR产生了特异性的三个峰值。SIV H9亚型TM值为91.8℃，PCV2TM值为84.8℃，PRV TM值为89.3℃。
[0106] 2.7多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果
[0107] 2.7.1同一浓度的SIV H9亚型、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果
[0108] 三次重复性试验中，这三种病毒的TM值都较为稳定。对照组中PRV、PPV及阴性对照均无特异性峰值产生(如表2，图6)。同浓度的SIV H9亚型、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应具有很好的稳定性。
[0109] 表2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR的同一浓度重复性试验分析
[0110]
[0111] 2.7.2不同浓度的SIV H9亚型、PCV2、PRV复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果
[0112] 在不同浓度重复性试验中，这几种病毒的TM值都较为稳定。对照组中PPV、CSFV及阴性对照都没有特异性峰值产生(如表3，图7-9)。不同浓度的SIV H9亚型、PCV2、PRV复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应同样具有很好的稳定性。
[0113] 表3多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR的不同浓度重复性试验分析
[0114]
[0115] 2.8SIV、PCV2、PRV复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR敏感性试验验[0116] pGEM-H9、pGEM-PCV2和pGEM-PRV三种质粒的浓度分别为52.7μg/μL、19.9μg/mL、32.4μg/μL；取等体积的两种质粒混匀后，进行10倍梯度稀释，以此作为模板进行复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应。SIV重组质粒的敏感性可以达到184拷贝/μL，PCV2重组质粒的敏感性可以达到207拷贝/μL，PRV重组质粒的敏感性可以达到193拷贝/μL。
[0117] 2.9三重荧光定量PCR与常规PCR检测比较
[0118] 将疑似患SIV、PCV2、PRV仔猪组织病料23头份(编号为1-23)，阴性对照2头份(编号为24、25)，提取DNA或cDNA，分别进行PCR和real-time PCR检测，结果显示，在23份病料中，常规PCR检出8份SIV H9亚型阳性病料，检出率为34.8％；10份PCV2阳性病料，检出率为43.5％；10份PRV阳性病料，检出率为43.5％；三重荧光定量PCR同样能够检测出常规PCR所检出的阳性病料，二者吻合率达100％；三重荧光定量PCR中，SIV H9亚型检出13份阳性病料，检出率为56.5％，比常规PCR的检出率高21.7％；PCV2检出14份阳性病料，检出率为60.9％，比常规PCR的检出率高17.4％；PRV检出14份阳性病料，检出率为60.9％，比常规PCR的检出率高17.4％.real-time PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。
[0119] 表4 SIV、PCV2、PRV复合荧光定量PCR方法与常规PCR方法比较
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