技术领域
[0001] 本
发明涉及一种利用干细胞组织工程技术构建全层替代皮肤的方法，可以用于替代活体动物(或人体)皮肤用于毒理学试验领域。
背景技术
[0002] 皮肤是人体最大的器官，是外源化学因素(化学品、药品、
化妆品等)或物理机械因素(紫外线、
微波等)毒性作用的主要器官。利用动物或人体皮肤进行皮肤毒性测试是化妆品、药品、
食品添加剂及原料、
农药、
生物制品、化学品健康安全评价的常规检测项目。传统的皮肤安全性评价实验不仅要求一定数量和高
质量的实验动物，而且试验周期长，成本高，某些反应会给动物造成极大的痛苦。世界各国非常重视实验动物的福利问题，如上世纪欧洲各国、美国颁布的动物福利法，中国的《实验动物管理条例》等。随着国际动物保护和动物福利运动的兴起，40多年前国外最先提出了以″减少(reduce)″、″替代(replace)″和″优化(refine)″为核心内容的“3R原则”，并在此
基础上大
力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，不再以动物模式为基础的毒理学系统已被科学家采用，并被许多国家的政府、欧洲和国际法规所接受。2002年11月7日欧洲议会与欧盟理事会在布鲁塞尔达成协议，决定“从2009年3月11日起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏实验”，也“不允许成员国从外国进口和销售进行动物实验的化妆品”。欧盟新化学品法规REACH(化学品的注册、评估、
许可和限制)也提出鼓励动物试验替代方法的开发和应用。采用体外构建的组织工程皮肤进行毒性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。 [0003] 组织工程化皮肤分为组织型表皮替代物、真皮替代物和器官型全层皮肤替代物几类。1975年，Rheinwald和Green采用3T3
成纤维细胞作滋养层，体外培养人自体表 皮细胞获得成功(Rheinwald JG，Green H.Serial cultivation of strains of humanepidermal keratinozytes：the formation of keratinizing colonies from singlecells.Cell.1975，6：331-344)。美国Advanced Tissue Science公司生产的商品名为Dermagraft的人工真皮以高分子材料PGA、PGL网为基础，植入新生儿成纤维细胞后培养成人工真皮替代物，结合自体表皮膜片用于临床移植(Hansbrough JF，Dore C，Hansbrough WB.Clinical trails of a living dermal tissue replacement placedbeneath mesh，split-thickness skin grafts on excised burn wounds.J Burn CareRehabil，1992，13：519-529)。美国Organogenesis公司生产的Testskin人工皮肤模型，其表皮层由人
角质细胞分化形成，真皮层由人成纤维细胞种植于I型
牛胶原
支架构成(Rodriguez H，O’Connell C，Barker PE，et al.Measurement of DNAbiomarkers for the safety of tissue-engineered medical products，usingartificial skin as a model.Tissue Eng，2004，10(9-10)：1332-1345)。2001年2月6日伍津津等人
申请了有关
专利(中国专利申请号01107099.4)，该发明包括胶原凝胶的制备和细胞的三维培养等。2002年9月2日金岩等人申请了有关专利(中国专利申请号02139398.2)，该发明包括胶原凝胶的制备和全层皮肤的培养等内容。但这几种皮肤替代物主要用于烧伤和溃疡、创伤等皮肤缺损病人的临床
治疗，还不能替代活体动物皮肤成熟用于皮肤毒性检验。作为组织工程皮肤也存在以下缺点：人工表皮由于不含真皮层，还不是真正意义上的人工皮肤；现有的含双层结构的人工皮肤组织构造上还有待改进；培养周期长，皮肤功能在体外维持时间短，不适用于慢性毒性试验。因此，用于毒性检验的皮肤不仅要求形态和组织结构与人体皮肤接近，而且要求生理功能和活性与活体皮肤相似，构建的皮肤重复性好，批间差异小，便于毒性效应的统计学分析。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题，就是提供一种利用诱导分化的表皮干细胞或原代分离的表皮干细胞，采用筏式培养技术，制备毒性检验用全层皮肤的方法，该方法培养周期短，皮肤含表皮与真皮双层结构，组织和结构与正常皮肤相似，功能和活性在体外维持时间较长，能满足毒性检验领域的需要。
[0005] 实现本发明依次包括以下几个步骤：
[0006] 1、高分子真皮支架的制备与修饰
[0007] 1)PHBV支架制备：
[0008] (a)将3- 羟 基 丁 酸-co-3- 羟 基 戊 酸 共 聚 物 (poly[3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvaleric acid]，PHBV)溶于氯仿中制成浓度为120-130g/L的溶液，然后每升溶液加入930-950g的
氯化钠(NaCl)为致孔剂，充分混匀，得到浓
浆液； [0009] (b)将浓浆液倒入孔径为0.8～1.0cm圆形金属模具中，待氯仿
溶剂挥发约70-80％后，从模具中取出成形支架，再置于通
风橱内室温48-54小时晾干，25℃-35℃
温度下，1000～1300Pa
真空范围内干燥2小时～3小时除去残余溶剂；
[0010] (c)将成形支架浸入去离子
水中，每隔6-8小时换水1次，48-52小时内换水6-8次直至将致孔剂滤除干净，室温晾干，25℃-35℃温度下，1000～1300Pa真空范围内干燥24-48小时制成PHBV多孔三维支架；
[0011] (d)将PHBV多孔三维支架以无水
乙醇浸泡1-2h，用
波长254nm、36W的紫外线正
反面各照射1.5-2h，无菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，无菌条件下自然晾干； [0012] 2)制备胶原-甲壳糖-
硫酸软骨素-透明质酸修饰液(复合胶原修饰液)： [0013] 按质量比例为14～16：2～4：1：1制备原料I型胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A；在36W紫外灯照射下，用0.1％乙酸搅拌溶解I型胶原然后加入甲壳糖，待甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的6-透明质酸和硫酸软骨素A溶液，继续搅拌溶解3小时；使胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、 透明质酸A最终浓度分别为7-8mg/ml、1-2mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml；然后在
冰浴条件下加入0.5ml10×DMEM培养液，用1mol/L的NaOH快速调pH至7.2-7.3；
[0014] 3)修饰PHBV支架：
[0015] 将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的PHBV多孔三维支架表面，室温条件下静置20-30min，以此面为真皮面，在PHBV多孔三维支架的另一面，用浓度为0.4％的人源Ⅳ型
胶原蛋白浸泡20-30min，此面为表皮面；
[0016] 2、制备表皮干细胞
[0017] 采用两种途径获得表皮干细胞(ESC)，即从人胚胎干细胞定向诱导分化制备ESC和从人皮肤原代分离培养制备ESC。
[0018] 1)从胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞
[0019] 先制备羊膜片：无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml
链霉素的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无菌环境下，按6孔培养板或12孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入无白血病抑制因子(LIF)的胚胎干细胞培养液，收集羊膜分泌液备用。
[0020] 从商业途径购买人胚胎干细胞(hES)，传代培养48小时后，以终浓度为0.125％的4 2
胰蛋白酶+0.01％EDTA消化液消化后按5×10 个细胞/cm
密度接种于铺布有羊膜的6孔或12孔培养板中，用无人LIF的ES细胞培养液培养；每隔1-2天半量换液；经过4天诱导分化培养后，收集粘附在羊膜上皮表面的表皮干细胞(ESC)；
[0021] 2)从人皮肤原代分离培养制备表皮干细胞
[0022] 将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织，将包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；用质量浓度0.25％的裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，然后用生理盐水或D-Hanks液清洗3-5次；
[0023] 表皮部分用质量浓度0.25％胰酶+0.02％EDTA(按1∶1比例混合)，4℃消化2±0.5小时，消
化成单细胞悬液，然后接种于铺布有质量浓度为0.4％的IV型胶原包被的培养皿中，置5％ CO2、37℃
培养箱内快速黏附10-15min后，弃去未粘附细胞。将粘附细胞
4 2
吹打脱离培养壁，按1×10 个/cm 置于第2步1)制备的铺布有人羊膜的培养皿上继续培养，培养基为无LIF的ES完全培养基；或将细胞接种于用5μg/ml丝裂霉素C处理的小鼠
3T3成纤维细胞滋养层上继续培养，所用培养基为全层皮肤专用培养基。
[0024] 采用上述两种方法制备的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19(CK19)单克隆
抗体和鼠抗人β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳性。
[0025] 3、制备原代人成纤维细胞：取外科环切手术获取的包皮组织，以第2步2)所述方法分离皮肤真皮部分，以0.125％胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后放入含10％新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM)培养基培养，每24-36小时半量换液。培养3～4天，待细胞融合约80％时，胰酶消化收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备。
[0026] 4、全层皮肤专用培养基制备
[0027] 取第2步1)收集的人羊膜分泌液，经0.22μm微孔小组
膜过滤后，与角质细胞无-10血清培养基(KSM)与按体积比1.5～2∶8～8.5混合，再添加关键促生长因子5×10 M霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子(EGF)、5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、30μg/mL庆大霉素、15ng/mL两性霉素、30μg/mL牛垂体提取物、5μg/ml转
铁蛋白、-10
1×10 M甲状腺素T3、24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分，培养基中
钙终浓度为0.10mM； [0028] 5、全层皮肤制备
[0029] 将第1步所得的PHBV多孔三维支架置于6孔或12孔培养板上，经复合胶原修饰的真皮面向上，以最小容量100-200μl接种以人KSM培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维5 2 5 2
细胞，细胞密度为1×10cel l/cm-2×10cell/cm，待4-8小时细胞粘附后，加1.5-2ml足量角质细胞无血清培养基浸没培养，每36-48小时半量换液，培养5-7天，完成全层皮肤真皮部分构建；
[0030] 将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步)或2)制备的人表皮干细胞，接种细胞密5 2 5 2
度为1×10cell/cm-2×10cell/cm，用第4步制备的全层皮肤专用培养基代替含10％新生牛血清的H-DMEM培养基，浸没培养72-96小时后，采用气-液界面培养，每48-60小时半量换液，10-14天后完成全层皮肤制备；
[0031] 6、检测
[0032] 同一批以12孔培养板制备的组织工程皮肤中，取其中一
块皮肤固定于以PBS配制的4％多聚甲
醛溶液中，常规乙醇脱水，
石蜡包埋，切片厚5μm—6μm，苏木素-伊红(H.E)
染色；
显微镜下观察人工皮肤的组织结构：去除皮肤结构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者，即得表皮层含基底层、棘层、颗粒层和角化层等分化结构；真皮层含大量成纤维细胞，与PHBV支架融合性好，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显的组织工程皮肤产品，可用于皮肤毒性检测试验。 [0033] 所述的用质量浓度0.25％裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，是将表皮和真皮在37℃的温度下经质量浓度0.25％裂解酶消化3±0.5小时；或在4℃的温度下经质量浓度0.25％裂解酶消化12-18小时。
[0034] 所述的胚胎干细胞培养液为一种常规方法，其采用80％DMEM基础培养液，然后加入20％胎牛血清，1mML-谷
氨酰胺、0.1mMβ-疏基乙醇，1000U/ml人白血 病抑制因子(LIF)，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
[0035] 所述的人胚胎干细胞(ES细胞)为一种来源于的人胚胎内细胞团或原始生殖嵴的全能干细胞，可从商业途径购买。
[0036] 所述的小鼠3T3成纤维细胞为一种来源于SWISS小鼠的成纤维细胞株，可从商业途径购买。
[0037] 所述的胶原为商品，主要成份为来源于牛肌
腱或猪皮或鼠尾的I型胶原粉末。 [0038] 所述的角质细胞无血清培养基KSM(Keratinocyte Serum-Free Medium)为商业化购自国外公司，如美国BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或GIBCO公司的DK-SFM(Defined Keratinocyte Serum Free Medium)。
[0039] 有益效果：本发明用表皮干细胞培养组织工程全层皮肤，细胞分裂增殖能力强，皮肤的形态和组织结构完整、功能和活性体外维持时间较长，能满足亚毒性检验领域的需要；人工合成的支架材料标准化程度高、批间差异小；皮肤构建过程中全程采用无血清培养基，明确了组织构建的影响因素，为以后用于毒性试验减少干扰奠定了基础。由此制备的组织工程全层皮肤重复性好、
稳定性强。通过本发明制备的全层皮肤在解剖和组织结构上更接近于天然皮肤，其应用于毒性检验的方式和检测指标更符合皮肤毒性作用的实际情况，可以代替整体动物，直接应用于化学品、化妆品、药品、农药等健康相关产品的皮肤毒性试验。
附图说明
[0040] 图1为筏式培养毒性检验用组织工程全层皮肤的模式图；
[0041] 图2PHBV与表皮干细胞构建组织工程替代皮肤的组织结构图。HE染色，生物显微镜观察，放大倍数200倍。
具体实施方式
[0043] 依次包括以下几个步骤：
[0044] 1、高分子真皮支架的制备与修饰
[0045] 1)PHBV支架的制备：
[0046] (a)将适量的PHBV粉末溶于氯仿中制成浓度为120-130g/L的溶液，然后每升溶液加入940g的氯化钠(NaCl)为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；
[0047] (b)将浓浆液倒入孔径为0.8～1.0cm圆形金属模具中，待约80％氯仿溶剂挥发后，从模具中取出成形支架，再置于
通风橱内室温48小时晾干，室温下真空干燥除去残余溶剂；
[0048] (c)将成形支架浸入去离子水中，每隔6小时换水1次，48小时内换水8次直至将致孔剂滤除干净，室温晾干后真空干燥24小时制成PHBV多孔三维支架，制成的支架的孔隙率＞90％，孔径大小为80-200um；
[0049] (d)将支架以无水乙醇浸泡1-2h，用波长254nm、36W的紫外线正反面各照射1.5-2h，无菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，无菌条件下自然晾干；
[0050] 2)制备复合胶原修饰液：(胶原为商品，主要成份为来源于牛肌腱、猪皮或鼠尾的I型胶原粉末)
[0051] 在35W紫外灯照射下，用0.1％乙酸搅拌溶解鼠尾胶原然后加入脱乙酰甲壳糖，待脱乙酰甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的透明质酸A和6-硫酸软骨素溶液，继续搅拌溶解3小时；鼠尾胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A净重比例为15：3：1：1，四种材料的最终浓度分别为7.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml和
0.5mg/ml；然后在冰浴条件下加入0.5ml10×DMEM培养液，用1mol/L的NaOH溶液快速调pH至7.2；
[0052] 3)修饰PHBV支架
[0053] 将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的支架表面，室温静置20-30min，以此面为真皮面，在支架另一面，用浓度为0.4％的人源Ⅳ型胶原蛋白浸泡
20-30min，此面为表皮面。
[0054] 2、从人胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞
[0055] 1)制备羊膜片：无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无菌环境下，按6孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于6孔板的孔底；最后加入无白血病抑制因子(LIF)的胚胎干细胞培养液，收集羊膜分泌液备用，铺布好的羊膜片3天内可接种细胞；
[0056] 其中的人胚胎干细胞培养液为一种常规方法，采用80％DMEM基础培养液，然后加入20％胎牛血清，1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-疏基乙醇，1000U/ml人白血病抑制因子(LIF)，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。人胚胎干细胞(ES细胞)为一种来源于胚胎内细胞团或原始生殖嵴的全能干细胞，从商业途径购买。
[0057] 2)胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞：取传代培养48小时的ES细胞，以4
终浓度为0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化液消化后按5×10 细胞/ml密度接种于已铺布好羊膜的6孔培养板中，用无LIF的ES细胞培养液培养；每隔1-2天半量换液；经过4天诱导分化培养后，收集粘附在羊膜上皮表面表皮干细胞。
[0058] 将获得的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19(CK19)单克隆抗体和鼠抗人β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳性。 [0059] 3、制备原代成纤维细胞：将手术环切下的幼儿新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗；然后在无菌条件下去除
皮下组织，将包皮剪切成约1.0mm×2.0mm的皮片；用质量浓度0.25％裂解酶(Dispases)37℃下消化3小时分离表皮和真皮。真皮部分以0.125％胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，放入含10％新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM)培养基培养，每24-36小时半量换液。培养3～4天，待细胞融合约80％时，胰酶消化收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备。 [0060] 4、组织工程全层皮肤专用培养基制备
[0061] 取第2步1)收集的人羊膜分泌液，经0.22μm微孔小组膜过滤后，与角质细胞无-10血清培养基(KSM)与按体积比1.5～2∶8～8.5混合，再添加关键促生长因子5×10 M霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子(EGF)、5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、30μg/mL庆大霉素、15ng/mL两性霉素、30μg/mL牛垂体提取物、5μg/ml转铁蛋白、-10
1×10 M甲状腺素T3、24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分。培养基中钙终浓度为0.10mM。 [0062] 角质细胞无血清培养基(KSM)为商业化购自GIBCO公司的DK-SFM(Defined Keratinocyte Serum Free Medium)；
[0063] 5、组织工程全层皮肤制备
[0064] 将第1步所得的PHBV多孔三维支架置于12孔培养板上，经复合胶原修饰的真皮面向上，以最小容量100-200μl接种第3步以DMEM培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维5 2
细胞，细胞密度为1×10cell/cm，待4小时细胞粘附后，加2ml足量角质细胞无血清培养基浸没培养，每36-48小时半量换液，培养5-7天，完成组织工程皮肤真皮部分构建； [0065] 将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步制备的来源于人胚胎干细胞的人表皮干细
5 2
胞，接种细胞密度为2×10cell/cm，用第4步制备的组织工程全层皮肤专用培养基浸没培养96小时，采用气-液界面培养，每48-60小时半量换液，10-14天后完成组织工程全层皮肤产品制备；
[0066] 5、检测
[0067] 同一批以12孔培养板制备的组织工程皮肤中，取其中一块皮肤固定于以PBS配制的4％多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5μm—6μm，苏木素-伊红(H.E)染色；显微镜下观察人工皮肤的组织结构：去除皮肤结构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者，即得表皮层含基底层、棘层、颗粒层和角化层等分化结构；真皮层含大量成纤维细胞，与PHBV支架融合性好，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显的组织工程皮肤产品，可用于皮肤毒性检测试验。 [0068] 所得的人工皮肤产品用于皮肤刺激性检测：将化妆品、化学品等固体或液体受试物直接放置于人工皮肤表面，液体用量为10μl，固体用量为(10±2)mg并涂布均匀，作用(15±1)分钟后，以无菌PBS冲洗去除受试物再孵育(42±1)小时。从12孔细胞培养板中取下组织工程替代皮肤，部分组织固定于多聚甲醛，HE染色观察
组织病理学形态结构；部分组织采用MTT法分析细胞活性，或用酶联
免疫吸附法(ELISA)检测IL-2等毒性效应指标。
[0069] 所述的MTT法为一种检验细胞活性的常规方法，所述的ELISA检测法为一种检测细胞因子的常规方法。
[0070] 实施例2
[0071] 1、高分子真皮支架的制备与修饰
[0072] 1)PHBV支架的制备：
[0073] (a)将适量的PHBV粉末溶于氯仿中制成浓度为130g/L的溶液，然后每升溶液加入930g的氯化钠(NaCl)为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；
[0074] (b)将浓浆液倒入直径为1.0cm圆形金属模具中0.15-0.2ml，待溶剂挥发后，从模具中取出成形支架，置于通风橱内室温54小时晾干，真空干燥除去残余溶剂； [0075] (c)将成形支架浸入去离子水中，每隔7小时换水1次，49小时内换水7次直 至将致孔剂滤除干净，室温晾干后真空干燥24小时制成PHBV多孔三维支架； [0076] (d)将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡2h，用波长25nm、36W的紫外线正反面各照射2h，无菌PBS漂洗4次，每次20min，无菌条件下自然晾干；
[0077] 2)制备复合胶原修饰液：
[0078] 在紫外灯照射下，用0.1％乙酸搅拌溶解鼠尾胶原然后加入脱乙酰甲壳糖，待脱乙酰甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的透明质酸A和6硫酸软骨素溶液，继续搅拌溶解3小时；鼠尾胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A净重比例为14：4：1：1，最终浓度分别为7mg/ml、2mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml；然后在冰浴条件下加入0.5ml10×DMEM培养液混匀用1mol/L的NaOH快速调pH至7.3；
[0079] 3)修饰PHBV支架：
[0080] 将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的支架表面，室温静置30min，以此面为真皮面，在支架另一面，用浓度为0.4％的人源Ⅳ型胶原蛋白浸泡30min，此面为表皮面。
[0081] 2、人皮肤原代分离制备表皮干细胞
[0082] 1)制备羊膜片：无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含双抗的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无菌环境下，按12孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于12孔板的孔底；最后加入角质细胞无血清培养基(SFM)，收集羊膜分泌液备用，铺布好的羊膜片3天内可接种细胞；
[0083] 2)人皮肤原代分离制备表皮干细胞：将手术环切下的幼儿新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗；然后在无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成约2.0mm×2.5mm的皮片；用质量浓度0.25％裂解酶(Dispases)4℃消化过夜(12小时)分离表皮和真皮，生理盐水清洗3次。表皮部分用质量浓度0.25％胰酶+0.01％EDTA(按1∶1比例混合)，4℃消化2小时，消化成单细胞悬液，然后接种于铺布有质量浓度为0.4％的IV型胶原包被的培养皿中，置5％ CO2、37℃培养箱内快速黏附15min后，弃去未粘附细
4 2
胞，将粘附细胞吹打脱离培养壁，按1×10 个/cm 置于第2步1)制备的铺布有人羊膜的培养皿上继续培养，所用培养基为角质细胞无血清培养基。将获得的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19(CK19)单克隆抗体和鼠抗人β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳性。
[0084] 角质细胞无血清培养基(KSM)为商业化购自GIBCO公司的DK-SFM(Defined Keratinocyte Serum Free Medium)；
[0085] 3、制备原代人成纤维细胞：取第2步2)分离的皮肤真皮部分以0.125％胰酶消化经获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后放入含10％新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM)培养基培养，每24-36小时半量换液；培养3～4天，待细胞融合约80％时，胰酶消化收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备。
[0086] 4、组织工程全层皮肤专用培养基制备
[0087] 取第2步1)收集的人羊膜分泌液，经0.22μm微孔小组膜过滤后，与角质细胞无-10血清培养基(KSM)与按体积比1.5～2∶8～8.5混合，再添加关键促生长因子5×10 M霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子(EGF)、5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、30μg/mL庆大霉素、15ng/mL两性霉素、30μg/mL牛垂体提取物、5μg/ml转铁蛋白、-10
1×10 M甲状腺素T3、24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分。培养基中钙终浓度为0.10mM。 [0088] 4、组织工程全层皮肤制备：
[0089] 将第1步所得的PHBV多孔三维支架置于12孔培养板上，经复合胶原修饰的真皮面向上，以最小容量100-200μl接种第3培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细胞，细胞5 2
密度为1×10cell/cm，待4小时细胞粘附后，加2ml足量角质细胞无血清培养基浸没培养，每48小时半量换液，培养5天，完成组织工程皮肤真皮部分构建；
[0090] 将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步制备的来源于人皮肤组织和原代人表皮干5 2
细胞，接种细胞密度为2×10cell/cm，用第4步制备的组织工程全层皮肤专用培养基浸没培养80小时，然后采用气-液界面培养，每48小时半量换液，12天后完成人组织工程皮肤产品制备；
[0091] 6、检测
[0092] 同实施例1。
[0093] 实施例3
[0094] 1、高分子真皮支架的制备与修饰
[0095] 1)PHBV支架的制备：
[0096] (a)将适量的PHBV粉末溶于氯仿中制成浓度为130g/L的溶液，然后每升溶液加入940g的氯化钠(NaCl)为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；
[0097] (b)将浓浆液倒入直径为1.0cm圆形金属模具中0.15-0.2ml，待溶剂挥发后，从模具中取出成形支架，置于通风橱内室温54小时晾干，真空干燥除去残余溶剂； [0098] (c)将成形支架浸入去离子水中，每隔8小时换水1次，56小时内换水7次直至将致孔剂滤除干净，室温晾干后真空干燥24小时制成PHBV多孔三维支架；
[0099] (d)将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡2h，用波长254nm、36W的紫外线正反面各照射2h，无菌PBS漂洗4次，每次20min，无菌条件下自然晾干；
[0100] 2)制备复合胶原修饰液：
[0101] 在紫外灯照射下，用0.1％乙酸搅拌溶解鼠尾胶原然后加入脱乙酰甲壳糖，待脱乙酰甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的透明质酸A和6 硫酸软骨素溶液，继续搅拌溶解3小时；鼠尾胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A净重比例为16：2：1：1，最终浓度分别为8mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml；然后在冰浴条件下加入0.5ml10×DMEM培养液，用1moil/L的NaOH快速调pH至7.3；
[0102] 3)修饰PHBV支架：
[0103] 将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的支架表面，室温静置30min，以此面为真皮面，在支架另一面，用浓度为0.4％的人源Ⅳ型胶原蛋白浸泡30min，此面为表皮面。
[0104] 2、人皮肤原代分离制备表皮干细胞
[0105] 1)制备羊膜片：无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含双抗的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无菌环境下，按12孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于12孔板的孔底；最后加入角质细胞无血清培养基(SFM)，收集羊膜分泌液备用，铺布好的羊膜片3天内可接种细胞；
[0106] 2)人皮肤原代分离制备表皮干细胞：将手术环切下的幼儿新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗；然后在无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成约1.5mm×2.5mm的皮片；用质量浓度0.25％裂解酶(Dispases)4℃消化过夜(12小时)分离表皮和真皮，生理盐水清洗3次。表皮部分用质量浓度0.25％胰酶+0.01％EDTA(按1∶1比例混合)，4℃消化2小时，消化成单细胞悬液，然后接种于包被Ⅳ胶原的培养皿中，置5％CO2、37℃培养箱内快速黏附15min后，弃去未粘附细胞，将粘附细胞吹打脱离培养壁，接种于用5μg/ml丝裂霉素C处理的小鼠3T3成细胞滋养层上。所用培养基为角质细胞无血清培养基。将获得的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19(CK19)单克隆抗体和鼠抗人β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳性。
[0107] 角质细胞无血清培养基(KSM)为商业化购自美国BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)。
[0108] 3、制备原代人成纤维细胞：取第2步2)分离的皮肤真皮部分以0.125％胰酶消化经获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后放入含10％新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM)培养基培养，每24-36小时半量换液；培养3～4天，待细胞融合约80％时，胰酶消化收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备。
[0109] 4、组织工程全层皮肤专用培养基制备
[0110] 取第2步1)收集的人羊膜分泌液，经0.22μm微孔小组膜过滤后，与角质细胞无-10血清培养基(KSM)与按体积比1.5～2∶8～8.5混合，再添加关键促生长因子5×10 M霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子(EGF)、5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、30μg/mL庆大霉素、15ng/mL两性霉素、30μg/mL牛垂体提取物、5μg/ml转铁蛋白、-10
1×10 M甲状腺素T3、24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分。培养基中钙终浓度为0.10mM。 [0111] 5、组织工程全层皮肤制备：
[0112] 将第1步所得的PHBV多孔三维支架置于12孔培养板上，经复合胶原修饰的真皮面向上，以最小容量100-200μl接种第3培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细胞，细胞5 2
密度为1×10cell/cm，待4小时细胞粘附后，加2ml角质细胞无血清培养基浸没培养，每
48小时半量换液，培养5天，完成组织工程皮肤真皮部分构建；
[0113] 将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步制备的来源于人皮肤组织和原代人表皮干5 2
细胞，接种细胞密度为2×10cell/cm，用第4步制备的组织工程全层皮肤专用培养基浸没培养96小时，采用气-液界面培养，每48小时半量换液，12天后完成人组织工程皮肤产品制备；
[0114] 6、检测
[0115] 同实施例1。
