一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群及其干性检测方法
专利汇可以提供一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群及其干性检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种特异的人 牙根 尖 乳头 干细胞亚群及其富集方法。本方法包含牙组织样品的采集运输， 牙根尖 乳头干细胞的分离，及表达CD18干细胞的富集。本发明还提供了一种富集的牙根尖乳头干细胞亚群 生物 学特性的检测方法。包括与干性相关的集落形成能 力 检测，增殖能力检测，体外成骨分化能力检测，体内成骨分化能力检测。，下面是一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群及其干性检测方法专利的具体信息内容。
1.一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群，其特征在于，所述干细胞为人牙根尖乳头干细胞，所述细胞表面标记选自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一个或多个。
2.权利要求1所述的人牙根尖乳头干细胞亚群，其特征在于，以CD18作为细胞表面标记，所述CD18使用荧光标记或磁珠标记。
3.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的富集方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1，收集正常的成人拔除智齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室，所述成人年龄为19到29岁，从收集到开始提取牙根尖乳头干细胞的时间间隔不超过72小时；
步骤2，转移至生物安全柜，取出智齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液清洗，即PBS清洗其外表面；步骤3，用无菌手术刀轻轻从牙根部切下根尖乳头，切碎；
步骤4，将牙根尖乳头组织置于含1-10 mg/ml I型胶原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化30min；
步骤5，将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得含有人牙根尖乳头干细胞的单细胞悬液，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；
步骤6，用PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；
步骤7，洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；步骤8，通过流式细胞仪分选或免疫磁珠分选，获得CD18阳性干细胞亚群。
4.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；
步骤2，900rpm 离心5min；
步骤3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、
100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；
步骤4，将104个CD18阳性干细胞接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
步骤5，每3-4天换液，14-16天后，倒掉培养液，PBS清洗贴壁细胞，随后用含有0.1%甲苯胺蓝和2%多聚甲醛的PBS溶液进行固定、染色。
5.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；
步骤2，900rpm 离心5min；
步骤3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、
100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；
步骤4，将步骤3得到的细胞以104每孔接种于12孔板中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
步骤5，培养1-2天后，加入Brdu试剂，所述Brdu试剂，孵育24h；
步骤6，Brdu染色试剂盒对细胞进行染色；苏木素复染；镜下计数阳性干细胞数，测定所述干细胞的增殖率。
6.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；
步骤2，900rpm 离心5min；
步骤3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、
100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；
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步骤4，接种 4×10个CD18阳性干细胞于6孔板中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
步骤5，待所述干细胞扩增到 80% 融合度时，更换成成骨诱导培养基，所述培养基为含有 5-30nM 地塞米松，50-300μg/mL 维生素 C 和 1-10 mM β-甘油磷酸钠的 α-MEM 培养基；
步骤6，每3-4天换液；3-4周诱导后，镜下观察所述干细胞，见暗黄色钙结节形成；
步骤7，弃去培养液，PBS 清洗 2 遍后，弃去 PBS；
步骤8，换成 60%的异丙醇进行固定，室温 1min之后，弃去异丙醇，使用双蒸水清洗 2遍，用 1%的茜素红染色，室温 3min；PBS 清洗 2 遍后，吸尽液体后拍照。
7.一种权利要求1或2所述的人牙根尖乳头干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1，将 2×106个CD18阳性干细胞与 15mg 的羟基磷灰石/磷酸三钙，即HA/TCP颗粒混合，并移植到 6-8周龄的免疫缺陷动物背部皮下；
步骤2，移植术后 8 周取材；
步骤3，安乐死处死所述免疫缺陷动物后，小心分离皮下细胞团块和皮肤，用4%的多聚甲醛固定，4℃过夜；
步骤4，弃去固定液，PBS 清洗干净后，换成 10%的 EDTA 进行脱钙，每3天换一次脱钙液，脱钙 21 天后，脱水包埋；
步骤5，切片后，进行苏木素/伊红染色和 Masson’s 三色染色；
步骤6，镜检。
8.权利要求7所述人牙根尖乳头干细胞亚群的干性检测方法，所述免疫缺陷动物为裸鼠。
9.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的用途，其特征在于，用于骨疾病的再生医学和组织工程材料的制备。
10.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的用途，其特征在于，通过转基因技术将CD18基因转入基质干细胞，用于骨疾病的再生医学和组织工程材料的制备。
11.权利要求10所述人牙根尖乳头干细胞亚群的用途，其特征在于，所述的基质干细胞来源选自牙齿、脂肪、骨髓、脐带、胎盘或脐血。
12.权利要求10所述人牙根尖乳头干细胞亚群的用途，其特征在于，所述转基因技术是通过逆转录病毒介导的方式。
一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚
群及其干性检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
10 mM。
图3 CD18阳性干细胞的集落形成能力分析
图4 CD18阴性干细胞的集落形成能力分析对比
图5 CD18阳性干细胞的增殖能力分析
图6 CD18阳性干细胞的体外成骨分化
图7 CD18阳性干细胞的体内成骨分化。
具体实施方式
1.收集正常的成人（19-29岁）拔除智齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-
300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室。从收集到开始提取牙根尖乳头干细胞的时间间隔不超过72小时；
2.转移至生物安全柜，取出智齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline，PBS）清洗其外表面；
3.用无菌手术刀轻轻从牙根部切下根尖乳头，切碎；
4.将根尖乳头组织置于含1-10 mg/ml I型胶原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化30min；
5.将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得单细胞悬液；
6.900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；
7.用适量PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；
8.洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；
9.通过流式细胞分选，分别获取CD18阳性和阴性细胞。
1. 取分选的CD18阳性干细胞亚群，计数；
2. 900rpm 离心5min；
3. 用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；
4
4. 将10 个CD18阳性干细胞接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
5. 每3-4天换液；
6. 14-16天后，倒掉培养液，PBS清洗贴壁细胞，随后用含有0.1%甲苯胺蓝和2%多聚甲醛的PBS溶液对细胞进行固定、染色。超过50个细胞的细胞群被记为一个集落（Colony Forming Unit-Fibroblast，CFU-F）。
材料与方法
1. 取分选的CD18阳性干细胞亚群，计数；
2. 900rpm 离心5min；
3. 用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；
4. 将步骤3得到的细胞以104每孔接种于12孔板中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
5. 培养1-2天后，加入BrdU试剂（1:100），孵育24h；
6. BrdU染色试剂盒对细胞进行染色；
7. 苏木素复染；
8. 镜下计数阳性干细胞数，测定细胞的增殖率。
1. 取分选的CD18阳性干细胞亚群，计数；
2. 900rpm 离心5min；
3. 用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；
4. 接种 4×105个CD18阳性干细胞于6孔板中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
5. 待细胞扩增到 80% 融合度时，更换成成骨诱导培养基（含有 5-30nM 地塞米松，
50-300μg/mL 维生素 C 和 1-10 mM β-甘油磷酸钠的 α-MEM 培养基）；
6. 每3-4天换液；
7. 3-4周诱导后，镜下观察细胞，见暗黄色钙结节形成；
8. 弃去培养液，PBS 清洗 2 遍后，弃去 PBS；
9. 换成 60%的异丙醇进行固定，室温 1min之后，弃去异丙醇，使用双蒸水清洗 2遍，用 1%的茜素红染色，室温 3min。PBS 清洗 2 遍后，吸尽液体后拍照。
1. 将 2×106个CD18阳性干细胞与 15mg 的羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）颗粒混合，并移植到 6-8周龄的裸鼠背部皮下；
2. 移植术后 8 周取材；
3. 安乐死处死小鼠后，小心分离皮下细胞团块和皮肤，用4%的多聚甲醛固定，4℃过夜；
4. 弃去固定液，PBS 清洗干净后，换成 10%的 EDTA 进行脱钙，每3天换一次脱钙液，脱钙 21 天后，脱水包埋；
5. 切片后，进行苏木素/伊红（H&E）染色和 Masson’s 三色染色；
6. 镜检。
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