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可溶性IL-17RA/RC融合蛋白以及相关方法

阅读：958发布：2020-06-17

专利汇可以提供可溶性IL-17RA/RC融合蛋白以及相关方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了IL-17A和IL-17F的拮抗剂。所述拮抗剂基于可溶性IL-17RA和IL-17RC融合蛋白，所述融合蛋白包括含有IL-17RC和IL-17RA(“IL-17RC/IL-17RA”)二者的部分的杂合可溶性受体。这类拮抗剂可用于阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F和/或IL-17A的活性。还公开了使用这类拮抗剂 治疗 疾病 特别是至少部分地由IL-17A和/或IL-17F介导的炎性疾病的方法。，下面是可溶性IL-17RA/RC融合蛋白以及相关方法专利的具体信息内容。

1.一种分离的多肽，包括与SEQ ID NO：158的32-458氨基酸残基具有至少90％或至少95％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够结合IL-17A和/或IL-17F。
2. 权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:183的1-426絲酸錄。
3. 权利要求2的分离的多肽，其中所述多肽包括免疫球蛋白部分。
4. 权利要求3的分离的多肽，其中所述免疫球蛋白部分为免疫球蛋白重链恒定区。
5. 权利要求4的分离的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:183的1-657 或1-658氨基酸残基。
6. 权利要求2的分离的多肽，其中所述多肽还包括分泌信号序列。
7. 权利要求l的分离的多肽，还包括免疫球蛋白部分。
8. 权利要求7的分离的多肽，其中所述免疫球蛋白部分为免疫球蛋白重链恒定区。
9. 权利要求7的分离的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO:158的 32-6卯氨基酸^具有至少90%或至少95%的序列同一性的a^f 列。
10. 权利要求7的分离的多肽，其中所述免疫球蛋白部分包括SEQ ID NO: 158的459-689或459-6卯氨基酸残基。
11. 权利要求7的分离的多肽，其中所述免疫球蛋白部分包括SEQ ID NO:175的1-232絲酸絲。
12. 权利要求l的分离的多肽，其中所述多Jlidi包括聚乙二醇化。
13. 编码权利要求1至12任一项的多肽的分离的核酸分子。
14. 一种表达载体，包括有效连接的下列元件：a) 转录启动子；b) 编码权利要求1至12任一项的多肽的DNA区段；以及c) 转录终止子。
15. —种含有权利要求14的表达栽体的培养的细胞，其中所述细胞表达由 所述DNA区段编码的多肽。
16. —种生产多肽的方法，包括：培养已被导入权利要求14的表达载体的细胞，其中所述细胞表达由所 述DNA区段编码的多肽；以及 回^达的多肽。
17. —种组合物，包括： 权利要求1至12任一项的分离的多肽；和 可药用的载体。
18. —种治疗受试者的炎性疾病的方法，所述方法包括： 将有效量的权利要求1至12任一项的多*予患有炎性疾病的受试者。
19. 权利要求18的方法，其中所述炎性疾病选自：银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、莱姆病关节炎、m菌细胞壁(scw)诱导的关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征(IBS)、憩室病、胰腺炎、I 型糖尿病(IDDM)、格雷夫斯病、特应性皮炎、接触性皮炎、免疫介导 的肾脏疾病、多发性硬化(MS)、系统性硬化症、硬皮病、肾病综冶^征、 J?Ul症、系统性红斑狼痴(SLE)、重症肌无力、肾小g化、膜性神经 病变、肾动M化、肾小球肾炎、淀粉样病变、卡斯尔曼氏病、脾肿大、 移植排斥反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、动脉粥样硬化、内毒素血 症、中毒性休克综合征、脓辜性休克、多器官功能衰竭、炎性肺损伤、 哞喘、成人呼吸系统疾病(ARD)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、嚢性纤 维化、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、气道高反应性、慢性支气管炎、湿疹、 由腹膜炎症导致的腹腔内粘连和/或脓肿、狼疾性肾炎、中风、牙龈il/ 牙周炎、单纯疱渗性角膜基质炎、骨质疏松症、神经炎、再狭窄和川崎病o
20. 权利要求18的方法，其中所述炎性疾病为慢性炎性疾病。
21. 权利要求20的方法，其中所述慢性炎性疾病选自炎性肠病(IBD)、关节炎、特应性皮炎和4H屑病。
22. 权利要求21的方法，其中所述炎性肠病选自溃疡性结肠炎和克罗恩病。
23. 权利要求21的方法，其中所述关节炎选自类风湿性关节炎和银屑病关 节炎。
24. 权利要求18的方法，其中所述炎性疾病为急性炎性疾病。
25. 权利要求24的方法，其中所述急性性炎性疾病选自内毒素血症、败血 症和中毒性休克综合征。
26. 权利要求18的方法，其中所述炎性疾病为自身免疫性疾病。
27. 权利要求26的方法，其中所述自身免疫性疾病选自I型糖尿病(IDDM)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼瘙(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节 炎、炎性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)。
28. 权利要求18的方法，其中所述炎性疾病为慢性炎性气道疾病。
29. 权利要求28的方法，其中所述慢性炎性气道疾病选自哮喘、成人呼吸系统疾病(ARD)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、嚢性纤维化、过敏性哮 喘、过敏性鼻炎、气道高^^应性和慢性支气管炎。
30. 权利要求18的方法，其中所述炎性疾病选自移植排斥反应和移植物抗 宿主疾病(GVHD)。

说明书全文

可溶性IL"17RA/RC融^^白以A^目关方法

背景技术

细胞因子是介导多种生物学效应的可溶性小蛋白质，所g物学效应包括 对多种细胞类型的生长和分化的调节(参见例如，Arai W W， j朋汰及ev. fiM微59:783 (19卯)；Mosma叫C"/r. 0/;/汰/附附腳/1 5 :311 (1991); Paul and Seder， ce//76:241 (1994))。属于细胞因子的蛋白质包括白细胞介素、干扰 素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子和其他的调节性分子。例如，人类白细胞介 素-17是一种刺激白细胞介素-6、胞内粘附^1、白细胞^"-8、粒细胞巨噬 细胞集落刺激因子和前列腺素E2的表达的细胞因子，它还参与了CD34"HtiL前 体选择成熟为嗜中'l!i^立细胞的过程(Yao " ", /• /附/w"/w?/: 755:5483 (1995); Fossiez " /•五平她d甜：2593 (1996))。
结合细胞因子的受体逸常由一种或多种膜内在蛋白质构成，它们以高亲和 力结合细胞因子，并将这一结合事件通过某些受体亚基的胞质部分传导至细 胞。基于各种细胞因子受体的J!^卜配体结合结构域的相似性，可以将各种细胞 因子受体分为几类。
已经证实的一些细胞因子及其受体的体内活性，表明了雞的细胞因子、 细胞因子受体、细胞因子激动剂和细胞因子拮抗剂具有临床应用前景，并且也 表明需要这些其他的细胞因子、细胞因子受体、细胞因子激动剂和细胞因子拮 抗剂。例如，已经证实的促炎细胞因子家族的体内活性，表明了促炎衬的拮 抗剂具有多种临床应用前景，并且樣明需要这些促炎衬的拮抗剂。
附图说明
图1A和lB是人类IL-17RCxl(SEQ D) NO:2)的外显子结构的示意图。对于 密码子被外显子/内衬接头剪接的那些絲酸，已除去接头部分以将完整的 密码子包含在内。
图2A和2B是人类IL-17RCx4(SEQ ID NO:166)的外显子结构的示意图。 图3是人类IL"17RA(SEQ ID NO:21)的外显子结构的示意图。
5图4A和4B是本文所述的位于SEQ ID NO:157和158中的一种本发明优选 的可溶性多肽的外显子结构的示意图。这一可溶性多肽既包括来自人类 IL-17RA(SEQ ID NO:21)的外显子，也包括来自人类IL-17RCxl(SEQ ID NO:2)的外显子。
图5是使用实施例34所述方法进行的一种典型测定的结果的示意图。该图 ;WPrizm软件程序生成的。Y值4议标准化的MFI值，所i^标准化过程;l将 只有配体的孔的MF1值设为最大值(100。/。)，将没有配体/没有可溶性受体的对 照孔的MFI值设为最小值(0。/。)，由此表示配体与细胞的结合百分比。用软件计 算了每条曲线的IC5(Ht。
图6显示了在移植物抗宿主疾病(GVHD)的小鼠模型中橫月mlL-17RA-Fc 进行治疗的效力。将受体小鼠(C57BL/6xDBA/2 Fl)分至各处理组中（PBS或 mlL-17RA-Fc)。通itJtM内注射(每次注射150照)，从而对鼠进行IL-17RA誦Fc 治疗，在-l天时进行第一次注射，之后每隔一天注射一次，直至第15天。在第 0天时，将来源于B6小鼠的8xl(T个^^脾淋巴细自过静脉内注射至受体小鼠 (C57BL/6xDBA/2 F1(BDF1);每组n-10)体内。每周对小鼠的体重变化监测3 次，体重变化是这一模型中疾病恶化的特征性指标。在H7RA-Fc治疗组的小 鼠中，体重下降并不严重(由空心三角形表示)，并JL^著小于PBS对照组的体 重下斷由实心方^4示)(p < 0.05)。
M实施方式
本发明通过提W1炎细胞因子IL-17A和IL-17F的拮抗剂满足了上述需要。 糾而言，所述促炎细胞因子IL-17A和IL-17F具有高度的序列相似性，并具有 许多共同的生物学性质，而且都由激活的T细胞产生。它们都作为可^ii各种 自身免疫性和炎性疾病进程的因子，所述疾病包括类风湿性关节炎和哮喘。事 实上在一些人类疾病的小鼠模型中，能够抑制IL-17A功能的试剂显著斷氐了疾 病的发病率和严重^JL IL-17A通过与其同源受体（cognate receptor) IL>17 受^^IL-17R)^目互作用而介导其效应，但是还未识别到IH7F的受体。以前我 们已经才pLit了 IL-17RCAIL-17A和IH7F二者的受体，并且以相近的高亲和力 与二者结合。另一方面，IL-17R以高亲和力与IL-17A结合，^a仅以非常4氐的亲 和力与IL-17F结合。与上述^it^目一致的是，已显示可溶形式的IL-17R4表达
6任一种受体的细胞中阻断IL-17A的结^^和信号传导，但是它不M扰IH7F 与IL-17RC的结合或IL-17F对IL^7RC的作用。
既然有人已经提出IL-17A干预可以作为对一些自身免疫性疾病的有效疗 法，那么使用能够阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A和/或IL47F的活性 的本发明的拮抗剂应该能够比仅耙向这两种细胞因子之一的疗法更l阮势，所 ii^发明的拮抗剂包括可溶性的IL-17RC和IL"17RC/IL-17RA受体。除了相关 组合物和方法"卜，本发明还提供了上述拮抗剂用于炎性疾病的用途。
A)综述
免疫相关疾病和炎性疾病是相当复杂并且通常互相关联的多种生物途径 的表现或结果，所述生物途^^正常生理M下对于下述过程非常重要：对损 害或损伤的应答，对损害或损伤的修复，以^t于外来生物体产生先天或后天 的防御。当上^常生^it径导致附加的损害或损伤时就会发生疾病或病症， 所述损害或损伤可能直接与应答的强度相关，或作为异常调节或itW，J激的结 果，或作为自身的反应，或;Ui述方式的组合。
虽然上述疾病的发生通常会涉及多个步骤的途径，并通常会涉及多种不同 的生物系统/途径，但是对上述一种或多种途径中的关铣吝、进行干预仍可具有 緩解性或治疗性效果。治疗性干预可以通过拮抗有害过禾l/途径或刺激有利过 銜途径而进行。
已经知道并已广j^JWf究过许多免疫相关疾病。这类疾病包括免疫介导的 炎性疾病(例如类风湿性关节炎、免疫介导的肾脏疾病、肝胆管疾病、炎'« 病(IBD)、银屑病和哮喘)、非免疫介导的炎性疾病、传染性疾病、免疫缺陷性 疾病、瘤形成等。
r淋巴细胞cr细胞)是哺乳动物的免^i答的一个重要部分。T细胞，识别由
主要组织相容性复^^(MHQ中的基因编码的自身^"(self-molecule)相关的 抗原。所述抗原与MHC^1—^J(L于抗原呈递细胞、病毒感染的细胞、癌 症细胞、移植物等的表面。T细胞系统会清除这些可負N"宿主哺乳动物的Ai: 产生iW的发生改变的细胞。T细胞包括辅助T细J^细J^性T细胞。辅助T 细胞在识别到抗原呈递细胞上的抗原一MHC复合物后会大量增殖。辅助T细胞 还分泌多种细胞因子，即淋巴因子，它们在B细胞、细胞条性T细胞和多种参 与免C^答的，细胞的激活中起关4t性作用。
7在体液和细胞介导的免疫应答中的一个关键事件是辅助T细胞的激活和克 隆扩增。辅助T细胞的激活过^^始于T细胞受体(TCR)""CD3复合物与抗原呈 递细I^4面上的抗原一MHC的相互作用。这一相互作用介导了生物化学« 事件并导^tn^2的高亲和性受体(有时AlL-4的高亲和性受体)的表达，所iii 物化学级联事^^导静息的辅助T细J5&i^细胞周期(G0期转变至Gl期)。激活 的T细皿过增殖和分化周期，成为记忆细M效应细胞。
除了通过TCR介导的信号"卜，T细胞的激活还涉及由抗原呈递细JW^L 的细胞因子诱导的或通过与抗原呈递细胞和1细胞上的膜结*子的相互作用 诱导的另外的共刺激。另夕卜，：R^呈递细J^面Ji^达的B7^"与T细J^面 Ji^达的CD28和CTLA-4^"之间的相互作用也导致T细胞的激活。激活的T 细J^4达更多数量的细胞粘附^"，例如ICAM-1、整联蛋白、VLA-4、 LFA-1、 CD56等等。
在混合淋巴细J^养物或混合淋巴细J3^应物(MLR)中的T细J^f殖是一 种^^物刺激免疫系统的能力的公认指标。在多种免a答中，炎症细胞浸润 受伤或感染的位置。迁移细胞可为嗜中'l^细胞、嗜酸性粒细胞、单核细M 淋巴细胞，它们都可通过受影响组织的组织学检查而确定。参见Cw/r做/ iVotoco/y /附附"wofogy， ed. John E. Coligan， 1994，. John Wiley & Sons, Inc。
可通过抑制免a答治疗免疫相关疾病。能抑制有免疫刺激活性的分 子的可溶性受体和/或中和抗体对于治疗免疫介导疾病和炎性疾病将是有利
的。可以应用能抑制免C^答的W(直接应用蛋白质或通过4M M激动剂）
来抑制免M答，并由jH^^免疫相关疾病。
白细胞衬-17(IL-17A)已被识别为松鼠猴(Saimiri)亲r淋巴细胞疱療病毒 (HSV)编码的蛋白质的细胞直系同源物（参见Rouvier et al.， J. ImmunoL, 150(12): 5445-5456 (1993); Yao et aL， J. Immunol" 122(12):5483-5486 (1995)和 Yao et al" Immunity, 3(6):811-821 (1995))。后续的鉴定研究显示，这一蛋白 是負化多种外周组织中诱，A^答的有效细胞因子。IL-17AA—种大小约为 32kDa的由^i键连接的同二聚体细胞因子，它仅由CD4+激活的记忆T细J!fe^ 成和分泌(参见Fossiez et al.， Int Rev. ImmunoL， 16: 541-551 (1998)的综述)。特 别地，IL-17被合成为一种带有一个19至23个g的N端信号序列的155个M 酸的前体多肽，并且以由二"^#^接的同二聚##蛋白的形式分泌。D-17A公 开于W09518826 (1995)、 WO9715320 (1997)和W09704097 (1997)以及美国专 利No.6，063^372。
8虽然H7A的组织分布范围很窄，但是它却^L现对多种类型的细JI^Rr
有多重生物学活性。已经发5UL-17A能够刺激多种细胞因子的产生。它诱导粘 附细胞例如成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞和内皮细胞分泌IL-6、 IL"8、 IL-12、白血病抑制因子(LIF)、前列腺素E2、 MCP-1和G"CSF。 IL-17A还能够 诱导ICAM-1的表面表达、T细胞的增殖和CD34+人类祖细胞的生长以及分化为 嗜中性粒细胞。IL-17A还参与骨代谢，并且它还被证明在以激活的T细胞的存 在和TNFw的产生为特征的病理性疾病中起重JHt用，所述病理性疾病例如类 风湿性关节炎和骨^LA^物的柏动(Van Bezooijen et al.， J. Bone Miner. Res. 14: 1513-1521 (1999))。已发现来自类风湿性关节炎患者的滑液组织的激活T细胞分 泌的lL-17A数量高于来自正常个体或骨关节炎患者的量(Chabaud et aL， Arthritis Rheum. 42: 963-970 (1999))。表明这种促炎细胞因子^?^M?ii:类 风湿性关节炎中的滑液炎症。除了IL"17A的促炎作用夕卜，它似乎iiit过另一种 机制参与类风湿性关节炎的病理学。例如，已显示IL-17A可以诱导破骨细胞分 化因子(ODF)的mRNA在成骨细胞中的表ii(Kotoke et al.， J. Clin. Invest, 103: 1345-1352 (1999))。 ODF刺激祖细胞分化为破骨细胞，破骨细胞是参与骨吸收 的细胞。
由于类风湿性关节炎患者的滑液中IL-17A的水平显著增高，因此IH7A 诱导的破骨细胞形成似乎在类风湿性关节炎的骨吸收中起关键作用。IL-17A还 被认为在某些其他自身免疫性障碍例如多发性硬化中起关键作用 (Matusevicius etal.，Mutt.Scler.， 5:101-104(1999))。另外i3L^示，^LA类巨噬 细胞中，IL-17A通iiJ&内信号传导刺激Ca、iiA^和[cAMP]的减少(Jovanovic et al.， J. Immunol., 160:3513 (1998))。用IL"17A^h理成纤维细胞^i秀导NF-KB的激 活(Yao et al.， Immunity, 3:811 (1995)， Jovanovic et aL，见上文)，而用IL-17A处理 巨噬细胞会激活NF-KB和促细胞分裂剂激活的蛋白激斷Shalom-Barek et al.， J. Biol. Chem.， 273:27467 (1998))。
此外，IL-17A还与参与骨和软骨生长的哺乳动物细胞因子样因子7具有序 列相似性。与IL-17A多肽具有序列相似性的雞蛋白质有人类胚胎来源白细胞 ^"相关因子(EDIRF)和白细胞^h素-20。
与IL-17A的多种作用相一致的是，发现IH7A的细胞表面受体广;^达于 许多组织和细胞类型中(Yao et aL， Cytokine, 9:794 (1997))。虽然才艮据人类 IL-17A受体(IL-17R)的^^酸序列(866个^t^酸)预计该蛋白具有一个单跨膜 结构域和一个525个JL^酸的长胞内结构域，但是该受体序列是独特的，并不类似于来自细胞因子/生长因子受体家族的任何受体的序列。将这一发现与
IL-17A本身与雞已知蛋白不相似这一i人i。4目结合，表明H7A及其受体可能 属于一^Ht号传导蛋白和受体的新家族。已经证实H^17A的活性是通it^合其 独特的细#面受体而被介导的，其中以前的研究显示将T细胞与可溶形式的 IL-17A受体多Jibf目接触会抑制由PHA、伴刀豆球蛋白A和抗TCR单克隆^/^诱 导的T细自殖和IL^2的产生(Yao et al.， J. Immunol., 155:5483-5486 (1995))。因 此，人们对于识别和表征与已知细胞因子受体特别AIU7A受体具有同源性的 新多肽具有浓厚的兴趣。
IL-17F的表顿式似乎与IH7A的相似，以至于它仅包M活的CD4十T 细^单核细胞(Starnes et al. J. Immunol. 167: 41374140 (2001))。已经证实 IL-17F在成纤维细胞中诸导G"CSF、 IL-6和IL"8(Hymowitz et aL EMBO J. 20:5322-5341 (2001》，在内皮细胞中诸导TGF-p(Starnes et aL J. Immunol. 167: 4137-4140 (2001》.最近报道了一种由树突细胞产生的细胞因子IL-23可以——
主要在记忆T细胞中-^h导IL"17A和IL-17F的产生(Aggarwal et aL J. Biol.
Chem. 278:1910-1914 (2003))。
jH^卜，在患关节炎和哞喘的^n^体内均显示出IL-17A和H^17F二者的it^ iiiL上调(参见Moseley et al. Cytokine Growth Factor Rev 14:155-174 (2003)的 综述)。对于关节炎而言，上述细胞因子作用方式的特征为风湿性关节炎和骨 关节炎相关的软骨和关节损伤。例如，已经证实在关节软骨移植物中，IH7A
聚糖和胶原的合成来增强基质的降解(Cai et al. Cytokine 16:10-21 (2001); A加r et al Arthritis Rheum 44:2078-2083 (2001》。
与IL-17A相似，已显示在小鼠体内IH7F的it4达也会增加肺嗜中'l^细 胞的募集，并导致Thl相关细胞因子4^中的表i^f加，所述Thl相关细胞因 子包括IL-6、 IFN个IP誦10和MIG(Starnes et al. J. Imm皿oL 167: 4137-4140 (2001))。 M受变应原攻击的哮喘患者的T细胞中IH7F也会上调(Kawaguchi et al J. Iimmmol 167:44304435 (2001))， i^50L-17F能诱导NHBE中IL-6和 IL-8的产生。与IL-17A不同的是，IH7F似乎在体外能够抑制血管发生 (Starnes et aL J. Immunol 167: 4137-4140 (2001))。
在多种人类組织中用RNA印迹^^r测不到IL-17F的mRNA，但发现它在激 活CD4十T细^单核细JJ^会显著itM^诱导。同样，在小鼠中，发现Th2细 胞和肥大细胞(mast cell)在被激活时会表达IL-17F。（参见Dumont^ ExpertOpin. Ther. Patents 13(3) (2003))。与IL"17A类似，在小鼠中^JLIL-17F的 表达可組國23上调。
IL-17细胞因子/受体家族似乎4化了细胞因子网络中的一个独特的信号传 导系统，这个系统可以为免^1答和炎症应答的处理提#—种新的手段。因此， 本发明基于对新的IL-17家族受体IL47RC以及它与IL"17A和IL-17F二者相结 合的能力的发JL
起初是在使用生物信息学手段寻找与IL"17RA相关的蛋白质时识别出了 IL-17RC，并且是通欲码IH7受糾目关蛋白IL-17RC的cDNA识别出它的。 虽然IL-17RC与能结合IL-17家族典型成员IH7A的IL-17受体(IL-17RA)具有 明显的相似性，而且也识别了IL-17细胞因子家族的五个其他成员，但是之前 并未报道IL-17RC的特异性配体。然而如2005年6月10日提交的z〉布号为No. 20060002925的美国专利申请No.ll/150^533所述，IL-17A和IH7F被识别为 IL-17RC的特异性配体。具体而言，使用被编码人类IH7RA(hlL-17RA)或 IL-17RC(ML-17RC)的构建体稳定转染的幼仓鼠肾细胞(BHK)识别了上述配 体。佳月针对hlL-17RA的单克隆^M^针对hlL-17RC的多克隆抗血清，通过 FACS分析确证了受体在表面的表达。为评估细胞因子的结合，4M了生物素 化形式的人类IL-17A、 C、 D、 E和F，以及荧光染料缀合的链亲和素，通过流 式细胞^测细胞因子与^L转染细胞的结合。结果清楚g^^定转染的表达 ML-17RA的BHK细胞不出所料地明显结合人类IL-17A(hn^l7A),而用空表达 载体转染的细胞不能与所测试的WIL"17家;^员相结合。i^见察到了人类 IL-17F(ML-17F)与hlL-17RA转染细胞的相对较弱的结合，但是所测试的IL-17 家族的^成员没有明显的结合。还检测了，BL"17家;^员与WL"17RC转 染细胞的结合，注意到这些细Jf&^45(L出与ML-17F的明显结合。彭卜，观察 到这些细胞与MI^17A明显结合，但是不与hlL"17C、 D或E结合。上述数^iiE 明ML-17RCAhlL-17F和hlL-17A二者的共同受体。
此外，还检测了各种细胞因子浓度下的荧光水平，以确定WL-17A和F对 于ML-17RA和hlL-17RC的相对亲和力。通过比较M细胞因子在其转染体上 的平均荧光强度，注意到hlL-17A与WL-17RA的结合要比WL-17F强得多，但 ^f起来两种细胞因子与hlL-17RC转染细胞的结合都同样好。^(i得关注的是， 细胞因子与同时表达两种受体的细胞的结合看^M^是加和性的，没有协同性的 迹象。接着，通过尝试与未标记的细胞因子的竟争性结合，研究了这种结合的特
染的BHK细胞-"^培养，并通itFACS定量分析结合的生物素化物质的量7结 果显示hlL-17A和F与ML-17RC的结合都是特异性的，因为浓度3^f增加的未 标记细胞因子^p扰生物素化物质的结合。事实上，未标记的hlL"17A和F可 以有效地与生物素化形式的这两种细胞因子相互竟争结合ML-17RC转染细 胞，这表明这两种细胞因子以相近的亲和力与hlL-17RC结合，并且它们的结 合位点纵使不同也是有所重叠的。未标记的H7A也能与生物素化的 WL-17A和F有舰竟争结合hlH7RA转染细胞，而^M示记的ML-17F絲出基 本上不能与ML-17A竟争结合hlL^17RA。这表明虽然hlH7F表现出结合 hlL"17RA的特异性，^^1这种相互作用的亲合度似乎比ML"17A和ML-17RA 之间的相互作用要弱得多。
进行了饱和结合研究以测量WL^17A和F与WL-17RC和ML"17RA结合的 亲和力。在饱和结^^fr下，将稳^JJihlH7RA或hlL"17RC的BHK细胞系 与硪化的hlL-17A或F—起培养，以测定每种细胞因子对于每种受体的亲和常 数。hlL-17A以相近的亲和力与hlL"17RA和ML-17RC结合《表l)。具体而言， 如方法部分中所述，使用被所示受体转染的BHK细胞来测定对于hlL-17A和 ML-17F的Kd值。结果显示的是来自三次平行实验测定的平均Kd值。 表l
WL國17A ML-17F
ML画17RC(x1)1 0.6 nM 1.0 nM
ML-17RA 1.9 nM
i表示hlL-17RC的xl剪接变体。
此夕卜，MH7F对WL-17RC的亲和力与ML-17A对这一受体的亲和力相当 接近(见上表l)。然而与使用生物素化细胞因子所得到的结^目一致的是，
这表明虽然hlL-17A和F以相近的亲和力与hlL-17RC结合，但是它们对 hlL-17RA的亲和力却迥然不同。
hlL-17RC以高亲和力结合hn^r7A和F的这一观察结果表明，表达 ML-17RC的细胞对于WL-17A和F应有相等的应答能力。另一方面，由于 hlL-17RA以高亲和力结合WH7A，而与h!L-17F的相应亲和力要"j氐约100(Hi"，这表明表达ML-17RA的细胞在生理奈件下可能只对hlL-17A有应答。在之前的 研究中已显示出ML-17RA的表达十分广泛，但是^iHii了其在itjfiL细胞中的 表达较高，而在絲组织中较低。因jtb^测了UL-17RC的表达，以确定各表 #式中的重叠程度。RNA印迹分;tt显示，H7RC在自织例如肾上腺、 前列腺、肝l^甲;^J泉中表ii^平较高，而在JtiL组织中没有可^r测的扇Ji。 为进一步研究这些受僻MfcitiL细胞中的表达，还用多^ltFACS分析^"测 了生物素化WL-17A和F与外周血单核细胞(PBMC)的结合。结杲昆示UL-17A 几乎与所检测的所有PBMC亚群都结合，而H7F与任何上iiit群都没有可 检测的结合。这一结果与hlL-17RA以高亲和力结合hlH7A但不结合WL-17F 的能力相符，而且与在PBMC中检测不到hlL-17RC的inRNA的结果HM目符。 总之，上述数据表明IL-17RC优先在非itjk组织中表达，而IL"17RA优先扭 血细胞中表达。
hlL"17A和F与ML-17RC转染细胞的高亲和力结合表明可溶形式的 ML-17RC可能是一种有效的治疗手段。这类分子可能是这两种细胞因子的有 效拮抗剂。为直接检验上述推断，以Fc-融^白的形式产生了可溶形式的人 类hlL-17RC,并测试了它抑制H7A和F的结合的能力。然后将上i^t果与 用可溶形式的UL-17RA获得的结果进行比较。在结合反应中使用了浓度* 增加的WL"17RC-Ig或WL-17RA-Ig，并^^IFACS分析来评估可溶性受体对于 生物素化细胞因子与稳定转染的BHK细胞的结合的影响。可溶性UL"17RC以 基本相同的程度抑制与WL^17A和F的结合，而IH7R家族的另一成员 WL"17RD的Fc-融^^白却没有作用。另一方面，可溶性WL"17RA有,阻断 了WL-17A的结合，但是对WL"17F的结合^^L有作用。在^"测hlL-17A与造 血细胞的结合时也得到了相似的结果。这一结合可以被ML-17RA-Ig和 WL"17RC-Ig有放地阻断，但不会自I^17RD-Ig阻断。上述数提与亲和力测量 所得到的结«目一致，表明可溶性受体与它们的膜锚定形式的作用相同。
作为评估人类ML"17RC-Ig与hlH7A和F结合的能力的另一种方式， Biacore^才/Hf估了可溶性受体对这些细胞因子的亲和力。可溶性ML"17RC以 高亲和力结合hlL-17A和F(42)，这为将这一试剂在体内用作WL^17A和F两者 效果的拮抗剂的想法提供了额外的支持。具体而言，将可溶性受^t获到芯片 上，并如下所述J4ii行结合实验。ND=没有可检测的结合。 42table see original document page 14

由于人类的剪接变体非常多，因处我们仅针对这些分子的一个亚群进行了
初始实验。净ici^择用于这一分析的那些分子也不尽相同，有的含有外显子7，
有的不含有外显子7，但是与小鼠的相应^不同的是所有的剪接变体^^有 整个外显子8。存在于小鼠夕卜显子8序列中部的隐藏剪接受体并不存在于人类外 显子8中。然而，所测试的，剪接变体可以含有或不含有WL-17RC外显子12。 这些变体被命名为UL-17RCxl(在外显子组成上与上述的小鼠xl相同）、 hlL^17RCx4(在外显子组成上与上述的小鼠x4相同）、hEL-17RCx2和 ML-17RCx7。另外，在293F细胞中短暂表iiil些剪接变体，并测试了它们结 合生物素化的小鼠和A^类IL"17A和F的能力，测试结果总结于^3中。
table see original document page 14

表示完全包含于转录物中的外显子。2(+)表示可检测的明显的细胞因子结合，所^合是^HFACS所测荧光的 显著增加而评估的。（-)表示荧光波有明显的变化。
与之前的实^^^f目一致的是，hlL-17RCxl可以与hlL-17A和F两者结合， 但是不与任一种小鼠细胞因子结合。hlL-17RCx4也可以与这两种人类细胞因 子结合，与其小鼠相应分子类似，它可以结合mlL-17F但不结合mn^l7A。 ML-17RCx2和x7不能结合测试的四种细胞因子中的^—种，但是它们在转染 细胞的表面有显著的表达，因为针对HL-17RC的多克隆^iL清能染色CD8+细 胞(数据未示出)。上^合实验的结^4^定转染的BHK细胞中^f到了很好 的重复。总之，上述数据支持了下i^论：IL-17RC蛋白的关键部分是结合人 类细胞因子所必需的。
多种出版物都涉;SJL-17A,狄较少的出版物涉;SJL-17F, ^H人为它们会 加重小鼠体内的J!^^诱导关节炎(CIA)和人类类风湿性关节炎的疾病进程和严 重程度。检测了被胶原免疫而诱发CIA的小鼠的关节和引流淋巴结(DLN)中的 mlL"17A和F两者的表达。通过实时PCR进行的分析清楚地证实，与未免疫的 对照相比，在患病小鼠的上述两种组织中这两种细胞因子均上调，清楚地表明 表达与疾病相关。此外，ii^目同组织中检测了mlL-17RA和mlL"17RC的相 对表达。然而，在这种情况下，并没有发现^"-受体的表达与疾病之间的可重 复的相关性。而且，DLN与非造jfiL组织(后足讨目比，表ii^JC平有明显的差异。 与前述研究人类受体表达的实M勤目一致，发现mlL-17RA4ilifiL组织中的 表达更高，mlL-17RC在非造^L组织中的表达更高。这一数据表明mlH7A和 mlL-17F表达的^L形式与疾病相关，^明这两种必需受体在患病组织和正 常组织中都有，a明中和这些细胞因子可食^1防止疾病J^的有效疗法。
因此，证明IH7A和F的同源受体为IL-17RC。值得注意的是，UL-17RC 以相似的亲和力结^WL"17A和F。由于这两个IL-17家;^员具有55%的序列 同一性，因此它们具有共同的受体可能也并不意夕卜。然而，UL-17RA与hlL"17A 结合的亲和力很高，但是与hlH7F结合的亲和力JH^近100(HI"， &明在 生理条件下WL-17RA不会结合hlL"17F。这暗示着表达hlL"17RC的细胞应该 对ML-17A和F都产生应答，而^f5l^达hlL-17RA的细胞应该^M"IL"17A有应 答。这一差异可能，响这些细胞因子对不同组织的作用。通#达分析，显 示虽然IL-17RA的表达十分广泛，^L是它^itjk细胞中的表达更高，而IL-17RC 倾向于在非itiL组织中表达而不4itjfe细胞中表达。与此一致的是人类外周血单核细胞的所有亚群都结合ML"17A，但郭不结合UL-17F。而且，&明非造 血组织将会对IL-17A和F都有应答，而itjk细l&4fMTL-17A有应答。
对于细胞因子与不同IH7RC剪接变体结合的这一检测发现了受体中的
细胞因子结合所必需的两部分，这两部分在小鼠和人类细胞因子的结^Nr性上
有细微的差异。而且，不论所检测的受体种类，对于细胞因子而言这些结^# 性都是一致的。如^3中的数据所示，由于hBL-17A和Ff5l^合人类xl变体和人 类x4变体，因此，外显子12和整个外显子8都是这些细胞因子结合IL-17RC所 必需的。上述所有同种型#^有整个外显子8和外显子12,但是它们在是否含 有外显子7方面有所差异。ii4明夕卜显子7不是结合人类细胞因子所必需的。
从现有信息似乎可以明显看出生成IH7A和n^l7F两者功能的拮抗剂的 重要性，贿信息表明IL-17A和F的表达与多种自身免疫性和炎性疾病的进程 都有很强的关联性。这两种细胞因子可诱导絲炎性细胞因子和趋化因子以及 M金属蛋白酶，它们会加重自身免疫性关节炎中的M^、和骨损伤。这"^剂 可以作为与hL"17A和F有关的类风湿性关节炎和务他炎性疾病的有效疗法。
因此，开发了可溶形式的人类IH7RC作为IL-17A和IL-17F两者的拮抗 剂。这些可溶性IL-17RC多肽是有治疗效果的。然而，由于M因素，可溶性 IL-17RCflb争由SW技术中可用的多种不同生产系统分泌。而且分泌的量也不 足以满足工业生产的需要。因此，在本领域中需要开发能够^L量表ii^分泌 的IL-17A和IL-17F的拮抗剂，所述的表达量和分泌量能够被放大至用于工业生 产。
因此，本发明通过提供可^Ji^分泌的IL"17A和IL-17F拮抗剂满足了上 述需要。M而言，本发明基于开发和发现了多种非天然存在的可溶fe^或 可溶性多肽，所述非天然存在的可溶性衬或可溶性多肽能够结合、拮抗和/ 或阻断IH7A和IL"17F与其同源受体的结合。所述可溶性多肽包括IH7RC的 一部分。所述可溶性多JI;a可同时包括IL"17RC的一^P^IL-17RA的一部分 ("IL画17RC/IL國17RA")0
图4A和4B以;SJSEQ ID NO:157和15鹏述了一种这样的优选实施方案。这 种可溶性多肽包括人类IH7RA(SEQ ID NO:21)的外显子l-6和人类 IL-17RCxl(SEQ ID NO:2)的外显子8-16。更M而言，这种可溶性多肽是与 Fc衬融合的，所述Fc分子例如SEQD)No:157和158中包含的Fc5。然而，本 领域技#员可以容易地认识到，可以4狄^fi^c^以及能导致形成二聚体 的做辆衬。因此，IL-17F和IL"17A活性的拮抗剂，例如本发明的IL-17RC和 IL-17RC/IL-17RA可溶性受体，可用于炎性疾病的治疗性疗法，特别是作为 IL-17F和IL-17A两者的拮抗剂单独或结合用于治疗与这些M有关的疾病。此 外，IL-17A和IL"17F活性的拮抗剂，例如本发明的可溶性受体，可用于， 炎性疾病的治疗性疗法，例如在下列疾病的治疗中可以(单独M共同地)结合、 阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F和IL-17A，所述疾病例如：银屑病、特 应性和接触性皮炎、IBD、 IBS、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关 节炎、银屑病关节炎、成人呼吸系统疾病(ARD)、感染性>^克、多器官功能衰 竭，炎'lt^损伤例如哮喘、慢性阻塞'l^病(COPD)、气道高瓦应性、慢性支 气管炎、过敏性哞喘、细菌性肺炎、银屑病、湿渗，以及炎性肠病例如溃疡性 结肠炎和克罗恩病(Crohn，s disease)、幽门螺^^杆菌(/^//cM"cte, /?>^")感染、 由于皿炎症(即由于感染、损伤等)引起的«内粘连和/或,、系统性红斑 狼瘙(SLE)、多发，lt^化、系统*1±^化病、肾病综合征、器官同种^^tt物 排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、肾、肺、心脏等器官的移植排斥、M菌 细胞壁(SCW)诱发的关节炎、骨关节炎、牙龈A/牙周炎、疱务性间质角膜炎、 包括前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病的癌症、血管M、 再狭窄和川崎病。
细胞因子受体亚基以多结构域结构为特征，包括一个配体结合结构域和一 个通常M信号转导的^结构域。多聚体细胞因子受体包括单体、同二聚体 (例如，PDGF受^oa和pp同种型，红细胞生成素受体，MPL[血小M成素受 体】和G-CSF受体)、亚^p^有酉沐结合结构域和效应结构域的异二聚体 (例如PDGF受体ap同种型)和由具有不同功能亚基构成的多聚体(例如H^2 、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 Hy7和GM-CSF受体)。 一些受体亚基是多种受体所 共有的。例如，AIC2B亚基AIL-3和GM-CSF受体所共有的组成部分，它本身 不能结合配体，但包括一个胞内信号转导结构域。许多细胞因子受体基于其结 构和功能^T被归入四个相关家族中的一个。例如I型itife受体的特征在于具 有一个包M守半MJL^J^WSXWS基序的结构域。在某些itiL受体中还
存在以_=^键环为特征的，结构域，包括蛋白激酶结构域、纤连蛋白m型结
构域和免疫球蛋白结构域。细胞因子受体结构的综述可参见Urdal， ^«汰 及gw他M^ C/^肌26:221-228， 1991和Cosman， Q^toA/"e 5:95~106， 1993。通常 认为在促^^物体获得新生物功能的选择压力下，在已有受体基因的复制过巻
17中会产生新的受体家M员，导致产生多基因家族。因此家^员就^^有祖 先基因的残留痕迹，可以利用这些特征来分离和识别务他的家族成员。
因此，本发明涉;SJI^17A和IL-17F的拮抗剂，所述拮抗剂能够通过^""种 配体对应的一种或多种受体阻断^种配体的结合和/或信号传导。
在优选的实施方案中，这类拮抗剂是基于图l-4所示的IL-17RC的多肽结 构。基于是否含有一些特定的外显子，IH7RC受体具有许多种剪接变体。如 下所述，这些外显子中有一些是酉&^(IL"17A和/或IL^17F)结合所必需的。
本发明部分地基于这一发现：IL"17RC和IL^17家族的其他成员例如 IL-17RA(SEQ ID NO:21之间具有相似的结构("结构域")。具体而言，识别了 三个结构域：
1) 结构域1(SEQ ID NO:159和160)包括IL-17RC的外显子8"10。这对应于 IL-17RCxl(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基193^276和IL-17RCx4(SEQ ID NO:166)的絲^J^208-291。
2) 结构J^2(SEQIDNO:161和162)包括IL-17RC的外显子ll-13。 i^t应于 IL-17RCxl(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基277-370和IL-17RCx4(SEQ ID NO:166)的^iJ^^J^92-385。
3) 结构J^3 (SEQ ID NO:163和164)包括IL-17RC的外显子14-16。 i^J"应 于IH7RCxl(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基371-447和IL"17RCx4(SEQ ED NO:166)的M^j386-462。
因此，本发明涉4于图l所示外显子的不同组合的可溶性IU7RC多肽。 M而言，这些可溶性多肽的实例包括：
1) 变体1210(SEQ ID NO:67和68)，它包括人类IL-17RCxl的外显子l"6和 8画16，并通iti^接物(SEQ ID NO:176和177)融合有FclO(SEQ ID NO:174和 175)。变体1210还具有来自otPA(示于SEQ ID NO:178的多肽序列)的一个前原 信号一re^pro signal peptide),也可以佳月Fc5或本领域已知的任何等同物代 替FclO。
2) 变体1390(SEQ ID NO:69和70)，它包括人类IL"17RCxl的外显子l-6和 8-16,并融合有FclO(SEQD)NO:174和175)。变体1390还具有一个天然信号序 列。也可以佳月Fc5或本领域已知的,等同物代替Fc10。
3) 变体1341(SEQ ID NO:71和72),它包括鼠类II^17RA的外显子l-6和人类 IL-17RCxl的外显子^16,并通过连接物(SEQ ID NO:176和177)融合有FclO(SEQ ID NO:174和175)。变体1341还具有来自鼠类IH7RA(SEQ ID NO:181)的一个ff号肽。也可以使用Fc5或本领域已知的任何等同物代替Fc10。
4) 变体1342(SEQ ID NO:73和74)，它包括A^类IL-17RCxl的外显子8"16， 通iti^接物(SEQ ID NO:176和177)融合有FclO(SEQ ID NO:174和175)。变体 1342还具有来自otPA(示于SEQ ID NO:178的多肽序列)的一个前原信号肽。也 可以偵月Fc5或本领域已知的任何等同物代替Fc10。
5) 变体Sl(SEQIDNO:77和78),它包括人类IL-17RCxl的外显子l-7，并融 合有Fc5(SEQ ID NO:179和180)。变体Sl还具有天然信号序列。也可以使用Fc10 或本领域已知的^^T等同物代替Fc5。
6) 变体S2(SEQIDNO:81和82)，它包括人类IL-17RCxl的外显子l-8，并融 合有Fc5 (SEQ ID NO:179和180)。变体S2ii具有天然信号序列。也可以4錢 Fcl0或本领域已知的^^T等同物^R^Tc5。
7) 变体S3(SEQIDNO:85和86)，它包括人类IL-17RCxl的外显子l-9，并融 合有Fc5(SEQ ID NO:179和180)。变体S3还具有天然信号序列。也可以使用FclO 或本领域已知的任何等同物代替Fc5。
8) 变体S4(SEQ ID NO:89和90),它包括人类IL-17RCxl的外显子l-10,并 融合有Fc5(SEQ ID NO:179和180)。变体S4还具有天然信号序列。也可以4M Fcl0或本领域已知的任啊等同物代替Fc5。
9) 变粘5(SEQ ID NO:93和94)，它包括人类EL47RCxl的外显子l-11，并 融合有Fc5(SEQ ID NO:179和180).变粘5还具有天然信号序列。也可以4M FclO或本领域已知的任何等同物代替Fc5。
10) 变粘6 (SEQ ID NO:97和98)，它包括人类IL-17RCxl的外显子14-16， 并融合有Fc5(SEQK)NO:179和180)。变体,具有天然信号序列。也可以使 用FclO或本领域已知的^^T等同物代替Fc5。
11) 变体S7(SEQ ID NO:101和102),它包括人类H7RCxl的外显子ll-16， 并融合有Fc5(SEQ ID NO:179和180)。变体S7还具有天然信号序列。也可以使 用FclO或本领域已知的任何等同物代替Fc5。
12) 变体S10(SEQ ID NO:105和106)，它包^v^类IH7RCxl的外显子7-16， 并融合有Fc5(SEQ ID NO:179和180)。变体S10还具有天然信号序列。也可以使 用Fcl0或本领域已知的^^T等同物>^#^^5。13) 变体S11(SEQ ID NO:109和110),它包括人类IL-17RCxl的外显子l-7 和14-16，并融合有Fc5(SEQIDNO:179和180)。变体S11还具有天然信号序列。 也可以使用FclO或本领域已知的，等同物代替Fc5。
14) 变体S12(SEQ ID NO:113和114),它包括人类IL-17RCxl的外显子l画7 和11-16,并融合有Fc5(SEQD)NO:179和180)。变粘12还具有天然信号序列。 也可以4^1 Fcl0或^^々页域已知的4彿等同物^R^Tc5。
15) 变体S13(SEQ ID NO:117和118)，它包括人类IL-17RCxl的外显子l-13 和人类IL-17RA的外显子7-9，并融合有Fc5(SEQ ID NO:179和180)。变粘13 还具有天然信号序列。也可以使用FclO或本领域已知的^^T等同物代替Fc5。
16) 变粘14(SEQIDNO:121和122)，它包括鼠类IL-17RA的外显子1^6、人 类H7RCxl的外显子8-13和鼠类IH7RA的外显子7-9,并融合有Fc5(SEQ ID NO:179和180)。变体S13还具有天然信号序列。也可以使用FclO或本领域已知 的《^T等同物^^^Fc5。
17) 变体1407(SEQ ID NO:139和140),它包括人类EL-17RA的外显子1-10 和人类IL-17RCxl的外显子8-16，并融合有Fc5(SEQ ID NO:179和180)。变体 1407还具有来自人类IL-17RA的天然信号肽。也可以使用FclO或W域已知的 B等同物代替Fc5。
18) 变体1459(SEQ ID NO:151和152)，它包括人类IL-17RCxl的外显子l-6 和8"16,并融合有Fc5(SEQIDNO:179和180)，并具有一个Leu21Ala的置换(与 IL-17RCxl相比)。变体1459还具有来自otPA (多肽序列示于SEQ ID NO:178) 的一个前原信号肽。也可以使用FclO或本领域已知的任何等同物代替Fc5。
19) 变体1454(SEQ ED NO:157和158)包括人类IL-17RA的外显子1^6和人类 IL-17RCxl的外显子8"16,与Fc5(SEQ ID NO:179和180)融合。变体1454iE具 有来自人类IL-17RA的天然信号Jl!L也可以使用FclO或本领域已知的任何等同 物代替Fc5。变体1454多肽的成熟形式示于SEQ ID NO:183,它由SEQ ID NO:182所示的核酸分子编码。可以橫月其他分泌信号序列代替人类IL-17RA 信号序列以用于在真核细胞中的表达，所述，分^ft号序列包括例如：人类 IL-17RC信号序列(例如SEQ ID NO:2的M^JJ-20)、 otPA前原信号序列 (SEQ ID NO:178)、人类生长激素信号序列(SEQ ID NO:168和169)以;^A类 CD3难号序列(SEQ ID NO:172和173)。任选地，可以切除或缺失变体1454的 C端的^J^14(SEQ ID NO:183的^658(Lys))。上述变体仅4化了有PHIt目的本发明实施方案。>$^页域技^员基于本申
请特别是其中附图1"4的教导，不必进行过多的实验就能够容易地设计和测试 务他的IL-17RC变体和/或IL-17RC/IL-r7RA变体。例如，可以用于代^Ui文7iS 开的信号肽的^fc信号肽包括：人类生长激素信号lfc(SEQ ID NO:168和169)、 鼠类免疫球蛋白重链可变区(VH 26-10)(SEQ ID NO:170和171)或人类CD33 (SEQIDNO:172和173)。
除M发明以外，本发明提供了本发明的可溶性受体的新用途。这些可溶 性受体可以仅基于IL"17RC(命名为"IH7RC，，或"可溶性IL"17RC，， 或"sIL"17RC",这些命名在本文中可以互换使用），或可以基于IL-17RA与 IL-17RC相组合的部分("IL"17RC/IL"17RA"、"杂合RC/RA"、 "RC/RA"、 "IL-17RA/RC，，或其任何变体，例如变体1454，这些命名在本文中可以互换使 用)。本发明还提供可用于人类炎性疾病和自身免疫性疾病的可溶性IL"17RC 和IL-17RC/IL-17RA多肽片段和融錯白。本发明的可溶性受体可用于阻断、 抑制、减少、拮抗或中和IL^17F和/或IL-17A的活性，以用于治疗下述炎症和 炎性疾病，例如#4病、4艮屑病关节炎、类风湿性关节炎、内毒素血症、IBD、 IBS、结肠炎、哞喘、同种^W植物排斥、免疫^h导的肾病、肝胆管疾病、
多发'I^M匕、动脉粥样硬化、肺瘤生妙快或退行性关节疾病，以;s^^文/^f
的，炎性疾病。
SEQ ID NO:l提供了一种示例性的编码人类IL-17RC("IL"17RCxr，)的核 苷酸序列；它所编码的多肽示于SEQ ID NO:2。 IL-17RCAlL-17A(SEQ ID NO:13和14)和IL-17F(SEQ ID NO:15和16)的共同受体。IL"17RC可以以单体、 同二聚体或异二聚体的形式起作用。优选地，H7RC以同二聚体形式作为 IL-17A和/或IL"17F的受体。如本申请所述，单体受体或同二聚体受体均可只 含有IL-17RC，或者可含有其他IH7家族受体例如IL-17RA的部分 ("IL-17RC/IH7RA")。因此，本发明包^it样的可溶性受体，所述可溶性受 体包括IL"17RC与IL-17RA、 H7RE或任何其他IL-17家族受体相组合的部 分。IL-17RC还可以作为IL-17相关细胞因子的异二聚体受体的亚基。例如， IH7RC可以与IL-17RA或另一种IH7样受体形成异二聚体。IH7RC公开于 同为本申请人所有的美国专利申请No,10/458，647和同为本申请人所有的国际 申请公，O01/04304中，这两篇文献均通过援引的方式全文纳A^^文。对编 码IL-17RC(SEQ ID NO:l)的人类cDNAjL隆的分析揭示了一个编码692个M 酸(SEQ ID NO:2)的开放读码框，该开放读码框中包括一个约20个^J^i^(SEQ ID NO:2的4J^^JJ至20)的推定的信号序列、 一个大约431个M酸 ^(SEQ ID NO:2的絲^i^21"452; SEQ ID NO:3)的JI&^卜配体结合结构 域、 一个约20个^J^^(SEQIDNO:2的募J^j453-473)的跨膜结构域 和一个大约203个M^J^SEQ ID NO:2的M^j474至677)的胞内结 构域。jtk^卜，SEQIDNO:22^4了一个配体结合结构域。
SEQ ID NO:165也显示了编码人类IL-17RC的一种变体（命名为 "IL-17RCx4")的另一个示例性核苷酸序列，它所编码的多肽示于SEQ ID NO:166。预计的信号肽为SEQ ID NO:165的^1"60和SEQ D) NO:166的^ 1-20; !^卜结构^SEQ ID NO:165的^61-1401和SEQ ID NO:166的g 21-467;跨膜结构^U(;SEQ ID NO:165的gl402-1464和SEQ ID NO:166的残 基468-488;胞内结构^SEQ ID NO:165的錄1465-2121和SEQ ID NO:166 的組489画707。
SEQ ID NO:4也显示了编码人类IL-17RC的一种变体（命名为 "IL"17RC-1")的另一个示例性核苷酸序列，它所编码的多肽示于SEQ ID NO:5。 IL-17RC-l公开于同为本申请A;斤有的美国专利申请No.l0/458，647和同 为本申请A^斤有的国际申请公布WO 01/04304中，这两篇文献均通过援引的方 式全文纳^^文。序列分析显示IL"17RC-1为一种截短形式的受体多肽。也就 是说，IL-17RC-1缺少SEQ ID NO:2的^J^^J^l-113。 SEQ ID NO:10表示 含有IH7RC的N末端部分的IL-17RC-1多肽的g酸序列。
对IL-17RC和IL-17RC-1的^^酸序列进行比较，nkJL现这两种多肽分别 4W不同的剪接变体。IL-17RC的^tJ^列包括一个17个M酸的区與SEQ ID NO:2的絲^J^39至355)，而IH7RC-1没有这一区段；IL"17RC-1在 tt酸479^包括一个13个^J^的区與SEQ ID NO:5的^J^J^350至 362)，而IH7RC没有这一区段。SEQIDNO:ll显示了一种含有上述两个^J^ 酸区段的多肽，而SEQ ID NO:12显示了一种不含有上述13个JL^酸区段和17 个M酸区段的多肽的JL^齡列。
SEQ ID NO:23也显示了编码人类IH7RC的一种变体（命名为 "IL"17RC-6")的又一个示例性核苷酸序列，它所编码的多肽示于SEQ ID NO:24。 IL-17RC-6与SEQ ID NO:2所示的IH7RC^目比含有一个25个^^酸 戎基的缺失。M而言，IL-17RC-6不含有SEQ ID NO:2的募J^i^94至氨 基酸残基118。对编码IL"17RC-6(SEQ ID NO:23)的人类cDNA克隆的分析显 示，它含有一个大约427个^J^^(SEQIDNO:24的^J^JJ-427)的胞外配体结合结构域、 一个大约20个^酸^(SEQ ID NO:24的g酸^ 428-448)的跨膜结构域和一个大约218个^酸^(SEQ ID NO:24的M酸 ^J449至667)的胞内结构域。
SEQ ID NO:25显示了编码鼠类IL-17RC的一种变体的一个示例性核苷酸 序列，它所编码的多肽示于SEQIDNO:26。鼠类IL-17RC是鼠类IH7A(SEQ ID NO:17和18)和鼠类IH7F(SEQ ID NO:19和20)的共同受体。对编码 IL-17RC(SEQ ID NO:25)的鼠类cDNA克J^ii行的分析揭示了一个大约449个 絲酸^(SEQ ID NO:27)的JI^卜西沐结合结构域。另外，SEQIDNO:2械 表了 一个配体结合结构域。
SEQ DO NO:29显示了编码鼠类IL-17RC的一种变体的另一个示例性核苷 酸序列，它所编码的多肽示于SEQIDNO:30。
IH7RC基因位于染色体3p25-3p24，如下所述，这一区域与多种障碍和 疾病相关。
RNA印迹分析显示，IL-17RC基因在曱拟泉、肾JJ泉、前列#肝1^且织 中有很强的表达，在心脏、小肠、胃和气管组织中表达较弱。相反地，它在脑、 胎盘、肺、骨骼肌、肾脏、膝泉、脾脏、胸腺、睾丸、卵巢、结肠、外周血白 细胞、脊柱、淋巴结和骨髓中表达极少或不表达。上述MJ^结果显示IL-17RC 序列可以用于区分各种不同的组织。
如下所述，本发明提供包括与参照#^^序列具有至少70%、至少80%、 或至少90%、或大于95%,例妨6%、 97%、 98%或大于99%或更高的同一性 的M酸序列的分离多肽，所述参照^J^序列为SEQIDNO:2的JL^^i^ 21-692,其中所述分离的多肽可以特异,结合这样一种私本，所述，能特 异性结^^有SEQ ID NO:2的^J^列的多肽。本发明还提供包括与参照氨 基酸序列具有至少70%、至少80%或至少90%同一性的M酸序列的分离多 肽，所述参照絲酸序列选自：（a) SEQ ID NO:2的M^JJl至452, (b) SEQ ID NO:10的^Jj^^21至435, (c) SEQ ID NO:2的JL&^J^1至677 和(d) SEQ ID NO:2的^J^^^l至692,其中所述分离的多肽可以特异'1^ 结合这样一种胁，所述抗体能特异性结合由SEQ ID NO:2的絲,列或 SEQ ID NO:10的^酸序列构成的多肽。示例性多肽包括^^有SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:IO、 SEQ ID NO:ll或SEQ ID NO:12的脉酸序列的多肽。
本发明还提供包括^卜结构域的分离的多肽，其中所ii^卜结构域包括氨 基酸序列SEQ ID NO:2的^tJ^l&21至452或者^酸序列SEQ ID NO:IO的氨基酸^21至435。这类多肽还可包括位于所i^卜结构域^J^端位置 的跨膜结构域，其中所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:2的^酸^j453至 473。这些多M可包括位于所it^膜结构^^末端位置的胞内结构域，其 中所述胞内结构域包括SEQ ID NO:2的M酸残基474至677或者SEQ ID NO:10的^J^^J457至673， ^i^，这类多^ii可包括位于所iiJ^卜结构 域^J^末端位置的信号分泌序列(signal secretory sequence),其中所述信号分 泌序列包^^tJ^列SEQ ID NO:2的M^Ja至20。
本发明还包括IL-17RC多肽的变体，其中所述多肽变体的M酸序列与 SEQIDNO:2的絲齡列具有至少70yo同一性、至少80%同一性、至少卯％ 同一性、至少95%同一性或大于95%的同一性，并且其中多肽变体的M^ 列与SEQ ID NO:2的絲断列之间的做差异都是由一个或多传守性氨 基^i换导致的。
此外，本发明还提供上文公开的能与IH7F(例如SEQ ID NO:16所示的人 类IL-17F多肽序列)结合的分离的多肽。人类IH7F多核苷酸序列示于SEQ ID NO:15。小鼠IL-17F多核苷酸序列示于SEQIDNO:19，其相应的多肽示于SEQ ID NO:20。本发明还提供上文公开的能与EH7A(例如SEQ ID NO:14所示的人 类IL-17A多肽序列)结合的分离的多肽。^v类IL-17A多核苷酸序列示于SEQ ID NO:13。小鼠IL-17A多核苷酸序列示于SEQIDNO:17，其相应的多肽示于SEQ IDNO:18。
本发明还4^供下述的分离的多#^^位，所述分离的多I^表位包括M
絲列SEQ ID NO:2或3的至少15个连续的絲^1^。示例性多肽包括：含 有SEQ ID NO:2或3或者由SEQ ID NO:2或3组成的多肽，含有SEQ ID NO:2或 3或者由SEQ ID NO:2或3组成的多肽的抗原'l;i^位，或者^^有SEQ ID NO:2或 3或者由SEQ ID NO:2或3组成的多肽的功能性H7A或IH7F结合片段。此 外，本发明还提供上文>^的能结合、阻断、抑制、减少、拮絲中和DL-17F 或H7A的活性的分离的多肽。
本发明还包括IL-17RC多肽变体，其中所述多肽变体的^J^序列与SEQ IDNO:2的^J^^i^具有至少70o/o同一性、至少80%同一性、至少90%同一 性、至少95%同一'14^大于95%的同一性，例切6%、 97%、 98%或大于99% 或更高的同一性，并且其中多肽变体的絲断列与SEQH)NO:2的相应絲 斷列之间的l沐差异都是由一个或多传守性絲紅换导致的。这类保守性^J^^换在本文中有述。j^卜，本发明还提供上文公开的能结合、阻断、
抑制、减少、拮抗或中和IL-17F或IL"17A的活性的分离的多肽。
本发明还提供药物组合物，所述药物组^包括可药用载体和至少一种这
类表达载M包^it类表达载体的重组病毒。本发明还包括药物组合物，所述
药物组^包括可药用载体和本文所述的多JiUlM。
本发明还4^供了融合蛋白，所述嚴^f"白包括IL-17RC多Jli^p免疫球蛋白
部分。在这类融錯白中，免疫球蛋白部分可为免疫球蛋白重链恒定区，例如
人类Fc片段。本发明还包括编码这类融^"白的分离的核^^。
参考下文的*#^述可以更清楚地认识到本发明的上述方面和务他方面。
jH^卜，下文引用了多种参考文献，它们都以援引的方式全文纳a^文。
在下文的说明中广泛^J^！ 了多种术语。«^供下狄义以便理解本发明。 本文所^^的"核酸"或"核^^"指多核苷酸，例如4W^糖核酸(DNA) 或核糖核酸(RNA)、 ^fe苷酸、通过聚合Sl^iC^(PCR)生成的片段，和通 过^^T连接^Jl、 ^J^^JI、内切8^用和外切,用生成的片段。核酸W 可由天然存在的核苷酸^MM^J成(例如DNA和RNA)，或者可由天然存在的核苷 酸的类似物构成(例如天然存在的核普酸的oXtl^形式)，或由它们的组合构
##^包括例如用卣4、、烷^、 :j^叠一u^代一个或多个ik，或者，
官能化为醚或酯。jHi^卜，整^HNp^P可以被其立体上和电子J^目似的结构所 取代，例如氮杂^^1,类似物。>^^部分的修饰的实例包^^化的噤呤 和嘧咬、酰基化的噤呤或嘧咬或^^知的杂环取代。核酸#可以通过磷酸 二酯键相连接或者通过这类键的类似物相连接。磷酸二酯键的类似物包括M 磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸硒酰酯(phosphorosdenoate)、磷酸二硒酰酯 (phosphorodiselenoate)、 ^M戈:^J^酸酯(phosphoroanilothioate)、 SM^fe裤酸 酯(phosphoranilidate)，募J^磷酸酯等等。术语"核酸^^"还包括所谓的"肽核
术语"核酸分子的互4傳"指的是具有与参照核苷酸序列反向互补的核苷 酸序列的核酸分子。例如，序列5， ATGCACGGG3，与5，CCCGTGCAT3，互 补。
脚赵术语"简并核苷酸序列"指的是与编码一种多肽的参照核酸^^相比具有一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子具有不同的核苷酸^1体，
但是却编码相同的M^l&(即GAU和GAC三联体均编码Asp)。
术语"结构基因"指的是这样一种核酸分子，它会被转录为信使RNA(mRNA),该信^RNA^被^^为特定多肽的特征性^J^酸序列。
"分离的核^^，，为未^^在生物体基因MDNA中的核^^。例如，从细胞的基因组DNA中分离出来的编码生长因子的DNA分子就是一种分离的DNAM。分离的核^^的另一个实例为未^^在生物体基因组中的化学合成的核^子。从特定物种中分离的核酸^^要小于该物种染色体的完整DNA衬。
"核酸衬构建体"为一种单絲双链的经过人类千预而被修饰、从而含有以自然界中不存在的排列方式组^f连接的核酸区段的核酸分子。
"线性DNA"是指具有游离的5，和3，末端的非环柳NA衬。线性DNA可以从例如质粒的闭合环状DNA^^通itil消化或物理破坏来制备。
"互补DNA(cDNA)"为^^mRNA模^itiill转^Jl^备生成的单toNA分子。通常，^^与mRNA的"^p分互补的引物来启动反转录。4^页域技仏员还^^1术语"cDNA"来指由这种单^DNA^^及其互补DNA^I且成的双toNAW。术语"cDNA"还^^yjlNA^^合成的cDNA^^的克隆。
"启动子"为指导结构基因的转录的核苷斷列。通常，启动子位于基因的5，非编码区，接ii^构基因的转^^位点。具有启动转录功能的启动子中的序列元件通常以共有核苷酸序列为特征。这些启动子元件包括：RNA聚合酶结合位点、TATA^列、CAAT序列、分化特异'ItiL件(DSE; McGehee " "， Mo/L£>«tocWw" 7 :551 (1993))、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE;Treisman， S柳/n歸/" C騰e"5M六47 (1990))、糖J^激素应答元件(GRE),以及，转录因子的结*点，例如CRE/ATF(0，Reilly " "， /.及V?A C^e肌267:19938 (1992》、AP2(Ye d /. fi/d C&肌269:25728 (1994》、SP1、 cAMP应答元件结合蛋白(CREB; Loeken， G^"e^^w. 3 :253 (1993))和八聚体因子(综述可参见Watson " "/L， eds" Mofec"/ar <说e (7e"e，她ed. (The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)和Lemaigre和Ro鹏eau，历0c&抓/. 3ft5:l (1994))。如果启动子为一种i秀导型启动子，那么转^il^^J应于诱导剂而提高。与此不同的是，如果启动子为细L^型启动子，那么^"^it率就不受"^导剂的调节。还已知一些抑制型启动子。"核心启动子"包括启动子功能所必需的核苷酸序列，包括TATA盒和转录起泉。才娥这一定义，核心启动子在缺少可增强活'liil赋予组织特异性活性的特定序列时可能具有或不具有可检测的活性。
"调控元件"为调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可包括能与下述的细胞因子结合的核苷酸序列，所述细胞因子可以使转录专一地或优先#特定细胞、组织或细胞器中进行。这些类型的调控元件通常与以"细胞特异性"、"组织特异性"或"细胞器特异性"方狄达的基因相关联。
"增强子"是一种肯缺高转^t率的调^t件，所述转^t率的提高与增强子相对于转^^位点的距离或方向没有关系。
"异源DNA"指的是并不天然存在于给定宿主细胞中的一种DNA分子或一群DNA分子。对于特定宿主细胞而言的异源DNA分子可以^^有来源于宿主细胞物种的DNA(即内源DNA)，前4Ij!宿主DNA与非宿主DNA(即外源DNA)相组合。例如，含有与包括转录启动子的宿主DNA区段有^i^接的编码多肽的非宿主DNA区段的DNAM^L认为是异源DNA分子。反过来，异源DNA^可以包括与外源启动子有^t^接的内源基因。作为另一实例，如果一种包括来源于野生型细胞的基因的DNA^被引入缺少该野生型基因的突变体细胞中，则这种DNA^^^M^认为是异源DNA。
"多肽"为絲^Jitit^^^接形成的聚^,包括天然形成的多薛合成多肽。少于约10个絲^^的多肽-"^被称为"肽"。
"蛋白质"是包^^个或多个多肽链的大W。蛋白质也可能含有非自分例dMt^团。产生蛋白质的细胞可能Wt类取^f^(J^M非肽类取^引入到所述蛋白质中，并且根椐不同细胞类型可能会引入不同的取*。本文中定义的蛋白质是根据它们的KJ^^链结构定义的；通常并不特别指明例dMt类基团等^M^，但是它们可以存在。
由非宿主DNA分子编码的肽或多肽为"异源"肽或多肽。
"克隆载体"为能够在宿主细胞中自主复制的核^^，例如质粒、粘絲噬菌体。克隆载倾常含有一个或少IUVh限制性内切核^i尸^位点，从而可以以确定性方式插入核^予而不丧失载体1^的生物学功能，也可以插Alfe码标记基因的核苷酸序列，所述才斜己基因适用于识别和筛选^^斤述克隆载^#化的细胞。才封逸因通常包括能够提供四环素私l^氨千青霉素私性的基因。
"^i^体"为编码能够在宿主细胞中表达的基因的核^^。通常，^Ji^
体包4^一个转录启动子、 一个基因和一个转^^止子。基因 ^iiii常处于启动子的控制之下，这样的基因被称为与启动予嗜^b^接"。#^她，如果一顿控
元件能够调节一个核心启动子的活性，则称该调节元件与该核心启动f有^ii接"。
"重组宿主"为含有异源核^^例如克隆栽絲表战体的细胞。在本文
中，重组宿主的一个实例为通it4ii^体产生IH7RC的细胞。相反地,IL~17RC 可以由IH7RC的"天然来源"的且不含有表达载体的细胞产生。
"整合转化体"为异源DNA被整合到细胞的基因组DNA中的重组宿主细胞。
"融合蛋白"为由包括至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子所表达的杂 合蛋白。例如，融合蛋白可以包括与一种可结合亲和基质的多IM目融合的 IL47RC多肽的至少一部分。这样的融合蛋白为使用亲和色镨分离大量 IL"17RC提供了手段。
术语"受体"指的是可以与被称为"配体"的生物活性分子相结合的细jf^目
关蛋白。这种相互作用介导了配体对细胞的作用。受体可为膜结合受体、细 胞溶质受体或核受体；单体受体(例如促甲状l^:素受体、卜肾上腺素能受体) 或多聚体受体(例如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、 G"CSF受体、红细胞生成素受体和IL"6受体)。膜结M体的特征在于具有多结 构域结构，包括^卜配体结合结构域和通常^信号转导的胞内效应结构域。 在某些膜结合受体中，J^卜配体结合结构域和胞内^结构域位于构成完整功 能性受体的分离的多^Lh。
"-^:而言，配体与受体的结^^导致受体的构象变化，所述构象变化会引 ^L应结构域和细胞内其他分子之间的相互作用，这又会导致细胞代谢的变 化。通常与受^B己体相互作用相关的代谢事件包括：基因转录、磷酸化、去 磷酸化、环AMP产量提高、细胞钾的运动、细lfej^旨类的运动、细胞粘附、 肌醇脂类的xK解^^^^旨的xK解。
"可溶性受体"是不与细舰结合的受体多肽。可溶性受顿常为没有跨膜 结构域和细胞质结构域、也没有M连接方式例如通it^基磷脂酰肌醇(gpi) 与细l&^相连的配体结^t体多肽。可溶性受体可包括附加的#^^基，例 如为便于纯化多肽而提供的亲和标签，或者用于提供多肽与底物的结*点的 亲和标签，或免疫球蛋白恒定区序列。许多细胞表面受^M"有天然存在的可溶 *財应物，它们是由蛋白水解产生的或由以其他方式剪接的mRNA翻译产生。 可溶性受体可为单体、同二聚体、异二聚体或多聚体的形式，多聚体受M常包括不多于9个亚基、优g包括不多于6个亚基、最优i^包括不多于3个亚
转导:，就称所述受体多a^4Ui没有跨膜和胞;多肽区段。"胞因子i:^:
可溶性受体通常包括胞夕卜细胞因子结合结构域而不^^膜结构域和胞内结构
域。例如，^r束性的可溶性受体包括SEQ H) NO:167(多核苷酸)和SEQ ID NO:21(多肽)表示的IL-17RA的可溶性受体。本领域技术人员完全能够确定已 知细胞因子受体序列中哪一段序列包括胞夕卜细胞因子结合结构域而不含跨膜 结构域和胞内结构域。jH^卜，^域技术人员通过遗传密码子可以容易地确定 编码这类可溶性受体多肽的多核苷酸。
术语"分泌信号序列"指的是编码这样一种肽的DNA序列，所述肽("分泌 狀"辨为一种较大多肽的4分，指引所述较大多lfci^v合成该多肽的细胞的
分泌途径。所述较大多皿常在所述分泌途径中被切割以除去分泌肽。
"分离的多肽"为^上不含有夹杂的细胞組分的多肽，所述夹杂的细胞 组分例如天然状态下与所述多肽共存的糖类、脂类或，蛋白质性质的杂质。 通常，分离的多肽制品所含有的所述多肽的^^很高，即至少约80%纯度，至 少约90%纯度、至少约95%纯度、高于95%纯度，例如96%、 97%或98%或更 高的纯度，或高于99%的纯度。显示某种^^蛋白制品含有分离多肽的一种方 法是对所述蛋白质制品进行的十二^J^酸钠(SDS)-聚丙烯SUfe皿电泳并 对所述^J&进^^马斯亮蓝染色^，出现单一条带^明所述制品含有分离 的多肽。然而，术發'分离的"并不排除同一种多肽的不同物理形式的存在，例 如二聚体形式或者糖基减衍生化形式。
本文中4M的术语"^J^端"和"^^端，，指的是多肽中的位置。在上下 iiyt许的情况下，在^5l多肽的某一特定部分或序列时^^这些术语，用于表 示接近的关系或相对位置。例如，位于多肽内的一^R参考序列的^S^端的某 一段序列指的是所述序列接i^斤述参考序列的^^端，但并不一定是位于整 个多肽的^J^端。
术语"表达"指的絲因产物的生物合成。例如，对于结构基因而言，狄包 括将所i^构基因转录为mRNA并将所iimRNA^^为一个或多个多肽。
本文中使用的术语"剪接变体"指的是从一个基因转录而得的RNA的不同 形式。剪接变体天然地是通过利用转录的RNA分子内的不同剪#^点而产生 的，或者也有少数时^bl利用独立转录的RNA^"之间的不同剪M点产生， 可肯fe^—个相同基因会转录出;WmRNA。剪接变体可能编码具有不同M酸序列的多肽。本文中还^^l术语"剪接变体"表示由基因转录而来的mRNA剪接 变体所编码的多肽。
本文所^^的术语"免疫调节剂"包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒 素、共刺^子、造血因子等，还包括上述分子的合成类似物。
术语"互4M^抗互4h^对"指的是在合适糾下形成非措结合的稳定配 对的不相同的部分。例如，生物素和亲^^(或链亲和素)为互净h^/抗互4H^t 的典型成员。其他示例性的互^h^/抗互^h^对包括受^/配体对、抗/^^f、(或 半抗原或表位对、正义/反义多核苷M等等。在随后需要互4H^/抗互4H^对 解离的情况下，互4H^/抗互4f^对的结合亲和力M地小于l09M"1。
"抗独特型抗体"为可与免疫球蛋白的可变区结构域结合的抗体。在本文
中，皿特型M可与抗D^17RC私沐的可变区结合，因此皿#^#可以 銜以IL47RC的表位。
"抗体片段"为抗体的一部分，例如F(ab，)2、 F(abh、 Fab，、 Fab等等。不论 结构如何，抗体片段都可以与完整抗体所识别的同一抗原相结合。例如，抗 IL-17RC单克隆M片段可以与IL"17RC的表"ii^合。
术语"胁片段"还包括能结^^异性^f、的合成多!Ul^因W生产的多 肽，例如由轻链可变区组成的多肽、由重M^^^可变区组成的"Fv"片段、轻 链可变区和重链可变区通itJifci^接物相连接的重组单链多肽分子("scFv蛋白")
和由模拟高可变区的募J^Jia^的最小识别^:。
"嵌合^^"为这#""种重组蛋白，它含有来源于"^^物胁的可变结构域 和互^卜决定区，而^k^的^^P分来源于人类^^。
"人源^^^"为这#-"种重组蛋白，其中将单克隆胁中的来源于鼠狄疫 球蛋白的重链可变区和^^可变区的鼠类互补决定区絲到人类可变结构域中。 用于人类治疗用途的来源于鼠类M的人源化^K例如可以结合或中和人类蛋
白的人源4^9的构建是44^页域技^Mv员的能力范围之内的。
本文所使用的"治疗剂"为与抗体部分缀合而产生可用于治疗的缀合物的 分子或原子。治疗剂的实例包括药物、毒素、免疫调节剂、#剂、硼^^物、 光活化剂或染料以A^性同位素。
"可^r测标记"为与扭体部分缀合而产生可用"f^断的分子的M或原子。 可检测标记的实例包^^剂、光活化剂、；^t性同位素、荧光试剂、顺磁性 离子或其^f示记部分。
30本文^J^的术语"亲和标l"指的是这样一种多肽片段，它可以与另 一多肽
连接，从而使得可以纯4^检测所述另一多JljUL者提^^斤述另一多肽与底物 结合的位点。原则上可以^^,具有可获得的^Ml，特异性结合物的肽
或蛋白作为亲和标善。亲和标4包括多组氨酸链、蛋白A(Nilsson " "， ^M丑0 /. 4:1075 (1985); Nilsson " "， Me欲^wfc五"gww?/L 7卵:3 (1991))、谷胱甘^S絲酶 (Smi也and Johnson, (7e"e 67:31 (1988))、 Glu画Glu亲和才^(Grussenmeyer " 7VM ^c"d M , 82:7952 (1985))、 P物质、FLAG肽(Hopp ^ "A， 说》tecA朋fogv 6:1204 (1988))、链亲和素结合JlUl，^^It4位或结合结构 域。总体上可^^见Ford C "A， iVo紐/zi £^ess/wi 户"i"^?cfl/fow 2:95 (1991)。编 码亲和标签的DNA分子是可从供应商(例如Pharmacia Biotech, Piscataway， NJ)处购买的。
"^:体"与胁片勸目对，表示未与治疗剂缀合的完整糾。棵胁包括
多克隆M和单克隆抗体，以及某些重组抗体例如嵌合M和人源化M。 本文所4线的术语":fe^组f包括完整^/^和M片段。 "免疫缀合物"为#组分与治疗剂或可^"测#^形成的缀合物。 本文所使用的术语"抗体融合蛋白"指的是包括一种抗体组分和一种 IL-17RC多肽组分的重组分子。M融合蛋白的实例包^it^H种蛋白，所述 蛋白包括IL-17RC的J^卜结构域，还包括Fc结构^MU^f结合区域。
"目标多肽"或"目标肽"为包括至少一个表位、并JL^目标细胞(例如肺瘤 细胞或携带传染物抗原的细胞)Ji^达的^J^^列。T细J3&识别由主J^组织相 容性复絲衬呈递的针对目标多狄目标肽的^4位，并通常裂解目标细 胞，或将，免疫细g集至目标细胞的位置，由此杀死目标细胞。
"抗原性肽"为与主要组织相容性复合物分子结合而形成MHC-肽复合物
细l^法林巴细胞应^。 抗源性肽能够结^^适的主要组织相容性复合 物^^WI"发细I^性T细胞应答，例如针对结合或表达抗原的目标细胞的细 胞,或特异性细胞因子的释故。抗原性肽可以结合抗原呈递细胞或目标细胞
上的I类或n类主要组织相容性复絲分子。
在真核细胞中，RNA聚合酶n催化结构基因的转^而产生mRNA。可 以设计核酸分子以使其包括RNA聚合酶n模板，在所述^^板中RNA转录物具 有与特定mRNA的序列互补的序列。所itRNA转录物被称为"反^RNA"，编码该反^RNA的核酸^^被称为"反义基因"。反:5CRNA分子能够结冶TiiRNA衬，导致mRNA翻译的抑制。
"特异性针对IL"17RC的反义寡核苷酸"或"IL47RC反义寡核苷酸"为具有下述序列的寡核苷酸：（a)所述序列能够与7L-77及C基因的-"^^成稳定的三蝶旋，或(b)所述序列能够与ZL^7及C基因的mRNA转录物的一^P^^I定的双螺北
"核酶"为具有催化中心的核^子。该术语包括RNA酶、自剪接RNA、自切割RNA和^f亍上述催化功能的核^^子。编码核酶的核酸^"^L称为"核酵基因"。
"外部引导序列"为能引导内源性核酶RNA酶P结合特定种类胞内mRNA并导IbnRNAteNA酶P切割的核i^子。编码外部引导序列的核酸^^L称为"外部引导序列基因"。
术语"变体IL47RC基因"指的是编码具有修饰形式的SEQ ID NO:2M酸序列的多肽的核酸分子。这类变体包括天然存在的IH7RC基因的多态性，以及含有絲齡列SEQ ID NO:2的保守性絲^j:换的合絲因。H7RC基
以通过例如在严4^ft下，测定一种基因是否与具有核苷餅列SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4的核酸分子或其互补核^子杂交，从而识别变体IL47RC基因。
或者，可以通过序列比较识别变体IH7RC基因。如M比对最大相符性时两个絲断列的M^J^目同，赫这两个絲齡列具有"100%的氨基酸序列同一性"。类似地，如^4比对最大相符性时两个核苷酸序列的核苷W^目同，就称这两个核苷^列具有"100。/o的核苷^f列同一性"。序列比较可以使用标准软^N^^进行，例如由DNASTAR(Madison， Wisconsin)生产的LASERGENE生物信息学软件包中所含有的软件。其皿过测定最优比对而比较两个核苷酸或M断列的方法是本领域技^Mv员7^的(参见，例如，Peruski and Peruski， /"fem" "/w/幼e iV， 5/ofogy: 7bo/sG"e"o附/c朋能力，而从功能上表征所迷基因或多肽。还可以^^本i^斤述的生物学或生物化学测定方法，,变体IL47RC基因或变体IL^7RC多肽与酉沐例如IH7A和/或IL47F结合的能力，而从功能Ji^iE所迷基因或多肽。
本文中使用的术语"等位基因变体"指的是位于相同染色体基因座上的某一基因的,两种或多种变化形式。等位基因变体天然M过突变产生，并可能导致^中的表型多态性。基因突变可能是沉默的(编码的多I^L有改变)，或者可能所编码的多肽的JL^酸序列有所改变。本文中使用的术语等位基因变#^£指的是由基因的等位基因变g码的蛋白质。
术语"直系同源物"指的是从一个物种获得的多肽或蛋白是从另 一不同物种获得的多肽或蛋白的功能类似物。直系同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
"旁系同源物"是由一种生物产生的不同^构相关的蛋白质。认为旁系同源物^l通it^因复制产生的。例如，a-珠蛋白、p-^:蛋白和Mit蛋白招Utb之间
互为旁系同源物。
本发明包括H7RC基因的功能性片段。在本发明的上下文中，IL47RC基因的"功能性片段"指的是编码IL47RC多肽的"^分的核^^，所述多肽的一^分为本文所述的结构域或至少能特异'1^结合抗IH7RC松体。
由于标准分析方法的不准确性，聚合物的分子量和长度棘理解为近似值。当这类值絲示为"大约"X或"近似"X时，应理解的^IJ^示的值应为实际
C) IL-17RA和IL-17RC多核苷酸il基因的制备
^^1基于SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO:4的多核苷酸探针，通过筛选人类cDNAi^或基因组iL^，可以获得编码人类IL-17RA或IL^7RC基因的核酸分子或编码本发明的任何可溶汰多肽的多核苷酸。上述技术是公知的标准技术，可以使用市售的克隆试剂盒完成。例如参见Ausubel " oA (编著)，
/" Mo/mitor 5油欲第3& John Wiley & Sons 1995; Wu " oi，/w Ge從5/她c^朋/ogy， CRC Press, Inc. 1997; Aviv and Leder，Ato，"owi似i75^狄.1408 (1972); Huynh e"/" "Constructing and Screening
33cDNA Libraries in XgtlO andXgtll，，见于ZW^ Ctow/wg: J 7V"crfca/々/wvac/r/，Glover(编著)，第49页（IRLPress, 1985); Wu (1997)，第47-52页。^J?I核苷^列基于IL-17RA或IL-17RC基因或cDNA的核苷^列的寡核苷酸引物，通过聚合SI^式反应(PCR)，也可以获得编码人类IH7RA或IL"17RC基因的核酸分子。在下述文献中提供了用PCR筛选文库的-^:性方法：例如,Yu C "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen PhageLibraries"见于M^/Zroifc /" 历o/o;gy， 75:尸CR C"/re",
朋flf J/^Z/ortfeiw, White (编著)，Humana Press, Inc., 1993。此夕卜，在下述文献中描述了使用PCR分离相关基因的技术：例如，Preston, "Use ofDegenerate Oligonucleotide Primers and the Potymerase Chain Reaction toClone Gene FamUy Members"见于Me^油/w M?fec油r历o/ogv， Ko/L /5: PCKPratoco&: C"/re"f White (编著)，Humana Press, Inc.
1993。或者，可通过使用互为引物(mu加allypriming)的长寡核苷酸和本文所述的核苷酸序列合成核酸分子，来获得IH7RA或IL"17RC基因（参见例如，Ausubd (1995))。 ^JH聚合SI^^应的已知技术能够合成至少两千个4长度的DNA^"(Adang " "/•， iV朋,Mofec;历"2?:1131 (1993); Bambot " "/•，PO? 2:266 (1993), Dillon "/" "Use of the Polymerase
Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes，，见于M^/wcfe //iMofec"/fl"历ofogv， Koi /5:户O? i^ratoco/s: C"ire","w"々/1//ca&"s，White (编著),第263-268页（Humana Press, Inc. 1993)和Holowadmk " niL，尸CR Me欲0血Jpp/: 4:299 (1995))。关于多核苷酸合成的综述可以参见例如，Glick and Pasternak^ 5/otec/r朋/e;gy， 做"y4p/?,/cflriww y
及ec6/"flrtf ^DA^4 (ASM Press 1994); Itakura C a/l， j"肌i?ev.历oc/te肌53:323 (1984)和Climie a" iVoa iVW74cflfii: 5ti S7:633 (1990)。
D)IL-17RA或IL-17RC基因变体的制备
本发明提供了多种编码本文公开的IH7RA或IL"17RC多肽的核酸分子，包括DNA和RNA^。本领域技^A员应容易地认识到，由于遗传密码子的简并性，这些多核苷酸分子中可食沐许多种序列变体。此外，本发明还提供了分离的可溶性科、同二聚体、异二聚体和多聚体形式的受体多肽，它们包括与SEQD)NO:2的受体多Jlfci4^上同源的IL"r7RC的至少一^P分。因此，本发明考虑到了包粘EQ ID NO:l或SEQ ID NO:4的简并核苷酸的编码IL-17RA或IL-17RC多肽的核酸分子以及它们的RNA等价物。
本领域技^A员应容易地认识到，由于遗传密码子的筒并性，这些多核苷酸分子中可能有许多种序列变体。SEQ ID NO:7为涵盖编码SEQ ID NO:2的IL-17RC多肽的所有核^^的简并核苷^列。本领域技HO^员应认识到，通过将SEQ ID NO:7中的T^换为U, SEQ ID NO:7的简并序列还提供了编码SEQ ID NO:2的所有RNA序列。因此，本发明考虑到了包樹EQ ID NO:l的核苷酸154至核苷^2229的编码IH7RC多肽的核酸分子，以及它们的RNA等价物。类似地，通过将SEQIDNO:6中的T^换为U， SEQ ID NO:6的IL-17RC-l简并序列^^供了编码SEQ ID NO:5的所有RNA序列。
表4示出了表示简并核苷酸位置的单字母编码。"解析"是用编码字母表示的核苷酸。"互^傳"表示的是互补核苦酸的编码。例如，编码Y表示C或T,其互^H^R^示A或G， A与T互^卜，G与C互4卜。
表4
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勤示出了对于某给定氨基酸而言涵盖所有可能密码子的简并密码子。勤
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本领域"fit技"员应当理解的是，由于筒并密码子^J(^码某一M酸 的所有可能的密码子，在确定简并密码子的过程中会引入一定的不确定性。例 如，丝氨酸的简并密码子(WSN)在有些情况下可能编^ft氨^(AGR),精氨酸 的简并密码子(MGN)在有些情况下可能编码丝氨酸(AGY)。编码苯丙氨酸和亮 氨酸的密码子之间M在类似的关系。因此，简并序列所涵盖的一些多核苷酸 可能编码变^J^酸序列，但是4^域"f^技术人员可以参照SEQIDNO:6的 M酸序列容易地识别这类变体序列。可以如本i^斤i^易J^t变体序列进行 功能性测试。
不同的物种可^4现出"偏好密码子使用"。总体而言可参见Grantham " "，7V"dl爿c她to《:1893 (1980); Haas " d C"zr.倫A 6:315 (1996)、 Wain-Hobson C "A, (7微":355 (1981); Grosjean and Fiers， G微 (1982); Holm, TV""爿c她":3075 (1986); Ik咖ura， /•胁A舰授573 (1982); Sharp and Matassi， C"ir. Op/汰G柳"Dev. 4:851 (1^4); Kane， C"/r. 印/汰历她cA" 6:494 (1995)和Makrides，紐柳:512 (1996)。本文 所偵月的术语"偏好密码子使用"或"偏好密码子"在本领域中是指在某一物种 的细胞中最通常^^1的蛋白质»密码子，因此偏好编>«%^种#^的可能密 码子(iL45)中的一种或几种密码子。例如，ACA、 ACC、 ACG或ACT都可能 编码氨基酸苏氨酸(Thr)，但是在哺乳动物细胞中ACC是最常用的密码子；在 ，物种例如昆虫细胞、酵母、病^或细菌中，可能^^好使用不同的Thr密 码子。可以使用多种^^U页域已知的方法在本发明的多核苷酸中引入某一特定物 种的偏好密码子。M好密码子序列引入重MDNA中可以例如通过使蛋白在特 定细胞类型或物种中更有^^*，从而提高蛋白质的产量。因此，本文公开 的简并密码子序列可以作为在本领域常用的和本文公开的各种细胞类型和物 种中优化多核苷i^达的模板。可以测试和优化含有偏好密码子的序列在各种 物种中的表达，并如本i^斤/iHf^^f亍功能测试。
可以通过多种方法分离编码IH7RA或IL"17RC的cDNA，例如可以4吏用 完整人类cDNA的或部分人类cDNA或基于所公开序列的一组或多组筒并探针 ^^ft^:测。还可以利用本文公开的^RJjl4A类IH7RA或IL^7RC序列设计 引物，使用聚合Sl^i^Ji来克隆cDNA。此外，可以佳月cDNAiL^转化或 转染宿主细胞，并用针对IL"17RA或IL"17RC多肽的抗体ij^r测目的cDNA的 表达。
37本领域技术人员应认识到，SEQ ID NO:l所公开的序列代表的是人类 IL-17RC的一个等位基因，预计也会存在等位基因变体^R剪接。可以通过
标准技术探测来自不同个体的cDNAi^或基因组i^，从而克隆这一序 列的等位基因变体。本文公开的核苷酸序列的等位基因变体，包括含有;m突 变的等^i基因变体和突变导it^酸亭列改变的等^i基因变体，以及作为本文 公开的絲斷列的等錄因变体的蛋白质，都在本发明的范围之内。通过替 代方式剪接的mRNA产生仍保留IU7RC多肽性质的cDNA分子，以及由这些 cDNA和mRNA编码的多肽，也包括在本发明的范围之内。可以通itf^辆
克隆这些序列的等位基因变;^剪接变体。 、一 、
佳月上述方法，本领域"fit技^A员可以制备多种编码包括IH7RC受体 亚基的-^P分或其等位基因变体、絲留野生型IH7RC受体的酉沐结合M 的可溶性受体的多肽，所itlH7RC受体亚基的""^分与SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4基本同源，或编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的4^序列或其片段 或其等位基因变体。这类多te可以包括本文总^^开的雞多肽区段。
在本发明的某些实施方案中，分离的核^子可以在严M件下与包括本 文公开的核苷酸序列的核酸分子杂交。例如，所述核酸分子可以在严#降下 与包樹EQ ID NO:l或SEQ ID NO:4的核苷酸序列的核^^子杂交，或与包括 与SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4互补的核苷酸序列的核酸分子杂交，或与它们 的片段杂交。
j而言，严^Ht应选择为在确定的离子强度和pH值下比特定序列的 热解^i显度(TmX氐大约5r: 。 Tm为(在确定的离子强度和pH值下)50y。的耙序列 与完全匹配的探针杂交时的温度。在杂交后可以在严^泮下或在高WM 件下洗涤核酸分子以除去未杂交的核酸分子。参见，例如，Sambrook ""， 杨/mi/ar C7o"/"g: J Afa"做/，第2版(Cold Spring Harbor Press
1989); Ausubd (编著)，Cwre"f/V她co/s /"胁fecw/ar必/Io/og); (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (编著)，G"/rfle to M9/m1/"r recA"i々Me$， (Academic Press, Inc. 1987);和Wetmur， OiTl i?ev. 5/oc/re肌
26:227 (1990))。序列分析^t件例M)LIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN)和 iV/mei*iVe/w&r (Premier Biosoft International; Palo Alto， CA)以^S^些因特 网网站都是可用的工具，可以用于分析给定序列并基于用户确定的标准计算 Tm。对于特定的多核苷酸杂交，本领域技术人员完全能够选"^合适的杂交条件和洗涤糾。
本发明还4^供与SEQ ID NO:2(IL-17RC)和SEQ ID NO:21(EL-17RA)多肽 或它们的直系同源物多肽具有基本上相似的序列同 一性的分离IH7RA或 IL-17RC多肽。本文所用的术语"i^U^目似的序列同一性"指的是与SEQ ID NO:2所示序列或其直系同源物具有至少70。/0、至少80%、至少90%、至少95%， 例如96%、 97%、 98%或大于95%的序列同一性的多肽。例如，IL-17RA或 IH7RC受体变体和直系同源物可以用于产生针对AJIIL"17RA或IL"17RC的 免C^答和交U应的抗体。这类^^可如本文所述的^A源化^L修饰，并 用于治疗4艮屑病、4艮屑病关节炎、IBD、 IBS、结肠炎、内毒素血症，以^ 于本文所述的务他治疗性应用。
本发明还考虑到了可以用以下两种标准识别的IL"17RA或IH7RC或 IL"17RC/IL-17RA变員^子： 一种标准是测定所编码的多肽与本文所述的 ^-^J^^列（例如：^J^^列SEQIDNO:2(IL-17RC)、 SEQIDNO:21 (IL"17RA)或SEQIDNO: 158和183(IL"17RCH7RA))的相似性，另一种标 准是杂交测定。所述变体包括下述核酸分子：（1)^严格洗涤M下仍然能与具 有本文所述核苷酸序列（例如IL47RC的核苷酸序列SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4(或其全长互4H^)，或IL-17RC/IL-17RA的核苷酸序列SEQ ID NO:157(或 其全长互##9)的核酸分子杂交的核酸分子，其中所述洗涤严格度等同于含 0.1%808的0.5乂-2xSSC，温度55國65匸；和(2)所编码的多肽与本i^斤述的氨 基酸序列（例如^J^序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 158)具有至少70%、 至少80%、至少90%、至少95%,或大于95%，例切6%、 97%、 98%或99% 的序列同一性的核酸分子。或者，iH7RC变体可^Jj征为下述核酸分子：（1) 在高^格洗涤条降下仍然能与具有本文所述核酸分子（例如核苷酸序列SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4(或其4^互^h^)，或核苷^列SEQ ID NO:157(或 其全长互^M机)）杂交的核酸分子，其中所述洗涤严格度等同于^0.1%808的 0.1x-0.2xSSC，温JL50 - 65"C;和(2)所编码的多肽与本i^斤述的絲^列（例 如^J^酸序列SEQIDNO:2和SEQIDNO: 158)具有至少70%、至少80%、 至少90%、至少95%、或大于95%,例切6%、 97%、 98%或99%的序列同一 性的核^子。
本发明提供了例如含有与SEQ ID NO:158的200-458氨基酸^(它包括 IH7RC的外显子8-16)、或SEQ D) NO:158的32-45atJ^li^它包括BL"17A 的外显子1-6以^SJL-17RC的外显子8"16)、或SEQ ID ]\0:158的1-458#1^^1基、或SEQ ID NO:158的32-690JL^^Jl^SEQ ID NO:158的l-6卯^J^絲 基的序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、 至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、 至少98%、至少99%和至少99.5%的序列同一性的分离的多肽，其中所述多肽 能够结合IL"17A和/或IH7F。在某些实施方案中，所述多肽不含有SEQ ID NO:158的1-690M^J^SEQ D) NO:158的l-458^J^^l基。在某些实施 方案中，所述多肽不是通过下財法产生的：（a辟养已导A^达栽体的细胞， 所述表达载体含有有效连接的下列元件：转录启动子、编码含有SEQ ID NO:158的l-6卯氨基酸残基或SEQ ID NO:158的1458氛基酸残基的多肽的 DNA序列、以》^转录终止子；以及(b)回收所表达的多肽。所述多J3iiE可在下 列疾病的治疗中用于结合、阻断、减少、拮抗或中和IL-17A和/或IL-17F，所 述疾病包括：银屑病、特应性皮炎和接触性皮炎、IBD、 IBS、结肠炎、内毒 素血症、关节炎、类风湿关节炎、莱姆病（Lyme disease)关节炎、银屑病关 节炎、成人呼吸系统疾病（ARD)、脓桊性休克、多器官功能衰竭、炎'l!i^损 伤例如哮喘、慢性阻塞',疾病（COPD)、气道高纽性、慢性支气管炎、 过敏性哞喘、细菌性肺炎、4^病、湿渗和炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗
恩病、幽门螺杆菌（^//co^c妙/^/柳'）感染、由JtM炎症（即感染、损伤等） 导致的«内粘连和/或旨、系统性红斑狼疳（SLE)、多良痴性肾炎、I型糖 尿病、冠心病、中风、多发'l!i^化、系统'l!i^化症、^JL病、肾病综^^征、败 血症、器官移植排斥反应、移^ti物抗宿主疾病（GVHD)、（例如肾、肺、心 脏的）移植排斥反应、M^菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、骨关节炎、牙龈炎 /牙周炎、单纯疱渗性角J^质炎（herpetic stromal keratitis)、骨质i^M^、神 经炎、单纯疱务性角M^质炎、癌症包括前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、 宫颈癌、白血病、癌#管形成（如卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌）、B细lfe^ 巴瘤、T细J!^沐巴瘤、嚢性纤维化、再狭窄和川崎病。
本发明提供了编码一种多肽的分离的核^^",所述被编码的多肽与SEQ ID NO:158的200-458氨基酸残基(它包括IL-17RC的外显子8^16)、 SEQ D) NO:158的32-458^^i^(它包括IL-17A的外显子l"6以;SJL-17RC的外显子 8-16)、或SEQIDNO:158的l-458^J^^基、或SEQ ID NO:158的32-690^J^ 酸^4iLSEQ ID ]\0:158的1~690#^^1^具有至少85%、至少86%、至少 87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和至少99.5%的序列同一性，其中所述多肽能够结合IL-17A和/或IL-17F。在某些实施方案 中，所述被编码的多肽不含有SEQ ID NO:158的1-690^^^JJISEQ D) NO:158的l-458^^基。在某些实施方案中，所述多肽不是通过下述方法 产生的：（a辟养已导A4达载体的细胞，所&达载体含有有效连接的下列元 件：转录启动子、编码^^有SEQ ID NO:158的1-690氨基酸残基或SEQ D) NO:158的145aU^i基的多肽的DNA序列、以^^转^if止子；以A(b)回收 所表达的多肽。所述多J^可在下列疾病的治疗中用于结合、阻断、减少、拮 抗或中和BL-17A和/或IL-17F，所述疾病包括：银屑病、特应性皮炎和接触性 皮炎、IBD、 IBS、结肠炎，内毒素血症，关节炎，类风湿关节炎，莱姆病关 节炎，#^病关节炎，^A呼吸系统疾病（ARD)、脓桊汰休克、多器官功能 衰竭、炎',损伤例如哮喘、慢性阻塞,疾病（COPD)、气道高站性、 慢性支气管炎、过敏性哞喘、细菌',炎、#^病、湿#炎'»病例如溃疡 性结肠炎和克罗恩病、幽门螺杆菌感染、由JM炎症（即感染、损伤等）导致 的，内粘连和/或,、系统性红斑狼齊（SLE)、狼备性肾炎、I型糖尿病、 冠心病、中风、多发'I4^化、系统'l^t化症、狄病、肾病综合征、触症、 器官移^tt排斥A^、移^t物抗宿主疾病（GVHD)、（例如肾、肺、心脏的）
移^tt排斥^、 M菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、骨关节炎、牙龈^l/牙周炎、 单纯疱渗1±角^质炎、骨质疏松、神经炎、单纯疱务性角J^质炎、癌症包 括前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、癌#管形成（如卵 巢癌、宫颈癌和前列腺癌）、B细lfe^巴瘤、T细JJ^巴瘤、嚢性纤维化、再 狭窄和川崎病。
本发明还提供了编码一种多肽的分离的核i^子，其中所述核i^子能够 在特定杂交M下与SEQ ID NO:157的598-1374核苷酸(或其全长互4H^)、 SEQ ID NO:157的94-137磁苷斷或其4^互^H^)、 SEQ ID NO:157的l國1374 核苷酸(或其4^互4H^)、 SEQ ID NO:157的94-207條苷^(或其4H^互4W9 或SEQ ID NO:157的1-2070核苷酸(或其全长互4H^)杂交，所述特定杂交M 为：在杂交溶液(5xSSC (lxSSC为0.15 M氣/tt^l和0.015 M梓檬酸钠)、0.02%十 二^fo^酸钠(SDS)、 0.1。/oN-十二^U^酸钠、1%封闭试剂)中于62匸预杂 交1小时，然后用2xSSC, 0.1% SDS在室温下严格洗涤两次，每次5分钟，再 在62X:下用0,5xSSC, 0.1% SDS洗涤15^4t;其中所述被编码的多肽能够结合、 阻断、减少、拮抗或中和IL-17A和/或IL"17F。所述^L编码的多M可用于治 疗银屑病、特应性皮炎和接触性皮炎、IBD、 IBS、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿关节炎、莱姆病关节炎、银屑病、关节炎、威^A呼吸系统疾病
(ARD)、脓毒性休克、多器官功能衰竭、炎'^N员伤例如哮喘、慢性阻塞性 肺疾病（COPD)、气道高^性、慢性支气管炎、过敏性孝喘、细菌',炎、 银屑病、湿#炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病、幽门螺杆菌感染、由 «炎症（即感染、损伤等）导致的腹腔内粘连和/或脓肿、系统性红斑狼瘙
(SLE)、狼瘙性肾炎、I型糖尿病、冠心病、中风、多发'顿化、系统'|« 化症、硬皮病、肾病综合征、J5Ul症、器官移植排斥反应、移;ti物抗宿主疾病
(GVHD)、（例如肾、肺、心脏的）移^t排斥反应、,菌细胞壁(SCW) 诱导的关节炎、骨关节炎、牙龈A/牙周炎、单纯疱療性角J^质炎、骨质疏 松、神经炎、单纯疱务性角MJ^炎、癌症包括前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵 巢癌、宫颈癌、白血病、癌^管形成（如卵巢癌、宫颈癌、前列腙_癌）、B 细胞林巴瘤、T细Jffe^巴瘤、嚢性纤维化、再狭窄和川崎病。
本发明还提供了含有SEQ BO NO:183的l-426^^J^、 SEQ ID NO:183 的1-657絲^J^SEQ ID NO:183的l-658^^J^的分离的多肽。絲 地，所述多Jlbi可包括免疫球蛋白部分，例如免疫球蛋白重链恒定区。所i^ 疫球蛋白重链恒定区可以来源于例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgD、 IgM、 IgE或它们的衍生物。所述免疫球蛋白重链恒定区可以具有抗体依赖性 细胞介导的细J^性("ADCC")和/或蜂H^，性细J^性("CDC")。所述免疫 球蛋白重链恒定区可为例如：Fc5、 FclO、 SEQ ID NO:183的427-657^^i 絲SEQ ID NO:183的427-658^J^1^。所述多JM可^J4包括分;i;Ht 号序列，例如人类IL-17RA(例如SEQ ID NO:184和185)、人类IL"17RC (例如 SEQD)NO:2的l-20^J^i^)、 otPA前原信号晰SEQ ID NO:178)、人类生 长激素(SEQ ID NO:168和169)以及人类CD33(SEQ ID NO:172和173)。所述多 肽可在培养的细胞中被重^E^达，所述细胞例如原核细胞(例如:^杆菌)和真
核细胞(例如，哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细#酵母细胞例如酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pidiia pastoris))。
本发明还提供了编码含有SEQ ID NO:183的1426^^l基的多肽的分 离的核^^。所述核^^可为例如SEQIDNO:182的核苷酸序列。^i^&， 所述被编码的多皿可包括免疫球蛋白部分，例如免疫球蛋白重链恒定区。所 述免疫球蛋白重链恒定区可以来源于例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgD、 IgM、 IgE或它们的衍生物。所述免疫球蛋白重链恒定区可以具有抗体依赖性 细胞介导的细J^性("ADCC")和/或4h^，性细l^)!i("CDC")。所述免疫球蛋白重链恒定区可为例如：Fc5、 FclO、 SEQ ID NO:183的427-657^tJ^i #SEQ ID NO:183的427-658^^1^。所述^L编码的多肽i^可^i^包 括分泌信号序列，例如人类IH7RA(例如SEQ ID NO:184和185)、人类 IL國17RC (例如SEQ ID NO:2的l-20絲^t^)、 otPA前原信号肽(SEQ ID NO:178)、人类生长激素(SEQ ED NO:168和169)以及人类CD33(SEQ ID NO:172和173)。所述被编码的多肽可在培养的细胞中被重姿J^达，所述细胞例 如原核细胞(例如大肠杆菌)和真核细Jffe(例如，哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢 细胞和酵母细胞例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris))。
本发明还提供了一种表达载体，所述载体含有有^i^接的下列元件：a)转 录启动子；b)编码一种多肽的DNA区段，所述被编码的多肽含有SEQ ID NO:183的l-426狄絲基；以及c)转录终止子。所述被编码的多腿可包括 免疫J^蛋白部分。所述免疫球蛋白重链恒定区可以来源于例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgD、 IgM、 IgE或它们的衍生物。所it免il^^蛋白重链恒 定区可以具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性("ADCC")和/或4H^依赖性细 ;j^性("CDC")。所述免疫球蛋白重链恒定区可为例如：Fc5、 FclO、 SEQID NO:183的427-657jtJ^^J^SEQ ID NO:183的427-658^tJ^^。所述被 编码的多Jte可任选地包括分泌信号序列，例如人类IL-17RA(例如SEQ ID NO:184和185)、人类IL-17RC (例如SEQIDNO:2的1-20^J^^J^)、 otPA前 原信号肽(SEQ ID NO:178)、人类生长激素(SEQ ID NO:168和169)以及人类 CD33(SEQ ID NO:172和173)。所述被编码的多肽可在培养的细胞中被重纟1^ 达，所述细胞例如原核细胞(例如;t^杆菌)和^fe细胞(例如，哺乳动物细胞例 如中国仓鼠卵巢细l^酵母细胞例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴 斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))。本发明还4^供了一种产生多肽的方法，包括： 培养已被导A^文所述的表ii^体的细胞，其中所述细胞表达由所iiDNA区段 编码的多肽；以及回i!t^斤^^达的多肽。
本发明还提供了一种组合物，所i^ia合物包含含有SEQ ID NO:183的 l-426M^l基的多肽以及可药用的载体。任选地，所述多g可包括免疫 球蛋白部分，例如免疫球蛋白重链恒定区。所狄疫球蛋白重链恒定区可以来 源于例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgD、 IgM、 IgE或它们的衍生物。 所述免疫球蛋白重链恒定区可以具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 ("ADCC")和/或4h^依赖性细J^性("CDC")。所述免疫球蛋白重链恒定区可为例如：Fc5、 FclO、 SEQIDNO:183的427-65Tt^^li^SEQIDNO:183
本发明还提供了一种治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包M予所 述受"^"含有SEQ ID NO:183的l-426^M基的多肽，其中所述多肽能够 结合、阻断、减少、拮抗或中和IL-17A和/或nrl7F的活性，并且其中所述疾 病选自：银屑病、特应性皮炎和"^触性皮炎、IBD、 IBS、结肠炎、内毒素血 症、关节炎、类风湿关节炎、莱姆病关节炎、银屑病关节炎、成人呼吸系统疾 病（ARD)、脓桊性休克、多器官功能衰竭、炎'li^损伤例如哞喘、慢性阻塞 ',疾病（COPD)、气道高M性、慢性支气管炎、过敏性哞喘、细菌#^ 炎、银屑病、湿瘆和炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病、幽门螺杆菌感染、 由«炎症（即感染、损伤等）导致的腹腔内粘连和/或脓肺、系统性红斑狼 疮（SLE)、狼癍性肾炎、I型糖尿病、冠心病、中风、多发'l!i^化、系统性 硬化症、M病、肾病综合征、败血症、器官移植排斥M、移;fct物抗宿主疾 病（GVHD)、（例如肾、肺、心脏的）移植排斥反应、M^菌细胞壁(SCW) 诱导的关节炎、骨关节炎、牙龈il/牙周炎、单纯疱瘆性角J^t炎、骨质疏 松、神经炎、单纯疱务性角g质炎、癌症包括前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵 巢癌、宫颈癌、白血病、癌鈔管形成（如卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌）、B 细g巴瘤、T细胞林巴瘤、嚢性纤维化、再狭窄和川崎病。>^地，所述多 ^ii可包括免疫球蛋白部分，例如免疫球蛋白重链恒定区。所述免疫^l蛋白重 链恒定区可以来源于例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgD、 IgM、 IgE 或它们的衍生物。所述免疫球蛋白重链恒定区可以具有^^依赖性细胞介导的 细J^性("ADCC")和/或矛HN^性细J^性("CDC")。所述免疫球蛋白重链 恒定区可为例如：Fc5、 FclO、 SEQ B0 NO:183的427-657JU^ll^SEQ ID NO:183的427-658^^Jl。
本发明还提供了一种治疗患有疾病的受^"的方法，所述方法包M予所 述受试者一种组絲，所i^^包含含有SEQ ID NO:183的l-426^絲 基的多#可药用的栽体，其中所述多肽能够结合、阻断、减少、拮抗或中和 IL-17A和/或IL"17F的活性，并且其中所述疾病选自：银屑病、特应性皮炎和 接触性皮炎、IBD、 IBS、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿关节炎、莱 姆病关节炎、#4病关节炎、成人呼吸系统疾病（ARD)、脓毒性休克、多器 官功能衰竭、炎',损伤例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD)、气道高反 应性、慢性支气管炎、过敏性哮喘、细菌',炎、银屑病、湿麵炎.f锡病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病、幽门螺杆菌感染、由皿炎症（即感染、损伤等）
导致的tt内粘连和/或旨、系统性红斑狼疳（SLE)、狼瘙性肾炎、I型糖 尿病、冠心病、中风、多发'I;4^化、系统'ti^化症、^C病、肾病综合征、败 血症、器官移植排斥反应、移植物抗宿主疾病（GVHD)、（例如肾、肺、心 脏的）移植排斥反应、M^菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、骨关节炎、牙龈炎 /牙周炎、单纯疱渗性角J^t炎、骨质琉险、神经炎、单纯疱务性角J^t 炎、癌症包括前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、癌#管 形成（如卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌）、B细胞淋巴瘤、T细胞林巴瘤、嚢性 纤维化、再狭窄和川崎病。任选地，所述多lkJ^可包括免疫球蛋白部分，例如 免疫球蛋白重链恒定区。所述免疫球蛋白重链恒定区可以来源于例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgD、 IgM、 IgE或它们的矛汴生物。所述免疫球蛋白 重链恒定区可以具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性("ADCC")和/或^H^依 赖性细胞条性("CDC")。所述免疫球蛋白重链恒定区可为例如：Fc5、 FclO、 SEQ ID NO:183的427-657M^J^SEQ ED NO:183的427-658^^i 基。
本发明还提供了能够与含有SEQ ID NO:183的l-426^^i^、 SEQ ID NO:183的l-657^J^^J^V或SEQ ID NO:183的l-658^J^^^的多肽特 异性结合的抗絲胁片段。所述^/^胁片m自：多克隆胁、鼠类单 克隆*、来源于鼠类单克隆M的人源化M、 *片段、中和^^和人类 单克隆M。 4i^4,所述^/^片段可为选自下列的片段：F(ab，)2、 F(ab)2、 Fab，、 Fab、 Fv、 scFv和最小识别iH^。本发明还提供了能够与本文所述的抗 ^:^片段特异性结合的，#^*。
本发明还提供了含有SEQ ID NO:183的l-426^^JJ^免疫球蛋白部 分的融M白。^i^，所述免疫球蛋白部分可为免疫球蛋白重链恒定区，例
基。本发明还提供了编码上^^融合i白的分离的核酸分子，例如S^Q ID NO:182的l-1971核苷酸和SEQIDNO:182的l-197磁苷酸。4^发明^£4^供了含 有上述融^"白和可药用栽体的组合物。所述组合物可以用于治疗本i^斤述的 一种或多种不同疾病。
序列同一性百分数可通过常规方法测定。参见例如，Altechul " d， 5wtt 她欲.历汰他603 (1986)和Henikoff and Henikoff， 油汰M , 《9:10915(1992)。简而言之，^^1空位开放罚分为10，空^4伸罚分为1，并使用表6所示的Henikoff和Henikoff(如上iiiL献)的"BLOSUM62"评分矩阵，将两 个M酸序列进行比对以优化t时分数(用标准单字母编码表示#^酸)。同一 性百分数按下式计算：（[相同匹配物的总数I/[较长序列的长度+为比对两序列而 在较A亭列中引入的空位数])(100)。
表6
A R N D c Q E G H I K M F P S T w Y
A 4
R -1 5
N 誦2 0 6
D -2 誦2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 ■4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 誦2 -2 6
H -2 0 1 -l 隱3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 誦3 -l -3 -3 -3 4
-1 -2 -3 ■4 -1 隱2 -3 -3 2 4
K 隱l 2 0 -1 隱3 1 1 -2 -l -3 -2 5
M -l -l -2 -3 -l 0 國2 -3 -2 1 2 -1 5
F 國2 -3 誦3 -3 -2 -3 -3 誦3 -l 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 國l -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 ■4
S 1 -l 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 隱l -2 -l 4
T 0 墨l 0 -l -1 -1 -1 -2 -2 -1 國l 隱l 誦l -2 -1 1 5
W -3 -3 ■4 曙2 誦2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 陽l 1 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 誦l -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 隱3 -3 -3 —1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 陽3 -1
本领域技术人员了解有多种已知算法可以用于比对两个M酸序列。
Pearson和Lipman的"FASTA"相似性搜索算法^l一种合适的蛋白质比对方 法，可用于检测本文公开的^J^序列和一种推定的n^l7RC变体的M^ 列之间的同一性水平。FASTA算法描述于Pearson and Lipman， jRwa 7VW/ Jcfld 5tA 85:2444 (1988)和Pearson， £>i^;»w/: 7&?:63 (1990)。简而言 之，FASTA首先在不考虑保守性M酸置换、插入或缺失的条件下，识别查询序列(例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)和测试序列共有的、具有最高密度 同 一性(在ktup变量-l时)或同 一'树(在ktup变J^2时)的区域，从而表征序列 相似性。然后通过^^I絲紅换矩阵H^;斤有配对的^^酸的相似性，对具 有最高密度同一性的十个区域迸行再评分，并将各区域的末端"修剪"为仅包括 那些对最高评分有贡献的残基。如果有一些区域的得分高于"阈(cutofO"值(通 过基于序列长度和k加iHi预定的公式计算得出)，则检测修剪后的初始区域以 确定这些区域是否参与形成有空位的近似比对。最后，使用改进的 Needleman画Wunsch-Sellers算法(Needleman and Wunsch， /•杨A 錄444 (1970); Sellers, 5Z4M/. J/?p/: 26:787 (1974))比对两个^J^^列的得分 最高的区域，该算法中考虑了M酸插入和缺失。FASTA分析的示例性M 为：ktup=l、空位开放罚h10、空位延伸罚^l以及置换矩I^BLOSUM620 可以如Pearson， ^yigwM 1«5:63 (1990)的附录2所述，通过修改评分矩阵 文件("SMATRIX")，将上述^lt引AJASTA禾I^中。
也可以使用上述公开的比值，将FASTA用于测定核^子的序列同 一性。 对于核苷酸序列比对而言，ktup值可为l至6、 ^^i^为3至6、最优逸地为3， ^fe^^:的设置同上所述。
本发明包^it样的核酸分子：它所编码的多肽与本文公开的JL^酸序列相 比含有保守性的JL^酸改变。例如，可获得如下变体：所述变体包^SEQ ID NO:2或21的 一个或多个氨基酸的置换，其中用烷基氨基酸置换IH7RA或 IH7RC氨基酸序列中的烷基氨基酸、用芳香族氨基酸置换IL-17RA或 H7RC氨基酸序列中的芳香族氨基酸、用含硫的氨基酸置换IL-17RA或 IL-17RC氨基酸序列中的含硫M酸、用含羟基的氨基酸置换IL-17RA或 IL-17RC氨基酸序列中的含羟基氨基酸、用酸性氨基酸置换IL-17RA或 IL-17RC絲絲列中的酸性絲酸、用碱性絲紅舰-17RA或IL-17RC M酰亭列中的>5^性#^酸，或用二元iN^^^l^IL"17RA或IL"17RC 絲斷列中的二元jf^^絲酸。在常JL^酸中，例如，"保守性^酸
置换"可用下列各组内的絲^J^目置^M兌明：（l)甘氨酸、丙氨酸、翔氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸，（2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，（3)丝氨酸和苏氨酸，（4) 天冬氨酸和谷氨酸，（5)谷氨i^和天冬,，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨 酸。BLOSUM62表为来源于蛋白质序列区段的约2，000次局部多重比对的M 酸置换矩阵，代表了多于500组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoff and Henikoff, iVw iVW/ X^wi 5ti f/^X4卵:10915 (1992》。因此，可以使用BLOSUM62置换频率来确定可被引WJ本发明絲断列中的保守性絲酸
置换。虽然可以M于化学'M来设计"tJ^i:换(如上所述的)，但是术语"保
守性J(J^^换"^^^指的是在BLOSUM62表中数值大于-l的那些置换。例 如，如果某一^J^^^换在BLOSUM62表中用数值为0、 1、 2或3表征，则该 置换为保守性置换。4緣这一系统，优选的保守性^^M换在BLOSUM62 表中的表征数值至少为l(例如l、 2或3),而更优选的保守性氨基酸置换在 BLOSUM62表中的表;^Elt值至少为2(例如2或3)。 IL-17RC的M变体可表征 为与相应M酸序列(例如SEQIDNO:2或21)具有至少70。/0、至少80%、至少 卯％、至少95%或大于95%例奶6%、 97%、 98%或99%或更高的序列同一性，
其中所述JL^酸序列的变化来自于一个或多^守性^J^i:换。
例如可以通过用核苦酸4戈替SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4所示的核苷 酸，在1-171^或11^1711<:基因中引入保守性#^改变。可以通it^fe苷酸 定向诱变、接头分区诱变、使用聚合Sl^it^应的诱变等方法(参见Ausubd (1995);和McPherson (编著)，D/m?to/ Mwtog欲esis..爿Practfcfl/ ^4/;/wYWic/r (IRL Press 1991))，获得这类"保守性^J^"变体。可通过与抗IL"17RC抗^!t异性 结合的能力来识别变体IL-17RC多肽。
本发明的蛋白质还可包括非天然存在的JLi^^。非天然存在的JU^ 包括但不限于：反^3-曱絲氨酸、2，4-曱醇絲氨酸、顺式4^絲氨酸、反 式4-羟Ut氨酸、iV-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基乙基半贿酸、 羟基乙基高半Jj3t^酸、硝l^tj^、同型^jl^(homoglutamine)、六氢 哌微酸、瘗wj^酸、脱Ut氨酸、3-和本甲絲氨乾33-二甲^Jt氨酸、 ^L-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和 4-氟苯丙氨酸。在4^页域中， 一些用于将非天然存在的絲i^^引入蛋白质 的方法是已知的。例如，可以佳月这样一种体外系统，该系统中使用化学M SM匕抑制物tRNA抑制了无义突变。合^&酸和^JJlMttRNA的方法是^2M页 域中已知的。通常，在一种含有^杆菌(五."//)8304是取物和市售的酶类和其 他试剂的无细胞系统中，进行含有无义突变的质粒的转«^，。通过色镨法 纯化蛋白质。参见例如，Robertson " flA， /.爿肌C&抓5^c: J":2722 (1991)、 Ellman " "， 7W^欲^wfe £>igwM^ 2似:301 (1991); Chung " "， 5W朋ce 259:806 (1993)和Ch皿g""A,PSrwiVa,，/爿aidL f/5^卯:10145 (1993)。
在第二种方法中，通过微注射突变mRNA和化学^J^M匕抑制物tRNA， 在非洲蟾蜍(Xenopus)卵母细胞中进行翻译(Turcatti " "， /• C7^肌2TZ:19991 (1996))。在第三种方法中，在不含有所要取代的天然M酸(例如苯 丙氨酸)而含所需的非天然存在的IL^酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨 酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的培养基中培养;tM杆菌细胞。非天然存 在的氨基酸就被引入蛋白质中而替代了其天然对应物。参见Koide W «A， 历oc/^抓":7470 (1994)。可以通过体外化学修饰将天然存在的M^l^转 化为非天然存在的种类。可以#[匕学^^与定点诱变相结合，以进一步扩ylli 换的范围(Wynn and Richards, iV0te//1 Sc力2:395 (1993))。
可以用有限数量的非保守性JL^酸、不是由遗传密码子编码的M酸、非
天然存在的M酸和非天然g^I^IL"17RA或BW7RC的^J^^l基。
可以根据下述本领域已知的方法识别本发明多肽中的关^:M酸，例如定 点诱变或丙氛酸扫描(alanine"Sca皿ing)诱变(Cu皿inghain and Wells， 5W欲ce 2«:1081 (1989); Bass nA, A^，/爿c"d Sci K&4朋:4498 (1991); Coombs and Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering,"见于 7Vote//w.^4"flr/>w/s朋"i)es/g"， Angeletti (编著)，第259隱311页(Academic Press, Inc. 1998))。在丙氨酸扫描诱变技术中，对衬中的每个^J-位置都引入单个 的丙氨酸突变，并测试所得的突变体分子的生物活性，从而识别分子活性的关 键絲^1^。还可参见，旭toii"aiL，丄说MO^饥277:4699 (1996)。
虽然可以^JI序列分析iMi—步确^JL"17RA或IL"17RC配体结合区域， 但是也可以通过结构的物理分析来测定对于IL-17RA或IL-17RC结合活性(例 如IL-17RC与I1-17A或IL"17F的结合，以;SJL"17RA与IL"17A的结合)^作用的 JL^酸，所述结构的物理分析可通过例如下述的方法并结合对推定的接触位点 ^J^的突变而测定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和力标记。参见例 如，de Vos " dl，化/柳ce 255:306 (1992)， Smi也"/. ^/o厶"4:柳9 (1992) 和Wlodaver W d， JERS丄e汰3卯:59 (1992)。 *^而言，识别了以下三个结构 域：
1) 结构域1(SEQ ID NO:159和160)包括IL"17RC的外显子8"10。 i^J"应于 IH7RCxl(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基193-276和IL"17RCx4(SEQ ID NO:166)的^J^i^208-291;
2) 结构J^2(SEQIDNO:161和162)包括n^l7RC的外显子ll-13。 i^J"应于 IL-17RCxl(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基277-370和BL"17RCx4(SEQ ID NO:166)的M^J^92-385;
493)结构^3(SEQIDNO:163和164)包括IL-17RC的外显子14"16。 i^J"应于 IL-17RCxl(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基371-447和IL"17RCx4(SEQ ID NO:166)的狄^j386-462。
可以用已知的诱变方法和筛选方法制备多个Mg换并进行测试，所述 方法例如Reidhaar-Olson和Sauer (5We"ce 2^/:53 (1988))或Bowie和Sa股r (iVwiV^7JawiSci t/5^S6:2152(1989))中公开的方法。简而言之，以Ji^者 公开的方法包括同时随^M匕多肽中的两个或多个位置、筛选功負fe性多肽，并随 后对诱变的多肽测序以确定在^-位置上可以置换的图谱。务他可以使用的方 法包括嗟菌体展示(例如Lowman e"/1，^:10832 (1991); Ladner^人 的美国专利No. 5^223,409; Huse的国际申请公布WO92/06204)和区域定向诱变 (Derbyshire C"A，（7e"e":145 (1986)和NerCdl，Z)A^ 7:127， （1988))。此外，可
克隆。 , ' 二 ，
还可以通itSteimner，池/脏，389 (1994); Stemmer， iVw泡7
W:10747 (1994)和国际申请公布WO 97/20078中公开的DNA?^i且技 术，产生所公开的IL-17RC或IL-17RA核苷酸和多肽序列的变体。简而言之， 通it将"^体DNA随机片殺?f匕，然后佳月PCRi^f亍重新iE^JMi^亍体外同源重 组，从而产生随机引入的点突变，以产生变体DNA^。这一技术可以通过使 用母体DNA分子的家族(例如来自不同物种的等位基因变体或DNA分子)进行 改进，以在过程中引入另外的可变性。对所需活性的选择或筛选，接着进行另 外的^1诱变和测定提供了序列的'fel"进化"，这种进化是通iti^择所需的突 变并同时筛选掉有害的改变而实现的。
本文公开的诱变方法可以与高通量自动筛选方法相结合，以检测宿主细胞 中克隆的诱变多肽的活性。可以佳月Sd/R化装置从宿主细胞中回Jjt^码生物活 性多肽或与抗IL-17RC或IL-17RA^结合的多肽的诱变DNA分子，并对其快 速测序。这些方、^f吏得可以iStil确定目的多肽中个别^J^l^的重要性，并 可以应用于未知结构的多肽。
本发明还包括IL-17RC或IH7RA多肽的"功能性片段"和编码这类功能性 片段的核酸分子。这些功能性片段可以单独M-^结合一个或多个配^即 IL-17A和IH7F两者）。可以进行核酸分子的常规缺失分析，以获得编码 EL-17RC或IL-17RA多肽的核^子的功能性片段。例如，可以用及必l核酶来 消化具有SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4的核苷酸序列的DNA分子，以获得一系列嵌狄失。然后将所述片段插A^达载体的合适的读码框中，分离所表达的 多肽并测试其与抗IH7RC:^结合的能力。或者可以不4捐外切核酸酶消化 而使用寡核苷酸定向诱变，来引入缺失或者终止密码子来限定所需片段的产 生。或者可以4^l聚^Sl^iU^来合j^IL-17RC或IL^17RA^因的特定片段。 这一通用方法在Horisberger and Di Marco， 66:507 (1995)
所总结的对于干扰素的一端或两端截短的研究中有所示例。jW^卜，用于蛋白质 功能性分析的标准技术在下述文献中有所描述：例如，Treuter " "， G肌（7e"" 2掀113 (1993); Content C "/•， " Expression and preliminary deletion anatysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon"
/"to/mwi^"fems，Cantell(编著)，第65-72页（Nijhoff 1987); Herschman， "The EGF Receptor,"见于Co"加/ <^4"/腳/ O// 7Vo/^#Yi/fe"， 7， Boynton C (编著）第169-199页(Academic Press 1985); Coumailleau " "， /• CAe饥 270:29270 (1995); Fukunaga " dL, /. C&抓270:25291 (1995); Yamaguchi C d，丑/oc/ie肌/^flmjflcM 50:1295 (1995)和Meisd C d， A/o/ec: 3决1 (1996)。
本发明还考虑到了与本文公开的氨基酸序列相比具有氨基酸改变的 IL-17RC或IL-17RA^因的功能性片段。可以如上所iiiikit过测定与所公开的 核苷酸和M酸序列的同一性水平，基于结构来识别变体IU7RC或IL-17RA 基因。另 一种基于结构识别变体基因的方法是测定一种编码潜在变体IL"17RC 或IL-17RA基因的核酸W是否能够与包括例如SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4 的核苷酸序列的核酸分子杂交。
本发明还包括^J^IH7RC或IH7RA多肽的功能性片段、IL-17RC和/或 IL-17RA多肽的抗原性表位、带有表位的部分或配体结合部分，以及编码 IL-17RC和/或IL"17RA多肽的这类功能性片段、^^'li^位、带有表位的部分 或西沐结^P分的核^^。^l这类片Wt产生多肽，以用于产生能够结合、 阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A和/或IL"17F的活性的可溶1"生受体或结 合衬。本议义的"功能性"IL-17RC或IL-17RC/IL-17RA多狄其片段的特 征是它们能够通过其诱导或抑制M细胞功能的能力或与IL-17A和/或IL-17F 特异性结合的能力，从而阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL"17A和/或IL"17F 的炎症活性、增殖活性或^M匕活性。如上文所述，IL-17RA和IL-17RC都是以 本文所述的独特细胞因子受体结构和结构域为特征的。因此，本发明M虑了^^1包括下舰的融錯白：（a)包括一个或多个上雌构域的多肽衬；以及 (b)包括一个或多个上^构域的功能性片段。所，M白的絲多肽部分可 以来自另一种细胞因子受体，例如IL-17样受体、IL-17RA、 IL-17RE、 IL-17RD， 或来自可以促i^斤述融M白分泌的非天然和/或非相关的分泌信号肽。
本发明还提供包括本文所逝L"17RC或IH7RA多肽的配体结合部分的多 肽片段或肽。这类片M肽可包括IL"17RC或IL-17RA的与其各自配/^(IL-17A 和/組-17F)结合的部分。
对于IL-17RC或IL-17RA多肽(包括变体和融^^白）而言，本领域"fit技 术人员 <捐以Ji^l和^2所列出的信息，可以容易地产生编码该变体的完整简 并多核苷酸序列。此外，本领域技术人员可以使用标准软件基于本文所述的核 苷酸和^J^^列设计IL-17RC或n^l7RA变体。
E)IL~17RC、 IL-17RA和II^17RC/II^17RA多肽的制备 本发明的多肽包括錄多肽；可溶性科、同二聚体、异二聚体和多聚体 形式的受体；全长受体；受体片段(例如配体结合片段和^^Ii4位)、功能性 片段、和融M白，它们树以才娥常^t絲重组宿主细胞中产生。为了絲
IL國17RC、 IL画17RA和IL-17RC/IL-17RA^因，必须将编码所述多肽的核齡 子与控制^Ji^体中的转^ii的调辦列有^i^接，然后再引入宿主细胞中。
适于筛选带有^Ji^体的细胞的才斜e^因。
适于在M细胞中产生外源蛋白质的表i^^it常含有:(l)编码细菌复制 起泉的原核DNA^件和抗生素抗'l^示记，以便于表ii^体在细菌宿主中生"^ 对其进行筛选；（2傳制转录启动的^feDNAiL件，例如启动子；和(3傳制转 录物的加工的DNAit件，例如转fJf止/多腺苷酸化序列。如上所述，表达载 ^ii可以包含编码分泌序列的核苷酸序列，所述分泌序列指导异源多J!fci^宿 主细胞的分泌途径。例如，IH7RC表达载体可包括IU7RC、 IL"17RA和 IL-17RC/IL"17RA基因和来源于,分泌基因的分泌序列。
本发明的IL-17RC、 BL-17RA和IH7RC/IL-17RA蛋白可在哺乳动物细胞 中表达。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero; ATCC CRL 1587)、人类胚胎肾细胞(293JIEK; ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞 (BHK画21， BHK-570; ATCC CRL 8544， ATCC CRL10314)、犬肾细胞(MDCK; ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细l&(CHO-Kl; ATCC CCL61; CHO DG44
52(Chasin e, "， S纖Ce汰層"G微il 22:555， 1986))、大鼠垂体细J&(GH1; ATCC CCL82)、 HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E; ATCC CRL 1548)、 SV40转化的猴肾细J3&(COS"1; ATCC CRL 1650)和鼠类胚 胎细胞(NIH-3T3; ATCC CRL1658)。
对于哺乳动物宿主而言，转f^翻译调节性信号可以来源于哺乳动物病 毒，例如，腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猿猴病毒等等，其中的调节性信号与具 有高表i^jc平的特定基因相关。合适的转^^，控序列还可来自哺乳动物 基因，例如，肌动蛋白基因、i^^基因、J3/L^l蛋白基因禾，^r属^t蛋白基因。
转录调控序列包括足以指导RNA合成的起始的启动子区域。合适的真核细 胞启动子包括：小鼠^r^^蛋白I基因的启动子(Hamer " /. ^/i/^ G"e""六273 (1982))、疱渗病毒的7^启动子(McKniglit， O// 3J:355 (1982))、 SKW早期启动子(Benoist " aA， 7Va/w^ ^>决304 (1981))、劳斯肉瘤病毒启动子 (Gorman " d， 7Vtf/'/』c(Foecking & "， G柳e 45:101 (1980))和小鼠乳腺瘤病毒启动子(总体参见， Etcheveriy， "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" 见于外她/"五"《/"從/^"^:7^"">/651做或者，如果原核启动子受真核启动子的调节，可以佳月该原核启动子(例 如噬菌体T3 RNA聚合酶启动子)来控制哺乳动物细胞中的基因表达(Zhou " fl" M?A 舰^:4529 (1990)和Kaufman "《iViidl爿c她紐":4485 (1991))。
在某些实施方案中，将编码IU7RC、 IH7RA和IL-17RC/IL-17RA可溶 性受体多肽的DNA序列，或编码IL"17RC、 IL-17RA或IL^7RC/IL"17RA多肽
的片段的DNA^列与表达载体中的表达所需的其"^il传元件有^U^接，所述其 他遗传元件通常包括转录启动子和终止子。载^f^t常含有一个或多个可筛选 的标记和一个或多个复制起氛，但是^U页域技^pv员应认识到，在某些系统中 可筛选标记可以在另一载体中提供，并且可通过^至宿主细胞基因組中W1 供夕卜源DNA的复制。启动子、终止子、可筛选才朽6、载体和^*^件的选#^ 是^^页域技^A员能力范围之内的常旨为。许多这类元件都在文献中有述并 可从供应商处商购。可溶性受体复合物的多个组分可以共同转染到各自的表达 载体上，或a包括在同一个表达载体中。表达蛋白质复合物中的多个组分的 这类技#本领域中是>^的。可以l^糾标准技术将^i^体引入宿主细胞中，所述标准^M^包括：磷
酸钩转染、脂质体介导的转染、賴战射介导的iHit和电穿孔等等。可以筛i^p扩
增转染的细胞，以4l^^"有^L稳、定^ii宿主细l^因组的^Ji^体的重la宿主 细胞。用于将栽体引入絲细胞的技术以朋显性可筛选才封己筛iiil类稳定转染
体的技术在下列文献中有述：例如，Ausubel (1995)和Murray (ed.)， Ge朋 7hm^r "/w/ £jgpmss/o" iVotoco/s (Humana Press 1991)。
例如， 一种合适的可筛选标记为可提供新霉素抗生素抗性的基因。在这种
情况下，要^在存在新霉素类药物的条降下进行筛选，所述新霉素类药物例如
G^418等等。还可以^^)筛选系统錄高目的基因的表狄平，这一过程被称 为"扩增"。扩增按照下述步^ii行：^^在4MC平筛选药物的条件下培养转染 体，然后*增加筛选药物的量，以筛选能够高水平表达所引入基因的产物的 细胞。 一种合适的可扩增可筛选标记为二氬叶酸^^SI(DHFR)，它可提供对 甲氨喋呤的抗性。也可以佳月务他药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多药物抗 性、噪呤霉素乙il^移酶)。或者，可以使用可引入4^型变化的标记，例如绿 色荧光蛋白或细^4面蛋白例如CD4、 CD8、 I类MHC和胎盘碱性磷酸酶， 从而可通过例如FACS^i^^K分离技术的方法将转染细胞与未转染细l^目 分离。
还可以通过使用病毒送递系统由培养的哺乳动物细胞产生本发明的多肽。 可用于这一目的的示例性病毒包括：腺病毒、逆转录病毒、疱療病毒、牛痘病 毒和腺伴随病4(AAV)。腺病毒为一种双toNA病毒，它是目前研究最透彻的 用于iMit异源核酸的基因絲载^K综述可参见Becker " "， Jfe仇。//历o/1 通过缺失部分腺病毒基因组，可以容纳较大的异源DNA插入物(最高达7 kb)。可以通过直接连接或通过，共转M粒的同源重组将这些插入物引入 病毒DNA。 一种方案是缺失病毒载体所必需的£7基因，这使得病毒不食t^宿 主细胞未^^供^7基因的条降下进^f复制。例如，腺病毒载体感染的人类293细 胞(ATCC编号CRL"1573， 45504， 45505)可以作为粘附细胞或在悬浮培养中以 相对高的细胞密度生长，以产生显著量的蛋白质（参见，Gamier " Q;totec/i朋/. ":145 (1994))。
54本发明的多Jte可以在头他高等的^^细胞中表达，所述高等真核细胞例 如鸟类细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细JJ^植物细胞。杆状病毒系M^供
了将克隆的基因引入昆虫细胞的有效手段。合适的表达载体基于苜蓿4IL^^^ 04wtogra/?/mcaft》/7i/cfl)多核型多角体病^(AcMNPV),并^^有爿>^的启动子， 例如：果錄(Drosophila)热休克蛋白(^p)70启动子、苜蓿4艮玟^j^fe型多角体 病毒立即早期基因启动子(/e-7)和延时早期WJT启动子、杆状病毒p^启动子和 果蝇金属硫蛋白启动子。另 一种制备重组杆状病毒的方法^J^ 了 Luckow所述 的基于转座子的系统(Luckow，" "A, /. Wra/L 67:4566 (1993))。这-^M絲载 体的系统以BAC-to-BAC试剂盒（Life Technologies, Rockville， MD)的形式出 售。这一系统中使用了含有Tn7转座子的转运载体PFASTBAC(Life Technologies),从而以被称为"bacmid"的;^t粒的形式将编码多肽的DNAiJlil1 至雄杆菌所含有的杆状病毒基因组中。参见，Hill-Perkins and Possee，丄Ge汰 F?ra/1 72:971 (1990)、 Bo皿ing， Ge汰Wra/L 75:1551 (1994)和Chazenbaik^
and Rapoport，/.5/wc&肌27化1543 (1995)。 jH^卜，极栽体可包括在所表达 多肽的C端或N端框内融合的编码表位标各的DNA，所i^^i^^N如Glu-Glu 表位才樹Grussenmeyer " "/L, Ph?c: ，，"cad似":7952 (1985))。朗^页 域已知的技术，将含有编码本发明多肽的基因的#^栽>^#化至;^杆菌中， 并针对bacmid进行筛选，含有被中断的/flcZ基因的即表明为重组杆状病毒。然 后佳月常^U支术分离含有bacmid DNA的重组杆状病毒基因组。
可以对示例性的PFASTBAC载体进^^目当大程度的修饰。例如，可以除 去多角体蛋白启动子并替换为杆状病毒威性蛋白启动子(^L称为Pcw， p6"或 MP启动子)，所述杆状病毒碱性蛋白启动子^f状病毒感染的较早期表达，并 被证实有利于表达分泌蛋白(参见例如，Hill-Perkins and Possee, /• Ge汰 77:971 (1990)、 Bonning，" /• Ge汰75:1551 (1994)和Chazenbalk and Rapopoit /.历o/: C&抓27(9:1543 (1995)。在这类絲载辆建体中可以^^1 长形式或短形式的碱性蛋白启动子。jH^卜，可以用来源于昆虫蛋白的分泌信号 序列替代天然分;^ft号序列，从而构建#^载体。例如，可4^i建体中使用来 自蜕皮素葡萄糖基转移酶(EGT)、蜜蜂蜂毒肽(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA)或杆状病^gp67(PharMingen: San Diego， CA)的分-JHt号序列 来代替天然IL-17RC分^fl:号序列。
使用重组病毒或bacmid来转染宿主细胞。合适的昆虫宿主细胞包括：来源 于ffLBn^-21的细胞系、草地贪^^/wwto/iteiYi户"gijpmto辨卵巢细胞系例如
55,ATCC CRL 1711)、 S/21AE和卿(Invitrogen Corporation; S油Diego， CA),以;5L^J^耐德(Schneider)-2细J^来源于甘兰尺蠖(rr/d^p/MwVi w/)的 HIGH FIVEO细胞系(Invitrogen)(美国专利No.5300，435)。可以^J?1市售的无 血清培养基^养和维持细胞。合适的培养基为用于S0细胞的S000 n ™(Ltfe Teclmologies)或ESF 921™ (Expression Systems);以;SJ^于甘兰尺蠖细胞(r.w/) 的Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa， KS)或Express FiveO™ (Life Teclmologies)。当使用重组病毒时，接种密度大约为2-&105个细胞，细胞由接 种密JLi长至l-2xl(^个细胞时加入重组病4^液，感染复lt(MOI)为0.1至10, 更通常鹏m。
用于在杆状病毒系统中生产重组蛋白的成熟技术在下列文献中给出：
Murray (编著)，第147-168页，BaUey等人的"Manipulation of Baculovims Vectors" (The Humana Press, Inc. 1991); C7wi/"g么'£^ressio" &败鹏， 第2版，Glover ""(编著)，第205-244页，Patel等人的"The baculovims expression system" (Oxford University Press 1995); Ausubel (1995),第16~37 至16-57页；Richardson (编著),^rcwfov/ms (The Humana
Press, Inc. 1995)和/We/"五"g/"從W"g: iV"cfc， Cleland " o/l
(编著)，第183-218页，Lucknow的"Insect Cell Expression Technology"(Johii Wiley & Sons, Inc. 1996)。
还可以^^l真菌细lfe(包^母细胞)WJi^文所述的基因。用于这一目 的的特别受关注的酵母物种包括：酿酒酵母(5tfcc/^/Ywg;c然cer^v/s/從)、巴斯德 毕赤酵母(Pfc似"/wi对w/s)和甲,赤酵母(Pfc似"附^/^朋//«1)。用于在酵母中的 表达的合适启动子包括：来自C^4U(半乳糖)、户GJT(磷酸甘油酸酯激酶)、 /4Z)好(醇脱氲酶)、爿OA7(醇氧化酶)、HIS4(組氨醇脱氬酶)等的启动子。已经设 计出了许多酵母克隆载体并且它们都是容易获得的。这类载体包括：基于YIp 的载体例如YIp5、 YRp栽体例如YRp17、 YEp载体例如YEp13，以及YCp栽体 例如YCpl9。用外源DNA转化酿酒酵母(X cem^/ffe)细胞并由此生产重组多肽 的方法爿>开于下列文献：例如，Kawasaki的美国专利No.4,599^11、 Kawasaki 等人的美国专利No. 4,931^73、 Brake的美国专利No. 4,870,008、 Welch等人的 美国专利No. 5，037，743和Murray等人的美国专利No. 4,845,075。通过由可筛选 标记确定的表型筛选转化的细胞，所述可筛选才封2it常为药物抗'1±^能够在缺 少特定营养物(例如亮氨酸)的条降下生长的能力。 一种^^适的用于酿酒酵母的载体系统为由Kawasaki等A(美国专利No.4，931073)^开的PO77载体系统，该 系统使得可以通it^含葡萄糖的培养基上的生长来筛选转化的细胞。*^可用
的美国专利No. 4,599^11、 Kingsman等人的美国专利No. 4，615,974和Bitter的 美国专利]\0.4，977，092)和醇脱氬酶基因的启动子和终止子。还可参见美国专利 No. 4,990,446、 5,063,154、 5，139,936和4，661，454。
用于其它酵母的转化系统也是^^w4页域已知的，所述，酵母包括：多形汉 森酵母(fl"做se"wAz/w/jwwp/f")、粟酒^t酵母(5"c始仍""/wwwwj^s/wwiAe)、 乳酸克鲁维酵母(AZi(^mwf3;ces toc泡)、脆壁克鲁维酵母(A7i^w/w^ces
加g战s)、玉蜀黍黑粉菌(CMfogo附fl[K剩、巴斯德毕赤酵母(Pfc綠/wisftwis)、曱 醇毕赤酵母(ftc/r/tf /we欲flrwW/ctf)、季氏毕赤酵母(PfcA/^《"说^»«««///)和麦芽糖 假丝酵母(GwwZ/d"附《//做")。参见例如，Gleeson " /. Af&w6/d /32:3459 (1986)和Cregg的美国专利No. 4,882^279。可以才MtMcKnight等人的 美国专利No. 4，935^349的方法使用曲霉(勿《^//鄉)细胞。Sumino等人的美国专 利No. 5，162»228中公开了转化产黄顶孢霉(^^附柳/"/« c/w^sw^e""/w)的方法。 Lambowitz的美国专利No. 4，486，533中公开了转化链^ (/Veww/wra)的方法。 例如，下列文献公开了使用甲醇毕赤酵母作为宿主生产重组蛋白的用途： Raymond的美国专利No. 5，716，808、 Raymond的美国专利No. 5，736»383、 Raymond " F做W W :11-23 (1998)和国际申请公布WO 97/17450、 WO 97/17451、 WO 98/02536和WO 98/02565。用于转化曱阵举赤酵母的DNA^^ 通常应制备为双链环形质粒形式，^H^k^转化前进行线性化。为了在甲醇 毕赤酵母中生产多肽，质粒中的启动子和终止子可为甲^赤酵母基因的启动 子和终止子，例如甲S^赤酵母的醇利用基因(^t/(^4yW^)。，可用的启 动子包^^二羟基丙酮合H(DHAS)、甲^氲Sl(FMD)和iilL化氲Sl(CAT)基因 的启动子。为帮助DNAl^^tAJ宿主染色体，优^#质粒的整个表达区# 在宿主DNA序列两端的侧翼。 一种可用于甲醇毕赤酵母的合适的可筛选标己为
EC:丄i.21)，并且可:使得ai/:宿主细M缺少腺噤呤^;降下生长。对于需 要尽量减少曱醇使用的;Wt工业工艺而言，可以使用缺失了两种甲醇利用基 因04t/Gi和JC/G2)的宿主细胞。为了产生分泌蛋白，宿主细胞可为空泡蛋白酶 基因(PEW和尸i^/)缺陷型细胞。使用电穿孔来帮助将含有编码目的多肽的 DNA的质粒引入甲醇毕赤酵母细胞。^f捐指数衰减脉冲电场，通过电穿孑L4H匕曱醇毕赤酵母细胞，所述电场的场强为2.5至4.5 kV/cm，优选地为约3.75 kV/cm,时间常数(t)为l至40亳秒，最^^i^为约20毫秒。
还可以将表达载体引入植物原M体、完整的植物组织或分离的植物细胞 中。将表达载体《1入植物组织的方法包括用根瘤土壤杆菌04gra^cten'"w 似m^ic^is)直接感染植物组织或将植物组织与根瘤Ji^杆菌共培养、Wi介导 的iHiH、 DNA注躲电穿孔等等。参见例如，Horsch " aA， 5tfew" "7 :1229 (1985)， Klein ""，飾te由o/柳:268 (1992)和Me^油/"M?tofor 朋"5fotec/r朋fogy， GIick ""(编著)，第67-88页，Miki等人的 "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plante"(CRC Press, 1993)。
或者，编码本发明多肽的基因也可以在原核宿主细胞中表达。可用于在原
核宿主中表达IL"17RC多肽的合适启动子是^2M页域技"员公知的，包括能够 识别T4、 T3、 Sp6和T7聚合酶的启动子、"筮菌体的PR和Pi启动子、；^杆菌 的印启动子、recv4启动子、热^K克启动子、/act/K5启动子、似c启动子、 启动子、/^ft4启动子和/flcZ启动子、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的启动子、芽孢 杆菌(Bacmus)的噬菌体的启动子、链霉菌(Str印tomyces)的启动子.、3J寇菌体的 /«/启动子、pBR322的6/fl启动子和氯霉素乙St^酶基因的CAT启动子。关于 原核启动子的综述^T参见Glick^ /. i>id Micra6/M / :277 (1987)， Wateon ""， 她fecw/"r历o/ogv <紐（7e"e， 4欲£Vi (Benjamin Cummins 1987)，和Ausubel" "(1995,
合适的原核宿主包括;^杆菌和枯草芽抱扦菌(5"^//鄉5""6说鄉)/^适的大 肠杆菌菌林包括：BL21(DE3)、 BL21(DE3)pLysS、 BL21(DE3)pLysE、 DH1、 DH41、 DH5、 DH51、 DH5IF'、 DH5IMCR、 DH10B、 DH10B/p3、 DH11S、 C600、 HB101、 JM101、 JM105、 JM109、 JM110、 K38、 RR1、 Y1088、 Y1089、 CSH18、 ER1451和ER1647(参见例如，B蘭n (编著)，編mz/"r倫/柳Z^/ox: (Academic Press 1991))。合适的枯草芽孢杆菌菌抹包括：BR151、 YB886、 MI119、 MH20和B170(^^见例如，Z)iVJ C7wi/"g:爿iVacdai/v4/^raflc/r， Glover (编著)中Hardy的"Bacillus Cloning Methods" (IRL Press 1985))。
当在例如大肠杆菌的细菌中表ii^发明的多肽时，多肽可食诚常以不可溶 颗粒的形式保留在细胞质中，或者可^it过细菌分泌序列定向至周质空间。对 于前一种情况，可以，细胞、回,粒并且使用例如异硫氰^Jl^尿素使其 变性。然后通过稀释变性液(例如用含有尿素和还原型和氧化型谷胱甘肽的溶 液进行透析，然后再用緩冲盐溶液进行透析M吏变性的多肽重新折叠并二聚化。对于后一种情况，可以通过破碎细胞(例如超声破碎或渗it^破碎;K吏得周质空 间中的内綠秋并回收蛋白质，从而以从周质空间中回收可溶性和功能性形 式的多肽，这样就无需进行变性和重新折叠。
在原核宿主中表达蛋白质的方法是本领域技术人员公知的(参见例如，
D7V^4 C7o"/"g 2: ^E;gwess/o" »5^她鹏，第2艮Glover C "A (编著)，第15页, Williams等人的"Expression of foreign proteins in co// using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" (Oxford University Press 1995); ^Pr/"cijo/ey "«人的"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" (Waey國Liss， Inc.
1995) 和iV她/w £>ig/"mi«g.. 做1996) )。
例如Ausubel(1995)中提供了用于将^Ji^体引入细菌细胞、酵母细胞、昆 虫细JJ&^植物细胞的标准方法。
方法在例如/Vvte/"五"g/"^r^"g.' 7W"c^fes a"" /Vflclfce， Cleland d d (编著)，第 163页，Etcheveny的"Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture"(Waey-Liss， Inc. 1996)中给出。回收由细菌系统产生的蛋白质的标准方 法在例如DAC4 C7朋/"g £^wes^wi »S>«fems，第2氣Glover " a/1 (编著)，第 59-92页，Giisshammer的"Purification of over-produced proteins from cells" (Oxford University Press 1995)中给出。A^f状病毒系统中分离重组蛋白的 成熟方法在Richardson (编著)，5tfCMfoWrws1 ^&^rcssfo" _flratoco& (The Humana Press, Inc. 1995)中有所描述。
或者，可以^^I完全固相合成法、局部固相合成法、片段缩合法或经典的溶 液合成法来合^^发明的多肽。这些^^成方法^1;^领^^支^A员7^的(^^见例 如，Merr迅eld， /•爿肌5W: :2149 (1963); Stewart " d, "Solid Phase Peptide Synthesis"(第2版)，（Pierce Chemical Co. 1984); Bayer and Rapp， 尸取3 :3 (1986); Atherton C《尸伊^feJ /Vflctt'cfl/y4/?/www^ (IRL Press 1989); Fields and Colowick» "Solid-Phase Peptide Synthesis," Me幼^wfe /w £>1矽腳/鄉第289巻(Academic Press 1997)和 Lloyd-Williams C "A, Or柳/cfl/々/w做cAes to说e ^yw幼es/s <尸伊6V/es做cf iVote/朋(CRC Press, Inc. 1997))。完全化学合成策略的一些修^:略，例如"天然化学连接"和"表达的蛋白质连接"也是本领域中的标准方法(参见例如，
Dawson C《5We"ce 266:776 (1994); Hackeng " "" 油/7 Jca^ M KS49¥ :7845 (1997); Dawson，五"矽腳A 2S7: 34 (1997); Muir " "/， iVoc:A^Yt/A4 95 :6705 (1998)和Severinov and Muir， /• Ote肌
本发明的肽和多肽包絲EQ ID NO:2、 SEQ H) NO:5或SEQ ID NO:21的至少6个、至少9个或至少15个连续氨基酸戎基。例如，多肽可包括SEQ IDNO:2、 SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:21的至少6个、至少9个或至少15个连续M酸残基。在本发明的某些实施方案中，所述多肽包括上述M酸序列的20、30、 40、 50、 100或更多个连续残基。编码这类肽和多肽的核酸分子可用作聚合sm^C^的S1物和探针。
此外，本发明的多肽及其片私在高等真核细胞中可以以牟体、同二聚体、异二聚体或多聚体的形^4达。可以佳月这类细jJMt产生至少含有IL^17RC多肽的 一部分("含IL-17RC的受体"或"含IH7RC的受体多肽")或IH7RC和IU7RA两者结合的一部分（以牟沐、同二聚M异二聚体的形式)的IH7RC单体、同二聚体、异二聚体和多聚体受体多肽，或者可以^^这类细胞作为筛选系统中的测试细胞。在本发明的一个方面，由培养的细胞产生至少包括IL-17RC或IL-17RA的J^卜结构域的配体结合部分的本发明的多肽，并且所述细Ji^L用于筛i^^斤述受体的配体，所述西沐包括天然配体IL"17F以^SJL"17A，或者甚至包括天然S沐的激动剂和拮抗剂。总而言之，这一方法包括将编码受体的cDNA或基因与其表i^斤需的，遗传元件(例如转录启动子)相结合，然后将所得的表^^^入至宿主细胞中。选择表达该DNA并产生功能性受体的细胞并将其用于多种筛选系统中。可^Nl同的细胞中表达单体、同二聚体、异二聚体和多聚体受体复絲的^组分。W卜，单体、同二聚体、异二聚体和多聚体受体复^的组姊可以与跨膜结构絲^fe膜融^PW目融合，以使
得可以如上所述^yjL^i合物并筛选转染体。
为测定本发明的多肽，适用于表iilH7RC和IL-17RC/IL"17RA受体或已知能结合IL-17A或IL"17F的其他受体并转导受体介导的信号的哺乳动物细胞(例如表iilL-17R的细胞)，包括冑汰达可与IL-17RC形成功能性复合物的其他受体亚基的细胞。还^i^f吏用与待表达的受体来自于同一物种的细胞。在一个优选的实施方案中，细胞的增殖依赖于夕卜部提供的it^生长因子。这一类型中优选的细胞系为人类TF-1细胞系(ATCC保藏号CRL-2003)和AML^193细胞系(ATCC保藏号d9589),它们是GM-CSF絲'tiA类白血病细胞系，这一类型中优选的细胞系还有BaF3(Palacios和Steinmete^ O//W: 727-734， （1985))，它AlL-3依赖性鼠类前B细胞系(pre"B cell line)。其他细胞系包括BHK细胞、COS-l细J!fe^CHO细胞。可以对^^适的宿主细l&^行基因工程^，以使其产生目的细胞应答所需的必需受体亚J^，细JJ^且分。这一方法的优势在于：由于可对细胞系进行基因工程^it使其表i^源于^^r物种的受体亚基，因此就克服可来源于物种特异性的潜在限制。可以克隆人类受^cDNA的物种直系同源物并用于来自相同物种的细胞系中，例如在BaF3细胞系中使用小鼠cDNA。因此，可以对，于il^生长因子(例如GM-CSF或ILO)的细胞系进行基因工程^it,使其变^f^于另一种通itlL"17RC或IL-17RA受体起作用的细胞因子，例如IL^17F或IL"17A。
在筛选测定中佳月表达功能性受体的细胞。本领域已知有多种合适的测定方法。这些测定方法基于对目标细胞中的生物应答的检测。 一种这类的测定方法为细胞增殖测定。分别^在或不存在测试^^物的4Hf下培养细胞，并检测细胞增殖，所述^^测细胞增殖的方法例如测量氮^^I腺嘧咬的掺入，或者基于3^4，&二甲基噻唑-2-基)^2，5-二苯基四唑溴(MTT)的代谢降解的比色测定(Mosman，/Jwm"m?/:M^h.65: 55~63， （1983))。另一种测定形i^^l经itii一步基因工程&造而表达报告基因的细胞。祸^R告基因与能响应受糾目关it径的启动子元件相连接，所述测定检测报告基因的转录的激活。这，一方面的M的启动子元件为血清应答元件即SRE。参见例如Shaw C flA， Ce// 56:563-572，(1989)。 一^N^选的这类^^4"基因为萦光素酶基因(de Wet" a/.， MM O汰7:725， （1987))。 ^^I本领域已知的方法(例如Baumgartner " a" «/• C/^肌2砂:29094画29101， （1994); Schenborn and Goiffin，^Pw附煤tf誦A^tes 47:11， 1993)通it^Ut^测萤光素酶基因的表达。萤光素酶活性测定试剂盒可从例如PromegaCorp., Madison, WI商购。这一类型的目标细胞系可以用来筛选化学物质库、P艮制M细I^养基、真菌培养肉汤、i^样本、^本等等。例如，可以用一系列限制M细J!fe^养基样^!，J定目标细胞以识别产生配体的细胞。然后用阳性细胞产生哺乳动物表达载体中的cDNAi^，将所ii^分为多个混M(pool),转染至宿主细胞中并进行表达。然后测定来自转染细胞的培养M本，再次分成多个混^#，再次转染，传代，并再次测定阳性细胞，以分离编码配体的克隆的cDNA。
61本发明提供的另一种筛选方法包括^^杂合的受体多肽。这种杂合多肽分
为两大类。在第一类中，IL-17RC的胞内结构域连接另一受体的配体结合结构域。第二类杂合受体多肽包括IL"17RC的胞夕卜(配体结合)结构域(SEQ IDNO:3)和IL-17RA(SEQ ID NO:21)以及另一受^(优选为iijk细胞因子受体)的胞内结构域和一个跨膜结构域。所絲二类的本发明受体的齡的单体、同二聚体、异二聚体和多聚体在已知能够对所述的另一受>^#导的信号进行应答的细胞中表达。总之，这两类杂合受体使得可以识别用于开发检测IL-17F或IL-17A的测定方法的应答细胞类型。jHW卜，这类细Jte可以用于4^在IL^17F或IL-17A的条件下，在竟争型测定中测定本发明的可溶性受⑩抗剂。在这类测定中，存在本发明的可溶性受体时，增殖或IH7F或IH7A的信号转导活性的降^^明本发明的可溶性受^"有拮抗活性。此外，IH7RC-可溶性受体结合测定是一种基于细胞的测定方法，它还可^于评估一种可溶性受体是否能够结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和II^17F或IL"17A的活性。
本发明提供了一种表达载体，所ii^达栽体含有有^i^接的下列元件：a)转录启动子；b)编码多肽的DNA区段，其中所述被编码的多肽含有与SEQ D)NO:158的33-458^^i^具有至少95。/o序列同一性的M酸序列，其中所述多肽能够结合IL-17A和/或IL-17F;以及c)转^Jf止子。所^DNA区g可编码分^Ht号序列。所^DNA区段还可编码免疫球蛋白部分，例如免疫^^蛋白重链恒定区，例如SEQ ID NO:158的459-690tJJ^基。任选地，所&ii^体可被导入培养的细胞，例如^杆菌或中国仓鼠卵巢细胞，其中所述细M达由所述DNA区^:编码的多肽。本发明的另 一个实施方案为一种生产多肽的方法，包括：培养已被导A^利要求13的表达载体的细胞，其中所述细#达由所述DNA区段编码的多肽；以及回il^斤ii^达的多肽。
本发明还提供了一种组合物，所述组^包括含有与SEQ ID NO:158的33-458氨基酸^具有至少95%序列同一性的ll^酸序列的分离的多肽以及可药用的栽体。所述多JM可含有免疫球蛋白部分（例如免疫球蛋白重链恒定区，例如来自IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4或它们的变体或突变体的Fc区域，SEQED NO:175的l-232^^i^，以;SJSEQ ID NO:158的459490絲^l&)。
本发明还提供了一种治疗患有由于IL"17A和/或IL-17F活性所引起、维持或恶化的疾病的受錄的方法，所i^r法包條予所述受絲含有与SEQ IDNO:158的33-458^J^酸^具有至少95"/o序列同一性的Jl^酸序列的分离的多肽，其中所述多肽能够结合、阻断、减少、拮抗或中和IL-17A和/或II^17F，并JI^斤述疾病选自：银屑病、特应性皮炎和接触性皮炎、IBD、 IBS、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿关节炎、菜姆病关节炎、银屑病关节炎、成人呼吸系统疾病（ARD)、脓毒性休克、多器官功能衰竭、炎'1^N员伤例如哞喘、慢性阻塞',疾病（COPD)、气道高^性、慢性支气管炎、过敏性哮喘、细菌性肺炎、银屑病、湿^炎'1^病例如溃疡性结肠炎和克罗恩病、幽门螺杆菌感染、由Jtt炎症（即感染、损伤等）导致的腹腔内粘连和/或脓肿、系统性红斑狼瘙（SLE)、狼瘙性肾炎、I型糖尿病、冠心病、中风、多发性硬化、系统'f4^更化症、^病、肾病综合征、JiBbfe症、器官移植排斥AJI、移植物抗宿主疾病（GVHD)、（例如肾、肺、心脏的）移植排斥反应、M菌细胞壁(SCW)诱导的关节炎、骨关节炎、牙龈勿牙周炎、单纯疱渗性角赂质炎、骨质疏松、神经炎、癌症包括前列腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、癌#管形成（如卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌）、B细胞林巴瘤、T细胞林巴瘤、嚢性纤维化、再狭窄和川崎病。
F)IL-17RC, IL画17RA和IL-17RC/D^17RA融^~白和^^^的制备IL^17RC、 IL-17RA和IL-17RC/IL"17RA类似物的一个大类是具有本文公开的氨基酸序列的突变氨基酸序列的变体。IL-17RC、 IL-17RA和IL-17RC/IL-17RA类似物的另 一个大类由如下所述的抗独特型抗体及其片段提供。此外，含有皿特型可变结构域的重组抗体也可^U^作类似物(参见例如，Monfardini "A， v4srac:爿肌户/^s/d""s (1996))。由于^life特
型IL-17RC抗体的可变结构域类似于IL-17RC,因此这些结构域可提供IL-17RC结合活性。生产皿4W催化抗体的方法^1本领域^M^员已知的(参见例如，Joron "，W Xci 672:216 (1992)、 Friboulet" "， ^p/?A
5/odi肌5te^"o/1 47:229 (1994)和Avalle "《爿肌TV FJowi 緣118(1998))。
识别IL"17RC、 IL-17RA和IL-17RC/IL^7RA类似物的另一种方法使用了
组合文库。构建和筛选喧菌体展示文库和其^i且合文库的方法在下列文献中有
述：例如，Kay C dl， i%flge 鄉 <尸e/rtiVfes做rf iVo,e/附(Academic Press1996); Verdine的美国专利No.5，783^384、 Kay等人的美国专利No. 5，747^334和Kauffman等人的美国专利No. 5，723»323.IL-17RC、 IL"17RA和IL-17RC/IL"17RA多肽可用于体内和体外用途。例如，可将可溶形式的IH7RC加入到细JI^养基中，以抑制由培养细胞产生的IL-17RC配^K即IL-17F和/或IL-17A)的作用。
可以^^IL-17RC、 IL-17RA和IH7RC/IL-17RA的融^^白絲姊分离相应的多肽。如下所述，特定的IL"17RC、 n^l7RA和II^17RC/IL"17RA融M白还具有诊断用途和治疗用途。 一种类型的融M白包括能导向由重组宿主细胞产生的IH7RC多肽的肽。为指导IL-17RC多肽J^X真核宿主细胞的分
泌途径，在il-17RC表达载体中提供了分;:;Hr号序列OiM^称为信号肽、前导
序列、前原序列或前序列)。虽然分泌信号序列可来源于DL"17RC，合适的信号序列也可以来源于另 一种分泌蛋白或完全从头合成。将分泌信号序列与IL-17RC编码序列有^i^接，以使得这两个序列处于正确的读码框中，并且它们的位置使得可以指导新合成的多肽i4A^宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的核苷酸序列的5，端，但是某些分^ft号序列也可以位于目的核苷酸序列的，位置(参见例如，XVelch等人的美国专利No. 5,037,743;Ho!land等人的美国专利No. 5,143,830)。
虽然由哺乳动物细胞产生的IL"17RC、 IL"17RA和IH7RC/IL"17RA的分泌信号序列(例如美国专利No. 5，641，655所述的组织型纤illS^原激活物信号序列)可用于相应多肽在重组哺乳动物宿主中的表达，但是对于酵母细胞中的表达而言还^_优选^^1酵母的信号序列。^^适的酵母信号序列的实例为来源于酵母交配外^L素ot-因子（由MFo/基因编码)、转化斷由SC/C2基因编码)或酸性磷酸酶（由户好05基因编码)的那些酵母信号序列。参见例如，Romanos""Expression of Cloned Genes in Yeast"见于Z)A^4 O!o"/"g 2:爿/Vm?/fctf/々/w做c/r，第2i^ Glover and Hames (编著)，第123-167页(Oxford UniversityPress 1995)。
可以通it^Ji^码^卜结构域(例如含有整个SEQ ID NO:3或其""^分或非人类受体的相应区域的多肽)的截短型DNA，来制备本发明的可溶性受体多肽。优舰，所制备的^卜结构域多肽形^J^上不含有跨膜多肽区W^胞内多肽区段。为了指导受体结构域从宿主细胞的输出，将受体DNA与编码分泌肽例如t-PA分泌肽的另一DNA区勸目连接。为了便于纯化分泌的受体结构域，可以在受体多JliUi融—段C端延伸序列，例如多组氨酸标4、 P物质、Flag™肽(Hopp " "， fi/otecA"ofo狄6:1204-1210， （1988);可购自Eastman Kodak Co"New Haven， CT)或絲具有可获得的^Mi特异性结^^的多赋蛋白。在另一种方法中，H17RC、 IH7RA或IL-17RC/IL-17RA的受体I^卜结 构域或其部分可以与免疫球蛋白重链恒定区-"^融合表达，所述免疫^l蛋白重 链恒定区通常为Fc片段，它含有两个恒定区结构域和一^N^链区域，但是不含 有可变区(参见，Sledziewski， AZ等人的美国专利No. 6，018，026和5，750^75)。本 发明的可溶性多肽包^il类融合蛋白。SEQroNO:64显示了一种这类融M 白。这类融^"白通常以多聚体分子的形式分泌，其中所^Fc的各部分feb之 间以^it键连接，并且两个受体多JI;ME排布Ji^此十分接近。il种类型的融合 蛋白可用于>^^液中亲和纯化同源配体，可用作体外测定工具在体外通过特异 性滴定配体而阻断、抑制或减少信号，并且可作为体内拮抗剂(通过肠胃外给 药以结合循环系统中的配体并将配^w循环系统中清除)。为了纯化配体，可
在有利于受^"配体结合的务降下(通常接i^t理条降的温度、pH和离子强;^)，
向含有配体的样本(例如限定条件的细胞培养基或组织提取物）中加入 IL"17RC、 IL-17RA和IL-17RC/IL-17RA-Ig嵌棘'然后通过^J?I蛋白A的混 ^分离嵌合配体复#,蛋白A被固定于固相载体（例如不可溶1±#脂«) 上。然后使用常规化学技^(例如盐梯度或pH梯度)、3y^配体。或者，可#^合 体本身结合在固相载体上，然后如上所iiiik^行结绅、舰。可在体内^^1嵌 M来调节炎性应答包括急性期应答，例如血清淀粉^白A(SAA)、 CSJI性 蛋白(CRP)等等。通it^胃外途径(例如通it^L内、皮下或静脉内注射)给予具 有高结合亲和力的嵌合沐。循环系统中的^结合酉沐，并^ML通itJL常生理过 ^w循环系统中清除。为了在测定中使用，可通itFc区域^^^与载^4目结 合，并用于ELISA方法中。
为辅助分离^^发明的多肽，优i^采用使用了配体结合受体(或抗体、互 4H^/抗互4h^对中的一个)或其结合片段和市售的生物传感器装置(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway，NJ)的测定系统。4^P这类受体、^#^、互#琳
/抗互4H^对中的一个或其片段固定于受体芯片的表面。这种装置的^^公开
于Karlsson， /• /加附m"0A 745:229-40， 1991和Cuimingham and Wells， /•
历W 2^:554-63， 1993。使用胺或^L^化学方法，将受体、抗体、互4f^/ 抗互4附中的一个或其片段^H^接至葡絲纤维上，所述葡緣纤^^ 至流通池中的金膜上。使测,本流过该池。如^^样本中存在配体、表^ 互#[^/抗互#^对中的另一个，它们就会分别与固定化的受体、抗体或互补 体/抗互41^对中的一个相结合，导致介质的折射率iLi改变，这可通过金膜的 表面等离子共^(plasmon resonance)的变化而进^^"测。这一系统可以测定结
65^E4率和解离速率，由此可以计算亲和力并评估结合的化学计量学。或者，可 以4^1 SELDI(TM)^支^(aphergen， Inc., Palo Alto， CA)分析配^/受体的结合。
配体结^t体多Jte可以用于4^域已知的头他测定系统。这些系统包括 用于测定结合亲和力的Scatehard分析(参见Scatehard， ^"". AT5"d 52: 660-72， 1949)和测热法测定(Cunningham et al.， 5We"ce 255:545-48， 1991; Cunningham et al" 5We""紙821-25， 1991)。
本发明还提供了多种其他的多肽融M和^^有一个或多个多肽融合昧的 相关多聚体蛋白。例如，可以如美国专利No. 5，155，027和5，567，584所公开的那 样，以与二聚化蛋白相融合的形式制备可溶性H7RC、 IL"17RA或 IL-17RC/IL-17RA受体多肽。在这方面优选的二聚化蛋白包括免疫球蛋白恒定 区结构域，例如IgGyl和人类K轻链。可以在经过基因工程^的细胞中表ii^ 发明的免疫球蛋白可溶性融合体，以产生多种多聚体IL-17RC、 IU7RA或 IL-17RC/IL"17RA受体类似物。可将本发明的可溶性多肽与辅助结构域相融 合，以使它们靶向于特定的细胞、组织或大分子(例如胶原或表达IH7F或 IL-17A的细胞)。本发明的多肽可以与两个或多^分相融合，所述部分例如 用于纯化的亲和标洛，以及乾向结构域。多肽融^ii可以包括一个或多^H^ 割位点，特别是在结构域之间的切割位点。参见，TuanetaL，OwmeWver/幼we 及e鄉w/r W:l画9， 1996.
在细菌细胞中，经常需要以融^白的形^^达异源蛋白以减弱所表达蛋 白的辜性、增加其稳、定'l^p增加其回^t率。例如，可以以包4^^胱甘Jlfc^转移 酶多肽的融^^白的形式表达EH7RC(或^^T本发明的多肽)。谷胱甘船-转 移酶融合蛋白通常为可溶性的，并且可以使用固化谷胱甘Jli^^易地将其从大 肠杆菌^物中纯化。在类似的方法中，可以^^直^>定^^^"脂柱分离>^有麦 芽糖结^"白多肽的IL-17RC融^"白，可以佳月IgG"Sepharose纯化含有截短 型蛋白A基因的C末端的融M白，在细菌细胞中以融^"白的形^达异源 多肽的成熟才支^^例如Williams C a" "Expression of Foreign Proteins in co// Using PIasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies," 见于DA^4 2: j Pracifcfl/ 4p/wwic/r，第2氣Glover and Hames (编著)，
第15-58页（Oxford University Press 1995)中有所描述。此々卜，也可以使用市售 的表达系统。例如，PINPOINT Xa蛋白质纯化系统(Promega Corporation; Madison, WI)提供的方法使用了包括亲和素的树脂来分离包括在表i^it程中 ^Ci物素化的多肽的融M白。
66可以用于分离由原核细M真核细I^达的异源多肽的肽标逸包括：多组 氨酸标對它对镍螯合树脂具有亲和力)、c-z^c标洛、钙调蛋白结M白(可使 用钙调蛋白亲和色镨法分离)、P物质、RYIRS标^(它可与抗RYIRSM结合)、 Glu-Glu标l和FLAG标善(它可与抗FLAG抗体结合)。参见例如，Luo ""，
历oc/re饥329:215 (1996); Morganti "A，历她c/t朋A 历0C&肌25:67 (1996)和Zheng " "， G^"e M6:55 (1997)。编码这类肽才絡的核 酸^f"可^^例如Sigma-AIdrich Corporation(St Louis， MO)商购。
另一种形式的融錯白包括本发明的多脉免疫球蛋白重链恒定区，所述 免疫球蛋白重链恒定区通常为Fc片段，它含有两个或三个恒定区结构域和一个 铰链区域，^a是不^"有可变区。例如，Chang等人的美国专利No. 5，723，12彌 述了一种包括人类干扰素和人类免疫球蛋白Fc片段的融^白。干扰素的C 端与Fc片段的N端通过一个ftki^接物部射目连接。^i^接物的一个实例为主要 含有T细胞隋.財列的肽，它K免疫活性的。 —种示例性的^i^接物具有下 述絲斷列：GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:9)。在这种融^^白 中， 一种示例性的Fc^5分为人类y4链，该^^溶液中稳定并JL^L有或几乎没有 ^傳激活活性。因此，本发明考虑到了包括IL-17RC部分或IL"17RC和IL"17RA 部分以及人类Fc片段的IL47RC或IL"17RC/IL47RA融合蛋白，其中所述 IL-17RC部分的C端与Fc片段的N端通过JI^接物相连接，例如包括SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:21的^J^酸序列的至少一部分的肽。 IH7RC和IL-17RA的部分均可为J^卜结构域或其任意片段。例如，融M白 可包括SEQ ID NO:3的氨基酸和一个Fc片段(例如人类Fc片段)(SEQ ID NO:64)。这类融^^白的另一实例为变体1454(SEQIDNO:157和158)，所述变 体包括与Fc5融合的人类IL47RA的外显子l七和人类IH7RCxl的外显子 8-16(SEQ ID NO:179和180)。变体1454还具有来自人类IL-17RA的天然信号肽。 也可以使用FclO或本领域已知的，等同物代替Fc5。
在另一个变化方案中，本发明的融^白包括一个IgG序列、 一个与所述 IgG序列的^J^末端共价连接的IL"17RC、 IL"17RA或IL-17RC/II^17RA部分 和与所述IH7RC或IL-17RA部分的^J^末端共价连接的信号肽，其中所述 IgG序列由下列元件以下&顷序组成：铰链区域、CH2结构域和CH3结构域。 因此，所述IgG序列不含有CH结构域。这些部分可以显示本文所述的生物活 性，例如能够结合IL-17A和/或IL"17F。生产包括抗体部分和非抗体部分的融 M白的通用技賴述于LaRochelle等人的EP 742830 (WO 95/21258)。包括IL-17RC或IL"17RC/IL-17RA部分和Fc部分的融合蛋白可被用作例 如体外测定工具。例如，可以佳月IL"17RC-免疫球蛋白融^"白来检测生物样 本中是否存在IL-F，其中使用IH7RC部^合配体，使用大W(例如使用蛋 白A或抗Fc抗体)将融M白结合到固相栽体上。可以佳J?I这类系统识别能够千 "itlL-17家族配体（例如IL-17F或IL-17A和IL-17F两者）与其受体的结合的拮 抗剂和、激动剂。
本发明还提供多种其他的多肽融合体。例如，可以将能产生目的生物学功 能(例如结合IL-17A)的整个结构域或其""^分和来自细胞因子受体家族的另一 成员（即IL-17RA)的等同功能性结构域与IL-17RC的"^分相融合，以产生不 同的W(即IL-17RC/IL"17RA)0可以在重组宿主细胞中表达多肽融合体，以 产生多种这样的融合类似物。IL-17RC、 IL-17RA或n^l7RC/IL"17RA多肽可 以与两个或多^NP分或结构樹目融合，例如与用于纯/f匕的亲和标逸和耙向结构 J^目融合。多肽融^^i可以包括一个或多物割位点，特别是在结构域之间 的切割位点。#^见例如，Tuan d ", Gwiwec6ve r/sw/e及ew"rc/r 34:1 (1996)。
可以利用本领域技^Mv员已知的方法，通过制备融M白的每个组成部分 并用化学方法将它们缀合在"^^制备融M白。或者，可以^^已知4支术产
生位于合适读码框内的编码融^S"白的^Ha^部分的多核苷酸，并用本iL^斤
述的方法表达该多核苷酸。对融合蛋白进^s^;割和化学切割的通用方法描述
于例如Ausubd (1995)第16-19至16-25页中。
还可通ii^"结构进行物理分析;^^征IL-17RC和/或IH7RA结合结构域， 所述的结构物理分析可用对配体激动剂的推定的接触位点氨基酸的突变并结 合例如下列的技术来测定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记。参见 例如，de Vos & "A， 5We"ce 255:306 (1992)， Smith d， /• Afo/L历"224:899 (1992)和Wlodaver Fi5S5X欲豫59 (1992)。
本发明还考虑到了经化学修饰的IL"17RC或IL"17RCH7RAi且合物，其 中所述多肽与聚合物相连接。示例性的IH7RC或IL"17RC/IL"17RA多肽为不 含有功能^^膜结构域的可溶性多肽，例如由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21 的^J^^Jia成的多肽。通常，所述聚合物为水溶性的，以使得所述缀# 不会在例如生理环境的水性环竟中沉淀。合适的聚合物的实例为经过修饰而具 有单个反应基团的聚合物，例如用于酰基化反应的活性酯或用于娱J^ftA应的 醛。这样就可以控制聚合的程度。活性醛的实例为聚乙二醇丙醛或其单 (C1-C10)烷氧基或芳氧基衍生物（参见例如，Harris等人的美国专利No.5J52，714)。聚*可为直链聚^^或支链聚絲。此外，也可以^^聚^# 的》'^^生产IL47RC或IL"17RG1L-17RA缀^/。
用于治疗的本发明缀合物可以包括可药用的水溶性聚^部分。合适的水 溶性聚^^包括聚乙二醇(PEG)、单甲拿JJ，EG、单(C1-C10)烷^L^PEG、芳 lU^PEG、敉N-乙烯基p比咯酮)PEG、三氟代乙絲Sti^tresyl)单甲liJ^PEG、 PEG丙醛、碳酸喊珀酰亚胺酯PEG、丙二醇同聚物、^!L化丙烯/氧化乙烯 共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或^f^ 于糖类的聚合物。合适的PEG的分子量为约600至约60，000，包括例如，5000、 12000、 20000和25000。 IL-17RC缀^^还可以包括这类水溶性聚^的^^ 物。
IL-17RC缀合物的一个实例包括IL"17RC部分(或IL"17RC/IL"17RA部分) 和连接到该IL-17RC部分的N端的聚)^lL化物部分。PEG是一种合适的， ;^l^化物。例如，H7RC(或IL"17RC/IL"17RA)可通过一个被称为"聚乙二醇 化"的过程而toEG修饰。可通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应来进行 IL"17RC的聚乙二^f匕(参见例如，EP 0154 316、 Delgado "0淑ai/及evfews /" 77rera/^"tfc Drag C"mVr 9:249 (1992)、 Duncan and Spreafico， O/汰
27:290 (1994)和Francis C"A， i/iZ//fe附"to/幼:l (1998))。例如， 可通过有反应性的聚乙二醇分子的酰基化反应或烷基化^JI来进行聚乙二醇 化。在另一种方法中，通it^合活化的PEG而形^JL-17RC缀合物，在活化的 PEG中，PEG的末端羟基或氨基基团被活化的连接物所取代(参见例如， Karasiewicz等人的美国专利No. 5^382,657)。
通过酰基化的聚乙二醇化通常需要^PEG的活化酯衍生物与IL-17RC或 IL-17RC/IL-17RA多M应。活化的PEG酯的实例为酯化为N-鞋J^讀酰亚胺 的PEG。本文所^f^J的术语"Sfc^化"包括在IL-17RC或IL"17RC/IH7RA和水 溶性聚絲之间的下述类型的键：驗、絲曱酸酯和絲甲酸乙酯等等。通 过酰基化制备聚乙二醇化的IU7RC或IL-17RC/IL-17RA的方法通常可包括 下述步骤：（a) ^JL-17RC或IL^17RC/EH7RA多肽与PEG(例如PEG的S^生 物的活化酯)反应，反应条件应使得一个或多个PEG基团连接到DL^17RC或 IL"17RC/IH7RA上，和(b)获得反应产物。通常，应,已知^^t和所需结果 确定用于酰基化反应的优化的反应条件。例如，PEG:EW7RC(或 PEG:IL-17RC/IL"17RA)的比值越大，则多聚乙二醇 >(匕的IL-17RC(或 IL-17RC/IL-17RA)产物的百分比越高。通过m^化产生的聚乙二^^产物通常为多聚乙二sff匕产物，其中的赖氨
^E-tJ^基团通itSfeJ^i^^基团而a乙二降化。连M的一个实例为^。 通常，所得的IL-17RC或IL"17RC/IL-17RA应为至少95"M)单聚乙二醇化、双聚 乙二醇^^三聚乙二醇化，但是皿MM可形成一些高JL^乙二醇化的产 物种类。可以使用标准纯化方法将聚乙二醇化的产物种类与未缀合的H7RC 或IL-17RC/IL"17RA多^bN分离，所述标准方法例如透析、超滤、离子交换色 语和亲和色谱等等。
通过^^化的聚乙二醇化通常包括^PEG的末端,生物^在还原剂 的条降下与IL-17RC或IL-17RC/n^l7RAA应。 PEG基团可通过-CH2-NH基团 连接到多肚。
通itiE原性烷基化产生单聚乙二醇化产物的衍生作用利用了可进行衍生 作用的不同类型的伯胺基团的反应活性的差异。通常，进行反应的pH值使得 可以利用赖氨酸^的s-^J^基团与蛋白质N端^的(x^J^之间的pKa值的 差异。通itit种选棒性衍生作用，可以控制含有活性基团例如搭基的水溶法聚 合物与蛋白质的连接。与聚合物的缀合主要J^t在蛋白质的N末端，而对， 活性基团(例如赖氨酸侧链#^)则没有显著的#^。本发明提供了IH7RC或 IL-17RC/ IL-17RA单聚^^缀^^的14^一的制剂。
用于产生基本均一的单聚合物IL-17RC或IL-17RC/II^17RA缀合物分子 群体的ii^性;^^化可包括下述步骤：（a)在ii^性^^化M和合适的pH值 条降下，佳IL-17RC或IL-17RC/IL-17RA多肽与活性聚乙二醇A^,所述合适 的pH值^Hf允许对IL-17RC或II^17RC/IL-17RA^J^末端的a-募J^基团进行 选棒性修饰，和(b)获得反应产物。用于ii^im^化的还原剂应在水溶液中稳 定，并且仅能ii^在iE^性^^化的初始过程中产生的Schiff喊。示例性的还 原剂包括硼氲化钠、氰基硼氲化钠、二曱胺硼烷、三甲胺硼絲p比咬硼烷。
对于基本均一的单聚合物IL"17RC或IL"17RC/IL"17RA偶联物的群体而 言，还原性烷基化反应条件应使得水溶性聚合物部分能够选择性连接到 IL-17RC或IL"17RC/IH7RA的N端。这样的^1##通常可提##对赖氨酸 ^^基团和N端的a-tJ^基团之间的pKa的差异。pH值还姊响所^^的聚合 物与蛋白质的比例。通常，如果pH较低，则需要聚合物远多于蛋白质的量， 因为此时N末端a基团的^JI活性较低、需要更多的聚^以获得最优化的反
应务降。如果pH值较高，则聚^7:IL-17RC(或聚^^:IL-17RC/IL"17RA)的 比例就不需要很大，因为此时可以获得反应活性较高的基团。通常，pH值应在3至9之间或在3至6之间。这一方法可以用于制备含有IH7RC或 IL-17RC/IL-17RA的同二聚体、异二聚M多聚体可溶性受体缀^咏。
需要考虑的另一因素为水溶性聚合物的分子量。通常，聚合物的^量越 高，能连接到蛋白质上的聚^b^"的数目M少。对于聚乙二a^f匕^^而言， 典型的分子量为约2kDa至约100kDa、约5 kDa至约50 kDa、或约12kDa至约 25 kDa。水溶性聚合物与IL-17RC或IL"17RC/IL-17RA的摩尔比通常应为1:1 至100:1。通常，对于多聚乙二醇化，水溶性聚合物与IH7RC或 IL-17RC/IL-17RA的摩尔比应为1:1至20:1;对于单聚乙二^f匕，水溶性聚^ 与IL-17RC或IL"17RC/IL-17RA的摩尔比应为和1:1至5:1。
用于生产包括多肽和水溶性聚合物部分的缀合物的通用方法是本领域中 已知的。参见例如，Karasiewicz等人的美国专利No. 5082,657; Greenwald等 人的美国专利No. 5，738， 846; Nieforth " ", C7/汰7%er. 59:636 (1996); Monkarsh"fl"J""/:5/0c/^肌3/7:434(1997))。 il一方法可用于制备 含有IL-17RC的同二聚、异二M多聚可溶性受体缀#。
本发明考虑了包括本文所述的肽或多肽，例如可溶性受体或抗体的组合 物。这类组^^还可包^^体。所述载体可为常规的有机载M无;bL载体。载 体的实例包括：水、緩冲液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、^M由和玉米油等等。
G) IL^17RC或IL47RC/IL^7RA多肽的分离
本发明的多肽可被纯化^目对于杂质大W(特别是M蛋白质和核酸傳 至少约80%的纯度、至少约90%的纯度、至少约95%的纯度、或大于95%,例 如96%、 97%、 98%或大于99%的纯度，并且不含有感染性物质和热原。本发 明的多肽还可被纯化至药用级纯度，即大于99.9%的纯度。在某些制品中，纯 化的多肽1^上不含有其他多肽，特别是不含有动物来源的其他多肽。
可以4M分级分离方法和/或常规纯4匕方法以iyf从天然来源(例:^人类纟且 织来源）纯化出的IH7RC或IL-17RC/IL~17RA制品、合成的IL-17RC或 IL-17RC/IL"r7RA多肽和从重组宿主细胞中纯化出的重组IL-17RC或 IL-17RC/IL-17RA多IMPIL"17RC或IL"17RC/IL-17RA多肽融合体。通常，可
以^^l^^铵沉淀法和酸或^^剂萃取法iMt样^Mi行分级分离。示例'li的纯 化步骤可包括羟基磷灰石、分子筛、FPLC和反相高效斜目色谱。合适的色谱 介质包括衍生化的葡，、琼脂糖、纤维素、聚丙烯,和特制皿等等。PEI、 DEAE、 QAE和Q^f生物也是合适的。示例性色谱介质包括苯基、丁M辛基基团衍生化的介质，例如苯基-S印harose FF(Pharmacia)、 Toyopearl丁差A50 (Toso Haas， Montgomeryville, PA)、辛基國Sepharose(Pharmacia)等等；或者聚 丙烯酸树脂例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等等。合适的固相载体包括玻 璃珠、基于^的树脂、基于纤维素的*^3旨、琼脂^tm、交联琼脂糖m、 M乙烯m、交联聚丙烯酰胺树脂等等在其^^l条降下不可溶的载体。可以 用^^性基团对这些载^ii^f參饰，所iiA^性基因使^^白质可以通过^^ 基团、^!^基团、^J^基团、鞋l^基团^V或,分与^^体il接。
偶联化学方法的实例包括溴化氰活化、N-羟^珀to胺活化、环氧化物 活化、^活化、SW活化和用于碳二亚J^f禺联化学法的^^iJ^衍生物。 上#务他固体介质都是^域公知并广泛使用的，均可^^t应商处商购。用 于多肽分离和纯化的M方法的选择是常规的设计问题，并且部分W^:于所 选##1体的性质。参见例如，4/??"妙C"Ara腳to;g7YJ5p/^: 在 (Pharmacia LKB Biotechnology 1988)和Doonan， iV她/" jPwn^iriwi (The Humana Press 1996)。
用于IL-17RC或IL"17RC/IL-17RA分离和纯化的其他变化方法可由本领 ^^支^Mv员i殳计得出。
还可以利用特定的'M分离本发明的多肽。例如，可以^^固定^f^r属离 子吸附色^(IMAC)来纯化富含组氨酸的蛋白质，包括那些带有组氨酸标签的 蛋白质。简而言之，首先使^负载二价金属离子以形成螯合物(Sulkowski^ rmwfe/"5/0c/^抓3:1(1985))。基于所使用的金属离子，富含组氨酸的蛋白质 将以不同的亲和力吸附在这一基质上，然后可用竟争性洗脱、降低pH或^J^ 强4^剂的方法将它们洗脱下来。M纯化方法包括使用凝集素亲和色镨和离 子交换色镨纯^^t基化蛋白(M. Deutecher，（编著)，五"gww?/: "2:529 (1990))。在本发明的另外的实施方案中，可以构建目的多肽和亲和标^(例如 麦芽糖结合蛋白，免疫球蛋白结构域)的融合本以便于纯化。此外，也可以利 用本发明的可溶性IL-17RC或IL-17RC/IL"17RA多肽(例如含有IL-17RC的可 溶性受体)的配体结合性质进行纯化，例如，可以使用亲和色谱方法，先将 IL-17F配体结合扭上，将含有IL-17RC的受体与柱结合，然后^^吏用标准色 语方法进行舰。
也可以通过如上所述的化学合成方法制备IL-17RC、 IL"17RA或 IL-17RC/IL"17RA多JlUL其片段。这些多肽可为单絲多聚体形式；糖基4t^非糖^^化形式；聚乙二醇化或非聚乙二醇化形式；并且可以含有或不含有起始
H) 针对IL-17RC或IL47RC/IL-17RA蛋白的M的制备 例如^JU IL"17RC或IL47RC/IH7RA^达载体的表达产物或从天然来源 分离的IL"17RC或IH7RC/IL"17RA作为抗原，可以获得针对IH7RC或 IL47RC/II^17RA的抗体。特别有用的抗IL"17RC或IH7RC/IL"17RA^l可以 与IH7RC或IL"17RC/IL^7RA"特异性结合，。当^M"有下述两种'M的至少 一种时认为抗体是特异性结合抗体：（l)抗体以阈值水平的结合活性结合 IL"17RC或IL"17RC/IH7RA，和(2)^/^与IL47RC或IH7RC/IL"17RA的相关 多Jii^L有明显的交iL^。
对于第一种'M而言，当M与IH7RC或IL47RC/EH7RA多肽、M 表位的结合亲和力(Ka)为106M^或更高、^^i^为107]V^或更高、更/ffei^为
108m4或更高、最mJ4为io9iv^或更高时，认为^/^是特异性结合胁。抗
体的结合亲和力可以由本领域技^A员容易地测定，例如可通itScatehard分 析测定(Scatehard，J"汰7VTJc"fli: 5^57:660 (1949))。对于第4性质而言，例 如，当抗体可通过标准蛋白质印迹分析检测到EL47RC或IH7RC/IH7RA， 但是检测不到已知多肽时，认为糾与相关多肽衬没有明显的交XAJL已 知相关多肽的实例包括已知的细胞因子受体。
可以使用携带抗原性H7RC或IL47RC/IL"17RA^位的JI^多*产生 抗IL"17RC或IL47RC/IL47RA私沐。本发明的携带抗原'l!i^位的^多肽含 有SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3、 SEQroNO:5或本文公开的另一M酸序列 中所含的至少9个或15至约30个M酸的序列。然而，含有本发明的M^ 列的更大部分的肽或多肽，含有本发明的多肽的30至50个M酸或最多至含有 本发明多肽的整个M酸序列的任何长度的肽或多肽，也可以用于诱导与 IH7RC或IL47RC/IH7RA结合的抗体。需要选择携带表位的肽的^J^齡 列以使得所述肽在水性溶剂中基本可溶(即所述序列包括相对多的亲水性残 基，而通常应狄含有疏水性残基)。此外，也可能需要含有脯氨酸残基的氨 基^列以用于产生M。
例如，可使用Jameson-Wotf的方法(Jameson and Wolf, C^5/OS 4:181, (1988))，利用LASERGENE^司(DNASTAR; Madison， WI)的PROTEAN^ (3.14版)，来识别IL"17RC中的潜在^^、性位点。在所述分析中^^J默认的^it。Jameson-Woif方法通it^^r个进行蛋白质结构预测的主要子程序，预测 潜在的抗原决^。简而言之，首先^^Hopp"Woods方法(Hopp " fl/L， AW/Jowi5^ C/5^ 7S:3824 (1981))来识别>^*4最高的局部亲水性的区域的氨 基,列(##1::平均七个^)。在第二步中，^J^Emini方法(Emini F?rafo^ 55:836 (1985))来计算表面概率(^lt:表面决定阈值(0.6) = 1)。第三步， 使用Karplus-Schultz方法(Karplus and Schultz， iVfl似nv/ssmsc/^e" 72:212 (1985))来预测主链的柔性(参数：柔性阈值(0.2) = 1)。在所述分析的第四步和第 五步中，对数据应用（1!11011"^8111311方法(外《//€/^" <外她/" 5^"c/"re 说e 7V/"");/es < iVo,e/" Co/?/iw附fltfo"， Fasman (编著)，第549-586页， Chou的 "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Add Composition" (Plenum Press 1990))和Garnier-Robson方法(Garnier a/L， /• 及V?/L 220:97 (1978))进行二级结构的预测(01011^38111311#^::构象表=6辦蛋白质；a区域阈 值=103; P区域阔值=105; Garnier-Robson参数：a和P决定常数=0)。在 第六个子程序中，结合了柔性;|^:和亲水#_/溶剂趋近性因子以确定表面轮廓 值，^^名为"抗原性指数"。：^，对抗原性指M用财展函数，所述函数 通过分别附加各自峰值的20%、 40%、 60%或80%对主要表面峰值进行扩展以 4M尝因表面区樹目对于内部区域的流动性所产生的附加自由能。然而，由于螺 旋区域可能柔',小，因此这种计算方法不适用于位于蝶旋区域中的^主要 峰。可以使用Hopp/Woods亲水性曲线来确定SEQ ID NO:3中潜在抗原性最强 的区J^(Hopp et al.， Ph?c: 7Va汰Jc原'l^^位作为优选的抗原'l!i^位，并JL^领域技"员可以确定该抗原'錄
位。所述^f'Ii^位包括：（1) SEQ ID NO:3的絲^l&73至絲^^82; (2) SEQ ID NO:3的^J^i^95至^J^^104; (3) SEQ ID NO:3的絲酸 絲111至絲^JJ19; (4) SEQ ID NO:3的絲^t&179至絲^i^ 186; (5) SEQ D) NO:3的^J^^200至^J^i^205; (6) SEQ ID NO:3 的絲^i&229至^J^J^36; (7) SEQ H) NO:3的^J^l^264至絲 ^J^268;和(8)SEQIDNO:3的^J^J^75至^J^i^281。本发明考 虑了抗原性肽X至Y的^""种用于产生抗IH7RC抗体的用途，或作为工具筛选或识别本发明的中和性单克隆胁的用途。本发明狄虑了包括^f性^X
至Y的至少一种的多肽。本发明考虑了本文所述的任何抗原性^il表位用于产
生针对IL-17RC的抗体的用途，以及用于识别和筛选中和性的抗IH7RC单克 隆抗体的用途，所述抗IU7RC单克隆^^可以结合、阻断、抑制、减少、拮 M中和IL-17r和/或IL-17A的活性(单独:^结^^)0
此外，合适的抗原还包括如下所述的IL-17RC或IL"17RC/IL-17RA多肽， 所述IL-17RC或IL-17RC/IL-17RA多肽包括上文z〉开的IL-17RC或 IL-17RC/IL-17RA的细胞因子结合结构域或胞外结构域以及另 一种细胞因子 的胞外结构域，例如I类或n类细胞因子受体结构域，例如可形成可溶性 IL-17RC或IL-17RC/IL-17RA异二聚体或多聚体多肽等等的结构域。
可以使用本领域技^A员公知的方法制备如下所述的多克隆抗体，所述多 克隆抗体针对重组IL"17RC或IH7RC/IL"17RA蛋白或者针对从天然来源分离 的IL47RC或IH7RC/IL"17RA。参见例如，//M/MM/10cAe附/cfl/ (Manson编著)，第l-5页，Green等人的"Production of Polyclonal Antisera" (Humana Press 1992)和DA^4 Cto"/"g 2: £^wess/o"柳紐微，第2& Glover " "A (编著),第15页，Williams等人的"Expression of foreign proteins in £1 co// using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" (Oxford University Press 1995)。可通过使用佐剂来增加IL~17RC或 IL47RC/IL"17RA多肽的免疫原性，所述佐剂例如alum(氢氧化铝)或弗氏完全 佐剂或弗氏不完全佐剂。可用于免疫的多肽也包括融合沐多肽，例如IH7RC 或IL"17RC/IL"17RA或其"^分与免疫球蛋白多Jl^与麦芽糖结^"白融， 成的融合体。多肽免疫原可为全长分子或其一部分。如果多肽部分为"半抗原 类型"，则优^M^该部分与大^载^K例如钥孔ili&L蓝素(KLH)、牛血清清 蛋白(BSA)或破伤风类毒素)^目连接或结合以用于免疫。
虽然多克隆抗体通常是在动物体内产生，例如在马、牛、狗、鸡、大鼠、 小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊体内产生，但是本发明的抗IH7RC或 IH7RC/IL47RA:^^也可以来源于类人灵长类抗体。在狒##^内产生可用于 诊断和治疗的抗体的通用技术可参见例如，Goldenberg等人的国际专利申请公 ^AVO 91/11465和Losman &"， /"t /• Gi"cer斩:310 (1990)。
或者，可以产生抗IH7RC或IL"17RC/IL"17RA的单克隆M。针对特定 抗原的啮齿类单克隆抗体可通过本领域技术人员已知的方法获得(参见例如， Kohler 《油/"" 256:495 (1975); Co%an d (编著)，C"/r朋/ jRratocC7o"/"g 2: /^y欲ms，第2氣Glover "/!(编著)，第93页，
Picksley等人的"Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in五.rf， （Oxford University Press 1995))。
简而言之，单克隆抗体可通过下述步骤获得：用含有IH7RC或 IH7RC/IL"17RA基因表达产物的组^^注射小鼠，：?Uk清样本以确i人旨的 产生，取出脾脏以获得B^淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髄瘤细胞融合以产生杂 錢细胞，克隆杂錢细胞，筛选产生针对^f、的糾的阳性克隆，培养产生 针对^f、的抗体的克隆，以^杂錢细鹏#^中分离胁。
jtt^卜，本发明的抗IL47RC或IL-17RC/IH7RA^^也可以来源于人类单克 隆*。人类单克隆^^可由转基因小鼠获得，所述转基因小鼠经it^因工程改 造而能^4十对^^'1±^激进行应狄而产生特异性的人类胁。^il种技术中， 将人类重妙^4因^t件引入小鼠品系中，所述小鼠品系来源于在内源性重 #3^^因座中含有定向中断的胚胎干细胞系。转基因小鼠可以^^成特异性针 对人类抗原的人类M，所述小鼠可以用于产生分泌人类^#^的杂^|细胞。由 转基因小鼠获得人类拔沐的方法在例:ipGreen " dl， 7Va/«re G柳a 7:13 (1994)， Lonberg "《胸脏565:856 (1994)和Taylor "《紐/画"汰6:579 (1994)中有
所描述。
可以使用多种成熟技^^杂^i细i^养物中分离和纯/f傳克隆抗体。这
类分离技术包括^J^蛋白A Sepharose的亲和色镨、^"筛色语和离子交换色 谱（参见例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页以及第2.9.1-2.9.3页；Me幼o血/" Mofec"/"r及》fogy， 20，第79-104页，Baines等人的"Purification of Immunoglobulin G (IgG)" (The Humana P謂，Inc. 1992))。
对于特定用途可能需要制备抗IL47RC或IH7RC/IL"17RAM的片段。 这类絲片段可通过例如对糾的蛋白Slil^解而获得。可通过4捐常财法 对完整抗^^4行胃蛋白酶消^il木瓜蛋白酶消化，而获得M片段。例如，抗 体片段的产生可通过^J^胃蛋白酶对抗体进行S^l切割以提供被称为F(ab，)2 的5S片段而实现。还可以^J?l^Jjli^试剂对这一片段进一步切割，从而产生 3.5S的Fab，单价片段。^i^，在切割^中可以朋^^封闭基团，所絲 基是由于二硫键断裂而产生的。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割可直接产生两 个单价的Fab片段和一个Fc片段。上述方法在例如下述的文献中有所描述： Goldenberg的美国专利No. 4j331，647， Nisonoff " 爿fc/r丑Zoc/^肌^B/op yw.卵:230 (1960); Porter， 5/oc/re肌/• 73:119 (1959)、 Edelman C n/" Afe欲orfs /w 五"矽附ofogV 7，第422页（Academic Press 1967)和Coligan，第2.8.1-2.8.10页 和第2.10.-2.10.4页。
也可以佳月其他切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价的轻链-重链 片段、对片段进4tii一步切割，或者絲酶技术、化学技絲遗传技术，只要 所得的片段能够与可M整^^识别的抗原相结合即可。
例如，FV片段包括VH和VL链的联M。这种联合可能是非M的，例如 在Inbar " flA， iVa/'/爿cfld: 5ti 砂:2659 (1972)中有所描述。或者，可 变链可以以分子间二硫键的形式连接，或通过例如戊二醛的化学试剂相交联 (^^见例如，Sandhu，C说i^v.历0tecA. ":437 (1992))。
Fv片段可包^ifitJlfci^接物相连接的VH和V!^链。可通过构建包括由M 苷酸连接的编码VH和V^结构域的DNA^列的结构基因，从而制^^这种单^^抗 原结M白(scFv)。将所述结构基因插Wj表ii^体中，然后将所&达载体 引入宿主细胞例如;U^杆菌中。重组宿主细Jlfe^成由肽连接物桥连两个V结构 域的单链多肽。用于产生scFv的方法在例如Whitlow C "， Me幼fwfe:爿 G?附/;做/wi似/" £>i^wK?/flgy 2:97 (1991)中有所描ii(也可参见，Bird " "，5W柳ce2^:423 (1988); Lad股傳人的美国专利No. 4,946,778; Pack""/., 5/c/rec/i朋fogv ":1271 (1993)和Sandhu， iLJi文)。
例如，可通it^体外使淋巴细胞与IL47RC或IH7RC/IL"17RA多^M目接 触并在噬菌M类似载体中筛选抗体展示i^ij^l得scFV(例如通过使用固定 化或被才封己的IL"17RC或IL"17RCH7RA蛋白质或肽)。可通过筛i^示于例 如^杆菌的细菌錄示于嗟菌^K喧菌体展示)上的随机li^隼，从而获得编 码具有潜在IL"17RC或IL"17RC/IL"17RA多JI^合结构域的多肽的基因。编码 多肽的核苷酸序列可通过多种方法iy茅，例如可通itl^机诱变和随机多核苷酸 合成ijt^得。可以佳月这些随机WL示iL^对能与已知乾标湘互作用的肽进行 筛选，所述已知^f示可为蛋白质或肽，例如配M受体、生物大W或合成大 分子或者有M质或无M质。创建和筛^il种随机Wl示i^隼的技术是本领 域已知的(Ladner等人的美国专利No. 5^223,409、 Ladner等人的美国专利No. 4，946，778、 Ladner等人的美国专利No. 5，403，484、 Lad股HF人的美国专利No. 5，571，698和Kay " fl/" /%， D/s/i鄉< jP一V/es朋抗体片段的另一种形式为编码单链互补决定区(CDR)的肽。CDIUk("最小 识别#")可通过构建编码目的^的CDR的基因而获得。可通过例dHM聚 合Sl^iU^从产生抗体的细胞的RNA来合成可变区，从而制名^这类基因(参 见，j如，Larrick C M"e幼^w/s: Ciw«/wi"/igwi0/ogy 2:106 (1991) ; 3/(9朋c/朋"/ y4"幼fwZ/es: iV或者，抗H7RC或IL"17RC/IL"17RA^^可来源于"人源化"的单克隆抗 体。人源化单克隆^^是通过将来自小統疫球蛋白重一^^可变区的小鼠 互补决定区转移J^类可变区结构域中而产生的。然后将人类抗体的典型g 替换至鼠类相应物的框架区中。使用来源于人源^#"克隆松体的^组^€^ 了可能与鼠类恒定区的免疫原'斜目关的潜在问题。用于克隆鼠类免疫球蛋白可 变结构域的通用技术在例如Orlandi " 外w 7Vfl/7爿awi Sd t/5^恥:3833 (1989)中有所描述。用于产生人源化单克隆抗体的技术在例如下列的文献中有 所描述：Jones " d, Ate,e幼:522 (1986); Carter C /Vo"油/7 ^cfld M
卵:4285 (1992); Sandhu, Cr叙itev.":437 (1992); Singer ef a/.， /. /附附肌750:2844 (1993); Sudbir (编著)，Pratoco/s (Humana Press, Inc. 1995); /V她/"五"g/"從W"g: 朋J /VYicdce，
Cldand d "/L (编著)，第399-434页，Kelley的"Engineering Therapeutic Antibodies"(John WUey & Sons, Inc. 1996)和Queen等人的美国专利No. 5,693,762(1997)。
此外，可以使用本领域已知的方法和本文所述的方法对本发明的抗 IL-17RC或IL-17RC/IH7RA^Ml胁片^it:行聚乙二^f匕。
可通过标准技术^^抗IL"17RC或IL"17RC/IL^7RA^iL抗体片M疫 动物，从而制备多克隆^*#^抗体。参见例如M^欲^wfe /« M0fec11/欲//fi附"朋c/f柳/c"/外她0?&， Manson (编著)，第1-12页, Green等人的 "Production of Polyclonal Antisera，，(Humana Press 1992)。还可参见Coligan， 第2.4.1-2.4.7页。或者，可通itJi述技术"f^I抗IL"17RC或D^17RC/IL-r7RA抗 M抗体片段作为免^f、来制备单克隆皿^M。再或者，可以4捐上述 技术制备人源化皿#^抗#^类人灵长类皿#^^。制备皿#^抗体 的方法在例如下述的文献中有所描述：Irie，美国专利No. 5J08，146、 Greene 等人的美国专利No. 5，637，677和Varthakavi and Minocha， /. Ge汰 77:1875(1996)。
可将抗IL-17RC或IH7RC/IH7RAi^与可^"测^ie^目缀合，以形成抗 IH7RC或IL-17RC/IL-17RA^疫缀^^。合适的可^^测才封己包括例如;^性 同位素、荧光才朽己、化学iuy^i己、酶才朽己、生物^Ut^ie^J^体金。制备和检 测这类带有可检测^i己的免疫缀絲的方法是4^页域技权员^^的，并且将在
可检测;^i己可为育feiiit^自显影;l^测的;^j"性同位素。对本发明目的特别 有用的同位素为"H、 1251、 1311、 35S和"C。
抗H7RC或IH7RCH7RA免疫缀合物还可以用荧光化合物进行标 记。通过将免疫缀^暴S^合适波长的光下，并检测产生的荧光，可以确定荧
ib^ie^的存在。荧ib^^e^包括异^^^t素、罗丹明、藻红蛋白、
!l^^白、别g蛋白、邻^=^^荧胺。
或者，可通过将抗体组分与化学发光化合物相偶联，而使抗IL"17RC或 IL-17RCH7RA^疫缀絲带有可;^测的才射己。通过^i^测化学M过程中产 生的光的存在来确定带有化学ilibf示签的免疫缀合物的存在。化学iubf封e^^ 物的实例包括鲁米i若、^^米诺、芳香族吖咬酯、咪哇、吖M和草酸酯。
类似地，可以使用生物JUfc^^iM示^^发明的抗IL-17RC或IL-17RC/ IL-17RAit疫缀合物。生物^Ufe^存在于生物系统中的一jyt学JDt^应，其中 催化性蛋白提高了化学^jt^的效率。通过检测JUfe^确^t物iUt蛋白的存
在。可用于才朽己的生物^^^包括萤光素、萤光素si^水母iut蛋白。
或者，可通过将抗IH7RC或n^l7RC/IL"17RA^^组分与酶连接，而使 抗IL"17RC或IL-17RC/IL-17RAit疫缀合物带有可检测的^i己。当抗IL-17RC 或IH7RC/IL"17RA酶缀^b与合适的底物一^育时，Sl^分与底物^i产 生可检测的化学物质，所述检测可通过例如分ifejtl法、^fe^或目测法进行。可用于使多特异性免疫缀^^带有可检测才射i的酶的实例包拾P"半專Ut普酶、葡萄糖氧4fc^、 it!U匕物Sl^^l性^^。
M域技7p^员应当知晓能够^ll本发明^^的^^适的才射己。可以4賴本领域已知的标准技术将才封己物部^^合到抗IL"17RC或IL-17RC/IL-17RA抗体上。用于这方面的一^T法在下列文献中有所描述：Kennedy C7/汰C似肌7ftl (1976); Schurs d "A， CZ/汰C嵐勿"S2:l (1977)， Shih &《/拟7 /•Cer俯IIOI (1990); Stein "《Gi"cci"紐5汰.1330 (1990)和Col^an， Jg^:X。
此外，可使用与亲和素、链亲和素和生物素缀合的抗IH7RC或IL-17RC/IL"17RA抗体来增加免疫化学检测的便利性和通用性(参见例如，WUchek C (编著)，"Avidin-Biotin Technology," Mgi/Kwfe /" £>igwM?/ogy， ^b/1
(Academic Press 1990)和M^/w必/" M?fec油尸胸/ogv， W /。， Manson (编著)，第149-162页，Bayer^"人的"Immunochemical Applications of Avidin-BiotinTechnology" (The H咖ana Press， Inc. 1992)。
用于进4亍免疫测定的方法^l/iH^的。参见例如，A/wwcfowa/^i^cwZ/ey.-iVWift^", 五"一m^"g，做^^发明i^虑到了用于对IL"17RC或IL^7RC/IL^7RA^因^Jiii行免疫诊断测定的试剂盒。这类试剂盒包括至少 一个含抗IL-r7RC或IL-17RC/IL-17RA抗体或抗体片段的容器。试剂盒还可包括装有能指示IL-17RC或IL-17RC/IH7RA^i^私沐片段的存在的一种或多种试剂的另一容器。这类指示试剂的实例包括可检测才封己，例如,性标记、荧光才朽己、化学JUb^i己、酶才封己、生物JU^朽e^胶体M等。试剂盒还可包括指"H^
IH7RC/IL-17RA蛋白的方法。例如，文字i兑明书可能^i兌明包装内的抗体或M片段可用于^r测IL-17RC或IH7RC/IL"17RA。文字^h可直接印在容器上，或者可以以包装糾的形iC^供。I)本发明的IL"17RC或IL^7RC/II^17RA多肽的治疗用途
具有可溶性H7RC或IL"17RC/IL"17RA活性的^tJ^酸序列可通过结合配体IL-17A和IL-17F(单独地或共同地），并因此阻止所述配体与内源性IL-17RC和/或EL-17RA受体的结合，从而可用于调节免疫系统。这类拮抗剂例如可溶性IL"17RC或IL"17RC/IL"17RA还可以通过抑制IL-17A和/或IH7F与内源性EL-17RC和/或IH7RA受体的结合，从而可用于调节免疫系统。因此，本发明包括具有IL-17RC或IL-17RC/IL"17RA活性的蛋白质、多Jlfc^JI^例如可溶性IL-17RC或IL-17RC/IL"17RA多肽、IL"17RC或IL"17RA多肽片段、IL"17RC或IL-17RC/IL"17RA类似物以;SJL-17RC或IL-17RC/IL-17RA融^^白)用于受试者的用途，所述受试者缺少足够量的所述多肽或产生了过量的IL-17A和/或IL-17F 。本发明的多肽（例如可溶性IH7RC和/或IL-17RC/IL-17RA)还可用于治疗产生过量IL"17A、 IL17F、 IL"17RA或IL-17RC的受试者。合适的受^"包括哺乳动物，例如人类。例如，这类可溶性多狀可用于结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17A和IL"17F(单独地或共同地)，可用于治疗炎症和炎性疾病，例如银屑病、4艮屑病关节炎、类风湿性关节炎、内毒素血症、IBD、 IBS、结肠炎、哞喘、同种^^植物排斥、免疫介导的肾脏疾病、肝胆管疾病、多发'ti^化、动脉粥样硬化、肺瘤生"^a速或退行性关节病，以^L^文公开的务他炎性病症。
在絲的实施方案中，所述可溶性受体包括IL-17RC(SEQ ID NO:3)并可为#、同二聚体、异二聚体或多聚体的形式，它们能够在体内结合、阻断、抑制、减少、拮M中和IL-17F和D^17A(单独赋共同地)。如本文所述，针对这类IH7RC牟本、同二聚体、异二聚体或多聚体的抗体和结合多肽也可以用作IL-17RC活性的拮抗剂和IH7A和IH7F的拮抗剂(单独M共同地)。
在M优选的实施方案中，所述可溶性受体同时包括IL-17RC和IL-17RA的一部分。 一种这样的M实施方案为一种IU7变体1454(SEQ ID NO:157和158)，它包括与Fc5(SEQ ID NO:179和180)融合的人类Ibl7RA的外显子l"6和人类IL-17RCxl的外显子8-16。变体1454还具有来源于人类IH7RA的天然信号肽。也可以使用FclO或本领域已知的任何等同物代替Fc5。
此外，本文中还描述了多克ll^单克隆的抗IL"17F中和抗体能够在基于细胞的中和测定中结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F和IL-17A的活性。针对对应于IH7RC cDNA的mRNA的组织分布分析显示，/LJ7及C基因的mRNA在曱M、肾上腺、前列^^肝Jlil且织中有很强的表达，而在心脏、小肠、胃和气管组织中表ii3^弱。特别地，IH7RC在非T细J!^卜周血细胞系包括单核细胞、B-细胞和髓系细胞中稳定Mk4^达。而且，IL-17RC的mRNA在来源于^J统的细胞系中有确信的表达。^4达IL-17RC的细胞系为阵列上存在的所有5个;U^细胞系。相M，在脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾脏、•、脾脏、胸腺、睾丸、卵巢、结肠、外周血白细胞、脊柱、淋巴结和骨髓中没有表狄几乎没有表达。IL-17RC所结合的配^(IL-17F和/或IL-17A)参与诱导炎性应答并促进炎性疾病，这是凭借它们能够增加炎性介质包括IL"ip、 IL-6和TNF-a的产生，以及能够增加与嗜中.,细胞的增殖、成熟和趋^f^目关的介质的产生的能力实现的(综述于Witowski et al. CelL Mol. Life ScL 61:56"7-579(2004))。
因此，本发明的 一个具体实施方案涉及可溶性IH7RC多肽和可溶性
的用途，所述疾病例如银屑:、银屑病关节炎、^应性皮炎、炎性M:、类风湿性关节炎、IBD、 IBS、克罗恩病、憩室病、哮喘、旨炎、I型糖尿病(IDDM)、 J3jM^癌、Jl^炎、格雷夫断病（Graves disease)、结肠癌和肠癌、自身免疫性疾病、脓毒症、器官或骨髓移植；由于内毒素血症、创伤、手^感染引起的炎症；淀粉样变；脾大；移植物抗宿主疾病；和炎症的抑制，免疫抑制，itit细胞、免疫细胞、炎性细胞或淋巴样细胞、巨噬细胞、T细鄉包括TM和Th2细胞)的增殖的抑制，对病原M抗原的免疫应答的抑制，或其他需^P制IL-17F和/或IL-17A的疾病。
此外，可溶性IL-17RC和可溶性IL-17RC/IL"17RA多肽可用于：
(1) 阻断、抑制、减少、拮抗或中和通itlL-17RA或IL"17RC进行的信号传导，以用于治疗急性炎症，即由创伤、组织损伤、手术、脒>^#或感染导致的炎症，以及慢性炎性疾病例如津喘、炎'歸病(IBD)、 IBS、慢性结肠炎、脾大、类风湿性关节炎、复发性急性炎症发作(例如结核病)，以;sj^于治疗淀粉样变和动脉粥样硬化、卡斯特尔曼氏病(Castleman，sdisease)、哮喘，以及，与急性期应答的诱导相关的疾病。
(2) 阻断、抑制、减少、拮抗或中和H7RA或IL"17RC的信号传导，以阻断或抑制免疫细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、白细胞)中的信号传导，用于治疗自身免疫性疾病，例如IDDM、多发'ti^化(MS)、系统性红斑狼^(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎、IBS和IBD。 4M本发明的多肽阻断、抑制、减少或拮皿itlL"17RC和/或IL"17RA进行的信号传导，还可有益于J^JI象、肾 脏、脑垂体和神经细胞的疾病。可有益于IDDM、 NIDDM、 Ml^炎和^y^癌。 IL-17RC和/或IL"17RA可以作为癌症的治疗乾标，其中本发明的拮抗剂可抑制 癌细胞生长并实现免疫介导的杀伤(Holliger P， and Hoogenboom， H: Nature Biotech. 16: 1015-1016， 1998)。本发明的可溶性多Jte可用于治疗肾病，例如 肾小球硬化症、膜性肾病、淀粉样变(该疾病也会影响除肾脏^卜的其^J且织)、 肾动乐^^^匕症、^^种起源的肾小球肾炎、肾脏的纤维增生性疾病以及与SLE、 IDDM、 n型糖尿病(NIDDM)、肾l^t瘤和^fe疾病相关的肾功能障碍。
(3)激动、增强、增加或启动通过IL-17RA或IL"17RC进行的信号传导， 用于治疗自身免疫性疾病，例如D)DM、 MS、 SLE、重症肌无力、类风湿性 关节炎、IBS和IBD。本发明的可溶性多肽可向淋巴细J!&iL其他免疫细胞传导 信号，以使得它们分化、改变它们的增^改变细胞因子或细胞表面蛋白的产 生，从而改善自身免疫。特别地，将T辅助细胞应答调制为另一种细胞因子分 泌模式可能改变自身免疫性应答，从而錄疾病(Sm他JA et al.，丄/附附""" /仰:4841-4849， 1998)。类似地，可以使用激动性可溶性多肽4fff号传导至免疫 细胞、消耗免疫细胞和改变免疫细胞，所述免疫细胞与哮喘、过^t性疾病和特 应性疾病有关。通itlL-17RC和/或IL"17RA进行的信号传导可有益于膝泉、肾 脏、脑垂体和神经细胞的疾病。可有益于IDDM、 NIDDM、 ^^炎和^^癌。
本文所述的可溶性IL-17RC或IH7RC/IL-17RA多肽可用于结合、阻断、 抑制、减少、拮抗或中和IH7F或IL-17A的活性(单独ijk^共同地)，可用于治 疗如上所述的自身免疫性疾病、特应性疾病、NIDDM、旨炎和肾脏功能障 碍。可溶形式的IL-17RC或IL-17RC/IL-17RA也可用于拓Et由Th细胞介导的抗 体应答和/或皿淋巴细MM免疫细胞产生IL-4或^fe细胞因子。
本发明的可溶性多肽可用作IH7A和/或IL-17F的拮抗剂。这种拮抗效果 可通过直接中和或通过与IL-17A或IH7F的结合实现。除了拮抗用途"卜，本 发明的可溶性受体可以结合IL-17F或n^l7A,將为配体的运栽蛋白将配# 运至体内不同的组织、器官和细胞中。这样，本发明的可溶性受体可以与能指 导可溶性受^-配体复合物到达特异性位置(例如组织、特异性免疫细絲肿瘤) 的分子、多M化学部W目融合或相偶联。例如，可以通itlH7F的作用诱导 炎症和局部急性期应答蛋白，从而有益于急性感染或某些癌症。因此，本发明 的可溶性受体可用于特异性指导IL-17A或IL^7F的作用。参见，Cosman， D.Q;toA/"e 5: 95-106， 1993; and Fernandez画Botran， R« ^P^汰/"ve就Drwgs 9:497-513， 2000。
炎症^^Ai物体防^Kt/V物质的一种保护性应答。炎症M是一种涉及 多种细胞介质和体液介质的«事件。 一方面，炎性应答的抑制可使宿主成为
免疫妥协宿主；然而如果不进^^r查，炎症可导致一些严重的并发症，包拾匱 性炎性疾病(例如银屑病、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病 等等)、感染性休克和多器官功能衰竭。重要的是，这些不同的疾病状态都涉 及相同的炎性介质。这些具有炎症特征的疾病对于人类的发病率和致死率有很 大的影响。因jH^艮显然的是，抗炎性蛋白质例如本发明的可溶li多财于多种 人类和动物疾病有着重要的治疗前景，所述疾病包括从哮喘和变态反应到自身 免疫和感染性休克。
1.关节炎
关节炎一包括骨关节炎、类风湿性关节炎和由损伤引起的关节炎等等 ——A很常见的炎性疾病，并且可以用抗炎性蛋白质例如本发明的可溶性多肽 进fr治疗。例如，类风湿性关节炎(RA)是一种影响整个身体的全身性疾病，它 是最常见的一类关节炎。该疾病以关节滑膜的炎症为特征，会导致疼痛、僵硬、 温热、发红和肺胀。炎症细g故能够消化骨和软骨的酶类。作为类风湿性关 节炎的后果，发炎的关节膜(滑膜)^t蚀并损坏骨和软骨，导致关节的退化、 剧痛和，生3S^。所涉及的关节将变形和弯曲，导致^iR动能力丧失。
类风湿性关节炎(RA)是一种免疫介导疾病，其特征尤其在于炎症和随后的 组织损伤，导致严重的失能和致死率上升。在风湿性关节的局部会产生多种细 胞因子。许多研究证实IL-l和TNF-a这两种原型促炎细胞因子在滑液炎症和进 行性关节损坏的机理中起了重要作用。事实上，对患有RA的患者给予TNF"a 和IL-1的抑制剂可使得炎症的临床指标和生理指标游到^^改善，并减少骨4曼 蚀和软骨损坏的絲性指标。然而，虽然具有上述有益絲，但是有相当百分 比的患者对于这些药物没有反应，&明在关节炎的病理生理学中还涉及M 的介质(Gabay，E;^抓C^/汰说dl 7%er. 2(2):135-149， 2002)。其中一种介质可能 为EL-17A或IH7F,这样看来，能结合EH7F或IL-17A或抑制IH7r或IL"17A 活性的一类分子，例如可溶jilH7RC或IL-17RC/IL-17RA，就可能作为有价 值的疗法以减轻类风湿性关节炎和其他关节炎疾病中的炎症。本领域中已知有一些类风湿性关节炎的动物模型。例如，在^f、诱导的关
节炎(CIA)模型中，小鼠会发生与人类类风湿性关节炎十分类似的慢性炎性关 节炎。由于CIA的免疫学特征和病理学特征都与RA相似，因此可将这一模型 作为筛选潜在的抗人类炎症的化合物的理想模型。CIA模型是一种/^p的小鼠 模型，它,于^J^生的免C^答和炎性应答。免疫应答包括6>细#004+ T-细胞的相互作用，所i^目互作用响应于作为抗原给予的胶原，并导致产生抗 ^f、抗体。某些上述抗体与小鼠的天然胶原发生交X^并激活4H^^^作 用，导致产生炎症的介质，对于该介质的组织应答就导致了炎症期。^J^CIA 模型的一个优势在于已经知道了其发病机制的^^IL理。已经识别了 n型^^、
上的相关T-细l&^B-细Ji&4位，也已经确定了与免疫^h导的关节炎相关的多个 免疫学W:(例如i^型超^UJI和^^:^9和炎症^lt(例如细胞因子、趋 化因子和M降解酶类)，因此就可将这些Wt^于评估待测^^物在CIA模型 中的效力(Wooley， Owr. Op/汰3:407-20， 1999; Williams et aL， /附附w"o/: 卵:9784國788， 1992; Myers et aL，丄1> 5ti W:1861画78, 1997;和Wang et aL， /附附ww" 92:8955-959,1995)。
一组研究显示抗小鼠IL"17抗体在小鼠CIA模型中相对于对照小鼠緩解了 症状，il4明从概念上看本发明的可溶性多肽可以用于治疗人类疾病。无论是 预防.,药还是^^型动物已经出现关节炎症^给药，单次给予特异性抗小 鼠IL-17的大鼠:iiir清均能减轻动物体内的关节炎症状(Lubberte et al,爿rrAW泡 朋w肌5tf:650-9， 2004)。因此，可以使用IL"17RC-Fc或IL"17RC/IL-17RA-Fc 来中和IL"17A和/或IL-r7F,用于治疗特定的人类疾病，例如关节炎、银屑病、 4艮屑病关节炎、内毒素血症、炎'^病(IBD)、 IBS、结肠炎和本文公开的， 炎-性疾病。
将本发明的可溶性多斷例如IL"17RC-Fc或，n^l7RC/IL-17RA可溶l!i 蛋白和融合蛋白)给予上述CIA模型小鼠，以评估它们作为IL-17F和IL"17A的 拮抗剂以銜眸疾病症状和改变疾病进程的用途。此外，结果显示本发明的可溶
他的IL-17A或n-17F拮抗剂也可以用于,疾病症状和改变疾病进程。而且， 由于IL"17A和/或IL"17F诱导n^ip和TNF"a的产生，而H^ip和TNF-a又都参与 类风湿性关节炎的发病机制和疾病进程，那么全身'I^局部给予上述的可溶性 多l就有可能抑制RA中的炎性应答。出于示例而非P艮制的意图，以每只小鼠 10画200Mg的量注射IL^17RC-Fc(每周l至7次，注射最多持续辩限于4周，通it^:下、静脉内或肌内给药途径)可以显著减少疾病评^(后足评分、炎"疾
病的JLt)。 ^4tlL-17RC-Fc^药的开始时间(例如在J&^免疫之前给药或在胶
原免疫时给药，或在第二;^^免疫^的^^r时间点给药，包括在已^jt
疾病的时间点给药)，IL-17RC可以有效地预防类风湿性关节炎和mjh疾病的进 程。，可能的疗法包括IH7RC/IH7RA多肽等等。
2.内毒素血症
内毒素血症是一种严重的疾病，它通常由传染物(例如细菌和^传染性 疾病致病物)、脓毒症、中毒性休克综合征或免疫妥协患者所经受的枳^会性感 染等等所导致。可用于治疗的抗炎性蛋白质(例如本发明的可溶性多肽)可帮助 预防和治疗人类和动物的内毒素血症。这些可溶性多肽可作为有价值的疗法， 以减轻内毒素血症中的炎症和病理作用。
脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症涉及许多在传染性疾病中产生病理作用的 促炎性介质，LPS诱导的^动物内毒素血症是一种被广泛，和接受的用于 研究促炎性药物或免疫调节剂的药理作用的模型，。LPS由革兰氏阴性细菌产 生，是感染性休克的发病机制中的一种主要的致病因子(Glausner et aL，丄tf"c^ W&732， 1991)。在实验中通过向动物单次注射LPS就可以有^bfc诱导类似休克 的状态。由细胞响应于LPS所产生的分子可直接或间接地把向于病原体。虽然 上述生物应答可以保护宿主不受病原体的侵害，但是它们也会产生有害的作 用。因此，由严重的革兰氏阴性细菌感染所导致的先天免疫的大M^刺激会导 致细胞因子和，^"过量产生，并会导5tiLt致命综合征即感染性休克综合 征，该综合征的特征为发烧、低血压、弥散性血管内凝集和多器官功能衰竭 (Dumitru et al. O// 1071-1083， 2000)。
LPS的这些毒性作用大多与巨噬细胞激活导致的多种炎性介质的释放有 关。给予中和性抗TNF抗体可以预防LPS的桊性，錄明在这些介质中TNF似 乎起了关键性作用(BeutleretaL，5W幼"229:869， 1985)。已经证实，对C57B1/6 小鼠注射l照的;^杆菌LPS，在注射后约2小时就可以导致循环系统中EL"6、 TNF-a、 IL-1和急性期蛋白(例如SAA)的显著增加。LPS的毒性似乎是由上述 细胞因子介导的，因为针对上述介质的被动免疫可^lt死率I^^(Beutler et aL， Science 229:869， 1985)。用于预防和/或治疗感染性休克的潜在的免疫干预策略 包括抗TNFmAb、 IL-1受⑩抗剂、LIF、 IL-10和G"CSF。可以对上^lps诱导的模型给予本发明的可溶性多肽，以评估il-17rc或 il-17rc/il-17ra用于M)^症状和改变lps诱导的疾病的进程的用途。jH^卜，
据：即M^il类拮抗剂也可以用;^^lps诱导的模型的症状和改变^病进 程。所述模型显示出lps注^^导了ih7f的产生，而所述可溶性多肽可用于 治疗疾病。由于lps诱导了可能与内毒素血症的病理学有关的促炎因子的产 生，因此可以使用拮抗剂可溶性多肽中和il-17f活性或中和^fc促炎性因子， 以减轻内毒素血症的症状，例如在内毒素性休克中所见的症状。
3.炎',病obd)
在美国大约有500，000人患有炎性肠病(ibd),该疾病影响结肠和/或JLM(溃 疡性结肠炎)，小肠和«(克罗恩病)。这些疾病的发病机制还不清楚，但是都 与受影响组织的慢性炎^M目关。本发明的可溶性多肽可作为有价值的疗法，以 减轻ibd、 UC和相关疾病的炎症和病理作用。
溃疡性结肠炎(uc)是一种;^(通常被称为结肠)的炎性疾病，其特征在于 结肠的粘膜或最内层衬膜的炎^溃疡。这种炎症使得结肠经常排空从而导致
腹泻。症状包括大便^lt以;M目关的腹部绞痛、；^和体重减轻。虽然还不知 道UC的确切病因，但是最近的研究表明;!M^的天然防御系统正在^i体内的 被;N^认为是外来的蛋白质(一种"自身免疫性M")。也许由于这些蛋白质类 似于肠道内的细菌蛋白质，所以它们可能会启动或刺激炎性过程，而所述炎性 过程会开始破坏结肠衬膜。由于结肠的衬膜被破坏，因而会形成溃疡##^:粘 液、J^p血液。这一疾病通常从，部分开始，可能最^蔓M整个大肠。 炎症的^Oj^作会导致肠壁增厚^jLM部分产生瘢痕组织。在疾病严重时可 育^L生结肠组织坏死或脓毒症。溃疡性结肠炎的症#严重程度上^^有所不 同，其发病可为渐发性或M性的。许多因素(包^"吸系统感染或应激)^ 能引起义病。
虽然目前没有有效的治疗uc的疗法，但是已有的治疗方法都主要关注于 抑制结肠衬膜的异常炎性过程。目1H"用于治疗该疾病的治疗方法包括皮质类 固醇免疫抑制剂(例如硫喳嘌呤、巯噤#曱氨喋呤)和#^^^:。然而， 长期使用免疫抑制剂例如皮质类固醇和硫喳噪"^^导致严重的副作用，包M 骼变细、白内障、感染和对肝脏和骨髓的影响。对于现有疗法无效的患者而言， 手术也是一种选择。手术包^7除整个结肠和JJ^。已经有几种可部分模拟溃疡性结肠炎的动物模型。最广泛使用的模型为
2，4，6-X^J^t酸(TNBS)/乙醇诱导的结肠炎模型，该模型是在结肠中诱导l"曼 性炎症和溃疡。当通过直肠内滴注将TNBS注入易感小鼠的结肠时，它可以在 结肠粘^Ji诱导T细胞介导的免疫应答，在这种情况下可导致以整个大肠壁上 的T细胞和巨噬细胞的稠密浸润为特征的大面积粘膜炎症。除了这种组织病理 学特征W卜还伴随有以下临床特征：进行性体重减轻(消耗)、血昧腹泻、JL^ 脱^^;U^壁增厚(Neiira也et al. /"tem.及ev. /附附""M ":51>62， 2000)。
另一种结肠炎模型使用右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)来诱导急性结肠炎，该疾 病的表现为血性腹泻、体重减轻、结肠变短和伴有嗜中'1^细J3&^润的粘膜溃 疡。DSS诱导的结肠炎的组织学特征为炎性细胞浸润至固有层中，并伴有淋巴 样增生、灶性隐窝损伤和上皮溃疡。这些改变被认为是由于DSS对上皮的毒性
作用和借助于固有层细胞的吞喧作用、以及产生TNF-a和IF]V/而形成。虽然 这一模型已被广泛使用，但;U)SS的枳J^A类疾病的相关度方面还有一些问 题没有解决。DSS^型被认为是一种不依赖T细胞的模型，因为在T细胞缺陷型 动物例如SCID小鼠中也观察到了相似症状。
可以对TNBS或DS&j莫型给予本发明的可溶性多肽，以评估它们用于^j^ 症状和改变胃肠道疾病进程的用途。W卜，结絲示这些可溶性多财IL-17F 和/或H7A的抑制或中和作用为以下推论提供了证据：即它们(或类似分子） 也可以用于銜醉结肠A/IBD模型的症状和改变疾病进程。
4^病是一种超过七百万美国A^5患有的慢性狄疾病。#4病在新生皮 肤细胞生长异常时发生，导致发炎、肺胀和因旧^^食化够快的脱落而产生 的鳞片状她。斑块状#4病絲常见的类型，其特絲于表面带有银白色的 鳞片的发炎的^:块("损伤")。银屑病可肯^限于少^L^块或者也可能涉及中 JL^较大面积的龙决，最常出现的部位为头皮、膝部、肘部和躯干部。虽然看 ^M艮明显，但是4^屑病并不是一种接触传染的疾病。该疾病的发病机制包括 受影响组织的慢性炎症。本发明的可溶性多肽可作为有价值的疗法，以减轻银 屑病、M炎性;^疾病、^^和粘膜变态^JI和相关疾病的炎症和病理作用。
银屑病是一种T-细l^h导的狄炎性疾病，可引起相当程度的不适。狄 一种目前无法治愈的疾病，并且可侵害所有年龄的A^。在欧洲和北美洲，有 大约2%的4患有银屑病。虽然患有轻度银屑病的个M常可以佳月局部药
88物控制疾病，但是^:界仍有超过一百万的患者需要紫外线治疗或全身性免疫 抑制治疗。不幸的是，紫外线辐照治疗的不便和危险性以及许多疗法的毒性限
制了这些疗法的长期使用。此外，患者通常会在停止免疫抑制疗法后的m^时 间内复发银屑病，有些时候还会由反弹。
本发明的可溶性多肽可用于诊断系统中，以检测循环系统中的H7F或 IL-17A水平，和检测与急性期炎性应答相关的IL-17F或IL"17A。 >^目关实施方 案中，可以使用本发明的可溶性多Jlb险测循环系统中或局部作用的IH7F或 IL-17A多肽。B沐或受体多肽水平的升高或降低可指示病理性疾病，包括炎症 或癌症。已知IH7r^^导相关的急性期炎性应答。jH^卜，对急性期蛋白质或 m(例如IL"17A或IH7F)的检测可以作为某些疾病状态(例如哮喘、银屑病、 类风湿性关节炎、结肠炎、IBD和IBS)的慢性炎性病症的指标。这类病症的检 测可以有助于疾病的诊断，并可帮助医生选择合适的疗法。
除了本文所述的务他疾病模型"卜，还可以佳J?I重度联合免疫缺陷(SCID) 小IL^型，在体内测量本发明的可溶性多財来源于人类银屑病损伤的炎'Iil且 织的活性。已经开发了一些人类细I^L^LA^疫缺陷型小鼠的小鼠模型(统称 为异种移植物模型)；参见例如，Cattan AR^ Douglas E，M:513國22， 1994和Flave11， DJ，及e附"tofog/co/ Ort"to狄":67-82， 1996。作为一种#4病的 体内异种移植物模型，将人类银屑病^i且织^^SCID小鼠模型中，并用合
适的拮抗剂攻击。此外，也可以使用本领域中的其他银屑病动物模型来评估
IL"17A和IL-17F拮抗剂，例如将人类银屑病^m:移植物;ltAAGR129小鼠模型 中，并用^^适的拮抗剂攻击(例如参见，Boyman， O. et al.， /• Online publication #20031482， 2004，该文献以援引的方式纳A^^文)。本发明的能够结 合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-17F或IL-17A和IL"17F两者的活性的可 溶性多肽是优选的拮抗剂，其他的IH7A和IL"17F拮抗剂也可以用于该模型 中。类似地，可将来源于人类结肠炎、IBD、 IBS、关节炎或m炎性损伤的 组织或细胞用于该SCHM^型，以评估本文所述的IL"17A和IL-17F拮抗剂的抗 炎録。
可以通过将本发明的可溶性多！^予带有人类炎性组织(例如银屑病损伤 等等)的SCID小鼠或本iL^斤述的^M^型，对设计用于^JU本发明的可、溶14多 肽来消除、^^或减轻炎症的疗法进行测试。使用4^页域公知的方法测:Ht治 疗A^中抗炎效果随时间的增加，从而测量疗法的^并进^^计学评估。一 些示例性方法包括但不限于：例如在银屑病模型中测量^Jf度、真皮上层中炎性细胞的数量和角化不全的^U，J。这类方法是本领域已知的，并在本文有记 载例如参见，Zeigler， M. et al.丄W /wve^ W:1253， 2001; Zollner， T. M. et aL义 C7/汰/"ve就J狄671， 2002; Yamanaka， N. et al. 3f/cra6/汰/ /挑附"朋/1 45:507， 2001; Raychaudhuri， S. P. et al.份./• Z)e騰toA嵌931， 2001; Boehncke， W. H et al.Der附fltoA及战2W:104， 1999; Boehncke, W. H et aL. /. /wve议 De尸附fl/W "6:596， 2001; Nickoloff， B. J. et aL爿肌/• iWAW "6:580， 1995; Boehncke， W. H et al. «/• Cn似汰户"幼o/: 24:1, 1997; Sugai， J.， M. et al. /• Z)c附fltoil 5ti 77:85， 1998;和Villadsen L.S. et al. /• C7/汰//fve就J":1571， 2003。 还可以使用例如流式细I&^(或PCR)的公知方法，测量样本中炎性细M损伤 细胞的数量、IBD^分(体重减轻、腹竭、狄出血、结肠长度)以及CIA和RA 模型的足疾病评#炎症评分，从而随时间监测炎症。例如，适用于在这类模 型中检测的治疗策略包括使用下述药物基于阻断H^17RC和/或IH7RA与其 相应配体的相互作用而进行的直接治疗，所述药物为可溶性IL-17RC或 IL-17ROIL-17RA，或^f&IL"17A和IH7F拮抗剂(单独地或共同地)，或相关 缀^或拮抗剂。
银屑病为一种慢性炎性狄疾病，该疾病与增生性上皮角质形成细胁浸 润性单核细胞（包括CD4+记忆T细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)相关 (Christophers, /"A爿rc/r.爿/fer欲/附/w""W， 7/汰.199， 1996)。目前认为5f^中的 抗原对于该疾病的iLi和该疾病的病理学有重要的作用。然而，认为对自身抗 原的耐受度下降介导了银屑病的病理学。树突细J^CD4+T细胞被认为在下述 的抗原呈递和识别过程中起重要作用，所述抗原呈递和识别过程介导了导致所 述病理的免疫应答。我们最近基于CD4+CD45RB转移模型开发了一种银屑病 模型(Davenport et aL， /"temartl J附附""o/i/fai"附"co" 2:653-672)。将本发明的可 溶性多肽给予小鼠。对疾病评^(^J^损伤和炎性细胞因子)的抑制表明所述可 溶性多toJ"于^L^病的效力。
5.特应性皮炎.
AD是一种常见的慢性炎性疾病，其特征在于辅助T细胞亚类2(Th2)的iUL 活跃的细胞因子。虽然尚不知itAD的确切病因学，但是已知有多种因素与其 相关，包括itl活跃的Th2免疫应答、自身免疫、感染、变应原和遗传倾向。 该疾病的关键特征包針燥病(M干燥)、瘙痒症(J^^辆)、结膜炎、炎性 ^J^损伤、金黄色葡萄球菌(5te/i卸foa?ccMS做wtts)感染、血液嗜酸粒细胞增多、血清IgE和IgGl水平升高和伴有T细胞、肥大细胞、巨喧细胞、和嗜酸性粒细 胞浸润的慢性皮炎。已经发现金黄色葡萄球菌的定殖或感染会加剧AIMH^这 种M疾病转为永久性慢性疾病。
AD常见于患有哮喘和变应性鼻炎的患者中，并且通常为变应性疾病的初 始表现。在西方国家中约有20。/o的A^患有这类变应性疾病，在发达国家的 AD发病率因为未知的原因i^i^上升。AD通常起始于童年期，并经常可从 青^^一直持续直至成年。目前针对AD的疗法包括：局部M激素治疗、口 服环孢菌素A、非皮质类固醇免疫抑制剂例如他克莫司(油膏形式的FK506)和 干扰素Y。虽然有多种针对AD的疗法，但是许多患者的症状并没有得到改善， 或者他们对药物有不M应，这就需J^找M更有效的治疗剂。本发明的可 溶性多肽可用于中和IL-17F和IL-17A，用于治疗特定的人^类疾病，例如特应性 皮炎、炎性^J统疾病和本文公开的M炎性疾病。
6.哮喘
IL-17对于气道中的变应原诱导的T细胞激活和嗜中'lt^立细胞内流具有重 ，用。IL-17的受体在气道中表ii(Yao， et al. Immunity 3:811 (1995))在过敏 性哮喘中，化学引诱物EL-8、 GRO^和由EW7刺激的人类支气管上皮细胞 (HBEC)和人类支气管成纤维细胞产生的巨噬细胞炎性蛋白-2(1\1«»-2)可以极 大地诱导IL-17介导的嗜中性粒细胞募集(Yao， et al. //附w"朋/ 755:54&? (1995)); Molet， et aL •/ j/fer狄C//w J附附w"o/ J做:4邓（2卵")。IL-17舳，J激 HBEC释放嗜中'I^细胞激活因子IL"6( FossieA et al， / ~ JW:25W (7妙6)机inden， et aL/^爿rcA爿/feis)^附附""o〃26:779 (2001))，并且已在体外 证实IL-17可以与TNF-口协同作用而延^A类嗜中性粒细胞的存活时间(Laan， etal.五",及^/，/r/2?:M7(2003))。 jH^卜，IL-17能够通过增强涉及气道重塑的细 胞因子的分泌，从而增强哮喘中的炎性应答，所述细胞因子例如促纤维变性 (profibrotic)细胞因子IL-6和IL"11和炎性介质粒细胞集落刺激因子(G^CSF)和 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (Molet， et al. /爿/fe/gv C7/w /附附w朋/
临店4i据显示，哮喘的急性重度恶化与气道中嗜中'fci^细胞的募集和激活
相关，这样看来IL-17可食tjt哮喘中起了重要作用.患有轻度哮喘的患者表现 出游离的可溶性IL-17A蛋白局部浓度的可检测的升高(Molet^ et aL J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001》，另夕卜，通过使絲的人类志愿者暴露于封闭猪舍中以诱导发生严重的气道炎症时，该志愿者的支气管肺泡间隙中的游离的可
溶1"生IL-17A蛋白浓度的表现出明显升高（Fossiez， et al， J Exp Med 183:2593 (1996)和Linden，etaLInt Arch Allergy Immunol 126:179 (2001》。此外，痰中 的IL-17水平与个体气道高反应性的提高相关(Barczyk^ et al. Respir Med 97:726(2003)。
在气道高反应性的动物模型中，4«:敏化的小鼠慢性pAX卵清蛋白可导致 支气管嗜酸錄细胞炎症，并可在发炎的肺组织和支气管嗜中'錄细胞中早期 诱导IL國17 mRNA的表ii(Hemngs， et aL Am J Respir Cell Mol Biol 28:42 (2003)。抗IL-17单克隆胁显著I^f氐了支气管嗜中'雄细胞内流，但^k^^提 高了支气管肺泡灌洗液和血清中的IL"5水平，并Jii加重了变应原诱导的支气 管嗜酸1±*立细胞内流，it^明IH7A可能^4决定在如上所述的^^攻击后的 嗜中'1^立细#嗜酸1^细胞累积的平斷同上)。
在IL-17家M员中，IL"17F与IL"17A的关系最近。由IU7A介导的生物 活性与由H7F介导的生物活性类似，其中IL-17F刺^LIL"6、 IL-8和G^CSF的 产生（Hurst, et al. J Immunol 169:443 (2002))。 IL-17Fi^内皮细胞中诱导 IL-2、转化生长因子(TGF)-口和单核细^^化蛋白(MCP)的产生(Starnes， et al. J Immunol 167:4137 (2001))。类似地，变应原攻击可以增加过敏性哞喘患者的局 部IL画17F水平(Kawaguchi， et aL J Immunol 167:4430 (2001))。将IH7F基因送 递至鼠类肺部可提高支气管肺泡间隙中的嗜中'l!^立细胞水平，而IU7F基因的
(Oda， et al. Am J Respir Crit Care Med 171:12 (2005))。
除哮-^卜，还有一些慢性炎性气道疾病也以气道中的嗜中'雄细胞募集 为特征，已有損道称IL"17在一些呼吸系统疾病的发病机制中起重要作用，所 述呼吸系统疾病例如慢性阻塞性肺病(COPD)、细菌性肺炎和嚢性纤维化病 (Linden, et al. Eur Respir J 15:973 (2000)， Ye， et aL Am J Respir Cell Mol Biol 25:335 (2001)3ahman， et al. Clin Immunol 115:268 (2005))。在体夕卜炎^j^型 中，已显示抗IL-17A和/或抗IL"17F治疗性^"对慢性炎性气道疾病有治疗效 果。IL-17F和/或IL"17A活性的拮抗剂，例如n^l7RC可溶性受体和其^(包括 本发明的^A类IL-17RC单克隆，和中和^9,抑制IL-17A和/或II^17F诱 导培养的HBEC或支气管成纤维细胞产生细胞因子和趋化因子的能力可以被 用于度量这类拮抗剂防止因IH7A和/或F刺激所直^致的炎性介质的产生 的效力。如^PAJL^17F和/或IL"17A活性的拮抗剂(例如本发明的可溶性多肽）可以显著I^f氐炎性介质的产生和表达，那么就可以预计所述拮抗剂能够有M
治疗与t曼性气道炎^M目关的炎性症状。
7.肠易激综合叙"IBS")
肠易激综合M示以腹部疼痛或不适和异常糸M更习惯为特征的疾病。可以 基于IBS患者的朝Nt习惯可以将IBD患者分为三种主要的类幹主要为经常排 便或大便木碌的患者；主要为不经常#1线大便干硬的患者；以及朝M更习惯不 定或大便正常的患者(Talleyeta1.，2002)。肠运动性的改变、上皮功能的异常、 粪便和空^t过的异常以;SJ[激柯能与症拟目关，而内脏的超^JI是大多 数患者的重^lt征。推测影响^i信号传导的遗传因素和传入信号的中m理 的失调可能^f吏个体易于在接触特定环^患上IBS。研究还证实，结肠中的 炎性应答会增加平滑肌和肠道神经的每:感性，由此扰乱肠的感觉-运动功能 (Collins et al.， 2001)。 IBS和IBD在临^Ji有交叉，在患^L确诊为IBD4^前经 常被报告絲出ffi辦症状，而且已经确诊为IBD的患者在^l期时出5ejBS症 状的情况比预计的要多。因此，这些疾病可能以高于预计的频率共存，或者可 能IBS和IBD是存在与一个连续镨中不同端点的疾病。然而应该注意到的是， 大多itlBS患者的结肠活检标本看^^是iE常的。尽管如此，IBSiiA^地影 响了相当多的个体(2000年在美国的患病个体大约有1600万)，导致的经济负担 一共为17亿美元(2000年)。因此，在各种高发病率和造成高经济花费的肠胃疾 病和病症中，IB败次于胃食管返流疾病(GERD)而排在第4。但是与GERD 不同的是,IBS的治疗现状并不令人满意(Talley et aL, 2002; Farhadi et al.， 2001; Collins et al.， 2001),说明治疗IBS的需求显然并未得到满足。
目前已提出的疾病模型都基于下述假设：中柩沣经系统(CNS)或消化道的 神经回路、免疫回路或神经免疫回路对中枢(##上的)或外周(组织刺激、A#、 感染)系统中正常稳态的波动的M性增强(Talley et al.， 2002)。这种增强的反 应性导致消化itii:动性的失调、上皮功負^免疫和通透性)失调和内脏的超^t^ 应，这些^^又导致了IBS症状。
可能有多种不同H在IBS的发病机制中起作用，包括刺激神经元的W 的作用和参与启动炎性过程的分子的作用。发明人掌握的多种的H都已知与
神经元的可能的活,I^目关，因为它们直接由神经;^4絲者它们的受体糾经 元Ji^达，所述内部W包括IL-17D、 IL"17B和IL"31。此外，有多个H7家族成员和相关分子与消化道炎^f目关，所M员包括IL"17A、 IL"17F、 IL-23 和11^31。
可以在疾病的动物模型中测^il些^"的体内抑制剂效力。已经提出了一 些^^以IBS的关键特征的动物模型，这些模型中涉及耙向中枢的剌激(应激)和 耙向外周的刺激(感染，炎症)。可以用于测定抑制剂治疗IBS的效力的体内动物 模型的两个实例为：（i)主要;^以原发性CNS定向的IBS发病机制的模型(应激模 型)，和(ii)主要模拟消化道定向的应激(即消化道炎症、感染或物理应激)的诱导 物的模型。然而应当注意的是，在CNS或在胃肠(GI)道中发生的事件并不是相 互独立的，IBS的症状很可能应归因于从CNS向GI的信号传导或从GI向CNS的 信号传导之间的复杂的相互作用。
J)药物学制剂
为了用于药物用途，可^^常M法将本发明的可溶性多肽配制为用于肠 胃外illit特别是静脉内illit或皮下illit的制剂。静脉内给药可以通过以下方式 进行：快速浓注、控辯例如使用微M^^适技术)或通常为一小时至几小 时内的输注。通常，药物制剂应包^tit蛋白以及可药用的载体，例如生理盐 水、緩冲盐溶液或5%葡萄糖水溶液等等。制剂还可包括一种或多种赋形剂、 防腐剂、助溶剂、緩冲剂或者防止容器表面的蛋白质损失的清蛋白等等。当使 用这类结合疗法时，可将各细胞因子混合为单一的制剂或者各细胞因子可以以 各独立的制剂形式给药。配制的方法是本领域公知的，并且公开于例如 及柳/m，"'s /%flr/iiace"#ca/ 5We"ces， Gennaro， ed" Mack Publishing Co" Easton PA， 1990中，该文献通过援引纳A4^文。治疗剂量通常应为0.1至100 mg/kg患者体重/天，优:^为0.5-20 mg/kg/天，賴"确的剂量可由临床医生， 现有的标准，并考虑游治疗疾病的'M和严重程度以及患者个^ft征等等因素 来确定。剂量的确定是在4^贞域"fit技术人员能力范围之内的。通常应在化疗 或骨髓移^给予蛋白质，可给予最多ii28天的时间M给予JJ^、板计数达 到S0，000/mm3，优g X0，000/mm3为止。更通常地，蛋白质可被给予一周 或^时间，通常*予一至三天。通常，本发明的可溶性多肽治疗有效量为 足以使淋巴样细胞或骨髓祖细胞的增殖和/或分化在临床上产生显著增加的 量，所述的增加表现为循环系统中成熟细胞(例如血小板或嗜中'1^细胞)水平 的增加。因此，对血小板疾病的治疗可持续至血小板计数达到至少20，000/mm3、 to^为50，000/mm3为止。本发明的可溶性多^ii可以与^^细胞因子联合给
94成素；G"CSF 和GM-CSF。在联合治疗方案中，M细胞因子的日剂量通常为：EPO， 150 U/kg; GM-CSF， 5-15]g/kg; 11^3， l國51g/kg;和G"CSF， l國25Ig/kg。与EPO 联合的疗法例如可用于EPO水平较低的贫血患者。
通常，可溶性多肽的给药剂量会根据下列因素而变化：例如患者的年龄、 体重、身高、性别、总体医学状况和病史。通常需要向受者提供的这类可溶性 多肽的剂量范围为约lpg/kg至10mg/kg(药物量/患者体重)，但是根据情况也可 以给予更低或更高的剂量。
将本发明的可溶性多M予受錄的给药途径可为：静脉内给药、动脉内 给药、JtM内给药、肌内给药、皮下给药、胸膜内给药、鞘内给药、通it^部 导管的输注给药或者在损伤区直接注射给药。当通过注射给予治疗性蛋白质 时，给药可以通赵续输注或单次或多次浓注的方式进行。
其條药途径包括口月峰药、粘膜给药、肺部给药和经皮给药。口J^iilil1 适用于聚酯m、玉米蛋白#^类蛋白质m、聚腈基丙烯酸酯#^基于 月旨类的系统(;^见例如，iVote/w De/iVe/y: i%"/ca/ iyjwte鹏，Sanders和Hendren (编著)，第255-288页，DiBase和Morrel的"Oral Deliveiy of Microencapsulated Proteins"(Plenum Press 1997))。例如胰岛素鼻内给药的方式说明了鼻内iHi菱的 可行性(参见例如，Hinchcliffe and Dlurn, ^rfu Drag Z)e//v.35:199 (1999))。 可以制备包括可溶性IL-17RC或抗IL"17RC抗体的干颗M液体颗粒，并在干 粉分散器、液体溶J^A器或喷雾器的帮助下用于^NJ^药(例如，Pettit and Gombotz， r游五CH^6:343 (1998); Patton "《她Dr"g歸'v.紐35:235 (1999))。这一方法可通iiAERX糖尿病控制系统得到说明，该系统为一种可以 将气溶皿岛素iilitJJt内的手控电子PAA器。研究显示，^量大到48，000 kDa的蛋白质可以在4顿超声波的辅助下以治疗浓度穿it^JUHit，这证明了 经皮给药的可行性(Mitragotri " "A， 5tfen" 2砂:850 (1995))。使用电穿孔的经 皮送递提供了用于给予本发明的可溶性多肽的另一种方式(Potts W a" 历她c/M 2化213 (1997))。
可以根据已知方法配制含有本发明的可溶性多肽的药物组#，以制备其 中治疗性蛋白和可药用栽体组合形成混合物的可药用组合物。当一种组合物的 给药可被接受该组合物的患者耐受时，就将该组合物称为"可药用载体"。可药
用载体的一个实例为无菌磷^it緩沖液。^^适的载体^1本领域技^^员7>知的。参见例如，Gennaro (编著)，及側/wgtow's尸/MWifttice"ifcflr/iyc/e"ces，第19 版(Mack Publishing Company 1995)。
出于治疗目的，可以给予患者治疗有效量的本发明的可溶性多#可药用 载体。当所给予的^^发明的治疗性W和可药用载体的组合的量产生^的生 理学作用时，就称该量为"治疗有效量"。如果一种药物的存在导致当接受给药 的患者的生理状况发生可检测的改变时，就称该药物产生了显著的生理学作 用。例如，如果一种用于治疗炎症的药物的存在减轻了炎性应答，就称该药物 产生了显著的生理学作用。
含有本发明的可溶性多肽的药物组合物可以以液体形式、气溶胶形式或固 体形式提供。液体形式的实例为可注射溶液和口服悬液。示例性的固体形式包 括胶嚢、片剂和控释形式。控释形式的实例为微量渗透^4i^物(Bremer " 历她c/r朋/1掀239 (1997);Z)i*"g De//ve/y <5^欲鹏,Ranade and Hollinger (编著)，第95-123页，Ranade的"Implante in Drug Deliveiy，，(CRC Press 1995); iV她/" 分他ms， Sanders and Hendren (编著)，
第239-254页,Bremer^人的"Protein Delivery with Infusion Pumps"(Ple肌m Press 1997); /Vvfe/" De//veij: i%j«/ca/ ^sterns, Sanders和Hendren (编著)，第 93画117页,Yewey等人的"Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant" (Plenum Press 1997))。
脂质#^1供了 一种通过以下给药途径将治疗性多lid^it至受錄的方法： 静脉内、鹏内、鞘内、肌内、皮下，或口月峰药、PilA^药或鼻内给药。脂 质体是由被脂质双层包围的一个或多个水性区室组成的微嚢(总体参见， Bakker画Woudenbei^ " "/L，/• C7/汰Af/cra6/o/L /"Ad Z)/s: " fS^，/1 /):S61 (1993); Kim， 46:618 (1993)和细g 一醒，Ranade和Hollinger
(编著)，第3画24页，Ranade的"Site"Spec迅c Drug Delivery Using Liposomes as Carriers" (CRC Press 1995))。脂质体在组成上与细皿类似，因此脂质体可以 用于^^药并且是可生物降解的。才娥制备方法的不同，脂质体可为单层 的或多层的，脂质体的直径大小可为0.02jim至10nm以上。脂质体中可包封多 种药物：分配于脂双层中的疏水性药物和分配于内部水性空间中的亲水性药物 (参见例如，Machy " "/!，丄扭ftwwwes /" CM 5/ofogj;爿""尸/wwwwico/ogv (John Libbeyl987)和Ostroe/"/1, J附eWcfl"丄及做p./^flmi^6:1576(1989))。 jlt外，还 可以通过改变脂质体的大小、脂双层的数目、液体组分以及改变脂质体的荷电 特#表面特性，从而控制被包封药物的治疗利用度。脂质体可吸附在a所有类型的细^Jl,并緩慢#^^斤包封的药剂。或者， 吸附的脂质体可被呑喧性细胞内吞。内吞作用^脂质体脂质会在^S^内被
降解而释放所包封的药物(Scherphof d d, ^"汰7V.E Jaw;fc "6:368 (1985))。在静脉内给药^，小脂质^K0.1至1.0nm)通常^J^Hi于肝Jii^脾 的网状内皮系统的细Jf^聂取，而大于3.0nm的脂质体会員部沉积。可以利用 这种网状内皮系统的细胞优先摄取艮小脂质体的特性来将化学治疗剂送递到 巨噬细#肝旨瘤中。
可以通过一些方法来绕it^斤述网状内皮系统，所述方法包括用大剂量的脂 质体颗粒饱和或用药物手^i^棒I^AW吏巨噬细胞失活(aaassei1 "
^""朋2:428 (1984))。 jJt^卜，已显示在脂质体膜中掺A^t脂衍生磷脂 或聚乙二醇衍生磷脂可以显著地降低网状内皮系统的摄取(Allen d fl/L， 及V?cA/抓倫/i一. Jc似7腳:133 (1991); Allen C《肠c似肌5一/f, Jc似 "50:9 (1993))。
还可以通it^L变磷脂组分或在脂质体中插入受体或西沐，从而制名4fe向于 特定细胞或器官的脂质体。例如，已有人使用用高含量的非离子型表面活性剂 制备的脂质体iMfe向于肝脏(Hayakawa "日本专利04^244，018; Kato " d， 历M 5w/A 76:960 (1993))。这些制剂通过下itit程制备：将大豆磷脂酰
胆喊、a-生育酚和乙tt氬化狄油(HCO-60)在甲醇中混合；将混^^在真空 中浓缩；然后将混合物在水中重溶。已显示^f^^^榈,脂St^(DPPC) 与大豆衍生化齒醇葡萄糖苷混合物(SG)和胆固醇(Ch)制备的脂质体制剂可以 靶向于肝li(Shimizu " «/1， fiw//1 2决881 (1997))。
或者，可以在脂质体表面结合各种乾向酉沐，例如M、 *片段、糖类、 维生素类和#^蛋白。例如，可以用支链型半專m脂类衍生物修饰脂质体，以 使其耙向于脱唾液酸糖蛋白(半孝Ut)受体，该受体专一iik^肝脏细胞的表面表 达(Kato and Sugiyama， CWt及ev. Tto. Gwrie/"辆":287 (1997);
Murahashi "A， 尸/^r肌5«//120:259 (1997))。类4她，Wu " d， He/witotogv 27:772 (1998)中已证明，^J1脱唾液録球蛋白才封己脂质体可以减短脂质体的 血浆半衰期，并^^提高肝细m脱唾^^球蛋白标记的脂质体的摄取。另 一方面，可以通过预先注射脱唾液g球蛋白来抑制含有支链型半專Ut脂类衍 生物的脂质体在肝脏中的累积(Murahashi C dl， 5"汰20:259 (1997))。聚乌头酸化(polyaconitylated)人类血清清蛋白脂质体提供了^J旨质体 靶向于肝细胞的另一种手^(Kamps " Ph?c: 7Virt，/爿awjt Sci 94:11681
97(1997) )。此外，Geho等人的美国专利No.4，603，04祸述了一种定向于肝细胞的 月旨质体嚢泡i!Bt系统，该系统特务性针对与肝脏的特化代谢细Jf^目关的肝胆管 受体。
在一种更常用的组织靼向手段中，用特异性针对目标细J!&Ji^达的配体的 生物素化抗体对目标细胞J^fffi标记(Harasym """爿咖.Dmg 及ev. ":99(1998))。在游离抗^^#浆中清除^,给予链亲^^缀合的脂质体。 在另一种方法中，直^P耙向絲连接到脂质体上(Harasym & d，Dmg Z)e//v.紐":99 (1998))。
可以<^标准的蛋白质微包封技术将多#抗体包封在脂质体内(参见例 如，Anderson C《/附附肌3i:1099 (1981); Anderson 《Cii"cer 50:1853 (1990)和Cohen C《历oc/r/肌历—Jc似/船:95 (1991);丄—柳e rec^iwtow，第2版，VoL m， Gregoriadis (编著)，第317页，Ahing等人的 "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies" (CRC Press 1993); Wassefd"/:，Me欲.五"g;/wMiW:124(1987))。如上所述，可用于治疗的 脂质体可含有多种组分。例如，脂质体可含有聚乙二醇的脂类衍生物(Allen d fl"爿c似7J50:9 (1993))。
可以设计可降解的聚杨郷来##治疗性蛋白较高的全身水平。4^1例 如下述的可降解聚合物来制备«，所述聚合物例如聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG)、聚酸酐、^^、酸酯、不可生物降解的乙酸乙基乙烯酯聚^，其中蛋 白质^^t捕获在聚^^中(Gombotz and Pettit，历^wi乂"g"te 0^饥6:332 (1995); /),Mg De//v«j ^sterns, Ranade and Hollinger (编著)，第51-93页，Ranade的 "Role of Polymers in Drug Delivery" (CRC Press 1995);外她/" Dd/vciy: i^拜'cfl/加fems， Sanders和Hendren (编著)，第45-92页，Roskos和Maskiewicz 的"Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery" (Plenum Press 1997); Bartus " «i， 5^腳2《i:1161 (1998); Putney and Burke， 7V"似fe 5/她cA朋/flgy 76:153 (1998); Putney, O/zr. C^p/". Cfee肌必/oA 2:548
(1998) )。聚乙二醇(PEG)包被的纳^M可以作为用于静脉内iHit治疗性蛋 白的栽#<>#^见例如，Gref" "， 及》tecA朋/L 70:167 (1997))。
本发明还考虑到了具有H7A和/或IH7F结合活性的经化学修饰的多 肽，例如IL-17RC或IL-17RC/IL^17RA科、同二聚体、异二聚M多聚体形 式的可溶性受体，其中所述所述受体为一种如上所述地与聚合物相连接的多 肽。本领域技^A员也可以如下^X^/斤ii^设计其他剂型，所itiL棘例如， Ansel and Popovich， JP/ra/TimceM^i/ F(9/ms朋"/Sy他附s1，
第5版(Lea & Febiger 1990)， Gennaro (ed.)，及e附/"^to"'s i%"miace"/fca/ /SWe"m1，第19版(Mack Publishing Company 1995)，和Ranade and Hollinger， /)，1^//，&弥微（CRC Press 1996)。
例如，药物组#可以以试剂盒的形式4^供，所述试剂盒包括装有一种本 发明的可溶性多肽的容器。治疗性多肽可以以用于单次或多次剂量的可注射溶
液的形式提供，或者以可在注射前重溶的无菌粉末形式提供。或者，这类试剂
盒可包括一个用于给予治疗性多肽的干粉喷射器、液体气溶J!^L生器或喷雾 器。这类试剂盒还可包括关于所述药物组合物的适应症和^^^方法的文字信 息。此外，这类信息可以包拾^下声明，声明已知对IL"17RC或IL-17RA过敏 的患者禁用所iil且^L
含有本发明的可溶性多肽的药物组合物可以以液体形式、气皿形式或固 体形式提供。液体形式的实例为可注射溶液、气溶胶、滴剂、局部用溶液和口 服悬液。示例性的固体形式包括胶嚢、片剂和控，式。控释形式的实例为微 量渗透泵和植入物(Bremer " 丑/ofec/wiM 10:239 (1997);
Z)eftvCTj ^ste附s， Ranade和Hollinger (编著)，第95-123页，Ranade的"Implants in Drug Delivery" (CRC Press 1995); iV她/" De/Zve/j: i%"/cfl/分他ms， Sanders和Hendren (编著)，第239-254页，Bremer等人的"Protein Delivery with Infusion Pumps，，(Plenum Press 1997); iVvte/w De//vw 加tems， Sanders和Hendren (编著),pages 93-117页,Yewey等人的"Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant"(Pleiium Press 1997))。 ^fe固体
形式包括乳剂、糊剂和^M^部应用形式等等。
脂质^^供了 一种通过以下给药途径将治疗性多liUllill至受试者的方法： 静脉内、舰内、鞘内、肌内、皮下，或口月峰药、^A^药或鼻内给药。脂 质体是由被脂质双层包围的一个或多个水性区室组成的微嚢(总体参见， Bakker-Woudenbei^ " /• C7/汰厕cra6/oA /"yfecA D/& 72 (SW/i/i/l ":S61
(1993); Kim， D，斩:618 (1993)和ZV"g Z)e/A^加fe鹏，Ranade和HoIlinger (编著)，第3-24页,Ranade的"Site"Spec迅c Drug Delivery Using Liposomes as Carriers" (CRC Press 1995))。脂质体在组成上与细皿类似，因此脂质体可以 用于安全*药并且是可生物降解的。根据制备方法的不同，脂质体可为单层 的或多层的，脂质体的直径大小可为0.02nm至l(Him以上。脂质体中可包封多种药物：分配于脂双层中的疏水性药物和分配于内部水14空间中的亲水性药物(参见例如,Machy "A，丄—sw附es /" O// 5/ofo狄爿""i%脂质体可吸附在M所有类型的细l&Ji，并緩慢#^^斤包封的药剂。或者，吸附的脂质体可被吞喧性细胞内吞。内吞作用^脂质体脂质会在^SI^内被降解而释放所包封的药物(Scherphof d "， ^i汰iV丄/4owi W6:368(1985))。在静脉内给药^，小脂质体(0.1至1.0nm)通常^i^于肝li^脾的网状内皮系统的细J&^取，而大于3.0nm的脂质体会M部J5L^。可以利用这种网状内皮系统的细胞优先摄:^小脂质体的特性来将化学治疗剂送递到巨噬细#肝旨瘤中。
可以通过一些方法iM&it/斤述网状内皮系统，所i^r法包:^用大剂量的脂质体颗粒^^或用药物手^i^择'I^iib使巨噬细胞失活(Claassen " "/L，
爿c似朋2:428 (1984))。 jtb^卜，已显示在脂质体膜中掺A^脂衍生磷脂或聚乙二醇衍生磷脂可以显著地降低网状内皮系统的摄取(Allen W5/oc似肌5—一. Jc似M幼:133 (1991); Allen C《历ocA/抓及V?/?/rj^. ^c似U5&9 (1993》。
还可以通过改变磷脂组分或在脂质体中插入受体或配体，从而制^Hfe向于特定细胞或器官的脂质体。例如，已有^U吏用用高含量的非离子型表面活性剂制备的脂质体棘向于肝脏(Hayakawa W "，日本专利04-244，018; Kato"flA， 5nZ/: i6:960 (1993))。这些制剂通过下述过程制备：将U
磷脂it4a喊、a-生育酚和乙M氢化E^油(HCO-60)在甲醇中混合；将混合物在真空中浓缩；然后将混合物在水中重溶。已显示使用1榈,脂酰胆碱(DPPC)与大豆衍生化甾醇葡萄糖苷^^(SG)和胆固醇(Ch)制备的脂质体制剂可以耙向于肝斷Shimizu ""， 5wZ/: ，:881 (1997))。
或者，可以在脂质体表面结合各种耙向配体，例如抗体、抗体片段、糖类、维生素类和转运蛋白。例如，可以用支链型半享Ut脂类衍生物修饰脂质体，以使其耙向于脱唾液酸糖蛋白(半享Ut)受体，该受体专一^肝脏细胞的表面表ii(Kato and Sugiyama， CWt i?ev. 7%er. C"/rfer Sy议74:287 (1997);Murahashi " 说M /Vmr机20:259 (1997))。类似地，Wu C a/L,〃e/witotog); 27:772 (1998)中已证明，^^l脱唾液赫球蛋白才朽己脂质体可以减短脂质体的血浆半衰期，并^J^提高肝细l^t脱唾液^球蛋白标记的脂质体 的摄取。另一方面，可以通过预先注射脱唾^^台球蛋白来抑制含有支链型半
孚m脂类衍生物的月旨质体在肝脏中的累积(Murahashi " fl/L,历o/L ，:259 (1997))。聚乌头酸44^v类血清清蛋白脂质^44供了^J3旨质^向于肝细 胞的另一种手段(Kamps "d， iVw iVfl/，/爿c"d &i W:11681 (1997))。此 夕卜，Geho等人的美国专利No. 4，603，04機述了 一种定向于肝细胞的脂质体嚢泡 iMit系统，该系统特异性针对与肝脏的特化代谢细船目关的肝胆管受体。
在一种更常用的组织靶向手段中，用特异性针对目标细^Ji^达的配体的 生物素化抗体对目标细胞^ii^^标记(Harasym ^rfu Z)mg Z)e//v.及w.
":99 (1998))。在游离抗^fl^L从血浆中清除之后，给予链亲和素缀合的脂质 体。在另一种方法中，直M耙向^^连接到脂质体上(Harasym " «/1，爿r/u """g M/v.紐32:99 (1998))。
可以使用标准的蛋白质微包封技术将本发明的可溶性多肽包封在脂质体 内(参见例如，Anderson 《/"yfecA /附腳汰3i:1099 (1981); Anderson CVi"cc50:1853 (1990)和Cohen C 历oc/r/肌jftfdi:95 (1991);rec/^«?fogv，第2&第m巻Gregoriadis (编著)，第317页， Alving等人的"Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies" (CRC Press 1993); Wassef " "A， 五"gww^ "9:124 (1987))。如上所述， 可用于治疗的脂质体可含有多种组分。例如，脂质体可含有聚乙二醇的脂类衍 生物(Allen " 及V?c似肌W5仇9 (1993))。
可以设计可降解的聚#«1来絲治疗性蛋白较高的全身水平。4M例 如下述的可降解聚合物来制备微球，所述聚合物例如聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG)、聚酸酐、聚原酸酯、不可生物降解的乙酸乙基乙烯酯聚合物，其中蛋 白质^L捕获在聚^^中(Gombotz and Petti仁itoow/"gflte Ore抓6:332 (1995);
Z)e/iv^y分ste/MS， Ranade和Hollinger (编著)，第51-93页，Ranade的"Role of Polymers in Drug DeIivery，，(CRC Press 1995); iVote/w DeftVeij?: i^拜'cfl/ 争tems， Sanders和Hendren (编著)，第45-92页，Roskos和Maskiewicz的 "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein DeIivery，，(Plenum Press 1997); Bartus C "A， 5We"ce 2W:1161 (1998); Putney and Burke， iV"/"w 历她di"o/柳76:153 (1998); Putney, Op/汰Or微5io/: 2:548 (1998)),聚 乙二醇(PEG)包被的纳米颗粒&可以作为用于静脉内送递治疗性蛋白的载体 (参见例如，Gref"《泡舰哉167 (1997))。本领域技术人员也可以如下述文献所述地设计其他剂型，所述文献例
如,Ansel and Popovich,尸/^r鹏ce"/fcfl/ Z)os"ge Fwms朋"De//v«y 分他/ws， 第5版(Lea & Febiger 1990); Ge皿aro (编著)，及柳/wgtow's 尸/f"r應m/to/ 5We"ces，第19版(Mack Publishing Company 1995)和Ranade and HoUinger，Z>/*"g/>e//ve/3;^stemy (CRC Press 1996)。
本发明考虑了本发明的可溶性多JliU且^，以及包括本文所述的相同多肽 的方法和治疗用途。这类組^还可包M体。所述载体可为常规的有机载体 或无机载体。载体的实例包括水、緩冲溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、麻油 和玉米油等等。
K) 4^基因小鼠的制备
可对转基因小鼠进行基因工程組，以使其在所有组织中it^达IH7F、 IL-17A、 IL-17RA或II^17RC基因，或^l且织特异'Iiil组织优先性调控元件的 控制下ii^达IL-17F、 IL-17A、 IL"17RA或IL-17RC基因。可以使用这些it^ 达产物来表征由it^达导致的表型，并且该转基因动物可以作为因过量的 IL-17F、 IL-17A、 IH7RA或IL"17RC导致的人类疾病的模型。it^JiJi述任 一产物的转基因小鼠也可以作为模型生物反应器，用于生产H7RA或 IL"17RC，例如在较大动物的乳或血液中生产任一种本发明的可溶性多肽。制 备转基因小鼠的方法是^U页域技仏员乂i^p的(参见例如，Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (编著)，第111-124页，Jacob 的"Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice" (Academic Press, Ltd. 1994); Monastersky and Robl (编著)，Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995)和Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez和Hoeffler(编著)，第367曙397页，Abbud 和Nilson的"Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice，，(Academic Press, Inc. 1999))。
例如， 一种制备表达H7RC基因的转基因小鼠的方法可以使用有生育 能力的成年雄鼠(种鼠)(B6C3fl， 2-8月•aconicFarms, Germantown，NY))、 切除输精管的雄鼠(绝育鼠)(B6D2fl， 2"8月斷aconicFarms))、青春期前的有 生育能力的雌鼠(^0(B6C3fl， 4-5周斷aconicFarms))和成年的有生育能力 的雌鼠(受体)(B6D2fl， 2-4月斷aconicFarms))。 4W^it应培养一周，然后 以大约8 IU/小鼠的量腹膜内注射孕马血清促性腺激素(Sigma ChemicalCompany; St Louis, MO)，然后在46"47小时后以8 IU/小鼠的量雌内注射人 类绒^J^促性^L素(hCG)(Sigma)以诱导超排卵。在激素注射^使供沐与种 鼠交配。通常在hCG注射后13小时内iLl排卵。通it^交配次日早Ji^阴道 塞的存在以确认交配完成。
在外M术镜(surgical scope)下收集受精卵。收集输卵管并将其中的卵放 在含有透明质酸斷Sigma)的尿分析栽玻片上。将卵用透明质酸酶洗涤一次并 用Whitten，s W640培养基洗涤两次(如例如Menino and O，CIaray， Biol. R印rod. 77:159 (1986)和Dienhart^Downs， Zygote 4:129 (1996)中所述)，所述培养基已 在5% C02、 5% 02和90% N2且371C的条件下孵育过。然后将卵储存于 37rV5。/oC02培养箱中直至用于微注射。
4^^有IL-17RC编码序列的10至20^:克的质粒DNA线性化、皿纯化并重 悬于10mMTris-HCl(pH7.4)、 0.25 mMEDTA(pH 8.0)中，4吏其终浓Jl^5-10 纳;L/微升，以用于微注射。例如，IH7RC编码序列可编^^"有SEQIDNO:2 的M^^21至452的多肽。
将质粒DNA微注射至收集的卵中，所述卵被置于一滴W640培养基中并用 温热的经C02平衡的矿物油覆盖。将DNApA/V注射针头中(从0.75mmlD、 lmm OD的硼^C璃毛细管中拉出)，并注射至每个卵中。用注射针头穿透每个卵， ii^一个或两个单倍体原核中。
将皮升量级的DNA注射至原核中，在不接触核仁的情况下将注射针头抽 出。重复这一步骤直^J"所有的卵进行注射。将微注射成功的卵^^至含有预 充气的W640培养基的器官组织培养亚中，妇7t:/5V。 C02培养箱中培养过l
第二天，将双细Jte胎絲至假怀孕的受体中。在与切除输精管的绝育鼠 交配后存在交配塞的小鼠被识别为受体。麻醉受体并刮去其后背左侧的毛，将 其置于外科显微镜下。在^JUi切一小口，，开位于J^P和膝t间的腹部中 间区域的肌肉壁，所述区域«*架、后背(saddle)和后M^斤P艮定。将生殖器官 外置于一个小的外^^术布上。^J3旨肪垫在手^r上捧故，并^""个嬰JL血管 镊(Roboz， Rockville， MD)与脂肪垫相连街并挂在小鼠的后背上，以防止器官滑 回体腔。
含有矿物油并在^交^^有W640和气泡的细移液管，将12-17* 康的来自于前一天注射的双细l^胎转移至受体体内。在受体体内固定一个膨 胀的安^(ampulla)，使输卵管保持在"^和粘液嚢之间，并用28g针头在输卵 管接近粘液嚢的地亨划一划口 ，注意不要划破^或粘液嚢200880017391.0
说明书第100/165页 将移液管插入输卵管的划口中并^A^胎，允许第一个气^A^液管中逸
出。将脂肪垫轻^y^^j度，m生殖器官滑回体腔。用^缝合jt^壁并
用缝合夹夹住m。将小鼠置于371C的载物片加温器上至少加热四个小时使其
将受体^J"地放回笼中，使其M19-21天。在出生后，g昏19-21天时 断奶，将断奶后的小鼠掩性别分别饲养在不同的笼中，用干净的剪刀剪下小鼠 尾部0.5 cm作为活;^样;m用于基因分型)。
例如使用Qiagen Dneasy试剂盒，按照厂商的说明用断尾中制名^基因组 DNA。佳月PCR分析基因纽LDNA，所述PCR的引物被设计为可扩增IL"17RC 基因或勤目同质粒中$j入的可筛选标记基因。在确认动物为转基因动物之后， 通过将转基因雌鼠与野生型雄鼠一^饲养或将转基因雄鼠与一只或两只野生 型雌鼠一起饲养，使其与近亲品系回交。在幼鼠出生和断奶后，按性别分离并 断^Ci^f亍基因^^型。 、
为检验转基因在活体动物中的表达，进行了部分肝切除术.在上腹部紧挨 着剑状软骨(zyphoid process)下方进行外科准备。佳月无菌技#胸骨下切一 个L5-2cm的小切口，将肝脏左侧叶外置。4^j4-0丝线在下叶处打结，使下叶 露在体齢卜。使用无创钳夹住丝线结，并在第一个结附a置另一个可吸收的 Dexon (American Cyanamid; Wayne， N丄)的环。>^1>€1011结处^^^^^^切除， 并将大约100 mg的切下的flfl且织置于无菌培^m中。将切下的肝脏部分转移至 一个14 ml聚丙烯圆底试管中，并在液氮中i^it冷冻，在干水上#。用^ 和缝合夹缝合外^术部位，在手术后将动物笼置于37"C加热垫Ji24小时。在 手术后每天检查动物并在手术后7-10天移去缝合夹。使用RNA溶液杂交测定法 或聚合S^i^JI^"测每只转基因小鼠的IH7RC mRNA^J^K平。
除了制备it^达IL-17F、 IH7A、 IL-17RA或IL-17RC的转基因小鼠"卜， 也可以对不表iiJi述4i^r基因或表达异常低的转基因小鼠进行基因工程^。 这种转基因小IUC供了与缺少IH7F、 IL^17A、 IL"17RA或IL-17RC相关的疾 病的有用模型。如上所述，可以^^I^X^因、核酶基因或夕卜部引导序列基因 来抑制IL-17RC基因的表达。例如，为制名^[^JilL"r7RC基因的转基因小鼠， 可m述抑制序列耙向IL-17RC mRNAo制##定基因表达异常低的转基因小 鼠的方法;^本领J^技^A员已知的(参见例如，Methods in Gene Biotechnology, 第205-224页，Wu等人的"Gene Undere邻ression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies, ，(CRC Press 1997))。
104另 一种制备M不表达或完全不表达IL-17RC基因的转基因小鼠的方法 是产生这样一种小鼠，该小鼠体内的至少一个正常的IL-17RC等位基因被无功 能的IL-17RC基因所替换。设计无功能IH7RC基因的一种方法;l将另 一基因 (例如一种可筛选标记基因)插入至编码IL-17RC的核B子中。制备这种被称 为"基因敲除小鼠"的标准方法是本领域技术人员已知的（参见例如， Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice， Jacob (编著)， 第111國124页，Jacob的"Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice" (Academic Press, Ltd. 1994)和Methods in Gene Biotechnology,第 339-365页，Wu等人的"New Strategies for Gene Knockout" (CRC Press 1997))。
通过下面的非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例l IH7RC基因的表达 ^f^J^ Human Multiple Tissue Blots试剂盒(Clontech Laboratories, Inc" Palo Alto，CA)进行RNA印迹分析。用^纯化的PCR产物中产生了两个探针。使 用ZC21798(5，CGG CGT GGT GGT CTT GCT CTT 3，； SEQ ID NO:8)和 ZC21808(5，TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3，； SEQ ID NO:31辨为引 物制备第一个^4h ^^l购自Amersham(Arlington Heights, IL)的Multiprime 标记试剂盒，根据厂商的说明对该探针进#^性标记。^fMNucTrap push 柱(Stratagene， La Jolla， CA)纯化该探针。，ExpressHyb(Clontech)溶液作为 RNA印迹的预杂交和杂交溶液。在65t!下杂交过夜。在杂^^^1含有0.1% SDS和SSC的下a液洗涤印迹，每:^30分钟：在室温下用2xSSC洗涤两次， 在50X:下用(UxSSC洗涤三次，在55X:下用0,lxSSC洗涤一次，以及在65X:下 用O.lxSSOH次。结絲明IL"17RC基因在曱M、肾上腺、前列#肝 脏组织中有很强的表达，在心脏、小肠、胃和气管组织中表ii^弱。与此不同 的是，在脑部、胎盘、肺部、骨骼肌、肾脏、膝腺、脾脏、胸腺、睾丸、卵巢、 結肠、夕卜周血白细胞、脊柱、淋巴结和骨髓中没有表iiil几乎没有表达。
实施例2
PCR溯，j^jnRNA在细胞系;feUi的分布从自培养的静息细胞系和经刺激的细胞系中纯化总RNA，并才M^厂商的说 明使用Qiagen(Valencia， CA)的RNeasy试剂盒，或者使用酸-苯酚纯化方法 (Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:156-9， 1987)纯化。 Agilent Bioanalyzer测定一份样本来评估RNA的质量。如果RNA,著降解， 则不能被用于随后的第一链cDNA的制备。通iW—份RNA进行PCR测定来评 估是否存在污染的基因组DNA ， 所迷PCR的引物为 zc41011(5，CTCTCCATCCTTATCTTTCATCAAC 3，； SEQ ID NO:32)和 zc41012(5，CTCTCTGCTGGCTAAACAAAACAC 3，； SEQ ID NO:33)，该引 物扩增基因间的基因lJLDNA的iNi点。用于测定污染的基因MDNA的PCR条 件如下：2.5nl的10x緩冲液和0.5jd Advantage 2 cDNA聚合酶混合物(BD Biosciences Clontech， Palo Alto， CA)、 2ul的2.5mM dNTP混合物(Applied Biosystems， Foster City, CA)、 2.5pl的10xRediload (Invitrogen， Carlsbad, CA) 和0.5nl的20fiMzc41011和zc41012， ^f^织为25fil。循环^^:如下：941C20秒， (94X:20秒W0X:i分20秒)的40个循环和72X:7分钟的一个循环。取每种AJI的产 物各10jil进行琼脂糖皿电泳，并检测^Ji是否存在来自污染的基因^LDNA 的PCR产物。如^X^到污染的基因桑JLDNA,则铜无DNA试剂(Ambion，Inc， Austin, TX)4艮据厂商的说明对总RNA进行DNA酶降解，然后再如上所ii^ 4豫测。只有看起来不含有污染的基因IJLDNA的RNA才可以用于随后的第一 ^^cDNA的制备。
将20將来自82种人类细胞系的总RNA用水溶至98ji1，然后分为两份49ji1 的等份，^-份含有10吗总RNA，然后将它们置于两勤6孔PCR^L上。向每 一等份中加入用于第一链cDNA合成的试剂（Invitrogen First Strand cDNA Syndesis System, Carlsbad, CA): 20nl的25mMMgCI2、 10ul的10xRT緩冲液、 I(HU的O.IMDTT、 2jil的^dT、 2ul的RNAseOut。然后向来自^—细胞系的一 个等份中加A2^ll的Superscript n反转^，向相应的细胞系等份中加A2fd的 H20作为无反转录酶的阴性对照。将所有的样M下述条降孵育：25X:i0^， 42匸50辨，70t;i5糾。将样本分置于深孑L^中并用H20稀释至1.7ml。 Multipette(Saigan)^^手分多次向96孔PCR板的^""孔中分装16.5nl的等^^ 样，产生多个细胞系一次性PCR板，然后密封该板^^存于-20lC。这些板中 的^孑lyR4^自大约100ng总RNA的第一^cDNA。将82种细胞系*于两 个板上，称为阵列針18A和糾18B。使用多重PCR测定法在一系列的^Ji评估 ;tUi的第^^cDNA的质量，PCR中使用的引物为针对两个表达广泛但是丰度
106中等的基因CLTC(网M白)和TFRC(^^蛋白受体C)的引物。将网*白引 物zc42901(5，CTCATATTGCTCAACTGTGTGAAAAG 3，； SEQ ID NO:34) 和zc42902(5，TAGAAGCCACCTGAACACAAATCTG3，; SEQ ID NO:35)，以 及TFRC引物zc42599(5，ATCTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATT3，; SEQ ID NO:36)和zc42600(5，TTCTCCACCAGGTAAACAAGTCTAC3，; SEQ ID NO:37)各0.5nl，与下列试剂混合：2.5jd的1(^緩沖液和0.5^1的 Advantage 2 cDNA聚^S^^(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)、 2jil W2.5mM dNTP混合物(Applied Biosystems,， Foster City， CA)和2.5fU的 10xRediload(Invitrogen， Carlsbad, CA)，然后加入到阵列弁118A和阵列針18B 的#-孔中。循环参lt如下：94*€20秒，（94^C20^t+67X:80秒)的35个循环， 以及72匸7分钟的一个循环。取每种反应的产物各10nl进行琼脂糖凝&电泳， 并通过^M对每种细胞系的+RT孔的每种特异性基因的稳定PCR产物的存在 进树分。
通过PCR分析IH7RC的人类第一链cDNA板上的mRNA的表达，所述 PCR使用的正义寡聚引物为ZC42756(5，ctetecaggcccaagtegtgctet3，； SEQ ID NO:38)、反义寡聚引物为ZC42757(5，ttgtectgggggcctegtgtetcc3，； SEQ ID NO:39)， ^-样本的PCR^条泮为：2.5nl的10x緩冲液和0,5nl的Advantage 2 cDNA聚^H;^^(BD Biosciences Clontech, Palo Alto， CA)、 2—2.5mM dNTP^^^(Applied Biosystems)、 2.5jil的10xRedaoad(Invitrogen， Carlsbad, CA)和0.5jd的20nM正义和反义引物。循环M如下：94*C2^t， （94"Cl^j1 +66匸30秒+72^1分30秒)的35个循环，以及721C7分钟的一个循环。取每种反 应的产物各10nl进行琼脂糖皿电泳，絲过aM^tlL"17RC的阳'fci4达和阴 錄組树分。
IL-17RC mRNA在^f^广泛的组织和细胞类型的多种细胞系中都有广泛 的表达。特别地，IH7RC在非T细^卜周血细胞系（包括单核细胞、B-细齡 髓系细胞)中有持续的表达。而且，BU17RC mRNA在来源于^J统的细胞系中 也有确信的表达。表达IL-17RC的其他细胞系为阵列上存在的全部5种大肠细 胞系。
实施例3
4MRT PCR测^jnRNA在小鼠细胞系;^Lh的分布从自培养的60种静息细胞系和经刺激的细胞系中纯化总RNA，并##厂商 的说明使用Qiagen(Valencia， CA)RNeasy试剂盒，或者佳月酸-^S^纯化方法 (Chomczynski和Sacchi， Analytical Biochemistiy， 162:156-9， 1987)，或4吏用 Trizol试剂的方法(Invitrogen， Carlsbad, CA)纯H
将来自各细胞系的5ng总RNA分置于深孔96孑UUi,向每孔中加入125fd 的3M NaOAc和100nl的沉淀染^KPellet Paint)(Novagen， Madison， WI)，然后用 H20将IH^P、调至1.25ml。使用Multipette(Saigan)^手分多次向96孔PCR^！ 的每一孔中分装25jil的RNA混合物的等^^样，然后再向每孔中加入75jil乙 醇，产生多个细胞系一次性RTPCR板，然后密封该板##存于-2(^。首先将 •Qiagen(Valencia， CA)96孔离心机上以6000 RPM离心10^K以进行RT PCR筛选。将板倒扣在吸水纸上以除去上清液。用100nl的70。/oEtOH洗涤RNA 沉淀，再以6000RPM离心5分钟。再次除去上清液，并将^X干直至剩余的乙 醇完全挥发。然后将RNA沉淀重悬于15jU的H20中。
通过RT PCR来评估IL"17RC mRNA在小鼠细胞系RNA板上的表达，所述 RT PCR中使用的引物为zc38910(5，acgaagcccaggtaccagaaagag3，； SEQ ID NO:40)和zc38679(5，aaaagcgccgcagccaagagtagg3，； SEQ ID NO:41)，每个样本的 RT PCR条件同使用Platinum Taq试剂盒(Invitrogeii， Carlsbad, CA)的 Superscript One^StepPCR。循环M为：48"C30分钟的一个循环，94C2分钟， 然后是(941C15秒+551C30秒+72X:1分30秒)的35个循环，然后是72匸7分绅的一 个循环。取每种反应的产物各10nl进行琼脂糖:^电泳，并通过^^tlH7RC 的阳'l!^Ji^阴'MJii^flSf分。
鼠类IL-17RCmRNA在一些小鼠细胞系中表达，特别是_在来源于骨髓的细 胞系（包括成骨细胞系、脂肪细胞系和前脂肪细胞系）中表达。此外，小鼠 IL"17RC mRNA在来自内分泌系统的一些样本中表达，例如在il^间质细胞 系、胰岛细胞系和下丘脑细胞系、唾^细胞系和睾丸细胞系的样本中^Jio
实施例4
;kJ^杆菌中产生的pIH7F的重折叠和纯化 A)包含体分离和pIL-17F的提取
在批M酵物或m^养物中诱导菱白质的表达，在诱导后将;tM杆菌培 养肉汤置于l升的瓶中，使用Sorvall浮桶式转头离心机以3000RPM离心。使用含200 mM NaCl和5 mM EDTA的50 mM Tris^沖^(pH 8.0)洗涤细胞^ti定以 除去所有的肉汤污染物，直至上清»清为止。
然后将细胞沉淀悬浮于冰冷的^J^緩冲液(50 mM Tris pH 8.0; 5 mM EDTA; 200mMNaCl; 10。/o蔗糖(w/v); 5mMDTT; 5mM苯甲脒)中，使其在 600 nm处的光密度为10"20光密度单位。然后将该悬液在水冷务降下用APV 2000实验室匀浆器以8500-9000psi匀^3次，产生破碎的细胞，物。在4X:下， 以20000xG离心细胞，物l小时，以回收不可溶的部^(包^9。
将20000xG离心所得的包^^5Cit称重后重悬于洗涤緩冲^(50 mM Tris pH8，含有200mM NaCl、 5mMEDTA、 5mMDTT、 5mM苯曱脒)中，每亳 克包含体^J^10 ml洗涤緩沖液。通过^^OMNI国际通用转子定子狄动器 (internationalrotor stator generator)i^行匀浆得到均匀的^lt系。然后将该悬 液在41C下以2,0xG离心30分钟。重复洗涤3-5次直至上清^"清为止。
将经过洗涤的最终^tJ定溶解于含7M盐酸胍的40 mM Tris緩沖液(pH 8， 含有0.11\1皿酸钠和0.02]\1连四^^钠)中。在4X:下緩慢搅拌过夜，进行提取 和魏^)^反应。将所得的粉红色溶絲4t:下以35000xG离心l小时，然后取 澄清的含有可溶性pIL-17r的上清液以0.45nmit^。
B) pIL"17F的重折叠过程
将溶解的M酸解的pIL^7F逐滴加入冰冷的重折叠緩沖液中稀释以进行 重折叠，所述重折叠緩冲液含有55mMMES、 10.56 mMNaCl、 0.44mMKCl、 0.055% PEG(3400K)、 l.lmMEDTA、 20%甘油、0.5M盐^、 0.75 M的 精氨酸以及比例为l:l的谷胱甘狀的氧^ii原对(lmM GSH:lmM GSSG)。用 HCl将重折叠緩冲液的pH调节至6.5,并加入pEL"17F至终浓度为100ng/ml。在 稀释后，将混<^在冷室中緩慢搅拌72小时。
C) 产物回#纯化
使用实验室M^的TFF系统和10kDa截留膜，将重折叠的pIL"17F,10 倍。然后使用0.4錄米的膜过滤，通妙入乙酸将pH调节至5.1。然后使用经 it50 mM pH 5.1的乙酸緩冲液平衡的Pharmacia SP Fast Flow柱，通过阳离子 交换色谱捕获经pH调节的物质。通过将pIH7F用5倍体积的平im冲液以流 速为190 «11/小时在线(1111^)稀#^行上柱。上述稀释降低了离子强度，使得 目标蛋白与M可以有,结合。在上样完^，用平m冲液将柱洗涤至基 线吸收。然后用^0.41\1~3(:1的50111]\1乙酸緩冲^(1)115.1)洗涤柱，然后再用 ^0.4 M-1.5 M NaCl的50 mM乙酸緩沖^(pH 5.1)以5CV的梯度舰结合的蛋白。通i^t、^^分的SDSPAGE分析表明，用约lMNaCl、皿的蛋白质中有 大约85%为二聚体。混^^有pIL"17F的级分，并在Amicon搅拌池中用10kDa 截留超滤膜浓缩所述级分，制备的级^后通过分子筛色谦进行纯化并更换緩 冲液。
D) W筛緩冲^Jl换和制剂配制
将浓缩的阳离子混合物(体积为CV的3-4o/。)以30 cm/小时的流速注射到 Pharmacia Superdex 75分子筛柱上，所i^已用含有109 mM NaCl的50 mM磷 酸钠緩冲^(pH 7.2)平衡。将含有所述产物的对称、3W^用含有109 mM NaCl 的50 mM磷酸钠緩冲液(pH 7.2)稀释至浓度为1 mg/ml。 ^将pIH7F以0.2fim
ii^、除菌，分成等份并储存于"8or;下。最终的加工产量为20%。
实施例5
哺乳动物可溶性IL-17RC表姚建体的构建 编码IL-17RC【L21-K451】的PCR片段包括：5，端的与pZMP20载体序列的 优化的组织纤溶酶原激活物前原分泌前导序列编码区域重叠的部分、编码 [L21-K4511的IL-17RCI^卜结构域，以及3，端的与mFcl编码区域重叠的部分。 PCR扩增反应使用 了5，寡核苷酸 [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGC TTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT; SEQIDNO:461、 3，絲 苷酸[TGTGGGCCCT CTGGGCTCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID NO:47】和一个在之前产生作为模板的IH7RC的DNA克隆。
编码mFcl的PCR片段包fe，端的与IH7RC序列重叠的部分、mFcl编码 区域以W端的与pZMP20载体的^M^t炎病毒内核糖体iiA^位点区域重叠 的部分。扩增反应使用了5，寡核苷酸 [GACAAATACATCCACAAGGAGCCCAGAGGGCCCACA; SEQ ID NO:48】 、 3， 寡 核 苷 酸
[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCG
110GAGTCCGGGA; SEQ ID NO:49]和一个在之前产生作为模fel的mFcl的DNA克隆。
PCR扩增MM如下：94^;5*的一个循环，（94t:i^4中+55lC2^t十72t:3^t)的35个循环，以及72X:iO分钟的一个循环。将PCRIl应产物混合物用iy。的琼脂糖^M进行分离，并^^QIAquick皿Gel Extraction试剂盒(Qiagen， Cat. No. 28704)v^^Ji4^取与预期大小相符的DNA片段。
通过重叠PCR将两个PCR片^^接在-"^。两个片段的^J&提取物各取大约ljd，通过PCR扩增反应连接，所述PCR扩增反应中使用了5，寡核苷酸[GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT; SEQ ID NO:46】和3，寡核苷酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA;SEQIDNO:49】。^J^的PCR糾如下：94X^5分绅的一个循环，（94X:i^K55匸2^^+72lC3^l0的35个循环，以及72X:i0分冲的一个循环。将PCR^应产物混合物用l。/o的琼脂糖^^进行分离，并使用QIAquick很Gel Extraction试剂盒(Qiagen， Cat. No. 2870攀:^Ji提取与插入物大小相符的DNA片段。
质粒pZMP20为一种哺乳动物表达栽体，该栽体中含有一个表达盒、来自^M^t炎病毒的内核糖^iiAiL件、^EJ^膜结构域的C端截短的CD8^卜结构域、大肠杆菌复制起泉、哺乳动物可筛选标^4达^N^包^SV40启动子、增强子和复制起泉，DHFR基因和SV40终止子);以及在酿酒酵母中进行筛选和复制所需的URA3和CEN-ARS序列，所i^达盒中具有下逸亭列：MPSV启动子、用于在酵母重组之前进行线性化的Bgin位点、otPA信号肽序列。
在将质粒pZMP20与^J&提取的IL-17RC[L21-K451I-mFcl的PCR片^^酵母中进行同源重组之前，^J^Bgin消化该质粒。将100fd的感受态酵母(酿酒酵母)细胞与10fil的IU7RC[L21-K451】-mFcl插入物DNA和100 ng的经Bgl n消化的pZMP20栽糾目混合，然后将该^^转移至0.2 cm电穿:j沐中。对酵母/DNA^^进行电^t, 4^1的电源(BioRad Laboratories, Hercules， CA)设置为0,75kV(5kV/cm)、 Qoohm和25jiF。向杯中加入600jil的1.2M山梨醇，然后分别将100nl和300nl等^^样的酵母铺于两块URA-D板上，并在30匸下培养。在约72小时后，将来自一块;^Ji的Ura+酵母转^f沐重悬于lmlH20中，短暂离心以沉淀酵母细胞。细胞沉淀重悬于0.5 ml的裂解緩冲液(2o/oTritonX-IOO、 1%SDS、 100mMNaCl、 lOmMTris、 pH8.0、 lmMEDTA)中。向装有250nl经酸洗涤的玻璃珠和300nl苯酚-氯仿的Eppendorf管中加入500nl裂解;^^，凝涡振荡3^K在Eppendorf离心机上以最大4^t离心5^K取300^11^目##至新管中，加入600jil乙醇以沉itDNA，然后以最大#^离心30*。倒出上清液并用lml的70。/o乙醇洗涤J5^定。倒出上清液并将DNA沉淀重悬于30 jil含l mM EDTA的IO mM Tris(pH 8.0)中。
使用5 jd酵母DNA制品和50 nl;^杆菌细Jlfeii行电击感受态;^杆菌宿主细胞(DH12S)的转化。以2,0kV、 25 jiF和400 ohm对细Ji&^行电Jl^t。在电穿孑L^，加入l mlSOC(2。/。Bacto预胰蛋白胨(D股o，Detroit, MI)、 0.5%酵母提取物(Dtfco)、 lOmMNaCl、 2.5mMKCl、 10mMMgCl2、 10mMMgSO4和20 mM葡萄糖)，然后分别^50nl和200nl等^^洋的细自于两^LB AMP板(LB肉汤(Le皿ox)、 1.8。/。Bacto预琼脂(Dtfco)、 100 mg/L^千青霉素)上。
对用于构建体的三种DNA克隆的插入物进行序列分析并选择含有正确序列的一个克隆。使用市售的试剂盒(QIAGEN Plasmid Mega试剂盒，Qiagen，Valencia, CA)，,厂商的说明进行;k^MM粒DNA的分离。
实施例6
表达IL"17RC-CEE、 IL"17RC-CHIS和IL-17RC-CFLAG的哺乳动物可溶性
IL-17RC表ii^j建体的构建使用编码IL-17RC[L21-K451]的DNA片段(SEQ ID NO:42)和表达载体pZMP20,通itPCR和同源重组构建了含有人类IH7RC[L21-K451】和C末端标签的表i^J建体，所述C末端标签为Glu-Glu(CEE)标签、六组氨酸(CfflS)絲或FLAG(CFLAG)絲。
编码IL-17RCCEE的PCR片段包括：5，端的与pZMP20载体序列的优化的组织纤溶酶原激活物前原分泌前导序列编码区域重叠的部分、编码[L21-K451】的IL"17RCJ!^卜结构域，Glu-Glu标^^序列(Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu; SEQIDNO:53),以W端的与pZMP20载体的^M^t炎病毒内核糖^A^位点区域重叠的部分。PCR扩增反应使用了5，寡核苷酸[GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCA
TGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT ; SEQ ID NO:46】 、 3， 寡 核 苷 酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTCCATGGGCATGTATTCTTCCT TGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID NO:50】和一个在之前产生作为;^的IH7RC的DNA^隆。
PCR扩增^jL^Hf如下：94"C5^t的一个循环，（94X:i^K55lC2^11+72"3^|0的35个循环，以及72ni0分绅的一个循环。将PCR^产物混合物用1%的琼脂糖皿进行分离，并使用QIAquickmGel Extraction试剂盒(Qiagen， Cat. No. 28704)从^MJi提取与预期大小相符的DNA片段。
在将质粒pZMP20与ai^提取的IL47RCCEE的PCR片fefc酵母中进行重组之前,^J^Bgl n消化该质粒。将IOO jil的感受态酵母(酿酒酵母)细胞与lO fil
后将该:^^#^多至0.2 011电穿孔杯中。对酵母/DNA^^进行电脉沖，朋的电源(BioRad Laboratories, Hercules, CA)的i殳置为0.75 kV(5 kV/cm)、 oo ohm和25jiF。向杯中加入600^11的1.2]\1山梨醇，然后分别将100nl和300nl等^^的酵母铺于两块URA-D板上，并在30X:下培养。在约72小时后，将来自一块^Ui的Ura+酵母转^fg重悬于lmlH20中，短暂离心以沉淀酵母细胞。细J3&;冗淀重悬于0.5 ml的狄緩沖^(2o/oTriton X-IOO、 1%SDS、 100mMNaCl、 10mMTris、 pH8.0、 lmMEDTA)中。向装有250 jil经酸洗涤的玻璃3^300 jil苯酚-氯仿的Eppendorf管中加入500 jil裂解混合物，旋涡振荡3分钟，在Eppendorf离心机上以最大^it离心5分钟。和OO nl斜目絲至一愤管中，加入600 pl乙醇以沉^DNA，然后以最大餘i复离心30分钟。倒出上清液并用1 ml的70%乙醇洗涤^5D定。倒出上清液并将DNA沉淀重悬于30 fil含l mM EDTA的10mMTris(pH8,0)中。
佳J^5jil酵母DNA制品和50nl;^杆菌细胞ii行电击感受态^杆菌宿主细胞(DH12S)的转化。以2.0 kV、 25jiF和400 ohm对细胞ii行电脉冲。在电穿孑L^,加入l ml SOC(2。/oBacto丽胰蛋白胨(Difco， Detroit, MI)、 0.5%酵^:提取物(Dtfco)、 10mMNaCl、 2.5mMKCl、 10mMMgC12、 10mMMgSO4和20mM葡萄糖)，然后分别^50nl和200nl等^#的细胞铺于两块丄8 AMP板(LB肉汤(Lennox)、 1.8。/oBacto顶琼脂(Dtfco)、 100 mg/LH节青霉素）上。
对用于构建体的三种DNA克隆的插入物进行序列分析并选择含有正确序列的一个克隆。使用市售的试剂盒(QIAGEN Plasmid Mega试剂盒，Qiagen，Valencia, CA),，厂商的说明进行;t^t粒DNA的分离。
使用与上述过斜目同的过程制备带有C末端组氨酸标签(组成为Gly SerGly GIy His His His His His His (IL"17RCCfflS; SEQ ID NO:51))或C末端
113FLAG标签（组成为Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys(IL"17RCCFLAG;SEQIDNO:52))的IL-17RC。为制4^这些构^t体，3，絲苷酸不再使用SEQ ID NO:50 ， 而是使用3，寡核苷酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTCCACCAGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID NO:54】来产生IH7RCCHIS ，或使用3，寡核苷酸[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTACTTATCATCATCATCCTTATAATCGGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID NO:55]来产生IL"17RCCFLAG。
实施例7
表达IL画17RC國mFcl融^^白和IL-17RC-CEE、 IL-17RC國CfflS和
IH7RC隱CFLAGC末端标记的蛋白的可溶性IL-17RC受体表，建体的转染和表达
将三个系列的每种可溶性IU7RC融合表幼建体或具有标签的可溶性H^17RC表^建^^^200ng分别用2(KMMi的PvuI在37X:下消4。小时，用异丙醇沉淀并在1.5 mL的Microfuge管中离心。弃去上清液得到J5^定，将^^定用1mL的70。/c乙醇洗涤并在室温下放置5分钟。用Microfiige离心机将管以14000RPM离心10分钟，弃去上清液得到沉淀。然后在无菌环境下将沉淀重悬于750ji1的CHO细胞组织培养基中，在60X:下培养30分钟，然后冷却至室温。三个管中每管离心得到大约5xl()6个CHO细胞，然后将细胞用DNA培养U^液重悬。将DNA/细胞)^^置于0.4 cm内径(gap)的杯中，^^I下列^lt进行电穿孔：950jiF、高电容、300 V。取出杯中物质，》齡，并用CHO细JJ^i且织培养基稀释至25mL，置于125mL^阮中。然后#^£于振荡器上的培养箱中，以120RPM在37匸、6%0:02糾下培养。
通it^增量加入甲氨喋"^(MTX)J^OOnM，然后至l jiM，以对CHO细Jffei^行营养筛选。通过蛋白质印迹确认融M白或具有标各的蛋白的4Ji，然后将CHO细^^扩大培养并Jim^于蛋白纯化。
实施例8可綠IH7RC的表达^JUIL-17RC一Tbx的DNA片段和表M体pZMP40，通过同源重组构建含 有IL-17RC-Tbx-C(Fc9)(SEQ H) NO:64)的表达质粒。使用引物zc44531和 zc44545通itPCR扩增产生所述片段。
PCR片to-17RC—Tbx含有部分IH7RCJ^卜结构域编码区域，4U之前 产生的IL-17RC克隆作为^fe制备所述区域。所述片段包括：5，端的与pZMP40 栽体序列的otPA编码区域重叠的部分、IL"17RC区與SEQ ID NO:2的^J^酸 ^J^21至451)、连接物序列、：^lSI^割位点，以及3，端的与pZMP40载体的 Fc9编码区重叠的部分。所用PCR扩增MM如下：94X:5分钟的一个循环， (94匸l^t+55"C2^Ht+72X:3^H0的35个循环，以及721C10分绅的一个循环。
将PCR^应产物混合物用l。/。的琼脂糖^J&ii行分离，^Ht^QIAquick™ Gel Extraction试剂盒(Qiagen， Cat. No. 28704)^^Ui提取与插入物大小相 符的条带。
质粒pZMP40为一种哺乳动物表达载体，该栽体中含有一个表达盒、来 自^MA^炎病毒的内核糖^^位点(IRES)元件和^^膜结构域的C端截短 的CD8胞外结构域、；U^杆菌复制起泉、哺乳动物可筛选标i2^达单位(包括 SV40启动子、增强子和复制起彔，DHFR基因和SV40终止子);以及在酿酒酵母 中进行筛选和复制所需的URA3和CEN-ARS序列，所i^4达盒具有MPSV启动 子、用于插入编码序列的多个限制性SI^位点、otPA信号JI^列和Fc9序列。 该质粒A^lpZMP21质粒(美国专利公^No. US 2003/0232414 Al;保藏于美国 典型培*保藏中心，保藏号为ATCC# PTA-5266)构建的。
在将质粒pZMP40与PCR片段进行酵母中的同源重组之前，佳月Bgl II切 割该质粒。将100jil的感受态酵母(酿酒酵母)细胞与10fil的插入物DNA(SEQ ID NO:66)和100 ng经切割的pZMP40载体独立^目混合，然后将该^^转移至 0.2 cm电穿孔杯中。对酵母/DNA混合物进行电脉沖，使用的电源(BioRad Laboratories, Hercules，CA)的设置为0.75kV(5kV/cm)、 Qoohm和25fiF。向杯中 加入600fil的1.2 M山梨醇，然后分别将100jil和300nl等^r样的酵母铺于两块 URA-D板上，并妇0t:下培养。在约72小时后，将来自一块板上的Ura+酵母 转4沐重悬于1 mlH20中，短暂离心以i5Ci定酵母细胞。将细胞^C^定重悬于0.5 ml 的^J^緩冲液(2。/。Triton X誦IOO、 1%SDS、 100 mM NaCl、 10 mM Tris、 pH 8.0、 1 mM EDTA)中。向装有250nl经酸洗涤的玻璃珠和300fil苯酚-氯仿的 Eppendorf管中加A500nl絲;;^^,旋涡振荡3^4中，在Eppendorf离心机上 以最大转速离心5分绅。^300fil7M目转移至新管中，加入600nl乙醇(EtOH)以沉^DNA,然后以最大餘逸离心30分冲。倒出上清液并用lml的70。/。乙醇洗涤 沉淀。倒出上清液并将DNA沉淀重悬于30jil的TE中。
橫月5jd酵母DNA制品和50jil;tM杆菌细胞进行电击感受态;^杆菌宿主 细胞(DH12S)的转化。以2.0 kV、 25jiF和400 ohm对细lfeii行电脉冲。在电穿 孑L4^，加入l ml SOC(2o/oBacto^^胰蛋白胨(Difco，Detroit, MI)、 0.5%酵^^提 取物(D股o)、 10mMNaCl、 2.5mMKCl、 10mMMgC12、 10mMMgSO4和 20 mM葡萄糖)，然后分别^50jil和200^il等^^洋的细l^甫于两^LB AMP板 (LB肉汤(Le皿ox)、 1.8%BactoT^^t(Difco)、 100 mg/L^节青霉素）上。
对用于构建体的三种DNA克隆的插入物进行序列分析,并JJ?t于每个构建 体选#^含有正确序列的一个克隆。使用市售的试剂盒(QIAGEN Plasmid Mega 试剂盒，Qiagen， Valencia, CA)， 4緣厂商的说明进行;kJIL^粒DNA的分离。
将三个系列的IH7RC[L21-K451LTbxj:(Fc9)构建^^200ng分别用200 iNi的PvuI在37t:下消^3小时，用n，A;?;^定并在1.5 mL的Mcrofuge管中离心。 弃去上清液得到沉淀，将^Cit用1 mL的70。/0乙醇洗'M在室温下;^5分冲。 在Microfuge离心机上将管以14000 RPM离心10分钟，弃去上清液得到沉淀。 然后在无菌环境下将沉淀重悬于750pl的PF-CHO培养基中，在60r下培养30 ^t，然后^HP至室温。三个管中M离心得到大约5xl(^个APFDXBll细胞， 然后将细胞用DNA培养M液重悬。将DNA/细胞》'^^置于0.4 cm内径的杯 中，^J^下列^l!t进行电穿孑L: 950jiF、高电鉢300V。取出杯中物质，；給， 并用PF-CHO培养基稀释至25mL,置于125mL^fe中。然后将^fe置于振荡 器上的培养箱中，以120RPM妇7t:、 6。/。C02条件下培养。
通iti^增量加入曱^^喋^^(MTX)至200nM，然后至lnMMTX，以对细 胞系进行营养筛选。通过蛋白质印迹确iA4达，然后将细胞系扩大培养并进行 蛋白纯化。
实施例9
从CHO细胞纯化可溶性IH7RC ^J^Pellicon-n切线流过滤系统，通过两个Biomax 0.1 m2 30kD^?"量截 留膜盒(Millipore， Bedford, MA)，将来源于表达IL"17RC-TbX-Fc9 (SEQ ID NO:64)的CHO细胞的M培养基浓缩大约l晤。用水乙酸将浓缩后的培养基 的pH调节到5.5, 0.2jim过滤除菌，然后通过批色^(bateh chromatography)上 样到蛋白G sepharose fast flow^"月旨柱上(Pharmacia， Piscataway， NJ)上，4"C下过夜。在调节好pH的^培养基上样之前，该蛋白G树脂柱应先用5^柱^R (大约150ml)的平衡緩冲液(25mM乙酸钠、150mMNaCl， pH5.5)进4tM平衡。 经it^虑且调节^pH的M培养基与树脂的比例为33:l(v/v)。
在室温糾下(大约21"C)进^f沐色歉理。将姊的经过pH调节和0.22nm 过滤的M培养基倒在一个空的5,5x20.5 cm的玻璃柱(BioRad， Hercules， CA) 上并利用重力压紧。将柱用10倍柱体积(大约300ml)的平l^冲液(25mM乙酸 钠、150mMNaCl， pH5,5)洗涤。然后用100mM甘氨酸，pH2.7的溶液对结合 的蛋白i^ftpH'^Jt。收^9.01111级分并立即用1.0 ml的2,0M Tris， pH 8.0溶M 行中和。通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色对所收集的级分进行分析。将含有 IU7RC-Tbx-Fc9的级分混合，并使用5kD分子量截留Biomax^旋转浓缩器 (M皿pore， Bedford, MA)， ##厂商的说明将混合的级分浓缩大约6#"。
在41C下，^J^7kD衬量截留MSlide"A-Lyzer(Pierce，Rockford，IL)，将 ,的;^^级分用lx磷^L緩冲盐溶^(pH 7.3)(Sigma， St. Louis， MO)广:i^it: 析。将所得的含有IL-17RC-TbX-Fc9的lx磷酸盐緩冲盐溶液(pH 7«3)经过 0.22jim过滤除菌，然后分装并，于-80"C。
实施例10 IL"17A和IL"17F与人类IL^7RC的结合
A) 生物素化细胞因子与转染细胞的结合
用编码人类IH7受^KSEQ ID NO:21)、人类IH7RC(SEQ ID NO:2)或编 码上述两种受体的表达载M染幼仓鼠肾(BHK)细胞，以评估它们结^^生物素 ^A类IU7A和人类IL-17F的能力。使用乙二胺四乙酸钠^细胞、计数并在 染色培养基(SM)中稀释至l()7细J!fe/nA所述染色培养勤SM)为加入了 lmg/ml牛 血清清蛋白(BSA)、 10 mM 11印68和0.1%叠氮钠(\¥〜)的朋880用不同浓度的 生物素^A类IL-17A(SEQ ID NO:14)和人类IL"17F(SEQ H) NO:16)在水上与 细胞-"^培养30分绅。妇0^^后，使用SM洗去过量的细胞因子，并用1:100 稀释度的链亲和素缀合的藻红蛋白(SA-PE)，在水上与细胞T"^培养30分钟。 洗去过量的SA-PE，使用流式细胞术分析细胞。由细胞因子染色的平均荧光强 度计算细胞因子结合的量。我们由上述分析发现，人类IH7A以相似的程度与 人类IL-17R和IL-17RC两者结合。人类BL-17F与H^17RC结合的程度与 IL-17A相似，与DL"17R结合的程度可;^测但是^i^于IL-17A。
B) 生物素化细胞因子与人类外周jfiLJ^核细胞的结合
117人类外周jk^核细胞(PBMC)通过^^糖密度梯度离心从全血中制备。将 PBMC以107细1&/1111的密度与lng/ml的生物素化IL-17A或IH7F以及针对特定 细JI^面蛋白的荧光染料缀合的M-"^培养，所述:^^l设计用于区分不同 的白细胞<语系。这些标记物包^CD4、 CD8、 CD19、 CDllb、 CD56和CD16。 洗去过量的抗体和细胞因子，如上所itit过与SA-PE-^培养^^测特异性的 细胞因子结合。使用流式细胞术分析样本，我们由上述分析发现，人类IL-17A 几乎与所检测的所有的PBMC类群都有结合，但是人类IL-17F不能以可检测的 程度结^W细胞类群。
C) 生物素化人类IL-17A和IH7F与未标记的细胞因子的特异性结合的抑
制
如上所述iik^ii^^^^研究，不同的只是在结合反应中包括了过量的未才射己
的人类IL-17A和IH7F。在针对BHK细胞的研究中，未标记细胞因子的量在 一定浓度范围内变化，我们发5(l^入未标记的IL-17A可以与n^l7A和IL-17F 竟争性地结合EL-17RC和IL-17R。然而，未标记的IL"17F可以与IH7A和 IL"17F竟争性结合IL-17RC ，但是不能有效地与IL-17A和IL-17F竟争性结合 IL"17R。这说明IL-17A和IL-17F浙5r以与IL-17RC特异性结合，而且由于它们 可以相互竟争结合，因此说明它们的结合位点相同或者相重叠。jH^卜，IL"17f 结合IH7R的竟争能力比IL"17A要弱，这说明这两种细胞因子也是结合 IL-17R的相似区域，但;IJH7F结合IH7R的亲和力要比IL"17F结合IL-17RC 的亲和力弱得多。
D) 生物素化人类IH7A和IL-17F与可溶性n^l7RC和IL-17R的特异性结 合的抑制
如上所述Akii行结合研究，不同的只是在结合反应中包括了可溶形式的 IL-17RC或IL-17R。这些可溶性受体为来源于每种受体的胞外结构域与人类 IgGl恒定(Fc)区相融合的融合蛋白。我们发现，可溶性IH7RC可抑制人类 IH7A和IH7F两者与IH7R和IH7RC转染的BHK细胞的结合。然而，可 溶性IH7R抑制IL"17A与任一种受体的结合，但并不能有效地阻断IL"17F与 IH7RC的结合，这一结果与IH7F对IL^17R的结合力较弱的事实相一致。
实施例ll ih7a和il"17f与il"17rc的结合 AMM冷配体(Cold Ligand辦制结合用ML國17RC(SEQ ID NO:2)和IH7R(SEQ ID NO:21)转細HK细胞，然 后以40，000细J^/孔的密度将细l&^24孑Ul(Costar 3527)上培养两^进#^测 定。分别向各孔中加入10ng/ml的通过碘珠(iodobead)法被放射性标记的 IH7A(SEQ ID NO:14)和H7F(SEQ ID NO:16)，以;SJf^P、至250nI/孔的结 合緩冲液(RPMI 1640培养基(JRH 51502-500M)和10mg/ml牛血清清蛋白 (Gibcol5260-037)),实验i殳三个平4沐。以10條过量的摩尔量加入冷竟争物。 ^"测的竟争物包括IH7A、 H^17B、 IL"17C、 IL-17D、 IH7E、 IH7F和I1^21。 ^!L^水上培养1小时，然后用PBS(Invitrogen20012-027)洗涤两次，用高盐溶 液(l,5MNaCl、 50mMHEPES， pH7.4)洗^-"次。用500fd的0.8MNaOH在室 温下提取孑L30^H7，并通过yi十数器(Packard Cobra n A5005)测量每^^的计 数。
结果表明，IOO倍摩尔量的冷IH7A和IH7F可以使usi标记的IL"17A与 BHKMH7RC的结合降低大约7倍，而IL"17B、 C、 D、 E和IL"21对结合没有 影响。10(H^摩尔量的冷IL-17A可以使i勺才斜己的IL-17A与BHK IL-17R的结合 减少大约4倍，而IL"17B、 C、 D、 E、 F和IL"21对结合没有影响。100#摩尔量 的冷IL-17A和IL-17F可以使U4标记的IL-17F与BHK ML-17RC的结合分别降 低大约4#5倍，而IL-17B、 C、 D、 E和IL"21对结合没有影响。
B)使用可溶性受体抑制结合：
如上部分所iiii行hzytorl4(SEQ ED NO:2)和IL-17R (SEQ ID NO:21)转 染的BHK细胞的结合研究，不同的是使用100倍过量摩尔量的可溶性 ML-17RCxl/Fc9 (实施例8)和可溶性IH7R/Fc(获自R&D; Ref. 177-IR)^替冷
配^^^ft^:争结合。细胞的洗涤、^W^十数步骤如上部分所述。
可溶性ML-17RC/Fc可抑制u5l标记的IL-17F与BHK hlbl7RC的结合，其 IC50约为10倍过量的摩尔量(三次"^的平均值)。可溶性hlH7RC/Fc可抑1251 才射己的IH7A与相同细胞系的结合，其平均IC50约为2(HI"过量的摩尔量，可溶 性IL-17R/Fc可抑制^I标记的IU7A，其平均IC50约为2(HI"过量的摩尔量。
如上文中所述将转染的BHK细胞铺于24孔板中。加入放射性标记的 IL"17A和IL-17F，将初始浓^JiH nM的iW性椒己的IL-17A和IL-17F用结合 緩冲液以l:3的比例梯度稀鄉份至浓度为1.83pM,每孔^积为250nl，诏三 个平行样。然后分别在每个稀释度的样本中点加入10瞻过量摩尔量的冷配体。 细胞的洗涤、提^i十数步骤如上文所述。通it^^-稀^JL的非竟争状态的计数减去100倍过量时的计数，可#^分钟的特异性结合计数相对于加入的放
射性标记配体的浓度作图。将上腿过标准化的数据作图，以产生针对絲性
标记配体和转染的BHK细胞的^种组合的旨结合曲线。^J显示了由上述 4^P三组实^i十，出的亲和力值。
表7
table see original document page 120
单位点结合曲线拟合与IL"17A和IL-17F与IL-17R结合的特征最为接近。双 位点结合曲线拟合与IL-17A和IH7F与hlL-17RC结合的特征最为接近。高亲 和力结#点为上表所示的值。低亲和力结*点具有的亲和力极低，并M 三个实验中还有所不同。
实施例12
鼠类Nih3t3细胞对人类IL"17A和IL-17F的应答
A) 细l&4甫板和kzl42腺病4^告物感染。
将来源于小鼠成纤维细胞(由ATCC记载)Nih3t3的Nih3t3细胞以5000细勿 孔的密度铺于细l&^^包被的白色固体96孑L^Ji(Cat. #3917. Costar)，佳月 含有谷氨S^和添加了丙酮^ik的DMEM/10。/oFBS^板，并在37"C、 5%C02 的M下培养过夜。在第二天，移去铺板培养基并且用含有^IL,和添加了 丙酮酸盐的DMEM/P/。FBS培养基制备感染复数为5000颗粒/细胞的Kzl42腺 病毒颗粒，并妇71C、 5ynC02的M下培养过夜。
B) 萤光素酶测定，以测量kzl42腺病毒报告物感染的nih3t3细胞中IL-17A 和F的激活作用。在与腺病4^粒报告物培养过夜后，用iti^清培养^(添加有0.28。/。 BSA) 准备人类IL-17A和IL-17F配体的处理物。移去腺病4^^培养基，并加入合 适剂量的配体，设三个平行样。然后继续在37匸和5%0)2条件下继续培#4 小时，之后移去培养基并使细胞裂解15分钟，使用萤光素酶测定系统和试剂 (Cat.#el531 Promega. Madison， WI.)以及微量板发光计测量平均荧光强度 (MFI)。检测浓度范围为(U-1000iig/ml的人类IL-17A和IL-17F的活性，得出两 种配体的EC5(HlL约为50iig/ml。上述数据表明nih3t3细胞携带有上述配体的受 体，并且IL-17A和IL-17F可激活NF-KB/Ap"l转录因子。
实施例13
鼠类Nih3t3细giilH7RA和IL-17RC两者 对nih3t3 RNA进行的RT PCR分析表明，这些细胞均为IH7RA和 IL-17RC阳性，这与这些细自人类IL-17A和IL"17F介导作用有Nr-KB/Ap^1 应答相一致，所iiA类IL-17A和IL"17F介导作用是通itJi述一种或两种受体介 导实现的。
RT PCR^的A^it程：
A) 鼠类IL-17RC的PCR
使用标准方法从分离自nih30细胞的总RNA制备第一链cDNA。使用hot star聚合Sl(Qiageii， Valencia, CA)^厂商的说明进行PCR，，的正义引物 为zc38910, 5， ACGAAGCCCAGGTACCAGAAAGAG 3， （SEQ ID NO:56), 反义引物为zc 38679， 5， AAAAGCGCCGCAGCCAAGAGTAGG 3， （SEQ ID NO:57)，进4f35个循环的扩增。琼脂糖^电泳显示出预期的850 bp大小的单 个明显扩增子。
B) 鼠类IL-17RA的PCR
使用标准方法从分离自nih3t3细胞的总RNA制备第一链cDNA。使用hot star聚^Sl(Qiagen， Valencia, CA讨娥厂商的说明进行PCR,，的正义引物 为zc38520， 5， CGTAAGCGGTGGCGGTTTTC 3，(SEQ ID NO:58)， ^JL引物 为zc 38521， 5， TGGGCAGGGCACAGTCACAG 3， （SEQ ID NO:59)，进4t35 个循环的扩增。琼脂糖皿电泳显示出预期的498 bp大小的单个明显扩增子。
实施例14
表iiapl/nfkb转录因子的稳定的Nih3(3测"^jL隆的制备^^含有新霉素可筛选标记的kz142 apl/nfkb^艮告物构建g定转染如上 所述的鼠类nih3t3细胞系。以克隆密度将新霉素抗性的转染混*铺板。 克隆环分离克隆，并^^人类BL-17A配体作为诱导物通过荄光素酶测定筛选克 隆。选择具有最高平均荧光强度(MFI)(通itAp-l/NF-KB萤光素酶)和最低背景 信号的克隆。筛选出了一个稳定转染的细胞系并将其命名为nih3t3/kz142.8。
实施例15
使用可溶法IL-17RC和IL-17RA/FC嵌^^抑制鼠类Nih3t3细胞中的人类
IL-17A和IL-17F的激活作用 在萤光素酶测定中，使用可溶形式的IL"17RC或IL"17RA作为Ap-l/NF-KB 元件^CA类IL-17A和IL-17F激活的拮抗剂。这些可溶li受体狄源于每种受体 的胞外结构域与人类IgGl恒定(Fc)区相融合的融^白。可溶,1^A类IL-17R FC融^^白是商购的(重^aA类IL-17R/FC嵌^^,目录号177-IR-100， R&D Systems, Inc., Minneapolis, Mn.)。如上所^k^建可溶)^A类IL"17RC FC嵌合 物(IH7RCsR/FC9)。我们发现过量的IH7RCsR/FC9和人类IL-17RsR/FC嵌 合物抑制人类IL"17A和IL"17F两者介导的鼠类11111313/1€2142.8测试细胞系中的 Ap-1/NF-KB激活的EC50水平。
IL-17RCsR/FC9蛋白显示出最高的拮抗BL-17F激活的效力，IL-17RsR/FC 嵌*显示出最高的拮抗IL-17A激活的效力。
实施例16
在哮喘的鼠类模型中IL-17F mRNAJi调 使用小鼠的致^气ii^激模型来测量IH7FmRNA水平。通it^第0天 和第7天对各组小鼠（8至10周龄）腹膜内注射含10照重组屋尘螨 (dermatophagoides pteronyssinus)变应原l(DerPl)(Indoor biotechnologies, Cardiff, UK)的500/。 Imject Almn(Pierce)，使得动iN^t敏。在七A^，朋 含20^克DerPl的50nl PBS对小鼠进行连续三天(第14、 15和16天)的刺激。该 组为4只小鼠。阴'I^t照组为5只小鼠(佳月磷酸緩冲盐溶^(PBS)致敏， PBS刺激)。还有3只小IUlJ^DerPl致敏和用PBS刺激的组。在用变应原或对照 物刺^48小时，收集整个肺组织并分离总RNA。
使用来自每一受试者的相同量的总RNA来制备第""^cDNA。使用Qiagen hotstar聚合酶(Qiagen， Valencia, CA)根据厂商的说明进行IL"17F的PCR。IL-17F的PCR进4亍35个扩增循环，4吏用的正义引物为zc46098， 5， ACTTGCCATTCTGAGGGAGGTAGC 3， （SEQ ID NO:60)， 的^^JL引物 为46099， 5，CACAGGTGCAGCCAACTTTTAGGA3，（SEQIDNO:61)。为 了确i^所有受试者中^^t量都是均一的，使用与IL-17F扩增中相同的每种 模板的量进行P肌动蛋白的PCR。 P肌动蛋白的PCR包括25个PCR循环，偵月 的正义引物为zc44779 ， 5， GTGGGCCGCTCTAGGCACCA 3， （SEQ ID NO:62)， 使用 的反义引 物为 zcc44776 ， 5， CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG 3, (SEQ ID NO:63)。
来自DerPl致^JJ)erpl刺激(津喘刺激)的处理组中的全部4只小鼠均表现 出明显的IL-17F扩增。与此不同的是，阴'I^照组中^f5W^到微弱的IU7r扩 增，所述阴性对照包括^^Jj)erPl致^/PBS刺M理组的全部3个受^r和代 ^PBS致^/PBS刺、,3^且的全部5个受试者。对于哞喘刺激受试者而言，P肌 动蛋白扩增的强度至少与阴'I^J"照相同，&明阴'l!^t照中IL-17F扩增微弱不 是因为^1的问题。
实施例17 COS细絲染和分泌捕获
A) Cos细M染和分泌捕获测^E示，IL^17RCsR/Fc9和II^17F为受衛配 体对
^^1分泌捕获测定将人类IL"17RC(SEQ ID NO:2)与人类IU7F(SEQ ID NO:16)^目匹配。佳月可溶性IH7RCsR/Fc9融合蛋白（实施例8)作为分泌测定中 的结^H^剂。^P^有人类IL-17B、 C、 D、 E和F的cDNA并带有SV40复制起泉 的表达载体瞬时转染至COS细胞中。使用下文所述的分泌捕获测定分析 IL-17RCsR/Fc9与转染的COS细胞的结合。仫J呢察到IL-17RCsR/Fc9与人类 IL-17F的阳性结合。上i^果证实了人类IH7RC和IL-17F为受^SC/^对的这
B) COS细胞的转染
按下述步骤进行COS细胞的转染：将3fil混合的DNA和5nl的 Lipofectamine™&92nl无血清DMEM培养J^500ml DMEM中^5mg丙酮酸 钠、146mgL画谷氨itfe、 5mg^4^蛋白、2.5mg胰岛素、lng琳5mgj^球蛋白） 中混合，在室温下培养30分钟，然后再加入400nl的^iL清DMEM培养基。将 500nl的上述^^加入到每孑L4煮有1.5xl05个COS细胞的12孑li且织培养板上，在37"C下培养5小时。加X500nl的20。/oFBS DMEM培养1^500ml DMEM中含 100mlFBS、 55mg丙酮酸钠和146mgL^^tj^^)并培养过夜。 C)分泌捕获测定
按下述步骤进行分泌捕获测定：用PBS洗去细胞上的培养基，然后用含 1.8。/。曱醛的PBS固定细胞15分钟。然后将细胞用TNT(0.1MTris-HCL、 0.15M 〜狂(:1和0.05%1界6611-20，溶于H20)洗涤，用^0.1。/oTriton-X的PBS透化15分 钟，再次用TNT洗涤。用TNB(O.lMTris-HCL、 0.15M〜3<:1和0.5%封闭试剂 (NEN Renaissance TSA-Direct试剂盒)，溶于H20)封闭细胞1小时，并再用 TNT洗涤细胞。将细胞与lng/ml的人类IL47RCxlsR/FC9可溶性受体融合蛋白 -"^培养1小时，然后用TNT洗涤细胞。再将细胞与1:200稀释度的山羊抗人类 Ig-HRP(Fc特异性的)抗体^^培养l小时。然后再次用TNT洗涤细胞。
将荧光素酪胺(fluorescein tyramide)试剂以l:50稀释于稀^^冲^(NEN试 剂盒)中并与细胞~-^培#4"6分钟，再用TNT洗涤，从而检测阳性结合。将细 胞用TNT以l:5稀释并保存于Vectashield Mounting培养基(Vector Labs Biirlingame，CA)中。^J^FITC滤光片在荧;5LE微镜下观察细胞。
实施例18
鼠类抗人类IL"17RC单克隆抗体的制备
A.用于制备抗H^17RC抗体的免疫 1.可溶組画17RC-muFc
使用25-50ng的可溶性人类IH7RC-muFc蛋白（实施例23)与Ribi佐剂 (Sigma)以l:l(v:v)混合，以隔周免疫方案对六周龄至十二周龄的正常小鼠或 IL-17RC基因敲除小鼠进行JM内注射免疫。在第三次免g七至十天，取眶 后血的血样并收集血清，用中和测定(例如，如本文所述)评估其抑制EL"17或 IL-17F与IL-17RC结合的能力，并且用FACS染色测定评估其对IH7RC转染 的293细J^未转染的293细胞的染色能力。继续如上所g对小鼠进行免疫、 ^jk#^Ht直至中和效价达到平台为止。此时，向具有最高中和效价的小 鼠血管内注射含25-50ng可溶性IL-17RC-Fc蛋白的PBS。三A^， ^il些小鼠 的脾脏和淋巴结以用于产生杂交瘤，杂交瘤的产生可以例如〗吏用小鼠骨髓瘤
(?3-乂63-~8.653.3.12.11)细1^^4^^1合的细胞系，^H狄M域已知 的标准方法(例如参见Kearney, J.F. et aL， J ImmunoL 123:1548-50， 1979;和 Lane， RD. J Immunol Methods 81:223-8， 1985)。IL-17RC-CEE 、 IL-17RC-CfflS 、 IL國17RC-CFLAG
使用25-50將的可溶性人类IL"17RC-CEE 、 IL-17RC-CHIS或 IL-17RC-CFLAG与Ribi佐剂(Sigma)以l:l(v:v)混合，以隔周免妙案对六周龄 至十二周龄的正常小鼠或IL-17RC基因敲除小鼠进行蒯度内注射免疫。在第三 次免疫后七至十天，提取眶后血的血样并收集血清，用中和测定(例如，如本 文所述)评估其柙制IH7或IL-17F与IL-17RC结合的能力，并且用FACS染色测 定评估其对IH7RC转染的293细I^未转染的293细胞的染色能力。继续如上 所iitoH、鼠进行免疫、^Ufa^MHf估，直至中和效价ii^J平台为止。此时， 向具有最高中和效价的小鼠血管内注射含25-50照可溶性IH7RC即 IL國17RC-CEE、 zcytor-CHIS或IL"17RC-CFLAG抗原蛋白的PBS。三^,取 这些小鼠的脾J3i^淋巴结以用于产生杂交瘤，杂交瘤的产生可以例如使用小鼠 骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细Jte，本领J^t合的细胞系，^H^W 域已知的标准方法(例如参见Kearney, J.F. et al.， J Immunol. 123:1548-50， 1979;和Lane， RD. J Immunol Me也ods 81:223-8， 1985)。 3.表达H7RC的P815转染体
对六周龄至十周龄的雌性DBA/2小鼠进行舰内注射免疫，注射lxl()S转 染的P815活细氣例如？815/11^171«:细1&(例如注射0.51111，细胞密度为2xl05 细^/ml)。注射前应使细胞维持于指lti长期。为用于注射，收集细胞并用PBS 洗涤三次，然后以2xl()S细胞/ml的密度重悬于PBS中。在这一模型中，小鼠会 在2-3周内U腹水瘤，如果没有产生针对转染的^^的免C^答，小鼠将 在冬6周内死亡。在三周内，对于腹部没有明显肺JI^(腹水的标志)的小鼠按照上 述方法以2-3周的间隔再次免疫。在第二次免疫后七至十天，取眶后血的jfi^ 并收集血清，用中和测定(例如，如本文所述)评估其抑制IL-17或II^17F与IL-17 或IL-17RC结合的能力，并且用FACS染色测定评估其对IL"17RC转染的293细 胞和未转染的293细胞的染色能力。继续如上所^对小鼠进行免疫、：|ufa# ^H古，直至中和效价达到平台为止。此时，向具有最高中和效价的小IUM 内注射lxl()S转染的P815活细胞。四天后，恥逸些小鼠的l^^r淋巴结以用于 产生杂交瘤，杂交瘤的产生可以例如使用小鼠骨髄瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 细胞或其他本领域适合的细胞系，并使用本领域已知的标准方法(例如参见 KearneyJ.F.et al.，见上文;和La股凡D.见上文)。另 一种代替对转染的P815活细J3&ii行免疫的方法包括以每2-3周的频率腹 膜内注射1-5乂106经辐照的转染细胞。在这种方法中，动物不^^jt并死于J^水
答，从第:次免疫后开始^#进行监测: 一;中和效价达到最高水平，则;
具有最高效价的小鼠]«内注射5乂106经辐照的细胞，进#^融合，四A^， ^it些小鼠的脾J3i^淋巴结以用于产生杂交瘤，杂^t的产生可以例如使用小 鼠骨髄瘤(？3-乂63-^8.653.3.12.11)细絲^^^£合的细胞系，^Ht^I本 领域已知的标准方法(例如参见KeameyJ.F.et aL，见上文;和Lane凡D.见上文)。
B.筛选杂交瘤融合体以获得结合IL-17RC并抑制IL-17或IL-17F与 IL-17RC结合的抗体
在融合后8"10天，对杂交瘤上清液进行三种不同的原代筛选。对于第一种 测定，使用HRP-缀合的山羊抗小鼠K^^^^^^(second step reagent),通 过ELISA方法，检测上清液中抗体与结合在板上的可溶性人类 IL画17RC(IL-17RC-muFc、 IL画17RC國CEE、 IL-17RC國CfflS或n^l7RC-CFLAG) 蛋白结合的能力，以识别结合的小鼠M。为证实IL-17RC融^"白的IH7RC 部分的特异性，就与相同的鼠类Fc区域(mG2a)、 EE序列、HIS序列或FLAG 序列融合的非相关蛋白，对初始测定中呈阳性的上清液进fr^H古。这些上清液 中与IL-17RC-融^^白结^a是不与含有muFc或^f&蛋白的非相关融^"白 序列结合的抗/^皮认为是特异性针对IH7RC的抗体。对于第二种测定，通过 ELISA对所有杂交瘤上清液中的^Mfp进行测定，评估它们抑制生物素4匕人类 IL-17或生物素化^AjllL"17F与结合^Ui的IL"17RC-muFc或IL"17RC-融合 蛋白结合的能力。
继续检测所有上清液——无论它们在ELISA测定中是否能抑制h7或 IL17F与IH7RC的结合——以测试它们抑制IL-17或IL-17F与IL"17RC转染 的BaC细胞或BHK细胞或正常人类支气管上皮细胞的结合能力，所述上清液 中含有特异性针对IH7RC的抗体。继续通过FACS分冲/Hf估所有在IL"17和/ 或lH7r抑制测定中呈中和阳性的上清液，以评估它们对IH7RC转染的Baf3 细J!&^BHK细胞以M未转染的Baf3细Jf^BHK细胞的染色能力。设计这一 分析的目的是证实对IL-17或EL"17F与IL"17RC的结合的抑制作用确实是由特 异性结合il-17rc受体的抗体产生的。jHJ卜，由于facs分析中佳州抗IgG抗体 作为二抗，因此特异性的FACS阳性结a明该中和抗似艮可食^于IgG类抗体。通iih述手段识别了一个原始孑L(master well),该孑Ljfe^合ELISA测定 中可结合IL-17RC、在基于ELISA的抑制测定中可抑制IH7或IL-17F与 IL-17RC的结合、可分别阻断IL-17和II^17F与IL^17RC转染Baf3细J^BHK 细胞的相互作用，并JL^使用抗小鼠IgG二抗的IU7RC转染的BaG或BHK 细胞染色测定中呈强阳性。
第三种分析中使用了表达H^17RC并可响应于IL^17F处理而被诱导分泌 IL-8或IL-6的原代人类支气管上皮细胞。测定了特异性单克隆抗体抑制IL"17 或IL-17F刺激这些细胞产生H^8或n^6的能力。如本文所逸地测定了对EH7 或IL-17F应答而产生的IL-8和IL"6。
或者，可以佳月单克隆,；抗IL"17RC介导的对IL-17或IL-17F诱导NIH 3T3细MM含有IL-17RC的细胞产生愛光素酶的抑制作用测定，来代替上 述生物活性中和测定的一种或与上述生物活性中和测定的一种一^f吏用。在 NIH 3T3细胞中的NF-kb介导的萤光素酶测定在本文中^Mf所描述。
C) 产生抗IL-17RC特异性抗体的杂交瘤细胞的克隆
使用标准的低密度稀释(通常少于l细胞/孔)方法来克隆产生特异性抗 IL-17RC mAb的杂^Jt细胞系，所述特异性抗IH7RC mAb可交叉中和IL"17 和H^17F与适当转染的BaF3细MBHK细胞的结合。在铺M约5-7天，通过 ELISA筛选克隆，例如可以利用结合有人类BL-17RC-muFc的板，然后再如上 所ii^itELISA对含有muFc的非相关融^"白进行阳性孔再测试。筛选其 上清液能结合IL-17RC-muFc^是不结合含有muFc的非相关融^^白的克隆， 并通过重复进行中和测定以及FACS分析进一步确认特异性M活性。将所有 筛选出的IH7RC抗体阳性克隆至少克隆两次以确M品系纯度(clonality)，并 评估絲产生的稳定性。继续如上所iiiikii行;L^克紗筛选，直JJL1^至 少95。/。的所得克隆都能够中和抗IL"17RC私沐的生产。
D) 被抗IL-17RC mAb识别的分子的生物化学表征
通过标准的免疫沉淀技术以;SJSDS-PAGE分析或蛋白质印迹方法，以生物 化学手段确认被推定的抗IH7RC mAb识别的耙分子IL"17RC确实是 IL-17RC，在上述分析中均使用了来自于IH7RC转染的和未转染的BaB细胞 或BHK细胞的可溶性膜制品。jHW卜，^^1表^IL-17RC的未转染细胞系的可溶 性膜制品，以显示mAb可识别天然受体链以及转染的细胞。或者，测试mAb 与可溶性IL-17RC-muFc^白进行特异性免疫i^定或进行蛋白质印迹的能力。实施例19
^A类IL-17RC转染的P815细胞注射小鼠，并使用来源于该小鼠的血清中
和人类IL"17RC
使用基于细胞的中和测定，将来自^v类IL-17RC转染的活P815细胞(实 施例17)注射的小鼠的血清进行系列稀释，稀释后的浓>^1%、 0.5%、 0.25%、 0.13%、 0.06%、 0.03%、 0.02%和0%。将测定;^L37。C、 5。/oC02糾下培养 4天，然后以20jil/孑L^AAlamarBlue(Accumed, Chicago, IL)试剂。将效'J定^L再 在37。C、 5"/oC02条件下培养16小时。结果显示，来自四只动物的血清可通过 人类IH7RC中和人类IL-17和人类IL"17F的信号传导。
上述的结果提供了进一步的iSL^明，例如通it^发明的抗IH7RC中和 性单克隆抗体，通过结合、阻断、抑制、减少、拮抗或中和IH7或IL^7F活 性(单独M共同地)，可以有^U4阻断IL"17RC，这样可有利地I^f氐体内IL"17 和IL-17F的作用(单独地或共同地)，并可以减轻由IL-17和/或IL-17F诱导的炎 症，例如，在例如下述的疾病中观^^到的炎症：银屑病、IBD、结肠炎、慢性 阻塞'J^病、嚢性纤维化病，或者头他由IL-17和/或IL-17r诱导的炎性疾病， 包括IBD、关节炎、哮喘、银屑病关节炎、结肠炎、炎性M病和特应性皮炎。
实施例20
^A类IL-17RC单克隆M的药物代谢动力学 将待测的单克隆抗^^A类IL47RC mAb分装为例如3x3 mL的等分 试样，浓^大约1 mg/mL(通it280 nM处的UV吸收测定)^^存于"80。C直至 4M。载体为lxPBS(50mMNaPO4、 109mMNaCl)，pH7.3。在用前将mAb在 室温下融化，并将,1和2分别用于100照的IV和SC剂量组。将"^#3的一半 用1XPBS以1:2稀释以用于50ng的SC剂量组，将^#3的另 一半用1XPBS以1:10 #^释以用于10ng的SC剂量组。雌性SCID小鼠(11=96)获自Charles River Labs。 在收到动物后确{人其#^状况，并^E饲^(每笼中3只动物)。开始研究时，小 鼠达到12周龄，平均体重为大约22g。
A) 给药方案
将雌性SCID小鼠随机分为四个剂量组(^'J量组n-24)(^8)。第1組通# 尾静脉IV注射约93nl给予^AJIlL^7RCmAb，第2、 3和4组通it^颈背SC注 射约93nl给予^AJIlL"17RC mAb。
B) 样本采集
128在纽前将小鼠用！U^或异絲充分麻醉。在各时间点(除168小时的时间 点"卜)通过心脏穿刺采集血洋，在168小时的时间点通过眼部iUiiMK同一只 动物在504小时的时间点通过心脏穿刺再次ifciL)。将血样收集于血清分离管中 并妙15^t使M结。然后将样本以14000rpm离心3分冲。在离心后，将样 本分为125-150nL的等份分^^标记好的eppendorf管中，并立即储存于-80。C 直至^^斤时。
勤
table see original document page 129

*在168小时和504小时的时间点佳月相同的动物。
C) 通itELISA对血清中^A类II^17RC mAb的浓度进行定量 在药物代谢动力学研究中佳月酶^Ut疫吸附测定(ELISA)，以定量分析来
自给予过抗IL-17RC mAb的动物的小1>清样本。这一测定的设计利用了市售 的4和TMB比色检测。对用于标准曲线的稀释度进行了改变，以改进标准 曲线的线性部分的清晰度。使用泉变范围为100ng/mL至0.231ng/mL的二倍稀 释标准曲线，可以对小IA清样^Ui行定量测定。 ^QC样本用10。/。的SCID小 !>、>^#释100倍、100(H^和10000倍，并##标准曲线进行回复计算。
D) 药物4^t^力学^^斤
将血清浓度对时间的数据下载至WinNonlin Professional 4.0软件 (Pharsight， Inc.; Cary， NC)中以进行药物代g力学分析。^^1无房室分析， 基于^-时间点的平均数据确定药物代谢动力学WL
实施例21200880017391.0
用基于细胞的中和测定，将纯化的小鼠^A类IL-17RC单克隆^ii行 连续#^^^加入，例:M^释后的浓y^lOng/ml、 5ng/ml、 2.5fig/ml、 1.25ng/ml、 625ng/ml、 313ng/ml、 56ng/ml和78ng/ml。将测定;M^37。C、 5。/。C02^Hf下 培#4天，然后以20nlAJL^AAlamarBlue(Accumed， Chicago, IL)试剂。将测定 板再在37。C、 5。/。C02条件下培养16小时。这一测定的结果可以证明，纯化的 ^A类IL"17RC单克隆抗体可通itA类IL-17RC中和人类IL-17和人类IL-17F 的信号传导。对于高效私体而言，在以约10ng/ml的浓度使用时，M可以完 全中和由人类IL"17或人类IL"17F诱导的增殖，而JL^较低浓度时增殖的抑制 以剂量依赖性方式下降。以上述浓JL对同种型匹配的阴'J^J"照小鼠mAb进行了 测试，：«期的一样没有产生对^~"种细胞因子诱导的增殖的抑制。上述结果 可以ii一步证实，针对IL-17RC的单克隆抗体在低浓度时就确实可以拮抗促炎 性配体IL-17和IL"17F的活性。
实施例22
IL-17A诱导IFN"7^TNr-a^A类外周jki^核细胞中水平的升高 通过聚蔗糖密度梯度离心纯^A类外周血单核细胞(PBMC)，并在37。C下 将它们单纯用培养基培养、或与50 ng/ml抗人类CD3抗体一起培养或与50 ng/mt^A类CD3^/^加上l卩g/ml^A^类CD28^的组^^-"^培养。建立了 用于上述每种培养条件的复制培^并且在培养物中加入细胞因子、加AJ5 ng/ml/v类IL-17A或加A25iig/ml^类IL"17F的^K在培养24小时后，收集每 种培养物的上清液，并使用B-D Bioscience，s人类Thl/Th2细胞计数^l阵列 (CBA)测定细胞因子含量。我们发现培^可被抗CD3抗体或抗CD3抗体+抗 CD28抗体刺激，并且添加IH7A的培养物与不加入细胞因子或加yNJL-17F的 培#相比，IFN—TNT"a的水平显著提高(每种提高3-5倍)。^M^入抗CD3 抗体刺激的培#^没有显示出细胞因子水平的明显改变。jH^卜，《吏用CBA测定 发现，加AJL-17A并未诱导^fe细胞因子(包括IL-2、 IL-4、 IL"5和IL"10)水平 明显改变。上^^明IL-17A而非IL"17F能够增加抗CD3^il抗CD3抗体 +抗。028#刺激的？8]\1(:培养物中1^\—1^-0[的产生。
实施例23鼠类代月HmlL-17RA-Fc^小鼠J^^诱导的关节炎(CIA)^型中降低疾病的
发病率并g疾病进程
A) 小HM^诱导的关节炎a:iA)^型
关节炎的CIA模型是一种用于评价药物(例如本文所述的IL"17RC和 H7RA/RC蛋白对治疗人类关节炎的潜在疗效的合it^^p的模型。在CIA 模型中，发现与未患关节炎的小鼠其淋巴结核足爪内的水平相比，关节炎小鼠 的受影响胭淋巴结和足爪内的鼠类IL"17A和IL"17F的inRNA水平显^h高(升 高了10-2(HI"; p< 0.001)， i^ii一步说明这一模型可用作IL"17A和n^l7F有影 响的疾病模型。由于mlL-17RA-Fc能够中和鼠类IU7A和IL-17F，这与人类 IL"17RC或IL-17RA/RC能够结合人类IL-17A和IL-17F的特征相类似，因此 mlL-17RA-Fc蛋白是本文所述的IL47RC和IL-17RA/RC蛋白的合适的代用 物。
在这些研究中使用八至十周龄的雄性DBA/lJ小鼠(Jackson Labs,每只约 25-30克)。在第-21天，在动物尾部皮内注射100 jil用弗氏完全佐剂配制的l mg/ml鸡II型胶原(由Chondrex， Redmond, WA生产)，三周后(第0天)#次进行 相同的注射，所不同的是这一次使用弗氏不完4^剂配制.在第二^M^、注射
后动物开始表现出关节炎症状，大多数动物在l-2周内发生炎症。每只足爪的
疾病的程度按下述方式评估：使用测径器测量足;i^f度，并对每只足爪进行临
床评^(0-3): 0=正常、0.5=足^1炎、1=^>^1爪炎症、2-中^t爪炎症、3= 重^A爪炎症，详见下文。
B) 监测疾病
这一模型中疾病的发病率通常为95-100%，也^JU^M 40只动物的研 究中，通常有0-2只动物没有^jL(通过6周的观察后确定)。注意到在炎症开始 时，通常会出现短期程度各异的低等MA爪炎^^足尖炎症的现象。因此，在 发生明显的持续的足/MtJi^^前，并不i人为动物确实具有疾病。
每W所有动物进行观察，并通ii^"每只足;Mi行定性临床评分来评估它 们足爪的疾病状态。每天^^其临床疾病状态对每只动物的4只足;M^t^分。
为确定临庙if"分，可将足爪分为3个区域：足尖、足;f^身(前足(ma肌s)或后 足(pes))和腕关节或踝关节。观察相对于上述区域的炎症范围和严重程度，包 括：X!?^只足尖的肿胀；趾曱撕絲足狄红；注意^fi-足爪中水胂或发红 的任何表见；注意自或骨的良好解剖学分界的^T缺失；评估腕关节或踝关 节的,水肿或发红；以及注意炎症是否向上延伸到附近的腿部。1、 2或3的
131足爪评分首先U于严重程度的总体印象，其:^A基于炎症涉及了多少区域。 临>^评分的标准示于下文。
C)临床评分
0=正常
0.5=炎症涉及一个或多个足尖，但是只有足尖发炎
1=涉M爪（l个区域）的轻度炎症，并可能包括一个或多个足尖
2=足爪中度炎症，并可包括一^分足尖和/或J^/踝关节(2个区域）
3=足爪、腕/踝关节和部分或全部足尖重度炎症(3个区域）
Mii^当足爪炎症的定性评分为l分或更高时，^C确定确实患有疾病。 一JS^认患有疾病，则记录当天的日期并将期旨定为该动物"确实患有疾病"的
第一天，同时开始治疗。^^PBS或不同剂量的mlL-17RA-Fc(150將；75照；25 照或IO照)治疗小鼠，将所述mlH7RA-Fc用PBS稀释至所需浓度并通iti.p. 给药，每两天给药一次，共给药5次。
在实验全程中采集血液以监测抗J&^抗体的血清水平以;SJ^疫球蛋白和 细胞因子的血清水平。在最后一次(第5次)治疗后的48小时(此时约为疾病发病 后第ll天)处死动物。采集血液以取得血清，并将所有的足爪收集到10。/oNBF 用于组织学研究。收集血清并冻存于"80。C用于免疫球蛋白和细胞因子测定。 经m!L-17RA-Fc治疗的小鼠各组的平均足爪评分示于下^9。
勤.经m!L47RA-Fc治疗的CIA模型小鼠各组的平均足爪评分
table see original document page 132

注：第l天为治疗开始的第一天；每两天通itip.注射给予治疗。数据表示为平 均值+SEM。
*与PBS治疗的组的平均足爪评分有J^性差异(p < 0.05)。
经iimlH7RA-Fc治疗的小鼠与用PBS治疗的小Ii目比，在临床评分的严 重程^Ji^在剂量^l性的显著下降。使用IO jig mlL-17RAFc治疗的小IA 现出^^性最低的疗效(即在10天的治疗中仅有3只小IL^现出^^疗效)。当使 用重复性量JLANOVA进行分析发现，佳月10和25照m!H7RAFc治疗的小鼠与PBS治疗组相比，随时间的趋势有显著差异(p < 0.05);使用75或150照 mlL-17RAFc治疗的小鼠与PBS治疗纟^目比，随时间的趋势有M著的差异(p < 0.001)。 ^J^mlL"17RA-Fc治疗的小lLii^现出剂量,性的患病足;Mt量 的减少，患病动物与未患病的预^(prebled)动物相比较，在^C^束时测量 的所有血清细胞因子(IL-ip、 -6、 -10、 -12、 -15、 17、 IP-IO、 GM-CSF、 TNF>a、 MIP-la、 MCP、 KC和RANTES)的血清水平均升高。^^ImlL-17RA-Fc治疗 后，细胞因子IL-ip、 -6、 -10、 -lS和MIP-la的血清水平比PBS治疗组低。在使 用150照mlL-17RA-Fc治疗的动物中观察到上述1^#^>^大也^^著。在试 验结束时测量发现mlL-17RA-Fc的血清水平呈剂量依赖性的升高。组织学分析 证实，在关节炎症和关节损害方面M现出剂量依赖性的降低，使用75 jig mlL"17RA-Fc治疗的小鼠组表现出显著性降低，p < 0.01;使用150將 mlL-17RA-Fc治疗的小鼠^E^L出最大的疗效(p < 0.001)。
通过对血清进行ELISA分析发现，所有患病的动物的抗^f、抗体的水平均 比预取血的动物高。在各治疗组之间未发现显著性差异。
总而言之，上述结果表明，本文所述的人类IL-17RC和IL"17RA/RC蛋白 的鼠类^J^！物(例:WiIL-17RA-Fc)能够,与这一合适的关节炎^t型相关的炎 症以及降低疾病发病率并緩解疾病进程，因此表明人类IL47RC和 IH7RA/RC蛋白具有治疗A^类关节炎的效力。
实施例24
IL"17RC在表iiapl/nfkb转录因子的鼠类测定细胞系Nih3t3/kzl42.8中的稳定
狄达
^J?l含有人类IL-17RCxl(SEQ ID NO:2)和甲氨喋呤抗'錄因(二氯叶酸还 原酶，011111)的表达载体转染鼠类11*313/1«142.8测定细胞系，使用市售的试 剂盒(Mirus，Madison，WI. Cat.弁MIR218)并^厂商的说明进行上述转染。将 细胞置于添加有ljiM mtx的生"^"养基中培养，以针对含有人类IL-17RCxl转 基因的表达栽#^^行筛选。在筛i^得到人类IH7RCxl转染混合物，并将其 命名为nih3t3/kzl42.8/hcytorl4xl。
AVf^lnih3t3/kzl42.8测定细胞系进行萤光素酶测定
由于11也3«/1«142.8具有稳定的1«142报告物，因此无需佳月腺病毒感染来 加AJ1—报告物。这样就简化了愛光素酶的测定步骤，M的测定步骤如下：将111113(3/1«142.8细胞以5000细勿孔的密>1铺于细1&^辆包被的白色固体96孔板上(Cat #3917. Costar),使用含有谷氨酰胺和添加了丙酮酸盐的DMEM/l(T/oFBS铺板，妇7。C、 5。/。C02的条件下培养过夜。在第二天，移去铺板培养基，更换为含有谷氨酰胺和添加了丙酮酸盐的DMEM/1。/。FBS培养基，并在37。C、 5。/。C02的糾下培养过夜。
2.萤光素酶测定，以测量H^17A和F对稳定的kzl42报告物的激活在用DMEM/P/。FBS培养基培养过夜后，用无血清培养基(添加有0.28%BSA)稀释人类IL-17A和IL-17F配体。在加入配^#释液后将细胞在37。。和5%0)2糾下培#4小时，然后移去培养基^H吏细胞,15辨，<^萤光素酶测定系统和试剂(Cat翻1531 Promega. Madison， WL)和微量^JUB十测量平均荧光强度(MFI)。检测浓度范围为0.1-1000ng/ml的两种配体的活性。nih3t3/kzl42.8/hcytorl4xl转染混合物表现出的对于鼠类IL-17A配体的活性与母细胞系相似(实施例14)。然而，cytorl4xl转染体^^^J(L出增高的对于人类IL-17A和F处理的应答性，甚至即使在上述配体浓度^f^20飞克时也有上述作用。mlL-17A的信号传导与母细胞系(实施例14)^目似这一事实表明，表iiA类IL-17RC的细胞并没有常见的非特异性问题，而且鼠类IL-17A很可能是通过内源性鼠类nih3t3细胞的IU7R或IL"17RC受^f^^行信号传导的。因此，人类IL-17A和IL-17F在如此低的配体浓度下导效JVIFI提高的这一事实可食汰明，细!^j"于那些配料有特异性的高应答性，这是通过狄达的人类IL-17RC受体介导的。
这一结果具有重要的临#生物学方面的意义和应用。例如，生理环境可能导ftlH7RC受体局部上调，而这^^吏得该区域对于IL-17A和IH7F有高应答性，从而导致在配体浓度非常低时产生生物激活，该配体浓度比没有
IL-17RCit4达时所推测的配体浓度低得多。因此，仅需要极低的可溶性受体水平就足以拮抗上述假设的较低的配体浓度，这种极低的可溶性受体水平比本领域技#员以前认为的或>^人的水平^##多。
实施例25
IL-17F和IL-17A活性的拮抗剂降低炎性肠病(IBD)^型的疾病发病率并减緩疾
病进程
这一模型被设计为显示来自患有IBD的患者的培养的肠组织所产生的炎性介质的水平要高于与来自^Xt照者的组织。这种升高的炎性介质(包括但不限于IL画1P、 IL~4、 IL"5、 IL-6、 IL~8、 IL画12、 IL-13、 IL~15、 H7A和F、IL-18、 IL-23、 TNF-a、 IFN个MIP家絲员、MCP-1、 G"和GM-CSF等等）水平通过它们激活炎性途径和下游效应细胞的作用加重了与IBD例如克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC0目关的症状和病理。上述途径和組分则可导致在体内，膽到的组织和细1^员伤/破坏。因此，这一模型可^^以IBD的炎性介质升高的特征。而且，絲在上述炎'^且分的糾下培养来自^fc^t照者或来自人类肠上皮细胞(IEC)细胞系的肠组织时，可以X!^炎性途径的信号传导以^Si且织和细胞损伤的迹象。
可能在体内对人类IBD有效的疗法也应该能通过抑制和/或中和炎性介质的产生和/或存在而在上述的离^JEC模型中起作用。
在该模型中，从经历肠组织活^再切片的^^对照者或IBD患者身上，或从死后的尸体组织中采集人类肠组织并使用改进的Alexakis et al (Gut53:85-90; 2004)的方法对采集的组织进行处理。在无菌M下^^大量的PBS小心地清洁样本，然后使用完全组织培养^(加入抗生素以抑制细菌it^长）培养组织碎片。对来自相同的组织碎片^^的样本分别用下述物质处理：栽体(PBS);重纟^aA类(rh)IL-17A; rWH7F;或rhlH7A+rhlL-17F。此外，还对上述样^^分别佳月或不佳月IH7A或IL^7F的拮抗剂进行处理，所述拮抗剂为单一拮抗剂或联合拮抗剂(例如可溶I4IL"17RC)。同样按照这一实验过^行人类IEC细胞系的研究，只是^^财的细胞偸液直接进行细M代。在不同的培养时间点(从l小时至几天)，分别收集上清液并分析其中炎性介质(包括上述的炎性介质)的水平。来自IBD患者的样^iW^1 rH7A和/或F处理的样本与^Mt理的^J^J"照组织样^目比，其中的炎性细胞因子和趋化因子水平升高。加入IL-17F和/或IL-17A活性拮抗剂（例如EL^17RC的可溶性受体和抗IL-17RCM，包括本发明的抗人类IL"17RC单克I^中和^9^^降欣了炎性介质的产生，因此，可预期它们食沐效治疗人类IBD。
实施例26
疾病进程
多发'l!i^化(MS)是一种被认为由多种因素介导的复杂的疾病，所述因素包括存在淋巴细J^单核细胞的炎'峻润和整个CNS的脱髓鞘作用。小赠细胞是存在于中枢神经系统(CNS)中的巨噬细,细胞，它在损伤或感染Bt^L活。
135小胶质细J^各种CNS疾病包括MS中起重要作用，并可^！于研究疾病的发生、^L^和治疗机制(Nagai et aL Neurobiol Dis 8:1057-1068; 2001; Olson et aL JNeurosciMethods 128:33-43; 2003)。因此，可以佳J^永生4^A^类小J^细胞系和/或已有的人类星形胶质细胞系来研究炎性介质对这些细胞类型的一些作用以及它们的中和能力。炎性介质(包括但不限于IHp、 ILA IL"8、 IL~12、 IL-13、IL~15、 IL画17A和F、 IH8、 IL"23、 TNFw、 IFN个MIP家:^员、RANTES、IP-IO、 MCP-1、 G"和GM-CSF等等)可通过它们激活炎'J^it径和下'^t^细胞的作用iMp重与MS^目关的症状和病理。
为评估IL"17A和IL-17F的促炎作用和IH7F和/或IL-17A活性拮抗剂(例如IL-17RC的可溶性受体和抗IL-17RC抗体，包括本发明的^A类IL-17RC单克隆和中和抗体)中和或减轻这些作用的能力，分别用下述一种物质处理培养的赠细胞：载体；rML國17A; rhlL-17F; rhlH7A+rML國17F。此外，上述培养细胞^^J或不^ IL"17A或IL"17F的拮抗剂进行处理，所述拮抗剂为单一拮抗剂或联合拮抗剂(例如可溶性IL-17RC)。在不同的培养时间点(从l小时至几天)，分别收^Ji清液和细胞并分析其中炎性介质(包括上述的炎性介质)的水平和/或表达。存在rML"17A和/或IH7F的培养物与仅用栽体处理的培养物相比，炎性细胞因子和趋化因子的水平升高。加AIL-17F和/或IL^7A活性拮抗剂(例如IL-17RC的可溶性受体和抗IL"17RC抗体，包括本发明的^A类IL-17RC单克隆和中和^^)^^降f氐了炎性介质的产生和表达，因此，可预期它们能有效治疗人类MS^目关的炎性症状。
实施例27
IL"17F和IL47A活性的拮抗剂!^f^风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)^型
的疾病发病率并减緩疾病进程这一模型被设计为显示来自患有RA和OA的患者的人类滑液培:^(包括滑液巨嗟细胞、滑液成纤维细胞和关节软骨细胞)和外植物所产生的炎性^^质的水平要高于与来自*^照者的培#^/外植物。这种升高的炎性介质(包括但不限于制瘤素M、 IL-ip、 n^6、 11^8、 IL"12、 IL-15、 11^17 A和F、 IL>18、IL-23、 TNF画a、 IFN个IP國10、 RANTES、 RANKL、 MIP家:^员、MCP-1、G-和GM-CSF、 一氧化氮等等)水平通过它们激活炎性途径和下游效应细胞的作用加重了与RA和OA相关的症状和病理。这些途径和组分则可导致炎性浸润、软骨和基质丟失/破坏、骨丢失以及前列腺素和环氧化酶的上调。因此，这一模型可在体外或离体实验中^^以RA和OA的破坏性炎性特征。而且，^ 在上述一些炎'J^且^(例如制瘤素M、 TNF-a、 IL-ip、 IL"6、 IL-17A和F、 IL-15 等等)的糾下培养来自Afe)"照者的夕卜植物和滑液培辆时，可以，膽炎性 途径的信号传导。可食t^体内对人类RA有效的疗法也应该育诚过抑制和/或中 和炎性介质的产生和/或存在而在上述的体外或离僻^^型中起作用。
在该模型中，从经历关节置换的^J^照者或RA或OA患者身上，或v^L 后的尸体组织中采集人类滑液外植物，并使用改进的Wooley and Tetlow(Arthritis Res 2: 65-70; 2000)^van Hof等(Rheumatology 39:1004 -1008;2000)的方法对夕卜植物进行处理。还研究了滑M纤维细胞、滑液巨噬细 胞和关节软骨细胞的培养物。对复制样本分别用下述一种物质处理：载体 (PBS);重纟^aA类(rh)IL-17A; rWL"17F;或rWL"17A+rWL-17F，还有一些样 本中含有了制瘤素M、 TNF-a、 IL"ip、 IL-6、 IL-17A、 IL-17F和IL-15的不同 组合。此外，还对上述样本分别佳月或不佳月IL-17A和/或nrl7F活性的拮抗 剂（例如IL-17RC的可溶性受体和抗IH7RC抗体，包括本发明的抗人类 IL-17RC单克隆和中和:^9进行处理。在不同的培养时间点(从l小时至几天)， 分别收集上清液并分析其中炎性介质(包括上述的炎性介质)的水平。来自RA或 OA患者的样^U吏用rMI^17A和/或F处理(单独处理或与其他炎性细胞因子 ""^t理)的样本中，与^M:理的A^t照夕卜植物或iMt理的细j^^^相比， 其中的炎性细胞因子和趋化因子水平升高。加AJL-17F和/或IH7A活性拮抗 剂（例如IL-17RC的可溶性受体和抗IH7RC抗体，包括本发明的抗人类 IL-17RC单克缺中和^^)显著斷氐了炎性介质的产生，因此，可预期它们能 有效治疗人类RA和OA。
实施例28 IL"17A和IL-17F的功能性应答 ^J^人类IL"17RCxl(SEQ ID NO:l)和小鼠IL-17RCxl(SEQ ID NO:25)稳 定转染NIH-3T3/KZ142细胞。如上所述，佳月IL-17A、 IL"17F、鼠类IL"17F 和合itiW照对每种细胞系进行剂量应答处理，处理7愤和15愤。当4賴 IL^17RCxl(SEQ ID NO:l)转染时，IH7A和IL-17F对磷酸化lKB"a和p38 MAPK转录因子产生剂量，性应答,这t时照细胞系中固有信号传导高大约 30%。当使用鼠类IL"17RCxl(SEQIDNO:25)转染时，IL-17A和IL"17F不能使 信号传导增强。鼠类IL"17F不能^A类或鼠类IL"17RCxl的信号传导增强.
137实施例29
鼠类疾病模型中IL-17A、 IL-17F、 IL-17RA和n^l7RC的表达 ^J?1针对IL-17A、 IL隱17F、 IL-17R和IL画17RC表达的已知技术，分析了四 种疾病(哮喘、DSS结肠炎、特应性皮炎和实验性变应性脑絲炎)的鼠类模型。 在哞喘模型中，n^l7A和IH7F在患病和未患病小鼠的肺、脾脏、肺引流 淋巴结和肺浸润细胞中的表达均低到了不能检测的水平。发现IU7RC信使 RNA員中的表达比在脾I^N沐巴结中高，但该表ii7JC平并不受疾病的调节。 IL-17R在脾Ji^p肺引流淋巴结中的表达比^^中高，但该表ii^C平也不受疾病 的调节。
与哞喘模型不同，在DSS结肠炎模型中，患病小鼠的近端和远端结肠中 IL-17A和IL-17F的水平均上调，^正常小鼠中并没有这种上调。在肠系膜淋 巴结中这两种细胞因子均未明显上调。jH^卜，i^mil两种细胞因子在急性的 DSS诱导结肠炎环境中上调，而在慢性的DSS诱导结肠炎中则没有上调。发现 IL-17R在肠系膜淋巴结中的表达比在近端和远端结肠中的表达高，但该表# 平并不受疾病的调节。相反地，IL-17RC在近端和远端结肠组织中的表达比在 肠系膜淋巴结中的表达高。IL-17RC的表ii^平也不受疾病的调节。
在特应性皮炎中，不能检测到IH7A mRNA。发jmi7F在^L和^J^ 引流淋巴结中表达，但L;l表ii^平似乎并不明显受疾病的调节。IL-17RmRNA 在^J统引流淋巴结中的表达比在^J统中高，但该表ii^平并不受疾病的调节。 IL-17RC在^J^中的表达比在M可1 ^姚巴结中高，但该表#平也不受疾病 的调节。
在实验性变应性脑械炎模型中，患病小鼠的糾中IL"17A和n^l7F的水 平似乎均上调，^a使泉小鼠中并没有这种上调。IL-17F在淋巴结中的表达比 在，中高，但是淋巴结中的表ii^平并不受疾病的调节。然而，在这些组织 中总体的表^C平都是非常低的。IH7R^淋巴结组织中的表达比在脑和M 中高。未测"^JL-17RC。
简而言之，在DSS诱导的结肠炎棘中和实验性变应性脑糾炎模型中， IL-17A和IL"17F的表达似乎受疾病的调节，但是在哞喘或特应性皮炎中IL-17A 和IL-17F的表达并不明显受疾病的调节。H7R和IL-17RC的表达并不明显受 疾病的调节，但^JL"17R似乎M巴样组织中表逸艮高，而IL-17RC似乎在非 淋巴样组织中表达较高。实施例30
IL-17RCAIL-17A和IL"17F二者的激活作用的介质 ^^l含有人类IL-17RCxl(SEQ ID NO:2)和甲氨喋呤抗性基因(二氢叶酸还 原酶，DHFR)的表达载体转染鼠类nih3t3/kzl42.8测定细胞系a类似地，还使 用人类IL-17RA(SEQ ID NO:21)转染该细胞系。使用市售的试剂盒(Mirus， Madison，WI. Cat.弁MIR218)并根据厂商的说明进行上述转染。将细胞置于添 加有ljtMmtx的生"^养基中培养，以针对含有表，建体的表ii^^ii行筛 选。在筛选后得到转染混合物，并将其命名为nih3t3/kzl42.8/hcytorl4Xl和 nih3t3/kzl42.8/IL-17R。
A)使用基于1101313/1€2142.8的细胞系进行萤光素酶测定 由于基于111113«/1«142.8的细胞系具有稳定的3?1/11&1^艮告物(1«142),因此 无需使用腺病毒感染^入这一报告物。这样就简化了萤光素酶的测定步骤， M的测定步^^u下：
1. 细戯板
将细胞以S000细胞/孔的密度铺于细胞培养物包被的白色固体96孔板上 (Cat. #3917. Costar)， ^f^I含有^^SU^添加了丙酮^L的DMEM/10。/oFBS 铺板，在37。C、 5。/。C02的M下培养过夜。在第二天，移去铺板培养基，更 换为含有^^iUfe和添加了丙酮酸盐的DMEM/l。/。FBS培养基，并将培养物在 37°C、 5%0)2 的糾下培养过夜。
2. 萤光素酶测定，以测量H^17A和F对稳定的kzl42^艮告物的激活
在用DMEM/1。/。FBS培养基培养过夜后，用无血清培养基(添加有0.28% BSA)稀释人类IL"17A和IL-17F配体。在加入配^#释液后将细胞在37"€和 5%<:02糾下培#4小时，移去培养基^H吏细胞狄15^t, ^^萤光素酶测 定系统和试剂(Cat紐1531 Promega. Madison， WL)和^:量;feJUt计测量平均荧 光强度(MFI)。枱"测浓度范围为O.l-lOO ng/ml的两种配体的活性。
下文所述的EC50为至少4次实验的平均值。nih3t3/kzl42.8/hcytorl4xl转染 混合物表现出的对于鼠类IH7A配体的活性与母细胞系相似，其EC50约为 4ng/ml(实施例14)。 hcytorl4xl重组细胞系中mlL"17A的信号传导与母细胞系 (实施例14)^目似这一事实表明，鼠类IH7A很可能是通过内源性鼠类nih3t3细 胞的IL-17RA或IL"17RC受^i行信号传导的，而且并不通ithcytorl4Xl激活 细胞。然而，h!L-17RCXl的转染混^对于人类rH7A的处3^现出更高的应答l"生，平均4次实验的EC50为0.41 ng/ml，而母细胞系为2.8 ng/ml(重组细胞 系中的£。50增强6.8倍)。而且，ML-17RCX1重组细胞系对于人类IL"17F^ 现出更高的应答性，其EC邻为0.61 ng/ml,而母细胞系为10ng/ml(重组细胞系 中的EC50增强17倍)。ML-17RCX1细胞系中ML^17A和F的效力增加与人类 IL-17RCXl为人类IL-17A和IL-17F二者的高亲和力受^it一事实相一致。相反 地，WL^17RA重组细胞系^tUL-17A有高敏感性，其EC50为0.6 ng/ml，而 母细胞系为2.8ng/ml。 hEL-17RA重组细胞系对于UL-17F的EC50没有增强，重 组细胞系的IL"17FEC50为12.4ng/ml，而母细胞系为8,9ng/ml。
这一结果很有意义，因为它特别地表明了ML-17RCX1是ML-17A和 hlH7F二者的激活作用的介质，而JLi^明hlL"17RA仅介导hEH7A激活的 信号传导，但不介导ML-17F激活的信号传导。
实施例31 IL-17A和IL-17F的静脉内给药
本实施例使用BALB/c小鼠测定了鼠类或人类IL-17A或IL-17F的静脉内送 递在不同时间点对于全血细胞计数(CBC)和血清细胞因子/趋化因子的影响。
I. V.给予l陶的mlL-r7A可导致在给药后1-2小时循环系统中的嗜中性粒细 胞增加约2倍(通过CBC测定)、血清中KC和MCP-l增加约10倍(通itLuminex 测定)；给予5ng的WL-17A^^Jl^到了对于上述趋化因子的相似的影响。在用 l照mlL-17A、 5fighlL"17A或5照hlL"17F处S^2小时的时间点，小鼠体内血 ，细胞水平也有明显的增加，其中给予lngmlL-17A时表现出的增加程JL^ 高。 I.V.给予鼠类和人类IL"17F在1小时和2小时的时间点导致血清IH5明显增 加(通itLuminex测定)，血清KC和MCP-1在上勤目同的时间点有少量增加。
实施例32
静脉内给予的BL-17A和IL"17F的中和 为用Lp,给予的可溶Ii受^(针对鼠类g己條予mlL-17RA-Fc;针对人类配 体给予可溶feiA类n^l7RC)中和静脉内给予的IH7A和IL-17F所介导的细胞 因子和趋化因子的增加，通过i.p.注射给予雌性BALBZc小鼠PBS、 100將 mlL-17RA-FciU00吗可溶fciA类IL"17RC,在三小时后通iiC静脉注射下列 物质：PBS; 2將的mlL-17A或mlL47F或2ng的mlL-17A+mlL-17F(对于接受 mlH7RA-Fc的小鼠)；或2照的ML"17A、 MH7F或2魄的ML"17A十WL-17F
140(对于接受可溶I4A类IL-17RC的小鼠)。在配條药后l小时采集血清，分析少 数血清细胞因子和趋化因子。
通过Lp.给予鼠类可溶性受体进行预处理的小鼠与用PBS+鼠类IL-17A处 理的小！^目比，由鼠类IL"17A介导的IL47A和KC(CXCL1)的血清浓度的增加 量显著下1%(降欣约2至2.2倍；P<0.05)。经也p.注射人类IL"17RC-Fc处理的小 鼠表现出由人类IL-17F介导的IL"15血清浓度的增加量的^^下斷^f氐约2倍； p < 0.05);由IL-17A介导的KC浓度的增加量的显著下降(降低约30。/o; p < 0.05);由人类IL-17A+IL-17F介导的KC浓度的增加量的^^下斷降低约25。/o; p < 0.05);以及由人类IL"17F或IH7A+IL-17F介导的IU5浓度的增加量的显 著下断降低约2倍；p<0.05)。
实施例33
可溶性IL-17RC和IL"17RC/IL"17RA多肽的基于板的蛋白结合测定 按照下述步^ii行捕叙IA:用lng/ml的山羊抗AjgG抗体包toLISA板， 并在4。C下培养过夜。洗:^并用200nl/孔的l。/。BSA在室温下封闭板l小时。洗 涤，然后向^Ji^入可溶性受体t/f^A1586F， A1587F)或IL"17RCxl(A1034F) 的系列稀释液(100ng/ml直至0.10fig/ml),在室温下培养l小时。洗涤，以 10:1(EL-17A)或6:1(IL-17F)的比例加入生物素标记的配体，并在室温下培养l 小时。洗涤，加入0.5ng/mL的链亲^^-^^itlL化物酶，在室温下培养l小时。 洗涤，加入TMB底物^4^t。通it^入终止溶^f止AjL (注：除非特别 指明，否则上it^斤有试剂的体积均为50nI/孔)。阳性结果是指较高的OlMi，通 常应高于0.5。结果显示，在这一测定中，构建体1342(SEQ ID NO:74)不与 IL-17A结合，与IL-17F微弱结合。构建体1341(SEQ ID NO:72)与IL-17A和 EL-17F二者^t很强的结合。IH7RCxl与IL-17A和IL"17F结合。
按照下述步ltii行中和EIA:用lng/ml的可溶性受^KA1034F)包掩l并 在4。C下培养过夜。洗械并用200nl/孔的l。/。BSA在室温下封闭板l小时。在封 闭的同时，在另 一块^Ji将相同^M?、的可溶性受体变^(A1586F， A1587F)的系 列稀释液(50ng/ml直至0.05jig/ml)与生物素标记的配体以10:1(IL"17A)或 6:1(H^17F)的比例培养，在室温下培养l小时。洗涤封闭好的板，然后向封闭 好的5^gUb^入受^-配体复合物，在室温下培养l小时。洗涤，加入0.5jig/mL的 链亲和素-辣^itlL化物酶，在室温下培养l小时。洗涤，加入TMB底物反应7 分钟。通it^入终止溶液终止^(注：除非特别指明，否则上述所有试剂的体积均为50fil/孔)。阳性结果是指较低的OlMt，通常应低于0.5。结^E示，构 建体1342(SEQ ID NO:74)^弱地中和IH7A与IL-17RCxl的结合，但肯M艮强地 中和IL-17F与IL-17RCxl的结合。构建体1341(SEQ ID NO:72)微弱地中和 BL-17A与IL-17RCxl的结合以及微弱地中和IL-17F与IL-17RCxl的结合。中和 表明变体蛋白与生物素化配糾目结合。
实施例34 FACS结合测定方法 为评估本发明的可溶性IH7RC和IL"17RC/IL-17RA多肽与配体EH7A 和IH7F结合的能力，应用了基于流式细胞术的竟争结合测定。在存在配体 IL-17A或IL-17F的条件下培养经4^:IL-17RCx4^定转染的BHK细胞系，偵月 靶向结合配体的可溶性受体可以枱侧和相对定量检测结合在细胞表面(因此未 被可溶性受体结合)的配体。对配体生物素化使得可以佳月链亲和素缀合的荧 光团作为二4^ii行FACS^测。1^可溶性受体的滴定，细胞结合配体的减少 可通过细胞的平均荧光的减少来记录。在染色培养_^(11888+1%884+0.1%叠 氮钠+10mM HEPES)中将ljig/ml的各种生物素化配体分别与滴定量的可溶性 受体预先混合，使其^^积为100ji1,在室温下培养15分钟。通过下述步骤处 理经4^JL-17RCx4稳定转染的BHK细胞系以用于配体染色：用乙二胺四乙酸 钠(Invitrogencat.l5040-066)重悬细胞，平衡至2乂105细1&/10(^1，沉淀细胞并重 悬于配M溶性受体的预混合物中。将染色的细胞在4'C下培养30分幹，用染 色培养基洗涤l次，然后用1:100的链亲衬-PE(BD Pharmingen cat. 554061) 进行染色。将细絲4'C下i^i^养30诚，用染色培养基洗涤2次，并重悬于 l:l的染色培养絲Cytofix(BDBioscience554655)的混合物中。佳月BDLSRII 流式细Jffc^或类似的仪器进行数据采集和分析。图5显示的是一^际准图。该 图是^J^Prizm软件程序产生的。Y轴的数值^4标准化的MFI值(该标准化是 ^f5l有配体时的MFI设为100%,没有ge/f^没有可、溶性受体的对照孔的MFI设 为0%)，并由jHl4示配体与细胞结合的百分比。该软件可针对每条曲线计算 IC50。
实施例35
生物素化人类IL-17A和IL-17F与可溶I4IL"17RC/IL^17RA多肽的特异性结合
的抑制使用本文所述的结合测定法来测定可溶性H7RC和IL-17RCH7RA 多肽与IL-17A和EL"17F结合的能力。如上所iDlk^^^合研究，只是在结合反 应中增加了另外的可溶性多肽，例如SEQ H) NO:157和158。这些可溶性多肽 抑制人类IH7A和IL-17F二者与IL47RC转染的BHK细胞的结合，^制程度 与可溶hiA类IL-17RCxl Fc融M白(SEQ D) NO:64)^目同。其余的可溶性多肽 包^SEQ ID NO:157和158的可溶法多肽，它们都包括在下勤0中。
表10*
table see original document page 143

*基于细胞的竟争结合IC50(ng/pL);构建体的排序是按照对每种S己体的 IC50, vM^强的结a至最弱的结^^。
实施例36
IL"17RC和IL"17RC/IL-17RA可溶性多肽对IL-17A和IL"17F的结合亲和力 按照下述步骤，^"测BL-17RCxl、 IU7RA和可溶性IL^7RC/IL"17RA可 溶性多肽(SEQ ID NO:157和158)对IU7A和IL-17F二者的结合亲和力：用 pH5,0的乙酸钠将山羊^AjgG"Fc特异性抗体(Jackson #109-005-008)稀释至 50^ig/ml，并固定在CM5Biacore芯片上。在^-"系列浓度的每种配体^/v以观 察结合和解离之前，按照理论上的结合最大值来优化捕获受体的实验方案。测 试了可溶性受体和IL-17RC/IL"17RA多肽与一系列浓度的每种配体的结合。在各轮之间通过2x30秒的注射pH 1.75的甘氨酸使表面再生。使用Biacore Evaluation软件评估数据以确定动力学数值，并示于下^J1。
表11*
人类H7RCxl对人类IL-17A的亲和力 ka(l/!V1s) kd(l/s) 1.05E+06 4.90E-04 469E-10 1.24E+06 4.38E-04 3.52E-10
05-2005
9.02 0.424 8.86 0.324
05-2005
7.22 0.378 7.57 0.549
04-2006
人类IL-17RCxl对人类IL"17F的亲和力 ka(l阔 kd(l/s) 9.91E+05 4.31E-04 4.35E-10 1.11E+06 3.84E-04 3.46E-10 可'溶性IL"17RaiL^17RA多^W人类IL-17A的亲和力 ka,s) kd(l/!s)
1.42E+06 6.22E-05 4.39E-11 20.5 0.460 2.61E+06 9.95E-05 3.82E-1J 18.3 0.888 可溶性IL"17RC/IL"17RA多M人类IL-17F的亲和力 04-2006
kd(^《",f^.吣麟浙，戲, 1.82E+06 2.61E-04 1.43E-10 2.49E+06 3.15E-04 1.26E-10 人类IL-17RA对人类IL-17A的亲和力
3.70E+05 8.65E-05 2.34E-10 2.89E+05 8.57E-05 2.96F.-I0 人类IH7RA对人类IL"17F的亲和力 ka(1/Ms) Jid(1/s) * 二1^^v : KmafxlKV^" 2.09E+04 5.56E-04 2.66E-08 20.3 0.071 2.55E+04 4.40E-04 1.72E-08 9.9 0.076 *显示了平^数和^速率常数，这些值都^器的限度范围内。 Chi2指的是结合曲线^f估拟合曲线之间的残差的平方和。该^t^^近0，
则说明数据的置信M高。显示的这些数据置信度桐艮高。
10.2 11.2
0.495 0.544 06-2006
'织鎰卦腐，繊膨 29.5 0.249 35.1 0.197
■IL-17RC的结合。特别地，人类IL-17RC对人类IL-17A和人类IL"17F絲出相 似的结合亲和力，解离平衡常数(KD)约为400皮摩（pM)。可溶性 IL-17RC/IL-17RA多M合人类IL^17A的亲和力(KD约为40pM)比其结合人类 IL-17F的亲和力(KD约为140pM)略高。人类EL-17RA对于人类IL-17A和人类 IL-17F的gi体结合亲和力差异最大，它对人类IL-17A的KD约为300pM而对人 类IL-17F的KD约为30纳摩(nM),相差了100倍之多。
实施例37
重纟^EA类IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8和IL"17RCx4/NIH3T3/KZ142.8^L告物测
定细胞系的产生
系，即人类H7RA(SEQ ID NO:21)或IH7RCx4(SEQ ID NO:166)的重组体。 这可通iW含有每种上^DNA的表^建^^染上述细胞而实现。所*达载 体利用了pzmpll，它含有二氬叶酸ii^酶基因。因此，^JU添加有lnM曱氨 喋呤的生长培养基筛选转染体以产生稳定的转染;^^。得到的测定细胞系被 称为hlL"17RA/NIH3T3/KZ142.8和hlL-17RCX4/NIH3T3/KZ142.8。
实施例38
可溶性IL"17RC/IL-17RA多肽拮^/v类IL47A对重^A类 IL"17RA/NIH3T3/KZ142.8细胞的激活 ^J^下述步骤测定可溶性IH7RC/IL-RA可溶性多JI^SEQ ID NO:157和 158)对人类IL-17A激活重组ML"17RA/NIH3T3/KZ142.8细胞的竟争效力：用于 安光素酶测定的细胞铺板和制备与本文所述的相同。在测定当天，首先对细胞 给予一系列2倍剂量的可溶fci受^(设三个平行样)，所述可溶法受体的体积为l 倍#^?"浓^终浓度的2倍，包括上i^斤述可溶性多肽即IH7RA和IH7RC 起始浓度为2ng/ml(将^a入百e^后成为lfig/ml的终浓度)。然后再加入1^^M?、 的l ng/ml的IL"17A，这一浓度也是终狄0.5 ng/ml的2倍，在受^配体^^在 —^M为0.5 ng/ml的终浓度。对接受了0.5 ng/ml的IU7A而未接受受体的 三^HH亍样的系列测定激活的最大值。对只接受了既不^S己体也不含可溶性受 体的测"^养基的三个平行样的系列测定激活的J^值。数据分析显示，上述 可溶性多肽抑制IL-17A激活上述细胞系的IC5(KiL为7 ng/ml。可溶性IL-17RA或IH7RC即使在最高剂量(ljig/ml)时，也不能足够有效地拮抗0.5 ng/ml的hlL-17A对该细胞系的激活。
实施例39
可溶性IL-17RC/IL-17RA多絲^A类IL^17F对重纟i/v类IL隱17RA/NIH3T3/KZ142.8细胞的激活^J?l下述步骤测定可溶性IL-17RC/IL-RA可溶l!i多枫SEQ ID NO:157和158)对人类IL"17F激活重组ML"17RA/NIH3T3/KZ142.8细胞(如上所述)的竟争效力：用于萤光素酶测定的细Jf&^板和制备与本i^斤述的相同。在测定当天，首先对细*予一系列2倍剂量可溶性受^K设三^HNt^),所述可溶性受体的体积为l^f^积，浓^7终浓度的2倍，包括上文所述可溶性多肽即IL-17RA和IL-17RC起始浓度为4ng/ml(将在加入配体后成为2ng/ml的终浓度)。然后再加入1倍体积的40 ng/ml的IL"17F，这一i^JL也是终刻UO ng/ml的2倍，在受^>配体^^在""^就成为20 ng/ml的终浓度。对接受20 ng/ml的IL"17F而无未接受受体的三个平4亍样的系列测定激活的最大值。对接受既不含酉沐也不含可溶性受体的测试培养基的三个平行样的系列测定激活的基线值。数据分析显示，IL-17RC/IL"r7RA可溶性多肽抑制IU7F激活上述细胞系的IC50值为0.48jig/ml。可溶性IL-17RA或IL"17RC即使在最高剂量(2ng/ml)时，也不足以表现出对20 ng/ml的n^l7F对该细胞系的激活的^r拮抗作用。
实施例40
可溶性IL-17RC/IL-17RA多J3fc^^A^类IH7F对重纟JLA类IL"17RCx4/NIH3T3/KZ142.8细胞的激活^^下述步骤测定可溶性IH7RC/IL"RA可溶性多J3i(SEQ ID NO:157和158)对IL-17F激活重组hlH7RCX4/NIH3T3/KZ142.8细胞(如上所述)的竟争效力：用于萤光素酶测定的细Jf&4甫5^制备与本文所述的相同。在测定当天，首先对细*予5#系列剂量的可溶昧受^K设三个平行样)，所述可溶性受体的体积为l倍体积，浓度为终浓度的2倍，包括上文所述可溶性多肽即IL"17RA和IU7RC起始浓度为4ng/ml。然后再加入1倍体积的2 ng/ml的IL"17F批次A1275F,这一浓度也是终浓度l ng/ml的2倍，在受^_配体^^在一为l ng/ml的终浓度。对接受l ng/ml的IL-17F而未接受受体的三个平行洋的系列测定激活的最大值。对接受既不含S己体也不含可溶性受体的测"^养基的三个平行样的系列测定激活的M值。数据分析显示，IL"17RCH7RA可溶l!i多狀抑制IL-17F激活上述细胞系的lC50值为0.8fig/ml。可溶性IL-17RC的IC50为6fig/ml，而IL-17RA在^剂量时都没有拮抗作用。
实施例41
可溶性IL-17RC/IL-17RA多肽中和人类IL47A和IL-17F二^^导G"CSF、 11^6
和IL"8的活性
^J?l人类IL-17A或^^I人类IL-17F处SA类小气ilJi皮细胞(SAEC)，在48小时后收集上清液。对这些上清液的测定显示出G"CSF、 IL"6和IL-8的剂量^!性"^导，结果示于下表12。
表12
48小时后上清液中诱导产生的增加倍数
IL"6 IL"8
处SSAEC的物质
人組-17A: 50ng/ml 26 13 8
10ng/ml 24 14 6
2ng/ml 14 8 3
0.4 ng/ml 13 8 3
人类IL47F: 250 ng/ml 15 11 4
50ng/ml 10 8 3
10ng/ml 8 8 2
2ng/ml 4 5 2
对于用10 ng/mlA类IL"17A或50 ng/ml/w类IL"17F处理的SAEC，还使用了0.01 - 10fig/ml剂量的可溶性IL"17RC/IL-17RA多Jlk(SEQ ED NO:157和158)进行处理(^AJ'J细^前先将配体和可溶性多JlM^7°C下一^^养30^#),在48小时后收集上清液。如下勤3所示，所iiJi清液中的G"CSF、 IL"6和IL^8的^J:下降，表明可溶性IL"17RC/IL-17RA多肽能够有放地中和人类IH7A和人类IL-17F诱导这些细胞因子的活性。应该注意的是，不能测定IL"6中和的IC50值，因为在所测试的可溶性IL"17RC/IL-17RA多肽的最低剂量(0.0lMg/inl)时，中和才下降到最大值的大约50%)。
table see original document page 148
实施例42
可溶性IL"17RC和n^l7RC/IL-17RA多肚对人类多发'l^ttt^本的效力多发'I^^化(MS)是一种被认为由多种因素介导的复杂的疾病，所述因素包括存在淋巴细J^单核细胞的炎性浸润和整个CNS的脱髓鞘作用。小胶质细胞是存在于中枢神经系统(CNS)中的巨噬细J^细胞，它在损伤或感染Bm^:活。小胶质细J^神经细JW在各种CNS疾病包括MS中起重要作用，并可被用于研究疾病的发生、发Jl和治疗机制(Nagai et aL， Neurobiol Dis 8:1057-1068;2001; Olson et al" J Neurosd Methods 128:33-43; 2003; Giuliani et aL， JNeuroimmunol 165: 83 - 91; 2005)。因此，可以使用原代神经细l&^养物、永生^A类小M细胞系和/或已有的人类星形M细胞系,究炎性介质对这些细胞类型的一些作用以及它们的中和能力。炎性介质(包括但不限于IL-ip、IL隱6、 IL-8、 IL-12、 IL隱13、 U5、 IL画17A和F、 H8、 BL~23、 TNF國a、 IFN个MIP家絲员、RANTES、 IP-IO、 MCP-1、 G"和GM-CSF等等)可通过它们激活炎性途径和下游^细胞的作用^Ma重MS^目关的症状和病理。
为评估IL"17A和IH7F对上述细胞类型的促炎作用和本发明的可溶性多肽例如可溶htlH7RC/IL-17RA多J&(SEQ ID NO:158)中和或减^il些作用的能力，分别用下述一种物质处理培养的神经细JI^U^t细胞:载体；rWL-17A;rML-17f; rML~17a+rhIL-17f0 jH^卜，还对上述培养细胞分别佳月或不佳月本发明的可溶性多肽例如可溶性IL"17RC/IL"17RA多JI^SEQ ID NO:158)进4亍处理。在不同系列的培养物中，在不存在外源性IH7A或IL"17-F的条降下， 将分离自人类受^^的被抗CD3M激活的循环系统T细l&^yV^培养的神经 细#自细胞中，藉jHl^供研究激活的T细lW这些细胞类型的破坏作用的 共培养方法。对T细胞分别使用或不使用本发明的可溶性多肽例如可溶性 IL-17RC/IL-17RA多4^SEQ ID NO:158)进行处理。在不同的培养时间点(从l 小时至几天)，分别收集上清液和细胞并分析其中炎性介质(包括上述的炎性介 质)的水平和/或表达，还分析细胞的存活水平。用rML-17A和/或IU7r处理的 细胞与但月载体处理的细l^目比，炎性细胞因子和趋化因子的水平和神经细胞 的死亡率升高。加入本发明的可溶性多肽例如可溶性IL"17RGH17RA多肽 (SEQ ID NO:158)显著降低了炎性介质的产生和表达并提高了神经细胞的存活 水平c
综上所述，由于这些离体实發汪实了本发明的可溶性多肽例如可溶性 IL-17RC/IL-17RA多肽(SEQ ID NO:158)能够减轻与人类MS的病3^目关的破 坏作用和炎性作用，因此可预期^^I这类可溶性多Jlfci^力'台疗能够有M减轻 与人类MS^目关的炎性症状、神经细胞死亡和/或脱髓鞘作用。
实施例43
可溶性IL-17RC和IL"17RC/IH7RA多肽对人类类风湿性关节炎("RA")和骨
关节炎("OA"辦本的效力
这些模型被设计为显示来自患有RA和OA的患者的人类滑液培:fM^(包括 滑液巨噬细胞、滑液成纤维细胞和关节软骨细胞)和外植物所产生的炎性介质 的水平要高于与来自^^t照者的培^^/外植物，这可^it^卜基质组^(例 如骨和软骨等)的降解，而这种降解正是上述疾病的标志。此外还设计了下文 所述的共培#^型，以显示RA/OA滑液和/或激活的T细胞中存在的炎性介质还 可能导致P重的炎症和M降解。
这种升高的炎性介质(包括但不限于制瘤素M、 IL"ip、 IL"6、 11^8、 IL-12、 IL-15、 IL-17A和F、 IH8、 IL-23、 TNFw、 IFN"y、 IP國IO、 RANTES、 RANKL、 MIP家絲员、MCP-1、 MMP國9、 G"和GM-CSF、 一氧化氮等等)水平通过它 们激活炎性途径和下游效应细胞的作用加重了与RA和OA相关的症状和病理。
这些途径和组分可导致炎性浸润、软骨和基质丢失/破坏、骨丢失以;5Li^金
属蛋白酶、前列腺素和环氧化酶的上调。因此，这一模型可在体外或离体实验 中^^以RA和OA的破坏性炎性特征。而且，絲在上必卜源加入的炎性组^(例如制瘤素M、 TNF-a、 IL-ip、 IL~6、 IL-17A和F、 IL-15等等)的^ft下，或在 存在来自RA患者的滑液(应含有内源性炎，^且分)的M下，培养来自^fcfej"照 者的夕卜植物和滑液培^^时可以，膽炎'I^降幹Jtit径的信号传导。可育t^体 内对人类RA有效的疗法也应该能通过抑制和/或中和炎性介质的产生和/或存 在而在上述的体外或离体模型中起作用。
在上述;^型中，从经历关节置换的^Xt照者或RA或OA患者身上，或从 死后的尸体组织中采IIA类滑:^卜植物，，并H"M^U近的Wooley and Tetlow (Arthritis Res 2: 65-70; 2000)^Kan 't Ho傳（Rheumatology 39:1004 -1008; 2000)的方法对外植物进行处理。还研究了滑液成纤维细胞、滑液巨噬细胞和 关节软骨细胞的培频。对复制样本分别用下述一种物质处理：载錄BS); 重组人类(rh)IH7A; rML-17F;或rhlL-17A+rhlL-17F，还有一些样本中含 有制瘤素M、 TNF-a、 IL-ip、 114、 IL~17A、 EL-17F和IL-15的不同组合。还
的样本。jlt^卜，i^tlii^有样^分别使用或不佳月本发明的可溶性多、:例如 可溶性IL-17RC多M可溶性IL47RC/n^l7RA多Ji!t(SEQ ID NO:158)进行处 理。在不同的培养时间点(从l小时至几天)，分别收集上清液和细胞并分析其中 炎性介质和软骨/骨/基质生物才射己(包括上述的那些)的水平。来自RA或OA患者 的样M^^RA/OA滑液、激活的T细胞、rhlL-17A和/或rhlL-17F处理(单独 处理或与其他炎性细胞因子-"^t理)的样本中，与iMt理的^^照夕卜植物 或未处理的细|^#^相比，其中的炎性细胞因子和趋化因子和软骨/骨/M 降阵性生物标记的水平升高。加A^发明的可溶性多^^l^f氐了炎性介质和 软骨/骨/M降解性介质的产生，因此，可预期它们能有效治疗人类RA和OA。
实施例44
通it^占膜活^^,测定可溶性IL-17RC和IL-17RC/IL"17RA多JM"人类炎
録病("IBD，，辦本的效力 这一模型被设计为显示来自患有IBD的患者的培养的肠组织所产生的炎 性介质的水平要高于与来自^fct对照者的组织。这种升高的炎性介质(包括但 不限于IL画ip、 IL-4、 11^5、 IL-6、 IL~8、 IH2、 IL-13、 IH5、 IL-17A和F、 IL-18、 IL-23、 TNT-a、 IFN个MIP家絲员、MCP-1、 G"和GM-CSF等等） 水平通过它们激活炎性途径和下游效应细胞的作用加重了与IBD例如克罗恩 病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)^目关的症状和病理。上iiit:径和组分可导致在体内XSLS到的组织和细胞损伤/破坏。因此，这一模型可^^IBD的炎性介质升高的 特征。而且，絲在上述炎'j^且分的糾下培养来自^ft照者或来自人类肠 上皮细胞(IEC)细胞系的肠组织时，可以观察炎'tiit径的信号传导以及组织和 细胞损伤的迹象。
可能在体内对人类IBD有效的疗法也应该能通过抑制和/或中和炎性介质 的产生和/或存在而在上述的离^IEC模型中起作用。
在该模型中，从经历肠组织活#再切片的A^t照者或IBD患者身上， 或从死后的尸体组织中采集人类肠组织，并使用改进的Alexakis等(Gut 53:85-卯，2004)的方法对组织进行处理。在无菌条降下^^J大量的PBS小心地 清洁样本，然后使用完全组织培养^(加入抗生素以抑制细菌it^l长辟养组
织碎片。对来自相同的组织碎片';s^的样本分别用下述一种物质处理：载体
(PBS);重纟^aA类(rh)IL-17A; rML~17F;或rML-17A+rML-17F。此外，•
可溶性IL-17RC/IL"17RA多Jli(SEQ ID NO:158)进行处理。同样按照i^一实验 过^ii行人类IEC细胞系的研究，只是^^5W的细胞偸液进行细胞传代。在 不同的培养时间点(从l小时至几天)，分别收集上清液并分析其中炎性介质(包 括上述的炎性介质)的水平。来自IBD患者的样4^/f^rML"17A和/或F处理的 样^4iMt理的^i^照组织样^目比，其中的炎性细胞因子和趋化因子水平 升高。加A^发明的可溶性多M著l^f氐了炎性介质的产生，因此，可预期它 们負沐效治疗人类IBD。
^9f究的另一方面可包括对来自接受有效治疗的IBD患者、目前未接受治
行比较。
实施例45
通itJi;^障功能测定可溶性IL-17RC和IL-17RC/IL"17RA多肽对人类IBD^
本的效力
维持上皮屏障的完整性是保持胃肠道健康的一个关鍵因素。实驺证据表 明，肠上皮屏障的渗漏可能会导ItIBD的发生。位于肠固有层中的免疫细l&it
以维持免^^督并有助于维持上M障的完塾性。然而，长时间的或失调的免疫介导的炎症可能导致上>^障细胞完塾性和功能的缺陷。设计了下述^f究以
测量T细胞产生的IL"17A和/或n^l7F对于上狄障完塾性的直接影响。
在本实施例中，^J^上皮细胞系例如Caco^2细J^半iiJ^Ji分化，并在
;。通过;估"上皮电P":財层对染料扩散的抗性，随时"f司监'^上皮^J^ 单层的完塾性。在共培絲中细絲层的跨上皮电阻的l^f錄明在共培辆中 的T细J!^单核细胞的活性诱导了细J3&^层的破坏。可以^^H17A和IL-17F 的抑制剂，例如本发明的可溶性多肽、例如可溶性IL-17RC多肽或可溶性 IL-17RC/II^17RA多肽(SEQ D) NO:158)，来测定H7A和IL"17F对上皮细胞 单层的破坏的相对作用，并^"测IL-17A和IL-17F的抑制剂是否能够有^^维持 上M障的完塾性。如果这类分子能够防止激活的T细胞诱导的上皮细J^层 的破坏，则说明本发明的可溶性IL"17RC和IL"17RC/IL"17RA多肽可有舰用 于A^类IBD的治疗。
还可以使用来自IBD患者的原代上皮细胞形成的细胞单层来产生共培养 系统，以测定这些细胞与来源于M个体的上皮细j^目比是否对于IL-17A和 IH7Fit^^:感。如果是这样，那么这些数据3lt4明抑制IL-17A和IL-17F是一 种治疗IBD的适当策略。
实施例46
IL-17A和IH7r对来自正常样^^人类IBD样本的固有层T细l^单核细lfe/
巨噬细胞的效力
失调的或持续的免疫介导的炎症可能通过组织损伤或永久地偏向不适当 的或延长的免疫应答的方式加重与IBD相关的症状和病理学。这一模型可以测
^:17A和IU7F可食^在于肠组织紧靠的环境性细胞因子环境中。
可能在体内对人类IBD有效的疗法也应该能通过抑制和/或中和炎性介质 (包括但不限于IL-1P、 IL國4、 IL"5、 11^6、 IL~8、 IL~12、 IH3、 IL-15、 IL"17A 和F、 H8、 IL-23、 TNF"0t、 IFN个MIP家絲员、MCP國1、 G"和GM-CSF 等等)的产生和/或存在，而在上述的离体模型中起作用。
在该^l^型中，通过下述步a活检样本中分离T细胞和单核细J^巨噬细 胞：在HBSS中小心地使用剪子仔细剪碎活检样本，用^^酶和^Ht酶II处理 并在摇^Ji于37。C培养l小时。用尼龙筛过滤细胞悬液以除去细IW片和细胞团，并用HBSS洗涤多次。可以^^直接细胞M或M消^/富集方法分离T 细胞和巨喧细胞/单核细胞。将分离的细胞与IL-17A和IL-17F—起培养。这可 诱导T细妙单核细勿巨噬细胞产生炎性介质或使得后续的T细胞应答偏向为 高促炎应答。可以对来自IBD患者和来自正常个体的细胞产生的炎性介质的类 型进行比较，并可肯汰明M在IH7A和IL-17F的务降下来自IBD患者的T细 胞和单核细勿巨噬细胞会具有更强的促炎性特征。加入本发明的可溶性多肽 (例如可溶性IL-17RC多肽或可溶性IL"17RC/IL-17RA多At(SEQ ID NO:158)) 可以中和IH7A和IL"17F诱导的下游炎性介质的产生，it^明这类可溶性 IL-17RC和IL"17RC/IL-17RA多肽可有M治疗患有IBD的患者。
实施例47
可溶性IL-17RC和IH7RC/IL-17RA多JlW肠易激综合征("IBS")的效力：CNS
定向的发病^L制
该模型主要研究IBS的原始CNS定向发病机制，该^^型^^应^'J激^^导 IBS的症状特征。新生幼崽的心3S^土^^应^:;^型模拟了 一些与IBS患者相关的临 床特征，包括内脏痛觉过敏、腹泻和应激过敏。在幼崽出生后4-18天，每天将 它们与母亲分隔180M可导致母方行为的改变，并M减少舔^/理4^f亍为的 时间。对于新生幼崽的应激导致CNS的永久性改变，并导致应^t^l"导的内li^ 躯体痛觉敏感，I^生变化。在这些动物中结肠运动功肯^t于应激的应答增强， 初步的数据显示有结肠ilit:性增加的迹l^(Mayer et al.， 2002)。 ^本发明的可 溶性多肽(例如可溶性IL-17RC多肽或可溶性IL-17RC/IL"17RA多肽(SEQ ID NO:158))进行治疗，并随后对结肠运动功能、上皮ifit:性和对应激的应答进行 分析，可以测定对这种IBS动物模型的有效性。在用上述抑制剂治疗后症M 病率的降低可表明IBS疗法的潜vW效性。
实施例48
可溶性IL"17RC和IL"17RC/IH7RA多肽对肠易激综合4iE("IBS，，)的效力：应激
的原始肠定向"^导物 该模型主要研究应激(即肠道炎症，感染或物理应激)的原始肠定向诱导 物。动物研究表明，程度较低的炎症或免疫激活可能是肠的运动性和/或传入 功能和上皮功育汰生改变的J^(MayeretaL，2002)。在该模型中，每^Jtit^" 新生动物(8-21日龄)结肠内注射芥子油产生每天的结肠刺激。芥子油是一种神
153经刺激物，已表明通it^肠内给予芥子油可诱导内脏痛觉过敏。这一模型^^以 了IBS的关^^征，包括内脏痛觉过^朝M更习惯改变。动物i^4现出腹泻或 便秘，这也;iJBS患者的关键特征(Mayeretal.， 2002; KimbaIIetal.， 2005)。可
il-17rc/ih7ra多^(IeQ id NO:l幼))，:测定与该模型相关的i^^艮的 变化。在^^本发明的抑制剂治疗后，内脏痛觉过敏的发病率^^度的降低以 皿道运动性的变化可表明这些分子用于治疗ibs的潜^f效性。
实施例49
设计用于生产可溶性IH7A和IH7F拮抗剂的可放;tM^的蛋白生产工艺 在设计主要用于开发可溶形式的il-17rc的可放大规漠的蛋白生产工艺 的策略时，在识别可在^fr培养基中产生高水平蛋白浓度的表达系统时it^了 许多困难。蛋白质印迹分析表明M^"蛋白在细胞中i^累积，蛋白分泌的水平 降低。在发现本发明的可溶性多肽的过程中，我们设计和制备了七十多种不同 的表ii^J建体并测试了它们在BHK细胞、CHO细J^HEK293细胞中的表达。 有些表，建体在一种以上的宿主细胞系中进行了测试。所测试的可溶性 IL-17RC表达盒的变体包括：
1) ^种信号序列，例如:a)天然；b)otPA; c)小IJ^^^l蛋白重^:可变区； d)人类生长激素；e)小鼠IH7RA。
2) 两种不同的天然存在的剪接变体(IL-17RCxl， SEQ ID NO:2;和 IL^17RCx4， SEQ ID NO:166)。
3) 在IL"17RC胞夕卜结构域(ECD)和Fc部分之间增加连接物序列，例如：a) 没有连接物；b)—种基于GlyGlyGlySer的9氨基酸连接物；和c)一种基于 GlyGlyGlySer的20^J^酸连接物。
4) 带His标洛的单体形式。
5) ^J^端和^^端Fc融妙白。
6) 去除N-连接的糖连g点。
7) 用Gln置^Asn的^J^换。
8) IL-17RA和IH7RC的杂合融^"白
所有的可溶除IL"17RC变体表ii^I建体都通过瞬时转染至孤K 293细胞 中进行了蛋白表达的儉测。4捐了蛋白质印迹分析ilb^测分泌至4H^培养基中 的蛋白，并与通it^集细胞，物测定的细胞中保留的蛋白的量进行比较。大多数构建体表达的分泌至条件培养基中的蛋白都几乎不能用蛋白质印迹方法
检出。jrt^卜，细胞瞎物样本中的信号比糾培养基样本中的信号强，狄明
蛋白不能被有皿分泌。使用那些在M培养基中产生最强信号的表i^J建体 来转染稳定的CHO细胞系。测量来自稳定的CHO细胞系的蛋白效价，并且如 果可能ii^基于细胞的竟争结合测定中分析了纯化蛋白与IL-17A和IL-17F的 结合。下表显示了用最高表达的构建^^染稳定的CHO细胞系所得到的蛋白 表ii^果。当^蛋白浓度的测量值低于儉测水平时，就##白效^^表示为< 0.5 mg/mLo
下表中包括IL-17RC和IL-17RC/RA蛋白表ii^建体的命名号、所含有的 外显子简述、来自转染稳定的CHO细胞系的蛋白效价和与IL-17A和IH7r的 结合能力。此处未包括表14中所包括的变体的全序列。
表14
table see original document page 155
table see original document page 156
实施例50
IL-17RA/RC-Fc5的^Jj^端序列的测定 蛋白表达：^^I含有编码II^17RA/RCFc5的DNA(;SEO ID NO:157，编码 SEQ ID NO:158的絲醋列)的表錄條染CHO DXB-11细胞。从*化 培养基的回收物中通过蛋白A亲和层析和尺寸排阻色谱纯化IL-17RA/RC-Fc5 蛋白。
N-端g^列分析：^J^)购自Applied Biosystems^司的试剂i^fr标准 的自动N-端多肽测序(Edman降解)。使用Model 494蛋白质测序系统(Applied Biosystems， Inc., Foster City， CA)进行N-端序列分析。使用Seq股ncePro^白质 序列分析软件2.0版(八？口116<1 Biosystems)进行数据分析。样本制备过程包括将 100先學尔(pmol)的样本上样至预循环滤器上。
IL-17RA/RC-Fc辨^K样本编号A1672F、A1774F和A1776F)的N-端序列分 析获得了起泉为L33(亮^^酸)的序列。
实施例51
使用鼠类代月物分子即可溶性鼠类IL"17RA-Fc治疗噁哇酮结肠炎 对雌性C57BL/10小鼠(约20 g)进行了如下所述的噁哇酮结肠炎研究。在第 -5天，通过皮下注射噁哇酮(3%溶于100°/0乙醇)对小鼠致敏，然后，在第0天， 通过，内给药溶于50%乙醇的1.25%噁哇酮进行药物^_。小鼠在lt^的2-3 A^会发生急性结肠炎。通常在第2天将它们处死并收^lia织。
进行了两项独立的噁喳酮结肠炎研究，以确定可溶性鼠类(m)IL"17RA-Fc 是否能够有效治疗小鼠的噁哇酮诱导的结肠炎，这一动物^^型是^^A类溃疡 性结肠炎的模型。由于mlL-17RA-Fc可以中和鼠类IL-17A和IL-17F，这一特征 与人类IL"17RC和IL"17RA/RC能够结合人类IH7A和IL-17F的特;^目类似，因此mlL"17RA-Fc蛋白是本文所述的IL-17RC和EH7RA/RC蛋白的合适的 代用物。
第一项研究的结a明，^^mlU7RA-Fc进行治疗与用PBS进行治疗相 比，噁喳酮结肠炎的小鼠疾病指#^^(包括体重下降、便^MWC^)^(p <
0. 05)下降了约2倍。治疗方案为对噁喳酮结肠炎模型动物每Aip.给药lOO照， 从第-6天或第-l天给药至第l天。与使用PBS进行治疗的噁唑酮结肠炎小鼠相
比，佳月mlL-17RA-Fc治疗的小Iiai^4现出更低的组织学评:^更轻微的结 肠炎诱导的结肠变短症状。
在第二项研究中，对这一模型的小鼠每天用PBS或mlL-17RA-Fc(100照，
1. p.)治疗，治疗从第4天持续至第1天，并^^合适的噁唑酮-载体对照(*予 乙醇)。oH^卜，^9f究中还包括在药物^l7^j^M肠炎恢复的各组小鼠，以 评估mlL-17RA-Fc对这一模型的这一阶^A否有效果。结果表明，在经it^第 -6天至第l天每日给予可溶性鼠类IL-17RA-Fcl治疗后，这一模型的疾病指树 分显著(p < 0.05)下降了约3倍。在患有噁唑酮结肠炎的小鼠组中，使用 mlH7RA-Fcl治疗的小鼠与使月PBS治疗的小IU目比，在第2天出现可JU员伤 的发生率降低，经mlL"17RA-Fcl治疗的小鼠的损伤发生率为37.50/0，而4WI pbs治疗的小鼠的损伤发生率为75。a。 j)^卜，与佳月pbs进行治疗的噁喳酮结 肠炎小！^目比，使用mlL-17RA-Fc治疗的小鼠Mi^J见出改善的组织学评# 更轻鄉< 0.05)的结肠炎诱导的结肠变短症状。在7天')^ia中，所有小鼠在 此时间点都已恢复，因此没有，J?^到差异。在结肠培M(在第2A^小鼠获得 的结肠小块，于37'C培养24小时)中，经过噁唑酮处理的小鼠的所有评估的炎 性细胞因子/趋化因子的水平均比裁/^(乙醇)组小鼠高。在患有噁喳酮结肠炎的 小鼠中，经mlL-17RA-Fc治疗的小鼠与经PBS治疗的小鼠相比，IH7A、 IL-17F、 TNF-a、 IHp、 IL-4、 IL~12、 GM-CSF和IFNi在结肠中的产生量均 有所下降。结肠中的IL"17A和IL-17F的浓度彼此显著相关(R =0.93; p< 0.000001)。 IL-17a和dl-17f的浓度与下列因子的水平显著相关：TNF-a(R = 0.91和0,95; p < 0.0000001)、 IL-ip (R均为0.64; p < 0.01)、 IFN^(R = 0.71和0.72; p〈0.01)和IL-6(R均为0,57; p<0.05)。疾病指才辩分与下列因子在结肠中的产 生l:相关：IL-17A(R = 0.70; p<0.01)、 IL 17F(R = 0.72; p<0.01)、 TNF-a(R =0.76; p < 0.001)、 IL^4(R = 0.59; p < 0.05)、 IL-ip (R = 0.50; p < 0.05)和IFN"y(R =0.52; p< 0.05)。总而言之，^^本iL^斤述的人类IL-17RC和IH7RA/RC蛋白的代用物(例 如mlL-17RA-Fc)的治疗可以,结肠炎疾病症状，减少炎性细胞因子在结肠 中的产生并改善病理学。这些结果表明使用本文所述的人类IL"17-RC或 EU17RA/RC蛋白能够有皿治疗A^类IBD。
实施例52
小鼠IL-17Fit4ii^鼠类疾病模型中的影响
^^J^^如本文所述的方法(见上文部分K)， ^^基因小鼠的制4^)产生i^基
因小鼠，该转基因小鼠^itiL细胞特异性启动子(EuLck^动子)的控制下it4 达IL-17F基因。
IL-17F转基因小鼠的血清中n^l7A与IL-17F的比值与人类相似：内部 开发的基于Luminex的测定手段，发现在EuLck启动子的控制下过表达鼠类 IL-17F的小鼠与野生型小鼠相比IL"17F的血清水平显著升高，该转基因小鼠 IL^17F的血清水平约为2 ng/mL,而野生型小鼠的血清中检测不到IL"17F。在 转基因小H血清中H^17A的水平约为IH7F的十分之一(约0.2 ng/mL)。因此， 在转基因小鼠血清中IH7A与IL-17F的比例约为1:10。在野生型小鼠的血清 中，IL-17A仅为可检出的水平(约0.1ng/mL)。这种IL-17F的血清水平^高于 (如10倍）IL-17A的现象也通常见于患有自身免疫性疾病的人类，因此说明 IL-17F转基因小鼠可用于^A类疾病(例如多发"l!i^化和关节炎)的小！^型中 研究IL-17F的作用。
实验性变应性脑械炎(EAE)的研究：^A类多发，l!^t化的小鼠模型特别 是在鼠类实验性变应性脑械炎(EAE )的小IL^型中进行了两项独立的研究， 以评估IL-17F狄达的影响。C57BL/6背景的EuLckIH7F转基因小鼠作为研 究动物，同窝出生的雄昧C57BL/6野生型小IUW作对照，每只小鼠约2(K22g， 使用MOG35-55/Ribi(第 一项研究)或MOG35-55/CFA(第二项研究)佐剂在第0 U疫各小鼠，然后在第2天通itiv.注射百日咳毒素。每日对小鼠称重并记录 其疾病临床症状(例如尾部和肢体麻痹)的评分。上述两项研究的结果都表明， IH7F转基因小鼠与野生型小鼠相比，疾病的发病和严重程度都有显著(p < 0.05)增加。在第一项研究中，转基因小鼠的发病高峰比野生型更早，平均的疾 病严重程度评分也比野生型高36%。在第二项研究中，IU7F转基因小鼠的疾 病严重程度评分比同窝出生的野生型对照小鼠高50^70%。J^/^秀导的关节炎fCIA)^f究：在人类类风湿性关节炎的小鼠模型特别是 在鼠类胶原诱导的关节炎(CIA)的模型中进行了两项独立的研究，以评估 IU7Fii^达的影响。C57BL/6背景的EuLck IL-17F转基因小鼠作为研究动 物，同窝出生的雄性C57BL/6野生型小鼠^I作对照，每只小鼠约23-28g,使 用鸡II型^^、/CFA通iiC部注射免疫各小鼠，三周后再用鸡II型J!L^/IFA进
行免疫。每日记录小鼠的疾病临床症状(即足;fJt胀)评分。以上研究的结果均
表明，IL-17F转基因小鼠与同窝出生的野生型对照小IU目比，疾病的发病和严 重程度辦显著(p < 0.05)增加(约2.5^3^)。
实施鄉
鼠类IL-17RA-Fc、人类IL-17RC-Fc和人类IH7RA/RC-Fc的药代动力学 对于不同的可溶性IL-17受体(包括人类可溶性IL-17RC和IL-17RA/RC受 体及其鼠类代用物mlL-17RA-Fc)进行了三项独立的研究。在上述研究中佳月 获自Charles River实验室的雌性C57BL/6小鼠。在获得动物时对其进行了M 检查，并将其^^且饲#(每笼5只)。当动物&ijl0-12周龄，平均体重^'J约20g 时，开始研究。
A) 剂量方案
在上述三项研究的各项研究中，将小鼠随机分为以下M旨定的剂量组(每 一剂量组的n-24),并分别通过专门的途條药：^^脉内(".)、M内(i.p.)或皮 下(s.c.，颈背处)。对^-组的小鼠^^照上述指定的给药途,予100pL的合 适的蛋白质。
B) 样本采集
在各不同时间点(从0.25小时^336小时)采集小1>#，在^jfc前，使用氟 烷或异B将小鼠完全^"。在所有的时间点均通过心脏穿刺进4亍^。将血 液收集^清分离管中，静置15^^使絲固。然后将样本以14，000rpm离心 3分钟。离心后将样本等分为125^150 jiL的等分试样并装于带有标签的 印pendorf管中立即置于"80。C储存，直至分析之前，
C) 结果
鼠类IL-17RA-Fc药代动力学研究：".给药的半衰期为61 h; Lp.给药的半 衰期为70h;".给药的半衰期为6911。 Lp,给药的生物利用度为100。/。； s.c.给药 的生物利用度为67%。对于Lv.、 Lp.和s.G途径的给药，分布#^?分别为6.7、 8.7 和10.3 mL。数据采集的最晚时间点为给药后120 h;在这一时间点之前(结果总结于下表)。
人类IL-17RC-Fc药代动力学研究：1义给药的半衰期为72 h; Lp.给药的半 衰期为64h; &<;.给药的半衰期为5411。 &.和^.给药的生物利用度均为100%。 对于i.v.、 ip.和s.c.途径的给药，分布#^?、分别为2.7、 2.4和2,2mLo
人类IL-17RA/RC-Fc(变体1454)药代动力学研究：".给药的半衰期为46 h; *.给药的半衰期为49 h; 8工.给药的半衰期为52 h。 Lp.给药的生物利用度为 100%; s,c给药的生物利用度为69"/。。对于i.v.、 Lp.和s.c.途径的给药，分布体 积分别为1.7、 2.2和3.5mL。
实施例54
鼠类代用^"mlL"17RA-Fc用于治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)的疗效 移植物抗宿主疾病(GVHD)是一种发生于干细胞或骨髓移^Lil输jMl输入 血组分之后的并发症，最常见于免疫功能受损的患者。GVHD最常发生于^^ 移植之后，但是有时也以较>^^率发生于同系移#自*植之后。GVHD可 发生于接受了来自如下儉沐的血液的有免疫活性的患者，所述儉本为纯合的 HLA单倍体型，而所述患者的该单^^型是条^的。这种病症的病因是由于移 植物中含有的免疫活性^^林巴细胞的植入，该淋巴细1&^#^被宿主的抗 原激活并导致增殖。于是这种抵抗感染的细胞就会攻击宿主体内的组织。 GVHD通常分为急性和慢性，急性GVHD是指在移^100天以内发作的疾病， 慢性GVHD是在移植后100天以后发作的疾病。通常该疾病所涉及的组织包括 肝脏、胃肠#皮肤；可食^jl严重的炎症。
当^和受体的HLA"R^的匹酉&^t^H氐、,^",大和患者^",大 时，GVHD的发病率就越高。根据上述以及其他因素，估计该病的发病率为20% 至70%。然而，可能仍有很多GCHD病例未被诊断出和未被^U逸。
急性GVHD的症状包括发渗，由于胆红素浓度升高而导致的皮趺和眼发 黄，以M泻。急性GVHD分为1至4级，4级絲严重的。慢性GVHD可以从 头纽或v^急性GVHD絲而来。慢性GVHD的症状比急性GVHD的症状范围 更广，并且与各种自身免疫疾病的症^目似。某些症状包^N艮症、口千、发 疹、^:和口腔溃疡、关节挛缩(关节难以运动)、肝liiL液的检测结果异常、 肺部僵硬(呼吸困难)、眼炎、吞咽困难、肌肉无力或口腔中长白膜。GVHD的 其他症状包括组织损伤(包括肠道、皮肤、肝脏，在严重的病例中还涉M和肾)以及由于循环系统中炎性细胞因子水平升高而导致的类似败血症的症状
("细胞因子KJ^")。在一些严重的病例中，GVHD可能^Jt命性的。
GVHD的一线治疗包括类固醇(例如甲;^龙(me也ylprediiisolone))疗法。 使用类固醇和环孢菌素A治疗慢性GVHD。类固醇类药物免疫抑制的副作用包 括增加了感染和继发性恶化的几率，这可能^Jt命的。目前4吏用的疗法还干扰 被移植餅细胞的移植物抗肿瘤活性。鉴于上述严重的副作用，需要选棒1±更 高的治疗药物。
预期本文所迷的IL"17RC和IL-17RA/RC蛋白能够有皿治疗GVHD和/或 用于移植。已报it^移植物排斥的患者和动物模型的血清和尿中IL47A(并且 最可能的是IL-17F)的水平升高。因此，使用可溶性的人类IL-17RC或 IH7RA/RC蛋白中和IL-17A和n^l7F可能能使GVHD和/或器官移植具有更 好的结果。
在急性GVHD的小鼠模型中评估了人类IL-17RC和IL"17RA/RC蛋白的鼠 类代用物(mlH7RA-Fc)的效果(Durie et al.， J. Clin. Invest. 94:1333-1338， 1994)。处死亲代小鼠(C57BL/6; n-12)并收集其脾脏。使用两片载玻片将混合 的脾脏研碎以解离脾细胞。向脾细胞悬液中加入^J^緩冲液以除去血细胞。使 用RPMI 1640(10% FBS辟养基洗涤细胞并重悬于合适量的PBS中，使细胞浓 度为3xl08细JI&/ml。将受体小鼠(C57BL/6xDBA/2Fl)分为两组，分别朋PBS 或mlH7RA-Fc治疗。通ii^膜内注射(每次注射150照)进行鼠类IH7RA-Fc 的治疗，从第-l天开始每两天注射一次，直至第15天。在第0天，将8xl(f个来 自B6小鼠的供体脾脏淋巴细胞静脉内注射至受体小鼠(C57BL/6xDBA/2 Fl (BDF1);每组11=10彿内。每周三«_测小鼠体重的变化(^|_该;^型中疾病恶 化的最重要的指征)以及^^T垂死的指征。处死体重比初始体重降>[^20%以上 的小鼠。务他的小鼠在细，植后12-18^Jt死，并收集脾J^血液。
针对T细^B细胞标志物(包括MHC I类标志物H2b和H2d)对^F脏染色， 以，J?J^/受体细胞的比例(急性GVHD脾细胞多为糾细胞)。收集血清，通 itELISA测量IgGl、 IgG2a和IgE的血清水平，以及使用市售的试剂盒(Luminex Corporation, Austin, TX)测量细胞因子和趋化因子的水平。
两项独立研究的结果显示了动物模型与急性GVHD发病的相关性。在PBS 对照中宿主(BDFl)脾细J3&it量减少，^KC57BL/6)的Treg细胞的数量也減少。 在接受治疗的动物中，mlL-17RA-Fc的治疗使得宿JJ陴细胞、CD4+ T细J!fe^ Treg细胞的数量得以维持。治疗未阻止^(C57BL/6)常MX:D4+T细胞的激活或扩散。所有组的动物均具有相似数量的#^常规01>4+ T细胞，并且GITR(糖 皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因)被#^常规004+ T细胞上 调。在两项研究中，经itlL-17RA-Fc治疗的組体重下降不很严重，而JLg两项 研究中，该体重下降比PBS对照^i^著(p < 0.05)降低(第二项研究，见图6)。 IL-17RA-Fc治疗未阻止基于脾脏:体重比的脾肿大，但是在第二项研究中显示， 与PBS处SM^目比，治疗能够减少疾病引起的脾细J^lt量的增加(数量方面^2 倍；p<0.01)。在第一项研究中，经itmlL-17RA-Fc治疗的小鼠与经PBS治疗 的对照小IU目比，IL-10的血清浓JL^增高(增高约2倍；p < 0.05)(IL"10被认 为是一种主要的抗炎细胞因子)。在第二项研究中，经itmlL"17RA-Fc治疗的 小鼠的TNF-a和IFN^的血清浓yl^降低。在两项研究中，使用mBL-17RA-Fc 的治疗均导致宿i^立细胞的百分比^^斷氐(I^f氐约2.5^; p < 0.001)。
综上所述，本文所述的IL"17RC和IL-17RA/RC蛋白的鼠类代用物 (mlL-17RA-Fc)对于GVHD的鼠类模型具有治疗效果。上i^a明，使用本 文所述的人类IL-17RC和IL-17RA/RC蛋白能够有皿治疗GVHD和移植物排斥。
实施例55
在293F细胞中表达IL"17A-CH6/IL-17F-CEE异二聚体 通过在酵母中的同源重组，在pZMP45栽体中分别构建了编码 IL-17A-CH6(核普酸序列和^J^酸序列分别示于SEQ ID NO:186和187)和 IH7F-CEE (核苷酸序列和M酸序列分别示于SEQ ID NO:188和189)的两种
表ii^粒。
^^先前产生的含有IH7A的质粒作为模板，使用正向引物zc57312以产 生与pZMP45的5，重叠区域，佳月反向引物zc48893以产生丝氨酸-甘氨酸连接 物、6x组氨酸标v^和与pZMP45的3，重叠区域，通itPCR方法生^JL"17A-CH6 片段。使用先前产生的含有IL-17F的质粒作为模板，使用正向引物k57314以 产生与pZMP45的5，重叠区域，使用反向引物zc58978以产生丝氨酸-甘氨酸连 接物、EE标蕃(EEYMPME;SEQIDNO:190)和与pZMP45的3，重叠区域，通过 PCR^法生成IL-17F-CEE片段。4捐Platinum® PCR SuperMix High Fidelity 试剂盒(Invitrogen， Cat.弁12532-016)进行PCR扩增，PCR^fH^下：94。C ， 2 min 的一个循环；（94°C, 30秒—55°C, 30秒—68°C， 45秒)x30个循环；然后^#在4。C。然后在l。/。琼脂糖^^和lxTAE中对PCR^:^^进行电泳。切下 正确条带^HMQiagen公司的:^纯化试剂盒进行纯化(Qiagen， Cat.#28704)o
pZMP45质粒是一种哺乳动物表达载体，它具有的表达盒中含有CMV启 动子、内^A、用于插入编码序列的多个限制性S^J位点、otPA信号肽序列、 SV40终止子、大肠杆菌复制起存、、以^于在酿酒酵母(51mw^從)中筛选和 复制的URA3和CEN-ARS序列。
将100nL的电感受态酿酒酵母(S. cerevisiae)细胞与10nl的上述纯化的DNA 相混合，再混入100 ng的经丑g/II酶切的pZMP45质粒，将上述混*转移至 0.2cm电穿孑L杯中。对上述酵母-DNA的混合物进^(K75kV(5kV/cm)、 ooohms 和25fiF的电脉沖。向每个杯子中加入l ml的L2M山梨醇，然后将所述薜母置于 URA-DS盘中于30。C下培养。约72小时后，从一个盘的Ura+酵母转4沐中取出 约50jtL的堆积酵母细胞，重悬于100jiL^J^緩冲液(2n/。 Triton X-IOO、 1% SDS、 100mMNaCl、 lOmMTris、 pH8.0、 lmMEDTA)、 100jiL的Qiagen微量制备 试剂盒(Qiagen， Valencia, CA，产品目录号讼7104)中的Qiagen P1緩冲^p20U 的酵母，酶（Zymolyase) (Zymo Research, Orange, CA，产品目录号射OOl) 中。将上述^^置于37。C培养30^h然后加入试剂P2并进^Qiagen微量制 备试剂盒中所述的其余流程。使用4(HiLEB试剂'WtDNA。
在0.2«11电穿《沐中，使用2nL酵母DNA转化15pL的电感受态:^杆菌细 胞(DH12S，Invitrogen， Carlsbad, CA)。对细l&ii行1.75kV、 25jiF和400 ohm的 电脉冲。在电穿孑L^后，向杯子中加入l ml SOC(2% Bacto Tryptone(Difco， Detroit, MI)、 0.5。/o酵母提取物(Difco)、 10mM NaCl、 2.5mM KC1、 lOmM MgCl2、 10mMMgSO4、 20mM葡萄糖)。将该溶^3E于两处B AMP^Lh(LB 肉汤培养^(Leimox)、 1.8% BactoAgar(Difco)、 100mg/L^千青霉素)，其中一 ^A200nL^化体，另一:fe^入100nL转^^。
从转化^Ui^^各单菌落，通过测序识别出 一个含有IL"17A-CH6的正 确表ii^I建体的菌落和一个含有IL-17F-CEE的正确表,建体的菌落。佳月 Invitrogen大量制备试剂盒(Invitrogeii， Carlsbad, CA»产品目录号#457009)，根 据厂商的说明书进行;t^漠的质粒DNA分离。
转染至293F细胞
为了测试IL-17A-CH6"IL-17F-CEE异二聚体的表达，使用Lipofectomine 2000试剂盒(Invitrogen， Carlsbad, CA，产品目录号針1668-019)和OptiMEM培 养基(Invitrogen， Carlsbad， CA，产品目录号紛1985^070)对293F细JJfci^f亍瞬时转染，然后在12《USL上生长。由于已经测得IL-17A比IL-17F蛋白表达量要少， 因此在转染中使用的DNA比例为3^IL"17A-CH6比1份IL"17F-CEE。在转染中 使用2ng的质粒DNA和lxl()6细胞。在96小时后收获培养基并准备进行蛋白质印 迹测定。
寸捐Invitrogen公司的试剂和方法进行蛋白质印迹测定，佳月抗^6x组氨酸 抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN，产品目录号弁MAB050H)作为检测 IL-17A-CH6的枱r测抗体，使用自制的小鼠mAb作为抬铡IL"17F-CEE的检测抗 体，^^Jackson HRP-山羊抗小鼠IgG (H+L)(产品目录号#115-035^003) + BD ?31111.111«»-抗小鼠每02&(1119-15)(产品目录号然53391)作为4。观察到明显 的表达，因此证明实现了;U^转染并由此能够获取蛋白。
实施例56
从CHO DXB11细皿养表达产物中纯4^"^A类IL-17A:IL-17F异二聚体 在WAVE设备中培^CHODXBll细Jlfciyf细J^^称，并由该细胞中的 单链构建体表达产生重纟^A类BL-17A:IL"17F异二聚体蛋白(zcyto40f2 v.2)。所 ,建体含有人类IL"17A的序列和H^17F的序列(构建体1789; C-His#^)，其 中所述IL-17A的序列的N端和IH7F的序列的C端通过一个(G4S)3连接物相连 接。在C端加上一个His标签以便于有^^捕获产物。收获大约IO L的^H战 养基，使用0.2jim滤器过滤除菌。在^NHt下加入乙酸以将培养基调节至pH 5.0。在此pH值下会出现明显的沉淀过程，使用0.8至0.2nm的两相滤器(Pa11 Corporation)对上述调节:J^pH的培养基再次进行itJ虑。 阳离子交换色谱
然后将上述调节好的培养基以10 ml/min的ii;UL样至配备有AKTATM 探索者色射台(GE Hea他care)的预平衡的阳离子交换柱(16 mlii床体积； 2cm直径(SPFastFlowresin，GEHeatthcare))上。平l^沖^pH5.0， 0.02 M 乙酸和O.lMNaCl。当上样完成时，使用2(H条柱^P、的平M冲^t柱子进行 洗涤，由jtb^得280 nm处的UV的稳^J^。
然后以20ml/辨的j;M/舰结合的蛋白，«的级分裕ml/份收集，洗 脱液共2(H^柱^?"其梯JL^7从平l^冲紅^y^沖液：0.02 M乙酸、1.0M NaCl、 pH5.0。通itSDS-PAGE和考马斯染色和蛋白质印i^r法对级^4i行分 析。在梯度洗脱中得到两个洗脱峰，其中第一^H^^^要的，，争，在该峰中 观察到一条38kDa的明显条带。主峰#^1结构域包^#20-48级分在内表现出抗His标、签染色，将在蛋白质印迹分析中可被染色的4^P宽度均^^在""^，以 用于下一步研究。
IMAC色^(金属#^亲和歩骤）
#5 mL HisTrap IMAC柱(GE Hea他care)用20倍柱棘的^0.5 M NaCl、 50 mM磷酸的钠盐、25 mM咪哇、pH 7.5的緩冲液进行平衡。向上述144 ml 的阳离子交换色镨的^^中加AA量的固体咪哇，以使得其中咪喳的浓度达 到25mM。再加入0.51\1磷酸二氬钠和0.5]\1磷酸氲二钠的等摩尔';^^液，以使 得其中磷酸根緩冲液的浓度达到20 mM，此时再用2N NaOH将溶液的pH调至 7.5。
将调节好的阳离子交换色谱^^准备上样至HisTrapIMAC柱。上样流 速为4ml/min。当上样完成时，使用4(H^柱体积的平衡緩冲液洗涤IMAC柱， 然后用^0.4 M NaCl、 400 mM咪喳、pH 7.5的緩冲液进行、舰步骤。在更换 为洗m冲液后不久，：lt^上皿下一个明显的峰。
;^^上述物质并絲至3 ml以用于最终的尺寸排阻色谞步骤中的^^.
尺寸排阻色谱歩骤
将来自EMAC步骤的浓缩物注入预平衡的Superdex 200(GE Hea他care;16/60; 120 ml)SEC柱上，i链为1.5 ml/min，流动相为35 mM磷酸 钠緩冲液、109mMNaCl、 pH7.3。级分收集为1.5 ml/份。在较早的时候会出 现一些水平较低的,物质，然后在0.7倍柱«?、的时候出现一个非常对称的洗
现的物质。将级分^給用于;备k高纯度的产物，并排i^"些含有产物"共洗
脱的不想要的污染物的级分。
纯化的单MA类II^17A:II^17F异二聚体的分析
对重组的单链人类IL-17A:IL^7F异二聚体进行如下分析：先是 SDS隱PAGE (10% BisTris， Invitrogen， Carlsbad， CA)以朋0.P/。考马斯R250 对蛋白进行染色，然后絲^^酸纤维素J^Ji,^^抗-His-HRP进行免疫染色。 ^^1 Invitrogen Novex，sXcell II ^M"纯化蛋白进行电泳，然后在室温下，在 含有25mMTris^、 200mM甘氨酸和20。/o甲醇的緩冲液中，以600mA电转移 45辨，絲白絲J^酸纤维素膜(0.2mm;Invitrogen，Carlsbad，CA)上。然 后^^含10%脱脂奶粉、50mMTris、 150mMNaCl、 5mMEDTA、 0.05% Ig印al (TBS)的緩沖液在室温下封闭滤膜15分冲。快速地洗涤硝酸纤维素膜， 加入偶联有HRP的特异性^(1:2500)。在温和振荡的M下在4。C培养蛋白印迹物过夜。培R后，将印迹物在TBS中洗涤三次，每次15介幹，然后在水中 快速洗涤。然后使用市售的化学^A物试剂(Roche LumiLight)使印迹物显 色，并使用Lumi-Imager，s Lumi Analyst 3.0软件(Boehringer Mannheim GmbH， Germany)捕获信号。非还原性考马斯染色分析发现二聚体产物以双条 带形式存在，其中下方的带为主^带。
对i^^性和非还原性产物进行的SDS-PAGE和考马斯染色分析发现， 聚体多狀链的表观电泳迁移度的位置上出现了强度不成比例的双条带。双条带 中上方的条带为观察到的主要条带。还原性SDS-PAGE和蛋白质印迹结果显 示，较低^^*#类的量很少，几乎可被忽略。取100 pmol的产物进行了N端 序列分析。结果表明单:^N端回收的可重复性产量为57.9 pmol, N端的絲为 G24，这是人类IL-17A^列的起泉。絲^l且成分析的结^ii了上itS^^且 成。分析性尺寸排阻色语表明产物的纯度大于99%。
实施例57
通it^面等离子共^^iacore)测量IH7RA/RC-Fc5与IL"17A/F异二聚体的结
合亲和力
进行本研究的目的是评估IL"17RA/RC-Fc5(变体1454)与IL-17A/F双链异 二聚体的结合亲和力。 亲和力测定
通过表面等离子共振，测量了IH7RA/RC-Fc5与IL"17A/F异二聚^f4^^原 的相互作用的动力学ii^常数、平M合常数和平衡醉离常数。结^1常数 (ka (M-V")狄映:^^-受体复絲形^^的数值。解离i^常数(kd(s、)是 反映该复^稳定性的数值。平衡结合亲和力通常^L^示为平,离常lt(KD (M))或平衡結合常数(Ka (M1))。 KD是用解离速度常数除以结合速度常数 (kd/ka辨到的，而KA^结^^常数除以解离i^JL常数(ka/kd)得到的。具
i4JL常数。因此，测量ka和kd，以及Ka或Kd，可以有助于唯一,述受秦 抗原相互作用的亲和力。 材粉方法
进行下述试验以测量纯化的IH7RA/RC-Fc5受体与重组人类IL-17A/F异 二聚体的结合亲和力。在BiacoreT100胃系统(GEHeal也care，Piscataway，NJ) 上进行结合动力学和亲和力研究。佳月Biacore T10()m控制软件，v l.l.l编程以^^J"Biacore T100顶系统进行操作。由于IH7RA/RC-Fc5受体^^有人类Fc 结构域，因此在研究中使用山羊抗AJgG Fcv/(Jackson ImmunoResearch， West Grove， PAyft为捕获M。 ^^0.4 M EDC [N-乙基-N，-(3-二乙^tJ^丙基)^1 二亚胺】和0.1 MNHS (N-幾^t珀跣亚胺)的^^，将捕获^MW固定^^ CM4传感器芯片上，使其密度达到约4000 RU。在固定化^^后，使用1M 乙醇胺封闭流通池上的剩余活性位点。CM4芯片上的一个流通池捕获的 IL-17RA/RC-Fc5受体的近似强度为90-100 RU。以10fiL/分冲的流速ii行受体 与固定^f汰面的捕获过程。Biacorei殳备能够测量传感器芯片表面上结合的蛋白 的质量，并由此确定^分析循环中捕获到的可溶性受体的量。
为了进行H7A/F异二聚体（如上文实施例55所述的 IL^17A-CH6/IL-17F-CEE双链异二聚体)的结合研究，将抗原按照l:3的比例进 4亍系列稀释，获得浓度为3311]\1至0.01511]\1的一系列稀释液，将所述稀#"液注 射至传感器芯片表面，以使其能够与传感器芯片上捕获的IH7RA/RC-FC5受 ^^Li特异性结合。每种浓度的IL"17A/F抗原稀释液重复注射两次，结合时间 7分钟，解离时间15分冲。以30nL/分冲的流速进行动力学结合研究。所有的结 合试验均在25。C下进;f亍，所使用的緩冲液均为含IO mM HEPES、 150 mM NaCl、 3mMEDTA、 0.05。/o表面活性剂P20(GE Healthcare, Piscataway，NJ)、 1 mg/mL牛血清白蛋白(Proliant Biologicals， Boone， IA)、 pH 7.4的緩沖液。
在^—分析循5?^间，使用20mM盐酸洗涤流通池以再a面。这一洗涤 步骤的目的是从固定化的抗体表面洗去捕获的IL"17RA/RC-Fc5受体，以使得 下一样本中的受体可以再次结合。Biacore T100™ Evaluation软件(l.l.l版)
整理数据。将所得的测量值数据减去参比流通池的测量值和空白注射的^y?
实际测量值。评估了絲稳定性，以保絲整个各次注射过程中再生步骤均提 供了一致的表面结合能力。重复注射两:^A为了检查可重复性。IH7A/F异二 聚体具有IL-17RA/RC-Fc5受体的两个可能的结^H吕(IL-17A和IH7F)。如果 该异二聚体中仅有一^分与受体结合，那么使用简单的l:l结合模型应该是 合适的，并JL^合曲线应符合这一模型。然而，如果该异二聚体中的IH7A部 ^IH7F部分均与受体结合，那么使用二條合模型应该是合适的，并JL^ 合曲线应符合这一模型。所述结合曲线总体上符合l:l模型和二价分析物结合 模型。 结果表征了 IH7RA/RC-Fc5受体与人类IH7A/F异二聚体抗原的结合亲和 力。测量了结^^常数(1%(]\1^-1))和解离^常数(1^(8-1))。虽然所得的结 合曲线不符合l:l结合模型，但是所得数据符合二价分析物模型。这一结果与 IL-17A/F异二聚体中的两^NP^(IU7A和IH7F)均与受体结合的预计相符。 二价分析物结合模型测量两个ka值(k^和ka2)和kd值(kdi和kd2)。第一系列的 数值(k^和k(U辦述了相互作用的-"^动力学。所^il的这些样本的亲和力来 自于上述数值，并净il4示为KiH和KM。第二系列的数值(ka2和kd2)表示的是 相互作用的总体亲合力，并J^^L有M。所测得的结合动力学为：k^为5E405 (]VrV1)， 1^1为2£-03(8-1),由此计算出的KDi为4E-9(M)[KA工为2E+8(]Vr1)】。 这些数值与对IL-17A/A和IL-17F/F同二聚体测量得到的结勤目近。
表15: IL-17A/F异二聚体的结合亲和力
table see original document page 168

实施例58
IL-17A/F异二聚体活'I4^其与IH7RA/RC-Fc5的中和^JI 使用IL-17A/F异二聚体构建体（单链或双链的zcyto40f2v.和单链的 zcyto40f2)测试了活'l!iA其与IH7RA/RC-Fc5的中和反应。IL-17RC活性测定 ^J^iLKZ17財艮告物构建体转染的NIH-3T3细胞，以便通过荧光素酶报告物测 定检测由NTKB介导的IL-17A和IH7F信号。在这一测定中，两种异二聚, 建体都表现出剂量，性反应，其中双^J建体的EC5(H直为15.19 nM，单链 构建体的EC5(H直为20.59 nM。 IL-17A和IH7F同二聚体^^J见出剂量依赖性 a，其£€5條分别为2.026禮和17.31亂
还使用基于NIH-3T3/KZ170荧光素酶才艮告物细胞的中和测定测试了 IL-17A/F异二聚体构建体。使用固定浓度的配体滴定了可溶性受体 IL-17RA/RC-Fc5(变体1454)，并在报告物生物测定对其进行了测试。两种异二 聚,建体均可被可溶性受体IL-17RA/RC-Fc5中和，并呈现剂量，性反应， 其中双链构建体的IC50值为3.169 nM，单链构建体的IC50值为13.34 nM。 IL-17A和EL-17F同二聚体^JJ(L出剂量絲性反应，其IC50值分别为0.1673 nM*0.8735nM。M文的描述可以认识到，虽然本文出于说明的目的描述了本发明的*实施方案，但是在不偏离本发明,和范围的前提下可以进行各种改变。在本
文中所引用的所有出版物、专利和专利申请的4r^内^l通ii^因的方式纳入本文，并用于所有目的。
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