技术领域
[0001] 本
发明涉及一种成纤维细胞的培养方法，尤其涉及一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法。
背景技术
[0002] 成纤维细胞，也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，属于终末分化细胞，这种细胞会分泌
胶原蛋白等
蛋白质。在人体的细胞中成纤维细胞数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清，具有突起。其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。
[0003] 成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜
碱性，胞核较大呈椭圆形，
染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基
复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。除此之外，成纤维细胞可分泌多种细胞生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮细胞生长因子等，这些细胞生长因子可进一步促进细胞再生，加快组织修复，故其在组织损伤修复和美容中起到至关重要的作用。目前研究者们已针对于此做了很多研究，并已取得了多项积极的成果，这些研究结果已证实上述结论。针对于这些研究结果，研究者们正在积极的采用成纤维细胞开发用于组织修复和美容的产品，但在开发这些产品中成纤维细胞的来源、活性及纯度对产品的疗效都起到决定性的作用，而目前开发的产品成纤维细胞大部分来源于人体
皮肤、易对人体表面造成创伤及疤痕，同时其
现有技术培养的成纤维细胞周期长，活性及纯度均较低，导致开发的产品功效不足，为了开发出功效佳的产品，培养出高活性及高纯度的成纤维细胞至关重要，基于此，本公司经过多年研发，建立了一种成纤维细胞培养方法，该培养方法可在短期内培养出大量、高活性及高纯度的成纤维细胞，这些成纤维细胞可用于组织损伤修复产品及美容产品的开发。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于，提供一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法，以在缩短的细胞培养周期内，得到产量、纯度、活性更高的成纤维细胞。
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案。
[0006] 本发明提供了一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法,包括以下步骤:
[0007] (1)组织采集：从口腔粘膜组织中采集样本；用
磷酸盐缓冲液加抗生素洗涤黏膜组织,随后将洗净的组织放置到含二甲基亚砜、胎
牛血清和培养基的保存溶液中，液氮保存；
[0008] (2)原代培养:使用75％酒精短时消毒新鲜解冻的黏膜组织，随后用不含
钙和镁的磷酸盐缓冲液进行洗涤，切成小
块，在室温下，在轻微
水平摇动下使用I型，II型胶原酶和II型分散酶的组合物进行过夜消化，以使原代培养组织
破碎；将过夜消化后的组织在含血清的专用培养基中培养10-20天；
[0009] (3)细胞纯化培养：当(2)中的细胞融合度达到50％以上时，加蛋白酶消化，在
显微镜下观察细胞形态，终止消化；将细胞传代到培养瓶中培养7-10d,当细胞融合度达到85％以上时，
收获细胞，此时细胞为第一代细胞P1；将第一代细胞传代到培养瓶中，培养3-4d，当细胞融合度达到85％以上时，收获细胞，此时细胞为第二代细胞P2；在自动细胞扩增系统中将第二代细胞继续扩增5-7天，在培养过程中每天检测乳酸值，当乳酸值显示培养的细胞达到亚饱和状态时，收获细胞，此时收获的细胞为所需数量的第三代细胞P3，即成纤维细胞。
[0010] 进一步地,所述自动细胞扩增体系中的培养过程为:将第二代细胞的1×107-2×107个细胞转移到自动细胞扩增体系中，其系统为全封闭系统，在5％CO2、37℃条件下进行培养，在培养过程中通过测量产生的乳酸或吸收的
葡萄糖情况，判断系统内细胞的生长情况，当细胞数量达到2×108-8×108个细胞，并且细胞仍处于指数生长期时，使用含有EDTA的
0.25％胰蛋白酶消化收获细胞，将收获的细胞在无菌PBS中洗涤并进行细胞计数，其细胞活
力＞95％，具有典型的成纤维细胞形态。
[0011] 进一步地,所述的细胞纯化培养的过程为：
[0012] 待步骤(2)中制得的口腔黏膜成纤维原代细胞的融合度达到85％后,进行传代培养:先用磷酸盐缓冲液洗涤口腔黏膜成纤维细胞,并用胰蛋白酶液进行消化,将所述消化得到的细胞加入新鲜的培养基继续培养,依旧贴壁的细胞丢弃，如此过程反复操作，得到纯化的口腔粘膜成纤维细胞。
[0013] 进一步地,步骤(2)的操作方法中还包括用
剪刀将所述粘膜小块剪至呈糊状,移至培养瓶,加入专用培养液,在37℃、5％CO2的
培养箱中静置培养,直至获得口腔粘膜成纤维原代细胞。
[0014] 进一步地,所述步骤(3)中，在细胞传代时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当纤维状细胞收缩变圆并漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。
[0015] 其中,所述第三代细胞总量为2×108-8×108个。
[0016] 其中,所述第三代成纤维细胞的纯度≥99％。
[0017] 其中,所述第三代成纤维细胞的活性≥95％。
[0018] 进一步地,将所述第三代细胞先进行数量、活性、纯度和安全性测试,并在液氮中冷冻保存。
[0019] 进一步地,所述步骤(1)中，分别从颊粘膜、
牙龈沟、牙龈、牙槽腭的一个或几个部位的口腔粘膜组织中采集样本,作为细胞提取组织。
[0020] 进一步地,所述步骤(1)中的口腔粘膜组织为完整口腔粘膜组织，包括上皮层、固有层、粘膜下层。
[0021] 进一步地,所述步骤(1)中，所述抗生素的用量为标准浓度的2倍。
[0022] 优选地，所述抗生素的用量为标准浓度的2倍，其中青霉素的浓度为200U/mL，
链霉素的浓度为200μg/mL。
[0023] 本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0024] 1.使用本发明所述的方法获得成纤维细胞的周期更短。
[0025] 使用本发明所述的方法，口腔粘膜细胞的平均倍增时间约为26.9小时。增殖时间(培养时间)约为27.7天。总体而言，使用本发明所述的方法，培养口腔粘膜细胞所需的时间比常规方法缩短了1-2个月。
[0026] 2.使用本发明所述的方法获得的成纤维细胞产量高，因只需三代培养，所以细胞的活性更高。
[0027] 使用本发明所述的方法获得的第三代细胞量大幅增加。经实验显示，相比之下，使用本发明所述的方法，采用口腔粘膜组织培养的成纤维细胞在第3代的平均产量为6.0×108个细胞，其细胞量可对应于通过诸如“堆积培养”或“滚瓶”技术等其他方法所制备的7-
10代细胞的细胞量。
[0028] 而传代次数的增加和培养时间的延长，通常会降低所得细胞制剂的效力和活性，通过本发明所述的方法培养得到的成纤维细胞的活性和效力更高。
[0029] 3.细胞活性高。
[0030] 经实验显示，口腔粘膜成纤维细胞为99.5％。相比之下，“堆积”培养体系的存活率往往低于90％。因此，根据本发明所述的方法获得的细胞活性更高，产品效果更好。
[0031] 4.使用本发明所述的方法，从口腔中采集黏膜组织，培养成纤维细胞，来源方便，成本更低，更易于大范围内推广，且口腔粘膜伤口恢复快，可避免表面疤痕。
[0032] 5.使用本发明所述的方法获得的成纤维细胞与纯成纤维细胞群高度吻合。
[0033] 6.建立了自动细胞扩增体系，在较大的程度上替换了人工培养，从根本上降低了成纤维细胞培养过程中的污染几率。
[0034] 7.使用本发明，从商业
角度来讲，大大降低了人力成本及时间成本。
附图说明
[0035] 图1为本
实施例1所获得的口腔粘膜成纤维细胞在4倍显微镜下培养21d时的细胞状态图。
[0036] 图2为自动细胞扩增系统细胞培养预测值
[0037] 图3为实施例1中的口腔黏膜成纤维细胞的流式检测结果图。
具体实施方式
[0038] 为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效,以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法，其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。
[0039] 实施例一
[0040] 本实施例中提供了一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法,包括以下步骤:
[0041] (1)组织采集：在口腔粘膜组织中，分别从颊粘膜、牙
龈沟、牙龈、牙槽腭中采集样本，样本长度约为3-4mm，在其他的实施例中，也可从颊粘膜、牙龈沟、牙龈、牙槽腭的一个或几个部位采集样本。然后，用磷酸盐缓冲液加标准浓度2倍的抗生素洗涤黏膜组织,本实施例中，青霉素的浓度为200U/mL，链霉素的浓度为200μg/mL,随后将洗净的组织放置到含二甲基亚砜、胎牛血清和培养基的保存溶液中,梯度降温后液氮冷冻保存；
[0042] (2)原代培养:使用75％酒精短暂
接触、消毒新鲜解冻的黏膜组织，随后用不含钙和镁的磷酸缓冲液进行洗涤，切成小块，在室温下，在轻微水平摇动下使用I型，II型胶原酶和II型分散酶的组合物进行过夜消化，以使初代培养组织破碎；将过夜消化后的组织在含血清的专用培养基中培养10天；
[0043] 在其他的实施例中，也可培养15天，或20天，或其它天数；
[0044] 在其他实施例中，也可用剪刀将所述粘膜小块剪至呈糊状,移至培养瓶,并加入专用培养液,在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养,直至获得人口腔粘膜成纤维原代细胞。
[0045] (3)细胞纯化培养：当(2)中的细胞融合度达到50％以上时，加胰蛋白酶消化，在显微镜下观察细胞，根据细胞变化终止消化，将细胞传代到T75培养瓶中培养7d。当细胞融合度达到85％以上时，进行传代培养:先用磷酸盐缓冲液洗涤人口腔黏膜细胞,并用胰蛋白酶液进行消化,收获消化后的细胞，依旧贴壁的细胞丢弃，此时细胞为第一代细胞(P1)；将本次消化得到的细胞传代到T175的培养瓶中加入新鲜的培养基继续培养3d,当细胞融合度达到85％以上时，收获细胞，仍然去掉依旧贴壁的细胞，此时细胞为第二代细胞(P2)；
[0046] 在自动细胞扩增体系中将第二代细胞继续扩增5天，在培养过程中每天检测乳酸值，当乳酸值显示培养的细胞达到亚饱和状态时，收获细胞，仍然去掉依旧贴壁的细胞，此时收获的细胞为所需数量的第三代细胞(P3)，即成纤维细胞。
[0047] 当(2)中的细胞融合度达到50％以上时，加胰蛋白酶消化，在显微镜下观察，当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化，将细胞传代到T75培养瓶中培养。
[0048] 在其他的实施例中，P0代细胞传代到T75培养瓶后，也可以培养10天或其他天数,当细胞融合度达到85％以上时，收获细胞；第一代细胞传代到T175培养瓶中可以培养4天或其他天数,当细胞融合度达到85％以上时，收获细胞；第二代细胞在自动细胞扩增体系中扩增时间可以为7天或其他天数,当乳酸值显示培养的细胞达到亚饱和状态时，收获细胞。
[0049] 其中,自动细胞扩增体系的培养过程为:将第二代成纤维细胞的(1-2)×107个细胞转移到自动细胞扩增体系中，该体系采用的介质为特殊配方所配置的介质，其系统为全封闭系统，在5％CO2、37℃条件下进行培养，在培养过程中通过测量产生的乳酸或吸收的葡萄糖情况，可以准确的判断系统内细胞的生长情况，当细胞数量达到2×108-8×108个细胞，并且细胞仍处于指数生长期时，使用含有EDTA的0.25％胰蛋白酶消化收获细胞，将收获的细胞在无菌PBS中洗涤并进行细胞计数，其细胞活力＞95％，具有典型的成纤维细胞形态，无细菌、
真菌、支原体污染，其内毒素含量在标准范围内。
[0050] (4)将获得的第三代细胞，进行测试，测试结果如下表1,之后于液氮中冷冻保存。
[0051] 表1:存活率与安全性检测结果表
[0052]
[0053]
[0054] 本实施例中获得的成纤维细胞，培养周期为29.5天，其第三代细胞活性为99.8％，产量为6.2×108个细胞，纯度大于99％。
[0055] 参见图1,为本实施例所获得的口腔粘膜成纤维细胞在10倍显微镜下培养21d时的细胞状态图，其表现出典型成纤维细胞生长形态。
[0056] 参见附图2，为自动细胞扩增系统细胞培养预测值。通过细胞在扩增系统的理论数量，在指数生长末期，或者到达产量要求时，收获细胞。
[0057] 参见附图3，采用流式细胞仪对自动细胞扩增系统收获的成纤维细胞所表达的表面标记物进行分析,结果显示，该细胞类型对CD90、CD105和CD26均呈阳性，而对HLA-DR呈阴性。纯度达到99％以上，这与纯成纤维细胞群高度吻合。
[0058] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单
修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
