技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体涉及抗
牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和国际命名为Solobacterium moorei三种
口腔厌
氧菌的特异性复合卵黄抗体及其制备方法及应用。
背景技术
[0002]
牙周病是一种非常常见的口腔
疾病，是危害人类
牙齿和全身健康的主要口腔疾病。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)是目前公认慢性
牙周炎的主要致病菌，与牙周病的发生密切相关，牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者的龈下菌斑中检出率高达98.15％，是慢性
龈缘炎、慢性牙周炎、侵袭性牙周炎的优势致病菌。
[0003] 具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.n)被认为是牙周
生态系统的优势菌和牙周病的病原菌，其在菌斑成熟过程中起关键作用，能与广泛的细菌和宿主细胞发生粘附共聚，代谢产物能够影响其他细菌生长代谢，还能诱导免疫细胞免疫表达和免疫抑制，从而去增强其他致病菌的治病能
力。
[0004] 研究表明，Solobacterium moorei分布于大部分口臭患者口腔内，而在健康受试者中出现的
频率远小于口臭患者，说明Solobacterium moorei与口臭有着密切的联系，是一种口臭致病菌。
[0005] 对于
预防和
治疗牙周病及口臭可以从这几个主要致病菌抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和Solobacterium moorei入手，有效的抑制这几种主要致病菌。
[0006] 卵黄抗体又称卵黄免疫球蛋白，是禽类蛋黄中存在的唯一的免疫球蛋白，目前应用较多的是鸡卵黄抗体，是用
抗原免疫产蛋母鸡后，鸡血清中科产生相应的抗体，母鸡又能以产蛋的方式将血清中的抗体有效地转移至卵黄中。不同的抗原免疫就会产生针对该抗原的特异性卵黄抗体。
[0007] 目前已有研究表明，特异性卵黄抗体对口腔中
变形链球菌引起的龋齿有比较显著的预防效果；口服卵黄抗体可为人或动物提供有效的被动免疫保护，防治由于细菌或病毒引起的一些消化道感染等。
[0008] 卵黄抗体无需
采血符合现代动物保护规则，产生的抗体量大，专一性强，性质稳定，无毒
副作用，且不仅具有能与抗原结合的能力还对抗原菌的生长具有显著的抑制作用。
发明内容
[0009] 为了克服
现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供了一种特异性复合卵黄抗体的制备方法。
[0010] 本发明的再一目的在于提供一种由上述制备方法制备得到的特异性复合卵黄抗体。
[0011] 本发明的又一目的在于提供上述特异性复合卵黄抗体的应用。
[0012] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0013] 一种特异性复合卵黄抗体的制备方法，按照以下操作步骤：将牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和国际命名为Solobacterium moorei的细菌混合后制备成复合抗原，对蛋鸡进行初次免疫和加强免疫，共计免疫五次；从第一次加强免疫开始，收集鸡蛋，得到卵黄液，分离并纯化得到特异性复合卵黄抗体。
[0014] 上述特异性复合卵黄抗体的制备方法，具体按照以下操作步骤：
[0015] (1)将培养的牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和国际命名为Solobacterium moorei的细菌分别溶于PBS制备成浓度为1.2×109CFU/mL的菌悬液，再将三种菌悬液按照体积比1:1:1进行混合得到三种菌的混合菌悬液，将混合菌悬液分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按照体积比1:1进行混合，充分乳化，分别制备成弗氏完全佐剂
疫苗和弗氏不完全佐剂疫苗；
[0016] (2)选取20周龄产蛋母鸡；初次免疫使用弗氏完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml；初次免疫两周后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫4次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋，并存放于4℃；
[0017] (2)将获得的免疫鸡蛋用酒精消毒，破壳收集蛋黄，用
水稀释，离心获得
水溶性成分，采用PEG6000进行沉淀获得特异性复合卵黄抗体。
[0018] 一种根据上述制备方法制备得到的特异性复合卵黄抗体。
[0019] 上述特异性复合卵黄抗体在制备口腔喷剂、漱口水、牙膏、口香糖或含片中的应用。该特异性复合卵黄抗体可以制成各类预防及治疗牙周病及口臭等的口腔喷剂、漱口水、口香糖及含片。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明研制了抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和Solobacterium moorei三种口腔厌氧菌的特异性复合卵黄抗体，代替抗生素等，更加有针对性的防治牙周病及口臭，为牙周病及口臭的预防和治疗提供一种安全有效的新方法。
具体实施方式
[0021] 下面结合
实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0022] 实施例1：
[0023] 一种抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和Solobacterium moorei的特异性复合卵黄抗体的制备方法，其特征如下：
[0024] (1)选取具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,ATCC 25586)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,ATCC 33277)、Solobacterium moorei(JCM10645)，将三种菌株分别在BHI-S血琼脂平板上复苏传代，并经鉴定确认为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和Solobacterium moorei；
[0025] (2)免疫原制备：将培养的牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和国际命名为Solobacterium moorei的细菌分别溶于PBS制备成浓度为1.2×109CFU/mL的菌悬液，再将三种菌悬液按照体积比1:1:1进行混合得到三种菌的混合菌悬液，将混合菌悬液分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按照体积比1:1进行混合，充分乳化，分别制备成弗氏完全佐剂疫苗和弗氏不完全佐剂疫苗；
[0026] (3)免疫：选取20周龄产蛋母鸡；初次免疫使用弗氏完全佐剂疫苗，采用双翼或胸肌处皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml；初次免疫两周后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫4次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋，并存放于4℃；收集未免疫鸡蛋作为阴性对照品；
[0027] (4)将获得的免疫鸡蛋用75％的酒精消毒，破壳收集蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，测定蛋黄体积，将蛋黄液与4℃的冻存蒸馏水按照体积比为1:9进行混匀，充分搅拌，调节PH为5.2，4℃保存过夜。用高速冷冻离心后取上清液，用纱布过滤，收集滤液即为水溶性组分；
[0028] (5)特异性复合卵黄抗体的纯化：在上述水溶性组分中加入PEG6000粉末使其终浓度为3.5％，调PH至7.2，充分混匀，4℃，10000g离心20min，过滤后得滤液；滤液中加入PEG6000粉末使其终浓度为8.5％，调PH至7.2，充分混匀，4℃，10000g离心20min，弃上清得到沉淀；沉淀用4℃PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.2)溶解后加入PEG6000粉末使其终浓度为12％，充分混匀，4℃，10000g离心20min，弃上清得沉淀；再用PBS溶解，转入
透析袋，透析24h以上，收集
透析液，在-56℃下
真空冷冻干燥12h至粉末，即为特异性复合卵黄抗体，-20℃保存。
[0029] 实施例2：抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和Solobacterium moorei的特异性复合卵黄抗体的效价检测：
[0030] 采用ELISA检测抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和Solobacterium moorei的特异性复合卵黄抗体的效价：采用96孔酶标板，分别包被牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和Solobacterium moorei三种抗原于三个板上，每孔包被100μl，用封膜
覆盖，37℃温育1h，4℃过夜，用PBST洗涤3次，吸水纸拍干；加入200μl/孔3％的
脱脂奶粉进行封闭，37℃温育1h后甩干，用PBST洗涤3次，用吸水纸拍干；卵黄抗体用0.01MPBS倍比稀释，100μl/孔加入酶标板中，最后一行加入PBS作为空白对照，37℃温育1h后甩干，用PBST洗涤3次，用吸水纸拍干；每孔再加入1:5000的兔抗鸡IgY-HRP抗体100μl，37℃温育1h后甩干，用PBST洗涤3次，用吸水纸拍干；每孔加入100μl新鲜配制的TMB显色液，37℃温育15min，然后每孔加入50μl的2M的H2SO4终止反应，立即用酶标仪测450nm
波长处的OD值，以免疫鸡IgY与未免疫鸡阴性IgY的OD值之比大于2.1，且阴性IgY吸光值大于0.1作为抗体阳性的判定阙值，阴性孔OD值大于等于2.1倍阴性孔OD值的最高稀释倍数为卵黄抗体的效价。结果显示如下表1所示：
[0031] 表1效价检测结果
[0032]
[0033] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
