牙周炎和牙槽脓溢等牙周病是成人牙齿脱落的主要原因，日本厚生劳动省 也从1988年开始致力于牙周病的预防，但其发病率仍逐年上升。例如，35～ 64岁的日本人约80％被怀疑患有龈炎(牙周病初期)和牙周炎(牙周病后期)，而 25～34岁的年轻一代龈炎达到60％左右，进展到牙周炎的患者据说也在10％ 以上。
此外，根据美国牙周病学会的调查，已查明与健康人相比，牙周病患者发 生心肌梗塞的危险约高2.8倍，而在女性，早产的危险约为7.5倍。而且据说 易引起肺炎、哮喘、咽炎等呼吸道疾病，血糖的控制变得困难，结果会使糖 尿病恶化。
牙周病的主要原因是蓄积在牙周袋的牙垢中的细菌。健康人的牙周袋中通 常革兰氏阳性菌占有大部分，而随着牙周病的进展，牙龈卟啉单胞菌(拟杆菌)、 具核梭杆菌、伴放线放线杆菌等革兰氏阴性菌增加。而且从重症成年牙周病 人的病灶部位可检出高比例的革兰氏阴性菌，特别是牙龈卟啉单胞菌，很多 病例患者血清中对该菌的抗体滴度也上升。如果给动物接种牙龈卟啉单胞菌， 则会使牙周的炎症恶化，从这些结果可暗示，牙龈卟啉单胞菌对牙周疾病的 形成和进展起着重要作用，确实可看作是牙周病的病原菌(牙周病菌)。
作为牙周病症状的改善方法，可列举依靠抗炎作用的牙周炎预防或治疗， 但这些是对症疗法，而依靠抗菌作用的预防或治疗是最根本的方法。
因此，为改善牙周病的症状，重要的是抑制牙周袋中牙龈卟啉单胞菌等阴 性菌的生长，开发并上市配合有对这些菌有效的各种抗菌物质的牙膏和漱口 剂等。
例如，日本专利特开平3-218320号公报(专利文献1)揭示了抗牙周病及口 臭的预防药，它以茶叶水乃至热水提取物或乙醇等亲水性有机溶剂提取物作 为有效成分。
日本专利特开平4-77424号公报(专利文献2)揭示了抗牙周病药物，该药物 的特征是，对牙周病病原菌牙龈拟杆菌(Bacteroides gingivalis)有特异性的生长 抑制作用，且对牙龈拟杆菌产生的胶原酶有抑制作用，作为有效成分，其中 含有没食子酸、(+)-儿茶酸、(+)-棓儿茶酸、(-)-表儿茶素、(-)-表棓儿茶酸 (epigallocatechin)、(-)-表儿茶素棓酸酯、(-)-表棓儿茶素棓酸酯及它们的二聚 体、三聚体等由茶(Cameria sinensis)提取的儿茶酸类。
日本专利特开平6-56687号公报(专利文献3)揭示了牙垢除去剂及牙石沈着 防止剂，它将茶叶水乃至热水提取物或乙醇等亲水性有机溶剂提取物作为有 效成分。
日本专利特开平7-238028号公报(专利文献4)揭示了牙垢形成抑制剂，该 制剂的特征是，含有从用碱性物质进行过碱处理的可可豆粗料或由该可可豆 粗料榨油得到的可可粉以极性溶剂提取的提取物或其分解物。
日本专利特开平8-81380号公报(专利文献5)揭示了抗牙周病药物，它以重 均分子量800～10000、聚合度3～30的多酚作为有效成分。
如上述专利文献1～3、5所揭示的，目前提出了多种以茶的提取物作为有 效成分的抗牙周病药物等，但关于可可豆粗料中所含有的可可组分或其提取 物对牙周病菌有抗菌效果尚无报道。例如，上述专利文献4记载了用碱性物 质进行过碱处理的可可豆粗料或该可可豆粗料榨油得到的可可粉的提取物或 其分解物能抑制作为龋齿原因菌的变异链球菌引起的葡聚糖附着沈积于牙齿 (牙垢形成)，而对其抗牙周病菌的抗菌效果丝毫没有记载。
而以前配有抗菌物质的牙膏和漱口剂等，未能得到充分的杀菌效果的情况 很多。另一方面，虽然例如四环素等抗生素具有优良的抗菌活性，但由于出 现耐药菌以及副作用等问题，其使用存在限制。此外，抗生素不仅对牙周病 菌，对于非病原性的口腔内固有细菌的生长也有抑制作用，所以也存在对口 腔内固有菌群的平衡产生不良影响的问题。
所以，牙周病的治疗是牙料医学中极困难的问题之一，至今牙周病尚无有 效的预防策略，今后，在老龄化的进程中，牙周疾病的预防将成为重要的问 题。
因此，本发明的目的是提供安全而无副作用、对口腔内非病原性的固有细 菌的生长不产生影响、而对牙周病菌具有优良的杀菌效果的抗牙周病菌组合 物、抗牙周病用食品饮料及口腔用清洁剂。
发明的揭示
本发明者为达到上述目的而深入研究后发现，可可能抑制牙龈卟啉单胞菌 等牙周病菌的生长，具有优良的抗牙周病菌活性，基于这一事实终于完成了 本发明。
即，本发明1是提供抗牙周病菌组合物，该组合物的特征是，含有可可豆 粗料中所含的可可组分作为有效成分。
上述本发明1因为将自古作为巧克力和可可的原料而摄取的可可组分作为 有效成分，所以安全而不用担心副作用，可提供具有优良灭菌效果的抗牙周 病菌组合物。而且，可可组分是营养良好的原材料，对螺杆菌也有杀菌效果 等(参照日本专利第3110020号公报)，预期同时有营养补充效果和保健作用。
本发明2是提供抗牙周病菌组合物，该组合物的特征是，含有可可豆粗料 中所含的可可组分的热水提取物作为有效成分。
上述本发明2可提供具有更优良的灭菌效果的抗牙周病菌组合物。而且， 可可组分的热水提取物不含有不溶性成分，因此容易配合用于食品饮料等中。
本发明3是提供抗牙周病菌组合物，该组合物的特征是，含有来自可可豆 粗料中所含的可可组分的多酚作为有效成分。
本发明4是提供抗牙周病菌组合物，该组合物的特征是，含有来自可可豆 粗料中所含的可可组分的游离脂肪酸类作为有效成分。
本发明5是提供抗牙周病菌组合物，该组合物的特征是，含有来自可可豆 粗料中所含的可可组分的多酚及来自可可组分的游离脂肪酸类作为有效成 分。
由上述本发明3、4和5提供的抗牙周病菌组合物在具有优良的杀菌效果 的同时，使用也方便。
本发明6是提供抗牙周病菌组合物，在上述本发明4或5中，上述游离脂 肪酸类含有选自棕榈酸、硬脂酸、油酸及亚油酸的至少1种。
本发明7是提供抗牙周病菌组合物，在上述本发明1～6的任一项中，上 述可可组分为可可及/或可可豆粗料。
本发明8是提供抗牙周病菌组合物，在上述本发明1～7的任一项中，该 组合物不会抑制口腔内非病原性固有细菌的生长，对牙周病菌具有抗菌作用。
本发明9是提供抗牙周病菌组合物，在上述本发明1～8的任一项中，上 述牙周病菌是属于卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属或放线杆菌属的 任一属的菌。
本发明的抗牙周病菌组合物不会抑制口腔内非病原性固有细菌的生长，但 能高效率地杀灭从牙周病患者的病灶部位高比例地检出的牙周病菌。
本发明10是提供抗牙周病用食品饮料，该食品饮料的特征是，含有上述 本发明1～9中任一项所述的上述抗牙周病菌组合物。
本发明11是提供口腔用清洁剂，该清洁剂的特征是，含有上述本发明1～ 8中任一项所述的上述抗牙周病菌组合物。
本发明10和11通过含有以来自可可组分的成分为有效成分的抗牙周病菌 组合物，可提供能安全、简便地预防牙周病的抗牙周病用食品饮料和口腔用 清洁剂。
附图的简单说明
图1是表示在加有可可全成分的热水悬浮液的培养基中培养作为牙周病菌 的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)时的活菌数随时间变 化的图。
图2是表示在加有可可全成分的热水悬浮液的培养基中培养作为牙周病菌 的具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum ATCC22586)时的活菌数随时间变化的 图。
图3是表示在加有可可全成分的热水悬浮液的培养基中培养作为牙周病菌 的中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia ATCC25611)时的活菌数随时间变化的 图。
图4是表示在加有可可全成分的热水悬浮液的培养基中培养作为牙周病菌 的伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans ATCC33844)时的活 菌数随时间变化的图。
图5是表示在加有可可组分的热水提取溶液的培养基中培养作为牙周病菌 的变黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens ATCC33563)时的活菌数随时间变化的 图。
图6是表示在加有可可组分的热水提取溶液的培养基中培养作为牙周病菌 的具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum ATCC22586)时的活菌数随时间变化的 图。
图7是表示在加有可可组分的热水提取溶液的培养基中培养作为非病原性 的口腔内固有细菌的咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus ATCC333977)时的 活菌数随时间变化的图。
图8是表示在加有可可组分的热水提取溶液的培养基中培养作为非病原性 的口腔内固有细菌的唾液链球菌(Streptococcus salivalius ATCC7075)时的活菌 数随时间变化的图。
图9是表示在加有可可组分的热水提取溶液的培养基中培养作为非病原性 的口腔内固有细菌的链球菌(Streptococcus sanguinis ATCC10556)时的活菌数随 时间变化的图。
图10是表示在加有可可全成分的热水悬浮液的培养基中培养作为牙周病 菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)时的活菌数随时间 变化的图。
图11是表示在加有可可溶液或从可可溶液提取的多酚部分(50％甲醇提取 部分)的培养基中培养作为牙周病菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)时的活菌数随时间变化的图。
图12是表示在加有上述50％甲醇提取部分的水溶性部分(PVPP处理前部 分)或从该组分吸附除去了多酚的部分(PVPP处理后部分)的培养基中，培养作 为牙周病菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)时的活菌 数随时间变化的图。
图13是表示在加有上述50％甲醇提取部分(来自可可的多酚)或茶儿茶酸的 培养基中培养作为牙周病菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)时的活菌数随时间变化的图。
图14是表示在加有由可可溶液提取的游离脂肪酸部分(己烷-甲醇提取部分) 的培养基中培养作为牙周病菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)时的活菌数随时间变化的图。
图15是表示在加有可可组分的热水提取溶液或“FFA组分”的培养基中 培养牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)时的活菌数随时间 变化的图。
图16是表示在加有可可组分的热水提取溶液或“FFA组分”的培养基中 培养变黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens ATCC33563)时的活菌数随时间变化 的图。
实施发明的最佳方式
本发明中，可可组分是指可可豆粗料除去可可油以后的成分，主要含有蛋 白质、糖类、食物纤维(水溶性难消化的多糖类、半纤维素、纤维素、木素等)、 磷脂、无机物(磷、镁、钙、铁、锌、铜、钾、钠等)、维生素A、维生素B族、 维生素C、维生素E(各种生育酚等)、烟酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、 乳酸、醋酸、多酚类(丹宁、表儿茶素、儿茶酸、栎精等)、无水咖啡因、可可 碱、各种游离脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等)等。
上述可可组分具体来讲较好的是使用可可豆粗料榨去可可油所得的可可(可 可粉)或者可可豆粗料本身。
可可组分的热水提取物是上述可可组分用热水提取所得的可可组分的水溶 性部分，含有可可组分所含的上述有机酸类、游离脂肪酸类、维生素、多酚 类等水溶性成分。对可可组分的热水提取物的配制方法没有特别限制，例如， 可在可可粉或可可豆粗料中加适量(通常为可可组分质量的5～100倍量)水、 较好是热水，使其均匀分散，在压热器等中加热处理(通常为40～130℃，1～ 30分钟)后，用过滤、离心分离等手段除去不溶性部分而得提取液，可使用提 取液本身，必要时也可浓缩然后干燥后再使用。
来自可可组分的多酚例如可如下配制，即，将可可或可可豆粗料悬浮于水 中，然后加等量己烷均匀混合，分离成己烷层和水层后，回收水层，加入与 回收的水层等量的50％(v/v)甲醇水溶液，充分混合，回收上清液，除去甲醇 就可得到多酚。
来自可可组分的游离脂肪酸类是指上述可可组分所含的各种游离脂肪酸， 具体可列举棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸、肉豆蔻酸、 月桂酸等。本发明中较好的是使用含上述各种游离脂肪酸的混合物，更好的 是使用含选自棕榈酸，硬脂酸、油酸和亚油酸的至少1种以上的混合物。对 该混合物中的各游离脂肪酸的比例没有特别限制，较好是根据上述可可组分 中所含的全部游离脂肪酸中的各游离脂肪酸的比例决定。具体来说较好的是 使用全部游离脂肪酸中各游离酸脂肪酸的比例为棕榈酸10～50质量％、硬脂 酸10～50质量％、油酸10～70质量％、亚油酸1～50质量％、亚麻酸1～10 质量％、棕榈油酸1～10质量％、肉豆蔻酸1～10质量％、月桂酸1～10质量 ％的混合物。
含上述各游离脂肪酸的混合物可经上述热水提取、醇提取、己烷提取、丙 酮提取等方法，提取上述可可组分所含的各种游离脂肪酸而得到。例如，上 述可可组分的热水提取物中含有上述比例的各游离脂肪酸，可使用该热水提 取物本身，必要时也可从该热水提取物进一步精制游离脂肪酸类再使用。此 外，也可根据上述可可组分中所含的全部游离脂肪酸中各游离脂肪的比例， 按规定比例配合各游离脂肪酸而调制。
本发明的抗牙周病菌组合物含有可可组分、可可组分的热水提取物，来自 可可组分的多酚及/或来自可可组分的游离脂肪酸类作为有效成分，可直接将 以上调制的可可组分、可可组分的热水提取物、来自可可组分的多酚及/或来 自可可组分的游离脂肪酸类用作抗牙周病菌组合物。而且，必要时可含有着 色剂、防腐剂、香精、调味剂、甜味剂、蛋白质(乳蛋白、大豆蛋白等)、维生 素类、矿物质类、糖类(糊精等)、有抗牙周病活性的乳酸菌和生药等。其中从 营养学角度出发，较好是含有乳蛋白和维生素类。
本发明的抗牙周病菌组合物在用可可组分作有效成分时，较好是含该可可 组分0.01～50质量％，更好是含0.01～10质量％。
在用可可组分的热水提取物作有效成分时，按固形物折算，较好是含该热 水提取物0.001～20质量％，更好是含0.1～10质量％。
在用来自可可组分的多酚作有效成分时，较好是含该多酚0.0001～10质量 ％，更好是含0.001～1质量％。
在用来自可可组分的游离脂肪酸类作有效成分时，较好是含该游离脂肪酸 类0.0001～1质量％，更好是含0.001～0.2质量％。
在并用来自可可组分的多酚和游离脂肪酸类作有效成分时，较好是含该多 酚0.0001～10质量％、含该游离脂肪酸类0.0001～1质量％，更好是含该多酚 0.01～1质量％、含该游离脂肪酸类0.001～0.2质量％。
本发明的抗牙周病菌组合物的有效剂量，对成人每天折算成可可组分(可可 豆粗料)为1g以上，更好为10g以上。折算成可可组分的热水提取物(固形物) 为0.1～10g，更好为1～10g。折算成来自可可组分的多酚为0.01～1g，更好 为0.1～1g。折算成来自可可组分的游离脂肪酸类为0.01～1g，更好为0.1～1g。
本发明的抗牙周病菌组合物如下列实施例所示，对非病原性的口腔内固有 细菌的生长无抑制作用，但可高效率地杀灭从牙周病患者的病灶部位高比例 地检出的属于卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属或放线杆菌的牙周病 菌。因此不必担心对口腔内固有菌群的平衡有不良影响。
属于卟啉单胞菌属的牙周病菌，可列举牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytca)、牙髓卟啉单胞 菌(Porphyromonas endodontalis)等。属于普雷沃氏菌属的牙周病菌，可列举中 间普雷沃氏菌(Prerotella intermedia)、变黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens)、 产黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)等。属于梭杆菌属的牙周病菌， 可列举具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)、舟形梭杆菌AA(Fusobacterium naviforme)等。属于放线杆菌属 的牙周病菌，可列举伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans) 等。
另一方面，作为非病原性的口腔内固有细菌，可举出咽峡炎链球菌 (Streptococcus anginosus)、唾液链球菌(Streptococcus salivalius)、Streptococcus sanguinis等。
对本发明的抗牙周病菌组合物的剂型无特别限制，可举出片剂、丸剂、散 剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、颗粒剂等，可配合使用方式进行选择。
作为固体制剂化的载体，可使用例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、高岭土、 结晶纤维素、硅酸等赋形剂，葡萄糖液、淀粉液、明胶溶液、羧甲纤维素、 羟丙纤维素等粘合剂，羧甲纤维素钠、低取代度羧丙纤维素等崩解剂，聚氧 乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类等表面活性剂，硬脂酸盐等润滑剂等。另外，为 片剂时可根据需要制成糖衣片、膜包衣片。
为制成溶液剂、乳剂、悬浮剂等形式，可使用稀释剂例如水、乙醇、聚乙 二醇、丙二醇、多氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸类等通常的助 溶剂、缓冲剂等，但从与可可组分的热水提取物的物性平衡的角度考虑，使 用丙二醇特别好。
本发明的抗牙周病菌组合物可添加到食品饮料中，例如巧克力、可可饮料 等各种饮料(也包括果冻饮料)、口香糖、糖果(硬糖、软糖)、片状糕点、各种 微波炉食品等。
食品和饮料中的抗牙周病菌组合物的添加量可根据上述有效剂量适当设 定，折算成可可组分(可可豆粗料)较好为0.01～50质量％，更好为5～30质量 ％。折算成可可组分的热水提取物(固形物)较好为0.1～20质量％，更好是0.2～ 10质量％。折算成来自可可组分的多酚较好为0.001～5质量％，更好是0.1～ 3质量％。折算成来自可可组分的游离脂肪酸类较好为0.01～1质量％，更好 为0.05～0.5质量％。
本发明的抗牙周病菌组合物可添加到例如牙膏、漱口剂等口腔用清洁剂 中。口腔用清洁剂中的抗牙周病菌组合物的添加量也可根据上述有效剂量适 当设定，折算成可可组分较好为0.01～10质量％，更好为0.1～5质量％。折 算成可可组分的热水提取物(固形物)较好为0.001～3质量％，更好为0.01～2 质量％。折算成来自可可组分的多酚较好为0.0001～10质量％，更好为0.001～ 1质量％。折算成来自可可组分的游离脂肪酸类较好为0.001～1质量％，更好 为0.01～0.5质量％。
实施例
以下列举实施例更详细地说明本发明。
实施例1可可粉对牙周病菌的抗菌效果的探讨
将可可粉(商品名“森永纯可可”，森永制果株式会社制)悬浮于蒸馏水， 使其浓度为30％(w/v)或10％(w/v)，在压热器中于121℃处理15分钟。将这些 溶液用作可可全成分的热水悬浮液，用以下方法进行抗菌活性的测定。
在脑心浸液(BHI，Brain Heart Infusion)培养基(Difco公司制)中添加5％(w/v) 酵母提取物(Difco公司制)和0.05％(w/v)的L-半胱氨酸(Sigma公司制)而配制的 液体培养基中，分别添加上述可可全成分的热水悬浮液10％(v/v)，调制培养 基，对照培养基系加蒸馏水代替可可全成分的热水悬浮液所得的BHI培养基。
将作为牙周病菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277) 或具核梭杆菌(Fusobacterum nucleatum ATCC22486)或中间普雷沃氏菌 (Prevotella intermedia ATCC25611)或伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans ATCC33844)悬浮于各培养基中，使之达到105CFU/ml 左右，在厌氧条件下于37℃进行培养。
培养开始后1、3、6小时，分别自培养液取样，牙龈卟啉单胞菌(ATCC 33277)、中间普雷沃氏菌(ATCC25611)在含有氯高铁血红素2-甲萘醌的布鲁氏 菌血液琼脂平板培养基中，具核梭杆菌(ATCC22486)、伴放线放线杆菌(ATCC 33844)在BHI琼脂平板培养基中，分别接种一定量的分步稀释的培养液进行 培养，对出现的集落进行计数。
然后求出1ml培养液中的活菌数，求出对最初的活菌数的比例(％CFU)。 图1显示牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)的结果，图2显示具核梭杆菌(ATCC 22486)的结果，图3显示中间普雷沃氏菌(ATCC25611)的结果，图4显示伴放 线放线杆菌(ATCC33844)的结果。
如图1所示，可知30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的热水悬浮液添加 10％(v/v)的任一场合，随着培养时间的推移，牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)的 活菌数大幅度减少。
如图2所示，可知30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的热水悬浮液添加 10％(v/v)的任一场合，随着培养时间的推移，具核梭杆菌(ATCC22486)的活菌 数大幅度减少。
如图3所示，可知30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的热水悬浮液添加 10％(v/v)的任一场合，随着培养时间的推移，中间普雷沃氏菌(ATCC25611)的 活菌数减少，虽然其减少的程度不及牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)和具核梭杆 菌(ATCC22486)。
如图4所示，可知30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的热水悬浮液添加 10％(v/v)的任一场合，随着培养时间的推移，伴放线放线杆菌(ATCC33844)的 活菌数减少，虽然其减少的程度和中间普雷沃氏菌(ATC25611)同样，不及牙 龈卟啉单胞菌(ATCC33277)和具核梭杆菌(ATCC22486)。
由以上结果可知，可可全成分的热水悬浮液对作为牙周病菌的牙龈卟啉单 胞菌(ATCC33277)、具核梭杆菌(ATCC22486)、中间普雷沃氏菌(ATCC25611)、 伴放线放线杆菌(ATCC33844)具有优良的抗菌活性。
实施例2可可粉热水提取物对牙周病菌的抗菌效果的探讨
将可可粉(商品名“森永纯可可”，森永制果株式会社制)悬浮于蒸馏水， 使其浓度为10％(w/v)，在压热器中于121℃处理15分钟。然后于室温离心15 分钟(×1000g)，回收上清液。用该上清液作为可可组分的热水提取溶液(固体 成分2～3质量％)，按以下方法进行抗牙周病菌活性的测定。
在BHI培养基(Difco公司制)中添加上述可可组分的热水提取溶液1％(v/v) 或10％(v/v)，调制培养基，对照培养基系加蒸馏水代替可可组分的热水提取 溶液所得的BHI培养基。
将作为牙周病菌的变黑普雷沃氏菌(ATCC33563)或具核梭杆菌(ATCC 22586)悬浮于各培养基中，使之达到106～107CFU/ml，在厌氧条件下于37℃ 进行培养。培养开始后1、3、6小时分别自培养液取样，在含有氯高铁血红 素2-甲萘醌的布鲁氏菌血液琼脂平板中，接种一定量的分步稀释的培养液进 行培养，对出现的集落进行计数。然后求出1ml培养液中的活菌数，得出对 最初的活菌数的比例(％CFU)。图5显示变黑普雷沃氏菌(ATCC33563)的结果， 图6显示具核梭杆菌(ATCC22586)的结果。
如图5所示，可知可可组分的热水提取溶液添加10％(v/v)的场合，随着培 养时间的推移，变黑普雷沃氏菌(ATCC33563)的活菌数大幅度减少。
如图6所示，可知可可组分的热水提取溶液添加1％(v/v)或10％(v/v)的任 一场合，随着培养时间的推移，具核梭杆菌(ATCC22586)的活菌数大幅度减少。
由以上结果可知，可可组分的热水提取液对作为牙周病菌的变黑普雷沃氏 菌(ATCC33563)、具核梭杆菌(ATCC22586)具有优良的抗菌活性。
实施例3可可粉对非病原性口腔内固有细菌的影响的探讨
和实施例1同样配制添加有实施例l调制的30％(w/v)可可全成分的热水悬 浮液10％(v/v)的BHI培养基，对照培养基系加蒸馏水代替可可全成分的热水 悬浮液所得的BHI培养基。
将作为非病原性口腔内固有细菌的咽峡炎链球菌(ATCC333977)、唾液链球 菌(ATCC7075)、Streptococcus sanguinis(ATCC10556)悬浮于该培养基中，使 之达到约105CFU/ml，在厌氧条件下于37℃进行培养。培养开始后4小时， 分别自培养液取样，在BHI琼脂平板培养基中分别接种一定量的分步稀释的 培养液进行培养，对出现的集落进行计数。然后求出1ml培养液中的活菌数， 求出对最初的活菌数的比例(％CFU)。图7显示咽峡炎球菌(ATCC33977)的结 果，图8显示唾液链球菌的结果，图9显示Streptococcus sanguinis(ATCC10556) 的结果。
如图7所示，可知30％(w/v)的可可全成分的热水悬浮液添加10％(v/v)的场 合，随着培养时间的推移，咽峡炎链球菌(ATCC33977)的活菌数未见减少。
如图8所示，可知30％(w/v)的可可全成分的热水悬浮液添加10％(v/v)的场 合，随着培养时间的推移，唾液链球菌(ATCC7075)的活菌数未见减少。
如图9所示，可知30％(w/v)的可可全成分的热水悬浮液添加10％(v/v)的场 合，随着培养时间的推移，Streptococcus sanguinis(ATCC10556)的活菌数未见 减少。
由以上结果可知，可可全成分的热水悬浮液对作为非病原性的口腔内因有 细菌的咽峡炎链球菌(ATCC33977)、唾液链球菌(ATCC7075)、Streptococcus sanguinis(ATCC10556)完全不显示抗菌活性。
实施例4短时间内可可粉的抗牙周病菌效果的探讨
和实施例1同样配制添加有实施例1调制的30％(w/v)可可全成分的热水悬 浮液10％(v/v)的BHI培养基，对照培养基系加水代替可可全成分的热水悬浮 液所得的BHI培养基。
将牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)悬浮于各培养基中，使之达到约105CFU/ ml，在厌氧条件下于37℃培养。培养开始后5、10、15、20、30、40、50、60 分钟，分别自培养液取样，在含有氯高铁血红素2-甲萘醌的布鲁氏菌血液琼 酯平板培养基中分别接种一定量的分步稀释的培养液进行培养，对出现的集 落进行计数，然后求出1ml培养液中的活菌数，得出对最初的活菌数的比例 (％CFU)。实验进行2次。其结果以图10表示。
如图10所示，可知30％(w/v)可可全成分的热水悬浮液添加10％(v/v)的场 合，牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)在培养10分钟后的活菌数几乎不变，但培 养15发钟后活菌数大幅度减少，培养30分钟后未能检出活菌。
由以上结果可知，可可全成分的热水悬浮液对作为牙周病菌的牙龈卟啉单 胞菌(ATCC33277)在短时间便能发挥优良的抗菌活性。因而提示即使通常的饮 用也可预期对牙周病菌具有充分的抗菌活性。
实施例5可可粉对牙周病菌的临床分离株的抗菌效果的探讨
和实施例1同样配制添加有实施例1调制的30％(w/v)或10％(w/v)可可全 成分的热水悬浮液10％(v/v)的BHI培养基，对照培养基系加水代替可可全成 分的热水悬浮液所得的BHI培养基。
从在鹤见大学附属医院接受治疗的牙周病患者的病灶用吸水尖(纸尖)采集 牙周病菌群，从其中选择在含氯高铁血红素2-甲萘醌的布鲁氏菌血液琼脂平 板培养基上形成黑色集落的菌株，通过采用PCR法的鉴定(A.Ashimoto，C.Chen， I.Bakker，J.Slots，.Oral Microbiology Immunology.1996 Aug；11(4)：266-73)分离出 表1所示的5株牙龈卟啉单胞菌临床分离株(Porphyromonas gingivalis 113H， Porphyromonas gingivalis 823D，Porphyromonas gingivalis 1113C， Porphyromonas gingivalis 1113D，Porphyromonas gingivalis 1433F)。
                                表1 患者性别 男性 女性 女性 女性 女性 分离部位 右上第一 大磨牙 右下第一 小磨牙 右上中 切牙 右上中 切牙 右下第一 小磨牙 牙周袋的 深度(mm) 6 6 8 8 8 出血 (BOP) + + + + - 排脓 - - + + - 纤毛类型 IV型 III型 II型 II型 II型 株名 113H 823D 1113C 1113D 1433F
将各临床分离株悬浮于上述各培养基中，使之达到约105CFU/ml，在厌氧 条件下于37℃培养。培养开始后1、3、6小时，分别自培养液取样，在含有 氯高铁血红素2-甲萘醌的布鲁氏菌血液琼脂平板培养基中分别接种一定量的 分步稀释的培养液进行培养，对出现的集落进行计数。然后求出1ml培养液 中的活菌数，得出对最初的活菌数的比例(％CFU)。
其结果是，30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的热水悬浮液添加10％(v/v)的 任一场合中，所有的牙龈卟啉单胞菌的临床分离株，随着培养时间的推移， 与牙龈卟啉单胞菌典型株(ATCC33277)同样，活菌数大幅度减少。
由此结果可确认可可粉对牙龈卟啉单胞菌的抗菌效果的实用性。
实施例6可可粉中的抗菌成分的鉴定-1
将可可粉(商品名“Red Cocoa”，森永制果株式会社制)悬浮于蒸馏水，使 其浓度为10％(w/v)。以下称此溶液为“可可溶液”。
在上述可可溶液中加入等量已烷，分离脂肪成分。在除去脂肪成分的残余 水溶性部分中加入等量的100％甲醇，振荡10分钟，离心分离，分出上清液。 在该沉淀中加入50％甲醇，振荡10分钟，离心分离，分出上清液。该操作重 复2次，蒸发所收集的上清，使甲醇完全蒸发后，将其悬浮于蒸馏水，使之 相当于10％(w/v)可可粉。该部分以下称为“50％甲醇提取部分”。据认为这 一部分含有可可中的多酚类。
配制上述10％(w/v)可可溶液、上述相当于10％(w/v)可可粉的50％甲醇提 取部分的悬浮液添加10％(w/v)而成的BHI培养基。作为对照培养基，配制加 水代替可可溶液的BHI培养基。
将牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)悬浮于各培养基，使之达到约105CFU/ml， 在厌氧条件下，于37℃进行培养。培养开始后1、3、6小时，分别自培养液 取样，在含有氯高铁血红素2-甲萘醌的布鲁氏菌血液琼脂平板培养基中分别 接种一定量的分步稀释的培养液进行培养，对出现的集落进行计数。然后求 出1ml培养液中的活菌数，得出对最初的活菌数的比例(％CFU)。其结果于图 11表示。
如图11所示，可知10％(w/v)可可溶液、相当于10％(w/v)可可粉的50％甲 醇提取部分添加10％(v/v)的任一场合，随着培养时间的推移，牙龈卟啉单胞 菌(ATCC33277)的活菌数大幅度减少。
由以上结果可以认为，可可的抗菌主成分为多酚的可能性很高，所以用吸 附多酚类等具有酚基的物质的树脂PVPP进行了以下实验。
将用上述方法所得的50％甲醇提取部分离心分离，分离回收水溶性的上清 液。将它称为“PVPP处理前部分”。在此部分中加PVPP，其量为1g/上清液 10ml，于37℃振荡30分钟，离心分离，将上清液和PVPP分离，回收上清液。 将它称为“PVPP处理后部分”。
配制上述PVPP处理前部分或PVPP处理后部分添加10％(w/v)的BHI培养 基，作为对照培养基，配制加水代替PVPP处理前部分的BHI培养基。
将牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)悬浮于各培养基，使之达到约105CFU/ml， 在厌氧条件下，于37℃进行培养。培养开始后1、3、6小时，分别自培养液 取样，在含有氯高铁血红素2-甲萘醌的布鲁氏菌血液琼脂平板培养基中分别 接种一定量的分步稀释的培养液进行培养，对出现的集落进行计数。然后求 出1ml培养液中的活菌数，得出对最初的活菌数的比例(％CFU)。其结果于图 12表示。
如图12所示，可知PVPP处理前部分添加10％(v/v)的场合，牙龈卟啉单胞 菌(ATCC33277)的活菌数大幅度减少，而除去多酚的PVPP处理后部分添加10％ (v/v)的场合，活菌数并未大幅度减少。这与各部分的多酚浓度测定结果也是一 致的。由以上结果确认，可可的抗菌主成分是被PVPP吸附的多酚类。
实施例7来自可可的多酚与茶儿茶酸的抗菌效果的比较
将含表棓儿茶酸等来自茶的多酚(商品名“Sunphenon”，太阳化学株式会 社制)悬浮于蒸馏水，使其浓度为0.05％(w/v)，在压热器中于121℃处理15分 钟。该溶液以下称为“茶儿茶酸溶液”。
测定上述茶儿茶酸溶液以及实施例6的“50％甲醇提取部分”的多酚浓度。 调整“50％甲醇提取部分”至相当于1.25％(w/v)可可粉使之与“茶儿茶酸溶液” 所含的多酚量(0.313mg/ml)具有相同浓度。
配制分别添加“茶儿茶酸溶液”和经调整的“50％甲醇提取部分”10％(w/v) 的BHI培养基。
将牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)悬浮于上述各培养基，使之达到约106 CFU/ml，在厌氧条件下于37℃培养。培养开始后1、3、6小时，分别自培养 液取样，在含有氯高铁血红素2-甲萘醌的布鲁氏菌血液琼脂平板培养基中分 别接种一定量的分步稀释的培养液进行培养，对出现的集落进行计数。然后 求出1ml培养液中的活菌数，得出对最初的活菌数的比例(％CFU)。其结果于 图13表示。
如图13所示，添加相当于1.25(w/v)可可粉的“50％甲醇提取部分”10％的 场合，培养1小时后牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)的活菌未被检出，而添加茶 儿茶酸溶液10％的场合，减少至0.3％CFU左右。其后随着培养时间延长，两 样本活菌数均大幅度减少。
由以上结果提示在比较同量的茶儿茶酸和来自可可的多酚的抗菌效果时， 来自可可的多酚具有更高的比活性。
实施例8可可粉中的抗菌成分的鉴定-2
用2N盐酸将10％(w/v)可可溶液的pH调整为2。经此操作，已成盐而溶 于可可溶液中的水分的游离脂肪酸全部转入油分中。
在上述可可溶液中加等量己烷，于室温振荡10分钟后，离心分离，分出 己烷部分。搅拌和离心分离的操作重复3次，蒸发所收集的己烷部分，将己 烷完全蒸发后，悬浮于蒸馏水使之相当于10％(w/v)可可粉。再用8N氢氧化钠 使pH恢复原状。在该部分中加4倍量的100％甲醇，加热至65℃，同时振荡 15分钟，然后离心分离，将油层和水层分离。搅拌和离心分离的操作重复2 次，蒸发收集的水层，将甲醇完全蒸发后，悬浮于蒸馏水使之相当于10％(w/v) 可可粉。以下该部分称为“已烷-甲醇提取部分”。一般认为这一部分中含有 可可中的游离脂肪酸。
配制添加有上述相当于10％(w/v)可可粉的己烷-甲醇提取部分悬浮液10％ (w/v)的BHI培养基，作为对照培养基，配制加水代替己烷-甲醇提取部分悬浮 液的BHI培养基。
将牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)悬浮于各培养基，使之达到约105CFU/ml， 在厌氧条件下，于37℃进行培养。培养开始后1、3、6小时，分别自培养液 取样，在含有氯高铁血红素2-甲萘醌的布鲁氏菌血液琼脂平板培养基中分别 接种一定量的分步稀释的培养液进行培养，对出现的集落进行计数。然后求 出1ml培养液中的活菌数，得出对最初的活菌数的比例(％CFU)。其结果于图 14表示。
如图14所示，可知添加相当于10％(w/v)可可粉的己烷-甲醇提取部分 10％(v/v)的场合，随着培养时间的推移，牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)的活菌 数减少。由以上结果可认为可可所含的游离脂肪酸也具有抗菌效果。
实施例9
和实施例2同样，配制可可组分的热水提取溶液添加10％(v/v)的BHI培养 基，作为对照培养基，配制加蒸馏水代替可可组分的热水提取溶液的BHI培 养基。
然后，按表2所示比例配制在精制水中添加游离脂肪酸的游离脂肪酸组合 物(以下称“FFA comp.”)，在BHI培养基中添加FFA comp.10％(v/v)，配制 培养基。该FFA comp.是根据质谱等分析所得的纯可可中的游离脂肪酸组成、 在精制水中添加它的4种主要的游离脂肪酸、人工地再现可可组分中的游离 脂肪酸组成的组合物，它和上述可可组分的热水提取溶液含有等量的各游离 脂肪酸。
                      表2     FFA comp.的游离脂肪酸组成     μg/ml(μM)     棕榈酸钠       143(513)     硬脂酸钠       128(418)     油酸钠       156(512)     亚油酸钠       43(142)
将牙周病菌(牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)或变黑普雷沃氏菌(ATCC33563)) 悬浮于这些培养基，使之达到106～107CFU/ml，在厌氧条件下，于37℃进行 培养。培养开始后1、3、6小时，分别自培养液取样，在含有氯高铁血红素2- 甲萘醌的布鲁氏菌血液琼脂平板培养基中分别接种一定量的分步稀释的培养 液进行培养，对出现的集落进行计数。然后求出1ml培养液中的活菌数，得 出对最初的活菌数的比例(％CFU)。图15表示牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)的 结果，图16表示变黑普雷沃氏菌的结果。
如图15所示，可知在可可组分的热水提取溶液添加10％(v/v)的场合，随 着培养时间的推移，牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)的活菌数大幅度减少。此外， 在添加FFA comp.的场合，随着培养时间的推移活菌数也大幅度减少。
如图16所示，可知可可组分的热水提取溶液添加10％(v/v)的场合，和图5 所示结果同样，随着培养时间的推移，变黑普雷沃氏菌(ATCC33563)的活菌数 也减少。此外，可知添加FFA comp.的场合，和对照组相比活菌数减少。
由以上结果可知，可可组分的热水提取物以及来自可可组分的游离脂肪酸 类的有效浓度虽然随牙周病菌的种类而异，但对于牙龈卟啉单胞菌(ATCC 33277)、变黑普雷沃氏菌(ATCC33563)，具核梭杆菌(ATCC22586)均有优良的 抗菌活性。
实施例10
根据以下表3的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的巧克力。
                    表3     原料     配合比例(质量份)     砂糖     45.56     可可豆粗料     20     全脂奶粉     16.5     可可油     16.5     卵磷酯     0.4     香草香精     0.04     可可组分热水提取物     1     合计     100
实施例11
根据以下表4的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的口香糖。
                    表4     原料     配合比例(质量份)     口香糖基质     20     砂糖     53.75     葡萄糖     15     糖浆     7     可可组分热水提取物     4.25     合计     100
实施例12
根据以下表5的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的糖果。
                    表5     原料     配合比例(质量份)     砂糖     50     糖浆     33     柠檬酸     1     可可组分热水提取物     2.5     水     13.5     合计     100
实施例13
根据以下表6的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的运动饮料。
                    表6     原料     配合比例(质量份)     浓缩橙汁     0.2     砂糖     1.8     异构化葡萄糖浆(F-55)     5.5     柠檬酸     0.14     食盐     0.08     柠檬酸钠     0.07     氯化钾     0.04     磷酸二氢钙     0.013     谷氨酸钠     0.004     氯化镁     0.003     抗坏血酸     0.1     悬浮剂(Cloudy)     0.1     乳化香精     0.01     香精     0.2     可可组分热水提取物     1.00     水     余量     合计     100
实施例14
根据以下表7的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的蜂王胶饮料。
                    表7     原料     配合比例(质量份)     异构化葡萄糖浆(F-55)     12     精制蜂蜜     11     天然蜂王胶     4.5     蒜提取物     0.2     灵芝提取物     0.3     柠檬酸     0.1     聚葡萄糖     4     天然咖啡因     0.08     抗坏血酸     0.5     盐酸维生素B1     0.02     维生素B2磷酸钠     0.01     盐酸维生素B6     0.03     烟酰胺     0.04     悬浮剂(Cloudy)     0.1     香精     0.4     可可组分热水提取物     0.1     水     余量     合计     100
实施例15
根据以下表8的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的微波炉烹调 袋装小豆粥。
                    表8     原料     配合比例(质量份)     粗米     4.2     白米     4.8     小豆     1.6     砂糖     0.5     食盐     0.1     可可组分热水提取物     2     水     余量     合计     100
实施例16
根据以下表9的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的片剂。
                    表9     原料     配合比例(质量份)     麦牙糖醇     74.3     乳糖     17.5     阿拉伯胶     6.0     一氟磷酸钠     0.7     薄荷醇     0.5     可可组分热水提取物     1     合计     100
实施例17
根据以下表10的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的漱口剂。
                    表10     原料     配合比例(质量份)     乙醇     20     糖精     0.05     叶绿酸铜钠     0.1     水     78.6     可可组分热水提取物     1.25     合计     100
实施例18
根据以下表11的配比，制造含有本发明的抗牙周病菌组合物的牙膏。
                    表11     原料     配合比例(质量份)     碳酸钙     50     甘油     20     角叉菜聚糖     0.5     羧甲纤维素     1     乙醇胺月桂酰胺     1     蔗糖单月桂酸酯     2     盐酸氯己定     0.01     糖精     0.05     叶绿酸铜钠     0.1     水     24.3     可可组分热水提取物     1     合计     100
工业上利用的可能性
如上所述，本发明由于含有可可豆粗料中所含的可可组分、该可可组分的 热水提取物、来自该可可组分的多酚及/或来自该可可组分的游离脂肪酸作为 有效成分，所以可提供不会有副作用的安全且具有优良的杀菌效果的抗牙周 病菌组合物。该抗牙周病菌组合物在短时间内对可自牙病患者的病灶部位高 比例地检出的属于卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属或放线杆菌属的 牙周病菌显示优良的抗菌活性，预期通过抑制这些细菌的增殖对牙周炎和龈 炎等牙周病具有预防、治疗效果，且不会抑制非病原性的口腔内固有细菌的 生长，可改善口腔内固有菌群的平衡。
因此，通过在食品饮料和口腔用清洁剂等中包含该抗牙周病菌组合物，可 以提供能安全、方便地预防牙周病的抗牙周病用食品饮料以及口腔用清洁剂。