本发明涉及生物样品玻璃化的方法，这样在复苏后该生物样品依然存活。
发明背景能够冷冻保存卵母细胞、胚胎、精子和其它类似的生物样品，对广泛应用辅助生殖技术是非常美键的。但是，由于这些细胞体积大且卵母细胞和早期胚胎对低温非常敏感，冷冻技术在多数种类中没有得到好好发展。
传统上，用“缓慢冷冻技术”冷冻保存胚胎。低浓度冷冻保护剂和缓慢控制的冷冻速度(一般在0.1℃-0.3℃/分钟间)使细胞在冷冻过程中缓慢脱水从而防止细胞内形成结晶。基于此，用此种方法冷冻保存卵母细胞、胚胎和其它发育细胞导致转移后其致孕能力和保孕能力下降。卵母细胞对冷冻保存损伤尤其敏感，因为冷冻期间其中期纺锤体微管的完整性受到破坏。
另一种更重要的冷冻方法依赖于用高浓度冷冻保护剂所形成的玻璃化，迅速冷却该保护剂时导致玻璃样状态形成。然而，该玻璃化技术的缺点在于此类冷冻保护剂对卵母细胞、胚胎和其它脆弱的发育细胞有很大毒性。可通过提高冷冻速率使冷冻保护剂的毒性缩至最小，快速冷冻可通过将位于电镜格栅或薄壁吸管(straw)(开口的拉伸的吸管)中的卵母细胞直接投放到液氮内来完成。然而，这两种方法都很麻烦，且胚胎的恢复很成问题。
因此仍需要使生物样品玻璃化的方法，该方法(应)能使样品细胞的冷冻速率达最大；在玻璃化和以后的复苏期间保持该样品的存活，避免样品遭受机械压力；并提供简易操作来进行冷冻保存和复苏。
发明概述本发明涉及生物样品玻璃化的方法。根据本发明的方法，使生物样品直接与冷冻物质接触。接触该冷冻物质时，该生物样品发生玻璃化。已发生玻璃化的生物样品可贮存一段时间，以后再复苏。复苏后的生物样品仍存活。根据本发明优选的生物样品是可发育的细胞。
本发明也涉及生物样品玻璃化的方法，包括应用转移工具将该生物样品置于冷冻物质比如液氮中，这样使该生物样品直接接触该冷冻物质。然后该生物样品在该转移工具中发生玻璃化，优选转移工具是套环。再优选使该转移工具和生物样品置于冷冻物质内并转移到含冷冻物质的容器中。该容器优选是小瓶。然后使含有该冷冻物质、套环和玻璃化生物样品的小瓶密封并冷冻保存直至再需要此生物样品之时。
本发明另一方面是在玻璃化之前在冷冻保护剂中处理该生物样品。
本发明还涉及已发生玻璃化之生物样品的复苏方法。该复苏方法学包括从其得以冷冻保存的冷冻物质中取出该生物样品并将该生物样品置于温暖的复苏溶液中。该复苏溶液可存在于任何恰当的容器中，优选存在于培养皿或吸管内。
本发明还有一方面是发育细胞玻璃化的方法，其中将一或多个发育细胞直接置于冷冻物质中，这样每个发育细胞直接接触该冷冻物质并因此发生玻璃化，其中该发生玻璃化的发育细胞在复苏、培养和移植到恰当的宿主有机体中时受精率与未发生玻璃化的同样的发育细胞相同。优选地，将该发育细胞置于套环内与冷冻物质接触。
本发明还涉及哺乳类囊胚或哺乳类分裂期胚胎发生玻璃化的方法，包括将一或多个囊胚或分裂期胚胎直接置于冷冻物质中，这样每一囊胚直接与该冷冻物质相接触并因此发生玻璃化，其中至少80％，更优选地，90％玻璃化的囊胚或分裂期胚胎在复苏并，优选在合适的基础培养基中培养后依然存活。优选地，将该囊胚或分裂期胚胎置于套环内与冷冻物质接触。
本发明还涉及马胚胎或猪胚胎玻璃化的方法，包括将一或多个胚胎直接置于冷冻物质中，这样每个胚胎直接与冷冻物质相接触并因此发生玻璃化，其中至少25％，更优选地，50％玻璃化胚胎在复苏并，优选在合适的基础培养基中培养后依然存活。优选将该胚胎置于套环中与冷冻物质接触。
本发明还涉及生物样品玻璃化的试剂盒。该试剂盒一般含有叙述生物样品玻璃化(方法)的说明书，其中将生物样品直接与冷冻物质相接触。该试剂盒也包括一种或多种可选成分，包括但不限于，转移工具，更优选套环、有合适的大小和形状以便容纳该套环和其中的玻璃化样品的小瓶、基础培养基、转移溶液和冷冻保护剂。
本发明还涉及通过本发明的方法发生玻璃化的生物样品。
附图简述图1为根据本发明生物样品玻璃化方法的图解说明。
详述本申请中，全文使用以下术语并根据申请目的定义如下：基础培养基：为培养、操作、运输或贮存此处的生物样品而特定生产的固体或液体制品。
冷冻保存：在极低温度下对生物样品的保存。
可发育细胞：有机体的生殖体，具有发育成能够独立存在的新有机体个体的能力。可发育细胞包括，但不限于，精子、卵母细胞、胚胎、桑葚胚、囊胚或其它早期胚胎细胞。
直接接触：若生物样品或含有该生物样品的培养基、溶液或物质的大多数表面与冷冻物质直接接触的话，则该生物样品，包括囊胚和胚胎，与该冷冻物质“直接接触”。
冷冻物质：任何能够使生物物质发生玻璃化的物质，包括但不限于，液体气体如液氮、液丙烷、液氦或乙烷半融物(slush)。
套环：小生物样本的操作工具，一般由一持有一块尼龙或金属丝如白金或镍钢等的竿状柄组成，该尼龙或金属丝在其游离端形成一个闭环。
转移工具：用来操作生物样品使之进入冷冻物质的工具，玻璃化期间其环绕和/或容纳该生物样品和/或含有该生物样品的培养基、溶液或物质，使之维持在原位，并且/或者便于在该冷冻物质中轻松操作该生物样品，其中该转移工具使该生物样品与该冷冻物质直接接触。该转移工具可以是本领域一般知晓的任何此类工具，包括但不限于，套环、带柄的网或带柄的桨。此处定义的术语“转移工具”不包括电镜格栅或吸管(包括密封和开口的拉伸的吸管)。
存活的：能生存并正常发育一段时间的生物样品。
玻璃化(使玻璃化)：一种现象，其中使生物样品迅速冷却至极低温度，这样样品内的水未经结晶而形成玻璃样状态。
本发明在美国临时专利申请第60/104,266号的基础上，指生物样品玻璃化的方法，该专利全文在此引入供参考。
根据本发明的方法，将生物样品直接置于冷冻物质中这样该生物样品与该冷冻物质直接接触。接触该冷冻物质时，该生物样品发生玻璃化。已发生玻璃化的生物样品可贮存一段时间，以后再复苏。复苏的生物样品依然存活。
因此本发明用途广泛。其可用于畜牧业、实验室研究、濒危物种保护以及人类辅助生殖。
本发明的生物样品可以是任一种活细胞生物样品，但优选发育细胞，更优选哺乳类发育细胞。此类细胞包括，但不限于，精子、胚胎、囊胚、桑葚胚和卵母细胞。此类优选细胞可来自任何所需的哺乳动物包括但不限于人类；非人类灵长类比如猴；实验动物比如大鼠、小鼠和仓鼠；农业家畜如猪、绵羊、牛、山羊和马；和有重要的动物学意义的和/或濒危动物等等。本发明范围也包括使用其它活生物体来源的其它发育细胞，比如爬行动物、两栖动物和昆虫比如果蝇属。本发明使用的其它合适的细胞包括干细胞，包括人干细胞，和植物组织细胞。以下实施例用许多不同类型的细胞说明本发明的用途，包括仓鼠胚胎，该胚胎对损伤极为敏感，因此成为任何冷冻技术的良好模型。这些实施例也表明本发明对牛卵母细胞和胚胎很有效，本领域技术人员知晓后者对冷冻损伤极为敏感。
优选地，在玻璃化前将该生物样品置于转移工具上。该转移工具可以是将该生物样品运送到冷冻物质中的任何工具，从而使该生物样品与该冷冻物质直接接触，使该生物样品迅速冷却，因此使该生物样品玻璃化而非在细胞内形成冰晶，后者反过来最终破坏细胞壁和其它重要的细胞成分。
本发明的方法有别于现有领域以前的方法，其中生物样品是包含在容器比如封闭的吸管或拉开的吸管中，而不是与冷冻物质直接接触。
另外，本方法学有别于现有领域以前的方法，该方法将生物样品置于开口的平盘比如显微镜格栅上，这不利于轻松操作包含在冷冻物质中的样本，使样本的处理变得困难并最终使玻璃化样品难于复苏。因此本发明可以在玻璃化过程中更好地对生物样品进行处理并籍此解决以前的显微镜格栅玻璃化方法中存在的样品复苏问题。
根据本发明，在玻璃化过程中转移工具包绕和/或容纳生物样品，使之维持原位，这样在此过程中生物样品不会丢失。因此，转移工具不仅如平盘板或显微镜格栅一样使生物样品置于其上，也确实可以帮助生物样品维持原位，就像套环通过很强的粘附力来环绕生物样品或含有该生物样品的培养基、溶液或物质一样。本发明优选的转移工具包括但不限于，套环、带柄的小网或小铲。可用本领域已知的任何方法修饰这些铲、网或套环，以帮助其固定生物样品，包括在套环、网或铲内另加入聚合筛孔或丝格。在一优选实施方案中，该套环是开放套环，经竿状尾与小瓶帽内部直接连接，该小瓶具有合适的大小和形状以便使玻璃化的生物样品和套环冷冻保存于其中。令人惊讶和意外发现的是，本玻璃化方法学中使用套环具有提高冷却速率、容易观察、方便操作和玻璃化样品在复苏和培养时存活率很高等优点。
在一优选实施方案中，在玻璃化前用少量冷冻保护剂处理该生物样品。本发明的方法学也可降低该生物样品与使用的冷冻保护剂之液相的接触时间缩短，从而降低冷冻保护剂对该生物样品的毒性。在冷冻保护期间大剂量使用冷冻保护剂比如乙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、甘油、丙二醇、糖和甲基戊二醇，以及本领域熟知的其它物质，可对敏感细胞比如卵母细胞和胚胎细胞产生毒性。本发明所使用的任何可选择的液相冷冻保护剂，与该生物样品的接触时间比本领域所述的以前的冷冻保护方法要短。
通过缩小冷却时间、降低与液相冷冻保护剂的接触时间和对生物样品进行可靠的固位和操作，本发明解决了本领域成功冷冻保存敏感生物样品比如发育细胞所长期存在的问题。如实施例中进一步说明的一样，本发明表明了使囊胚或分裂期胚胎发生玻璃化的成功率，这样，复苏并在合适的基础培养基中培养时，该冷冻保存的囊胚或分裂期胚胎的存活率是80％，优选90％，更优选超过90％。另外，本发明使发育细胞发生玻璃化，其中该玻璃化的发育细胞在复苏、培养和植入恰当的宿主有机体内时，会产生与同样植入但未经冷冻保存的发育细胞相同的受精率。运帮助解决了长期存在的由于使用冷冻保存的发育细胞而产生的低致孕率问题。
另外，本方法学可以对以前不能冷冻保存的生物样品进行冷冻保存。应注意的是，猪胚和马胚如会可根据本发明发生玻璃化，其中至少25、30、35、40或45％，更优选50、55、60、65、70或75％玻璃化的胚胎在复苏和培养后依然存活。
根据本发明，通过本领域熟知的任何方式收集一或多个生物样品并优选地将之转移到基础培养基中。该基础培养基可含有一或多种可选的成分，比如避免该生物样品受低温影响的冷冻保护剂和/或提高粘度的化合物，以便帮助该物质维持于转移工具中，优选套环。提高粘度的化合物可以是本领域所知的任何此类化合物，包括但不限于，Ficoll、Percoll、透明质酸、白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和甘油。
根据本发明，将该生物样品优选置于转移工具上。该样品可置于基础培养基中，再用转移工具比如套环或小桨将该生物样品从该基础培养基中舀出来。在一优选实施方案中，转移工具是套环，并优选将该套环浸在基础培养基中以便在套环上形成基础培养基薄膜，再用移液管将该生物样品直接置于套环中。若发育细胞比如胚胎、精子或卵母细胞用作生物样品，可将一或多个置于每个套环内。
然后使含有该生物样品的转移工具迅速置于冷冻物质中，这样该生物样品直接接触冷冻物质从而发生玻璃化。优选地，用移液管将该生物样品移至转移工具上与将该生物样品置于冷冻物质之间的时间是45秒或更短，更优选30秒或更短。冷冻物质可以是液氮、乙烷半融物或任何其它的本领域熟知的冷冻物质。优选地，在玻璃化后的全部操作期间使该生物样品置于冷冻物质内直至样品复苏。
再将玻璃化的生物样品转移到贮存容器内。在一优选实施方案中，转移工具是连至小瓶盖内部的套环。该小瓶装满了冷冻物质，并放在与使生物样品发生玻璃化的冷冻物质所使用的容器相同的贮存器中。发生玻璃化后，可将仍位于套环内的生物样品密封于小瓶内而无需从冷冻物质中取出之。然后其冷冻物质中含有玻璃化生物样品和套环的密封小瓶可无限期地冷冻保存。
之后，可使生物样品复苏，存活的生物样品还可以发育。通过从贮存罐取出含有玻璃化生物样品的小瓶，迅速从小瓶中取出含有生物样品的转移工具并将转移工具和样品投至复苏液中来完成复苏(过程)。在一优选实施方案中，将贮存小瓶置于含冷冻物质的贮存器中，优选与小瓶内所含冷冻物质相同之冷冻物质的贮存器。在冷冻物质中，打开小瓶，取出含有生物样品的转移工具，迅速投到复苏液中。复苏液可以是任何足以使生物样品得以复苏并保护其存活的溶液或物质，包括但不限于本领域所知的适于作为特定生物样品的基础培养基的培养基。复苏后可采用对于该种类及该样品利用过程而言任何已知的适宜方式来对该生物样品进一步操作。
依据图1 还说明了本发明的优选方法。如I所示，将在适宜基础培养基中的生物样品直接加至套环或直接舀至套环。如I中所示该套环与有磁性的小瓶盖相通。随后立即将该套环直接投入保存在容器中的冷冻物质中，该容器可以是装满液氮的绝缘盒。或者，可将该冰冻物质直接放在小瓶中，并且生物样品通过本身与小瓶中的冰冻物质直接接触可发生玻璃化，从而减少了对分离贮存器的使用。在液氮下，将该套环放在贮存瓶中，该玻璃化样品保存于套环中。可通过使其直立放于贮存器中小瓶-大小的孔中来充满多个小瓶，或者，可选择地，用钳或其它工具可将单个小瓶置于液氮下。然后多个小瓶可无限期地冷冻保存于任何适宜的容器中，例如III中说明的标准杜瓦瓶。在以后的任何时间，如IV所示，与以上所述的该玻璃化过程恰恰相反，可将套环从在冷冻物质如液氮下的小瓶中取出。在复苏前，应用含有包埋小瓶的冷冻物质的贮器是便利的，但不是必须的，但是在小瓶中的冷冻物质本身足以使生物样品在复苏前进行操作时得以冷冻保存。然后将生物样品直接放在复苏液中。将复苏液以任何方便的形式放在，包括如V所示的开放的培养皿中或在吸管中以便直接装入转移枪中。将该生物样品立即放在复苏液中稀释，并且从套环中飘浮出来。然后可将生物样品以任何本领域所知的适当方式进行培养。
应用本发明的方法，敏感生物样品例如精子、卵母细胞和胚胎的玻璃化比传统冷冻保存步骤具有优势，这是因为本方法缺少生物样品与冷冻物质间的损伤层。该因素和不到1-5μl极少量的所用的一般生物样品或培养基、溶液或其它含有所用生物样品的物质，在冷却时导致极快速和均匀的热交换。高速率冷冻防止对敏感细胞例如发育细胞的冷损伤。本发明达到的极快的冷冻速率也明显降低与所用的任何选择性冷冻保护剂的接触时间并因此降低其对样品的冷冻毒性。
本发明方法其它的优点包括：(具有)在操作时便于观察样本的开放系统；不需要贵重或复杂的装置便能对大量样品进行快速冷冻；标记和贮存方法非常简易；及可以对少量和即刻样品进行复温和恢复。对于需要封闭系统的应用例如人类临床应用而言，使用标准冷冻瓶能使它们密封于标准塑料纸中，或可选择地，可封住冷冻瓶盖内的释放孔，防止任何可能的病毒交叉传播。
冷冻保存后卵母细胞生存能力的最终评定是指致孕和保孕以生成正常的可生育的幼体的能力。对于此有两个原因说明仓鼠是绝佳动物模型。首先仓鼠对体外环境非常敏感，这使它成为非常敏感的模型，因为本发明的发明者未发现任何文献报道过用任何方法冷冻保存后可成功地产生仓鼠幼仔。第二，仓鼠的妊娠期只有16天，并且在3-4个月后可达性成熟期。后面的实施例证实了本发明可成功冷冻保存多种卵母细胞，此后可将这些卵母细胞复苏并用以产生正常的幼仔，成熟率至少达90％。
牛卵母细胞和优选地牛胚胎据报道对冷损伤异常敏感。而且在卵母细胞中的高脂成分与牛卵母细胞对冷冻保存过程中敏感性增加相关。如后面的实施例所示，用本发明的方法使牛胚胎和分裂期卵母细胞发生的玻璃化，使其在培养中后来可发育至桑葚胚/囊胚期，并且成功孵化的百分率很高。
该发明也涉及用于生物样品玻璃化的试剂盒。该试剂盒一般包含该生物样品玻璃化的说明，其中该样品直接与冷冻物质接触。该试剂盒还包括1个或多个可选择成分，包括但不限于，转移工具，最优选套环，装套环和与其所含的玻璃化样品的具有适宜大小和形状的小瓶、基础培养基、转移溶液和冷冻保护剂。
通过下面非限制性实施例进一步对本发明进行说明，申请中列出的参考文献在这里引用作为参考。
实施例1-用于牛和仓鼠卵母细胞和胚胎玻璃化的方法和物质A.培养基在以下实施例中，所用的培养基是胚胎培养基-10，按Lane等人分子生殖和发育(Mol.Reprod.Dev)50：433-450(1998)描述的方法制备，应用Hepes缓冲的HECM-10改变液进行胚胎的收集和冷冻保护，其中用20mM Hepes(pH7.35)代替20mM NaHCO3。在应用前，立即将冷冻保护液加入培养基中。如Gardner等人人类生殖13：3434-3440(1998)所述的培养基G 1.2和G 2.2用于牛胚胎的培养。所有的盐、碳水化合物、氨基酸、二甲亚砜(DMSO)、乙二醇和蔗糖均购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。牛血清白蛋白购自Bayer Diagnostics。
B.仓鼠胚胎的收集和培养如前面Lane等人分子生殖和发育(Mol.Reprod.Dev)50：433-450(1998)所述，从超-排卵母仓鼠中收集仓鼠胚胎。在1-细胞或2-细胞期将仓鼠胚胎冷冻保存。如Lane等人分子生殖和发育50：433-450(1998)所述，将仓鼠胚胎在HECM-10中进行培养。在用三硝基甲苯处理后应用碘化丙啶染色法对产生的囊胚数目进行测定。
C.牛胚胎的体外成熟/体外受精/体外培养(IVM/IVF/IVC)如Krisher等人生物生殖(Biol.Reprod.)60：1345-1352(1999)所述，从卵巢上将未成熟的牛卵母细胞分离，并使其成熟。将成熟的卵母细胞玻璃化和复苏，或不进行玻璃化和复苏以作为对照，并且应用Krisher等人生物生殖60：1345-1352(1999)所述的方法进行体外受精。在受精后将假定的合子分离并在连续培养基G 1.2和G 2.2培养，在每一培养基培养72小时。经过总共144小时后，评定发育到桑葚胚/囊胚和囊胚期的情况。
D.应用套环的玻璃化用于玻璃化的套环是尼龙套环(20μm宽，直径0.5-0.7mm)绑在不锈钢管上，后者又用环氧树脂固定在冷冻小瓶的瓶塞上。(HamptonResearch，Laguna Niguel，CA)。通过2步加入冷冻剂将卵母细胞和胚胎玻璃化。开始，将卵母细胞和胚胎在含有10％DMSO和10％乙二醇的冷冻液I中放置1-3分钟。然后转移至含有20％DMSO和20％乙二醇，10mg/ml Ficoll(MW 400,000)和0.65M蔗糖的溶液II中放置20秒钟。然后将细胞转移至事先浸入溶液II中制成薄膜的套环上。对于仓鼠胚胎，在套环上放置10-12个胚胎，对于牛胚胎，在每个套环上放3-6个胚胎，然后将悬浮于尼龙套环中的胚胎直接放于液氮中。通过事先将冷冻小瓶浸入液氮下，将含有胚胎的套环插入含有液氮的冷冻小瓶中并同时将其在液氮下密封。
用蔗糖通过2步稀释将卵母细胞和胚胎复苏。将冷冻小瓶置于液氮下，打开小瓶并且从液氮中将含有细胞的套环取出，然后将其插入含有0.25M蔗糖的基础培养基的孔中，该卵母细胞/胚胎立即从套环上脱离并进入复苏液中。在2分钟后将卵母细胞从此溶液中取出，并且转移至含有0.125M蔗糖的基础培养基中再放置5分钟。接着，在基础培养基中将卵母细胞和胚胎冲洗两次并达5分钟，并且然后恢复培养。
E.应用开口的拉伸吸管技术的玻璃化为了进行比较，应用Vaita等人冷冻通讯(Cryo-Letters)18：191-195(1997)描述的该开口的拉伸的吸管技术(OPS)将仓鼠胚胎玻璃化。将10-12个胚胎分2步加到由乙二醇和DMSO组成的冷冻保护剂中，其浓度与上面的相同。将胚胎抽吸到1μl的第二冷冻保护液滴中，然后用毛细管作用加到开口的拉伸的吸管中，将含有该胚胎的吸管直接投入至液氮中。如果复苏的话，通过如上所述的复温和复苏过程逐渐增大压力使胚胎从吸管中排出。
F.胚胎转移将仓鼠桑葚胚/囊胚转移至3(-1天非同步性)天假孕受体中。将8个胚胎转移至每一子宫角。在孕14天，将一些动物处死并且确定种植和胚胎发育率。使其它的雌性动物在孕16天时产仔，并在幼仔出生不久记录其数目。
G.统计学分析用线性对数回归来评价处理组间发育差别，其中该分布是二项的(Glim 4.0，Numerical Algorithms Group，Oxford，UK)。将实验天数作为因子进行拟合。确定Gaussian归一化和方差齐性时应用方差分析评价细胞数目差别。通过用于多重比较的Bonferroni′s方法来评价组间的多重比较。
实施例2-玻璃化和仓鼠胚胎的随后发育依据本发明的方法，应用套环将仓鼠2-细胞胚胎玻璃化，并且与直接和冷冻保护剂接触的对照胚胎或应用实施例1中所述的OPS方法而玻璃化的胚胎结果相比较。从输卵管收集胚胎，并分至对照、套环和OPS玻璃化组。如下面表1所示，与应用OPS玻璃化的胚胎相比，在套环中玻璃化时，明显更多的胚胎发育至桑葚/囊胚和囊胚期。
如表1所示，与对照胚胎相比，应用任何一种技术玻璃化后再培养，能持续发育至桑葚/囊胚或囊胚期的2-细胞胚胎明显减少。然而如表1所示由玻璃化2-细胞胚胎产生的囊胚(分裂率指标)的细胞数目明显与未经玻璃化的2-细胞胚胎数目在统计学意义上相等。应用套环也可以将大鼠2-细胞胚胎成功玻璃化，并且与对照组相似(n＝10)，其在复苏后能正常发育且分裂率达75％。
为进一步评价玻璃化敏感细胞的能力，用1-细胞胚胎重复该实验，但1-细胞胚胎与冷冻保护剂稀释液接触的时间由2分钟降至1分钟。初步的研究证实1-细胞胚胎与冷冻保护液接触2分钟(不发生玻璃化)使其发育能力严重降低。同样胚胎收集自输卵管并且被分配至对照、套环或OPS玻璃化组。
如表1所示，在用套环进行的玻璃化之后，仓鼠1-细胞胚胎在培养中能分裂和持续发育桑葚胚/囊胚期。与应用OPS玻璃化的胚胎相比较(表1)应用套环玻璃化的胚胎玻璃化的发育率明显较好。应用套环也能将仓鼠卵母细胞成功玻璃化(n＝20)并且随后使其进行受精，与对照非冷冻保护卵母细胞相比较，其以10％的比率发育至桑葚胚/囊胚期。
表1.玻璃化后培养的仓鼠胚胎的发育情况
M/B 桑葚期/囊胚发育期B 囊胚发育N＝对单细胞胚胎而言至少每个处理组有100个胚胎(重复4次)；对2-细胞胚胎而言至少每个处理组有400个胚胎(重复8次)a与对照组有明显差异(P＜0.05)b与对照组和套环玻璃化组有明显差异(P＜0.05)实施例3-玻璃化后仓鼠1-细胞和2-细胞仓鼠胚胎的存活力应用套环或通过OPS方法将仓鼠胚胎玻璃化。复温后在转移至假-孕受体之前将胚胎培养至桑葚/囊胚期(玻璃化和对照胚胎)。如表2所示，与未行冷冻剂保护的对照胚胎相比较，事先在2-细胞期进行玻璃化的桑葚胚/囊胚期的胚胎种植和发育成活胎鼠的存活力没有差别。但是如表2所示，当采用OPS玻璃化时，能种植并发育活胎鼠的胚胎明显较少。接受在2-细胞期应用套环玻璃化的桑葚胚/囊胚的两只雌鼠产仔产下5只幼鼠。这些幼鼠发育成了形态上正常和可育的成鼠。
类似的，如图2所示，1-细胞的仓鼠胚胎的着床和胚胎发育没有受到使用套环的玻璃化方法的影响。没有OPS玻璃化的胚胎因为在从前的实验中的低的存活率而被转移。又有2只接受了2-细胞所称用套环玻璃化的桑葚胚/囊胚的雌鼠产仔并生下共9只幼鼠。生下幼鼠6-9天后，该雌鼠吃掉了一只幼鼠。其它的幼鼠发育成形态正常并能生育的成鼠。
表2.玻璃化后宫内仓鼠胚胎的发育
a与对照胚胎有明显差异(P＜0.05)实施例4-牛卵母细胞、分裂期胚胎和囊胚的玻璃化为判定本发明玻璃化方法成功将不同细胞类型的胚胎玻璃化的能力，用如实施例1所述的方法将牛卵母细胞和胚胎玻璃化，对其生存率和以后的发育进行评定，结果如表3所示。将卵母细胞和胚胎分至对照组或应用本发明方法应用套环玻璃化组中，如表3所示，应用套环将体外产生的牛囊胚成功玻璃化且80％扩增的囊胚能在玻璃化后再扩增和孵育。对照囊胚培养的结果是培养48小时后100％的囊胚孵育。而且应用套环玻璃化能成功地将75％的完全孵育的囊胚玻璃化。如表3所示，应用本发明的玻璃化方法玻璃化的8-细胞牛胚胎，能进行玻璃化并且复温后的生存率(通过向桑葚胚/囊胚期的发育来判定)与未经冷冻保护的新鲜胚胎的生存率相等。与新鲜胚胎相比，在该4-细胞期胚胎的玻璃化导致生存率的轻微下降，但是如表3所示，许多胚胎能正常发育至桑葚胚/囊胚期。牛卵母细胞对冷损伤异常敏感并且很少有报道证实在行冷冻保护后取得的任何成功。在体外，应用套环将成熟牛MII卵母细胞成功玻璃化。行玻璃化和复温的卵母细胞随后受精，有33％继续发育桑葚胚/囊胚期(n＝42)。
表3.玻璃化后培养的牛胚胎的发育状况
M/B，桑葚/囊胚发育期B 囊胚发育HB 孵化的囊胚发育n/a 未得n/d 末确定实施例5-人和小鼠囊胚玻璃化的方法和材料A.培养基用于胚胎培养的培养基是G 1.2和G 2.2(IVF SciencesScandinavian，Gothenburg，瑞典)。胚胎收集培养基是G 1.2的HEPES的改变液并且冷冻保护和复苏的基础培养基为不含氨基酸和维生素的G 2.2 HEPES-缓冲改变液。在上述两种培养基中，通过用20mMHEPES代替20mM NaHCO3来改变培养基，并调整pH为7.35。
B.小鼠从4-6周龄F1雌小鼠(C57BL6×CBa)中收集胚胎。用5iu孕与促性腺激素(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)刺激小鼠，并且48小时后再用5iu的人绒毛膜促性腺激素(hCG；Sigma Chemical Co.)，在注射hCG后将雌鼠与同系雄鼠置于一起，次日早晨，阴道栓的出现表明交配的发生。在注射hCG 22小时后收集合子并且通过在含0.5mg/ml透明质酸酶的H-G 1.2中孵育不到一分钟使合子从环丘中裸露出来。在H-G 1.2将合子冲洗两次并进行培养。
C.小鼠胚胎培养在37℃，含5％CO2的潮湿空气中，在20μl G 1.2培养基液滴中将小鼠合子分成10组进行培养。培养48小时后，在G 2.2培养基中将8-细胞胚胎冲洗3次，再在G 2.2培养基液滴中培养48小时。培养96小时后评价囊胚的发育。
D.人胚胎培养依据Gardner等人人类生殖Hum.Reprod.13：3434-40(1998)所述，建立囊胚生长培养体系。在将卵母细胞复苏后，为行人工受精在补充了胎脐血清(FCS)的Ham′s F-10中孵育卵丘包囊的卵母细胞。依据起始精液参数用50-70-95非连续梯度或小梯度方法(精子提纯，Nidacon，Gothenburg)制备精液，在Ham′s F-10中冲洗得到的产生的精液块。就正常人工受精而言，每一卵母细胞需加入50-100,000精子/ml。如果进行胞质内注射(ICSI)，用透明质酸酶和吸管将卵母细胞剥离。将每一成熟卵母细胞放在添加了15％FCS的6μl磷酸缓冲盐中。将配偶精子放在6μl PVP(IVF Sciences Scandinavian)液滴中。用Ovoil(IVF Sciences Scandinavian)平铺所有液滴。用装有Narishige显微操纵器的Nikon倒置显微镜进行ICSI。冲洗注射后的卵母细胞，并将其放在含有G 1.2的试管中，直至进行受精结果的评定。在人工受精或ICSI 15-18小时后进行受精结果的评定。在器官培养皿中用27-号的可处理针通过解剖将细胞柱和细胞丘取下。冲洗干净得到的2原核胚胎并且随后将其分2-3组并在含5％CO2的空气中在1-ml Falcon培养中的G 1.2培养基中进行培养。
培养48小时后，将胚胎冲洗3次并且再培养72小时。第6天的囊胚认为是不很适合进行此前本领域已知方式的冷冻保护，也就是其不完全扩增或者内细胞群发育差，本发明的该方法选用此囊胚进行玻璃化。
E.应用套环的玻璃化用于玻璃化的套环由与不锈钢管相连的尼龙套环(20μm宽，直径0.5-0.7mm)构成。该钢管固定在冷冻小瓶的瓶塞上。购买安装好的套环(Hampton Research，Laguna Niguel，CA)然后粘至小瓶中。在盖上放置金属片，这样需要的话可以使用带有小磁铁的手柄来操作该套环。
通过2步加入冷冻保护剂的方法使囊胚玻璃化。开始将囊胚放在含有10％DMSO和10％乙二醇的冷冻保护液I中2分钟，之后在含有20％DMSO和20％乙二醇、10mg/ml Ficoll(MW 400,000)和0.65M蔗糖的溶液II中放置20秒。冷冻保护剂的这些浓度和与胚胎的接触时间长短在前已证明最适于应用套环方法进行啮齿动物和家畜胚胎的玻璃化。把囊胚放在冷冻保护液I中时，将套环放在冷冻保护液II中使在套环上形成薄膜。然后将囊胚从溶液II中转移套环上的冷冻保护剂膜上。此后将含有囊胚的套环投入浸入并装满液氮的冷冻小瓶中。通过事先将冷冻小瓶浸入液氮，可将含有囊胚的套环投入含有液氮的冷冻小瓶中并且同时在液氮下将小瓶封口。将小瓶贮存于标准容器中。
用蔗糖2步稀释法复苏囊胚。把冷冻小瓶浸入液氮下将小瓶打开，并且将含有囊胚的套环从液氮中取出，并直接放进含有0.25M蔗糖的基础培养基孔中。该囊胚立即从该套环上掉入复苏液中。2分钟后将囊胚从该溶液中取出。将囊胚转移至含有0.125M蔗糖的基础培养基中再放置3分钟，接下来5分钟内在该基础培养基中将囊胚冲洗两次然后进行培养。
玻璃化以后，将小鼠和人的囊胚在培养基G 2.2中培养6小时，在评定囊胚生长之前评定其再扩增。之所以选择6小时孵育是因为在转移之前这是用于复苏囊胚评定的该正常时期。
F.囊胚生长的评定对小鼠和人囊胚的生长均进行评定，作为以后的存活力标志。将囊胚转移至加入10％胎脐带血清的培养基G 2.2中以评定囊胚的附着和生长。在4孔板上培养囊胚，该4孔板用0.1％ 500μl明胶液滴在37℃在含有5％CO2的空气中预包被。24小时后对囊胚的孵化和附着进行评定，并且再培养24小时后进行囊胚生长的评定。内细胞群(ICM)和滋养外胚层的生长，依据其数量，在0和3之间给分，如Spindle和Pederson，J Exp.Zool.，186：305-318(1972)所述，其中0分是无生长而3是过度生长。
G.小鼠囊胚存活力的评定通过将其转移到假孕受体来进行小鼠囊胚玻璃化后存活力的评定。复温后转移之前，将囊胚在培养基G 2.2中培养6小时。6小时后收集所有的再扩增囊胚并随机选择需转移的囊胚。每一个子宫角转移6个囊胚，在孕15天，进行种植、胎儿发育和胎儿重量的评定。将非冷冻保护的囊胚作为对照。
H.统计分析用Yates校正的卡方分析来评定玻璃化后囊胚孵化、附着和存活力的差异。起先对ICM和滋养层细胞生长的数据进行Kolmogorov-Smirnov检验以判定数据的归一性。然后F-检验评定两组数据的方差齐性。该归一性和方差齐性确立后，用Student′s t-检验评定生长的差异。
实施例6-小鼠囊胚的玻璃化根据本发明应用套环使总共160个小鼠囊胚发生玻璃化。玻璃化后，100％的这些囊胚能够在培养物中再扩增。如表4所示，与对照胚胎相比，发生玻璃化的囊胚在培养物中孵化和贴壁的能力没有差别。同样，如表4所示，ICM或滋养外胚层在培养物中的生长能力与对照和玻璃化的囊胚没有区别。
在玻璃化和复苏后，将60个囊胚转移到假孕受体中，并将其存活率与未经冷冻保存的同胞对照囊胚进行比较。与对照囊胚相比，玻璃化囊胚种植和发育成胚胎的能力没有差别。玻璃化的囊胚所形成的胎鼠之体重(0.245±0.021g)与对照囊胚(0.250±0.017g)类似。所有玻璃化过的囊胚及对照囊胚产生的胎鼠形态都正常。另外使接受了8个玻璃化囊胚(每个子宫角4个)的雌性受体产仔。出生3个形态正常的幼仔。
表4.小鼠囊胚套环玻璃化对再扩增及生长的影响
1对照和玻璃化囊胚之间所测得的任何指标都无差别对照和玻璃化囊胚n≥100实施例7-人囊胚的玻璃化根据本发明的方法应用套环使十八个人囊胚发生玻璃化，运些囊胚为极小至半扩增之间的囊胚。其中11个(83.3％)在培养物中发生再扩增。如表5所示，ICM和滋养外胚层在培养物中的孵化能力和生长与玻璃化的囊胚和未经冷冻保存的对照囊胚类似。
表5.人囊胚套环玻璃化对再扩增和生长的影响
1对照和玻璃化囊胚任何测量指标都没有差别实施例8-第8天牛囊胚的玻璃化以下溶液用于本实施例：冷冻液：溶液1：含10％乙二醇和10％DMSO的基础培养物(如实施例1所示)溶液2：含0.65M蔗糖和20％乙二醇和20％DMSO和10mg/mlFicoll复苏液：溶液1：含0.25M蔗糖的基础培养基溶液2：含0.125M蔗糖的基础培养基溶液3：基础培养基溶液4：基础培养基根据实施例1 所述方法产生牛囊胚。玻璃化前使所有囊胚进行一定程度的扩增。用标准装置将该囊胚吸至套环上，该套环已浸入冷冻液2中。每个套环含一个囊胚。然后将含有囊胚的套环在冷冻液1中处理2分钟，然后在包括Ficoll粘液的冷冻液2中处理30秒，再迅速将其直接投至液氮中进行玻璃化。将该囊胚在液氮中冷冻30-90分钟，然后复苏。
为复苏囊胚，将该囊胚和在其中发生玻璃化的套环依次置于复苏液1-4中各5分钟。
在根据本发明进行玻璃化和复苏的13个囊胚中，9个囊胚在培养48小时后孵化。
第二批4个囊胚如上所述经过玻璃化、复苏和培养，培养48小时后全部成功孵化。
按实施例1所述方法产生第三批8-天牛囊胚。共使用了12个囊胚，并将2个已扩增的囊胚置于每个套环内。如上所述使该囊胚玻璃化、复苏和培养，只是复苏过程如下进行。溶液1中2分钟；溶液2中5分钟；溶液3中5分钟和溶液4中5分钟。培养48小时后11个囊胚孵化。
实施例9-九天牛囊胚的玻璃化按照实施例1 所述方法产生牛囊胚，按实施例8所述方法使之玻璃化。然后如实施例8所述复苏和培养该囊胚。48小时后，80％的囊胚孵化。
实施例10-七天牛囊胚的玻璃化如实施例1 所述产生七天的牛囊胚，并如实施例1所述用G 1.2/G2.2进行培养。共有20个囊胚按照实施例8所述方法发生玻璃化和复苏，并且冷冻2小时，每个套环2到3个囊胚。然后如实施例8所述复苏和培养该囊胚。复苏后的囊胚培养48小时后，20个囊胚中有15个孵化，2个发生再扩增。
七天囊胚的第二次实验按上述方法进行，每个套环1到2个囊胚。培养48小时后，33个经玻璃化的囊胚中有29个发生孵化。
实施例11-牛卵母细胞的玻璃化在本实施例中，使应用本发明之方法而发生玻璃化的牛卵母细胞与应用已知的开口的拉伸的吸管(OPS)之方法发生玻璃化的卵母细胞以及未经冷冻的对照卵母细胞进行了比较。应用实施例8所述溶液，使待玻璃化的卵母细胞在溶液1中处理35秒，溶液2中单独处理30秒或溶液2和粘液中处理30秒。然后按照每个吸管1-3个或每个套环1-3个细胞将之投入到液氮中冷冻。玻璃化后，所有的卵母细胞按以下步骤复苏：溶液1中1分钟；溶液2中5分钟；溶液3中5分钟；和溶液4中5分钟，所用溶液均为实施例8的溶液。然后使该牛卵母细胞返回到成熟培养基中2小时，再按正常方式受精。一天后，将该卵母细胞如实施例1所述移至G 1.2培养基中。4天后，如实施例1所述将分裂的胚胎转移到新鲜的G 1.2培养基中。对照卵母细胞分裂率为37.5％，根据现在的方法发生玻璃化的卵母细胞分裂率为19％，用OPS方法发生玻璃化的卵母细胞分裂率为14％。再将该卵母细胞转移到新鲜的G 2.2培养基中培养4天。在八天末，24个原来的裸露卵母细胞对照中仅有2个发育至了桑葚期。作为比较，根据本发明发生玻璃化的16个卵母细胞中3个卵母细胞发育至桑葚胚期。作为比较，应用OPS方法已经玻璃化的28个卵母细胞中，无任何细胞发育至桑葚胚期，该卵母细胞只有4个存活，最成功的OPS方法的单个实施例发育至16-32细胞期。
实施例12-用于小鼠和人卵母细胞玻璃化的方法和材料A.培养基用于胚胎培养的培养基是添加了5mg/ml人血清白蛋白(Gardner等人，Hum.Reprod.13：3434-40(1998))的G 1.2和G 2.2。用于胚胎收集和玻璃化的培养基是HEPES缓冲的、无EDTA的G 1.2改变液，用20mM HEPES代替20mM NaHCO3并调整pH值为7.35。
B.小鼠从4-5周龄F1(C57BL6×CBa)雌鼠收集卵母细胞。用5iu孕马促性腺激素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)刺激雌鼠并且53个小时后再用5iu的人绒毛膜促性腺激素(hCG；Sigma ChemicalCo.)。注射hCG后14个小时收集卵母细胞并通过在H-G 1.2中用0.5mg/ml透明质酸酶作用不到一分钟降解周围的环丘，使卵母细胞裸露。在H-G 1.2中将卵母细胞冲洗两次并且进行人工受精或冷冻保护。
C.人卵母细胞的收集根据Gardner等人，人类生殖(Hum.Reprod.)13：3434-40(1998)的方法刺激病人产生多个卵母细胞。将卵母细胞自滤泡中冲洗出来，置于G 1.2中培养4小时。通过在G 1.2中与透明质酸酶温育去掉周围的环丘使卵母细胞裸露。再将未成熟的卵母细胞置于含有胎儿脐带血清的G 2.2中培养24小时。然后使成熟的MII卵母细胞作为对照或应用套环进行玻璃化。
D.小鼠和人类卵母细胞的套环玻璃化应用2个加有冷冻保护剂的步骤使卵母细胞玻璃化。首先将卵母细胞置于含有10％DMSO和10％乙二醇的冷冻保护液I中1分钟，再转移到含20％DMSO和20％乙二醇、10mR/ml Ficoll(分子量40万)和0.65M蔗糖的溶液II中约20秒。然后将卵母细胞转移到已浸入到溶液II中而形成薄膜的套环上，直接投入液氮中。通过预先将冷冻瓶浸入到液氮下，含卵母细胞的套环可投到含液氮的冷冻瓶中并同时在液氮下密封。该小瓶贮存于标准的罐中。
用含蔗糖的2步稀释(法)复苏卵母细胞。在冷冻瓶浸在液氮下时打开小瓶，从液氮中取出含细胞的套环，将其直接放到含有0.25M蔗糖的H-G 1.2基础培养基的孔中。卵母细胞立即自套环掉入复苏液中。2分钟后从此溶液中取出卵母细胞，转移到含0.125M蔗糖的H-G 1.2基础培养基中。3分钟后用H-G 1.2洗卵母细胞2次，5分钟，再恢复培养。
E.小鼠卵母细胞的体外受精和胚胎培养从12-16周龄的F1(C57BL6×CBa)雄鼠附睾中抽吸出精子，注入到FG1培养基中(如Gardner和Lane，1997，Hum.Reprod.Update3：367-382中所述)，该培养基添加1mg/ml谷胱苷肽和5mg/ml HSA(Scandinavian IVF Sciences，Gothenburg，Sweden)。人工受精使精子获能1.5小时。在卵母细胞人工受精前，应用Fertilase 670nm激光定位来和准值1.48μM的激光束(MTM医学技术，Montreux，Switzerland)在卵母细胞带上产生一个小孔(5μM)。将卵细胞放于100μl FG1液滴中并与大约1×104个精子共孵育4小时。将卵母细胞冲洗两次并在20μl G 1.2液滴中于37℃及6％CO2、5％O2和89％N2中进行培养。在次日早晨，通过2-细胞胚胎的出现来评定受精情况。将所有的2-细胞移至新鲜的G 1.2液滴中。在48小时后在G 2.2中将培养胚胎冲洗干净，并且在G 2.2中再培养48小时至囊胚期。
F.人卵母细胞的存活力评定通过染料-排斥法评定人卵母细胞存活力。将卵细胞在含有25μg/ml碘化丙锭的H-G 1.2中放置10分钟，然后在H-G 1.2中冲洗5分钟。经过玻璃化过程未存活的卵母细胞核物质染色阳性，而存活的卵母细胞不着色。
G.统计分析用线性-对数回归评价处理组间发育的差异，其中该分布是二项分布(Glim 4.0，Numerical Algorithms Group，Oxford，UK)。将实验日期作为实验因素。当证实Gaussian正态性和方差齐后应用方差分析评价细胞数目间的差异。通过用于多重比较的Bonferroni′s方法来评价处理组间的多重比较。
实施例13-冷冻保护后培养的小鼠卵母细胞的发育如表6所示，与应用缓慢-冷冻方法冷冻保护的卵母细胞相比，应用本发明方法玻璃化的卵细胞具有明显较高的生存率。类似地，如表6所示，与缓慢-冷冻方法相比，应用本发明方法玻璃化的卵母细胞的受精率明显较高。如表6所示，应用本发明方法冷冻的卵母细胞与人工受精的对照组新鲜卵母细胞具有相等的受精率。如表6所示，应用缓慢-冷冻方法冷冻保护的卵母细胞的受精率明显较低。未冷冻的对照卵母细胞有70.0％总卵母细胞发育到囊胚期或有95.4％2-细胞胚胎发育至囊胚期。如表6所示与对照卵母细胞相比，应用套环玻璃化的卵母细胞的该囊胚发育率没有差异。相反，如表6所示在通过缓慢-冷冻而冷冻保护的卵母细胞中总卵母细胞或2-细胞胚胎的囊胚发育率明显下降。
表6.小鼠卵母细胞的冷冻保存对小鼠受精和胚胎发育的影响
N＝每组处理组至少300个胚胎*与所有其它组有明显差异(P＜0.05)**与所有其它组有极明显差异(P＜0.01)实施例14-冷冻保护后小鼠卵母细胞的后继存活力将自新鲜或冷冻保护的卵母细胞(应用本发明方法发生玻璃化或缓慢-冷冻)衍生的囊胚转移到假孕受体中，并且评定其种植和胎鼠发育情况，结果见表7。自应用本发明方法玻璃化的卵母细胞衍生的囊胚与新鲜卵母细胞具有相似的种植率，但是胎鼠发育轻微减缓。相反，与对照卵母细胞或应用本发明方法玻璃化的卵母细胞相比，应用缓慢冷冻方法冷冻的卵母细胞的种植率和胎鼠发育率明显下降。另外，使各转移有8个囊胚的2个雌鼠产仔，这些囊胚来自玻璃化的卵母细胞。出生了11个幼仔(7和4)，所有幼仔都发育成了形态正常并具有生育能力的成年小鼠。出生的11个幼仔中，8雌3雄。
表7.冷冻保存对转移后小鼠存活力的影响
N＝每个处理组至少转移50个囊胚a-c表示有明显差异的不同字母(P＜0.05)实施例15-冷冻保存后人卵母细胞的存活率用本方法玻璃化后评定人卵母细胞的存活力。如表8所示，观察到此存活率很高。
表8.冷冻保存后人卵母细胞的存活率
实施例16-小鼠分裂期胚胎的玻璃化根据实施例1所述方法收集胚胎。单细胞胚胎在收集后立即进行套环玻璃化，而2-细胞胚胎在24小时后获得。根据实施例1所述方法进行培养。
根据实施例12所述方法应用套环使单细胞和2-细胞胚胎发生玻璃化。与未经冷冻保存的新鲜胚胎相比，小鼠1-细胞或2-细胞胚胎在培养时发育至囊胚期的能力没有差别。结果如以下表9所示。
表9.根据本发明发生玻璃化后小鼠1-细胞和2-细胞胚胎的发育状况
#与新鲜胚胎比较套环玻璃化的1-细胞或2-细胞胚胎培养发育能力没有差别。
实施例17-应用本发明小鼠精子的玻璃化按照实施例12所述方法收集成熟的小鼠精子。
将1μl含10％DMSO和10％乙二醇的冷冻保护液I液滴加到培养皿盖上。将1μl精子溶液加到溶液1液滴上。20秒后，加入1μl含20％DMSO和20％乙二醇、10mg/ml Ficoll(MW 400,000)和0.65M蔗糖的溶液II并将整滴置于套环上，将该套环投放入液氮。复苏时，将该套环置于20μl含0.25M蔗糖的基础培养基中30秒，再将20μl基础培养基加到此液滴上，放置1分钟，最后加入2ml基础培养基。然后，通过测定活动能力获得活精子。
应理解本发明并不限于上面所示范的具体的实施方案，其还包括属于下列权利要求范围的所有此类变更的形式。