技术领域
[0001] 本公开总体上涉及对病状的治疗和治疗方法的特性。更具体地，本公开涉及对潜在的或经批准的治疗方法的毒性，如与潜在的或经批准的心脏或非心脏治疗方法相关联的心脏毒性的体外分析。
背景技术
[0002] 心脏毒性仍然是占I-III阶段临床试验中药物损耗的22％以及占1975年到2007年期间美国市场的药物
戒断的45％的常见主要原因。[1,2]具体地，尖端扭转型室性心动过速(TdP)——潜在致命的
心律失常形式独占药物戒断的33％。[1-3]重要地，致心律失常呈现出不仅对心脏药物而且对如抗组织胺药、抗菌药和抗抑郁药等大量其它药物的药物安全的主要关注。[4]除了显著的患者损害之外，单一的后期损耗成本超过20亿美元和10年。[5]因此，灵敏且准确的临床前测试平台是高度期望的。尽管动物模型是常见的，但是显著的物种差异仍然存在(例如，与人类相比，小鼠每分钟约500次心跳并且缺乏QT间隔)。使用永生化转基因中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人类胚肾(HEK293)细胞的传统工业标准也是高度次优的，这些细胞被基因修饰成异源过表达单离子通道蛋白hERG(人类果蝇相关基因)以评估致心律失常，因为天然心脏细胞携带过多的离子通道和
泵，导致释放许多不安全药物或错误地终止其它有用的候选物。[6-9]因此，被证明分化为真正的人类心肌细胞(CM)的人类多能干细胞(hPSC)已被追求为药物发现和毒性筛选治疗的更好替代。[10,11]各种证据表明，带有hPSC衍生的CM(或hPSC-CM)的膜片钳实验足以确定如动作电位延长、去极化后早期和延迟等促心律失常性质。[12-14]尽管这些数据提供了初始评估，然而，这种单细胞特性只是多细胞心律失常的触发因素或替代物，但从定义上讲其本身并不是多细胞心律失常，并且不提供如发病率和发生
阈值等关键信息。事实上，一些结果甚至可能是误导性的。作为假阴性，单细胞测定无法检测对于如传导等细胞间性质的影响；作为
假阳性，由于系统内的代偿性反应，单细胞
缺陷可能不会转化为持续的折返心律失常事件。
[0003] 出于上述原因，本领域继续存在对体外筛选测定的需求，该筛选测定可靠且成本有效地确定如毒性等潜在或现有治疗方法的不良影响，例如，如心律失常等心脏毒性。
发明内容
[0004] 本文公开了
生物混合材料，其形式为(1)如hPSC-CM等人类心肌细胞(例如，人类心室心肌细胞)，以及(2)为人类心肌细胞生长和有序发育提供附着点的微加工基质，作为已经通过设计策略地对齐的基本构建
块。在使用中，人类心肌细胞形成
镀在微加工基质上的
单层细胞(称为心脏
各向异性片或CAS)，该单层细胞提供有助于人类心脏细胞在体内各向异性特性发育的环境。这种生物混合的实例可以是人类心脏各向异性片(hCAS)，其由人类心肌细胞构成，位于微加工基质上。除了明确定义的包含/排除
质量控制标准和
算法外，如CAS等CAS平台(例如，hCAS、人类
心房心脏各向异性片或haCAS、人类心室心脏各向异性片或hvCAS)可以再现自然人类心脏的关键电生理特征，同时最小化常见于hPSC-CM的常规电生理测定中的变化性，以便对药物诱发的心律失常进行系统评估。生物混合材质提供使更准确地反映如心脏毒性等体内生理效应的体外测定可用的显著益处。利用生物混合材料，可以对例如治疗任何心律失常使用的现有或潜在治疗方法的心脏毒性效应进行体外测定，该心律失常包含但不限于
长QT综合征、布鲁格达综合征、遗传性心脏病、
淀粉样变、早衰、糖尿病昏迷症、
水母中毒、甲状腺功能亢进、黄热病、美洲锥虫病、主动脉瓣返流、
处方药滥用导致心律失常、雷特综合征、心肌炎、三尖瓣闭
锁、莱姆病、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)、涉及心律失常的心脏病或心
力衰竭形式、心脏增大、心碎综合征、甲状腺结节、房室管缺损、霍乱、二尖瓣狭窄、多系统萎缩(MSA)、打鼾、二尖瓣脱垂、
羊水栓塞、坏疽、再生障碍性贫血、成人先天性心脏病、热衰竭、格雷夫斯病、心肌病、心室早发性收缩、心动过缓、疲劳、心动过速、头晕或呼吸急促，以及其它非心脏性疾病。
[0005] 本公开的一个方面提供了一种评估化合物的心脏毒性的方法，其包括：(a)使微加工基质上的各向异性心脏(例如，心室)细胞层与化合物
接触；(b)在一个或多个点刺激该各向异性细胞层；(c)检测该各向异性细胞层中的电
信号传播；以及(d)确定该化合物是否展现心脏毒性。本公开提供了用于评估任何化合物或化合物的组合的心脏毒性的方法，该化合物包含但不限于1A、1B或1C类抗心律失常化合物(例如，对应地普鲁卡因胺、妥卡尼和氟卡胺)，以确定该化合物的任何心脏毒性效应以及任选地其程度。在一些
实施例中，该各向异性细胞层包括源自人类的心肌细胞(例如，心室心肌细胞)。在一些实施例中，该微加工基质包括沿基质的单轴定向的凹槽。
[0006] 在一些实施例中，该凹槽具有相似的尺寸。在一些实施例中，该凹槽的宽度为1μm到30μm，包括其中凹槽的宽度为5μm到15μm的实施例，如其中凹槽的宽度为15μm。在一些实施例中，该凹槽的深度为约5μm。在一些实施例中，凹槽之间的间距为约5μm。
[0007] 本公开的该方面的实施例存在，其中该微加工基质是聚苯乙烯。在一些实施例中，在一点上刺激各向异性心脏细胞层，如其中该刺激为5伏特到30伏特，其中
脉冲持续时间为5毫秒到30毫秒。在示例性实施例中，该刺激为10伏特，其中脉冲持续时间为10毫秒。
[0008] 在本公开的该方面的一些实施例中，如果化合物在该各向异性细胞层中诱发螺旋电传播波，则该化合物被确定为展现心脏毒性。在一些实施例中，该化合物为1A类、1B类或1C类抗心律失常化合物。
[0009] 还设想了实施例，其中该各向异性心脏细胞层包括具有例如至少70％肌
钙蛋白T+的心肌细胞(例如，心室心肌细胞)。在一些实施例中，在不暴露于化合物的情况下，该各向异性心脏细胞层不展现折返事件。在一些实施例中，该各向异性心脏细胞层已经经历了程控
电刺激，如包括以1.5赫兹(Hz)传递的八个S1刺激序列，随后是过早额外刺激(S2)，S1-S2间隔开始于550毫秒(ms)，并且以50ms的步长连续缩短直到捕获失败，此时S1-S2间隔增加20ms，随后是2ms衰减，直到达到有效不应期(ERP)，该ERP被定义为未能导致AP传播的最大S1-S2间隔。在一些实施例中，当对1C类抗心律失常化合物的暴露从0.3μM到3μM逐渐增加时，该各向异性心脏细胞层展现出APD50传导速度的逐步剂量依赖性减慢。在一些实施例中，响应于1A类抗心律失常化合物，该各向异性心脏细胞层展现出剂量依赖性APD90延长。在一些实施例中，响应于1A类抗心律失常化合物，该各向异性心脏细胞层展现出折返事件的至少两倍增加。在一些实施例中，响应于1B类抗心律失常化合物，该各向异性心脏细胞层不展现出剂量依赖性APD90延长。在一些实施例中，响应于1B类抗心律失常化合物，该各向异性心脏细胞层不展现出折返事件的增加。
[0010] 本公开的该方面还包含一种鉴定适于在体外心脏毒性测定中使用的心肌细胞(例如，心室心肌细胞)的方法，其包括：(a)使衍生自多能干细胞的心肌细胞与微加工基质接触；以及(b)将适于在体外心脏毒性测定中使用的心肌细胞鉴定为展现至少两种以下性质的心肌细胞：(i)响应于电点刺激，各向异性比率至少1.8的
辐射传导图案；(ii)至少70％的心脏肌钙蛋白T+；(iii)至少1.5Hz的最大捕获
频率；(iv)响应于从0.5Hz到3Hz(10V，10ms)具有0.5Hz增量直到失去1:1捕获的稳态起搏，不存在折返事件；或者(v)响应于程控电刺激，不存在诱导的螺旋波，该程控电刺激包括第一序列八个电脉冲(S1)，之后是第二序列电脉冲(S2)，其中S1-S2间隔逐渐缩短。
[0011] 在一些实施例中，该方法可以进一步包括：(a)将该心肌细胞暴露于
治疗有效量的1C类抗心律失常化合物；以及(b)如果该1C类抗心律失常化合物诱导信号传导速度的剂量依赖性减慢，则将该心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。在一些实施例中，该
1C类抗心律失常化合物是氟卡胺。
[0012] 在一些实施例中，该方法可以进一步包括：(a)将该心肌细胞暴露于治疗有效量的1A类抗心律失常化合物；以及(b)如果该1A类抗心律失常化合物诱导信号传导速度的剂量依赖性减慢，则将该心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。在一些实施例中，该
1A类抗心律失常化合物是普鲁卡因胺。
[0013] 在一些实施例中，该方法可以进一步包括：(a)将该心肌细胞暴露于治疗有效量的1B类抗心律失常化合物；以及(b)如果该1B类抗心律失常化合物不诱导信号传导速度的剂量依赖性减慢，则将该心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。在一些实施例中，该1B类抗心律失常化合物是妥卡尼。
[0014] 在一些实施例中，该方法可以进一步包括：(a)将该心肌细胞暴露于特非那定；以及(b)如果该特非那定在100nM浓度下不诱导折返事件，但当在300nM浓度下施用该特非那定时，相对于暴露于生理惰性对照化合物，折返事件的可能性增加至少1.2倍，则将该心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。
[0015] 在一些实施例中，该方法可以进一步包括：(a)将该心肌细胞暴露于西沙必利；以及(b)如果相对于暴露于生理惰性对照化合物，该西沙必利使折返事件的可能性增加至少2.7倍，则将该心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。
[0016] 本公开的另一方面涉及一种产生各向异性心脏细胞层的方法，其包括：(a)解离至少80％汇合的多能干细胞培养物以产生单个细胞；(b)在约5％的O2和约5％的CO2的低
氧条件下悬浮培养单个细胞约8天以产生培养细胞，其中该培养包括：(i)在补充有1μM到40μM例如10μM Rho激酶
抑制剂、0.1ng/mL到10ng/mL例如1ng/mL骨形态发生蛋白-4和5μg/mL到100TMμg/mL例如40μg/mL基质胶的mTeSR -l培养基中孵育该细胞约24小时；(ii)在含有5μg/mL到
200μg/mL例如50μg/mL
抗坏血酸、0.1mM到20mM例如2mM GlutaMAXTM、1ng/mL到40ng/mL例如
10ng/mL BMP4和1ng/mL到40ng/mL例如10ng/mL活化素-A的 -34SFM完全培养基中进一步孵育该细胞约3天；(iii)在含有5μg/mL到200μg/mL例如50μg/mL抗坏血酸、0.1mM到
20mM例如2mM GlutaMAXTM和0.5μM到50μM例如5μM Wnt抑制剂的 -34SFM完全培养基中继续孵育该细胞约3天；(iv)在含氧量正常(环境O2、5％CO2)条件下在第8天将该细胞转移到含有5μg/mL到200μg/mL例如50μg/mL抗坏血酸的 -34SFM完全培养基中以产生心肌球；(c)在含有5μg/mL到200μg/mL例如50μg/mL抗坏血酸的 -34SFM完全培养基中维持该心肌球直到第15到22天，其中每3到4天补充培养基；(d)通过暴露于0.1mg/mL到10mg/mL例如1mg/mL胶原酶10到120分钟例如30分钟，然后暴露于0.005％到1.0％例如
0.05％胰蛋白酶1到120分钟例如3分钟来解离该心肌球；(e)将该心肌球接种到基质胶涂覆的微加工基质上以形成各向异性心脏细胞层；(f)将该各向异性心脏细胞层在含有10％热灭活胎
牛血清、0.1X到5X例如1X GlutaMAXTM和0.1X到10X例如1X MEM非必需
氨基酸的高
葡萄糖(至少1g/L，例如4.5g/L)DMEM培养基中孵育2天；以及(g)每隔2天用RPMI 1640培养基补充该培养基(用B27补充)持续至少7天，从而产生各向异性心脏细胞层。在一些实施例中，该多能干细胞培养物是人类多能干细胞培养物。在一些实施例中，该多能干细胞培养物是人类诱导的多能干细胞培养物。在一些实施例中，该多能干细胞培养物是用accutase解离的。在一些实施例中，该Wnt抑制剂为IWR-1。
[0017] 本公开的另一方面涉及一种制造微加工基质的方法，其包括：(a)使用
光刻法生成弹性
体模具以产生具有一系列沿同一轴线定向的通道的模具，其中每个通道为3μm到10μm深且2μm到50μm宽，其中通道之间的间距为3μm到10μm；(b)使用热量将步骤(a)的特征压印到塑料上以产生基质；(c)暴露该基质以进行UVO处理约8分钟；以及(d)通过在化学灭菌剂中将该基质灭菌来产生该微加工基质。在一些实施例中，该弹性体模具是聚二甲基
硅氧烷模具。在一些实施例中，该通道的深度大致相同，如其中该通道深度为约5μm。在一些实施例中，该通道的宽度大致相同，如其中该通道宽度为约10μm或约15μm。在一些实施例中，通道之间的间距大致相同，如其中该通道间距为约5μm。
[0018] 本公开还提供了模拟用于筛选治疗剂、评估化合物的任何心脏毒性效应或者研究疾病过程的心脏病的系统。另外，本公开提供了筛选治疗剂的方法、用于评估化合物的任何心脏毒性效应的方法以及研究心脏病过程的方法。
[0019] 在某方面中，本公开提供了模仿心脏病的系统，其包括生物混合材料，该生物混合材料包括：(a)人类心肌细胞，和(b)用于细胞附着的微加工基质。用于细胞附着的微加工基质提供某种基质，该基质支持hPSC、hPSC-CM或由此衍生的细胞的附着并且允许其生长和发育成在体内具有人体心脏细胞的各向异性特性特征的心脏各向异性片(CAS)。在一些实施例中，该心脏病为心律失常，包含但不限于长QT综合征、布鲁格达综合征、遗传性心脏病、淀粉样变、早衰、糖尿病昏迷症、水母中毒、甲状腺功能亢进、黄热病、美洲锥虫病、主动脉瓣返流、处方药滥用导致心律失常、雷特综合征、心肌炎、三尖瓣闭锁、莱姆病、丘-施综合征、涉及心律失常的心脏病或心力衰竭形式、心脏增大、心碎综合征、甲状腺结节、房室管缺损、霍乱、二尖瓣狭窄、多系统萎缩(MSA)、打鼾、二尖瓣脱垂、羊水栓塞、坏疽、再生障碍性贫血、成人先天性心脏病、热衰竭、格雷夫斯病、心肌病、心室早发性收缩、心动过缓、疲劳、心动过速、头晕或呼吸急促。在一些实施例中，该疾病为非心脏疾病。在一些实施例中，该心肌细胞是心室心肌细胞。在各个实施例中，该系统用于筛选治疗剂、评估化合物的任何心脏毒性效应或者研究疾病过程的方法中。
[0020] 根据上述描述，本公开提供一种筛选心脏病治疗剂的方法，其包括(a)在维持细胞活力的条件下孵育各向异性心脏细胞层；(b)使该心脏细胞与心脏病候选治疗剂接触；以及(c)测量该心脏病候选治疗剂对心脏细胞的效应，其中如果该心脏病候选治疗剂减少心脏细胞中如心律失常等心脏病的症状，则将该心脏病候选治疗剂鉴定为心脏病治疗剂。在一些实施例中，该心脏细胞包括微加工基质。本公开的筛选方法适于与模仿任何心脏病的各向异性心脏细胞层一起使用，该心脏病包括任何心律失常，依次包含但不限于长QT综合征、布鲁格达综合征、遗传性心脏病、淀粉样变、早衰、糖尿病昏迷症、水母中毒、甲状腺功能亢进、黄热病、美洲锥虫病、主动脉瓣返流、处方药滥用导致心律失常、雷特综合征、心肌炎、三尖瓣闭锁、莱姆病、丘-施综合征、涉及心律失常的心脏病或心力衰竭形式、心脏增大、心碎综合征、甲状腺结节、房室管缺损、霍乱、二尖瓣狭窄、多系统萎缩(MSA)、打鼾、二尖瓣脱垂、羊水栓塞、坏疽、再生障碍性贫血、成人先天性心脏病、热衰竭、格雷夫斯病、心肌病、心室早发性收缩、心动过缓、疲劳、心动过速、头晕或呼吸急促。
[0021] 本公开还提供了一种用于评估化合物的心脏毒性效应的方法，其包括(a)使各向异性心脏细胞层与化合物接触；以及(b)测量该化合物对该心脏细胞的心脏毒性效应。在一些实施例中，该心脏细胞附着于微加工基质。在一些实施例中，该心脏毒性效应为心律失常。在一些实施例中，该各向异性心脏细胞层包括健康细胞或模仿心脏或非心脏疾病，遗传地(遗传性)或通过操纵，如通过化学、物理和/或电诱导。在该方法的一些实施例中，该心脏病为长QT综合征、布鲁格达综合征、遗传性心脏病、淀粉样变、早衰、糖尿病昏迷症、水母中毒、甲状腺功能亢进、黄热病、美洲锥虫病、主动脉瓣返流、处方药滥用导致心律失常、雷特综合征、心肌炎、三尖瓣闭锁、莱姆病、丘-施综合征、涉及心律失常的心脏病或心力衰竭形式、心脏增大、心碎综合征、甲状腺结节、房室管缺损、霍乱、二尖瓣狭窄、多系统萎缩(MSA)、打鼾、二尖瓣脱垂、羊水栓塞、坏疽、再生障碍性贫血、成人先天性心脏病、热衰竭、格雷夫斯病、心肌病、心室早发性收缩、心动过缓、疲劳、心动过速、头晕或呼吸急促。在一些实施例中，该心脏毒性效应为心律失常。
[0022] 本公开提供了一种用于研究心脏病过程的方法，其包括(a)在维持细胞活力的条件下孵育模拟心脏病的各向异性心脏细胞层；(b)使该各向异性心脏细胞层与心脏病候选调节剂接触；以及(c)测量该候选调节剂对该各向异性心脏细胞层的效应，其中如果该候选调节剂产生如心律失常等心脏病症状的变化，则该心脏病的候选调节剂被鉴定为该心脏病的调节剂。本文公开的任何心脏病适于在该方法中使用，包含但不限于任何心律失常，如长QT综合征、布鲁格达综合征、遗传性心脏病、淀粉样变、早衰、糖尿病昏迷症、水母中毒、甲状腺功能亢进、黄热病、美洲锥虫病、主动脉瓣返流、处方药滥用导致心律失常、雷特综合征、心肌炎、三尖瓣闭锁、莱姆病、丘-施综合征、涉及心律失常的心脏病或心力衰竭形式、心脏增大、心碎综合征、甲状腺结节、房室管缺损、霍乱、二尖瓣狭窄、多系统萎缩(MSA)、打鼾、二尖瓣脱垂、羊水栓塞、坏疽、再生障碍性贫血、成人先天性心脏病、热衰竭、格雷夫斯病、心肌病、心室早发性收缩、心动过缓、疲劳、心动过速、头晕或呼吸急促。在有关方面中，本公开提供研究非心脏疾病的方法，其包括(a)在维持细胞活力的条件下孵育各向异性心脏细胞层；(b)使该各向异性心脏细胞层与病候选调节剂接触；以及(c)测量该候选调节剂对该各向异性心脏细胞层的效应，其中如果该候选调节剂产生疾病症状的变化，则该疾病的候选调节剂被鉴定为该疾病的调节剂。在本段所公开的任一方面的一些实施例中，该候选调节剂是已知的心脏治疗剂。在本段所描述的任一方面的一些实施例中，该各向异性心脏细胞层附着于微加工基质。
[0023] 本公开的上述方面中的每一方面的实施例包括分别将心室心脏细胞或心室心肌细胞用作示例性心脏细胞或示例性心肌细胞。
[0024] 通过参考以下详细说明，包含
附图和实例，可以更好地理解本公开的其它特征和优点。
附图说明
[0025] 图1、与示例性心脏各向异性细胞片或单层相关联的示例性基质的示意图。示出了促进人类心脏细胞(例如，人类心室心脏细胞)的示例性各向异性层的生长和有序发育的示例性基质。也示出了示例性等时线传导图，其示出了正常传导和螺旋折返。
[0026] 图2、使用微槽技术设计效仿自然人类心室的各向异性比率。(A)从HES2hESC产生的cTNT+群体的流式细胞计数分析的典型图(左边)；如膜片钳动作电位(AP)测量(中间)示出的，大多数cTNT+hESC-CM具有心室(V)AP表型；示出了有助于心脏心室动作电位的主要离子
电流INa，以说明这些hESC-VCM的电生理完整性，还检测了如ICaL、If、Ikr、IKATP等其它离子电流(右边)。(B)示出使用的微槽基质的物理尺寸的说明图(顶部)、亮
视野和显示微槽基质上HES2-VCMs的对齐组织的免疫
染色的显微图像(中间；绿色：cTNT；蓝色：DAPI)、以及当被点刺激时通过生长于不同基质上各向异性细胞层示出电传播的等时线图(底部)。(C)与L10各向异性细胞层和未对齐的随机各向异性细胞层相比，在L15基质上对齐的HES2-VCM的增加的各向异性比率(LCV/TCV)(顶部)；在L10-和L15-hvCAS(第二个)中都观察到显著上升LCV；如90％复极化的动作电位持续时间等AP参数，或带有示出类似的去极化-复极化模式的AP追踪的APD90(第三个)中无显著差异(底部)。*p<0.05，***p<0.001(n＝4；平均值±SD)。(D)成功率取决于％cTNT，但是当达到70％cTNT-阳性hESC-CM群体(42批次的hESC-CM；平均值±SEM)时平稳化。(E)在用于评估心律失常
风险的随后试验前，进一步评估hvCAS的电
稳定性。给出了典型的等时线传导图。
[0027] 图3、对hvCAS上响应于药物治疗的AP性质的测量。典型的等时线图，示出正常电传播和心律失常折返事件作为点刺激上的螺旋波(左上
角)，基线(BL)处和药物治疗后的AP轨迹(蓝色虚线：基线处的APD90；红色虚线：药物治疗后的APD90；右上角)，当以1Hz电起博时在添加(A)氟卡胺(FLE)、(B)普鲁卡因胺(PROC)、(C)妥卡尼(TOC)、(D)特非那定(TERF)、(E)西沙必利(CISA)和(F)阿司匹林(ASP)之后标准化为基线条件的APD90的百分比变化(中间)和平均上升时间(底部)。相比于基线，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(平均值±SD)。(G)用FLE、PROC、TOC、TERF、CISA、ASP和媒剂对照(VC；Tyrode(TYR)或DMSO)处理的hvCAS中螺旋
波形成的发生率。折返事件用红色框住，在治疗浓度范围内的剂量下发生的事件用黄色突出。(H)通过标准化将药物与相应VC相关联的心律失常发生率来计算每个受试药物的心律失常风险。带有指示的TdP风险(FLE、PROC、TERF和CISA)的所有药物示出升高的风险，同时TdP-阴性TOC和ASP相较于对应VC呈现较低的风险。
[0028] 图4、对hvCAS上响应于媒剂对照的AP性质的测量。典型的等时线图，示出正常电传播和心律失常折返事件作为点刺激上的螺旋波(左上角)，基线(BL)处以及药物治疗后的AP轨迹(右上角)，当以1Hz电起博时在添加(A)Tyrode溶液(TYR)和(B)DMSO之后标准化为基线条件的APD90的百分比变化(中间)和平均上升时间(底部)。相比于基线，*p<0.05(平均值±SD)。
具体实施方式
[0029] 公开了新颖的心脏模拟生物混合材料，其包含在使用微
图案化技术创造的微槽基质上发育的人类心肌细胞。人类心肌细胞形成心脏各向异性片(CAS)或细胞层，其与微加工基质提供的指导策略地对齐。除了明确定义的包含/排除质量控制标准和算法外，公开的CAS平台再现了自然人类心脏的关键电生理特征(例如，各向异性)，同时最小化常规测定中常见的变化性，从而提供允许改进的方法通过直接
可视化来评估心律失常风险的新工具，以进行药物发现或疾病模型。
[0030] 本公开提供了一类基质，其用于促进如心室心肌细胞等心肌细胞有序生长和发育，以及提供细胞本身。本公开还提供根据本公开产生心肌细胞(例如，心室心肌细胞)的方法。图1中示出的示意图提供了本公开的各个方面。该技术是从专注于确定和开发有用的和可靠的体外测定的研究发展的，其用于评估各种化合物，如以抗心律失常为示例的候选心脏药物的心脏毒性。在这项研究过程中，褶皱的仿生基质被示出为提供足以诱导接种的hPSC-vCM的细胞对齐的地形线索，以便生成重现在自然心室中看到的结构和功能各向异性的细胞片或单层，从而模拟内生电生理特征，包含对折返性心律失常的易感性。[15-17]注意，虽然单细胞的生物学指示其各自的内在特性，但是该图案化决定各向异性细胞层或单层的多细胞传导性质。与前述一致，除非另有说明，否则细胞“单层”在本文中被用作“各向异性片”或“各向异性细胞片”的替换。作为发展可靠筛选模型的第一步，采取了两种措施以增强实验再现性：1)用具有离散微图案化参数的制造的基质代替多标度的皱褶以实现几何一致性；2)使用本文公开的使用唯一心室规范方案衍生的hPSC-vCM，其产生具有良好表征的单细胞性质的hPSC-vCM，这些性质如动作电位(AP)(图2A)、Ca2+处理和转录组学特征[18-20]。使用hPSC-vCM产生被称为人类心室CAS或hvCAS的CAS的实例。在比较不同尺寸的基质上的hvCAS特性时，测试了平面对照(该平面对照导致随机定向)10×5×5(L10)和15×5×5(L15)μm基质，导致发现L15-hvCAS当受点刺激时显示具有2.0+0.2(n＝4)的各向异性比率或AR的辐射传导图案，该图案最佳模仿自然心室电生理学(图2B到图2C)。注意，如90％复极化的动作电位持续时间等AP性质，或对照-hvCAS、L10-hvCAS和L15-hvCAS的APD90是不可区分的，这与如AR等这种传导性质中的差异可归因于自身对齐的观点一致。[15]免疫染色确认了微槽诱导的对齐。因此，选择L15-hvCAS用于剩余研究。其次，设置特定功能标准以选择适合心律失常筛选的hvCAS。为了准备证明合格，第一基本要求是完全捕捉起搏频率的生理范围(0.5Hz到1.5Hz)。应注意的是，基于该标准放入合格的hvCAS的百分比显著取决于组合物中的心脏肌钙蛋白T(cTNT)-阳性hPSC-VCM的百分比。当cTNT百分比大于70％(图2D)时该依赖性趋于平稳，因此选择该依赖性用于所有剩余hvCAS实验。
[0031] 在定义
基础材料(基质)和细胞组合物后，通过高
分辨率光学电生理分析对最初合格的hvCAS进行下一次功能性质量对照测试。图2E示出了在0.5Hz至3Hz下稳态起搏过程中，10％(229个hvCAS中的22个)自发地以螺旋波的形式显示折返事件，这可能归因于hvCAS的可能不完全符合微图案的区域。在体外组织培养中发育的显示折返事件的细胞从进一步分析中剔除。剩余207种制剂进一步经受程控电刺激(PES)，一种更激进的临床方案，用于测试对心律失常的易感性，其中给出了第一序列8脉冲(S1)，随后S1-S2间隔逐渐缩短的第二序列(S2)。百分之五(207个hvCAS中的10个)显示出可诱导螺旋波并且也被排除。剩余197个hvCAS被视为电稳定的，并被选择为后续筛选实验的基线。
[0032] 在1986年到1998年间进行的心脏心律失常抑制试验(C.A.S.T.)中，发现一些包含氟卡胺和普鲁卡因胺的“抗心律失常药”通过在超过1700名患者中测试后导致致命心律失常而意外地并且带有讽刺意味地增加了死亡率。[21]为了验证本文所公开的hvCAS平台，我们首先筛选了Ic类抗心律失常氟卡胺的效果。[22]在有效的血清治疗浓度下(即，0.3μM和1μM)及以外(3μM)加入氟卡胺时，细胞AP的显著电生理变化立即变得明显。如先前在单细胞hiPSC-CM研究中报道的，图3A示出由于减缓的上冲，氟卡胺主要通过延长APD50有力地且剂量依赖性地减缓传导速度。[23]有趣地，在多细胞水平上，相较于通过相同批次hvCAS(图4)进行的媒剂对照(Tyrode溶液)的6％的hvCAS(32个中的2个)，临床
血浆浓度下的氟卡胺导致在稳态起搏或24％的hvCAS(21个中的5个)中PES过程中形成螺旋波，其转化为心律失常发生率或风险的4.0倍增加(图3F到图3G)。然而，所观察的螺旋波的
手性和频率似乎没有示出任何明显的相关性(表1)。因此，氟卡胺的人类心律失常可能首次被体外可视化和量化。[21]
正如C.A.S.T. 所报道的，该结果相当于氟卡胺相较安慰剂对照心律失常风险增加3.4倍。[21]
[0033] 表1
[0034] 药物或媒剂治疗引发的折返频率和手性的概述。
[0035]
[0036] [a]数据表示对于给定药物的治疗浓度范围内在一个或多个剂量上发生的折返事件。
[0037] 根据可信的证据，基于hvCAS的测试之后分别扩展到具有和不具有已知临床TdP风险的1a类和1b类抗心律失常药物普鲁卡因胺和妥卡因。在加入普鲁卡因胺时，看到由于较缓的上冲和衰减造成的剂量依赖性APD90延长，同时妥卡因的作用与媒剂(DMSO)对照基本上不可区分(图3)。对于折返事件，普鲁卡因胺和妥卡因的相关联心律失常风险在标准化到相应的媒剂对照后分别增加2.3倍和0.7倍。不具有已知的TdP风险的阿司匹林被用作阴性对照，并且不会导致AP改变或螺旋波的形成(0％或n＝14个中的0个)。
[0038] 同时还评估了特非那定，非
镇静抗组胺药的心律失常遗传性，该药物在1998年戒断前是世界上广泛使用的药物之一。在相对低的剂量(30nM和100nM)下，未观察到对AP的明显影响。因此，未观察到折返事件(16个中的0个)。与之鲜明对比的是，在超出治疗范围测试的最高剂量(300nM)下观察到折返事件，导致相较于媒剂对照(DMSO)风险适度增加1.2倍。这与临床观察一致，即特非那定相关的心律失常事件经常见于肝功能缺陷患者或干扰药物代谢酶CYP3A4的共同用药患者中。[24]事实上，临床TdP与120nM的血清特非那定浓度相关联，证明在目前的hvCAS模型中，仅在超过该浓度的剂量(300nM)下才发生折返事件。[25][0039] 也使用hvCASs评估西沙必利，一种由于关联到危及生命的心律失常在2000后受限制的胃肠道促运动剂的心律失常遗传性。观察到总计9个折返事件，或相较于DMSO媒剂对照心律失常风险增加2.7倍。在嵌套病例对照研究中在住院期间这与心律失常风险的两倍或三倍或者西沙必利有关的猝死一致。[26]有趣地，在所有剂量(30nM、100nM和300nM)下观察到相似的折返发生率。这种剂量依赖性反应的显著缺乏反映在临床数据中观察的反应。[26,27][0040] 正如现有临床前(ICH S7b)和临床(ICH E14)指南中规定的，体外hERG通道测定和体内QT研究是过去十年制药领域中采用的推荐标准，其后是在通过两种临床前测试时进行的全面的QT研究。然而，各种证据表明在评估该临床TdP风险时这些测试是欠佳的，导致药物安全问题、无根据药物损耗和高成本。[28]首先，并非所有抑制hERG通道的药物导致TdP。
例如，异搏定是强烈的hERG阻滞剂，但是不导致QT延长或TdP。[29]其次，先前研究已经示出QT延长不仅仅导致任何促心律失常作用，并且甚至在特定环境下会成为抗心律失常药物[30,31] [32]
(例如，缺乏三角测量)。 事实上，延迟复极化的如雷诺嗪等药物根本不会导致TdP。
这些突出了开发更好筛选平台以评估TdP风险的需求，如本文呈现的hvCAS平台。通过标准化材料，包含基质、细胞、组合物和基于功能的选择标准，我们已经最小化变量的数量以开发系统的研究方法，用于将心律失常可视化为多细胞折返事件并且量化促心律失常风险。
所选hvCAS是电稳定的并且本文公开的结论与被调查药物所熟知的药理学特征完全一致。
[0041] 本文第一次在没有体外受试者情况下，公开了对于失败的C.A.S.T.药物氟卡胺、普鲁卡因胺和戒断的特非那定的尖端扭转性(torsadogenicity)的成功检测的示范。通过实现临床试验前促心律失常风险的预测，本公开的hvCAS模型有望促进新的治疗方法、电紊乱和精益筛选的体外模型的发展。使用
机器人和工程使筛选过程自动化的后续操作有望进一步增加通过率、敏感性和测定准确度。
[0042] 实例
[0043] 实例1
[0044] hESC培养、定向心脏分化和hvCAS形成
[0045] 在37℃下、在补充有hESC专用MatrigelTM(354277；BD生物科学(BD Biosciences))的无饲养层和无血清mTeSRTM1条件(干细胞技术公司(Stemcell Technologies,Inc.))下、在用5％CO2平衡的加湿常氧
培养箱中使人胚胎细胞(hESC)系HES2(ESI，NIH码ES02)保持处于其多能状态。根据已建立的方案获得hESC培养物的定向心脏分化，该方案可以以高产率和高纯度高效地产生心室(V)亚型心脏细胞[18]。
[0046] 用accutase(A11105；Gibco)将汇合率为80％到90％的hESC培养物解离成单细胞，并且随后将其在超低
吸附板(3471；康宁(Corning))中在缺氧(5％O2/5％CO2)条件下在悬浮液中培养8天。在前24小时内采用补充有Rho激酶(ROCK)抑制剂(1254；R&D)、骨形态发生蛋TM白-4(BMP4；PHC9534，Gibco)和基质胶(354277；BD生物科学)的基于mTeSR -1的培养基，并且将其转移到含有抗坏血酸、GlutaMAXTM(35050-061；Gibco)、BMP4和激活素-A(PHC9654；
Gibco)的 -34SFM完全培养基(10639-011；Gibco)持续接下来的72小时。将细胞簇在含有抗坏血酸、GlutaMAXTM和Wnt抑制剂IWR-1(BML-WN103-0005；恩佐生命科学(Enzo Life Sciences))的 -34SFM完全培养基中再培养72小时，然后在第8天将培养物转移到常氧条件下。然后，将心肌球保持在补充有抗坏血酸的 -34SFM完全培养基中并且每3到4天补充心肌球，直到第15到22天，此时使用2步胶原酶-胰蛋白酶法解离hESC-vCM。然后，以250,000/cm2的基质胶涂覆的聚苯乙烯基质接种细胞。初始地使用含有热灭活FBS(10％；10270；Gibco)、GlutaMAXTM(IX；35050；Gibco)、MEM非必需氨基酸(1X；11140-050；
Gibco)的基于高葡萄糖DMEM的培养基(11965；Gibco)将hvCAS保持2天，随后每隔一天使用RPMI 1640培养基(72400；Gibco)/B-27(17504；Gibco)进行补充。在用于药物测试的电生理学检查之前，将hvCAS培养至少7天以允许形成细胞间电连接。
[0047] 实例2
[0048] 制作微槽基质
[0049] 利用光刻产生聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具以创建尺寸分别为10μm(R)×5μm(D)×5μm(W)或15μm(R)×5μm(D)×5μm(W)的L10或L15。然后，在180℃下将微观线条特征
热压印到聚苯乙烯(PS)收缩膜(Clear Shrink )上。然后，对基质进行UVO处理8分钟(Jetlight UVO)，并且最后通过浸入70％的
乙醇中进行消毒，随后是在使用前进行UV处理至少20分钟。
[0050] 实例3
[0051] hvCAS的光学测绘与电生理学
[0052] 在37℃下在1小时内用di-8-ANEPPS(10μM；D-3167；分子探针(Molecular Probes))/普朗尼克(Pluronic)F-12(0.04％；P-3000MP；生命技术(Life Technologies))将hvCAS制剂装在DMEM-F12中，然后在室温(RT)下在Blebistatin(50μM；B0560；西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))中在台式液(Tyrode's solution)中孵育15分钟。台式液由140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、10mM D-葡萄糖和pH为7.4的10mM HEPES组成以最小化运动伪像对光学标测信号的潜在干扰。将装载有染料的hvCAS制剂浸泡在使用培养皿孵育箱(华纳仪器(Warners Instruments))保持处于35℃到37℃的台式液中。使用具有1x物镜和1x聚光透镜以获得10mm*10mm的视野的Micam Ultima(美国加利福尼亚州SciMedia)执行对AP和传导特性的高分辨率光学标测。使用通过515±35nm带通激发滤光片和590nm高通发射滤光片过滤的
卤素灯执行
荧光成像。以200Hz的
采样率收集数据，并使用BVAna
软件(SciMedia)进行分析。采用可编程刺激器(Master8；AMPI，以色列)通过垂直于hvCAS表面放置的单极点刺激
电极(美国
马萨诸塞州哈佛仪器(Harvard Apparatus))递送起搏刺激(10V，10ms脉冲持续时间)。
[0053] 实例4
[0054] 电生理学研究
[0055] 使用Master-8(以色列AMPI)根据示意图(图2E)在hCML制剂的中心处应用点刺激，并且首先以0.5Hz的增量从0.5Hz到3Hz(即，30bpm到180bpm)应用稳态起搏(10ms，10V)，除非存在1:1夺获损失。然后，引入标准(S1-S2)编程电刺激(PES)方案以进一步评估致心律失常性，这与之前描述的类似[15]。以1.5Hz递送由八个S1刺激组成的序列，随后以从550ms开始并且以50ms的补偿连续缩短的S1-S2间期进行过早额外刺激(S2)，直到夺获失败。然后，在后面将S1-S2间期增加20ms，随后是2ms的减量，直到达到有效不应期(ERP)，该ERP被定义为未能导致AP传播的最大S1-S2间期。
[0056] 实例5
[0057] 评估药物诱导的致心律失常性
[0058] 在采用hvCAS进行后续药物测试程序之前，严格遵循一组选择标准，以确保公平比较。具体地说，该选择标准包含：(1)在整个视场中观察一致的传播信号；(2)至少1.5Hz的最大夺获频率；(3)基线处没有折返。然后，以三个累积剂量添加药物以
覆盖治疗范围，并且使用本领域已知的常规技术确定HERG IC50。[33]所有药物均从西格玛奥德里奇(美国密苏里州)采购。同时进行媒剂对照以校正心律失常易感性的可能批次间变化；台式液用于氟卡尼(F6777)、普鲁卡因胺(P9391)和阿司匹林(A2093)；DMSO用于妥卡尼(T0202)、特非那定(T9652)和西沙必利(C4740)。如上文所述，针对每种剂量重复稳态起搏和PES，除非在应用最高剂量之前发生折返。随后，使用Clampfit分析动作电位参数和传导特性，其中APD90被定义为从峰值到90％复极化的时间。数据被单独地呈现为平均值±SD并使用学生t检验进行统计学比较，其中p<0.05被认为具有统计学意义。
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申请中提及的所有出版物和
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[0094] 实施例。实际上，用于制作或使用本公开的主题所描述的方式的各种修改也在下列
权利要求的范围之内，其中该修改对(多个)相关领域的技术人员是显而易见的。
