技术领域
[0001] 本
发明属于组织工程中
细胞支架及其制备和应用领域，特别是涉及一种多尺度三维生物组织工程支架的制备方法。
背景技术
[0002] 组织工程是一个跨领域的学科，是将工程和生命科学的原理应用于发展生物替代品，是用于恢复、维持或改善组织的功能，或是替代一个整体组织功能的科学。传统的医疗手段对于器官的
坏死和组织的失能而引起的许多
疾病缺乏有效的疗法，而组织工程中设计的具有生物功能的组织和器官为治愈这些疾病提供了新的途径。组织工程的一个主要的目标是设计并制备合适的支架来模拟天然细胞外基质(ECM)的结构及生物学功能从而用来替代生物组织。为细胞提供生长繁殖的环境，同时诱导它形成具有一定几何外形的组织结构，在被植入人体后提供适当的
力学性能且能够在体内随着细胞的繁殖以及新组织的生成而降解，对于不同损伤组织，其所需要的支架结构与性能也大不相同。在组织工程过程中需要将人造组织植入受损组织或器官，因此植入的支架材料需要具有符合受损组织或器官的几何外形。这就要求支架具有立体的三维结构，并且同时具有相互连通的多孔结构使细胞能够自由的在支架内部迁移、生长，且泡孔的尺寸应与目标组织的细胞尺寸相适应。具有较大表面积/体积比的支架有利于大量细胞的粘附以及营养物质的运输和代谢废物的排出。然而，制备高连通性、具有均一泡孔尺寸的三维支架仍然面临着很大的挑战。
[0003] 研究者们采用不同的工艺方法来制备具有多种结构的组织工程支架，发现不同的支架结构能够显著影响细胞行为。一般来说低于75％的孔隙率不足以满足多数细胞的正常生长，高于90％的孔隙率可能导致细胞无法形成连续的细胞膜。不同细胞所能够适应的泡孔尺寸也不相同，例如：心脏细胞能够适应100μm左右的泡孔，而成骨细胞一般需要200μm的泡孔尺寸才能够获得良好的生长状态。另外，细胞一般无法迁移通过小于10μm的泡孔。因此，符合目标细胞的泡孔尺寸和目标组织要求的支架结构是制备组织工程支架中应考虑的重要因素。制备出具有几何形状的三维立体结构以及具有高连通性且具有均一泡孔尺寸的支架有着十分重要的意义。
[0004]
快速成型技术(3D打印技术)由于其产品生产周期短、制造
精度高、能够直接制造复杂模型等可以快速实现优质的个性化定制产品而广受医学研究者的关注。在作为仿生生物支架方面研究较广泛，比如：制备一体化的仿生复合支架模型、具有
生物相容性的骨架、具有多孔结构的组织等等。但是由于其制作精度不足以达到微纳级，这就限制了其作为一种真正的可直接的细胞支架使用，现阶段三维打印在细胞支架上的应用处于一种辅助支架的使用。
[0005] 另外，静电丝纺技术的微
纳米纤维支架具有高的孔隙率和微
纳米级的孔径，可以更好地适应细胞的生长黏附，有利于调节细胞的营养物质和废物交换运输，提高材料降解率，并有利于生物活性因子的释放，形成类似于天然ECM的形态结构。由于其在结构方面的可控性，与性能方面的日益改善而得到医院的广泛关注，在神经再生、血管、心脏组织、骨骼肌再生、肌
腱修复、
角膜修复等方面都有研究。但是，由于
静电纺丝制备过程的独特性，以及其尺寸处于微纳级别的原因，所制备出的材料的力学性能以及三维形状的可控性较差。
[0006] 综上，本发明的
发明人认为，可以结合三维打印与静电纺丝的各自的优点将两者相结合，制备出既有三维几何形状又具有特定的微纳结构以及一定强度的组织工程支架。这将对推动
人类医学的进步与改善人类健康有着重要的意义。
发明内容
[0007] 本发明所解决的技术问题是提供一种多尺度三维生物组织工程支架的制备方法，将静电纺丝得到的高孔隙率的网状纳米纤维固定在三维宏观尺寸网络结构内部，既保证了组织工程支架的力学性能又保证了组织工程支架内部高的孔隙率和微纳米级的孔径，或者将3D打印
外壳作为一种模具，制备出具有特定几何外形的组织工程支架，上述结构的组织工程支架具有导向细胞分化、输送养分的作用。
[0008] 一种多尺度三维生物组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：
[0009] (1)制作具有三维网络结构或者型腔结构的模具；
[0010] (2)利用静电纺丝制作二维纤维
薄膜；
[0011] (3)将模具和二维纤维薄膜同时置于对模具内表面具有亲和力的、且可产生气泡的液相体系中，且保证模具压于二维纤维薄膜顶面，气泡和毛细作用力共同作用下促使二维纤维薄膜向三维网络结构的网格孔内或者型腔内迁移膨胀，在三维网络结构内成型；
[0012] (4)
真空干燥得到对细胞具有导向作用的组织工程支架；
[0013] 可选择的，将模具拆除。
[0014] 通过本发明的方法，即可制备得到具有良好机械强度的组织工程支架，也可通过对型腔结构的设计，制作各种形状的组织工程支架，比如可根据人体器官和组织的形状，设计型腔结构。
[0015] 作为优选，步骤(1)中，采用三维打印方法制作具有三维宏观尺寸的网络结构或者型腔结构的模具。采用三维打印与静电纺丝相结合，同时结合了三维打印与静电纺丝的各自的优点的同时，也使得整个制备方法操作简单快捷，成本低，对环境友好，经济效益高。
[0016] 三维打印可以采用现有的方法，比如，实现进行三维模型设计，将三维打印数据导入三维打印装置中，然后利用三维打印装置进行打印即可。利用三维打印，可以实现各种三维网络结构的设计和打印，灵活性较高，实用性很强。
[0017] 另外一方面，结合三维打印本身的特点，三维打印一般分层打印，材料
固化后，从微观结构讲，每一层均为向外弧形凸起的环状的结构，层与层衔接的部位会形成凹槽结构，在三维网络孔壁上会形成多层环形的凹槽结构，在后续二维纤维薄膜膨胀并向网格孔内迁移且成型后，这些环形的凹槽结构内会形成纤维部分的固定臂，进一步增加了与三维网络结构的固定强度。
[0018] 三维打印采用的材料可以采用生物可降解的聚乳酸(PLA)。
[0019] 步骤(2)中，静电纺丝采用的纤维材料选自可降解纤维，可以是有序也可以是无序的。其材料可以有生物可降解高分子材料聚己内酯(PCL)、聚
乙醇酸(PGA)、聚乙交酯丙交酯(PGLA)、聚乳酸(PLA)、聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚对二
氧环己
酮(PDS)中的一种或几种复合制备而成。
[0020] 作为优选，静电纺丝采用的纤维材料为聚己内酯(PCL)，其静电纺丝过程如下：
[0021] (2-1)将PCL溶于二甲基甲酰胺与二氯甲烷溶液(二甲基甲酰胺：二氯甲烷溶液体积比＝1：5～1：3)中，搅拌，PCL的
质量百分比为5％～20％的PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液；
[0022] (2-2)进行PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液的静电纺丝，流量为0.3～7ml/h，施加
电压为8～50kv，接收距离为10～30cm。
[0023] 本发明中，所述的生物支架内部结构是采用静电纺丝法喷射的PCL微纳米级纤维制成的高表面积、高孔隙率、三维网络状结构。外部几何结构是采用FDM打印成型的具有宏观尺寸的规则网格状孔形结构作为模具成型的。
[0024] 步骤(2)完成静电纺丝后，取下二维纤维薄膜，在真空条件下干燥20～30h。
[0025] 步骤(2)中的静电纺丝接收装置为规则的平板
铝箔。
[0026] 本发明步骤(3)中，由于液相体系对模具内表面具有亲和力，可促二维纤维薄膜快速的进入到模具内腔或者网孔内；同时在气体协同作用下，进一步膨胀和向模具内腔或者网孔内转移。
[0027] 作为优选，所述液相体系选自如下体系之一：
[0031] 双氧水。
[0032] 步骤(3)中，作为优选，所述硼氢化钠/甲醇溶液中，硼氢化钠质量百分比为5％～25％。保证亚微米级纤维以适当的速度进入到三维网络状结构内，同时以适当的速度膨胀定型。该步骤一般在常温下进行，时间一般为20～40min。
[0033] 步骤(4)中，用蒸馏水以及70％的甲醇溶液洗净，在真空条件下干燥20～30h，并
包装消毒，从而可用作对细胞导向的组织工程支架。
[0034] 当需要将模具拆除时，可采用现有的方法拆除。例如可以将模具本身设计为可拆卸的结构，烘干完成后，可以利用外部机械力将模具拆除；或者，可利用模具的溶解特性，利用一定的
溶剂将模具溶解等。
[0035] 通过调整3D打印的网格状模型内网格大小可以控制支架的形状与强度以及柔软性；
[0036] 通过调节静电纺丝的工艺参数可以控制组织工程支架的纤维直径、孔隙率、空洞尺寸等结构参数。
[0037] 本发明的聚己内酯(PCL)静电纺丝/3D打印组织工程支架可用于培养需要特定形状的组织的细胞。
[0038] 本发明的支架微观上是具有高孔隙率的三维网状纳米纤维，宏观上是具有高长宽比、高
比表面积、高孔隙率的长孔状的三维网络结构，具有多尺度三维结构。所述的生物支架高10mm～30mm；
[0039] 与
现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0040] (1)本发明的组织工程支架是通过静电纺丝装置在3D打印模具的控制下制备而成的一种高比表面积、高孔隙率、具有三维网状与三维几何外形的结构，可以起到导向细胞生长、输送养分等作用。
[0041] (2)本发明的制备方法操作简单，成本低，对环境友好，经济效益高；
[0042] (3)本发明的3D打印模具可以按需设计、打印，满足需求广泛。
[0043] (4)本发明可以通过型腔结构的设计，制作出各种形状的组织工程支架，满足各种场合的需要。
[0044] 总之，本发明结合3D打印的快速、高精度个性化
制模以及静电纺丝在制备高
空隙率纳米纤维的优点，制备具有优良机械强度，且可控几何形状的三维纳米纤维支架，过程简单，实用性强。
附图说明
[0045] 图1：3D打印俯视图；
[0046] 图2：3D打印模具外观图；
[0047] 图3：静电纺丝胀大示意图。
具体实施方式
[0048] 下面结合具体实例，进一步阐述发明。应理解，这些
实施例仅用于说明发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种移动或
修改，这些等价形式同样落于本
申请所附
权利要求书限定的范围。
[0049] 实施例
[0050] (1)采用聚乳酸(PLA)作为打印材料，利用FDM三维
打印机打印出设计好的具有网格状立体型腔的模具，其中形成的立体型腔为边长为2.5mm×2.5mm的长方体状结构，结构如图1和图2所示；
[0051] (2)将聚己内脂(PCL)溶解于二甲基甲酰胺与二氯甲烷溶液(二甲基甲酰胺：二氯甲烷体积比＝1：4)中，搅拌成质量分数为12％的PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液。
[0052] 本步骤中，聚己内酯(PCL)也可替换为聚乙醇酸(PGA)、聚乙交酯丙交酯(PGLA)、聚乳酸(PLA)、聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚对二氧环己酮(PDS)等。
[0053] (3)利用现有的静电纺丝设备，进行PCL/二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液的静电纺丝，采用平板接收装置作为接收器，收集静电纺丝纺出的纤维；流量为1.5mL/h，施加电压值为17kv，接地距离(喷死头末端与平板接收装置之间的距离)为10cm；
[0054] (4)静电纺丝结束后，取下纺好的二维纤维薄膜，在真空下干燥24h，并将二维纤维薄膜置于质量百分比为5％～25％(本实施例中硼氢化钠的质量百分比为15％)的硼氢化钠/甲醇溶液，同时将3D打印的网格状模型压于二维纤维薄膜之上，硼氢化钠与甲醇产生的氢气会对二维纤维薄膜产生推动力，由于
三维网格的阻挡作用，促使其向网格孔内移动，同时在氢气的作用下膨胀成型，形成柱状三维结构；
[0055] 如图3所示，由于三维打印工艺本身的特点，在层2与层2衔接处形成沟槽结构3，二维纤维薄膜1进入网格孔内时，也会向这些沟槽结构3内迁移，进而形成纤维的固定臂，进一步增强了纤维结构的固定强度。
[0056] (5)取出三维结构支架，用蒸馏水以及70％的甲醇溶液洗净，在真空下干燥24h，并包装消毒，从而可用作对细胞导向的组织工程支架。
