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一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤 酵母突变株

阅读：1032发布：2020-08-25

专利汇可以提供一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株，属于微生物、酶工程技术及淀粉加工领域。本发明对来源于Bacillus deramificans和Bacillus naganoensis的普鲁兰酶编码基因进行密码子优化，利用DNA Shuffling进行分子改组，得到一种嵌合体基因，嵌合体酶在酸性条件下能保持较高酶活，同时比酶活高于来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶。编码嵌合体的基因WXP03在巴斯德毕赤酵母细胞内表达出普鲁兰酶酶活，重组酶最适作用温度 55℃，最适pH4.5酶活半衰期约18小时，在55℃，pH4.0酶活半衰期约为12小时。进一步诱变筛选获得一株摇瓶发酵酶活水平明显提高的巴斯德毕赤酵母突变株。突变株在5 L 发酵罐上的发酵酶活达1800 U/mL。，下面是一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体WXP03，所述普鲁兰酶嵌合体WXP03是一种在pH4.0-
4.5活性稳定的普鲁兰酶，在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中的α-1,6糖苷键，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.一种编码权利要求1所述的普鲁兰酶嵌合体WXP03的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3.一种重组大肠杆菌JM109/pMD-WXP03，其特征在于，是将权利要求2所述的基因与pMD18-T Simple组成重组质粒，然后转化大肠杆菌JM109获得的，所述重组大肠杆菌已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016168。
4.一种重组巴斯德毕赤酵母突变株WBB359，其特征在于，所述菌株能够表达权利要求2所述基因，且已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016169。

说明书全文

一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕

赤酵母突变株

技术领域

[0001] 本发明 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株，涉及采用基因工程手段获得的一种普鲁兰酶嵌合体、编码基因及高产这一普鲁兰酶嵌合体的重组巴斯德毕赤酵母突变株，属于微生物、酶工程技术及淀粉加工领域。

背景技术

[0002] 淀粉质原料是工业上制造淀粉糖、直链淀粉等产品的主要原料。淀粉分子主要由葡萄糖通过α-1,4-糖苷键连接形成分子链，但在分子链中还经常含有分支链，分支链通过α-1,6-糖苷键与上述主链连接。在淀粉水解过程中，淀粉酶和糖化酶主要用于水解淀粉分子中的α-1,4-糖苷键，而普鲁兰酶则是主要降解淀粉支链的分支点处的α-1,6-糖苷键的酶，这三类酶配合使用可以完全降解淀粉，获得葡萄糖、麦芽糖等产物。普鲁兰酶在直链淀粉及以普鲁兰糖为原料的麦芽三糖等的制造中也有一定的应用。在淀粉糖的生产中，普鲁兰酶主要与来源于黑曲霉的糖化酶配合使用，由于黑曲霉来源的糖化酶的最适pH在4.0-4.5范围内，而酸性条件又有利于避免糖化过程中产生的葡萄糖进一步与反应液中的其他成分反应，所以能耐受pH4.0-4.5的酸性条件的普鲁兰酶在工业上有很好的应用前景。国内外已有许多关于普鲁兰酶分子的报道。Philippe Deweer等在1995年公开了一种从Bacillus deramificans中克隆获得的普鲁兰酶基因的全序列，该基因编码的普鲁兰酶在pH 3.8-5.0的范围内可以保持90%以上的酶活，具有理想的耐酸性（美国专利，专利号5,
721,127，1995年6月）。来源于长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）的普鲁兰酶也具有一定的耐酸性，在淀粉糖生产中有一定的应用潜力。但早期的研究发现，Bacillus naganoensis来源的普鲁兰酶最适pH在5.0，在pH 4.5和60℃条件下其活性半衰期只有几十分钟，无法满足制糖工业的要求（美国专利，专利号5,721,127，1995年6月）。1999年，Teague,W.M.等公开了来源于Bacillus naganoensis的普鲁兰酶基因序列（美国专利，专利号6，300,115，1999年，）。以后国内外研究者对Bacillus naganoensis的普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质进行了广泛的研究，结果与之前研究者以Bacillus naganoensis来源的普鲁兰酶的研究结果基本一致，该普鲁兰酶的最适pH在5.0 5.5左右，在pH4.0条件下的~
酶活只有5.0条件下的70%以下（张艳，路福平，刘逸寒. 长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究. 生物技术通报, 2012, (7): 114-118），其耐酸性还不够理想。为获得具有较高耐酸性和较高活性的普鲁兰酶，本专利发明人分别根据Teague,W.M.等公开的Bacillus deramificans的普鲁兰酶的氨基酸序列（美国专利，专利号5,721,
127，1995年6月），以及Teague, W. M.等公开的来源于Bacillus naganoensis的普鲁兰酶的氨基酸序列（美国专利，专利号6，300,115，1999年），按照巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因的密码子组成（美国国家生物技术信息中心 www.NCBI.nlm.nih.gov，登录号：U96967.1），合成了编码上述普鲁兰酶的基因，进一步利用DNA Shuffling技术获得了上述两种基因的嵌合体，通过大量筛选获得了一种比酶活明显高于Bacillus deramificans来源的普鲁兰酶，而耐酸性明显高于Bacillus naganoensis来源的普鲁兰酶的嵌合体分子。本发明公开上述性能改善的普鲁兰酶嵌合体的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列，以及在巴斯德毕赤酵母中实现嵌合体分子高效表达的方法。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是：主要利用基因重组技术获得一种最适pH在4.5或4.5以下，比酶活较高的普鲁兰酶嵌合体并实现嵌合体的高效表达。

[0004] 本发明的技术方案：一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体WXP03，是一种蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

[0005] 上述普鲁兰酶嵌合体WXP03的编码基因WXP03，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。所述基因WXP03与pMD18-T Simple组成的重组质粒pMD-WXP03的大肠杆菌转化子，分类命名为：大肠杆菌 JM109/pMD-WXP03，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016168。高表达所述基因WXP03的重组巴斯德毕赤酵母突变株，分类命名为巴斯德毕赤酵母 WBB359，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016169。

[0006] 所述的普鲁兰酶嵌合体WXP03的应用， WXP03是一种有较高比酶活，在pH4.0-4.5条件下活性稳定的普鲁兰酶，利用重组DNA技术生产的普鲁兰酶嵌合体WXP03在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中的α-1,6糖苷键。

[0007] 所述的巴斯德毕赤酵母WBB359的应用，用于高效制备普鲁兰酶嵌合体WXP03。

[0008] 上述性能改善的普鲁兰酶嵌合体WXP03的编码基因WXP03的获得方法如下：

[0009] （1）根据Philippe Deweer等公开的Bacillus deramificans的普鲁兰酶的氨基酸序列（美国专利，专利号5,721,127），根据巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因的密码子组成，设计并合成编码Bacillus deramificans的普鲁兰酶的基因BdP8。为叙述方便上述基因编码的蛋白质即Bacillus deramificans的普鲁兰酶，用代号BdP8表示。基因BdP8的核苷酸序列为SEQ ID NO: 3。

[0010] （2）根据Teague,W.M.等公开的来源于Bacillus naganoensis的普鲁兰酶的氨基酸序列（美国专利，专利号6, 300,115，1999年），根据巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因的密码子组成，设计并合成编码Bacillus naganoensis的普鲁兰酶的基因BnP2。为叙述方便上述基因编码的蛋白质，即Bacillus deramificans的普鲁兰酶，用代号BnP2表示。基因BnP2的核苷酸序列为SEQ ID NO: 4。

[0011] （3）分离上述合成的基因BdP8和BnP2的DNA，用DNA Shuffling 技术进行随机拼接，获得基因BdP8和BnP2的嵌合体基因库，嵌合体基因库与可控制宿主菌裂解的大肠杆菌表达载体连接，转化大肠杆菌，获得大量转化子，构建表达嵌合体库的重组大肠杆菌库。在上述转化子组成的大肠杆菌库中筛选在菌体裂解后可以在pH 3.5条件下降解半固体培养基中普鲁兰糖，在添加乙醇后形成透明圈的菌株，获取其所含质粒。进一步将上述质粒在大肠杆菌中表达，检测重组菌普鲁兰酶酶活，选取其中酶活最高的菌株。将该菌株中的普鲁兰酶基因克隆到pMD18T Simple上进行测序，结果显示该基因是由BdP8和BnP2基因构成的嵌合体。上述嵌合体基因命名为WXP03，该基因与pMD18-T Simple组成的重组质粒pMD-WXP03的大肠杆菌转化子，分类命名为：大肠杆菌 JM109/pMD-WXP03，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016168。基因WXP03所编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。命名为WXP03。

[0012] （4）嵌合体WXP03的性质

[0013] 普鲁兰酶嵌合体WXP03的最适pH4.5、最适作用温度55℃，最适条件下比酶活大约在206 U/mL，酶活半衰期约18 h。是一种综合了BdP8的耐酸性和BnP2的高比酶活的新型普鲁兰酶嵌合体。

[0014] 高表达所述基因WXP03的重组巴斯德毕赤酵母突变株的获得方法如下：

[0015] 1）获得高表达普鲁兰酶嵌合体WXP03的重组巴斯德毕赤酵母

[0016] 酶切重组质粒pMD-WXP03，分离其中的普鲁兰酶基因，与表达载体pPIC9K连接，获得重组质粒pPIC9K-WXP03。重组质粒线性化后转化巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115，筛选获得一株普鲁兰酶产量较高的重组转化子，命名为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8，简称M8。其WXP03的表达受AOX启动子控制。

[0017] 2）获得在M8中分泌表达淀粉酶基因的重组菌

[0018] 对M8进行诱变，并筛选得到一株ura3基因缺陷的菌株。以URA3基因为标记基因，构建在AOX启动子控制下分泌表达淀粉酶的重组菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 H11，简称H11

[0019] 3）以淀粉分解能力为指标间接筛选普鲁兰酶产量提高的菌株

[0020] 对H11进行诱变，筛选淀粉酶活力提高的突变株。检测上述突变株的普鲁兰酶产量，结果显示在上述淀粉酶活力提高的菌株中，1/3以上的菌株的普鲁兰酶产量也明显提高。从上述普鲁兰酶活力提高的菌株中筛选获得普鲁兰酶产量提高幅度最大的菌株J359。以5-氟乳清酸抗性为标记筛选获得URA3及淀粉酶基因同时删除的菌株J359C。在上述J359C菌株中回补URA3基因获得不带营养缺陷型标记的菌株Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 WBB359，简称WBB359。该菌株的普鲁兰酶产量比诱变前的出发菌M8提高幅度在15 %以上，在5 L 发酵罐上普鲁兰酶产量达到1800 U/mL以上。上述WBB359分类命名为巴斯德毕赤酵母 WBB359，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016169。

[0021] 普鲁兰酶嵌合体WXP03在淀粉制糖工艺的糖化阶段的高温酸性条件下具有较高的活力和稳定性，与糖化酶配合提高淀粉或糊精的分解效率，也可以用于在其他条件下分解淀粉和糊精分子中α-1,6 糖苷键。巴斯德毕赤酵母WBB359可以高效制备WXP03。

[0022] 材料和方法

[0023] 普通分子生物学方法：

[0024] 除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行 (Sambrook等1989分子克隆实验手册)。

[0025] 除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见 (Sambrook等1989分子克隆实验手册)。

[0026] DNA操作所使用的酶根据供应商的说明书使用。

[0027] 引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。

[0028] 克隆载体pMD18-T Simple和pMD18-T均为宝生物工程（大连）有限公司产品，产品编号分别为D506A、D504A，用于和纯化后的PCR产物直接按T-A连接法连接，T-A连接法按产品说明书进行，T-A连接法所使用的试剂均为试剂盒所附带

[0029] 大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21（DE3） CodonPlus、巴斯德毕赤酵母GS115、大肠杆菌JM109/pPIC9K均从中国高校工业微生物资源与信息中心 (http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)购买，其保藏编号依此为：CICIM B0012、CICIM B0139、CICIM Y0703、CICIM MMB0094。大肠杆菌/pEly和Pichia pastoris GS115/pPIC9K-SfA均为专利菌种，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号依此为：CCTCC NO：M2011212和CCTCC NO：M2012440。

[0030] DNA操作使用的酶和试剂盒

[0031] 除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均为大连宝生物工程有限公司产品。PCR反应使用的DNA 聚合酶为宝生物工程（大连）有限公司产品Ex Taq，产品编号为DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反应时所使用的缓冲液均为购买酶时附赠，缓冲液浓度均为反应所需浓度的10倍。回收PCR产物、酶切产物或其他DNA片段的柱式DNA片段回收试剂盒以及从电泳凝胶中回收DNA片段的胶回收试剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品，产品编号分别为DV807A和DV805A。

[0032] 其他试剂

[0033] 普鲁兰为Sigma公司产品，酵母氮基（YNB）为Difco公司无氨基酸酵母氮基（货号291920），该产品不含碳源和氨基酸，但含有硫酸铵。无氨基酸酵母氮基（无氮YNB）为Difco公司无氨基酸无硫酸铵酵母氮基（货号233520）。曲利笨蓝（台盼蓝）为上海生工生物工程有限公司产品。

[0034] 培养基

[0035] 1） LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述；

[0036] 2）YPD培养基（g/L）：酵母粉 10，蛋白胨20，葡萄糖20；

[0037] 3) MD培养基（g/L）：YNB 13.4，生物素4×10-4，葡萄糖20.0；

[0038] 4) SM培养基（g/L）：MD培养基，尿嘧啶0.06；

[0039] 5) MS培养基（g/L）：YNB 13.4，生物素4×10-4，可溶性淀粉20.0，甲醇20 mL；

[0040] 6) BMGY培养基（g/L）：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，YNB 13.4，生物素4×10-4，100 mM pH 6.0磷酸钾缓冲液100 mL，甘油10.0；

[0041] 7) BMMY培养基（g/L）：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，YNB 13.4，生物素4×10-4，100 mM pH 6.0磷酸钾缓冲液100 mL，100%甲醇10 mL；

[0042] 8) YPD培养基（g/L）：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0；

[0043] 9) YPG培养基（g/L）：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，甘油20.0；

[0044] 10) BSM培养基（g/L-）：H3PO4 (85%) 26.7 mL，Ca2S04 0.93，K2S04 18.2，MgS04·7H20 14.9，KOH 4.13，甘油40.0，50%氨水调节pH；

[0045] 11) PTM1微量元素（g/L）：CuS04·5H20 6.0，NaI 0.08，MnS04·H20 3.0，Na2MoO4·2H20 0.2，H3BO3 0.02，CoCl2 0.5，ZnCl2 20.0，FeS04·7H20 65.0，生物素0.2，H2S04 5 mL；

[0046] 11) 无氮MM培养基（g/L）：无氮YNB 3.0，葡萄糖10.0；

[0047] 12) MM培养基（g/L）：YNB 3.0，葡萄糖10.0，硫酸铵0.3；

[0048] 13) 补料生长培养基：甘油质量浓度 500 g/L，每L添加12 mL的PTM1微量元素；

[0049] 14) 补料诱导培养基：每L甲醇中添加12 mL的PTM1微量元素。

[0050] 缓冲液均按文献（诸葛健, 王正祥编著. 工业微生物实验技术手册. 1994, 北京, 中国轻工业出版社.）配置，两种主要缓冲液简述如下：

[0051] 100 mM pH 6.0磷酸钾缓冲液：13.2 mL 100 mM磷酸氢二钾溶液与86.8 mL 100 mM 磷酸二氢钾溶液混合，如果pH偏离6.0则以磷酸或氢氧化钾调整pH至6.0；

[0052] pH4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液：9.0 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液与11 mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液混合，如果pH偏离4.5，可以用NaOH或柠檬酸溶液调整；

[0053] 检测用半固体培养基：含有2%普鲁兰糖，5 mmol/L 柠檬酸，10 mmol/L 的EDTA.Na2，用HCl和NaOH调整至所需pH，凝固剂为0.6%的琼脂糖。

[0054] 碘溶液

[0055] 按文献[姜锡瑞等. 新编酶制剂实用技术手册. 2002，北京：轻工业出版社]中第398页“稀碘液”配制。

[0056] 方法1 普鲁兰酶酶活测定

[0057] 1) 葡萄糖标准曲线的制作

[0058] 在试管中分别加入不同体积的1g/L的葡萄糖溶液，分别加入对应体积的双蒸水至终体积为2.0 mL，分别加入DNS试剂3 mL，沸水浴15 min，流水冷却后在550 nm处测定吸光值。制作的葡萄糖标准曲线如图 1。

[0059] 2) 酶活力的测定

[0060] 普鲁兰酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）。（Nair SU, Singhal RS, Kamat MY. Enhanced Production of Thermostable Pullulanase Type 1 Using Bacillus cereus FDTA 13 and Its Mutant[J]. Food Technology and Biotechnology, 2006, 44(2): 275-282.]。主要操作方法简述如下：

[0061] 取适当稀释的粗酶液75 μL，加入pH4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液175 μL（如pH有变化将在实施例中具体说明），加入10 g/L普鲁兰糖溶液250 μL，50℃下金属浴20 min。加入DNS试剂750 μL摇匀，煮沸15 min，流水冷却后在550 nm 波长下，以0.5 cm比色杯，用零管调零，测定反应液的吸光值。对照用煮沸灭活后的粗酶液加入普鲁兰糖溶液。

[0062] 酶活单位定义：在相应条件下，每分钟分解普鲁兰所释放的还原糖，其还原力相当于1 μmol葡萄糖所需的酶量，以1 U表示。

[0063] 方法2 巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备与转化

[0064] 挑取毕赤酵母GS115单菌落于20 mL YPD培养基，30℃，200 r/min，培养16 h，以1%的接种量转接至50 mL YPD培养基，培养至细胞密度检测指标吸光度OD600在1.2-1.5之间，将菌液冰浴30 min，4℃，转速5000 r/min，离心5min，收集菌体，分别用20 mL预冷的无菌水和无菌山梨醇溶液（1 mol/L）洗涤菌体2遍，以300 μL预冷的无菌山梨醇溶液（1 mol/L）悬浮菌体，作为感受态细胞。取90 μL感受态细胞，加入10 μL经线性化后的质粒，冰浴10 min，转入电转杯中，1500 V，5毫秒，电击两次，加入900 μL山梨醇悬浮菌体，转移至1.5 mL离心管，30℃静置培养1 h，取适量菌液涂布MD平板，30℃培养48 h左右。

[0065] 方法3 重组巴斯德毕赤酵母的摇瓶诱导表达

[0066] 挑取重组巴斯德毕赤酵母划线分离后获得的单菌落接种于BMGY培养液中，30℃、200 r/min振荡培养至OD600≈20；5000 r/min离心5 min去上清，用BMMY培养基悬浮酵母细胞，30℃、200 r/min继续振荡培养。培养期间每24 h补加0.5%甲醇以维持诱导。

[0067] 方法4 毕赤酵母细胞破碎

[0068] 取毕赤酵母细胞悬液约20 mL于50 mL的塑料烧杯中，烧杯放入另一个装有冰水混合物的200 mL烧杯中。将超声波细胞破碎仪的金属头没入上述酵母细胞悬液中。开启细胞破碎仪开始破碎，破碎条件为1秒间隔1秒破碎至细胞悬液澄清。破碎过程大约需要40min，破碎液进行酶活检测。

[0069] 方法5 重组酶的纯化

[0070] 将粗酶液经0.22 μm的滤膜过滤，以2 mL上样量进DEAE阴离子交换柱。用A溶液平衡DEAE离子交换柱，以B溶液线性洗脱，流速为1 mL·min-1，每管收集1 mL洗脱液。检测洗脱液中的酶活。将检测有酶活的酶液用Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter超滤管浓缩3倍，用0.22 μm的滤膜过滤，以500 μL上样量进Superdex 200凝胶柱。用C溶液洗脱，流速为0.5 mL·min-1，检测洗脱液中的酶活。将普鲁兰酶酶活高的洗脱液进行收集。上述纯化操作及SDS-PAGE电泳主要参考文献（田亚平，周楠迪主编. 生化分离原理与技术. 化学工业出版社，2010）的方法及原理进行操作，其中SDS-PAGE电泳的浓缩胶为5%，分离胶为10%。

[0071] 相关试剂配方

[0072] A液：50 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液；

[0073] B液：含有1 mol·L-1 NaCl的50 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液；

[0074] C液：含有0.15 mol·L-1的NaCl的Tris-HCl缓冲液。

[0075] 方法6 蛋白浓度检测

[0076] 按照文献（Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical biochemistry, 1976, 72(1-2): 248-254.）介绍的Bradford法进行。

[0077] 方法7 重组酶最适反应温度及温度稳定性测定

[0078] 分别在30℃-65℃（间隔5℃）条件下检测普鲁兰酶的酶活。以最高酶活力为100%计算相对酶活。将酶液适当稀释，取1 mL酶液分别在50℃、55℃、60 ℃下保温6 h。每隔1 h取样，迅速置于冰上冷却30 min，在最适条件下测定酶活。以未进行热处理的样品酶活力为100%计算相对酶活以研究酶的热稳定性。检测pH一般是在4.5，或在实施例中具体说明。酶活半衰期检测是在上述酶的温度稳定性检测的基础上延长酶的保温时间，每隔1 h检测酶活，至酶活下降至原有酶活一半时，该时间即为酶活半衰期。

[0079] 方法8 重组酶最适反应pH测定

[0080] 分别配制pH 3-6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，不同pH缓冲液中检测普鲁兰酶酶活力，以最高酶活为100%计算相对酶活。

[0081] 方法9 重组巴斯德毕赤酵母发酵罐发酵

[0082] 首先进行种子培养，挑取单菌落接种20 mL YPD培养基，30℃、200 r/min培养36 h后，转接1 mL 到20 mL YPG培养基中继续培养12 h，转接5 mL到100 mL YPG培养基中继续培养12 h。

[0083] 将上述培养得到的种子液按10%接种量接入装有2.4 L BSM培养基的5 L全自动发酵罐中，用质量浓度50%氨水控制pH稳定在5.0，温度30℃，搅拌转速和通气量分别为800 r/min和2 V/v.m。培养至19 h左右，菌体增长即将进入稳定期时开始流加补料生长培养基。当菌体干重达到87 g/L（实际操作时按OD600=360控制），停止补料。待甘油耗尽，继续保持基质匮乏状态约1 h，控制指标为当DO>60%时，开始流加补料诱导培养基，流加速率为9.9 mL/h以溶氧作为反馈指标，将溶氧控制在25%，间隔12 h取样。所使用发酵罐为上海百伦生物科技有限公司产品BLBIO-5GJ。

[0084] 方法10 菌体干重的测定

[0085] 取5 mL发酵液置于离心管中，8000 r/min离心5 min，弃上清液，将离心管置于105℃，烘干至恒重，称量并计算菌体干重（单位为g/L）。

[0086] 本发明的有益效果：本发明获得的普鲁兰酶嵌合体WXP03是一种有较高比酶活，在pH4.0-4.5范围内活性稳定的普鲁兰酶。利用重组DNA技术生产的上述普鲁兰酶嵌合体在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中的α-1,6糖苷键，适合在淀粉制糖工艺的糖化阶段使用。本发明获得的巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-WXP03 WBB359是一种可以高效制备WXP03的重组菌。

[0087] 生物材料样品保藏：大肠杆菌 JM109/pMD-WXP03（Escherichia coli JM109/pMD-WXP03），已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学保藏日期2016年4月5日，保藏编号CCTCC NO：M 2016168。

[0088] 巴斯德毕赤酵母 WBB359（Pichia pastoris WBB359），已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学保藏日期2016年4月5日，保藏编号CCTCC NO：M 2016169。附图说明

[0089] 图1 葡萄糖标准曲线的制作

[0090] 图2重组质粒pPIC9k-BdP8酶切电泳图

[0091] M：DL15000 Maker；1：pPIC9k-BdP8/BglII+EcoRI

[0092] 图3 普鲁兰酶BdP8和BnP2纯酶的SDS-PAGE电泳图。1：纯化后的普鲁兰酶BdP8；2：纯化后的普鲁兰酶BnP2；M：标准分子量蛋白。

[0093] 图4 普鲁兰酶BdP8最适温度检测

[0094] 图5 普鲁兰酶BdP8最适pH检测

[0095] 图6 普鲁兰酶BnP2最适温度检测

[0096] 图7 普鲁兰酶BnP2最适pH检测

[0097] 图8 控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体pEly的结构图

[0098] 图9 pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP 的酶切电泳图。M：DL15000 Maker；

[0099] 1：pPIC9K-SfA-TT-URA3-RP/Sal I，2：pPIC9K-SfA-TT-URA3-RP/AvrII.。

[0100] 图10 pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP的结构图

[0101] 图11 （a）pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP在染色体上整合后的结构示意图及（b）标记基因剔除后的结构示意图。

[0102] 图12 5L发酵罐发酵的酶活和菌体干重变化曲线

[0103] 图13 纯化的普鲁兰酶嵌合体WXP03的SDS-PAGE电泳图

[0104] 图14 普鲁兰酶嵌合体WXP03的最适温度检测

[0105] 图15 普鲁兰酶嵌合体WXP03的最适pH检测

[0106] 图16 普鲁兰酶嵌合体WXP03的热稳定性检测

[0107] 注：热稳定性检测是在pH4.5的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液中进行。

具体实施方式

[0108] 通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。

[0109] 实施例1 密码子优化的Bacillus deramificans普鲁兰酶基因BdP8的获得与表达[0110] 根据Philippe Deweer等公开的Bacillus deramificans的普鲁兰酶的氨基酸序列（美国专利，专利号5,721,127），根据巴斯德毕赤酵母甲醇氧化酶基因的密码子组成，设计编码Bacillus deramificans的普鲁兰酶的基因BdP8。在Philippe Deweer等公开的Bacillus deramificans的普鲁兰酶的氨基酸序列中，在编码区（含信号肽）的第164、620、812位氨基酸均用X表示，为有效选择这三个位点的氨基酸以便于合成，用序列比对软件CLUSTAL将上述Bacillus deramificans普鲁兰酶的氨基酸序列与Kelly AP等于1994年发表的来源于Bacillus acidopullulyticus的普鲁兰酶B的氨基酸序列（Kelly AP, Diderichsen B, Jorgensen S and McConnell DJ. Molecular genetic analysis of the pullulanase B gene of Bacillus acidopullulyticus. FEMS Microbiol Lett,
1994, 115 (1): 97-105.）进行比对，结果显示上述两种蛋白的氨基酸相似性接近60 %，而在上述相应的三个位点，Bacillus acidopullulyticus的普鲁兰酶的氨基酸残基分别为丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和苏氨酸（Thr），根据相似蛋白质氨基酸序列相似的一般原则，进行BdP8的基因设计时，上述位点按丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和苏氨酸（Thr）进行设计。为叙述方便上述基因编码的蛋白质即Bacillus deramificans的普鲁兰酶，用代号BdP8表示。
基因BdP8的核苷酸序列为SEQ ID NO: 3。基因设计后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成该基因。所合成的基因被克隆在重组质粒pUK-BdP8上，其中含有上述质粒的大肠杆菌JM109/ pUK-BdP8保藏在中国高校工业微生物资源与信息中心 (http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)，保藏编号为：CICIM B7101。所合成基因的5’端除SEQ ID NO: 3所显示的编码区外，在起始翻译密码子ATG上游还添加了一些与分子克隆及表达相关的序列，具体为：AGATCTATAATG。其中ATG为编码区本身的起始翻译密码子，ATG前的三个碱基ATA是按酵母基因Kozak结构增加的序列，以利于提高翻译水平。ATA之前的序列AGATCT是核酸内切酶BglII的识别位点，以便于基因的克隆表达。所合成基因的3’端在翻译终止密码子TAA后面增加了EcoRI的识别位点GAATTC。所列SEQ ID NO: 3除基因编码区从翻译起始密码子ATG到终止子TAA之外也包括ATG之前的9个碱基和TAA之后的6个碱基。由于BdP8基因的长度约
2.8 kb，与载体pUK接近，为便于基因的回收，在操作时用ApaLI、BglII和EcoRI三个核酸内切酶酶切载体pUK-BdP8。其中ApaLI用于将载体pUK切成三个片段。酶切后回收其中约2.8 kb的普鲁兰酶编码基因BdP8。上述片段回收纯化后与经BamHI和EcoRI酶切并经纯化的载体pPIC9K连接，连接物转化大肠杆菌JM109，转化物涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，培养16 h后任选两个转化子提取质粒，酶切鉴定。本实施例普鲁兰酶基因BdP8的一端是用BglII酶切获得粘末端，与载体pPIC9K用BamHI酶切获得的粘末端是相同的，两者进行连接，连接后两种酶切位点均消失。在载体pPIC9K的BamHI酶切位点前约0.95 kb和3.34 kb处各有一个BglII酶切位点。重组质粒用BglII和EcoRI酶切重组质粒应该形成一个3.75 kb的特征条带，而pPIC9K空载体经同样酶切后与此对应的片段只有1.2 kb。用限制性内切酶BglII和EcoRI酶切所获得的质粒，分别得到2.4 kb、3.75 kb和5.6 kb的三条片段，与重组质粒应有特征一致。上述质粒命名为pPIC9K-BdP8。质粒的酶切电泳结果如图2所示。

[0111] 将上述质粒进行测序，测序结果也显示，该重组质粒确实是在pPIC9K的BamHI和EcoRI之间插入了BdP8后得到的重组质粒，其中的BdP8基因的编码区序列与SEQ ID NO: 3的编码区序列完全一致。在载体pPIC9K中，在BamHI和EcoRI位点之间有一段酵母α-因子的编码区，用于引导重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。本发明在进行重组蛋白表达时将所表达的基因在BamHI和EcoRI之间插入，实际上已经将α-因子的编码区切除，同时所合成的普鲁兰酶基因也只含有成熟肽编码区，因此所进行的表达是酵母细胞内表达，所表达的蛋白理论上只存在于细胞内，不能分泌到培养液中。

[0112] 大量提取重组质粒pPIC9K-BdP8，使用BglII酶切线性化，使用柱式DNA片段回收试剂盒纯化酶切产物，用于转化巴斯德毕赤酵母GS115。按材料方法中方法2介绍的方法进行多次转化，获得约1000个以上的转化子。上述转化子全部挑取并点种至含3 mg/mL G418的MD-G418培养基平板，30℃培养48h，共计获得57个可以在MD-G418培养基上生长并形成菌落的转化子。这些转化子理论上是很可能含有高拷贝普鲁兰酶表达单元的转化子。随机挑取20个在3mg/mL G418的MD-G418平板上正常生长的重组巴斯德毕赤酵母单菌落划线分离后接种于BMGY培养液中，按材料方法中方法3进行诱导表达。上述20个转化子在诱导至120h分别取样，离心收集细胞，用与发酵液同样体积的pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液悬浮细胞，细胞悬液用材料方法中方法4进行细胞破碎，破碎液进行酶活检测。酶活检测结果显示，
20株转化子中，有7株检测不到明显的普鲁兰酶酶活，其中一株在发酵120 h后达到最高酶活1.6 U/mL，该菌株被命名为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-BdP8，余12株的酶活均在
0.4-1.5 U/mL范围内，13株的平均酶活为1.2 U/mL。同样条件下，用pPIC9K空质粒转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的重组菌均完全检测不到酶活。

[0113] 实施例2 密码子优化的Bacillus naganoensis普鲁兰酶基因BnP2的获得与表达[0114] 根据Teague,W.M.等公开的来源于Bacillus naganoensis的普鲁兰酶的氨基酸序列(美国专利，专利号6, 300,115，1999年)，根据巴斯德毕赤酵母甲醇氧化酶基因的密码子组成，设计编码Bacillus naganoensis的普鲁兰酶的基因BnP2。为叙述方便上述基因编码的蛋白质，即Bacillus naganoensis的普鲁兰酶，用代号BnP2表示。基因BnP2的核苷酸序列为SEQ ID NO: 4。基因设计后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成该基因。所合成的基因被克隆在重组质粒pUK-BnP2上。所合成基因的5’端增加了便于克隆和表达的序列，序列为：AGATCTATAATG。所列SEQ ID NO: 4除基因编码区从翻译起始密码子ATG到终止子TAA之外也包括ATG之前的9个碱基。其中ATG为起始翻译密码子，ATG前的三个碱基ATA是按酵母基因Kozak结构增加的序列，以利于提高翻译水平。ATA之前的序列AGATCT是核酸内切酶BglII的识别位点，以便于基因的克隆。所合成基因的3’端终止密码子TAA之后增加了EcoRI的识别位点GAATTC。用ApaLI、BglII和EcoRI三个核酸内切酶酶切载体pUK-BnP2，回收其中约2.8 kb的普鲁兰酶编码基因BnP2。上述片段回收纯化后与经BamHI和EcoRI酶切并经纯化的载体pPIC9K连接。连接物转化大肠杆菌JM109，转化物涂布含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，培养16 h后任选四个转化子提取质粒。用限制性内切酶BglII和EcoRI酶切所获得的质粒，其中的4#质粒酶切后得到2.4 kb、3.75 kb和5.6 kb的三条片段，与重组质粒应有特征一致（具体分析同pPIC9K-BdP8，见实施例1）。将4#菌所含质粒进行测序，测序结果也显示，该重组质粒确实是在pPIC9K的BamHI和EcoRI之间插入了BnP2后得到的重组质粒，其中的BnP2基因的序列与SEQ ID NO: 4完全一致。上述重组质粒命名为pPIC9K-BnP2。与实施例1的情况相同，本发明在进行BnP2基因表达时，BnP2基因是在BamHI和EcoRI之间插入，实际上已经将α-因子的编码区切除，同时所合成的普鲁兰酶基因也只含有成熟肽编码区，因此所α进行的表达是酵母细胞内表达，所表达的蛋白理论上只存在于细胞内，不能分泌到培养液中。

[0115] 大量提取重组质粒pPIC9K-BnP2，使用BglII酶切线性化，使用柱式DNA片段纯化试剂盒纯化酶切产物。按材料方法中方法2介绍的方法转化毕赤酵母GS115感受态细胞。进行多次转化获得约1000个以上的转化子，全部挑取并点种至含3 mg/mL G418的MD-G418培养基平板，30℃培养48 h，共计获得51个可以在MD-G418培养基上生长并形成菌落的转化子。这些转化子理论上是很可能含有高拷贝普鲁兰酶表达单元的转化子。随机挑取在3mg/mL G418的MD-G418平板上正常生长的重组巴斯德毕赤酵母20个，划线分离后挑取单菌落接种于BMGY培养液中，按材料方法中方法3进行诱导表达。上述20个转化子在诱导120 h后分别取样，离心收集细胞，用与发酵液同样体积的pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液悬浮细胞，细胞悬液按材料方法中方法4进行细胞破碎，破碎液进行酶活检测。酶活检测结果显示，
20株转化子中，有4株检测不到明显的普鲁兰酶酶活，其中一株在发酵120 h后达到最高酶活164 U/mL，该菌株被命名为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-BnP2，余15株的酶活均在
50-150 U/mL范围内，16株的平均酶活为116 U/mL。同样条件下，用pPIC9K空质粒转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的重组菌完全检测不到酶活。

[0116] 实施例3 BdP8和BnP2的纯化与酶学性质

[0117] 上述实施例1和2制备的普鲁兰酶BdP8和BnP2粗酶液按材料方法中方法5进行纯化，纯化得到的纯酶的SDS-PAGE蛋白电泳图如图3所示。由图3可见，纯酶的电泳结果均表现为单一条带，分子量在97.2 kDa-116.0 kDa之间，符合根据基因序列推测的所编码的蛋白质的应有分子量。用上述纯化获得的BdP8和BnP2分析酶学性质（按方法7、8进行）。图4、5显示了BdP8的酶学性质。图4所示，重组普鲁兰酶BdP8的最适温度为55℃，温度低于55℃时，酶活随温度上升而上升，当温度高于55℃时，酶活迅速下降。由图5可知，重组普鲁兰酶BdP8在pH 3.5-4.5之间表现出较高酶活力，保持在90%以上，在pH 4.0时酶活力达到最高。根据纯酶蛋白量的检测结果（方法6）及在4.0条件下的酶活检测结果计算，BdP8的比酶活为1.9 U/mg。图6、7显示了BnP2的酶学性质。图6所示，重组普鲁兰酶BnP2的最适温度也是55℃，温度低于55℃时，酶活随温度上升而上升，当温度高于55℃时，酶活迅速下降。由图7可知，重组普鲁兰酶BnP2在pH 5.0-5.5之间都表现出较高酶活力，酶活保持在90%以上，最适pH为5.0，在pH 4.5条件下其酶活不到pH 5.0时的80 %，而在pH 4.0条件下其活大约只有pH 5.0时的60 %，这与张艳等的研究结果基本一致（张艳，路福平，刘逸寒. 长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究. 生物技术通报, 2012, (7): 114-118），可见BnP2基本不能适应pH4.0的酸性条件，在pH4.5条件下其活性下降也很严重。在pH 5.0条件下BnP2的比酶为247.1 U/mg。进一步检测BdP8和BnP2的酶活半衰期，结果显示在pH4.5，温度分别为50℃和55℃时，BdP8的酶活半衰期分别为38 h和22 h，而在pH4.0，温度分别为
50℃和55℃时，BdP8的酶活半衰期分别为40 h和20 h，可见BdP8具有很强的耐酸性。同样在pH4.5，温度分别为50℃和55℃时，BnP2的酶活半衰期分别为26 h和12 h，而在pH4.0，温度分别为50℃和55℃时，BnP2的酶活半衰期分别为6 h和2 h。可见BnP2在pH4.5条件下酶活不够稳定，而在pH4.0条件下则酶活下降速度很快，基本不能适应长时间催化的要求。前期人们对Bacillus naganoensis的普鲁兰酶的研究也发现这种酶在pH4.0条件下不稳定(美国专利，1999年，6, 300,115)，本实施例的研究结果与之基本一致。

[0118] 实施例4 普鲁兰酶基因BdP8和BnP2在可裂解大肠杆菌表达系统中的表达[0119] 表达载体pEly是一种可以控制外源基因在大肠杆菌中表达同时又可以控制表达了外源基因的重组大肠杆菌在EDTA作用下发生自裂解从而释放出所表达的外源基因表达产物的一种特殊的表达载体（沈微, 范如意, 王正祥. 一种控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体. 专利号：201110174758.3）。本发明利用pEly构建表达普鲁兰酶基因的重组菌，重组菌在LB平板上形成菌落后用检测用半固体培养基检测菌落所表达的普鲁兰酶的活力。

[0120] 检测方法如下：当LB平板上形成菌落之后，在平板上倾倒约1 mm厚度的检测用半固体培养基，待平板凝固后转入55℃培养4 h。表达载体pEly的特点是在载体上含有一个控制大肠杆菌宿主自裂解的噬菌体溶菌酶编码基因lyMu，这个基因在宿主中与外源基因一起串联表达（见图8）。在正常情况下，裂解蛋白存在于细胞质中，不接触细胞壁，因此并不会马上将菌体裂解。但菌体接触到EDTA时，EDTA会导致细胞膜不稳定，导致溶菌酶蛋白渗出，接触到细胞壁时，分解其中的肽聚糖导致菌体裂解，同时导致胞内重组蛋白释放，在本专利中是重组普鲁兰酶释放到培养基中，导致普鲁兰糖被降解。在上述半固体平板上加无水乙醇，室温放置20 min。如果转化子菌落能产生酸性普鲁兰酶则应该在菌落周围形成透明圈，而其他不具有产生耐酸性普鲁兰酶的转化子周围的普鲁兰糖没有被分解，与酒精形成沉淀，因此没有透明圈或只能形成很小的透明圈。

[0121] 根据BdP8基因序列，设计引物P1和P2：

[0122] 引物P1序列：5’-CCGGAATTCA TGGACGGTAA CACTACCACT ATC-3’ （SEQ ID NO : 7）；

[0123] 引物P2序列：

[0124] 5’-CCCAAGCTTA TTTCTTACCG TGGTCTG-3’ （SEQ ID NO: 8）。

[0125] 以载体pPIC9K-BdP8为模版，以P1、P2为引物PCR扩增获得2.8 kb的BdP8基因。用EcoRI和HindIII酶切后与经同样酶切的载体pEly连接，获得转化子，任取2个转化子提取质粒后酶切鉴定，电泳鉴定显示其中一个转化子酶切后获得5.9 kb和2.8 kb的条带，分别与载体pEly和基因BdP8一致，为重组质粒。将上述含重组质粒的转化子点种在含卡那霉素的LB平板上，形成菌落后用上一节介绍的方法进行普鲁兰酶活性检测，结果显示，重组菌菌落周围不能形成透明圈。进一步调整半固体琼脂的pH为3.5、4.0、4.5、5.0和5.5进行检测，均未能形成透明圈。这可能是由于BdP8表达的普鲁兰酶比酶活过低无法将菌落周围半固体琼脂中的普鲁兰糖全部分解，因此不能形成透明圈。

[0126] 另一个对照试验表达BnP2基因。根据BnP2基因设计引物P3、P4：

[0127] 引物P3序列：5’-CCGGAATTCA TGGACGGTAA CACTACCAAC-3’ （SEQ ID NO : 9）；

[0128] 引物P4序列：5’-CCCAAGCTTA CTACTTACCG TCGGATGG-3’ （SEQ ID NO : 10）。

[0129] 以载体pPIC9K-BnP2为模版，以P3、P4为引物PCR扩增获得BnP2基因，构建以pEly为载体表达BnP2的重组菌。上述重组菌点种在含有卡那霉素的LB平板上，形成菌落后用同样方法检测普鲁兰酶酶活。结果显示，当检测用半固体琼脂的pH为5.0和5.5的情况下，重组菌菌落周围可以形成明显的透明圈。当pH为4.0和4.5时，有时能隐约形成微小而模糊的透明圈。当pH为3.5和3.0时不能形成透明圈。上述对照试验显示，由于在pH为5.0和5.5的情况下，BnP2蛋白的酶活较高，因此可以形成透明圈而在pH3.0和3.5的情况下，BnP2蛋白的酶活较低因此不能形成透明圈。因此，如果能筛选到可以在pH 3.5条件下形成透明圈的重组菌，则重组菌所表达的应该是一种在酸性条件下有较高比酶活的重组普鲁兰酶。

[0130] 实施例5 用DNA Shuffling 技术获得基因BdP8和BnP2的嵌合体

[0131] 用ApaLI、BglII和EcoRI三个核酸内切酶分别酶切载体pUK-BdP8和pUK-BnP2，电泳分离并回收其中的基因BdP8和BnP2。上述回收的基因片段等体积混合，在37℃用DNaseI进行部分消化，酶的用量为终浓度0.1 U/mL，酶切时间分别控制在5 min、10 min、15 min、20 min，在酶切终点时在酶切体系中加入1/10体积的加样缓冲液以终止酶切反应，再分别电泳鉴定。结果显示，酶切10 min的产物主要在250-350 bp范围内。选用这一条件下获得的酶切产物，电泳分离并回收其中大小在250-400 bp的片段。以上述片段进行无引物PCR，重新组装普鲁兰酶基因。无引物PCR条件如下：在50 μL体系中加入上述回收的PCR产物5 μL，其余材料同普通PCR，混合后按下列条件进行PCR反应：预变性94℃ 3 min；循环条件：94℃ 30 s，42℃ 30 s，72℃ 30 s，共进行40 个循环，延伸反应 72℃ 10 min。无引物PCR结束后进行有引物PCR，反应条件如下：预变性94℃ 2 min，循环条件：94℃ 30 s，52℃ 30s，72℃ 30 s，共进行35 个循环，延伸反应 72℃ 10 min。有引物PCR的模版是上述无引物PCR的反应产物，分4组进行有引物PCR。其中第一组以引物P3和P2进行PCR，第二组以引物P1和P4进行PCR，第三组以P1和P2进行PCR，第四组以P3和P4进行PCR。第一组PCR引物P3只能与BnP2的5’端结合，而引物P2则只能与BdP8的3’端结合，所以PCR产物一定是5’端来源于BnP2，而3’端来源于BdP8的嵌合体基因。第二组PCR使用的引物P1只能与BdP8的5’端结合，而P4只能与BnP2的3’端结合，所以PCR产物一定是5’端来源于BdP8，而3’端来源于BnP2的嵌合体基因。第三组PCR产物的5’端和3’端均来源于BdP8。第四组PCR产物的5’端和3’端均来源于BnP2。
电泳鉴定上述PCR产物，分离并回收其中约2.8 kb的片段，用核酸内切酶EcoR I和Hind III酶切，酶切产物纯化后与表达载体pEly连接，连接物转化大肠杆菌DH5α的高效感受态细胞（为宝生物工程（大连）有限公司产品，产品号D9057），转化物涂布含有卡那霉素的LB平板。
待平板上长出转化子后进一步检测其是否能产生在酸性条件下有较高酶活的普鲁兰酶。检测方法同实施例3，其中检测用半固体培养基的pH控制在3.5，每一块平板的菌落数控制在
300个左右。经过多次转化，以每一组PCR得到的产物为基础各获得并鉴定了大约5万个菌落，总计获得并鉴定了大约20万个菌落。其中只有第一组PCR产物为基础获得的重组菌有菌落能形成透明圈，共计获得有透明圈的菌落133个。将上述形成透明圈的区域的半固体琼脂拨开，将菌落中未被完全裂解的残余菌体取出提取质粒，质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）codonplus，转化后各涂布1块含有卡那霉素的LB平板。在上述133个菌落中，有43个通过上述方法再次得到转化子。得到的转化子在43块平板上，最少的有11个转化子，最多的200多个。其余90个菌落在检测时已经被几乎全部裂解，提取质粒后再次转化未能再得到转化子，被放弃。大肠杆菌BL21（DE3）codonplus是一种将密码子AGA、AGG等大肠杆菌中很少使用的密码子对应的氨酰tRNA高表达的特殊宿主菌，有利于真核生物来源的基因在大肠杆菌中表达。本发明合成的基因BnP2和BdP8是按照巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性设计的，含有较多的AGA和AGG密码子，因此在大肠杆菌BL21（DE3）codonplus中可以得到较高的表达。在上述43个菌落转化大肠杆菌BL21（DE3）codonplus得到的43块平板分成43组进行进一步检验。
每组随机挑取20个转化子（转化子不足20个的就全部挑取），划线分离后各取2个，分别对应点种两块含有卡那霉素的LB平板，编号。形成菌落后任取其中一块，再次用实施例3的方法进行检测，结果显示只有11个组有菌落再次显示透明圈。其余22组的菌落已经不能再形成透明圈，可能其转化子是由边上的其他菌落污染形成的，或其他不清楚的原因造成。在有菌落形成透明圈的11个组中，各自任选一有透明圈的菌落，在与之对应的未用于检测的平板上，按照标号找的对应的菌落。上述共计11个菌落再次分离后再各自点种进行透明圈实验，结果显示这11个菌落划线得到的菌落均能再次形成透明圈。这11株菌中以代号为W03的菌株形成的透明圈较大。上述11株菌进一步进行摇瓶检测，结果也是W03的摇瓶发酵酶活最高，为1.5 U/mL，其余菌株细胞破碎液的酶活大约在0.2-1.1 U/mL。据此我们选定W03菌株用于进一步的工作。

[0132] 设计一对引物：Pwx1、Pwx2：

[0133] Pwx1：5’-GGAAGATCTA TAatggacgg taacactacc aac-3’(SEQ ID NO: 11)；

[0134] Pwx2：5’-CCGGAATTCT TACTATTTCT TACCGTGGTC TGG -3’(SEQ ID NO: 12)。

[0135] 从W03号菌株中提取质粒，以其为模版，用引物Pwx1，Pwx2进行PCR扩增，获得一2.8 kb左右的扩展片段，片段与载体pMD18-T Simple连接，转化大肠杆菌JM109，任选一个转化子所含重组质粒进行测序。结果显示，重组质粒中的插入片段是一个分别来源于BdP8和BnP2的片段组合而成的嵌合体，其嵌合体编码区序列列于SEQ ID NO: 2。上述插入片段中的编码区命名为WXP03，所编码的普鲁兰酶蛋白命名为WXP03，其氨基酸序列列于SEQ ID NO: 1。插入片段中在编码区起始密码子ATG上游包含了由引物Pwx1带入的片段ATATCTATA，其中AGATCT是BglII的识别位点，用于片段的再次克隆，ATA为提高基因在酵母中表达水平的Kozak结构。插入片段中嵌合体编码区最后一个密码子AAA的下游增加了由引物Pwx2带入的序列TAGTAAGAATTC，其中TAGTAA是为有利于基因的翻译终止而增加的两个终止密码子，GAATTC是增加的核酸内切酶EcoRI识别位点。上述含有WXP03基因的重组质粒命名为pMD-WXP03，含有这一重组质粒的重组大肠杆菌的分类命名为：大肠杆菌JM109/pMD-WXP03，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2016168。重组载体pMD-WXP03插入片段全序列列于SEQ ID NO: 5。SEQ ID NO: 5包括从BglII识别序列AGATCT到EcoRI识别序列GAATTC之间的全部序列以及上述两个识别序列本身，其中的普鲁兰酶嵌合体基因编码区序列与SEQ ID NO: 2一致。

[0136] 对WXP03，BnP2及BdP8的氨基酸序列进行比对，结果显示WXP03与BdP8的氨基酸相似性为92.69%；WXP03与BnP2的氨基酸相似性为95.58%。WXP03，BnP2及BdP8的氨基酸序列比对显示，WXP03大致可以分为4个部分，其中第一段从第一个氨基酸Met至第262个氨基酸残基来源于BnP2，第二段从第263个氨基酸E到第573个氨基酸残基Thr来源于BnP8，第三段从第574个氨基酸残基Asp到第794个氨基酸残基Asp来源于BnP2，第四段从第795氨基酸残基Ala到最后一个氨基酸残基Lys来源于BdP8。可见氨基酸序列比对也显示，WXP03是BdP8和BnP2的嵌合体。

[0137] 实施例6 表达基因WXP03的重组巴斯德毕赤酵母的构建

[0138] 用核酸内切酶ApaLI、BglII和EcoRI 酶切重组质粒pMD-WXP03，分离其中约2.8 kb的普鲁兰酶基因，与经BamHI和EcoRI酶切的表达载体pPIC9K连接，获得重组质粒pPIC9K-WXP03，重组质粒转化子的筛选方法与实施例1中pPIC9K-BdP8的相同。大量提取重组质粒pPIC9K-WXP03，使用BglII酶切线性化，使用DNA片段纯化试剂盒纯化酶切产物。按材料方法中方法2介绍的方法转化巴斯德毕赤酵母GS115。获得转化子后挑取并点种至含3 mg/mL G418的MD-G418培养基平板，30℃培养48小时，共计获得23个可以在MD-G418培养基上生长并形成菌落的转化子。这些转化子理论上是很可能含有高拷贝普鲁兰酶表达单元的转化子。挑取上述转化子划线分离后取单菌落按材料方法中的方法3进行摇瓶发酵。发酵获得的细胞按材料方法中方法4进行细胞破碎，破碎液检测酶活。酶活检测结果显示，23株转化子中，有3株检测不到明显的普鲁兰酶酶活，其中编号为8#的菌株是酶活最高的一株为201.9 U/mL，其余20株的酶活均在50-150 U/mL范围内，平均酶活为136.7 U/mL，根据毕赤酵母发酵的一般规律，结合上述20株菌的酶活情况判断，WXP03的比酶活应该与BnP2的比较接近。

[0139] 为了获得重组酶发酵活力更高的毕赤酵母菌株，大量提取pPIC9K-WXP03，线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115，获得的转化子点种含3 mg/mL G418的MD-G418平板。经过多次转化和点种共计获得约407个可以在MD-G418培养基上生长并形成菌落。将上述407个转化子菌落划线分离后选取单菌落进行摇瓶发酵，结果显示。其中一株代号为M8的菌株，在发酵5天后胞内酶活可达211.8 U/mL，是所有转化子中最高的。上述菌株命名为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8，简称M8，用于下一步的工作。

[0140] 实施例7 Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8营养缺陷型突变株的获得[0141] 本实施例和下面的5个实施例介绍在Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8基础上进一步通过诱变育种获得高表达基因WXP03的重组巴斯德毕赤酵母突变株的方法[0142] 诱变育种是获得高产突变株的重要方法。本发明获得的Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8是一株在细胞内表达普鲁兰酶的重组酵母。用直接检测普鲁兰酶表达水平的方法筛选M8的高表达突变株需要耗费大量精力对每一个突变株进行摇瓶发酵、破细胞和酶活检测，工作量大而效果有限。在影响真核生物基因表达的各种因素中，针对某一个或某一类启动子的与转录相关的调控因子的表达水平及其功能起着十分重要的作用，这些调控因子的变化不但可以影响某一个基因的表达水平，也同时影响与这个基因拥有相同或相类似的启动子控制的基因的表达水平。宋毅等研究者曾经将真菌潮霉素抗性基因的蛋白编码区与黑曲霉的糖化酶基因的启动子组成一个表达框，转化一株具有多拷贝糖化酶基因的黑曲霉，获得一株具有潮霉素抗性的重组黑曲霉。用理化因子对这株重组黑曲霉进行诱变获得潮霉素抗性提高的突变株（宋毅. 糖化酶工业生产菌株选育及其种子制备工艺优化[D]: [硕士学位论文]. 无锡: 江南大学，2009）。而摇瓶发酵检测发现，在上述潮霉素抗性提高的突变株中，糖化酶产量同时提高的菌株的比例高达37.5%。在所研究的基因以高拷贝形式存在时，这种相同启动子控制下的不同基因其表达水平同时提高的可能性一般较高，因为基因剂量的提高往往导致相应的转录调控相关因子的不足。如果在Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8中导入AOX启动子控制的，表达水平易于检测的基因，通过诱变育种获得该基因表达水平提高的突变株，那么在这些突变株中同样在AOX启动子控制下的WXP03基因表达水平也同时提高的可能性应该比较高。来源于扣囊复膜孢酵母的淀粉酶SfA是一种比酶活较低的淀粉酶，在AOX控制下在巴斯德毕赤酵母中表达一般只能在含有淀粉的平板上形成较小的透明圈，因此透明圈的大小是一种比较方便的选择性标记，本实施例和后面的5个实施例介绍通过筛选SfA表达水平提高的突变株间接筛选普鲁兰酶WXP03表达水平提高的菌株的方法。

[0143] 为了将SfA基因导入Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8中，首选要获得遗传标记。本实施例将该菌株进行诱变，筛选ura3基因缺陷的营养缺陷型菌株。方法如下：

[0144] 1）菌体的紫外诱变

[0145] 酵母Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8单菌落一个接种YPD液体培养基，30 ℃震荡培养过夜，取10 mL菌液，离心收集菌体，弃上清，用5 mL pH7.0的磷酸缓冲液悬浮菌体。菌悬液倒入一个无菌的 9 cm的玻璃培养皿中，盖好培养皿盖。在紫外诱变箱内打开一个15瓦的紫外灯，稳定10 min，同时达到紫外诱变箱本身进行紫外消毒的目的。期间工作人员穿好防护服、戴好防护手套及防护眼镜。将培养皿放在距离紫外灯管30 cm处。左手打开培养皿盖，右手摇动培养皿保持菌悬液震动以使菌体均匀接受照射，照射时间控制在
30 s左右，盖上培养皿盖结束照射。照射结束后将经过照射的5 mL菌液全部转移到30 mL 液体YPD培养基，30℃震荡培养16 h。

[0146] 2）用制霉菌素富集营养缺陷型

[0147] 取5 mL菌液，离心收集菌体，弃上清，用10 mL无菌生理盐水悬浮菌体，离心收集菌体，弃上清，再次用10 mL生理盐水悬浮菌体，再次离心收集菌体，用20 mL液体MM培养基悬浮菌体，30℃震荡培养3 h。离心收集菌体，用生理盐水悬浮菌体，离心弃上清，用20 mL无氮MM培养基悬浮菌体，用血球计数板估算酵母细胞数，控制菌体浓度在1-5×107个/mL，菌悬液在30℃震荡培养3 h。在菌悬液中加入1 mL 浓度为1mg/mL的硫酸铵溶液，1 mL 浓度为100 μg/mL的制霉菌素溶液（溶剂为95%的乙醇），静置培养2 h。离心弃上清，沉淀全部转移到30 mL液体YPD培养基中，30℃震荡培养6 h，这一步可以使未被制霉菌素杀死的可能是营养缺陷型的菌株活力得到回复。

[0148] 3） ura3缺陷菌株的筛选

[0149] 上面两步通过制霉菌素富集可以获得营养缺陷型含量较高的菌液，但所含营养缺陷型是多种类型的。URA3基因所编码的乳清苷酸脱羧酶是催化尿嘧啶合成的关键酶，破坏URA3基因的菌株由于无法合成尿嘧啶，在不含尿嘧啶的培养基中无法生长，成为ura3缺陷型。因此可以作为遗传标记来筛选毕赤酵母转化子。URA3基因所编码的乳清苷酸脱羧酶同时还可以催化一种特殊的化合物：5-氟乳清酸（5-FOA）形成有毒害作用的5-氟尿嘧啶核苷酸，使URA3基因功能完整的毕赤酵母在含有5-FOA的培养基中生长时死亡，因此无法在含有5-FOA的培养基上生长，因此可以通过在培养基中添加5-FOA和尿嘧啶来筛选ura3基因缺陷型菌株。将上面介绍的通过制霉菌素富集获得的营养缺陷型较多的酵母菌液涂布含有0.2%
5-FOA的SM平板（含0.006% 尿嘧啶以保证ura3缺陷型可以正常生长）。经过多次筛选一共获得在5-FOA筛选平板上生长的菌株200多个。将这200个菌株分别在含尿嘧啶的SM平板和不含尿嘧啶的MD平板上划线，30℃培养3天，其中有7株菌在SM上能形成正常菌落，而在MD上完全不能生长。将上述7株菌再次划线分离后取单菌落进行摇瓶发酵培养。方法同材料方法，但其中的BMGY和BMMY培养基中添加0.006%的尿嘧啶。摇瓶发酵结果显示其中一株代号为E107的菌株发酵酶活最高为200 U/mL。这株菌命名为：Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 E107，选定用于下一步工作。

[0150] 实施例8 构建在AOX启动子控制下分泌表达淀粉酶基因的重组质粒

[0151] 第一步，在T载体中插入淀粉酶基因SfA

[0152] 设计一对引物PYb1、PYb2：

[0153] PYb1：5’-TGGCCTAGGC AACCAGTGAC TCTATTC-3’ ，SEQ ID NO: 13；

[0154] PYb2：5’-CCGCTCGAGA AGCTTGCACA AACGAACTT-3’，SEQ ID NO:14。

[0155] 提取Pichia pastoris GS115/pPIC9K-SfA的染色体DNA，以其为模版，以PYb1和PYb2为引物进行PCR扩增，获得一1.8 kb的片段，该片段命名为SfA-TT。载体pPIC9K-SfA是一个将来源于扣囊复膜孢酵母的淀粉酶成熟肽编码基因SfA插入到载体pPIC9K信号肽编码区下游多克隆位点处获得的重组质粒，用BglII将载体线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115，筛选得到Pichia pastoris GS115/pPIC9K-SfA（沈微, 郭玉婉, 黄雯雯, 樊游, 陈献忠, 王正祥. 一种以淀粉为原料的麦芽三糖制备方法及其专用真菌α-淀粉酶, 专利号：ZL201210471187.4），据此，上述PCR产物SfA-TT包含SfA基因及巴斯德毕赤酵母甲醇氧化酶基因的转录终止区。上述PCR产物纯化后利用T-A连接法与载体pMD-18 T连接，连接物转化大肠杆菌JM109，转化物涂布含氨苄青霉素的选择性平板，37℃过夜培养，获得转化子。任取两个转化子提取质粒酶切鉴定。在pMD18-T的插入位点两侧各有多个酶切位点，其中在靠近lac启动子一侧有一个KpnI位点，按照计划，下一个基因是在这一个KpnI位点和SfA-TT片段中由引物PYb2带入的XhoI之间插入标记基因PpURA3，因此这两个位点必须在同一侧，相应的插入片段SfA-TT的另一侧由引物PYb1带入的AvrII位点应该位于KpnI位点较远的另一侧，所以适合用于下一步试验了的重组质粒中片段自带的AvrII位点和载体本身的KpnI酶切位点之间包含着1.8 kb的插入片段。据此用AvrII和XhoI双酶切从转化子中提取的质粒，电泳结果显示，其中一个质粒的酶切产物形成两个条带，一个为2.7 kb与pMD18-T Simple一致，另一个为1.8 kb，与SfA-TT一致，符合SfA-TT于pMD18-T Simple连接获得的重组质粒，该质粒命名为pMD-SfA-TT，用于下一步工作。

[0156] 第二步，插入筛选标记基因PpURA3。

[0157] 设计引物PYb3、PYb4：

[0158] PYb3：5’-CCGCTCGAGC TGCAGAAATG GGGAGATAAC-3’ ，SEQ ID NO: 15；

[0159] PYb4：5’-CCGGGTACCA CTAGTGGTTT TCTGGGGGT-3’，SEQ ID NO:16；

[0160] 提取巴斯德毕赤酵母GS115的染色体DNA，以其为模版，以PYb3和PYb4为引物进行PCR，获得一2.0 kb的片段，该片段为巴斯德毕赤酵母URA3基因的完整片段，包括792碱基的编码区，642碱基的上游片段和609碱基的下游片段，可以在酿酒酵母中互补ura3基因的缺陷(Cereghino L, et al. New selectable marker/auxotrophic host strain combinations for molecular genetic manipulation of Pichia pastoris. Gene, 2001, 263 (1-2): 159-169.)。上述PCR产物命名为PpURA3。上述PCR产物纯化后用Kpn I和XhoI酶切，与经同样酶切的质粒pMD-SfA-TT连接，并按常规方法筛选转化子，最终获得一个重组质粒，该质粒用XhoI和KpnI酶切后可以得到2.0 kb和4.5 kb的两个片段，分别与片段PpURA3和pMD-SfA-TT一致，符合PpURA3与pMD-SfA-TT重组获得的重组质粒应有的特征，该质粒命名为pMD-SfA-TT-PpURA3。

[0161] 第三步，插入重复片段。

[0162] 设计引物PYb5、PYb6

[0163] PYb5：5’-CCGGGTACCT CATTCTGAGA ATAGTGTATG C-3’ ，SEQ ID NO: 17；

[0164] PYb6：5’-ACGAGCTCTC CTAGGTTTCA GTGTTCCCGA TCT-3’，SEQ ID NO:18；

[0165] 以质粒pPIC9K为模板，用PYb5、PYb6为引物进行PCR，获得一0.6 kb片段。该片段与pPIC9K载体上的AOX启动子与氨苄青霉素抗性基因之间的0.6 kb的片段相同（包含氨苄青霉素抗性基因5’端的一部分），用于标记基因的删除，具体原理在实施例11中介绍。上述片段命名为RP。将上述RP片段纯化后用KpnI和SacI酶切，与经同样酶切的载体pMD-SfA-TT-PpURA3连接，并按常规方法筛选转化子，最终获得一个重组质粒，该质粒用KpnI和SacI酶切后电泳鉴定获得6.5 kb和0.6 kb的条带，分别与质粒pMD-SfA-TT-PpURA3和RP片段一致，符合RP片段与载体pMD-SfA-TT-PpURA3连接获得的重组质粒应有特征。上述重组质粒命名为pMD-SfA-TT-PpURA3-RP，在这个载体中，最后一步插入的RP片段靠近SacI位点一侧有一个由引物PYb6带入的AvrII酶切位点（引物中以方框标识），这个位点与构建载体时插入的第一个片段SfA-TT中由引物PYb1带入的AvrII处于相对的位置，两个AvrII位点之间是完整的插入片段SfA-TT-PpURA3-RP。

[0166] 第四步，构建表达淀粉酶基因的重组质粒。

[0167] 上述质粒pMD-SfA-TT-PpURA3-RP用AvrII酶切，获得2.7 kb和4.4 kb的两个片段，其中2.7 kb的片段与载体pMD18-T Simple一致，4.4 kb的片段是上述几步插入载体中三个片段组合成的片段，该片段命名为SfA-TT-PpURA3-RP。电泳分离并回收其中4.4 kb的SfA-TT-PpURA3-RP片段，与经同样酶切并纯化的载体pPIC9K连接，连接物涂布含50 微克/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃培养16小时。由于这一步DNA重组时载体只进行单酶切因此转化子中大部分是载体重新自环化后转化得到的含有空质粒的转化子。挑取上述氨苄青霉素平板上形成的约120 个转化子进行菌落PCR，PCR引物为PYb1和PYb2。结果显示，其中有4个菌落PCR后得到1.8 kb的片段，是含有重组质粒的转化子。提取上述4个转化子质粒，用AvrII酶切后电泳鉴定，结果显示4个质粒酶切后都是得到大约为9.2 kb和4.4 kb的两条带，分别与pPIC9K和插入片段SfA-TT-PpURA3-RP一致。由于SfA-TT-PpURA3-RP片段是以单酶切形式与载体pPIC9K连接，因此可以有两种连接方式，一种是SfA基因在pPIC9K的启动子AOX（包括载体自带的信号肽）一侧，另一种是RP片段在AOX一侧。显然只有当SfA基因在pPIC9K启动子AOX一侧时才有可能实现SfA基因的分泌表达。在插入pPIC9K质粒的多克隆位点中插入片段SfA-TT-PpURA3-RP的位点，即AvrII识别位点的下游大约1.9 kb处有一个SalI的识别位点，而在PpURA3基因的大约745 碱基的位置有一个SalI识别位点。在PpURA3基因中的SalI识别位点距离SfA-TT-PpURA3-RP片段的5’端（即SfA基因前端）大约是2.54 kb，而距离该片段的3’段（即RP片段的末端）大约是1.9 kb。当SfA-TT-PpURA3-RP片段以正向插入pPIC9K的AvrII识别位点，即当SfA基因的前端在AOX启动子一侧时，用SalI酶切重组质粒应该得到两个条带分别为3.8 kb和9.2 kb。如果SfA-TT-PpURA3-RP片段以反方向插入AvrII位点，即RP片段在AOX启动子一侧时，用SalI酶切重组质粒则应该得到4.45 kb与9.15 kb的片段，即其中的小片段应该略大于用AvrII酶切重组质粒时得到的片段。将上述4个重组质粒分别用SalI酶切，电泳结果显示，只有3#质粒酶切后产生的两个片段中，小片段比该质粒用AvrII酶切后产生的小片段更小，可见只有3#质粒是SfA-TT-PpURA3-RP片段以正向插入AvrII识别位点得到的重组质粒。图9是3#质粒分别用AvrII和SalI酶切得到的产物的电泳图。进一步将3#质粒进行测序，结果显示，该质粒确实是在pPIC9K的AvrII位点处插入SfA-TT-PpURA3-RP片段得到的重组质粒，插入片段的全序列见Seq ID NO：6。上述质粒命名为pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP，其结构图见图10。

[0168] 实施例9 构建在AOX启动子控制下分泌表达淀粉酶基因的重组巴斯德毕赤酵母[0169] 将质粒pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP转入高表达WXP03的巴斯德毕赤酵母时首先要选定质粒的线性化位点，这个位点在宿主细胞中的对应位点也是将来转化时质粒在宿主菌中的插入位点，有可能导致插入位点基因的失活。在质粒pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP中，在Kan基因，也就是编码G418抗性的基因中有一个XmaI的识别位点（图10），也是XmaI在这个重组质粒中唯一的识别位点，适合选为质粒的线性化位点。计划使用的宿主菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 E107是用pPIC9K-WXP03转化得到的转化子，在筛选多拷贝转化子时就使用了菌株的G418抗性，因此应该含有多个Kan基因，而Kan基因在完成了多拷贝转化子筛选后就失去了使用价值。如果在宿主菌的Kan基因中插入线性化的重组质粒pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP，虽然可能破坏kan基因，但不会对宿主菌产生新的不良影响。因此本实施例选用XmaI进行载体的线性化。载体线性化后按常规方法转化Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 E107的感受态细胞，转化物涂布MD平板，在30℃培养3天后，获得约200个转化子。将上述转化子划线分离后，以PYb1和PYB2为引物进行菌落PCR鉴定，电泳结果显示其中约100个菌落的PCR结果含有一1.8 kb的扩增条带，表明是线性化载体pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP插入宿主菌染色体得到的阳性重组菌。将上述阳性重组菌分别点种到MS培养基上，30℃培养2天。MS培养基是含有淀粉和甲醇的培养基，可以被甲醇诱导AOX启动子控制下的淀粉酶SfA表达，表达产物在酵母信号肽引导下分泌到细胞外，降解淀粉。上述培养物培养2天后，在平板上加上稀碘液，结果显示大部分阳性转化子的周围都能形成透明圈。作为对照，将Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 E107在MS平板上培养后不能形成透明圈。透明圈的大小一般与表达框的拷贝数有关，透明圈小的很可能是含单拷贝表达框的转化子，由于本专利在后期需要删除淀粉酶的表达框，而单拷贝基因相对容易被删除，所以对转化子的透明圈情况仔细观察后选择了其中透明圈较小的11#转化子用于下一步试验，该转化子命名为：Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 H11。

[0170] 实施例10 高表达WXP03的突变株的获得

[0171] 用亚硝基胍对重组菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 H11进行诱变。诱变方法如下：Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 H11单菌落接种液体YPD培养基，培养24 h，达到对数生长期时，取10 mL菌体，离心，弃上清，用等体积的2 mmol/L的pH 6.0的磷酸缓冲液悬浮菌体，加入用磷酸缓冲液预先溶解的亚硝基胍2 mg，30℃震荡培养2 h。离心，弃上清，再用磷酸缓冲液悬浮菌体，菌体转入80 mL YPD液体培养基中，30 ℃震荡培养16 h。取菌液适当稀释后涂布MS+0.03%曲利苯蓝平板，控制每块平板的菌落数在200以下。30℃培养2天。观察菌落周围透明圈大小，将透明圈较大的菌落点种到同一块YPD平板上。第一轮诱变后，在大约4万个菌落中挑选出大约200个菌落。将上述菌落集中后接种液体YPD培养基，培养至对数期再次进行诱变，并在MS+0.03%曲利苯蓝平板上挑选透明圈较大的菌株。共计进行5次诱变及筛选。第五次诱变后选出420个菌落，划线分离后接种单菌落在BMMY培养基中进行摇瓶诱导发酵，在甲醇诱导120 h后测定淀粉酶酶活，进行进一步的淀粉酶酶活检测。
结果显示其中27个菌株的淀粉酶产量相比出发株提高幅度在10 %以上。将上述27株菌按每株三瓶再次进行摇瓶诱导发酵，并同时检测发酵液淀粉酶酶活和胞内普鲁兰酶酶活。结果显示，27株菌中，有17株的淀粉酶酶活水平比出发株H11提高10%以上，而这17株菌中有7株的普鲁兰酶酶活提高幅度在10%以上，其中普鲁兰酶酶活提高幅度最高的菌株的编号为J359，提高幅度达到15%，该菌株命名为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 J359。

[0172] 实施例11 高产突变株中淀粉酶表达框的删除及标记基因的回补

[0173] 淀粉酶基因SfA在 J359中的表达可能会对普鲁兰酶的表达在转录翻译调控因子及其他方面形成竞争，将其删除理论上可以有利于普鲁兰酶酶活的提高。在载体pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP整合到毕赤酵母E107菌株的染色体上之后，应该形成如图11（a）所示的结构。在该结构中，RP片段有两个，在启动子基因AOX、SfA基因和PpURA3基因的两侧重复出现。酵母细胞的一个特点是相同序列的片段在染色体上距离较近的区域内重复出现时有可能以比较高的频率发生同源重组，从而把两个重复区之间的片段删除掉，形成如图11（b）所示的结构。酵母的这个特点被国内外许多科研工作者用于标记基因或其他基因的删除（项峥, 陈献忠, 张利华等. 利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母基因敲除系统. 遗传, 2014, 36(10): 1053-1061）。本实施例利用这一原理通过筛选删除了PpURA3基因的菌株同时筛选出淀粉酶表达框被删除的菌株。删除了PpURA3基因的菌株表现为ura3缺陷，同时应该表现出对5-氟乳清酸的抗性。将Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 J359接种YPD液体培养基，培养24 h后取100 μL培养液涂布一块含5-氟乳清酸的平板，共计涂布20块，30℃培养3天，共计大约获得200个在5-氟乳清酸平板上生长的单菌落。将上述单菌落划线分离后分别点种SM和MD平板，30℃培养3 天，其中有11株菌在SM上生长而在MD上完全不生长。以引物PYb1和PYb2对上述菌株进行菌落PCR，结果其中只有1株菌PCR得到1.8 kb的扩增条带，其余10株均都没有扩增条带。上述10株菌和对照菌J359点种MS（加0.006%尿嘧啶）平板，培养2天后只有对照菌J359菌落附件有透明圈而其他10株菌周围都没有透明圈，表明其淀粉酶表达框及URA3基因均已经被删除。随机取其中一株命名为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 J359C，简称J359C用于下一步工作。

[0174] J359C虽然剔除了淀粉酶基因，但所带有的ura3缺陷使其培养时需要添加尿嘧啶，不利于菌株的应用，因此需要将PpURA3基因重新回补。本实施例计划以J359C的ura3基因为目标进行基因的回补，为此首先分析了出发菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 E107中ura3基因的突变情况。提取Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 E107染色体DNA，以实施例8第二步中使用的引物PYb3和PYb4进行PCR获得2.0 kb的ura3基因，将该基因与pMD18T-Simple连接后测序，结果显示E107中的失活的ura3基因是在编码区的257位和258位碱基之间插入了1个胞嘧啶，发生编码区的移码突变从而导致基因失活，突变位点之前后的片段都是正常的。据此采用Pichia pastoris GS115的正常的URA3基因进行回补。

[0175] 首先以Pichia pastoris GS115的染色体DNA为模版，用PYb3和PYb4为引物按照实施例8的方法PCR获得2 kb完整的PpURA3基因通过T-A连接法将其与pMD18-T Simple连接，得到重组质粒pMD-PpURA3。E107的失活的PpURA3基因是在编码区的257位和258位碱基之间插入了1个胞嘧啶。在基因PpURA3编码区107碱基处有一个SalI识别位点的，如果在这一位点将重组质粒pMD-PpURA3线性化，再转化J359C，则在上述片段整合后则染色体上SalI位点上游的片段与载体带入的SalI位点下游的片段可以组合成一个完整的没有突变的PpURA3基因。据此将pMD-PpURA3用SalI酶切线性化后转化Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 J359C，转化物涂布MD平板，获得多个转化子。这些转化子均为ura3缺陷基因获得回补的菌株。任选3株划线分离后按材料方法中方法3进行发酵，结果显示，三株菌的发酵酶活均在240 U/mL左右。理论上讲这些菌株都是ura3缺陷得到回补的菌，其发酵酶活不应该有明显差异，因此任取其中一株命名为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 WBB359，简称WBB359，用于下一步实验。

[0176] 实施例12 高产突变株的普鲁兰酶发酵性能

[0177] 将改造前的菌株Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 M8和Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 WBB359分别进行摇瓶发酵，在相同条件下进行多次试验。结果显示，出发菌M8的平均酶活为210.4 U/mL，WBB359的平均酶活为243.6 U/mL，WBB359的平均酶活比未经诱变的出发菌M9提高了15.6%。进一步在5 L发酵罐上按材料方法中的方法10进行WBB359的发酵试验。结果如图12所示。

[0178] 由图12可见，WBB359在诱导114 h后，酶活达到最高为1906 U/mL，酶活最高时菌体量大约是在细胞干重137 g/L。进行多次试验，结果显示发酵酶活均在1800 U/mL以上。高产普鲁兰酶的重组菌巴斯德毕赤酵母突变体Pichia pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 WBB359，分类命名为巴斯德毕赤酵母 WBB359，或Pichia pastoris WBB359，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016169。

[0179] 实施例13 重组酶WXP03的应用性能

[0180] 将实施例12中WBB359菌株5 L发酵罐发酵获得的酶液按材料方法中的方法5进行纯化，获得的纯化后的酶用SDS-PAGE电泳鉴定。结果如图13所示。有图13可见，纯化获得的酶液电泳只获得一条电泳带，在分子量97.6-116kDa之间，符合重组酶WXP03应有分子量。可见已经获得了电泳纯的酶液。进一步用纯酶液按材料方法中方法7、8进行酶学性质研究。结果如图14、15、16所示。由图14可知，重组普鲁兰酶WXP03的最适温度为55℃，温度低于55℃时，酶活随温度上升而上升，当温度高于55℃时，酶活迅速下降。由图15可知，重组普鲁兰酶WXP03在pH 4.0-4.5之间都表现出较高酶活力，酶活保持在90%以上，在pH 4.5时酶活力达到最高，可见WXP03有较好的耐酸性。在pH4.0-5.0范围内酶活保持在80%以上。可见WXP03是一种酶活范围比较宽泛的普鲁兰酶，其稳定pH范围比BnP2偏向酸性而相对BdP8倾向于碱性，因此可以有不同的应用。图16所示是WXP03在最适pH 4.5条件下，在50 ℃、55 ℃和60 ℃的热稳定性。重组普鲁兰酶WXP03在保温的最初1 h内酶活下降较快，以后酶活缓慢下降。在50 ℃和55 ℃下酶活稳定性较高，其中在50 ℃下保温6 h后酶活仍保留80%，而55 ℃下保温6 h酶活保留70%。进一步研究显示WXP03在pH 4.5的柠檬酸-磷酸二氢钾缓冲液中，55℃条件下的酶活半衰期为18 h，50℃条件下为30 h。用材料方法中方法4检测纯酶的蛋白含量，进一步推算比酶活，结果是在最适pH4.5条件下，WXP03的比酶活大约为：206.5 U/mg。表
1、2中，将普鲁兰酶嵌合体WXP03与BdP8、BnP2的性质进行比较。

[0181] 表1 三种普鲁兰酶pH4.5条件下酶学性质比较

[0182]

[0183] 注：酶活半衰期是纯酶在pH 4.5条件下测得，比酶活是用纯酶在最适pH及最适温度条件下测得。

[0184] 表2 三种普鲁兰酶pH4.0条件下酶学性质比较

[0185]

[0186] 注：酶活半衰期是在pH 4.0条件下测得，比酶活是在最适pH及最适温度条件下测得。

[0187] 由表1、2可见，WXP03的比酶活与BnP2接近，具有较高的比酶活，而其最适pH在4.5，能较好的达到传统的以黑曲霉来源的糖化酶进行的糖化工艺中的耐酸性要求。另外目前在糖化时也经常采用pH4.0和55℃的条件以达到防止杂菌生长而污染糖液，糖化时间一般为24 h，在这一条件下WXP03在大约12 h内保持50%的酶活，因此可以通过在糖化进行到12 h后再次加酶的方式进行应用，因此也有一定的应用价值。WXP03在pH4.5-5.0范围内也比较稳定，因此是一种适应pH比较宽泛的酶，在与真菌淀粉酶等配合进行麦芽糖生产时也有一定的应用前景。

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一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株

一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕

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