重组的以黄热病病毒为载体的疫苗
阅读：228发布：2023-03-10
专利汇可以提供重组的以黄热病病毒为载体的疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种黄热病病毒载体，在其基因组中插入外源多肽表达组件，所述表达组件从5′至3′依次具有：(a)5′端释放元件；(b)编码外源多肽的基因元件；和(c)3′端释放元件，所述的释放元件选自：编码 口 蹄 疫 病毒自身 水 解 酶的核苷酸序列、编码 信号 肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合。该载体可在宿主细胞中提供病毒及 肿瘤 的 抗原 性多肽，从而引发针对病毒及肿瘤的免疫反应。，下面是重组的以黄热病病毒为载体的疫苗专利的具体信息内容。
1.一种黄热病病毒载体，其特征在于，在所述的黄热病病毒的基因组中插入外源多肽表达组件，所述的表达组件从5’至3’依次具有以下元件：(a)5’端释放元件，所述的5’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合；(b)编码外源多肽的基因元件，所述外源多肽的分子量为10-150Kda；(c)3’端释放元件，所述的3’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合，所述的表达组件插入黄热病病毒基因组的编码区，且不引起黄热病病毒的基因组序列发生移码；其中所述的黄热病病毒基因组缺失了以下黄热病病毒结构蛋白基因序列：C蛋白。
2.如权利要求1所述的黄热病病毒载体，其特征在于，所述的外源多肽是病毒蛋白或癌相关蛋白。
3.如权利要求1所述的黄热病病毒载体，其特征在于，所述的外源多肽的基因元件是全长的SARS-冠状病毒的S1基因、N基因、S基因、S2基因、M基因或上述基因的片段或其组合。
4.如权利要求1所述的黄热病病毒载体，其特征在于，所述的表达组件插入黄热病病毒基因组的位点选自下组：(i)NS2B编码区和NS3编码区之间；(ii)E编码区和NS1编码区之间；(iii)C编码区和prM编码区之间。
5.如权利要求1所述的黄热病病毒载体，其特征在于，所述的5’端释放元件和3’端释放元件都是SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的黄热病病毒载体，其特征在于，所述的5’端释放元件是编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的黄热病病毒载体，其特征在于，所述外源多肽的分子量为20-100Kda。
8.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的黄热病病毒载体和药学上可接受的载体。
9.权利要求1所述的黄热病病毒载体的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗性疫苗。
10.一种制备黄热病病毒的方法，其特征在于，包括步骤：(1)将黄热病病毒基因组引入包装细胞，其中所述的黄热病病毒基因组中插入了外源多肽表达组件，所述的表达组件从5’至3’依次具有以下元件：(a)5’端释放元件，所述的5’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合；(b)编码外源多肽的基因元件，所述外源多肽的分子量为10-150Kda；(c)3’端释放元件，所述的3’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合，且所述的基因组缺失了以下的结构蛋白基因序列：C蛋白，并且重组后的基因组保留了自我复制功能；而所述的包装细胞选自下组：(i)被含所述病毒基因组缺失的结构蛋白基因的质粒所转染的细胞，(ii)被含所述病毒基因组缺失的结构蛋白基因的辅助病毒载体所转染的细胞，和(iii)基因组整合有所述病毒基因组缺失的结构蛋白基因的细胞；(2)培养步骤(1)的包装细胞；(3)从培养物中分离出重组黄热病病毒。
重组的以黄热病病毒为载体的疫苗
技术领域
背景技术
黄热(病)病毒(yellow fever vaccine，YFV)呈球形，直径40-50nm，由包膜和核壳体构成，核壳体由衣壳蛋白(C)与核酸构成，包膜表面有囊膜糖蛋白(E)刺突，囊膜内尚有内膜蛋白(M)，参与病毒的装配。病毒基因组为单股正链RNA，全长11kb，自5’至3’端依次编码结构蛋白C、M、E以及非结构蛋白NS1-NS5，病毒RNA在细胞浆内直接起mRNA作用，翻译出结构蛋白和非结构蛋白。
由黄热病病毒感染引起的黄热病(yellow fever，YF)为人畜共患病，目前还不能被彻底根除，但通过在黄热病爆发流行或在进入黄热病流行地区前接种17D黄热病病毒疫苗，以及在黄热病流行的地区对儿童进行黄热病病毒疫苗的常规免疫接种，可以有效的降低人群的患病率。
17D黄热病病毒疫苗(17D yellow fever vaccine)为减毒活疫苗，于1937年由MaxTheiler和Simth发明，是世界卫生组织(WHO)认定的标准安全疫苗，亦是目前生产使用的唯一安全有效预防黄热病的疫苗。(Monath TP.Stability of yellow fever vaccine.Dev Biol Stand 1996；87：219-25)于1945年建立的17D黄热病病毒疫苗的病毒种子库有效地解决了疫苗灭活条件不稳定的情况，并使17D黄热病病毒疫苗得以普遍安全的使用，自1945年，疫苗在全球的使用量超过4亿支。免疫接种后，10天内可引发免疫，有效率可达95％以上，并且可检测到病毒中和抗体的期限可达35年。
17D黄热病病毒疫苗对成人免疫的血清转化率达93.8％，对6个月大婴儿和9个月大婴儿免疫的血清转化率可分别达98.6％和98％。(Osei-Kwasi M，Dunyo SK，Koram KA，etal.Antibody response to 17D yellow fever vaccine in Ghanaian infants.Bull WorldHealth Organ 2001；79(11)：1056-9)由17D黄热病病毒疫苗免疫接种而引起的严重副作用及疫苗的病毒突变率均非常罕见，几乎不存在回复野生型的可能性，因此其有效性及安全性已得到了充分验证。
严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS)，在中国大陆又称传染性非典型性肺炎(简称非典)，是一种主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播的传染性很强的呼吸道传染病，最初于2002年11月在中国大陆的广东省发现，并迅速波及亚洲、北美洲、欧洲等33个国家和地区。SARS的临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象。起病急，以发热为首发症状，体温一般高于38℃，偶有畏寒；可伴有头痛、关节酸痛、肌肉酸痛、乏力、腹泻；可有咳嗽，多为干咳、少痰，偶有血丝痰；可有胸闷，严重者出现呼吸加速，气促，或明显呼吸窘迫。致死率约3.5％。SARS不同于一般感冒，一般感冒的病症包括发烧，咳嗽，头痛，可在数日后转好，并且一般没有肺炎迹象。
2003年4月16日，世界卫生组织正式宣布SARS的病原体是一种新的冠状病毒，并正式命名为SARS冠状病毒(SARS coronarivus)。
SARS冠状病毒为ssRNA(+)病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。在电镜下，病毒颗粒呈不规则形，直径约为60-220nm，其表面有梅花形的膜粒，状如皇冠。颗粒中心在负染电镜下呈不定形态，核壳体呈疏松状态。SARS冠状病毒的结构蛋白包括刺突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、跨膜蛋白(M)与核衣壳蛋白(N)。S蛋白与病毒的感染性密切相关，介导病毒与宿主细胞的受体结合及病毒包膜与宿主细胞膜的融合，该蛋白是冠状病毒保护性免疫的主要抗原。M蛋白参与包膜形成，在病毒出芽释放过程中起重要作用。N蛋白参与病毒RNA的包装及核衣壳的形成，并协助S蛋白抗体的产生。在一些亚类中，还有第三种糖蛋白，HE红细胞凝集素酯酶。基因组RNA与碱性磷酸蛋白N结合。
SARS疫情的爆发，在世界范围引起了很大的震动。为了有效地控制和预防SARS，人们正在开发各种SARS疫苗，其中主要有五种类型：灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒病毒载体疫苗。其中以减毒病毒载体疫苗最受青睐，被认为是技术含量最高、最有希望成功的SARS疫苗。许多研究所和公司都选择了以减毒腺病毒载体研制SARS疫苗。
然而，现有的以减毒腺病毒载体研制疫苗的技术存在以下缺陷：(1)大多数人(55％)体内有腺病毒抗体，接种疫苗时，抗体与腺病毒载体结合，严重影响疫苗效果；(2)高滴度时，细胞毒性较大；(3)载体有回复野生型的可能性，存在安全隐患。
WO0153467公开了一种重组黄病毒，其中包括可编码外源氨基酸序列的外源核苷酸序列。用重组黄病毒感染宿主细胞，可在宿主细胞中提供外源核酸，并产生由外源核酸编码的抗原性多肽，进而引发对外源多肽的免疫应答。然而，其缺点是(a)使用了可自主复制增殖的黄热病病毒，保留了全部的黄热病病毒基因组序列，没有结构蛋白基因的缺失。(b)插入的外源序列仅为约30个核苷酸的小片段基因序列，不太适合插入长度超过300bp的片段，尤其长度超过1000bp的片段。(c)所用的蛋白酶解切割位点的切割效果还不十分令人满意。
因此，本领域迫切需要开发更安全更有效的用于预防SARS等病毒性疾病的疫苗。
由黄热病病毒感染引起的黄热病(yellow fever，YF)为人畜共患病，目前还不能被彻底根除，但通过在黄热病爆发流行或在进入黄热病流行地区前接种17D黄热病病毒疫苗，以及在黄热病流行的地区对儿童进行黄热病病毒疫苗的常规免疫接种，可以有效的降低人群的患病率。
17D黄热病病毒疫苗(17D yellow fever vaccine)为减毒活疫苗，于1937年由MaxTheiler和Simth发明，是世界卫生组织(WHO)认定的标准安全疫苗，亦是目前生产使用的唯一安全有效预防黄热病的疫苗。(Monath TP.Stability of yellow fever vaccine.Dev Biol Stand 1996；87：219-25)于1945年建立的17D黄热病病毒疫苗的病毒种子库有效地解决了疫苗灭活条件不稳定的情况，并使17D黄热病病毒疫苗得以普遍安全的使用，自1945年，疫苗在全球的使用量超过4亿支。免疫接种后，10天内可引发免疫，有效率可达95％以上，并且可检测到病毒中和抗体的期限可达35年。
17D黄热病病毒疫苗对成人免疫的血清转化率达93.8％，对6个月大婴儿和9个月大婴儿免疫的血清转化率可分别达98.6％和98％。(Osei-Kwasi M，Dunyo SK，Koram KA，etal.Antibody response to 17D yellow fever vaccine in Ghanaian infants.Bull WorldHealth Organ 2001；79(11)：1056-9)由17D黄热病病毒疫苗免疫接种而引起的严重副作用及疫苗的病毒突变率均非常罕见，几乎不存在回复野生型的可能性，因此其有效性及安全性已得到了充分验证。
严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS)，在中国大陆又称传染性非典型性肺炎(简称非典)，是一种主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播的传染性很强的呼吸道传染病，最初于2002年11月在中国大陆的广东省发现，并迅速波及亚洲、北美洲、欧洲等33个国家和地区。SARS的临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象。起病急，以发热为首发症状，体温一般高于38℃，偶有畏寒；可伴有头痛、关节酸痛、肌肉酸痛、乏力、腹泻；可有咳嗽，多为干咳、少痰，偶有血丝痰；可有胸闷，严重者出现呼吸加速，气促，或明显呼吸窘迫。致死率约3.5％。SARS不同于一般感冒，一般感冒的病症包括发烧，咳嗽，头痛，可在数日后转好，并且一般没有肺炎迹象。
2003年4月16日，世界卫生组织正式宣布SARS的病原体是一种新的冠状病毒，并正式命名为SARS冠状病毒(SARS coronarivus)。
SARS冠状病毒为ssRNA(+)病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。在电镜下，病毒颗粒呈不规则形，直径约为60-220nm，其表面有梅花形的膜粒，状如皇冠。颗粒中心在负染电镜下呈不定形态，核壳体呈疏松状态。SARS冠状病毒的结构蛋白包括刺突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、跨膜蛋白(M)与核衣壳蛋白(N)。S蛋白与病毒的感染性密切相关，介导病毒与宿主细胞的受体结合及病毒包膜与宿主细胞膜的融合，该蛋白是冠状病毒保护性免疫的主要抗原。M蛋白参与包膜形成，在病毒出芽释放过程中起重要作用。N蛋白参与病毒RNA的包装及核衣壳的形成，并协助S蛋白抗体的产生。在一些亚类中，还有第三种糖蛋白，HE红细胞凝集素酯酶。基因组RNA与碱性磷酸蛋白N结合。
SARS疫情的爆发，在世界范围引起了很大的震动。为了有效地控制和预防SARS，人们正在开发各种SARS疫苗，其中主要有五种类型：灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒病毒载体疫苗。其中以减毒病毒载体疫苗最受青睐，被认为是技术含量最高、最有希望成功的SARS疫苗。许多研究所和公司都选择了以减毒腺病毒载体研制SARS疫苗。
然而，现有的以减毒腺病毒载体研制疫苗的技术存在以下缺陷：(1)大多数人(55％)体内有腺病毒抗体，接种疫苗时，抗体与腺病毒载体结合，严重影响疫苗效果；(2)高滴度时，细胞毒性较大；(3)载体有回复野生型的可能性，存在安全隐患。
WO0153467公开了一种重组黄病毒，其中包括可编码外源氨基酸序列的外源核苷酸序列。用重组黄病毒感染宿主细胞，可在宿主细胞中提供外源核酸，并产生由外源核酸编码的抗原性多肽，进而引发对外源多肽的免疫应答。然而，其缺点是(a)使用了可自主复制增殖的黄热病病毒，保留了全部的黄热病病毒基因组序列，没有结构蛋白基因的缺失。(b)插入的外源序列仅为约30个核苷酸的小片段基因序列，不太适合插入长度超过300bp的片段，尤其长度超过1000bp的片段。(c)所用的蛋白酶解切割位点的切割效果还不十分令人满意。
因此，本领域迫切需要开发更安全更有效的用于预防SARS等病毒性疾病的疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种表达SARS冠状病毒抗原的黄热病病毒载体及含该载体的重组SARS疫苗。
在本发明的第一方面，提供了一种黄热病病毒载体，在所述的黄热病病毒的基因组中插入外源多肽表达组件，所述的表达组件从5’至3’依次具有以下元件：(a)5’端释放元件，所述的5’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合：(b)编码外源多肽的基因元件；(c)3’端释放元件，所述的3’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合，所述的表达组件插入黄热病病毒基因组的编码区，且不引起黄热病病毒的基因组序列发生移码。
在另一优选例中，所述的外源多肽是病毒蛋白或癌相关蛋白。
在另一优选例中，所述的外源多肽的基因元件是全长的SARS-冠状病毒的S1基因、N基因、S基因、S2基因、M基因或上述基因的片段或其组合。
在另一优选例中，所述的表达组件插入黄热病病毒基因组的位点选自下组：(i)NS2B编码区和NS3编码区之间；(ii)E编码区和NS1编码区之间；(iii)C编码区和prM编码区之间。
在另一优选例中，所述的5’端释放元件和3’端释放元件都是SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的5’端释放元件是编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的黄热病病毒基因组缺失了部分黄热病病毒结构蛋白基因序列，所述缺失的结构蛋白基因序列选自下组：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明上述的黄热病病毒载体和药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面，提供了本发明所述的黄热病病毒载体的用途，它们被用于制备预防或治疗性疫苗。
在本发明的第四方面，提供了一种制备黄热病病毒的方法，包括步骤：(1)将黄热病病毒基因组引入包装细胞，其中所述的黄热病病毒基因组中插入了外源多肽表达组件，所述的表达组件从5’至3’依次具有以下元件：(a)5’端释放元件，所述的5’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合：(b)编码外源多肽的基因元件；(c)3’端释放元件，所述的3’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合，且所述的基因组缺失了选自下组的结构蛋白基因序列：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合，并且重组后的基因组保留了自我复制功能；而所述的包装细胞选自下组：(i)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的质粒转染的细胞，(ii)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的辅助病毒载体转染的细胞，和(iii)基因组整合有所述病毒缺失的结构蛋白基因的细胞；(2)培养步骤(1)的包装细胞；(3)从培养物中分离出重组黄热病病毒。
附图说明
图1为黄热病病毒的RNA基因结构示意图。
图2为把黄热病病毒RNA转化成三段黄热病病毒cDNA片段的流程图。
图3为制备全长的黄热病病毒cDNA克隆的流程图。
图4为制备插入点在黄热病病毒cDNA的NS2B和NS3之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的冠状病毒疫苗的流程图。
图5为制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的冠状病毒疫苗的流程图。
图6为制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)和信号肽水解酶底物的基因片段修饰的冠状病毒疫苗的流程图。
图7为制备插入点在黄热病病毒cDNA的C和prM之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的冠状病毒疫苗的流程图。
图8为制备含有YFV亚基因组的SARS疫苗和HBV疫苗的流程图。
在本发明的第一方面，提供了一种黄热病病毒载体，在所述的黄热病病毒的基因组中插入外源多肽表达组件，所述的表达组件从5’至3’依次具有以下元件：(a)5’端释放元件，所述的5’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合：(b)编码外源多肽的基因元件；(c)3’端释放元件，所述的3’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合，所述的表达组件插入黄热病病毒基因组的编码区，且不引起黄热病病毒的基因组序列发生移码。
在另一优选例中，所述的外源多肽是病毒蛋白或癌相关蛋白。
在另一优选例中，所述的外源多肽的基因元件是全长的SARS-冠状病毒的S1基因、N基因、S基因、S2基因、M基因或上述基因的片段或其组合。
在另一优选例中，所述的表达组件插入黄热病病毒基因组的位点选自下组：(i)NS2B编码区和NS3编码区之间；(ii)E编码区和NS1编码区之间；(iii)C编码区和prM编码区之间。
在另一优选例中，所述的5’端释放元件和3’端释放元件都是SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的5’端释放元件是编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的黄热病病毒基因组缺失了部分黄热病病毒结构蛋白基因序列，所述缺失的结构蛋白基因序列选自下组：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明上述的黄热病病毒载体和药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面，提供了本发明所述的黄热病病毒载体的用途，它们被用于制备预防或治疗性疫苗。
在本发明的第四方面，提供了一种制备黄热病病毒的方法，包括步骤：(1)将黄热病病毒基因组引入包装细胞，其中所述的黄热病病毒基因组中插入了外源多肽表达组件，所述的表达组件从5’至3’依次具有以下元件：(a)5’端释放元件，所述的5’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合：(b)编码外源多肽的基因元件；(c)3’端释放元件，所述的3’端释放元件选自：SEQ ID NO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合，且所述的基因组缺失了选自下组的结构蛋白基因序列：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合，并且重组后的基因组保留了自我复制功能；而所述的包装细胞选自下组：(i)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的质粒转染的细胞，(ii)被含所述病毒缺失的结构蛋白基因的辅助病毒载体转染的细胞，和(iii)基因组整合有所述病毒缺失的结构蛋白基因的细胞；(2)培养步骤(1)的包装细胞；(3)从培养物中分离出重组黄热病病毒。
附图说明
图1为黄热病病毒的RNA基因结构示意图。
图2为把黄热病病毒RNA转化成三段黄热病病毒cDNA片段的流程图。
图3为制备全长的黄热病病毒cDNA克隆的流程图。
图4为制备插入点在黄热病病毒cDNA的NS2B和NS3之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的冠状病毒疫苗的流程图。
图5为制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的冠状病毒疫苗的流程图。
图6为制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)和信号肽水解酶底物的基因片段修饰的冠状病毒疫苗的流程图。
图7为制备插入点在黄热病病毒cDNA的C和prM之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的冠状病毒疫苗的流程图。
图8为制备含有YFV亚基因组的SARS疫苗和HBV疫苗的流程图。
具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究，开发了一种预防病毒性疾病(如SARS)的疫苗，此疫苗是在黄热病病毒的基因组中插入两侧带有释放元件的病毒抗原多肽的基因元件，其中释放元件是口蹄疫病毒的基因片段(2A)和/或信号肽水解酶底物的基因片段。采用上述结构的表达组件时，不仅能够使SARS病毒、HBV等抗原多肽的基因元件稳定地存在于黄热病病毒的基因组中，而且在黄热病病毒感染宿主细胞时能够有效地释放出抗原性多肽，从而有效地激发免疫应答。在此基础上完成了本发明。
术语如本文所用，“外源多肽的基因元件”指编码外源多肽的核酸序列。
如本文所用，“外源多肽”指天然黄热病毒基因组不编码的多肽，例如各种抗原、抗原决定簇、细胞因子、生长因子、多肽类激素、酶、受体、抗体和/或癌相关蛋白。特别优选的外源多肽是SARS病毒、HBV病毒、HCV病毒、HIV病毒的抗原多肽、癌抗原多肽，尤其是分子量为1-200Kda，较佳地为10-150Kda，更佳地20-100Kda或更大的抗原多肽。例如，“SARS抗原性多肽”指任何能够引起针对SARS病毒的免疫应答的多肽，代表性的例子包括S蛋白、N蛋白等。抗原性多肽可以是全长蛋白或其片段。抗原性多肽可以是天然的，也可以是突变的。
如本文所用，“释放元件”指位于外源多肽的基因元件两侧的核酸序列，当与外源多肽的基因元件一起翻译成蛋白质后，用于释放完整的、不含无关序列的外源多肽。释放元件包括5’端释放元件和3’端释放元件。优选的5’和3’端释放元件选自：SEQ IDNO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合。在抗原性基因元件任一侧的释放元件通常为一个，但也可以是多个。
如本文所用，术语“外源多肽表达组件”指具有以下结构的一段核酸序列：5’端释放元件-外源多肽的基因元件-3’端释放元件外源多肽表达组件可以不包含启动子、起始密码子和终止密码子。当该外源多肽表达组件插入黄热病病毒基因组后，会与黄热病病毒的核苷酸序列一起表达一个大前体蛋白。然后，在该前体蛋白的后期加工过程中，水解酶会酶切5’端和3’端释放元件所编码的氨基酸序列后，从而释放出外源多肽(如SARS抗原性多肽)。
术语“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的肽诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“抗原性多肽”或“抗原性肽”指可引发哺乳动物免疫应答的氨基酸序列，无论是单独或与辅助分子结合(如I或II类主要组织相容性抗原分子)。
本文所用的术语“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)导致的疾病的发作。
如本文所用，术语“对象”或“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些易受黄病毒(如黄热病病毒)感染的对象，如可以支持黄热病病毒复制的对象。
“生物样品”包括从生物体得到，且可用于诊断或监测分析的各种样品类型。该术语包括血样和其它生物性液体样品、固态组织样品(如活组织检查样品或组织培养物或由其衍生的细胞及它的子代)。该术语包括在购置后以任何方法操作的样品，如用试剂处理、溶液化或富集其某些成分。该术语包括临床样品，还包括细胞培养物、细胞上清液、细胞溶解产物、血清、血浆、生物液体和组织样品。
重组的黄热病病毒载体可从公用数据库(包括，如GenBank)获得若干YFV毒株的核苷酸序列。示范毒株是“YFV 17D”。可在GenBank登记号X03700获得YFV基因组的核苷酸序列以及可编码病毒多蛋白的氨基酸序列。黄热病病毒颗粒的生产是本领域所熟知的。
本发明所述的YFV基因组，可以是全基因组，也可以是缺失部分核酸序列的亚基因组。在本发明的一个实施方案中，所述的YFV基因组是全基因组。在本发明的另一个实施方案中，所述的YFV基因组是缺失了部分结构蛋白基因序列的亚基因组，其中，缺失的结构蛋白基因序列选自下列基因：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合。
在本发明中，外源多肽表达组件可以位于黄热病病毒基因组的不同位点。作为非限制性例子，可将外源核酸序列插入以下的一个或多个位置：(1)病毒多肽的N-末端；(2)病毒蛋白质C和prM之间；(3)病毒蛋白质NS2A和NS2B之间；(4)病毒蛋白质NS2B和NS3之间；(5)病毒蛋白质NS3和NS4A之间；(5)NS4A和NS4B之间；(6)E编码区和NS1编码区之间。外源核酸可插入黄热病病毒基因组的其它位点。最好是，外源核酸的插入不破坏黄热病病毒蛋白质的功能、和/或病毒多肽的蛋白水解加工、和/或病毒的复制。
以SARS抗原性多肽为例，当使用本发明的黄热病病毒载体感染宿主细胞时，重组的黄热病病毒编码含有SARS冠状病毒的抗原多肽的重组多蛋白前体。该重组多蛋白前体通过2A自身水解酶和/或信号肽水解酶酶解加工，从而释放出SARS冠状病毒的抗原多肽。用重组后的黄热病病毒感染宿主细胞，可在宿主细胞中提供SARS冠状病毒抗原性多肽的编码序列，并产生相应的抗原多肽，从而引发针对SARS冠状病毒抗原多肽的免疫反应。因此，本发明的重组的黄热病病毒载体可用作预防SARS的疫苗。
与仅可产生一轮抗原病毒表达的其它载体和/或会停止表达的其它载体不同，本发明的活性重组病毒会持续繁殖直到免疫系统被充分活化从而制止感染。与用常规表达载体(如病毒复制子)所引发的免疫应答相比，这样就会产生更强的(针对SARS抗原性肽)的免疫应答。
药物组合物本发明还提供了包含本发明的重组黄热病病毒的各种组合物，包括药用组合物，尤其是疫苗组合物。
包含本发明的重组黄热病病毒的各种组合物可以包含按重组黄热病病毒的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington：药学和药学实践”，第19版(1995)Mack Publishing Co.。
可将药用组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂、和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。
当用作疫苗时，本发明的重组黄热病病毒可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。
另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’s TiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分。
给药途径和剂量当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组黄热病病毒施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式时，除有重组YFV病毒以外，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。
给药的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予重组黄热病病毒疫苗，即重组黄热病病毒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗SARS病毒感染或SARS症状。
在各疫苗剂份中所选用的重组黄热病病毒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1-1000μg，较佳地为1-200μg，更佳地10-100μg蛋白质。以重组黄热病病毒核酸为基础计算的疫苗有效剂量，通常包括给予约1-1000μg核酸。另外，重组黄热病病毒疫苗的有效剂量的一般范围为约102-107，103-106或104-105空斑形成单位(PFU)。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
与现有技术相对，本发明的主要优点在于：(1)安全性好。作为载体病毒，黄热病病毒是WHO认定的标准安全疫苗，已应用近七十年，副反应发生率接近千万分之一。
(2)免疫效果好。一次接种几天即可见效，并可长期保持免疫力(通常10年以上)。
(3)中国人体内没有黄热病病毒抗体，基本上不会影响疫苗的效果。
(4)适合生产，生产工艺和质量标准容易建立，利用现有设施生产，生产成本低。
(5)本发明释放元件对长的外源多肽的释放效率更高，与缺失部分结构基因的YFV结合可以表达500氨基酸或更长的外源多肽。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1黄热病病毒疫苗的全长cDNA克隆的制备构建过程如图1、图2、图3所示：1.把全长的黄热病病毒疫苗cDNA整合到pRS424质粒(Plasmid)内，所述的黄热病病毒疫苗Yellow Fever virus Strain 17D(YF 17D)和pRS424质粒(ATCC#：77105)，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
a)用RT-PCR的方法把黄热病病毒YF 17D的RNA转化成三段黄热病病毒cDNA片段(5’端cDNA，3’端cDNA和中间段cDNA)，在5’端cDNA片段的5’端加上Not I酶切位点和Sp6增强子序列；在5’端cDNA片段的3’端是YF cDNA的EcoR I酶切位点；在3’端片段的3’端加上Xho I酶切位点；在中间片段的两头包括部分与5’端cDNA片段的3’端和3’端cDNA片段的5’端相同的基因序列。
所使用的DNA引物的序列如下：
b)获得三个黄热病病毒片段，长度分别为2280bp，6130bp，和2580bp。
c)先把5’端片段，然后把3’端片段，通过连接的方法克隆到pRS424质粒内。
d)利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，把中间片段cDNA插到上述克隆中，产生全长的黄热病病毒cDNA克隆。
实施例2制备插入点在黄热病病毒cDNA的NS2B和NS3之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的SARS疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的4572-4573nt)构建过程如图4所示。
1.把实施例1获得的全长的黄热病病毒cDNA克隆用Kpn I内切酶和Nhe I内切酶切去一约2.2kb长的片段，此片段包括黄热病病毒cDNA序列第3445-5576位的碱基。
2.以黄热病病毒cDNA克隆为模板，分别以GGATACAAGGTTCAGACGAAC(SEQID NO：10)和AACCATCGATTCGGGGCCAGGGTTGGACTCGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCA AAATTCAACAGCTGCATATGCCACAAGACATCCCCACTTCTC(SEQ ID NO：11)为一对引物；并以AACCCTGGCCCCGAATCGATGGTTCGAGGCGCGCGACGCAGCGGTGACGTACTCTGGGATAT TCCCACTCCTAAGATCATC(SEQ IDNO：12)和CGCTGCCCAACCTCTAGCGGC(SEQ ID NO：13)为另一对引物，然后用PCR的方法产生两个DNA片段，在其中引入一个2A的基因序列，所述的2A的基因序列是口蹄疫病毒的基因片段，由六十个碱基组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结成在NS2B和NS3基因之间内含口蹄疫病毒的2A的DNA片段，其5’端和3’端包括大约50bp的DNA序列分别与Kpn I酶切点和Nhe I酶切点相邻序列相同。
3.把步骤1中所述的切去约2.2kb长片段的黄热病病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，上述片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
4.含SARS冠状病毒(SARS coronarivus)S1基因的DNA质粒B21和H21可从BritishColumbia Cancer Agency，Canada获得。S1基因的全序列如SEQ ID NO：3所示。
以CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTGGCCGGCGATGTGGAATCAAATCCCGGGCCTATGTTTATTTTCTTATTATTTCTT(SEQ ID NO：14)和GGTGGGGTGCAAGGTTTGCCATCA(SEQ ID NO：15)为引物，以DNA质粒B21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原5’端的部分DNA片段。
以CCTTTGAGAGAGACATATCTAATG(SEQ ID NO：16)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGCTCAGCTCCTATAAGACAGCC(SEQ IDNO：17)为引物，以DNA质粒H21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原3’端的部分DNA片段。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结成完整的S1DNA片段(SARS冠状病毒-S1-2A)，其5’端和3’端包括2A的序列。
5.用Afl II内切酶将步骤3中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
6.把线性化的重组黄热病病毒cDNA和步骤4中产生的SARS冠状病毒-S1-2A片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，SARS冠状病毒-S1-2A片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒(简称重组黄热病病毒，rYFV)cDNA。
7.用XhoI内切酶将步骤6中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
8.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)将线性化的重组黄热病病毒cDNA转录成RNA。
9.用电穿孔法(electroporation)，把重组黄热病病毒RNA转染入宿主细胞BHK-21(Baby hamster kidney)(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)。
实施例3制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的SARS疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的2453-2454nt)构建过程如图5所示。
1.把全长的黄热病病毒cDNA克隆用Pst I切去一约1kb长的片段。此片段包括黄热病病毒cDNA序列第1959-2782位。
2.以黄热病病毒cDNA克隆为模板，分别以GTCAAGAACCCAACTGACACT(SEQ ID NO：18)和AAGGTCAAAATTCAACAGCTGAAAGAAGATGGCGCATCCTTG(SEQ ID NO：19)为一对引物；并以CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCCAACATGACAATGTCCATGAGC(SEQ ID NO：20)和CCAGACCCGGTTTGAAAACGG(SEQ ID NO：21)为另一对引物，然后用PCR的方法产生两个DNA片段，在其中引入一个2A的基因序列，所述的2A的基因序列是口蹄疫病毒的基因片段(SEQ ID NO：1)。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结产生一段在E和NS1基因之间内含口蹄疫病毒的2A的DNA片段，其5’端和3’端包括大约50bp的序列分别与Pst I相邻序列相同。
3.把步骤1中所述的切去约1kb长片段的黄热病病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，上述片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
4.按实施例2步骤4相同方法，获得完整的S1 DNA片段(SARS冠状病毒-S1-2A)，其5’端和3’端包括2A的序列。
5.用Afl II内切酶将步骤3中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
6.把线性化的重组黄热病病毒cDNA和步骤4中产生的SARS冠状病毒-S1-2A片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，SARS冠状病毒-S1-2A片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
7.用XhoI内切酶将步骤6中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
8.用DNA依赖性Sp6RNA聚合酶将线性化的重组黄热病病毒cDNA转录成RNA。
9.用电穿孔法，把重组黄热病病毒RNA转染入宿主细胞BHK-21(ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到重组的黄热病病毒颗粒。
实施例4制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)和信号肽水解酶底物的基因片段修饰的SARS疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的2453-2454nt)构建过程如图6所示。
1.把全长的黄热病病毒cDNA克隆用Pst I切去一约1kb长的片段。此片段包括黄热病病毒cDNA序列1959-2782。
2.按实施例3步骤2相同方法，获得一段在E和NS1基因之间内含口蹄疫病毒的2A的DNA片段，其5’端和3’端包括大约50bp的序列分别与Pst I相邻序列相同。
3.把步骤1中所述的切去约1kb长片段的黄热病病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，上述片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
4.以AGCATGATCTTGGTAGGAGTGATCATGATGTTTTTGTCTCCACAAGCCCAAGCCAGTGACCTTGACCGGTGCACCACT(SEQ ID NO：22)和GGTGGGGTGCAAGGTTTGCCATCA(SEQ ID NO：14)为引物，以DNA质粒B21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原5’端的部分DNA片段，同时在其5’端插入了修饰过的信号肽水解酶底物的基因片段序列(即SEQ ID NO：22中第40-54位，编码序列如SEQ ID NO：2所示的信号肽水解酶底物)；以CCTTTGAGAGAGACATATCTAATG(SEQ ID NO：16)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGCTCAGCTCCTATAAGACAGCC(SEQ ID NO：17)为引物，以DNA质粒H21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原3’端的部分DNA片段。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结成完整的S1 DNA片段(SARS冠状病毒-S1-2A)，其5’端包括黄热病病毒的蛋白质E的3’端序列和修饰过的信号肽水解酶底物基因片段，其3’端包括2A的序列。
5.用Afl II内切酶将步骤3中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
6.把线性化的重组黄热病病毒cDNA和步骤4中产生的SARS冠状病毒-S1-2A片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，SARS冠状病毒-S1-2A片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
7.用XhoI内切酶将步骤6中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
8.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶将线性化的重组黄热病病毒cDNA转录成RNA。
9.用电穿孔法(electroporation)，把重组黄热病病毒RNA转染入宿主细胞BHK-21(ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到重组的黄热病病毒颗粒。
实施例5：制备插入点在黄热病病毒cDNA的C和prM之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的SARS疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的482-483nt)构建过程如图7所示。
1.把全长的黄热病病毒cDNA克隆用Bsm I切去一约1kb长的片段。此片段包括黄热病病毒cDNA序列458-1514。
2.以黄热病病毒cDNA克隆为模板，分别以GCCAGTTTGATGAGAGGATTG(SEQ ID NO：23)和AGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCAAAATTCAACAGCTGCACTCCACCCGTCATCAACAG(SEQ ID NO：24)为一对引物；并以GGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCCTCCCATGATGTTCTGACTGTG(SEQ ID NO：25)和CTCTCTCCACACCCCGCCACT(SEQ ID NO：26)为另一对引物，然后用PCR的方法产生两个DNA片段，在其中引入一个2A的基因序列(SEQ ID NO：1)。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结产生一段在C和prM基因之间内含口蹄疫病毒的2A的DNA片段，其5’端和3’端包括大约50bp的序列分别与Bsm I相邻序列相同。
3.把步骤1中所述的切去约1kb长片段的黄热病病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，上述片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
4.以TTCCTAATTTTGGGAATGCTGTTGATGACGGGTGGAGTGAGTGACCTTGACCGGTGCACCACT(SEQ ID NO：27)和GGTGGGGTGCAAGGTTTGCCATCA(SEQ ID NO：28)为引物，以DNA质粒B21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原5’端的部分DNA片段。以CCTTTGAGAGAGACATATCTAATG(SEQ ID NO：16)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGCTCAGCTCCTATAAGACAGCC(SEQ ID NO：17)为引物，以DNA质粒H21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原3’端的部分DNA片段。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结成完整的S1 DNA片段(SARS冠状病毒-S1-2A)，其5’端包括黄热病病毒的蛋白质C的3’端序列，其3’端包括2A的序列。
5.用Afl II内切酶将步骤3中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
6.把线性化的重组黄热病病毒cDNA和步骤4中产生的SARS冠状病毒-S1-2A片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，SARS冠状病毒-S1-2A片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
7.用XhoI内切酶将步骤6中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
8.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶将线性化的重组黄热病病毒cDNA转录成RNA。
9.用电穿孔法，把重组黄热病病毒RNA转染入宿主细胞BHK-21(ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到重组的黄热病病毒颗粒。
实施例6：制备重组YFV亚基因组本实施例制备去除了YFV结构蛋白C序列的cDNA克隆。
1.将实施例5得到的含有SARS冠状病毒-S1序列的重组黄热病病毒cDNA克隆用Not I切成线性。
2.用常规的融合PCR方法，制得长384bp碱基的DNA片段，该片段对应于黄热病毒结构蛋白C基因但缺失了第179-409位核苷酸序列。
3.将线性的重组黄热病毒cDNA和384bp的cDNA片段转化酵母菌(ATCC 76628)，得到去除了YFV结构蛋白C序列的重组黄热病毒cDNA克隆(ΔC-rYFV cDNA)。
4.用Kpn I内切酶将步骤3中产生的ΔC-rYFV cDNA线性化。
5.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)将线性化的ΔC rYFV cDNA转录成RNA，即ΔC-rYFV RNA。
实施例7：制备含有YFV亚基因组的SARS疫苗参见图8。
1.以pCI(购自PROMEGA，USA)作为模板，以5’CMV和3’CMV作为引物，用PCR方法制备CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)的DNA片段(简称CMV)。CMV作为早期增强子和启动子，其长度为631bp。以实施例1得到的全长黄热病毒cDNA克隆为模板，以5’YFV5’end和3’YFV5’end作为引物，用PCR的方法制备YFV cDNA的5’端片段(简称YFV5’end)。以上述2个DNA片段作为模板，以5’CMV和3’YFV5’end作为引物，用fusingPCR的方法制备CMV-YFV 5’end的DNA片段(简称CMV-YFV 5’end)。
2.将步骤1产生的CMV-YFV 5’end与pRS424质粒(ATCC#：77105)用Not I和ApaI进行酶切。用Qiagen spin column(购自QIAGEN Inc.)对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶(购自New England Bio lab)连接，并转化至大肠杆菌内。筛选得到CMV-YFV 5’end克隆(简称pRS/CMV-YFV 5’end)。
3.以实施例1得到的全长黄热病毒cDNA为模板，以5’YFV3’end和3’YFV3’end作为引物，用PCR方法制备YFV cDNA的3’端片段(简称YFV 3’end)。以5’HDVr和3’HDVr作为引物，用融合PCR方法制备肝炎delta病毒抗原血症核酶(hepatitis delta virusantigenomic ribozyme，HDVr)的DNA片段(简称HDVr)。以pcDNA3(购自Invitrogen)作为模板，以5’pA和3’pA作为引物，用PCR的方法制备牛生长激素poly A(bovinegrowth hormone poly A，BGH pA)的DNA片段(简称pA)。以上述三个片段为模板，以5’YFV3’end和3’pA作为引物，用融合PCR方法制备YFV 3’end-HDVr-pA的DNA片段。
4.将上述步骤2生成的pRS/CMV-YFV5’end与步骤3生成的YFV3’end-HDVr-pA的DNA片段用Pml I和Sac II进行酶切，用Qiagen spin column对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶连接，并转化至大肠杆菌内。筛选得到pRS/CMV-YFV5’end-YFV3’end-HDVr-pA的克隆。
5.将上述步骤4生成的pRS/CMV-YFV5’end-YFV3’end-HDVr-pA的克隆用Pml I进行酶切，将实施例1得到的全长黄热病毒cDNA克隆用NotI和Kpn I进行酶切。将上述酶切产物进行纯化，并将纯化产物转化至酿酒酵母，利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，得到修饰后的全长YFVcDNA克隆(简称pRS/CMV/YFV)。
6.将步骤5产生的pRS/CMV/YFV用Stu I进行酶切，得到线性的pRS/CMV/YFV克隆。以GTGAAGGAAGAAGGAAAGGAGGAGCTCCAAGAGATCCCGCCTGAGGAACATGAGATCTTG(SEQ IDNO：37)和TGTTTCACCGCTGTCATTCAAGATCTCATGTTCCTCAGG(SEQ ID NO：38)为引物，用融合PCR方法生成一个78bp长的DNA片段，其序列为GTGAAGGAAGAAGGAAAGGAGGAGCTCCAAGAGATCCCGCCTGAGGAACATGAGATCTTGAATGACAGCGGTGAAACA(SEQ ID NO：39)。将上述线性的pRS/CMV/YFV克隆和78bp长的DNA片段一同转化至酵母菌(ATCC 76628)，利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，将线性的pRS/CMV/YFV克隆中部分YFV NS3编码区基因序列(nt 5126-6280)切除，得到NS3缺失的YFV cDNA克隆。
将上述步骤6产生的NS3缺失的YFV cDNA克隆和pcDNA3(购自INVITROGEN)同时转染BHK-21 cell(ATCC#：CCL-10)。该细胞培养一天后，转换为含有G418(购自SIGMA)的细胞培养液。用实施例6得到的ΔC rYFV RNA转化抗G418细胞株，挑选出包装细胞系。该细胞系的产量可以达到每毫升106重组黄热病毒颗粒(ΔC-rYFV)，即SARS疫苗。
实施例8制备插入点在黄热病病毒cDNA的NS2B和NS3之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的HBV疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的4572-4573nt)重复实施例2的步骤1-9，不同点仅在于用HBV抗原多肽替换SARS抗原多肽。具体地，在步骤4中，以CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTGGCCGGCGATGTGGAATCAAATCCCGGGCCTATGGAGAACATCACATCAGGATTC(SEQ ID NO：40)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGAATGTATACCCAAAGACAAAAGAA(SEQID NO：41)为引物，以HBV表面抗原(HBVsAg)基因的DNA质粒(ATCC#45020D)为模板，用常规PCR的方法产生HBVsAg DNA片段(HBVsAg-2A)，其5’端和3’端包括2A的序列。
结果，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)，其中在黄热病病毒cDNA的NS2B和NS3之间插入有HBVsAg基因。
实施例9制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的HBV疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的2453-2454nt)重复实施例3的步骤1-9，不同点仅在于用HBV抗原多肽替换SARS抗原多肽。具体地，在步骤4中按实施例7步骤4相同方法，获得HBVsAg DNA片段(HBVsAg-2A)，其5’端和3’端包括2A的序列。
结果，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)，其中在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间插入有HBVsAg基因。
实施例10制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)和信号肽水解酶底物的基因片段修饰的HBV疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的2453-2454nt)重复实施例4的步骤1-9，不同点仅在于用HBV抗原多肽替换SARS抗原多肽。具体地，在步骤4中，以AGCATGATCTTGGTAGGAGTGATCATGATGTTTTTGTCTCCACAAGCCCAAGCCATGGAGAACATCACATCAGGATTC(SEQ ID NO：42)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGAATGTATACCCAAAGACAAAAGAA(SEQ ID NO：41)为引物，以HBV表面抗原(HBVsAg)基因的DNA质粒(ATCC#45020D)为模板，用PGR的方法产生的HBVsAg DNA片段(HBVsAg-2A)，其5’端包括黄热病病毒的蛋白质E的3’端序列和修饰过的信号肽水解酶底物基因片段(编码如SEQ ID NO：2所示的信号肽水解酶底物)，PCR产生的HBVsAg DNA片段的3’端包括2A的序列。
结果，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)，其中在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间插入有HBVsAg基因。
实施例11：制备插入点在黄热病病毒cDNA的C和prM之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)和信号肽水解酶底物的基因片段修饰的HBV疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的482-483nt)重复实施例5的步骤1-9，不同点仅在于用HBV抗原多肽替换SARS抗原多肽，且3端释放元件为信号肽水解酶底物的基因片段。具体地，在步骤4中，以TTCCTAATTTTGGGAATGCTGTTGATGACGGGTGGAGTGATGGAGAACATCACATCAGGATTC(SEQ ID NO：43)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGAATGTATACCCAAAGACAAAAGAA(SEQ ID NO：41)为引物，以HBV表面抗原(HBVsAg)基因的DNA质粒(ATCC # 45020D)为模板，用PCR的方法产生的HBVsAg DNA片段(HBVsAg-2A)，其5’端包括黄热病病毒的蛋白质C的3’端序列和修饰过的信号肽水解酶底物基因片段，其3’端包括2A的序列。
结果，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)，其中在黄热病病毒cDNA的C和prM之间插入有HBVsAg基因。
实施例12：制备重组YFV亚基因组本实施例制备去除了YFV结构蛋白C序列的cDNA克隆。
重复实施例6的步骤1-5，不同点仅在于用含有HBsAg基因序列的重组黄热病病毒cDNA克隆替换含有SARS冠状病毒-S1序列的重组黄热病毒cDNA克隆。具体地，在步骤1中，将实施例11得到的含有HBsAg基因序列的重组黄热病病毒cDNA克隆用Acl I切成线性。
结果，得到去除了YFV结构蛋白C序列的cDNA克隆(ΔC-rYFV cDNA)，其中含有HBsAg的基因序列，进而得到ΔC-rYFV RNA。
实施例13：制备含有YFV亚基因组的HBV疫苗重复实施例7的步骤1-6。然后用实施例12得到的ΔC rYFV RNA转化实施例7得到的抗G418细胞株，获得包装细胞系。该细胞系的产量可以达到每毫升106重组黄热病毒颗粒(ΔC-rYFV)，即HBV疫苗。
实施例14：
小鼠抗SARS冠状病毒IgG检测在本实施例中，测试了实施例2-5和7制备的重组黄热病病毒颗粒(SARS冠状病毒疫苗)的免疫原性，进行了小鼠抗SARS冠状病毒IgG检测。方法如下：1.BALB/c小鼠共16只，随机分为两组，每组8只。组一于皮下注射105PFU重组黄热病病毒颗粒(0.5ml)，组二注射105PFU 17D黄热病病毒疫苗(0.5ml，作为对照)免疫小鼠。分别在注射后第0天、第7天、第14天、第21天、第28天从小鼠眼眶采血，血清在-70℃贮存。
2.用S300抗原包被酶联板(S300为SARS冠状病毒S蛋白第14-313位氨基酸，是将S300表达质粒转化大肠杆菌，表达出S300蛋白片段，经Ni-NTA亲和树脂纯化而制得)。
3.待检血清1∶50稀释，每孔加稀释后血清样品100微升，37℃孵育1h，洗板6次，每孔加入酶标记抗体(HRP-山羊抗小鼠IgG，1∶1000稀释)100微升，37℃孵育45min，加TMB/H2O2显色，硫酸终止反应后用酶标仪测定A450/A630。
4.判断标准：重组黄热病病毒颗粒免疫组小鼠血清的A450/A630与对照17D黄热病病毒疫苗组血清的平均值大于或等于2.1则抗体检测阳性。
检测结果如下：
结果表明，在第14天就产生了抗SARS抗体。实施例2-5的SARS疫苗也在第14天就产生了抗SARS抗体(第14天时比值T为2.2-2.6不等)。
实施例15：小鼠抗HBs IgG检测在本实施例中，测试了实施例8-11和13制备的重组黄热病病毒颗粒(HBV疫苗)的免疫原性，进行了小鼠抗HBs IgG检测。使用上海科华生物工程股份有限公司的酶免疫法检测HBsAg试剂盒，测定血清样品中抗-HBs IgG的效价，测试方法如下：1.BALB/c小鼠共8只，随机分为两组，每组4只。组一于左胫前肌肉注射105PFU重组黄热病病毒颗粒(0.5ml)，组二注射105PFU 17D黄热病病毒疫苗(0.5ml)免疫小鼠。2周后加强免疫一次，剂量同第一次。免疫后每天观测小鼠，并于加强免疫注射3周后摘除眼球取血，分离血清后置-20待检。
2.待检血清1∶50稀释，每孔加稀释后血清样品50微升，并设阳性及空白对照。
3.每孔加入酶结合物1滴(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37C孵育30分钟。
4.洗板6次，每孔加入显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，置37C孵育15分钟。
5.硫酸终止反应后用酶标仪测定A450/A630。
6.判断标准：重组黄热病病毒颗粒免疫组小鼠血清的A450/A630与对照17D黄热病病毒疫苗组血清的平均值大于或等于2.1则抗体检测阳性。
检测结果如下：
结果表明，在第35天就产生了抗-HBs。实施例8-11的HBV疫苗也在第35天就产生了抗-HBs(第35天时比值T为2.1-2.8不等)。
重组黄热病病毒颗粒(HBV疫苗)免疫4周后采血，分离血清，测定抗HBs平均几何滴度为650mIU/ml。
实施例16：黄热病病毒中和抗体测定黄热病病毒中和抗体测定采用蚀斑减少试验。采集实施例14、15中分别用重组黄热病病毒颗粒(SARS疫苗)、重组黄热病病毒颗粒(HBV疫苗)和17D黄热病病毒疫苗(对照)免疫小鼠7天后的血清。将三组血清分别与稀释好的黄热病病毒株(约200PFU/0.4ml)等量混合，同时将稀释好的病毒再1∶2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃孵育90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培育5天，染色，蚀斑计数，计算血清蚀斑减数中和效价，其中，病毒对照组的蚀斑平均数为80，重组黄热病病毒颗粒(SARS疫苗)的抗体中和效价为1∶20，重组黄热病病毒颗粒(HBV疫苗)的抗体中和效价为1∶20，17D黄热病病毒疫苗(阳性对照)的抗体中和效价为1∶20。
这表明，重组黄热病病毒颗粒(SARS疫苗及HBV疫苗)同17D黄热病病毒疫苗一样，免疫动物后产生的抗体可有效地中和黄热病病毒抗原，因而是安全的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海天甲生物医药有限公司美国天甲生物医药有限公司北京东方天甲科技发展有限公司<120>重组的以黄热病毒为载体的疫苗<130>034975<150>CN 03141721.3<151>2003-07-21<160>43<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>60<212>DNA<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)<400>1cagctgttga attttgacct tcttaagctt gcgggagacg tcgagtccaa ccctggcccc 60<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>信号肽水解酶底物<400>2Pro Gln Ala Gln Ala1 5<210>3<211>1920<212>DNA<213>SARS冠状病毒(SARS coronarivus)<400>3atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320
aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt 1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat 1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc 1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag 1920<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(51)<223>引物<400>4cgcggcggcc gcatttaggt gacactatag agtaaatcct gtgtgctaat t 51<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>5caccgtatga attcctttcc c 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>6ggagacaccg cctgggattt c 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>7cacgtagtac atttcatgag t 21<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物<400>8ccatacatgc cagatgttct tgagaaactg gaattgctcc aa 42<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物<400>9cccctcgagt ggttttgtgt ttgtcatcca 30<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>10ggatacaagg ttcagacgaa c 21<210>11<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(97)<223>引物<400>11aaccatcgat tcggggccag ggttggactc gtctcccgca agcttaagaa ggtcaaaatt 60caacagctgc atatgccaca agacatcccc acttctc 97<210>12<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(81)<223>引物<400>12aaccctggcc ccgaat cgat ggttcgaggc gcgcgacgca gcggtgacgt actctgggat 60attcccactc ctaagatcat c 81<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>13cgctgcccaa cctctagcgg c 21<210>14<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(84)<223>引物<400>14cagctgttga attttgacct tcttaagctg gccggcgatg tggaatcaaa tcccgggcct 60atgtttattt tcttattatt tctt 84<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物<400>15ggtggggtgc aaggtttgcc atca 24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物<400>16cctttgagag agacatatct aatg 24<210>17<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(81)<223>引物<400>17ggggccaggg ttggactcga cgtctcccgc aagcttaagc agatcgaagt tcaggagttg 60ctcagctcct ataagacagc c 81<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)<223>引物<400>18gtcaagaacc caactgacac t 21<210>19<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物<400>19aaggtcaaaa ttcaacagct gaaagaagat ggcgcatcct tg 42<210>20<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(81)<223>引物<400>20cagctgttga attttgacct tcttaagctt gcgggagacg tcgagtccaa ccctggcccc 60aacatgacaa tgtccatgag c 81<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>21ccagacccgg tttgaaaacg g 21<210>22<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(78)<223>引物<400>22agcatgatct tggtaggagt gatcatgatg tttttgtctc cacaagccca agccagtgac 60cttgaccggt gcaccact 78<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)
<223>引物<400>23gccagtttga tgagaggatt g 21<210>24<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(75)<223>引物<400>24agggttggac tcgacgtctc ccgcaagctt aagaaggtca aaattcaaca gctgcactcc 60acccgtcatc aacag 75<210>25<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(48)<223>引物<400>25ggagacgtcg agtccaaccc tggcccctcc catgatgttc tgactgtg 48<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>26ctctctccac accccgccac t 21<210>27<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(38)<223>引物<400>27aaatatgcgg ccgcttgaca ttgattattg actagtta 38<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物
<400>28aattagcaca caggatttac tcggttcact aaacgagctc tg 42<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>29agtaaatcct gtgtgctaat t 21<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物<400>30taccaccacg tgggctgtga tcttttttcc 30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物<400>31atcacagccc acgtggtggt agaaagacgg 30<210>32<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物<400>32gtggagatgc catgccgacc cagtggtttt gtgtttgtca tc 42<210>33<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(48)<223>引物<400>33gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccg 48
<210>34<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(55)<223>引物<400>34ctcccttagc catccgagtg gacgtgcgtc ctccttcgga tgcccaggtc ggacc 55<210>35<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物<400>35ccactcggat ggctaaggga gctagagctc gctgatcagc ct 42<210>36<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物<400>36tatatccgcg gagaatagaa tgacacctac tc 32<210>37<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(60)<223>引物<400>37gtgaaggaag aaggaaagga ggagctccaa gagatcccgc ctgaggaaca tgagatcttg 60<210>38<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(39)<223>引物<400>38tgtttcaccg ctgtcattca agatctcatg ttcctcagg 39<210>39<211>78<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(78)<223>寡核苷酸<400>39gtgaaggaag aaggaaagga ggagctccaa gagatcccgc ctgaggaaca tgagatcttg 60aatgacagcg gtgaaaca 78<210>40<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(84)<223>引物<400>40cagctgttga attttgacct tcttaagctg gccggcgatg tggaatcaaa tcccgggcct 60atggagaaca tcacatcagg attc 84<210>41<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(84)<223>引物<400>41ggggccaggg ttggactcga cgtctcccgc aagcttaagc agatcgaagt tcaggagttg 60aatgtatacc caaagacaaa agaa 84<210>42<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(78)<223>引物<400>42agcatgatct tggtaggagt gatcatgatg tttttgtctc cacaagccca agccatggag 60aacatcacat caggattc 78<210>43<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(63)<223>引物<400>43ttcctaattt tgggaatgct gttgatgacg ggtggagtga tggagaacat cacatcagga 60ttc 63
术语如本文所用，“外源多肽的基因元件”指编码外源多肽的核酸序列。
如本文所用，“外源多肽”指天然黄热病毒基因组不编码的多肽，例如各种抗原、抗原决定簇、细胞因子、生长因子、多肽类激素、酶、受体、抗体和/或癌相关蛋白。特别优选的外源多肽是SARS病毒、HBV病毒、HCV病毒、HIV病毒的抗原多肽、癌抗原多肽，尤其是分子量为1-200Kda，较佳地为10-150Kda，更佳地20-100Kda或更大的抗原多肽。例如，“SARS抗原性多肽”指任何能够引起针对SARS病毒的免疫应答的多肽，代表性的例子包括S蛋白、N蛋白等。抗原性多肽可以是全长蛋白或其片段。抗原性多肽可以是天然的，也可以是突变的。
如本文所用，“释放元件”指位于外源多肽的基因元件两侧的核酸序列，当与外源多肽的基因元件一起翻译成蛋白质后，用于释放完整的、不含无关序列的外源多肽。释放元件包括5’端释放元件和3’端释放元件。优选的5’和3’端释放元件选自：SEQ IDNO：1所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：2所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合。在抗原性基因元件任一侧的释放元件通常为一个，但也可以是多个。
如本文所用，术语“外源多肽表达组件”指具有以下结构的一段核酸序列：5’端释放元件-外源多肽的基因元件-3’端释放元件外源多肽表达组件可以不包含启动子、起始密码子和终止密码子。当该外源多肽表达组件插入黄热病病毒基因组后，会与黄热病病毒的核苷酸序列一起表达一个大前体蛋白。然后，在该前体蛋白的后期加工过程中，水解酶会酶切5’端和3’端释放元件所编码的氨基酸序列后，从而释放出外源多肽(如SARS抗原性多肽)。
术语“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的肽诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“抗原性多肽”或“抗原性肽”指可引发哺乳动物免疫应答的氨基酸序列，无论是单独或与辅助分子结合(如I或II类主要组织相容性抗原分子)。
本文所用的术语“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)导致的疾病的发作。
如本文所用，术语“对象”或“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些易受黄病毒(如黄热病病毒)感染的对象，如可以支持黄热病病毒复制的对象。
“生物样品”包括从生物体得到，且可用于诊断或监测分析的各种样品类型。该术语包括血样和其它生物性液体样品、固态组织样品(如活组织检查样品或组织培养物或由其衍生的细胞及它的子代)。该术语包括在购置后以任何方法操作的样品，如用试剂处理、溶液化或富集其某些成分。该术语包括临床样品，还包括细胞培养物、细胞上清液、细胞溶解产物、血清、血浆、生物液体和组织样品。
重组的黄热病病毒载体可从公用数据库(包括，如GenBank)获得若干YFV毒株的核苷酸序列。示范毒株是“YFV 17D”。可在GenBank登记号X03700获得YFV基因组的核苷酸序列以及可编码病毒多蛋白的氨基酸序列。黄热病病毒颗粒的生产是本领域所熟知的。
本发明所述的YFV基因组，可以是全基因组，也可以是缺失部分核酸序列的亚基因组。在本发明的一个实施方案中，所述的YFV基因组是全基因组。在本发明的另一个实施方案中，所述的YFV基因组是缺失了部分结构蛋白基因序列的亚基因组，其中，缺失的结构蛋白基因序列选自下列基因：C蛋白、prM蛋白、E蛋白或其组合。
在本发明中，外源多肽表达组件可以位于黄热病病毒基因组的不同位点。作为非限制性例子，可将外源核酸序列插入以下的一个或多个位置：(1)病毒多肽的N-末端；(2)病毒蛋白质C和prM之间；(3)病毒蛋白质NS2A和NS2B之间；(4)病毒蛋白质NS2B和NS3之间；(5)病毒蛋白质NS3和NS4A之间；(5)NS4A和NS4B之间；(6)E编码区和NS1编码区之间。外源核酸可插入黄热病病毒基因组的其它位点。最好是，外源核酸的插入不破坏黄热病病毒蛋白质的功能、和/或病毒多肽的蛋白水解加工、和/或病毒的复制。
以SARS抗原性多肽为例，当使用本发明的黄热病病毒载体感染宿主细胞时，重组的黄热病病毒编码含有SARS冠状病毒的抗原多肽的重组多蛋白前体。该重组多蛋白前体通过2A自身水解酶和/或信号肽水解酶酶解加工，从而释放出SARS冠状病毒的抗原多肽。用重组后的黄热病病毒感染宿主细胞，可在宿主细胞中提供SARS冠状病毒抗原性多肽的编码序列，并产生相应的抗原多肽，从而引发针对SARS冠状病毒抗原多肽的免疫反应。因此，本发明的重组的黄热病病毒载体可用作预防SARS的疫苗。
与仅可产生一轮抗原病毒表达的其它载体和/或会停止表达的其它载体不同，本发明的活性重组病毒会持续繁殖直到免疫系统被充分活化从而制止感染。与用常规表达载体(如病毒复制子)所引发的免疫应答相比，这样就会产生更强的(针对SARS抗原性肽)的免疫应答。
药物组合物本发明还提供了包含本发明的重组黄热病病毒的各种组合物，包括药用组合物，尤其是疫苗组合物。
包含本发明的重组黄热病病毒的各种组合物可以包含按重组黄热病病毒的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington：药学和药学实践”，第19版(1995)Mack Publishing Co.。
可将药用组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂、和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。
当用作疫苗时，本发明的重组黄热病病毒可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。
另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’s TiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分。
给药途径和剂量当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组黄热病病毒施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式时，除有重组YFV病毒以外，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。
给药的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予重组黄热病病毒疫苗，即重组黄热病病毒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗SARS病毒感染或SARS症状。
在各疫苗剂份中所选用的重组黄热病病毒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1-1000μg，较佳地为1-200μg，更佳地10-100μg蛋白质。以重组黄热病病毒核酸为基础计算的疫苗有效剂量，通常包括给予约1-1000μg核酸。另外，重组黄热病病毒疫苗的有效剂量的一般范围为约102-107，103-106或104-105空斑形成单位(PFU)。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
与现有技术相对，本发明的主要优点在于：(1)安全性好。作为载体病毒，黄热病病毒是WHO认定的标准安全疫苗，已应用近七十年，副反应发生率接近千万分之一。
(2)免疫效果好。一次接种几天即可见效，并可长期保持免疫力(通常10年以上)。
(3)中国人体内没有黄热病病毒抗体，基本上不会影响疫苗的效果。
(4)适合生产，生产工艺和质量标准容易建立，利用现有设施生产，生产成本低。
(5)本发明释放元件对长的外源多肽的释放效率更高，与缺失部分结构基因的YFV结合可以表达500氨基酸或更长的外源多肽。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1黄热病病毒疫苗的全长cDNA克隆的制备构建过程如图1、图2、图3所示：1.把全长的黄热病病毒疫苗cDNA整合到pRS424质粒(Plasmid)内，所述的黄热病病毒疫苗Yellow Fever virus Strain 17D(YF 17D)和pRS424质粒(ATCC#：77105)，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
a)用RT-PCR的方法把黄热病病毒YF 17D的RNA转化成三段黄热病病毒cDNA片段(5’端cDNA，3’端cDNA和中间段cDNA)，在5’端cDNA片段的5’端加上Not I酶切位点和Sp6增强子序列；在5’端cDNA片段的3’端是YF cDNA的EcoR I酶切位点；在3’端片段的3’端加上Xho I酶切位点；在中间片段的两头包括部分与5’端cDNA片段的3’端和3’端cDNA片段的5’端相同的基因序列。
所使用的DNA引物的序列如下：
b)获得三个黄热病病毒片段，长度分别为2280bp，6130bp，和2580bp。
c)先把5’端片段，然后把3’端片段，通过连接的方法克隆到pRS424质粒内。
d)利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，把中间片段cDNA插到上述克隆中，产生全长的黄热病病毒cDNA克隆。
实施例2制备插入点在黄热病病毒cDNA的NS2B和NS3之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的SARS疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的4572-4573nt)构建过程如图4所示。
1.把实施例1获得的全长的黄热病病毒cDNA克隆用Kpn I内切酶和Nhe I内切酶切去一约2.2kb长的片段，此片段包括黄热病病毒cDNA序列第3445-5576位的碱基。
2.以黄热病病毒cDNA克隆为模板，分别以GGATACAAGGTTCAGACGAAC(SEQID NO：10)和AACCATCGATTCGGGGCCAGGGTTGGACTCGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCA AAATTCAACAGCTGCATATGCCACAAGACATCCCCACTTCTC(SEQ ID NO：11)为一对引物；并以AACCCTGGCCCCGAATCGATGGTTCGAGGCGCGCGACGCAGCGGTGACGTACTCTGGGATAT TCCCACTCCTAAGATCATC(SEQ IDNO：12)和CGCTGCCCAACCTCTAGCGGC(SEQ ID NO：13)为另一对引物，然后用PCR的方法产生两个DNA片段，在其中引入一个2A的基因序列，所述的2A的基因序列是口蹄疫病毒的基因片段，由六十个碱基组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结成在NS2B和NS3基因之间内含口蹄疫病毒的2A的DNA片段，其5’端和3’端包括大约50bp的DNA序列分别与Kpn I酶切点和Nhe I酶切点相邻序列相同。
3.把步骤1中所述的切去约2.2kb长片段的黄热病病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，上述片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
4.含SARS冠状病毒(SARS coronarivus)S1基因的DNA质粒B21和H21可从BritishColumbia Cancer Agency，Canada获得。S1基因的全序列如SEQ ID NO：3所示。
以CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTGGCCGGCGATGTGGAATCAAATCCCGGGCCTATGTTTATTTTCTTATTATTTCTT(SEQ ID NO：14)和GGTGGGGTGCAAGGTTTGCCATCA(SEQ ID NO：15)为引物，以DNA质粒B21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原5’端的部分DNA片段。
以CCTTTGAGAGAGACATATCTAATG(SEQ ID NO：16)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGCTCAGCTCCTATAAGACAGCC(SEQ IDNO：17)为引物，以DNA质粒H21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原3’端的部分DNA片段。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结成完整的S1DNA片段(SARS冠状病毒-S1-2A)，其5’端和3’端包括2A的序列。
5.用Afl II内切酶将步骤3中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
6.把线性化的重组黄热病病毒cDNA和步骤4中产生的SARS冠状病毒-S1-2A片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，SARS冠状病毒-S1-2A片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒(简称重组黄热病病毒，rYFV)cDNA。
7.用XhoI内切酶将步骤6中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
8.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)将线性化的重组黄热病病毒cDNA转录成RNA。
9.用电穿孔法(electroporation)，把重组黄热病病毒RNA转染入宿主细胞BHK-21(Baby hamster kidney)(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)。
实施例3制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的SARS疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的2453-2454nt)构建过程如图5所示。
1.把全长的黄热病病毒cDNA克隆用Pst I切去一约1kb长的片段。此片段包括黄热病病毒cDNA序列第1959-2782位。
2.以黄热病病毒cDNA克隆为模板，分别以GTCAAGAACCCAACTGACACT(SEQ ID NO：18)和AAGGTCAAAATTCAACAGCTGAAAGAAGATGGCGCATCCTTG(SEQ ID NO：19)为一对引物；并以CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCCAACATGACAATGTCCATGAGC(SEQ ID NO：20)和CCAGACCCGGTTTGAAAACGG(SEQ ID NO：21)为另一对引物，然后用PCR的方法产生两个DNA片段，在其中引入一个2A的基因序列，所述的2A的基因序列是口蹄疫病毒的基因片段(SEQ ID NO：1)。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结产生一段在E和NS1基因之间内含口蹄疫病毒的2A的DNA片段，其5’端和3’端包括大约50bp的序列分别与Pst I相邻序列相同。
3.把步骤1中所述的切去约1kb长片段的黄热病病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，上述片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
4.按实施例2步骤4相同方法，获得完整的S1 DNA片段(SARS冠状病毒-S1-2A)，其5’端和3’端包括2A的序列。
5.用Afl II内切酶将步骤3中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
6.把线性化的重组黄热病病毒cDNA和步骤4中产生的SARS冠状病毒-S1-2A片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，SARS冠状病毒-S1-2A片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
7.用XhoI内切酶将步骤6中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
8.用DNA依赖性Sp6RNA聚合酶将线性化的重组黄热病病毒cDNA转录成RNA。
9.用电穿孔法，把重组黄热病病毒RNA转染入宿主细胞BHK-21(ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到重组的黄热病病毒颗粒。
实施例4制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)和信号肽水解酶底物的基因片段修饰的SARS疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的2453-2454nt)构建过程如图6所示。
1.把全长的黄热病病毒cDNA克隆用Pst I切去一约1kb长的片段。此片段包括黄热病病毒cDNA序列1959-2782。
2.按实施例3步骤2相同方法，获得一段在E和NS1基因之间内含口蹄疫病毒的2A的DNA片段，其5’端和3’端包括大约50bp的序列分别与Pst I相邻序列相同。
3.把步骤1中所述的切去约1kb长片段的黄热病病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，上述片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
4.以AGCATGATCTTGGTAGGAGTGATCATGATGTTTTTGTCTCCACAAGCCCAAGCCAGTGACCTTGACCGGTGCACCACT(SEQ ID NO：22)和GGTGGGGTGCAAGGTTTGCCATCA(SEQ ID NO：14)为引物，以DNA质粒B21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原5’端的部分DNA片段，同时在其5’端插入了修饰过的信号肽水解酶底物的基因片段序列(即SEQ ID NO：22中第40-54位，编码序列如SEQ ID NO：2所示的信号肽水解酶底物)；以CCTTTGAGAGAGACATATCTAATG(SEQ ID NO：16)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGCTCAGCTCCTATAAGACAGCC(SEQ ID NO：17)为引物，以DNA质粒H21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原3’端的部分DNA片段。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结成完整的S1 DNA片段(SARS冠状病毒-S1-2A)，其5’端包括黄热病病毒的蛋白质E的3’端序列和修饰过的信号肽水解酶底物基因片段，其3’端包括2A的序列。
5.用Afl II内切酶将步骤3中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
6.把线性化的重组黄热病病毒cDNA和步骤4中产生的SARS冠状病毒-S1-2A片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，SARS冠状病毒-S1-2A片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
7.用XhoI内切酶将步骤6中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
8.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶将线性化的重组黄热病病毒cDNA转录成RNA。
9.用电穿孔法(electroporation)，把重组黄热病病毒RNA转染入宿主细胞BHK-21(ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到重组的黄热病病毒颗粒。
实施例5：制备插入点在黄热病病毒cDNA的C和prM之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的SARS疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的482-483nt)构建过程如图7所示。
1.把全长的黄热病病毒cDNA克隆用Bsm I切去一约1kb长的片段。此片段包括黄热病病毒cDNA序列458-1514。
2.以黄热病病毒cDNA克隆为模板，分别以GCCAGTTTGATGAGAGGATTG(SEQ ID NO：23)和AGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCAAAATTCAACAGCTGCACTCCACCCGTCATCAACAG(SEQ ID NO：24)为一对引物；并以GGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCCTCCCATGATGTTCTGACTGTG(SEQ ID NO：25)和CTCTCTCCACACCCCGCCACT(SEQ ID NO：26)为另一对引物，然后用PCR的方法产生两个DNA片段，在其中引入一个2A的基因序列(SEQ ID NO：1)。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结产生一段在C和prM基因之间内含口蹄疫病毒的2A的DNA片段，其5’端和3’端包括大约50bp的序列分别与Bsm I相邻序列相同。
3.把步骤1中所述的切去约1kb长片段的黄热病病毒cDNA片段和步骤2中产生的DNA片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，上述片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
4.以TTCCTAATTTTGGGAATGCTGTTGATGACGGGTGGAGTGAGTGACCTTGACCGGTGCACCACT(SEQ ID NO：27)和GGTGGGGTGCAAGGTTTGCCATCA(SEQ ID NO：28)为引物，以DNA质粒B21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原5’端的部分DNA片段。以CCTTTGAGAGAGACATATCTAATG(SEQ ID NO：16)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGCTCAGCTCCTATAAGACAGCC(SEQ ID NO：17)为引物，以DNA质粒H21为模板，用PCR的方法产生SARS冠状病毒S1抗原3’端的部分DNA片段。再以溶合PCR的方法将上述两个DNA片段连结成完整的S1 DNA片段(SARS冠状病毒-S1-2A)，其5’端包括黄热病病毒的蛋白质C的3’端序列，其3’端包括2A的序列。
5.用Afl II内切酶将步骤3中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
6.把线性化的重组黄热病病毒cDNA和步骤4中产生的SARS冠状病毒-S1-2A片段用来转化酵母菌，在酵母菌的DNA复制的过程中，SARS冠状病毒-S1-2A片段能够自动整合产生重组的黄热病病毒cDNA。
7.用XhoI内切酶将步骤6中产生的重组黄热病病毒cDNA线性化。
8.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶将线性化的重组黄热病病毒cDNA转录成RNA。
9.用电穿孔法，把重组黄热病病毒RNA转染入宿主细胞BHK-21(ATCC#：CCL-10)。7-10天后收集上清，得到重组的黄热病病毒颗粒。
实施例6：制备重组YFV亚基因组本实施例制备去除了YFV结构蛋白C序列的cDNA克隆。
1.将实施例5得到的含有SARS冠状病毒-S1序列的重组黄热病病毒cDNA克隆用Not I切成线性。
2.用常规的融合PCR方法，制得长384bp碱基的DNA片段，该片段对应于黄热病毒结构蛋白C基因但缺失了第179-409位核苷酸序列。
3.将线性的重组黄热病毒cDNA和384bp的cDNA片段转化酵母菌(ATCC 76628)，得到去除了YFV结构蛋白C序列的重组黄热病毒cDNA克隆(ΔC-rYFV cDNA)。
4.用Kpn I内切酶将步骤3中产生的ΔC-rYFV cDNA线性化。
5.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)将线性化的ΔC rYFV cDNA转录成RNA，即ΔC-rYFV RNA。
实施例7：制备含有YFV亚基因组的SARS疫苗参见图8。
1.以pCI(购自PROMEGA，USA)作为模板，以5’CMV和3’CMV作为引物，用PCR方法制备CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)的DNA片段(简称CMV)。CMV作为早期增强子和启动子，其长度为631bp。以实施例1得到的全长黄热病毒cDNA克隆为模板，以5’YFV5’end和3’YFV5’end作为引物，用PCR的方法制备YFV cDNA的5’端片段(简称YFV5’end)。以上述2个DNA片段作为模板，以5’CMV和3’YFV5’end作为引物，用fusingPCR的方法制备CMV-YFV 5’end的DNA片段(简称CMV-YFV 5’end)。
2.将步骤1产生的CMV-YFV 5’end与pRS424质粒(ATCC#：77105)用Not I和ApaI进行酶切。用Qiagen spin column(购自QIAGEN Inc.)对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶(购自New England Bio lab)连接，并转化至大肠杆菌内。筛选得到CMV-YFV 5’end克隆(简称pRS/CMV-YFV 5’end)。
3.以实施例1得到的全长黄热病毒cDNA为模板，以5’YFV3’end和3’YFV3’end作为引物，用PCR方法制备YFV cDNA的3’端片段(简称YFV 3’end)。以5’HDVr和3’HDVr作为引物，用融合PCR方法制备肝炎delta病毒抗原血症核酶(hepatitis delta virusantigenomic ribozyme，HDVr)的DNA片段(简称HDVr)。以pcDNA3(购自Invitrogen)作为模板，以5’pA和3’pA作为引物，用PCR的方法制备牛生长激素poly A(bovinegrowth hormone poly A，BGH pA)的DNA片段(简称pA)。以上述三个片段为模板，以5’YFV3’end和3’pA作为引物，用融合PCR方法制备YFV 3’end-HDVr-pA的DNA片段。
4.将上述步骤2生成的pRS/CMV-YFV5’end与步骤3生成的YFV3’end-HDVr-pA的DNA片段用Pml I和Sac II进行酶切，用Qiagen spin column对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶连接，并转化至大肠杆菌内。筛选得到pRS/CMV-YFV5’end-YFV3’end-HDVr-pA的克隆。
5.将上述步骤4生成的pRS/CMV-YFV5’end-YFV3’end-HDVr-pA的克隆用Pml I进行酶切，将实施例1得到的全长黄热病毒cDNA克隆用NotI和Kpn I进行酶切。将上述酶切产物进行纯化，并将纯化产物转化至酿酒酵母，利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，得到修饰后的全长YFVcDNA克隆(简称pRS/CMV/YFV)。
6.将步骤5产生的pRS/CMV/YFV用Stu I进行酶切，得到线性的pRS/CMV/YFV克隆。以GTGAAGGAAGAAGGAAAGGAGGAGCTCCAAGAGATCCCGCCTGAGGAACATGAGATCTTG(SEQ IDNO：37)和TGTTTCACCGCTGTCATTCAAGATCTCATGTTCCTCAGG(SEQ ID NO：38)为引物，用融合PCR方法生成一个78bp长的DNA片段，其序列为GTGAAGGAAGAAGGAAAGGAGGAGCTCCAAGAGATCCCGCCTGAGGAACATGAGATCTTGAATGACAGCGGTGAAACA(SEQ ID NO：39)。将上述线性的pRS/CMV/YFV克隆和78bp长的DNA片段一同转化至酵母菌(ATCC 76628)，利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，将线性的pRS/CMV/YFV克隆中部分YFV NS3编码区基因序列(nt 5126-6280)切除，得到NS3缺失的YFV cDNA克隆。
将上述步骤6产生的NS3缺失的YFV cDNA克隆和pcDNA3(购自INVITROGEN)同时转染BHK-21 cell(ATCC#：CCL-10)。该细胞培养一天后，转换为含有G418(购自SIGMA)的细胞培养液。用实施例6得到的ΔC rYFV RNA转化抗G418细胞株，挑选出包装细胞系。该细胞系的产量可以达到每毫升106重组黄热病毒颗粒(ΔC-rYFV)，即SARS疫苗。
实施例8制备插入点在黄热病病毒cDNA的NS2B和NS3之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的HBV疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的4572-4573nt)重复实施例2的步骤1-9，不同点仅在于用HBV抗原多肽替换SARS抗原多肽。具体地，在步骤4中，以CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTGGCCGGCGATGTGGAATCAAATCCCGGGCCTATGGAGAACATCACATCAGGATTC(SEQ ID NO：40)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGAATGTATACCCAAAGACAAAAGAA(SEQID NO：41)为引物，以HBV表面抗原(HBVsAg)基因的DNA质粒(ATCC#45020D)为模板，用常规PCR的方法产生HBVsAg DNA片段(HBVsAg-2A)，其5’端和3’端包括2A的序列。
结果，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)，其中在黄热病病毒cDNA的NS2B和NS3之间插入有HBVsAg基因。
实施例9制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)修饰的HBV疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的2453-2454nt)重复实施例3的步骤1-9，不同点仅在于用HBV抗原多肽替换SARS抗原多肽。具体地，在步骤4中按实施例7步骤4相同方法，获得HBVsAg DNA片段(HBVsAg-2A)，其5’端和3’端包括2A的序列。
结果，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)，其中在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间插入有HBVsAg基因。
实施例10制备插入点在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)和信号肽水解酶底物的基因片段修饰的HBV疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的2453-2454nt)重复实施例4的步骤1-9，不同点仅在于用HBV抗原多肽替换SARS抗原多肽。具体地，在步骤4中，以AGCATGATCTTGGTAGGAGTGATCATGATGTTTTTGTCTCCACAAGCCCAAGCCATGGAGAACATCACATCAGGATTC(SEQ ID NO：42)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGAATGTATACCCAAAGACAAAAGAA(SEQ ID NO：41)为引物，以HBV表面抗原(HBVsAg)基因的DNA质粒(ATCC#45020D)为模板，用PGR的方法产生的HBVsAg DNA片段(HBVsAg-2A)，其5’端包括黄热病病毒的蛋白质E的3’端序列和修饰过的信号肽水解酶底物基因片段(编码如SEQ ID NO：2所示的信号肽水解酶底物)，PCR产生的HBVsAg DNA片段的3’端包括2A的序列。
结果，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)，其中在黄热病病毒cDNA的E和NS1之间插入有HBVsAg基因。
实施例11：制备插入点在黄热病病毒cDNA的C和prM之间的经口蹄疫病毒的基因片段(2A)和信号肽水解酶底物的基因片段修饰的HBV疫苗(插入位点为黄热病病毒基因组的482-483nt)重复实施例5的步骤1-9，不同点仅在于用HBV抗原多肽替换SARS抗原多肽，且3端释放元件为信号肽水解酶底物的基因片段。具体地，在步骤4中，以TTCCTAATTTTGGGAATGCTGTTGATGACGGGTGGAGTGATGGAGAACATCACATCAGGATTC(SEQ ID NO：43)和GGGGCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGCAGATCGAAGTTCAGGAGTTGAATGTATACCCAAAGACAAAAGAA(SEQ ID NO：41)为引物，以HBV表面抗原(HBVsAg)基因的DNA质粒(ATCC # 45020D)为模板，用PCR的方法产生的HBVsAg DNA片段(HBVsAg-2A)，其5’端包括黄热病病毒的蛋白质C的3’端序列和修饰过的信号肽水解酶底物基因片段，其3’端包括2A的序列。
结果，得到重组的黄热病病毒颗粒(rYFV)，其中在黄热病病毒cDNA的C和prM之间插入有HBVsAg基因。
实施例12：制备重组YFV亚基因组本实施例制备去除了YFV结构蛋白C序列的cDNA克隆。
重复实施例6的步骤1-5，不同点仅在于用含有HBsAg基因序列的重组黄热病病毒cDNA克隆替换含有SARS冠状病毒-S1序列的重组黄热病毒cDNA克隆。具体地，在步骤1中，将实施例11得到的含有HBsAg基因序列的重组黄热病病毒cDNA克隆用Acl I切成线性。
结果，得到去除了YFV结构蛋白C序列的cDNA克隆(ΔC-rYFV cDNA)，其中含有HBsAg的基因序列，进而得到ΔC-rYFV RNA。
实施例13：制备含有YFV亚基因组的HBV疫苗重复实施例7的步骤1-6。然后用实施例12得到的ΔC rYFV RNA转化实施例7得到的抗G418细胞株，获得包装细胞系。该细胞系的产量可以达到每毫升106重组黄热病毒颗粒(ΔC-rYFV)，即HBV疫苗。
实施例14：
小鼠抗SARS冠状病毒IgG检测在本实施例中，测试了实施例2-5和7制备的重组黄热病病毒颗粒(SARS冠状病毒疫苗)的免疫原性，进行了小鼠抗SARS冠状病毒IgG检测。方法如下：1.BALB/c小鼠共16只，随机分为两组，每组8只。组一于皮下注射105PFU重组黄热病病毒颗粒(0.5ml)，组二注射105PFU 17D黄热病病毒疫苗(0.5ml，作为对照)免疫小鼠。分别在注射后第0天、第7天、第14天、第21天、第28天从小鼠眼眶采血，血清在-70℃贮存。
2.用S300抗原包被酶联板(S300为SARS冠状病毒S蛋白第14-313位氨基酸，是将S300表达质粒转化大肠杆菌，表达出S300蛋白片段，经Ni-NTA亲和树脂纯化而制得)。
3.待检血清1∶50稀释，每孔加稀释后血清样品100微升，37℃孵育1h，洗板6次，每孔加入酶标记抗体(HRP-山羊抗小鼠IgG，1∶1000稀释)100微升，37℃孵育45min，加TMB/H2O2显色，硫酸终止反应后用酶标仪测定A450/A630。
4.判断标准：重组黄热病病毒颗粒免疫组小鼠血清的A450/A630与对照17D黄热病病毒疫苗组血清的平均值大于或等于2.1则抗体检测阳性。
检测结果如下：
结果表明，在第14天就产生了抗SARS抗体。实施例2-5的SARS疫苗也在第14天就产生了抗SARS抗体(第14天时比值T为2.2-2.6不等)。
实施例15：小鼠抗HBs IgG检测在本实施例中，测试了实施例8-11和13制备的重组黄热病病毒颗粒(HBV疫苗)的免疫原性，进行了小鼠抗HBs IgG检测。使用上海科华生物工程股份有限公司的酶免疫法检测HBsAg试剂盒，测定血清样品中抗-HBs IgG的效价，测试方法如下：1.BALB/c小鼠共8只，随机分为两组，每组4只。组一于左胫前肌肉注射105PFU重组黄热病病毒颗粒(0.5ml)，组二注射105PFU 17D黄热病病毒疫苗(0.5ml)免疫小鼠。2周后加强免疫一次，剂量同第一次。免疫后每天观测小鼠，并于加强免疫注射3周后摘除眼球取血，分离血清后置-20待检。
2.待检血清1∶50稀释，每孔加稀释后血清样品50微升，并设阳性及空白对照。
3.每孔加入酶结合物1滴(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37C孵育30分钟。
4.洗板6次，每孔加入显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，置37C孵育15分钟。
5.硫酸终止反应后用酶标仪测定A450/A630。
6.判断标准：重组黄热病病毒颗粒免疫组小鼠血清的A450/A630与对照17D黄热病病毒疫苗组血清的平均值大于或等于2.1则抗体检测阳性。
检测结果如下：
结果表明，在第35天就产生了抗-HBs。实施例8-11的HBV疫苗也在第35天就产生了抗-HBs(第35天时比值T为2.1-2.8不等)。
重组黄热病病毒颗粒(HBV疫苗)免疫4周后采血，分离血清，测定抗HBs平均几何滴度为650mIU/ml。
实施例16：黄热病病毒中和抗体测定黄热病病毒中和抗体测定采用蚀斑减少试验。采集实施例14、15中分别用重组黄热病病毒颗粒(SARS疫苗)、重组黄热病病毒颗粒(HBV疫苗)和17D黄热病病毒疫苗(对照)免疫小鼠7天后的血清。将三组血清分别与稀释好的黄热病病毒株(约200PFU/0.4ml)等量混合，同时将稀释好的病毒再1∶2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃孵育90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培育5天，染色，蚀斑计数，计算血清蚀斑减数中和效价，其中，病毒对照组的蚀斑平均数为80，重组黄热病病毒颗粒(SARS疫苗)的抗体中和效价为1∶20，重组黄热病病毒颗粒(HBV疫苗)的抗体中和效价为1∶20，17D黄热病病毒疫苗(阳性对照)的抗体中和效价为1∶20。
这表明，重组黄热病病毒颗粒(SARS疫苗及HBV疫苗)同17D黄热病病毒疫苗一样，免疫动物后产生的抗体可有效地中和黄热病病毒抗原，因而是安全的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海天甲生物医药有限公司美国天甲生物医药有限公司北京东方天甲科技发展有限公司<120>重组的以黄热病毒为载体的疫苗<130>034975<150>CN 03141721.3<151>2003-07-21<160>43<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>60<212>DNA<213>口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)<400>1cagctgttga attttgacct tcttaagctt gcgggagacg tcgagtccaa ccctggcccc 60<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>信号肽水解酶底物<400>2Pro Gln Ala Gln Ala1 5<210>3<211>1920<212>DNA<213>SARS冠状病毒(SARS coronarivus)<400>3atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320
aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt 1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat 1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc 1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag 1920<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(51)<223>引物<400>4cgcggcggcc gcatttaggt gacactatag agtaaatcct gtgtgctaat t 51<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>5caccgtatga attcctttcc c 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>6ggagacaccg cctgggattt c 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>7cacgtagtac atttcatgag t 21<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物<400>8ccatacatgc cagatgttct tgagaaactg gaattgctcc aa 42<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物<400>9cccctcgagt ggttttgtgt ttgtcatcca 30<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>10ggatacaagg ttcagacgaa c 21<210>11<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(97)<223>引物<400>11aaccatcgat tcggggccag ggttggactc gtctcccgca agcttaagaa ggtcaaaatt 60caacagctgc atatgccaca agacatcccc acttctc 97<210>12<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(81)<223>引物<400>12aaccctggcc ccgaat cgat ggttcgaggc gcgcgacgca gcggtgacgt actctgggat 60attcccactc ctaagatcat c 81<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>13cgctgcccaa cctctagcgg c 21<210>14<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(84)<223>引物<400>14cagctgttga attttgacct tcttaagctg gccggcgatg tggaatcaaa tcccgggcct 60atgtttattt tcttattatt tctt 84<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物<400>15ggtggggtgc aaggtttgcc atca 24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物<400>16cctttgagag agacatatct aatg 24<210>17<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(81)<223>引物<400>17ggggccaggg ttggactcga cgtctcccgc aagcttaagc agatcgaagt tcaggagttg 60ctcagctcct ataagacagc c 81<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)<223>引物<400>18gtcaagaacc caactgacac t 21<210>19<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物<400>19aaggtcaaaa ttcaacagct gaaagaagat ggcgcatcct tg 42<210>20<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(81)<223>引物<400>20cagctgttga attttgacct tcttaagctt gcgggagacg tcgagtccaa ccctggcccc 60aacatgacaa tgtccatgag c 81<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>21ccagacccgg tttgaaaacg g 21<210>22<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(78)<223>引物<400>22agcatgatct tggtaggagt gatcatgatg tttttgtctc cacaagccca agccagtgac 60cttgaccggt gcaccact 78<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)
<223>引物<400>23gccagtttga tgagaggatt g 21<210>24<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(75)<223>引物<400>24agggttggac tcgacgtctc ccgcaagctt aagaaggtca aaattcaaca gctgcactcc 60acccgtcatc aacag 75<210>25<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(48)<223>引物<400>25ggagacgtcg agtccaaccc tggcccctcc catgatgttc tgactgtg 48<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>26ctctctccac accccgccac t 21<210>27<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(38)<223>引物<400>27aaatatgcgg ccgcttgaca ttgattattg actagtta 38<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物
<400>28aattagcaca caggatttac tcggttcact aaacgagctc tg 42<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>29agtaaatcct gtgtgctaat t 21<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物<400>30taccaccacg tgggctgtga tcttttttcc 30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物<400>31atcacagccc acgtggtggt agaaagacgg 30<210>32<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物<400>32gtggagatgc catgccgacc cagtggtttt gtgtttgtca tc 42<210>33<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(48)<223>引物<400>33gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccg 48
<210>34<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(55)<223>引物<400>34ctcccttagc catccgagtg gacgtgcgtc ctccttcgga tgcccaggtc ggacc 55<210>35<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(42)<223>引物<400>35ccactcggat ggctaaggga gctagagctc gctgatcagc ct 42<210>36<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物<400>36tatatccgcg gagaatagaa tgacacctac tc 32<210>37<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(60)<223>引物<400>37gtgaaggaag aaggaaagga ggagctccaa gagatcccgc ctgaggaaca tgagatcttg 60<210>38<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(39)<223>引物<400>38tgtttcaccg ctgtcattca agatctcatg ttcctcagg 39<210>39<211>78<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(78)<223>寡核苷酸<400>39gtgaaggaag aaggaaagga ggagctccaa gagatcccgc ctgaggaaca tgagatcttg 60aatgacagcg gtgaaaca 78<210>40<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(84)<223>引物<400>40cagctgttga attttgacct tcttaagctg gccggcgatg tggaatcaaa tcccgggcct 60atggagaaca tcacatcagg attc 84<210>41<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(84)<223>引物<400>41ggggccaggg ttggactcga cgtctcccgc aagcttaagc agatcgaagt tcaggagttg 60aatgtatacc caaagacaaa agaa 84<210>42<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(78)<223>引物<400>42agcatgatct tggtaggagt gatcatgatg tttttgtctc cacaagccca agccatggag 60aacatcacat caggattc 78<210>43<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(63)<223>引物<400>43ttcctaattt tgggaatgct gttgatgacg ggtggagtga tggagaacat cacatcagga 60ttc 63
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m58抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 | 2021-11-01 | 1 |
| 一对短肽、蛋白质和多核苷酸、其宿主细胞及其应用 | 2020-10-22 | 2 |
| 一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法及应用 | 2022-02-03 | 3 |
| 一种用于胆汁淤积防治的hFXR激动剂的高通量筛选模型 | 2021-03-22 | 4 |
| 一种非小细胞肺癌标志物及应用 | 2020-10-29 | 4 |
| 表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法 | 2020-06-19 | 2 |
| 利用TRAIL和HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用 | 2020-09-11 | 3 |
| ATRP法构建以PGMA为骨架的高性能阳离子基因载体 | 2021-03-08 | 0 |
| 一种高效稳定的细胞表达载体、表达系统及其制备方法、应用 | 2022-06-17 | 2 |
| 一种双特异性抗体及其制备方法和应用 | 2022-10-01 | 2 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈