1.一种线性的以PGEA为骨架的阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，其具体制备步骤为：
1）0-60℃无氧条件下，将2,2-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种共0.08g-0.26g，0.1g-0.2g五甲基二乙烯三胺，5g-10g四氢呋喃，6g-12gGMA，0.033g-0.15gCuBr混合，各组分添加顺序为：先将GMA溶于四氢呋喃，然后加入上述0.1g-0.2g五甲基二乙烯三胺，再加入上述2,2-联吡啶、
1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种共0.08g-0.26g，最后加入CuBr引发活性可控自由基聚合，或者先将GMA溶于四氢呋喃，然后加入上述0.1g-0.2g五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入上述2,2-联吡啶、
1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种共
0.08g-0.26g引发活性可控自由基聚合；聚合反应时间为1-9h，反应完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得产物为线性PGMA；
2）0-60℃无氧条件下，将0.2g-0.5g步骤1）得到的线性PGMA溶于4g-10g四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和1g-2g三乙胺，开环反应72-168h；然后用乙醚沉淀直到产物形貌为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后将产物溶于水中，加水量与产物的比例为100-300ml/g；产物溶解后放入截留分子量为2500-4500Mw的透析袋中，在去离子水中透析3-6h；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得到线性的以PGEA为骨架的阳离子基因载体。
2.根据权利要求1所述的一种线性的以PGEA为骨架的阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的醇胺为乙醇胺、2-氨基-1-丙醇、3-氨基-1-丙醇中的一种或几种。
3.一种梳状的以PGEA为骨架的阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，其具体制备步骤为：
1）0-60℃无氧条件下，将2,2-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种共0.08g-0.26g，0.05g-0.2g五甲基二乙烯三胺，5g-10g四氢呋喃，6g-12gGMA，0.033g-0.15gCuBr混合，各组分添加顺序为：先将GMA溶于四氢呋喃，然后加入上述0.05g-0.2g五甲基二乙烯三胺，再加入上述2,2-联吡啶、
1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种共0.08g-0.26g，最后加入CuBr引发活性可控自由基聚合，或者先将GMA溶于四氢呋喃，然后加入上述0.05g-0.2g五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入上述2,2-联吡啶、
1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种共
0.08g-0.26g引发活性可控自由基聚合；聚合反应时间为1-9h，反应完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得产物为线性PGMA；
2）0-60℃无氧条件下，将1.5g-2.5g步骤1）中制备的线性PGMA溶于7g-10g四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺中，再加入0.36g-0.37gα-溴异丁酸；反应12-48h，用乙醚沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚，所得产物为PGMA-Br；
3）0-60℃无氧条件下，将0.2g-0.5g步骤2）得到的PGMA-Br，5g-10g有机溶剂，3g-6g单体，2,2-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种共0.082g-0.15g，0.033g-0.1gCuBr混合，各组分加入顺序为：先将PGMA-Br溶于有机溶剂，然后加入单体，再加入上述2,2-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种，最后加入CuBr引发活性可控自由基聚合，或者先将PGMA-Br溶于有机溶剂中，然后加入单体，再加入CuBr，最后加入上述
2,2-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4-联吡啶中的一种或几种引发活性可控自由基聚合；反应1-500min，然后加入甲醇，或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，最后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，即得到梳状的以PGMA为骨架的聚合物；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；
4）0-60℃无氧条件下，将0.1-0.5g步骤3）得到的梳状的以PGMA为骨架的聚合物溶于5g-10g四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和1g-2g三乙胺，开环反应72-168h；然后用乙醚沉淀直到产物形貌为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后将产物溶于水中，加水量与产物的比例为100-300ml/g；产物溶解后放入截留分子量为
2500-4500Mw的透析袋中，在去离子水中透析3-6h；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得到梳状的以PGEA为骨架的阳离子基因载体。
4.根据权利要求3所述的一种梳状的以PGEA为骨架的阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，步骤3）所述的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、N-异丙基丙烯酰胺、聚(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的一种梳状的以PGEA为骨架的阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，步骤4）所述的醇胺为乙醇胺、2-氨基-1-丙醇、3-氨基-1-丙醇中的一种或几种。
技术领域
[0001] 本
发明属于非病毒基因载体技术领域，具体涉及ATRP法构建一系列以PGMA(聚甲基
丙烯酸缩
水甘油酯)为骨架，具有高的基因
转染效率低毒的阳离子基因载体。
背景技术
[0002]
基因治疗方法为先天性遗传
疾病和严重后天获得性疾病的治疗提供了一条富有前景的新途径。基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治病目的的治疗方法。DNA分子通常以带负电的疏松状态存在，体积较大，满负电荷与细胞表面之间存在排斥作用，难于进入细胞；另外，血液及细胞内存在大量的
水解酶尤其是核酸酶，能将裸DNA分子破坏，因此单独使用DNA转染时，效率较低。为了使DNA有效转染，需要借助物理方法或使用基因载体辅助DNA转染。物理方法需要使用专
门的设备，不能进行全身性使用，并且会对组织和细胞产生严重损害，采用基因载体法有望克服物理方法的
缺陷。
[0003] 应用于基因治疗的载体主要分为病毒载体(viral vector)和非病毒载体(non-viral vector)。病毒载体主要为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及单纯疱疹病毒，其优点是转染率高，缺点是缺乏安全性，可能引起致癌作用与不希望的自身免疫反应(unexpected immune response)和白细胞的病毒变化，甚至可能造成病人多器官衰竭导致死亡。此外病毒载体还会引起插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶行转化，而且病毒载体携带DNA的能
力有限，不利于大规模的生产。由于它的上述弱点，目前科学界已经研究
重心转向非病毒载体技术的研究与开发。与病毒性载体相比，非病毒载体安全性高，并且具有低免疫原性、能够携带大量DNA分子、容易大批量生产及
费用低廉等优点，是一个有潜力的替代路线，故人们愈来愈重视人工合成的非病毒载体的研究。阳离子
聚合物是目前研究最广泛的人工合成非病毒载体。阳离子聚合物能够自发与带负电荷的基因通过电荷相互作用，可形成带正电荷
纳米级的
复合体(complex)，从而协助基因穿过带负电的细胞膜。此外，阳离子聚合物载体也能够保护质粒，避免被核酸酶降解，
加速基因的
细胞转染。
[0004] 近 年 来，随 着 活 性/ 可 控 自 由 聚 合 (living/controlled radical polymerization，LRP)研究的快速发展，LRP技术在制备具有新颖特定功能的
生物高分子材料中也得到了巨大发展。LRP集活性可控聚合与自由基聚合的优点为一身，不但可得到相对分子量分布极窄、相对分子量可控、结构明晰的高分子，而且可聚合的
单体多，反应条件温和易控制。所以，LRP技术具有极高的实用价值，受到了高分子化学家们的重视。迄今为止，已有
原子转移自由基聚合(atom transfer radical polymerization，ATRP)、稳定自由基氮
氧游离基调控(nitroxide mediated free radical polymerization，NMRP)体系和可逆加成-裂解链转移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT)等LRP体系问世。其中，ATRP近几年得到了迅速发展并有着重要应用价值。其所用引发剂一般为卤代烷
烃，基本原理是通过一交替的“活化-去活”可逆反应使体系中游离基浓度极低，迫使不可逆终止反应降低到最低程度，而链增长反应仍可进行，从而实现“活性”聚合。ATRP反应
温度适中，适用单体范围广，甚至可以在少量氧存在下进行，对高分子材料的分子设计不需复杂的合成路线，是现有NMRP、RAFT等其它活性聚合方法无法比拟的，因此可以说ATRP技术的出现开辟了活性聚合的新领域。
[0005] 随着高分子科学、医学、生物学以及工程学等多门学科的相互交融、相互渗透和迅速发展，高分子基因载体材料进入一个快速发展的时期。目前，文献中报道一系列非病毒阳离子聚合物载体，包括聚-L-赖
氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(poly(amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N，N-二甲氨 基 乙 酯 (poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)、聚 乙 烯 亚 胺(polyethylenimine，PEI)等。其中PEI具有较高的转染效率，是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是上述阳离子聚合物仍具有相当高的毒性，大大限制了它们的应用。这样，开发低毒而高效阳离子聚合物是研究非病毒基因载体的核心内容。目前较为流行的方案是在阳离子聚合物中插入生物相容的成份，最常见的是聚乙二醇(PEG)。另一种常见的思路是多糖阳
离子化，包括壳聚糖(chitosan)、环糊精(cyclodextrin)、葡聚糖(dextran)等。但是上述报道的非病毒载体的性能(比如安全性和转染效率)与实际应用的要求还有相当大的距离。
[0006] 近几年研究者致力于ATRP理论和应用的研究工作，在ATRP合成
生物材料以及ATRP技术的生物材料应用方面开展了广泛的研究，取得了一定的研究成果。对多种单体(包括DMAEMA、PEGEEMA、PEGMA以及GMA)的ATRP进行了系统的研究，积累了丰富的经验，促进了活性可控聚合在医用生物高分子中的应用。
[0007] 阳离子基因载体与DNA通过电荷作用将DNA包裹成纳米颗粒，这样就减小了DNA和细胞表面的排斥。同时阳离子基因载体可以保护DNA防止核酸酶的分解，这样有利于提高在细胞的转染效率。现在常用阳离子基因载体有：聚乙烯亚胺(PEI)，聚类氨酸(PLL)，聚乙二醇(PEG)等，其中PEI是目前应用最广泛的基因载体，由于它的高的转染效率在阳离子基因载体中PEI被作为黄金标准。但是对于大多数具有高转染效率的基因载体往往具有较大的毒性。而成功的基因载体不仅要有高的转染效率同时要具有低的毒性。而目前大多数阳离子基因载体不仅转染效率不高，毒性也很大。
[0008] 对于非病毒基因载体转染效率的提高和毒性的降低，将在临床上应用有巨大的意义，最普遍的方法是通过引入非离子亲水基团，来屏蔽阳离子聚合物毒性。最近，有研究发现环氧族PGMA可以与胺族开环反应，并且合成的PGEA阳离子基因载体通过它在不同细胞中的转染效率相当于枝化PEI(25KD)甚至还高。通过一系列的转染和毒性试验表明了PGEA系列作为具有高转染效率和低毒性，安全的基因载体对与将来临床上基因治疗具有深远的意义。
[0009] 综上所述，尽管在利用活性可控自由基聚合法制备基因载体方面已经做了很多工作，但是在技术方面还有以下问题需要解决：
[0010] 1、在制备高性能阳离子基因载体时，随着单体不断的接枝到PGMA骨架上，阳离子基因载体的分子量随之增大，细胞内吞作用增大，转染效率增加，但是细胞的毒性也随之增大，如何最大限度的降低基因载体的毒性成为需要解决的问题。
[0011] 2、在制备高性能阳离子基因载体时，接枝不同单体，可以得到不同性能的阳离子聚合物，但是不同单体的质子化能力不同，导致载体的转染效率高低不同，如何筛选出具有高效高性能的单体是需要考虑的问题。
[0012] 3、在制备高性能阳离子基因载体时，接枝相同的单体，在不同的细胞包括癌细胞和普通细胞中，转染高低不同，如何提高在确定细胞中的转染效率是需要研究的问题。
发明内容
[0013] 本发明的目的是提供一种活性可控自由基聚合法(ATRP法)构建的以PGMA(聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)为骨架的，其中包括线性PGEA、PGAP1、PGAP2、PGDED、梳状PGEA、梳状PGEAPEG的生物可还原高效阳离子基因载体。该阳离子基因载体分子量可控，分布窄、可剪切、毒性低，转染效率高，高效无毒的特点使其具备了投入临床试验的可能。
[0014] 所述的线性的以PGEA为骨架的阳离子基因载体的制备方法为：
[0015] 1)0-60℃无氧条件下，将0.1g-0.2g五甲基二乙烯三胺、5g-10g四氢呋喃、6g-12g GMA、0.08g-0.26g配体、0.033g-0.15g CuBr混合，各组分添加顺序为：先将GMA溶于四氢呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配体，最后加入CuBr引发活性可控自由基聚合，或者先将GMA溶于四氢呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配体引发活性可控自由基聚合；聚合反应时间为1-9h，反应完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，放入
真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得产物为线性PGMA；
[0016] 所述的配体为2，2-联吡啶(BPY)、1，1，4，7，10，10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA)、4，4-联吡啶中的一种或几种；
[0017] 2)0-60℃无氧条件下，将0.2g-0.5g步骤1)得到的线性PGMA溶于4g-10g四氢呋喃或N-N-二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和1g-2g三乙胺，开环反应72-168h；然后用乙醚沉淀直到产物形貌为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后将产物溶于水中，加水量与产物的比例为100-300ml/g；产物溶解后放入截留分子量为2500-4500Mw的
透析袋中，在去离子水中透析3-6h；最后将透析袋中的产物
冷冻干燥直至除去所有水分即得到线性的以PGEA为骨架的阳离子基因载体。
[0018] 步骤2)所述的醇胺为
乙醇胺(EA)、2-氨基-1-丙醇(AP1)、3-氨基-1-丙醇(AP2)、N-N-二甲基乙二胺(DED)、胱胺中的一种或几种。
[0019] 所述的梳状的以PGEA为骨架的阳离子基因载体的制备方法为：
[0020] 1.0-60℃无氧条件下，将0.05g-0.2g五甲基二乙烯三胺、5g-10g四氢呋喃、6g-12g GMA、0.08g-0.26g配体、0.033g-0.15g CuBr混合，各组分添加顺序为：先将GMA溶于四氢呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配体，最后加入CuBr引发活性可控自由基聚合，或者先将GMA溶于四氢呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配体引发活性可控自由基聚合；聚合反应时间为1-9h，反应完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得产物为线性PGMA；所述的配体为2，2-联吡啶(BPY)、1，1，4，7，10，10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA)、4，
4-联吡啶中的一种或几种；
[0021] 2.0-60℃无氧条件下，将1.5g-2.5g步骤1中制备的线性PGMA溶于7g-10g四氢呋喃或N-N-二甲基甲酰胺中，再加入0.36g-0.37gα-溴异丁酸(BIBA)；反应12-48h，优选24-48h，用乙醚沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚，所得产物为PGMA-Br；
[0022] 3.0-60℃无氧条件下，将0.2g-0.5g步骤2得到的PGMA-Br、5g-10g
有机溶剂、3g-6g单体、0.082g-0.15g配体、0.033g-0.1g CuBr混合，各组分加入顺序为：先将PGMA-Br溶于
有机溶剂，然后加入单体，再加入配体，最后加入CuBr引发活性可控自由基聚合，或者先将PGMA-Br溶于有机溶剂中，然后加入单体，再加入CuBr，最后加入配体引发活性可控自由基聚合；反应1-500min，优选1-450min，然后加入甲醇，或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，最后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，即得到梳状的以PGMA为骨架的聚合物；
[0023] 4.0-60℃无氧条件下，将0.1-0.5g步骤3得到的梳状的以PGMA为骨架的聚合物溶于5g-10g四氢呋喃或N-N-二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和1g-2g三乙胺，开环反应72-168h；然后用乙醚沉淀直到产物形貌为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后将产物溶于水中，加水量与产物的比例为100-300ml/g；产物溶解后放入截留分子量为2500-4500Mw的透析袋中，在去离子水中透析3-6h；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得到梳状的以PGEA为骨架的阳离子基因载体。
[0024] 步骤3所述的有机溶剂为N-N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
[0025] 步骤3所述的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯(DMEMA)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、聚(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯(PEGEEMA)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇(PEG)中的一种或几种。
[0026] 步骤3所述的配体为2，2-联吡啶(BPY)、1，1，4，7，10，10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA)、4，4-联吡啶中的一种或几种。
[0027] 步骤4所述的醇胺为乙醇胺(EA)、2-氨基-1-丙醇(AP1)、3-氨基-1-丙醇(AP2)、N-N-二甲基乙二胺(DED)、胱胺中的一种或几种。
[0028] 有益效果：本发明利用活性可控自由基聚合法制得分子量大小从20000-100000，分子量分布1.6-2.1的聚合物。该聚合反应平稳，易于调控，并可根据需要制备出多种不同分子量系列的、窄分子量分布的高性能阳离子基因载体。该基因载体储存
稳定性好，放置几天或几个月后仍可保持原有性能；并且在Hepg2、Hela、C6、Cos7、HEK293等细胞中具有高于PEI(25Kda)的转染效率，使用方法简单，具有商业化潜力。
附图说明
[0029] 图1不同的以PGMA为骨架的梳状阳离子基因载体的合成图。
[0030] 图2以PGMA为骨架的线性阳离子基因载体的开环反应图。
[0031] 图3转染效率图；PEI为金标，1-PGEA为
实施例1得到的线性的以PGMA为骨架的阳离子基因载体PGEA；c-PGEA、c-PGEAPEG分别为实施例3和是实施例4得到的梳状的以PGMA为骨架的阳离子基因载体。
[0032] 图4细胞内毒性曲线图；PEI为金标，1-PGEA为实施例1得到的线性的以PGMA为骨架的阳离子基因载体PGEA；c-PGEA、c-PGEAPEG分别为实施例3和实施例4得到的梳状的以PGMA为骨架的阳离子基因载体。
具体实施方式
[0033] 实施例1
[0034] 1)50℃氮气保护条件下连续反应，将12gGMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)加入小烧瓶中，然后依次加入10g的THF(四氢呋喃)、120mg五甲基二乙烯三胺、213.6mg PMDETA，最后加入86.4mg CuBr来引发活性可控自由基聚合；3h后打开瓶塞加速搅拌10min，与空气充分
接触停止反应，聚合产物用甲醇反复沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去甲醇，即得到线性PGMA，该聚合物数均分子量(Mn)为580000g/mol，PDI(Mw/Mn)为1.23。
[0035] 2)50℃氮气保护条件下连续反应，将0.3g步骤1)得到的线性PGMA加入5.6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺(或使用2-氨基-1-丙醇、3-氨基-1-丙醇、N-N-二甲基乙二胺、或者0.15g乙醇胺和0.15g N-N-二甲基乙二胺)，1g的三乙胺后进行开环反应168h，聚合产物用乙醚反复沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后将产物溶于40ml水放入截留分子量为3500Mw的透析袋中，之后转入5L大烧杯中加满去离子水开始透析，透析6h；之后放入
冷冻干燥机中冷冻干燥直至除去所有水分，得到线性的以PGMA为骨架的阳离子基因载体，记为PGEA(使用2-氨基-1-丙醇得到的产物记为PGAP1，使用3-氨基-1-丙醇得到的产物记为PGAP2，使用N-N-二甲基乙二胺得到的产物记为PGDED，使用0.15g乙醇胺和0.15g N-N-二甲基乙二胺得到的产物记为PGEADED)。
[0036] 实施例2
[0037] 1)37℃氮气保护条件下连续反应，在烧瓶中取1.5克实施例1的步骤1)中得到的线性PGMA溶于10g的THF中，加入0.36克BIBA(2-Bromoisobutyric acid)，反应24h后，乙醚沉淀，真空干燥后得到PGMA-Br(PGMA/BIBA为5∶1，分子链上每6个GMA链段中有一个上面接Br)。
[0038] 2)50℃氮气保护条件下连续反应，将0.3g上述步骤1)得到的PGMA-Br加入5g THF中溶解，然后依次加入4gGMA，82mg的HMTETA，最后加入33.5mg的CuBr引发活性可控自由基聚合，待反应4h后打开瓶塞加速搅拌10min，与空气充分接触停止反应；聚合产物用甲醇反复沉淀直到产物变为固体，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳状PGMA。
[0039] 3)50℃氮气保护条件下连续反应，将0.3g步骤2)得到的梳状PGMA加入5.6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，1g的三乙胺后进行开环反应168h，聚合产物用乙醚反复沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后将产物溶于40ml水放入截留分子量为3500Mw的透析袋中，之后转入5L大烧杯中加满去离子水开始透析，透析6h；之后放入冷冻干燥机中冷冻干燥直至除去所有水分，得到梳状的以PGMA为骨架的阳离子基因载体。
[0040] 实施例3
[0041] 1)37℃氮气保护条件下连续反应，在烧瓶中取2.5克实施例1的步骤1)中得到的线性PGMA溶于10g的THF中，加入0.37克BIBA(2-Bromoisobutyric acid)反应24h后，乙醚沉淀，真空干燥后得到PGMA-Br(PGMA/BIBA为8∶1，分子链上每8个GMA链段中有一个上面接Br)。
[0042] 2)50℃氮气保护条件下连续反应，将0.3g上述步骤1)得到的PGMA-Br加入5g THF中溶解，然后依次加入4gGMA，82mg的HMTETA，最后加入33.5mg的CuBr引发活性可控自由基聚合，待反应4h后打开瓶塞加速搅拌10min，与空气充分接触停止反应；聚合产物用甲醇反复沉淀直到产物变为固体，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳状PGMA。
[0043] 3)50℃氮气保护条件下连续反应，将0.3g步骤2)得到的梳状PGMA加入5.6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，1g的三乙胺后进行开环反应168h，聚合产物用乙醚反复沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后将产物溶于40ml水放入截留分子量为3500Mw的透析袋中，之后转入5L大烧杯中加满去离子水开始透析，透析6h；之后放入冷冻干燥机中冷冻干燥直至除去所有水分，得到梳状的以PGMA为骨架的阳离子基因载体。
[0044] 实施例4
[0045] 1)50℃氮气保护条件下连续反应，将0.3g实施例3中步骤1)得到的PGMA-Br加入3.6gTHF中溶解，然后依次加入3.7gGMA，0.3g PEGEEMA，82mg的HMTETA，最后加入33.5mg的CuBr引发活性可控自由基聚合，待反应4h后打开瓶塞加速搅拌10min，与空气充分接触停止反应；聚合产物用甲醇反复沉淀直到产物
颜色变浅为止，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳状P(GMA-PEGEEMA)。
[0046] 2)50℃氮气保护条件下连续反应，将0.3g步骤1)得到的梳状P(GMA-PEGEEMA)加入5.6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，1g的三乙胺后进行开环反应168h，聚合产物用乙醚反复沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后将产物溶于40ml水放入截留分子量为3500Mw的透析袋中，之后转入5L大烧杯中加满去离子水开始透析，透析6h；之后放入冷冻干燥机中冷冻干燥直至除去所有水分，得到梳状的以PGMA为骨架的阳离子基因载体，记为PGEAPEG。
[0047] 通过
X射线光
电子能谱(XPS)表征聚合物主要组分的含量，用
核磁共振谱仪(NMR)对原料、反应中间体和产物进行了结构分析和验证。使用激光粒度及电位分析仪表征所得产物的粒径、zeta电位，用凝胶渗透色谱(GPC)对产物的可剪切性和分子量进行了表征。最后，通过凝胶
电泳实验测试所得基因载体包埋DNA的能力，细胞转染实验测试了产物载体的转染效率和
生物相容性。所得到的阳离子基因载体的转染效率和毒性如图3和图4。
