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一种用于胆汁淤积防治的hFXR激动剂的高通量筛选模型

阅读：4发布：2021-03-22

专利汇可以提供一种用于胆汁淤积防治的hFXR激动剂的高通量筛选模型专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于胆汁淤积防治的hFXR激动剂的高通量筛选模型。本发明涉及种筛选人法尼醇X受体激动剂方法，利用该方法可以筛选能够对FXR产生的激动作用的活性药物配体，可用来预防和治疗胆汁淤积。所诉方法将hFXR表达质粒、萤火虫萤光素酶报告基因质粒和内参比海肾萤光素酶质粒瞬时共转染人胚肾HEK293T细胞，同时检测萤火虫和海肾荧光素酶的活性反映药物对FXR活性的调控作用，从而建立能快速、方便地筛选具有激动FXR活性的化学合成物和天然产物，为胆汁淤积防治的新药研发与临床提供新的途径。，下面是一种用于胆汁淤积防治的hFXR激动剂的高通量筛选模型专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于胆汁淤积防治的hFXR激动剂的高通量筛选模型，其特征在于包括如下步骤：1.1将处于对数生长期的人胚肾HEK293T细胞进行消化，将细胞吹打均匀后按适当密度接种于96孔板中；细胞种板后放入细胞培养箱中，12-16个小时后，至细胞在96孔板中覆盖率达到60-80%即可进行质粒转染；1.2 转染4-6小时后，对已转染的细胞分别加入适量含药培养基进行孵育，设置阴性对照组、阳性激动对照组和受试药物组，孵育24-48小时后进行双荧光报告基因检测。
2.权利要求1.1所述的方法，其特征在于所诉的质粒为hFXR表达质粒、萤火虫萤光素酶报告基因质粒和内参比海肾萤光素酶质粒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述萤火虫萤光素酶报告基因质粒为含有Ecdysone receptor启动子区域的报告基因质粒。
4.根据权利要求1.2所诉的方法，其特征在于所诉阳性激动对照组选用鹅去氧胆酸-1
（CDCA）作为阳性激动剂，优选浓度为10~50 μmolL 。
5.根据权利要求1.2所诉的方法，其特征在于：双萤光素酶报告基因检测按照Promega公司双萤光素酶报告基因检测试剂盒进行操作。
6.根据权利要求1.2所诉的方法，其特征在于：每孔的萤光素酶活性值用海肾萤光素酶的活性进行校正，故最后每样品孔校正酶活性为：RLU（相对荧光强度）= 萤火虫萤光素酶活性值/海肾萤光素酶的活性值。
7.根据权利要求1和6所诉的方法，其特征在于：以检测出来的RLU（相对荧光强度）来hFXR的活性高低，以样品对RLU（相对荧光强度）的调控作用来评价该样品对hFXR活性的调控作用。

说明书全文

一种用于胆汁淤积防治的hFXR激动剂的高通量筛选模型

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学和药理学领域，具体地说本发明涉及一种筛选人法尼醇X受体激动剂方法，利用该方法可以筛选能够对FXR产生的激动作用的活性药物配体，并应用于中药单体化合物库以及临床药物，为胆汁淤积防治的新药研发与临床提供新的途径。

背景技术

[0002] 利用效应靶标寻找治疗相关疾病的先导化合物是新药研发领域越来越重要的手段。法尼醇X受体（Farnesoid X receptor, FXR）属于核受体超家族的一员，是一个重要的配体激活转录因子，在胆汁酸代谢、脂代谢、糖代谢和肝脏保护等过程中具有多种重要的调控功能。作为一种代谢调节因子，FXR可通过作用于在胆汁酸、胆固醇代谢以及转运中起重要作用的靶基因，抑制胆汁酸的生成，加速胆汁酸的排泄、解毒，并调节其转运。同时，FXR作为胆汁酸感受器，可使肝细胞避免胆汁酸超负荷和过多堆积所引发的组织损伤，是胆汁酸内环境稳态的主要调节因子。FXR作为新型药物靶点，近十年来其相关研究不断深入，尤其是在与胆汁淤积等方面。研究显示，FXR激动剂（如GW4064、6-ECDCA）可通过诱导雌激素预防肝细胞免受胆汁淤积的影响，可诱导BSEP、MRP2和MDR2基因的表达，且可逆转胆管增生和坏死等。因此，FXR激动剂已成为肝内胆汁淤积防治药物研发的热点。

[0003] 在药物研发方面，分子、细胞水平的体外/体内药物筛选模型是在激素-核受体作用机制的基础上建立的。研究人员从受体的亲和力、专一性以及对受体功能影响等多个角度，探寻具有激动或拮抗活性的化合物，并据此研发出有效的受体药物。采用的方法包括计算机辅助药物虚拟筛选、同位素竞争试验、生物传感器检测、共激活物/共抑制物结合试验、哺乳动物单杂交技术共转染报告基因系统等。其中，报告基因法建立药物筛选模型更为简便、快速。

[0004] 以FXR为靶标寻找调节FXR的小分子药物——FXR激动剂，对于研发预防或治疗胆汁酸淤积的新药有重要意义。构建一个以高通量筛选技术为核心的细胞水平的FXR激动剂筛选模型，将表达质粒和报告质粒瞬时共转染动物细胞，通过测定报告基因荧光素酶的表达水平检测化合物的激动活性，从而进行 FXR 的激动功能性筛选，从中药单体化合物库中寻找预防或治疗胆汁淤积的先导化合物。本发明将会提供一个有力的工具，在更大的范围内（中药单体化合物库以及临床药物），用更经济快捷的方法寻找出效应强、毒副作用小的药物，为胆汁淤积防治的新药研发与临床提供新的途径。

发明内容

[0005] 本发明的目的是在于提供一种操作简单、特异性好的可用于筛选激动人法尼醇X受体（hFXR）活性的药物的高通量筛选方法。

[0006] 为实现上述目的，本发明将该方法应用于人胚肾HEK293T细胞，简历一种快速筛选hFXR激动剂的方法，该方法包括如下步骤：1）将处于对数生长期的人胚肾HEK293T细胞进行消化，将细胞吹打均匀后按适当密度接种于96孔板中；细胞种板后放入细胞培养箱中，12~16个小时后，至细胞在96孔板中覆盖率达到60~80%即可进行质粒转染。

[0007] 2）转染4-6小时后，对已转染的细胞分别加入适量含药培养基进行孵育，设置阴性对照组、阳性激动对照组和受试药物组，孵育24~48小时后进行双荧光报告基因检测。

[0008] 所诉步骤1）中的质粒为hFXR表达质粒、萤火虫萤光素酶报告基因质粒和内参比海肾萤光素酶质粒。

[0009] 所诉步骤1）中质粒中的萤火虫萤光素酶报告基因质粒为含有Ecdysone receptor启动子区域的报告基因质粒。

[0010] 所诉步骤2）中的阳性激动对照组选用鹅去氧胆酸（CDCA）作为阳性激动剂，优选-1浓度为10~50 μmolL 。

[0011] 所诉步骤2）中的双萤光素酶报告基因检测按照Promega公司双萤光素酶报告基因检测试剂盒进行操作：1) 去除培养孔中的培养基，用PBS溶液洗涤细胞1次，然后用一次性注射器小心去除PBS溶液，每个培养孔中加入20 μL 1×PLB溶液，室温下震荡15 min。

[0012] 2) 提前将100 μL LARII溶液加入到报告基因检测试管底部中，转移震荡后的裂解产物100 μL入LARII液体内,用枪吹打6-7下后，用化学发光检测萤光素酶活性，再迅速加入100 uL Stop & GloReagent，涡旋3秒后混匀后进行海肾萤光素酶活性检测。

[0013] 所诉步骤2）中的报告基因检测结果按照RLU（相对荧光强度）来表示：每孔的萤光素酶活性值用海肾萤光素酶的活性进行校正，故最后每样品孔校正酶活性为：RLU（相对荧光强度）= 萤火虫萤光素酶活性值/海肾萤光素酶的活性值。以空白组的RLU作为基础表达（统计时以1表示），其他待测物的RLU与其相比，以RLU的大小表示FXR活性的高低。

[0014] 采用本发明可以快速、方便地筛选具有激动FXR活性的化学合成物和天然产物，为胆汁淤积防治的新药研发与临床提供新的途径。附图说明

[0015] 图1是不同浓度的阳性激动剂CDCA对相对荧光强度的作用图；图2是不同核受体激动剂对相对荧光强度的作用图。具体实施方案

[0016] 下面实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的保护范围。需要说明实施例1表达质粒和报告基因质粒的构建
从HepG2细胞中提取细胞内的总RNA，对总RNA进行RT-PCR逆转录总cDNA，然后用特异性引物扩增hFXR的编码序列（CDS）区域，将该DNA序列连接到pEGFP-N3载体上构建了融合表达载体pEGFP-N3-hFXR。过表达质粒pEGFP-N3-hFXR含有hFXR的CDS区域全长，其中包含了 FXR 羧基末端配体结合区（LBD）的基因序列，并且含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达。

[0017] 人工合成5个拷贝含有Ecdysone receptor的启动子区域连接到pGL3-basic载体上构建了报告基因质粒pGL3-EcRE。该报告基因质粒pGL3-EcRE含有蜕皮激素响应元件 ecdysone response element（EcRE），该反应元件能被FXR-RXRα特异性结合并启动下游基因的转录。

[0018] 实施例2根据所得到的最佳转染条件分别瞬转入FXR的表达质粒和报告基因质粒以及内参质粒pRL-TK的HEK293细胞给予相应阳性药，药物刺激24 h后检测双萤光素酶活性，结果如图1所示，相对荧光强度均与阳性药物呈剂量依赖性增长，其中，100 μM CDCA的相对荧光强度最高可达到30左右。

[0019] 实施例3模型特异性的考察
采用PXR激动剂Rif、FXR激动剂CDCA、LXRα激动剂T0901317、PPARγ激动剂Rog和组成型雄甾烷CAR受体激动剂CITCO对这FXR药物筛选模型的特异性进行考察。使用不同浓度的受试药物处理转染后的HEK293细胞，24h后检测相对萤光素酶活性。结果如图2所示，只有FXR阳性激动剂CDCA可对相对荧光素酶活性产生良好诱导，其他核受体激动剂都不能对FXR产生激动作用。

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