表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法
阅读：2发布：2020-06-19
专利汇可以提供表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，包括以下步骤：构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体；将所述重组慢病毒表达载体和慢病毒 包装 质粒共 转染 到293T细胞得到已包装的慢病毒；以及用所述已包装的慢 病毒感染 RBL-2H3细胞。，下面是表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法专利的具体信息内容。
1.一种表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，包括以下步骤：
构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体；
将所述重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒共转染到293T细胞得到已包装的慢病毒；以及
用所述已包装的慢病毒感染RBL-2H3细胞。
2.根据权利要求1所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体的步骤包括：
提供所述hFcεRIα基因；
提供原始慢病毒表达载体；以及
将所述hFcεRIα基因与所述原始慢病毒表达载体连接。
3.根据权利要求2所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，所述原始慢病毒表达载体包括GV367载体。
4.根据权利要求1所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，所述慢病毒包装质粒包括pHelper 1.0和pHelper 2.0。
5.根据权利要求4所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，所述重组慢病毒表达载体：pHelper 1.0：pHelper 2.0的质量比为(3～5)：(2～4)：(2～4)。
6.根据权利要求5所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，所述重组慢病毒表达载体：pHelper 1.0：pHelper 2.0的质量比为4：3：3。
7.根据权利要求1所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，所述重组慢病毒表达载体含有绿色荧光蛋白标签。
8.根据权利要求2所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，所述提供所述hFcεRIα基因的步骤包括：
提供人cDNA；
提供用于hFcεRIα基因扩增的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；以及
以所述人cDNA为模板、所述上游引物和所述下游引物为引物，经过PCR扩增得到所述hFcεRIα基因。
9.根据权利要求1所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，用于感染所述RBL-2H3细胞的所述已包装的慢病毒的病毒滴度为1×108TU/mL～1×109TU/mL。
10.根据权利要求1所述的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，其特征在于，被感染的所述RBL-2H3细胞的细胞密度为1×104个/mL～1×105个/mL。
表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法
技术领域
背景技术
[0002] 近年来，变态反应疾病的发病率呈上升的趋势，对人类健康的危害日益严重，发达国家每年有3％-4％的成年人发生食物过敏，儿童及婴幼儿食物过敏的发生率为5％。另外，随着转基因食品的快速发展，转基因食品的安全性尤其是致敏性成为人们关注的热点。能够导致食物过敏的食品有很多种，食品法典食品标签分委会(CCFL)列出了8种主要的致敏性食品：花生、大豆、奶、鸡蛋、鱼、贝壳类、小麦和坚果。研究表明，食物过敏涉及各种类型的免疫反应，尤以I型过敏反应，即IgE介导的食物过敏最为常见。肥大细胞、嗜碱性粒细胞等效应细胞表面FcεRI与IgE结合是触发变态反应的关键。
[0003] RBL-2H3细胞作为大鼠嗜碱性白血病粒细胞系(rat basophil leukemia，RBL)的一个亚系，与肥大细胞的许多特性和功能类似，常用于过敏反应、免疫反应等方面的研究。RBL-2H3细胞表面表达鼠IgE高亲和力受体(FcεRI)，由于种属特异性，不能与人血清IgE结合，因此使用RBL-2H3细胞研究人IgE与FcεRI作用有局限性。故构建表达人IgE高亲和力受体(hFcεRI)的人源化RBL-2H3细胞，是研究食物过敏的重要方法之一。hFcεRI以αβγ2四聚体(α、β和两个γ亚基组成)或αγ2三聚体(α和两个γ亚基组成)的形式存在，啮齿类动物FcεRI只以αβγ2的形式存在。人IgE高亲和力受体α亚基(hFcεRIα)是人IgE的结合部位，是触发过敏反应的关键部位，对过敏性疾病的诊断和治疗提供重要的信息。因此构建稳定表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株是研究的热点。
发明内容
[0004] 基于此，有必要针对由于种属特异性，RBL-2H3细胞仅能表达鼠IgE高亲和力受体的问题，提供一种表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法。
[0005] 一种表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0006] 构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体；
[0008] 用所述已包装的慢病毒感染RBL-2H3细胞。
[0009] 在其中一个实施例中，所述构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体的步骤包括：
[0010] 提供所述hFcεRIα基因；
[0011] 提供原始慢病毒表达载体；以及
[0012] 将所述hFcεRIα基因与所述原始慢病毒表达载体连接。
[0013] 在其中一个实施例中，所述原始慢病毒表达载体包括GV367载体。
[0014] 在其中一个实施例中，所述慢病毒包装质粒包括pHelper 1.0和pHelper 2.0。
[0015] 在其中一个实施例中，所述重组慢病毒表达载体：pHelper 1.0：pHelper 2.0的质量比为(3～5)：(2～4)：(2～4)。
[0016] 在其中一个实施例中，所述重组慢病毒表达载体：pHelper 1.0：pHelper 2.0的质量比为4：3：3。
[0017] 在其中一个实施例中，所述重组慢病毒表达载体含有绿色荧光蛋白标签。
[0018] 在其中一个实施例中，所述提供所述hFcεRIα基因的步骤包括：
[0019] 提供人cDNA；
[0020] 提供用于hFcεRIα基因扩增的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；以及
[0021] 以所述人cDNA为模板、所述上游引物和所述下游引物为引物，经过PCR扩增得到所述hFcεRIα基因。
[0022] 在其中一个实施例中，用于感染所述RBL-2H3细胞的所述已包装的慢病毒的病毒滴度为1×108TU/mL～1×109TU/mL。
[0024] 本发明实施例通过构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体，在293T细胞中，通过所述慢病毒包装质粒，将所述含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体进行包装，得到所述已包装的慢病毒，所述已包装的慢病毒中含有hFcεRIα基因，利用所述已包装的慢病毒感染目的细胞RBL-2H3细胞，从而能够将目的基因hFcεRIα基因整合到宿主细胞RBL-2H3细胞中，从而能够得到表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株，所述表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株可作为研究人食物过敏的实验细胞，为进一步研究打下实验基础。附图说明
[0025] 图1为本发明一实施例的hFc的一为研基因PCR扩增的电泳结果照片；
[0026] 图2为本发明一实施例的菌落PCR的电泳结果照片；
[0027] 图3为本发明一实施例的白光和荧光显微镜下的慢病毒感染RBL-2H3细胞的结果照片，其中，图3A为白光下的空白对照组，图3B为白光下的阴性对照组，图3C为白光下的实验组，图3D、图3E及图3F分别为图3A、图3B及图3C在荧光显微镜下的照片；
[0028] 图4为本发明一实施例的流式细胞仪检测感染RBL-2H3细胞的GFP和hFcεRIα的表达状态照片，其中，图4A为空白对照组，图4B为阴性对照组，图4C为实验组。
具体实施方式
[0029] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0030] 本发明实施例提供一种表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0031] S10，构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体；
[0032] S20，将所述重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒共转染到293T细胞得到已包装的慢病毒；以及
[0033] S30，用所述已包装的慢病毒感染RBL-2H3细胞。
[0034] 本发明实施例通过构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体，在293T细胞中，通过所述慢病毒包装质粒，将所述含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体进行包装，得到所述已包装的慢病毒，所述已包装的慢病毒中含有hFcεRIα基因，利用所述已包装的慢病毒感染目的细胞RBL-2H3细胞，从而能够将目的基因hFcεRIα基因整合到宿主细胞RBL-2H3细胞中，从而能够得到表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株，所述表达hFcεRIα的RBL-2H3细胞株可作为研究人食物过敏的实验细胞，为进一步研究打下实验基础。
[0035] 慢病毒属逆转录病毒科，慢病毒载体是基因工程的重要工具。本发明实施例的利用慢病毒感染的方式将外源目的基因hFcεRIα基因整合至宿主细胞RBL-2H3细胞的基因组中，使hFcεRIα基因在RBL-2H3细胞中获得稳定持久的表达，相对于传统的质粒转染表达方式，本发明实施例的慢病毒感染方式的感染宿主细胞的能力更强，目的基因hFcεRIα基因在宿主细胞RBL-2H3细胞中的表达效率更高。相对于其他病毒转染方式，如逆转录病毒感染、腺病毒感染，本发明实施例的慢病毒感染也具有很大的优势。例如逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。而本发明实施例的慢病毒感染方式能够感染任何时期的RBL-2H3细胞、能够容纳外源性基因片段大，例如可以容纳10kb，甚至百kb的质粒，并且可以长期表达，有利于对病理现象的深入研究。
[0036] 在一实施例中，慢病毒包装系统由慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒组成。所述慢病毒表达载体，包含包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。所述慢病毒包装质粒可提供所有的转录和包装所需要的辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的慢病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因hFcεRIα基因随已包装的慢病毒进入到宿主细胞RBL-2H3细胞株之后，经过反转录，整合到RBL-2H3细胞株基因组，从而高水平的表达hFcεRIα。
[0037] 在步骤S10中，所述构建含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体的步骤可以包括：
[0038] S11，提供所述hFcεRIα基因；
[0039] S12，提供原始慢病毒表达载体；以及
[0040] S13，将所述hFcεRIα基因与所述原始慢病毒表达载体连接。
[0041] 在一实施例中，提供所述hFcεRIα基因的步骤可以包括：
[0042] S111，提供人cDNA；
[0043] S112，提供用于hFcεRIα基因扩增的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；以及
[0044] S113，以所述人cDNA为模板、所述上游引物和所述下游引物为引物，经过PCR扩增得到所述hFcεRIα基因。
[0045] 本实施例以人cDNA为模板(addgene公司)，人cDNA中包括hFcεRIα基因的全长序列，通过设计用于特异性扩增hFcεRIα基因的上游引物和下游引物，经过PCR特异性扩增得到所述hFcεRIα基因的扩增复制品。扩增得到的所述hFcεRIα基因作为目的基因，通过进一步的与所述原始慢病毒表达载体连接构建所述重组慢病毒表达载体。
[0046] 在一实施例中，所述PCR扩增得到的产物在用于与所述原始慢病毒表达载体连接之前可以包括S114，验证步骤。通过验证步骤以检验hFcεRIα基因是否扩增成功。所述验证步骤可以为电泳验证，所述hFcεRIα基因的全长为920bp左右，如果电泳结果在820bp附近有条带，则说明扩增结果正确。
[0047] 在其中一个实施例中，所述原始慢病毒表达载体可以优选为GV367载体，GV367载体与目的基因hFcεRIα基因连接得到的重组慢病毒表达载体更有利于在293T细胞的转染和包装。
[0048] 在步骤S13中，可以通过将所述原始慢病毒表达载体进行酶切，酶切后的原始慢病毒表达载体与目的基因hFcεRIα基因通过酶连接得到所述重组慢病毒表达载体，从而使重组慢病毒表达载体携带所述hFcεRIα基因。所述酶连接产物可以通过转化到感受态细胞，使重组慢病毒表达载体得到进一步体内扩增。在一实施例中，所述原始慢病毒表达载体为GV367载体，所述酶切位点可以为Agel和Nhel双酶切位点。
[0049] 进一步，转化到所述感受态细胞的所述酶连接产物可以包括进一步的验证步骤。所述验证步骤用以检验hFcεRIα基因和原始慢病毒表达载体是否酶连接成功。所述进一步的验证步骤可以包括菌落PCR验证。所述菌落PCR的引物可以包括如SEQ ID NO.3所示和如SEQ ID NO.4所示的引物组合。经过所述引物组合扩增得到的菌落PCR产物理论的序列长度为1363bp，如果菌落PCR产物的序列长度在1363bp附近，则说明hFcεRIα基因和原始慢病毒表达载体的酶连接成功。进一步，菌落PCR验证成功后可以包括基因测序步骤，对验证成功的样本进行基因测序，根据测序结果能够准确判断hFcεRIα基因和原始慢病毒表达载体的没连接是否成功。
[0050] 在其中一个实施例中，所述重组慢病毒表达载体含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)标签，通过测定GFP标签便于判断宿主细胞RBL-2H3细胞的感染效率和计算已包装的慢病毒的病毒滴度。
[0051] 在步骤S20中，所述慢病毒包装质粒用于提供对所述重组慢病毒进行转录和包装的辅助蛋白。所述慢病毒包装质粒可以为一种质粒或两种质粒。可以根据实际需要选择最优的方案。在一实施例中，所述慢病毒包装质粒可以包括pHelper 1.0和pHelper 2.0采用pHelper 1.0和pHelper 2.0两种慢病毒包装质粒的组合使得包装效果更好，生物安全性更高。
[0052] 在其中一个实施例中，用于共转染所述293T细胞的所述重组慢病毒表达载体和所述慢病毒包装质粒的质量比是慢病毒包装的关键因素，影响慢病毒质量和进一步的感染宿主细胞的RBL-2H3细胞的效率。在一实施例中，所述慢病毒包装质粒为pHelper 1.0和pHelper 2.0的二元慢病毒包装载体。所述重组慢病毒表达载体：pHelper 1.0：pHelper 2.0的质量比可以为(3～5)：(2～4)：(2～4)。在该质量比范围内，对于所述重组慢病毒表达载体的包装效果更好，所述已包装的慢病毒对于RBL-2H3细胞的感染效率更高。优选的，所述重组慢病毒表达载体：pHelper 1.0：pHelper 2.0的质量比为4：3：3。
[0053] 在一实施例中，通过培养基培养293T细胞，在添加转染液的条件下将所述重组慢病毒表达载体和所述慢病毒包装质粒共转染到所述293T细胞进行慢病毒包装。已包装的慢病毒具有蛋白质外壳和所述蛋白质外壳包裹的含有hFcεRIα基因的重组慢病毒表达载体，得到的所述已包装的慢病毒具有感染宿主细胞RBL-2H3细胞的能力。优选的，所述293T细胞宜处于对数期，对数期的细胞的生长速率更快，细胞的状态更高，有利于转染的进行。
[0054] 在一实施例中，所述转染液可以包括LipofectamineTM2000，所述包括LipofectamineTM2000的转染液使用方便，可直接加入所述培养基中进行转染，并且所述包括LipofectamineTM2000的转染液的加入对于293T细胞自身的生长影响较小，更有利于保持
293T细胞良好的生长质量。
293T细胞良好的生长质量。
[0055] 在一实施例中，将所述重组慢病毒表达载体和所述慢病毒包装质粒共转染到所述293T细胞时，所述293T细胞的培养基为无血清培养基，无血清培养基的环境更有利于所述重组慢病毒表达载体和所述慢病毒包装质粒穿过细胞膜转染进入所述293T细胞内部。在一实施例中，转染后的293T细胞采用胎牛血清培养基进行培养，所述胎牛血清的营养程度更有利于转染后的293T细胞的生长。
[0056] 在其中一个实施例中，收集所述转染后的293T细胞的细胞上清液，所述细胞上清液中含有所述已包装的慢病毒，用于后续感染所述RBL-2H3细胞。
[0057] 在一实施例中，在感染所述RBL-2H3细胞之前，可以包括对所述已包装的慢病毒进行病毒滴度测定的步骤。所述病毒滴度的测定可以包括以下步骤：对所述已包装的慢病毒进行稀释；提取所述稀释液的DNA；以及进行实时荧光定量PCR。所述已包装的慢病毒的DNA含有绿色荧光蛋白(GFP)标签，能够通过实时荧光定量PCR检测所述已包装的慢病毒的DNA的荧光变化得到所述稀释液的荧光细胞数。所述病毒滴度的计算公式为：病毒滴度(TU/mL)＝荧光细胞数/终末稀释管所含的病毒原液量。优选的，用于感染所述RBL-2H3细胞的所述已包装的慢病毒的病毒滴度为1×108TU/mL～1×109TU/mL。在所述病毒滴度范围内，所述已包装的慢病毒对RBL-2H3细胞的感染能力更强。
[0058] 在步骤S30中，在用已包装的慢病毒感染RBL-2H3细胞前，将所述被感染的所述RBL-2H3细胞培养至一定的细胞密度。所述被感染的所述RBL-2H3细胞的细胞密度对于慢病毒的感染效率有很大影响。优选的，所述被感染的所述RBL-2H3细胞的细胞密度为1×104个/mL～1×105个/mL。在所述细胞密度范围内，所述RBL-2H3细胞的生长状态较好。
[0059] 进一步的，在步骤S30还包括步骤S40，验证已包装的慢病毒对RBL-2H3细胞的感染情况。
[0060] 在一实施例中，所述验证已包装的慢病毒对RBL-2H3细胞的感染情况可以通过实时荧光定量PCR检测hFcεRIα基因的表达、流式细胞仪检测GFP表达率和流式细胞仪检测hFcεRIα的表达之中的一种或多种方式进行验证。所述实时荧光定量PCR检测hFcεRIα基因的表达可以通过提取被感染的RBL-2H3细胞的mRNA，以所述被感染的RBL-2H3细胞的mRNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测被感染的RBL-2H3细胞的hFcεRIα基因的表达量。通过验证，可以判断hFcεRIα基因是否能够成功在RBL-2H3细胞进行表达。
[0061] 实施例
[0062] (1)重组慢病毒表达载体的构建
[0063] hFcεRIα基因扩增PCR：反应体系：上游引物(序列如SEQ ID NO.1所示，10μM)1μL，下游引物(序列如SEQ ID NO.2所示，10μM)1μL，5×buffer10μL，dNTP混合物(各2.5mM)4μL，模板cDNA(10ng/μL)1μL，DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 32.5μL，共50μL；扩增循环反应条件：98℃10秒，55℃10秒，72℃90秒，30个循环。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳结果请参阅图1，出现820bp左右的扩增条带，说明hFcεRIα基因扩增成功。
[0064] 对初始慢病毒表达载体GV367载体进行Agel/Nhel双酶切使其线性化，反应体系：GV367质粒(1μg/μL)2μL，10×酶切缓冲液5μL，AgeI(10U/μL)1μL，NheI(10U/μL)1μL，ddH2O
41μL，共50μL；反应条件：37℃酶切3h。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切目的条带。hFcεRIα基因扩增PCR产物与AgeI/NheI双酶切的GV367载体进行酶连接得到重组慢病毒表达载体。酶连接反应体系及条件如下：5×细胞缓冲液2μL，hFcεRIα基因扩增PCR产物(0.1μg/μL)1μL，双酶切的GV367载体2.5μL，DNA连接酶1μL，ddH2O 3.5μL；37℃反应30min。
41μL，共50μL；反应条件：37℃酶切3h。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切目的条带。hFcεRIα基因扩增PCR产物与AgeI/NheI双酶切的GV367载体进行酶连接得到重组慢病毒表达载体。酶连接反应体系及条件如下：5×细胞缓冲液2μL，hFcεRIα基因扩增PCR产物(0.1μg/μL)1μL，双酶切的GV367载体2.5μL，DNA连接酶1μL，ddH2O 3.5μL；37℃反应30min。
[0065] 随后将酶连接产物置于冰水浴中冷却5min，将酶连接产物与TOP10感受态细胞混匀，混匀产物在冰上放置30min，42℃热激90s，冰水浴孵育2min。然后将所述混匀产物加入500μL的LB液体培养基，置于37℃摇床振荡培养1h得到菌液。将所述菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素抗性的筛选平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。
[0066] 其中，试剂来源：上游引物和下游引物由捷瑞生物公司合成；GV367载体(上海吉凯基因化学技术有限公司)；模板cDNA(addgene公司)。
[0067] (2)菌落PCR验证
[0068] 在超净工作台中，用无菌枪头挑取筛选平板上的8个单菌落分别置于20μL菌落PCR验证体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。
[0069] 菌落PCR验证体系为：上游引物(序列如SEQ ID NO.3所示)(10μM)0.4μl，下游引物(序列如SEQ ID NO.4所示)(10μM)0.4μl，2×Taq Plus Master Mix(菌落PCR反应试剂)10μl，ddH2O 9.2μl，共20μl。菌落PCR扩增循环反应条件：94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，30秒，22个循环。菌落PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，请参阅图2，泳道1表示阴性对照(ddH2O)；泳道2表示阴性对照(空载自连GV367载体对照组)；泳道3表示阳性对照，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)；泳道4表示DNA分子量标记Marker；泳道5-12表示不同菌落的菌落PCR扩增产物。结果显示，泳道5-12在1363bp附近均观察到清晰的扩增条带，而泳道2的空载自连GV367载体对照组得到661bp的条带，说明重组慢病毒表达载体构建成功。
[0070] 其中，试剂来源：上游引物和下游引物由捷瑞生物公司合成；菌落PCR其他试剂(Takara公司)。
[0071] (3)重组慢病毒表达载体的包装与纯化
[0072] 按照去内毒素质粒抽提试剂盒说明，分别提取足量重组慢病毒表达载体与空载GV367载体。
[0073] 用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整293T细胞的6
细胞密度约5×10个/15ml，重新接种于10cm的细胞培养皿中，37℃、5％CO2培养箱内培养。
24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。
细胞密度约5×10个/15ml，重新接种于10cm的细胞培养皿中，37℃、5％CO2培养箱内培养。
24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。
[0074] 转染前2h将293T细胞的培养基更换为无血清培养基，将重组慢病毒表达载体或对照空载GV367载体各20μg分别与慢病毒包装质粒(15μg pHelper1.0和10μg pHelper 2.0)TM混合后加入含有适量Lipofectamine 2000的Opti-MEM转染液中，得到转染混合液，调整转染混合液总体积为1mL。室温下孵育15min，将转染混合液缓慢滴加至293T细胞的无血清培养基培养液中进行转染和包装，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
[0075] 培养6h后，弃去含有转染液的培养基，加入10mL的PBS清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染液后倒弃；缓慢加入含10％胎牛血清的细胞培养基20mL，于37℃、5％CO2培养箱继续培养48h。
[0076] 收集转染后48h的293T细胞上清液，4℃，4000rpm/min离心10min，除去细胞碎片。用0.45μm滤器过滤出去细胞碎片的上清液于40mL超速离心管中，于4℃高速离心机中
25000rpm/min离心2h。离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入PBS，轻轻反复吹打重悬，经充分溶解后，高速离心10000rpm/min，离心5min后，取上清分装后-80℃保存备用。所述上清中含有已包装的慢病毒。
25000rpm/min离心2h。离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入PBS，轻轻反复吹打重悬，经充分溶解后，高速离心10000rpm/min，离心5min后，取上清分装后-80℃保存备用。所述上清中含有已包装的慢病毒。
[0077] 其中，试剂来源：去内毒素质粒抽提试剂盒(Promega公司)；LipofectamineTM 2000的Opti-MEM转染液(Thermo Fisher Scientific公司)；293T细胞(上海吉凯基因化学技术有限公司)；pHelper1.0和pHelper 2.0(上海吉凯基因化学技术有限公司)。
[0078] (4)已包装的慢病毒的病毒滴度测定
[0079] 检测前一天，胰酶消化对数生长期293T细胞，调整细胞数至4×105个/ml，将293T细胞按每孔100μl接种到96孔板。检测当日准备10个无菌EP管，每管加入无血清培养基90μl，取待测步骤(3)得到的已包装的慢病毒上清原液10μl加入第一管，混匀后取10μl加入到第二个管中，采用同样操作直到最后一管，得到慢病毒稀释液。选取含293T细胞的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl慢病毒稀释液，培养箱培养，感染24h后，加入完全培养基100μl，小心操作，不要吹起细胞。4天后，观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。计算慢病毒滴度，计算公式如下：病毒滴度(TU/ml)＝荧光细胞数/终末稀释管所含的病毒原液量。计算得到的病毒滴度为5×108TU/mL。
[0080] (5)已包装的慢病毒感染RBL-2H3细胞
[0081] RBL-2H3细胞(由国家食品安全风险评估中心毒理实验室赠予)培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。感染前一天，消化RBL-2H3细胞，调整细胞数至4×104个/ml，每孔2ml接种至6孔板。分别用已包装慢病毒的实验组及空载自连GV367载体慢病毒的阴性对照组感染RBL-2H3细胞。感染16h后更换常规培养基，培养72h后，换成含嘌呤霉素(2μg/ml)的培养基继续培养48h，对慢病毒感染细胞进行筛选，最终获得荧光显微镜下感染已包装慢病毒且稳定表达GFP的目的细胞株。请参阅图3，荧光显微镜下，空白对照组未感染慢病毒，不显示荧光细胞；阴性对照组为空载自连GV367载体慢病毒，空载自连GV367载体含有GFP标签，感染空载自连GV367载体的RBL-2H3细胞均显示荧光；实验组为已包装慢病毒，含有GFP标签，感染已包装慢病毒的RBL-2H3细胞显示荧光。
[0082] 请参阅图4，采用流式细胞仪检测GFP表达和hFcεRIα的表达，结果显示，空白对照组的RBL-2H3细胞不进行GFP和hFcεRIα的表达；阴性对照组的空载自连GV367未插入目的基因hFcεRIα，仅表达GFP，不表达hFcεRIα；而实验组的已包装慢病毒含有重组慢病毒表达载体，能够同时表达GFP和hFcεRIα。
[0083] 请参阅表1，流式细胞仪检测转染RBL-2H3细胞的hFcεRIα的表达的结果统计表明，已包装慢病毒实验组的hFcεRIα表达较阴性对照组和空白对照组明显升高。进行统计学分析显示，已包装慢病毒实验组内的差异有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组与空白组内的差异无统计学意义。
[0084] 表1流式细胞仪检测稳定感染RBL-2H3细胞的hFcεRIα表达
[0085]分组 hFcεRIα
空白对照组 1.19±0.17
阴性对照组 0.98±0.14
实验组 8.10±0.96**
空白对照组 1.19±0.17
阴性对照组 0.98±0.14
实验组 8.10±0.96**
[0086] **表示P<0.01
[0087] 请参阅表2，采用Real-time PCR检测感染RBL-2H3细胞的hFcεRIα的mRNA的表达，结果显示，已包装慢病毒实验组的hFcεRIα的mRNA表达较阴性对照组和空白对照组明显升高。进行统计学分析显示，已包装慢病毒实验组内的差异有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组与空白组内的差异无统计学意义。
[0088] 表2Real-time PCR检测感染RBL-2H3细胞的hFcεRIαmRNA的表达
[0089]分组 hFcεRIα
空白对照组 0.725±0.003
阴性对照组 1.001±0.049
**
实验组 10533.522±1165.428
空白对照组 0.725±0.003
阴性对照组 1.001±0.049
**
实验组 10533.522±1165.428
[0090] **表示P<0.01
[0091] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
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