技术领域
[0001] 本
发明属于狂犬病病毒中和抗体的检测技术领域，尤其涉及一种基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法。
背景技术
[0002] 狂犬病(Rabies)是由嗜神经性的狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)引起的人兽共患的世界性传染病，是一种古老的
疾病，能感染所有温血动物。全球每年死于狂犬病的人数约55000人(WHO数据)，主要集中在亚洲和非洲等一些落后的国家和地区。我国患狂犬病人数呈现逐年上升趋势，仅次于印度，狂犬病已成为我国关注的公共卫生问题之一。一旦出现狂犬病症状，致死率接近100％，目前尚无有效
治疗药物。犬是我国人类狂犬病的主要传染源，占85％～95％，因此，加强犬的暴露前免疫和人暴露后处理是防制狂犬病的根本措施。WHO规定，人和动物血清中狂犬病病毒中和抗体效价大于0.5IU/mL时，即可获得完全保护。70％的犬获得免疫时，基本上可控制犬对人类的传播。随着免疫
密度的加大，需要建立有效的检测手段来监控免疫效果。
[0003] 目前，狂犬病病毒中和抗体定量检测的方法主要有小鼠血清中和试验、空斑减少中和试验、间接免疫
荧光试验、快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)和荧光抗体病毒中和试验(FAVN)。其中，WHO和OIE分别推荐RFFIT和FAVN作为狂犬病病毒中和抗体的标准检测方法。这两种方法检测结果一致性好，在结果判定时，受主观因素影响较小。然而，RFFIT和FAVN以狂犬病病毒CVS-11株作为标准攻毒株，毒
力较强，存在潜在的安全隐患；同时操作较复杂，需要严格的实验室条件和熟练的操作人员；而且需要
质量好且昂贵的特异性抗狂犬病病毒的一抗和FITC标记的二抗，不利于
基层检测狂犬病病毒中和抗体
水平。因此，建立新型安全、经济、快速的狂犬病病毒中和抗体检测方法是现实需要。
[0004] 我国的家犬数量庞大，主要养于农村，狂犬病也主要发生在农村。目前对狂犬病血清抗体的监测主要依赖于地级市和县二级的疫控中心或动物疫控中心，因此尽可能简便、易操作、特异、敏感的方法才可能被推广应用。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、安全经济、操作快速简便的基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，以方便基层和现场检测人和犬等动物血清中狂犬病中和抗体滴度。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，利用反向遗传学技术拯救出具有融合表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的狂犬病弱毒株rRV-eGFP，将该毒株与56℃30min灭活的待检血清37℃作用一小时后，接种到BHK-21细胞上，48小时后直接在荧光
显微镜观察结果。
[0007] 上述基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，利用两倍系列稀释的预灭活的犬或人血清与等体积的100TCID50的rRV-eGFP株混匀，于37℃5％CO2作用1小时4
后接种到约2×10 个BHK-21的96孔板中，于37℃5％CO2
培养箱培养48小时，直接在倒置荧光显微镜下观察有无绿色荧光。
[0008] 上述基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，包括以下步骤：
[0009] (1)血清的准备
[0010] 将待检测和OIE标准血清于56℃水浴作用30分钟，取100μL犬或人血清按两倍-1 -7系列稀释(2 ～2 )；
[0011] (2)血清与重组病毒相互作用
[0012] 分别取50μL系列稀释好的血清于灭菌离心管中，每个稀释度设3个重复，每管加入等体积100TCID50的重组病毒液，混匀，于37℃培养箱作用1小时；
[0013] (3)取上述处理的100μL血清与病毒
混合液加入到事先培养成2×104个BHK-21细胞的96孔板中，于37℃5％CO2孵育1小时，吸出血清与病毒混合液，加入含2％胎
牛血清的DMEM，于37℃5％CO2温湿培养箱中培养48小时，直接在倒置荧光显微镜下观察有无绿色荧光。
[0014] 狂犬病弱毒株rRV-eGFP的制备方法，包括以下步骤：
[0015] (1)重组狂犬病病毒rRV-eGFP的感染性cDNA构建
[0016] 利用反向遗传学技术，将eGFP基因与狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合，具体操作过程按以下步骤进行：
[0017] 以prRC-HL(+)质粒为模板分别扩增出P-1基因和M-2基因部分，以peGFP-N1质粒为模板扩增出eGFP部分，利用重叠PCR将这三段基因融合扩增在一起，命名为P+eGFP，克隆到pMD18-T载体中，随后利用酶切位点Spe I和SacⅡ将融合的P+eGFP基因
片段置换到prRC-HL(+)质粒中，得到重组质粒pRV-eGFP；
[0018] (2)制备拯救重组病毒rRV-eGFP
[0019] 于24孔细胞培养板培养BSR-T7细胞至70％
单层，约为1×105个细胞时，吸出培养液，用无血清的Opti-MEM(1×)洗涤细胞两次，然后加入室温已静置20分钟的混合
转染试剂：2μg pRV-eGFP、0.4μg p-N、0.1μg p-P、0.2μg p-L和3μL的脂质体混匀物，4小时后吸出转染试剂加入5％胎牛血清培养基，3天后补加200μL的维持液，5天后
收获病毒。
[0021] P-F：5'-tcaacccagatcactagtcaagagcc-3'，
[0022] P-R：5'-catggtggcgctagcgcaagatgcatagcgat-3'；
[0023] eGFP-F:5'-gcatcttgcgctagcgccaccatggtgagcaag-3'，
[0024] eGFP-R：5'-agttcggagcggccgcttacttgtacagctcgt-3'；
[0025] M-F：5'-caagtaagcggccgctccgaactcttaaactcag-3'，
[0026] M-R：5'-caagtgatgagcccgcgggatatagt-3'。
[0027] P+eGFP融合基因，具有
序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
[0028] 上述P+eGFP融合基因在制备基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测
试剂盒方面的应用。
[0029] 上述P+eGFP融合基因的制备方法，利用反向遗传学技术，将eGFP基因与狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合。
[0030] 针对目前狂犬病毒中和抗体检测方法存在的问题，
发明人利用反向遗传学技术拯救出带有绿色荧光蛋白的重组病毒rRV-eGFP，并运用该重组病毒改进了国际公认的检测抗狂犬病毒中和抗体效价的RFFIT法，从而建立了行之有效的基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法(改良RFFIT-eGFP方法)。本发明改善了RFFIT方法的检测效果，与标准的RFFIT法相比具有一致性良好、特异性强、安全性好，无需昂贵的一抗和FITC标记的二抗，更加快速简便等特点，解决了传统RFFIT法用
毒力强的标准攻毒株CVS-11株和耗时较长等问题。
[0031] 本发明具有以下突出优势：
[0032] (1)安全稳定：标准的RFFIT法使用的是强毒株CVS-11株，存在一定的散毒隐患；而本发明以日本动物用
疫苗株RC-HL为
基础，该毒株毒力低，脑内注射不能致小白鼠死亡。
拯救出表达绿色荧光蛋白的重组病毒rRV-eGFP与亲本株rRC-HL生长特性相近，与CVS-11株相比毒力弱，安全性好，不存在散毒隐患。
[0033] (2)rRV-eGFP的P蛋白融合表达eGFP，使eGFP成为RV核衣壳构造的一部分，易于
跟踪RV。
[0034] (3)能稳定表达绿色荧光蛋白，特异性荧光分布在细胞核周边，呈点状，较大的圆形、椭圆形斑点状或颗粒状，荧光点清晰，
亮度高。最直接观测病毒发出的荧光，直观判断效果好，易于识别，不需考虑非特异荧光，排除
假阳性或假阴性结果。
[0035] (4)特异性好：本发明与标准的RFFIT法一致性良好，操作步骤更加简单，结果判断直观、更加易行。
[0036] (5)经济快速：本发明无需固定和免疫
染色细胞，也节约了昂贵的一抗和FITC标记的二抗，减少了IFA(一抗、二抗反应步骤)染色步骤，更加快速简便。
[0037] (6)材料易获取：rRV-eGFP病毒可接种至易感细胞NA上，进行大量增殖，容易获取。
附图说明
[0038] 图1是重组狂犬病病毒rRV-eGFP株的构建示意图。
[0039] 图2是重叠PCR扩增P+eGFP基因产物
电泳图。
[0040] 图3是构建P+eGFP基因重组质粒酶切鉴定电泳图。
[0041] 图4是拯救的重组病毒rRV-eGFP接种NA细胞后荧光显微镜观察图。
[0042] 图5是RT-PCP鉴定重组病毒rRV-eGFP接毒细胞后上清的eGFP基因鉴定电泳图。
[0043] 图6是重组病毒rRV-eGFP的eGFP表达
稳定性的检测结果图。
[0044] 图7是Western blot鉴定rRC-HL的P蛋白结果图。
[0046] 图9是rRV-eGFP与rRC-HL两种病毒的多步生长曲线。
[0047] 图10是rRV-eGFP与rRC-HL一步生长曲线。
[0048] 图11是rRV-eGFP与rRC-HL
病毒感染昆明小鼠的体重变化图。
[0049] 图12是运用本发明建立的RFFIT-eGFP法与RFFIT检测结果对比图。
具体实施方式
[0050] 以下结合
实施例和附图进一步详细说明本发明。
[0051] 实施例1
[0052] 1、材料的准备
[0053] 狂犬病毒株RC-HL、pRC-HL(+)、辅助质粒p-N、p-P和p-L由日本岐阜大学惠赠，BSR-T7细胞、BHK-21细胞、NA细胞和peGFP-N1载体由
申请人保存，抗狂犬病病毒P多克隆抗体由申请人制备并保存，狂犬病疫苗(法国梅里亚)免疫和未免疫的犬血清样品由广西区动物疫病
预防控制中心提供，血清来源于隆安县动物疫病预防控制中心。4周龄昆明小鼠购自广西中医药大学实验动物中心。
[0054] 2、构建重组病毒的引物设计与合成
[0055] 根据GenBank中RC-HL毒株P和M序列及eGFP序列，利用Oligo6.0
软件设计3对重叠PCR的引物。引物P-F和P-R扩增P-1基因，引物M-F和M-R扩增M-2基因，引物eGFP-F和eGFP-R扩增绿色荧光蛋白(eGFP)基因，其序列如表1。
[0056] 表1 构建新型重组质粒pRV-eGFP所使用的引物
[0057]
[0058] 3、重组质粒pRV-eGFP的构建(图1、图2和图3)
[0059] 利用反向遗传学技术，将eGFP基因与狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合，具体操作过程按以下步骤进行：
[0060] 以pRC-HL(+)质粒为模板分别扩增出P-1基因和M-2基因部分，以peGFP-N1质粒为模板扩增出eGFP部分，利用重叠PCR法将这三段基因融合扩增在一起，命名为P+eGFP(SEQ.ID.No.7)，克隆到pMD18-T载体中，随后利用酶切位点Spe I和SacⅡ将融合的P+eGFP基因片段插入到pRC-HL(+)质粒中，得到重组质粒pRV-eGFP。
[0061] 4、重组病毒rRV-eGFP的拯救
[0062] 于24孔细胞培养板培养BSR-T7细胞至70％单层约1×105个细胞，吸出培养液，用无血清的Opti-MEM(1×)洗涤细胞2次，然后加入室温已静置20分钟的混合转染试剂：2μgpRV-eGFP、0.4μg p-N、0.1μg p-P、0.2μg p-L和3μL的脂质体混匀物；4小时后吸出转染试剂加入5％胎牛血清培养基，3天后补加200μL的维持液，5天后收获重组病毒。
拯救的重组病毒rRV-eGFP第5天的细胞上清接种NA细胞后24小时直接在荧光显微镜下直接观察特异性荧光(图4)，证明成功拯救出重组病毒。
[0063] 4.1重组病毒携带eGFP基因的鉴定
[0064] 为了确认拯救的重组病毒携带有eGFP基因，从收获的病毒上清抽提得到RNA，用Oligo(dT)18作为下游引物进行反转录得到cDNA,以引物eGFP-F和eGFP-R扩增得到包括eGFP基因ORF在内的745bp的基因片段，将其克隆到pMD-18T载体上，经测序完全正确(图5)。
[0065] eGFP表达稳定性的检测：将rRV-eGFP在NA细胞中连续传代5次，分别取各代次细胞上清，倍比系列稀释后，接种96孔板上NA细胞，12小时后在荧光显微镜下可见明亮的特异性绿色荧光，36小时后可见细胞全部出现特异性绿色荧光，表明rRV-eGFP能够稳定表达eGFP(图6)。
[0066] 4.2拯救重组病毒rRV-eGFP的P蛋白与eGFP蛋白融合表达的鉴定
[0067] 为了确定P基因与eGFP基因为融合表达，Western blot检测显示rRC-HL的P蛋白分子量大约为40kDa，eGFP的分子量为27KDa，而rRV-eGFP的P蛋白大约为67kDa，表明重组的病毒P基因与eGFP为融合表达(图7)。
[0068] 同时用免疫染色定位P蛋白,结果证实rRV-eGFP的P蛋白与eGFP在细胞内共定位，细胞荧光为P蛋白的颗粒状蛋白颗粒，确认P基因与eGFP融合表达(图8)。
[0069] 4.3重组病毒的特异性荧光鉴定
[0070] 重组病毒rRV-eGFP感染细胞(NA或BHK-21)后，可在荧光显微镜下直接观察病毒荧光，特异性病毒荧光主要分布在细胞核周边，呈点状，较大的圆形、椭圆形斑点状或颗粒状，荧光点清晰，亮度高(图4)。
[0071] 4.4重组病毒rRV-eGFP生长特性
[0072] 将拯救重组病毒rRV-eGFP和亲本毒株rRC-HL分别按MOI＝0.1或2接种于NA细胞，37℃5％CO2条件下培养，分别于感染后0、6、12、24、36和48小时收获上清，并在BHK-21细胞上测定病毒滴度，绘制病毒的生长曲线。rRV-eGFP与亲本毒株rRC-HL生长特性比较，两种病毒的一步或多步生长曲线相似，显示两种病毒的生长特性相近，表明P基因与eGFP的融合表达对毒株的生长特性无显著影响(图9和图10)。
[0073] 4.5重组rRV-eGFP病毒致病性试验
[0074] 分别取1000FFU/mL的狂犬病病毒rRV-eGFP和rRC-HL稀释到30μL的PBS里，脑内注射4周龄的昆明小鼠，每组注射5只，同时以DMEM做空白对照，每日观察小鼠的体重和存活率变化，连续观察21天。结果显示rRV-eGFP与亲本毒株rRC-HL都为弱毒株，都未致死昆明小鼠,体重变化也无明显差异(图11)。
[0075] 5、标准RFFIT法检测犬血清抗狂犬病毒中和抗体的主要步骤
[0076] 将33份待检测的犬血清于56℃水浴作用30分钟，取100μL犬血清在96孔板中按-1 -7两倍系列稀释(2 ～2 )，分别取50μL血清于灭菌离心管中，每个稀释度设3个重复，每管加入等体积100TCID50的狂犬病毒株rRC-HL混匀，于37℃培养箱作用1小时；取上述处理的
4
100μL血清与病毒混合液加入到约含2×10 个BHK-21细胞的96孔板中，于37℃5％CO2培养箱中孵育1小时，PBS洗涤2次，吸出血清与病毒混合液，加入含2％胎牛血清的DMEM，于37℃5％CO2培养48小时，弃上清，细胞经预冷的丙
酮甲醇(1:1)固定液固定，弃去固定液，加入30μL抗狂犬病毒P多克隆抗体，37℃孵育1小时；用PBS洗涤细胞数次，每孔加入
30μL FITC标记的山羊抗小鼠荧光二抗，37℃孵育1小时，用PBS洗涤细胞3次，于倒置荧光显微镜下观察荧光。
[0077] 6、本发明新型改良RFFIT-eGFP法检测犬血清抗狂犬病毒中和抗体的主要步骤[0078] (1)血清的准备
[0079] 将待检测和OIE标准血清于56℃水浴作用30分钟，取100μL犬或人血清按两倍-1 -7系列稀释(2 ～2 )；
[0080] (2)血清与重组病毒相互作用
[0081] 分别取50μL系列稀释好的血清于灭菌离心管中，每个稀释度设3个重复，每管加入等体积100TCID50的rRV-eGFP株重组病毒液，混匀，于37℃5％CO2培养箱作用1小时；4
(3)取上述处理的100μL血清与病毒混合液加入到事先培养成2×10 个BHK-21细胞的96孔板中，于37℃5％CO2孵育1小时，吸出血清与病毒混合液，PBS洗涤2次，加入含2％胎牛血清的DMEM，于37℃5％CO2温湿培养箱中培养48小时，直接在倒置荧光显微镜下观察有无绿色荧光。
[0082] 若有绿色荧光，则该稀释度的血清不能完全中和病毒；若无绿色荧光，则该稀释度的血清能完全中和病毒；根据能中和病毒的血清最高稀释度对比OIE标准血清算出该血清的抗狂犬病毒中和抗体效价。
[0083] 取33份待检测的犬血清，按上述步骤检测，结果如图12。
[0084] 7、RFFIT法和RFFIT-eGFP法检测结果的比较(表2和图12)
[0085] 用二种方法对33份犬血清狂犬病毒中和抗体效价进行检测，尽管检测值稍有差异，对疫苗免疫的23份血清结果分析显示，12份血清的RFFIT值略为高于RFFIT-eGFP法。其它11份血清的RFFIT值则轻度低于RFFIT-eGFP法，而未免疫犬血清的中和抗体均为0。
总体结果相关性一致，表明本发明新型的RFFIT-eGFP法检测犬血清抗狂犬病毒中和抗体具有很高的准确性。由于应用拯救的重组病毒rRV-eGFP，毒力比CVS-11更弱而稳定，说明本发明的方法与WHO标准RFFIT法相比更具有安全、经济、快速等优点。
[0086] 表2 RFFIT法和RFFIT-eGFP法检测犬血清狂犬病毒中和抗体效价的比较[0087]
[0088] 为方便基层和现场检测人和犬等动物血清中狂犬病中和抗体滴度，可将上述P+eGFP融合基因、重组质粒pRV-eGFP、重组狂犬病病毒rRV-eGFP株设计
包装成检测试剂盒使用。
