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CDC45L肽及包含它的疫苗

阅读：568发布：2023-02-24

专利汇可以提供CDC45L肽及包含它的疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了自SEQ ID NO：18衍生的分离的肽或片段，其结合HLA 抗原且诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。该肽可包括上述氨基酸序列之一及1、2、或几处氨基酸序列替换、删除、或添加。本发明还提供了包括这些肽的药物组合物。本发明的肽可用于治疗癌症。，下面是CDC45L肽及包含它的疫苗专利的具体信息内容。

权利要求

1.分离的肽，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的肽。
3.一种用于诱导CTL的组合物，其中所述组合物包含权利要求1所述的肽或者权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药物组合物，其中该组合物包含权利要求1所述的肽，或权利要求2的多核苷酸，且其中所述癌症表达HLA-A24以及CDC45L基因，或表达HLA-A2以及CDC45L基因。
5.权利要求4的药物组合物，其配制为用于对HLA抗原为HLA-A24或HLA-A2的受试者施用。
6.权利要求4或5的药物组合物，其配制为用于治疗表达HLA-A24以及CDC45L基因的癌症，或表达HLA-A2以及CDC45L基因的癌症。
7.一种用于诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APC)的体外方法，其中该方法包括选自下组的步骤：
(a)在体外使表达HLA-A2或HLA-A24的APC接触权利要求1的肽；和
(b)将权利要求2的多核苷酸导入表达HLA-A2或HLA-A24的APC。
8.一种用于诱导CTL的体外方法，其中该方法包括选自下组的步骤：
(a)共培养CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA-A24与权利要求1的肽的复合物的APC，或共培养CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA-A2与权利要求1的肽的复合物的APC；
(b)共培养CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA-A24与权利要求1的肽的复合物的外来体，或共培养CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA-A2与权利要求1的肽的复合物的外来体；和
(c)将包含编码能够结合权利要求1的肽的T细胞受体(TCR)亚基多肽的多核苷酸的基因导入T细胞。
9.一种分离的APC，该APC在其表面上呈递HLA-A24与权利要求1的肽的复合物，或呈递HLA-A2与权利要求1的肽的复合物。
10.权利要求9的APC，其是通过权利要求7的方法诱导的。
11.一种分离的CTL，其是通过权利要求8的方法诱导的。
12.权利要求1的肽或编码所述肽的多核苷酸在制备用于在受试者中诱导针对表达HLA-A24以及CDC45L基因的癌症、或表达HLA-A2以及CDC45L基因的癌症的免疫应答的组合物中的用途。
13.一种抗体，其是通过用权利要求1的肽免疫动物而获得的。
14.一种载体，其包含编码权利要求1的肽的核苷酸序列。
15.一种宿主细胞，其经过依照权利要求14的表达载体转化或转染。
16.权利要求1的肽在制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的组合物中的用途，其中所述APC表达HLA-A24或HLA-A2。
17.权利要求2的多核苷酸在制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的组合物中的用途，其中所述APC表达HLA-A24或HLA-A2。
18.权利要求1的肽在制备用于在HLA-A24或HLA-A2的背景下诱导CTL的组合物中的用途。

说明书全文

CDC45L肽及包含它的疫苗

技术领域

[0001] 优先权

[0002] 本申请要求2009年5月26日提交的美国临时申请No.61/217,133的权益，通过述及将其全部内容收入本文。

[0003] 本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗极其有效的新肽，和用于治疗和预防肿瘤的药物。

背景技术

[0004] 肺癌是癌症的最常见形式，占每年1090万例癌症新病例中的135万例。它还是癌症相关疾病所致死亡的首要原因，占全世界670万癌症相关死亡中的118万(NPL 1)。尽管最近系统疗法诸如化疗和分子靶向疗法取得改进，但是晚期肺癌患者的预后仍然很差(NPL2)。在50％的患者中肺癌在手术后复发，而且不到25％的患者响应系统化疗。因而，迫切需要更加有效的治疗模态，而且免疫疗法对于未来的肺癌疗法代表一种有希望的办法(NPL
3-5)。

[0005] 治疗性癌症疫苗的成功最终可依赖于在肿瘤中相对于正常组织过表达的免疫原性抗原的鉴定。肿瘤相关抗原(TAA)对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的有效诱导已显示出有希望的结果(NPL 6-7)。最近，与基因组信息关联的cDNA微阵列技术的开发提供了恶性细胞的基因表达的综合谱，然后可将其与正常细胞的比较(NPL 8)。用cDNA微阵列技术进行的基因表达谱分析是鉴定可用于癌症诊断和免疫疗法的新TAA的一种有效办法(NPL9-12)。

[0006] 虽然已经发表了在肺癌中表达的几种候选TAA(NPL 13-14)，但是重要的是要鉴定在给定癌症中过表达的多种TAA以开发更加有效的T细胞介导的癌症免疫疗法(NPL 15)。

[0007] CDC45L(细胞分裂周期45样)是一种至关重要的细胞蛋白质，其在DNA复制的启动和延长二者中发挥功能，以确保染色体DNA每个细胞周期只复制一次(NPL 16-19)。CDC45L在所有真核生物间高度保守，而且在小鼠中对此基因的靶向破坏引起胚胎致死(NPL 20)。在成人中，绝大多数细胞已经分化并停止细胞分裂，而且只有小群细胞在一些自我更新组织中增殖(NPL 21)。因此，虽然CDC45L在长期休眠的、终末分化的且衰老的人细胞中不存在，但是它存在于增殖中的癌细胞的整个细胞周期(NPL 18)。因而，CDC45L表达与增殖中的细胞群密切相关，并因此被认定为癌细胞生物学中新增殖标志物的一种有希望的候选(NPL 18，22)。然而，尚未完全调查CDC45L作为癌症免疫疗法靶标的有用性。引用表

[0008] 非专利文献

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[0031] 发明概述

[0032] 本发明至少部分基于可充当免疫疗法靶标的肽的发现。由于TAA有时被免疫系统察觉为“自身”并因此常常没有免疫原性，适宜靶标的发现是极其重要的。如上所述，CDC45L(典型氨基酸序列和基因序列分别显示于SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：17，而且序列还可得自GenBank登录号NM_003504)已经被鉴定为在癌症中上调，所述癌症的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。因此，CDC45L是癌症/肿瘤免疫疗法的候选靶标。

[0033] 本发明进一步涉及CDC45L基因产物的拥有诱导对CDC45L特异性的CTL的能力的特定表位肽的鉴定。如下文详细讨论的，使用自CDC45L衍生的HLA-A*2402或HLA-A*0201结合性候选肽来刺激从健康供体获得的外周血单个核细胞(PBMC)。然后建立了具有针对经每一种候选肽冲激的HLA-A24或HLA-A2阳性靶细胞的特异性细胞毒性的CTL系。这些结果证明，这些肽是能诱导针对表达CDC45L的细胞的强力且特异性的免疫应答的HLA-A24或HLA-A2限制表位肽。另外，结果指示，CDC45L具有强免疫原性，而且它的表位是癌症/肿瘤免疫疗法的有效靶标。

[0034] 因而，本发明的一个目的是提供分离的结合HLA抗原的肽，特别是那些自CDC45L(SEQ ID NO：18)或其免疫学活性片段衍生者。这些肽预期具有CTL诱导能力，并因此可用于离体诱导CTL或用于给受试者施用以诱导针对癌症的免疫应答，所述癌症诸如睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、结肠直肠癌等等。优选的肽是九肽或十肽，更优选具有选自SEQ ID NO：1至16的氨基酸序列的肽。其中，具有选自SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列的肽显示强CTL诱导能力，并因此是最优选的。

[0035] 本发明的肽涵盖其中替换、删除或添加了1个、2个或更多个氨基酸的肽，只要所得经过修饰的肽保留原始的CTL诱导能力。

[0036] 本发明还提供了分离的编码本发明任一种肽的多核苷酸。这些多核苷酸可用于诱导具有CTL诱导能力的APC，并可供施用给受试者以诱导针对癌症的免疫应答，正如本发明的肽那样。

[0037] 当对受试者施用时，本发明的肽优选呈递在APC的表面上，以诱导靶向相应肽的CTL。因而，本发明的另一个目的是提供诱导CTL的组合物或作用剂，此类组合物或物质包括一种或多种本发明肽或多核苷酸。本发明进一步涵盖包括一种或多种本发明肽或多核苷酸的组合物或作用剂，其配制为用于治疗和/或预防癌症以及防止其手术后复发，此类癌症包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。因此，本发明还提供了用于治疗和/或预防癌症，和/或防止其手术后复发的药物组合物或作用剂，此类药物组合物或作用剂包括一种或多种本发明肽或多核苷酸。作为上述肽或多核苷酸的补充和/或替代，本发明的药物组合物或作用剂可任选包括呈递一种或多种本发明肽的APC或外来体作为活性组分。

[0038] 本发明的肽和多核苷酸能诱导在其表面上呈递HLA抗原与本发明肽形成的复合物的APC，例如通过使自源自受试者的的APC接触本发明肽，或将编码此类肽的多核苷酸导入APC来实现。此类APC具有针对靶肽的高CTL诱导能力，而且可用于癌症免疫疗法。因此，本发明涵盖用于诱导具有CTL诱导能力的APC的方法及通过此类方法获得的APC。

[0039] 本发明还提供了用于诱导CTL的方法，其包括共培养CD8阳性细胞与在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体的步骤。或者，该方法可包括导入如下基因的步骤，该基因包括编码能与本发明肽结合的T细胞受体(TCR)亚基多肽的多核苷酸。通过此类方法获得的CTL可用于治疗和/或预防癌症，癌症的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。因此，本发明涵盖通过本发明方法获得的CTL。

[0040] 本发明的又一个目的是提供用于在有此需要的受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其包括施用包含本发明CDC45L多肽或其免疫学活性片段、编码本发明CDC45L多肽的多核苷酸、或呈递此类CDC45L多肽的外来体或APC的组合物的步骤。

[0041] 具体而言，本发明提供了下述[1]-[22]：

[0042] [1]一种结合HLA抗原且具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力的分离的肽，其中该肽衍生自由氨基酸序列SEQ ID NO：18或其免疫学活性片段组成的多肽，

[0043] [2][1]的分离的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或A2，

[0044] [3][1]或[2]的分离的肽，其中所述肽包含选自下组的氨基酸序列：

[0045] (a)SEQ ID NO：4，2，3，7和12；和

[0046] (b)SEQ ID NO：4，2，3，7和12，其中替换、插入、删除和/或添加1、2、或几个氨基酸，

[0047] [4][1]至[3]中任一项的分离的肽，其中上述肽具有下列特征之一或二者：

[0048] (a)N端起第二个氨基酸为或修饰为选自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸；和

[0049] (b)C端氨基酸为或修饰为选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸，

[0050] [5][1]至[3]中任一项的分离的肽，其中上述肽具有下列特征之一或二者：

[0051] (a)N端起第二个氨基酸为或修饰为选自亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；和

[0052] (b)C端氨基酸为或修饰为选自缬氨酸和亮氨酸的氨基酸，

[0053] [6][1]至[5]中任一项的分离的肽，其中所述肽是九肽或十肽，

[0054] [7]一种分离的多核苷酸，其编码[1]至[6]中任一项的肽，

[0055] [8]一种用于诱导CTL的组合物，其中所述组合物包含一种或多种[1]至[6]中任一项所述的肽或者一种或多种[7]所述的多核苷酸，

[0056] [9]一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药物组合物，其中该组合物包含一种或多种[1]至[6]中任一项所述的肽或者一种或多种[7]的多核苷酸，[0057] [10][9]的药物组合物，其配制为用于对HLA抗原为HLA-A24或HLA-A2的受试者施用，

[0058] [11][9]或[10]的药物组合物，其配制为用于治疗癌症，

[0059] [12]一种用于诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APC)的方法，其中该方法包括选自下组的步骤：

[0060] (a)在体外、离体或在体内使APC接触[1]至[6]中任一项的肽；和

[0061] (b)将编码[1]至[6]中任一项的肽的多核苷酸导入APC，

[0062] [13]一种用于诱导CTL的方法，其中该方法包括选自下组的步骤：

[0063] (a)共培养CD8阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[6]中任一项的肽的复合物的APC；

[0064] (b)共培养CD8阳性T细胞中与在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[6]中任一项的肽的复合物的外来体；和

[0065] (c)将包含编码能够结合[1]至[6]中任一项的肽的T细胞受体(TCR)亚基多肽的多核苷酸的基因导入T细胞，

[0066] [14]一种分离的APC，其在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[6]中任一项的肽的复合物，

[0067] [15][14]的APC，其是通过[12]的方法诱导的，

[0068] [16]一种分离的CTL，其靶向[1]至[6]中任一项的肽，

[0069] [17][16]的CTL，其是通过[13]的方法诱导的，

[0070] [18]一种在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中该方法包括对所述受试者施用包含一种或多种[1]至[6]中任一项的肽、一种或多种其免疫学活性片段、或一种或多种编码所述肽或片段的多核苷酸的组合物，

[0071] [19]一种抗体或其片段，其针对[1]至[6]中任一项的肽，

[0072] [20]一种载体，其包含编码[1]至[6]中任一项的肽的核苷酸序列，

[0073] [21]一种宿主细胞，其经过依照[20]的表达载体转化或转染，和

[0074] [22].一种诊断试剂盒，其包含[1]至[6]中任一项的肽、[7]的核苷酸或[19]的抗体。

[0075] 本发明的适用性延伸至多种涉及或源自CDC45L过表达的疾病中的任何一种，诸如癌症，例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。

[0076] 在阅读下面的详述，结合所附的图和实施例之后，本发明在上文之外的其它目的和特征会变得更加完全显然。然而，要理解，前面的发明概述和下面的详述都是关于例示性实施方案，而非限制本发明或本发明的其它备选实施方案。特别地，虽然本文中参照一些例示性实施方案描述了本发明，但是会领会该描述对本发明的例示而不构成对本发明的限制。本领域技术人员会想到各种更改和应用，不背离所附权利要求中描述的本发明精神和范围。类似地，根据此概述和下文描述的某些实施方案，本发明的其它目的、特征、好处和优点会是明显的，而且对于本领域技术人员会是显而易见的。根据上文，结合所附实施例、数据、图和自其得出的所有合理推论，或者再考虑本文中收录的参考文献，此类目的、特征、好处和优点会是显然的。

[0077] 附图简述

[0078] 本领域技术人员在考虑了下文的附图简要说明及对本发明及其优选实施方案的详细说明后将清楚地得知本发明的各个方面的应用：

[0079] [图1a-d]图1由一系列照片，A至F构成，描绘了人正常组织、癌细胞系和癌组织中表达的CDC45L mRNA分析的结果。A，B部分：多种正常组织中表达的CDC45L mRNA的RT-PCR和Northern印迹分析。C部分：多种癌细胞系中表达的CDC45L mRNA的RT-PCR分析。D部分：肺癌组织和邻近正常肺组织中表达的CDC45L mRNA的RT-PCR分析。

[0080] [图1e-f]E部分：自胃癌、肝胆管癌、乳腺癌、胰腺癌和结肠直肠癌衍生的多种癌细胞系中表达的CDC45L mRNA的RT-PCR分析。F部分：腺癌、鳞癌、小细胞癌、正常肺、睾丸和正常皮肤中表达的CDC45L蛋白的免疫组织化学分析(原始放大倍数X400)。阳性染色信号呈棕色。比例尺，50微米。

[0081] [图2]图2描绘了用于自PBMC诱导CDC45L特异性CTL的方案。自供体分离PBMC，并分别使用抗CD8单抗或抗CD14单抗包被的微珠自HLA-A24阳性健康供体和肺癌患者的+ + +PBMC分离CD8T细胞和CD14 细胞。通过在GM-CSF和IL-4存在下培养5天，自CD14 细胞获得DC。在β2-微球蛋白存在下将DC用HLA-A24结合肽于37℃冲激2小时。然后辐+
照这些将肽冲激的DC，并以1∶20的比例与自体CD8T细胞混合以生成肽反应性CTL。在第0天在补充有2％自身血清的AIM-V中用IL-7培养细胞，并在第2天给这些培养物补充IL-2。在第7天和第14天用经肽加载的自体PHA胚细胞(PHA-blasts)再进行两次每+
周一次的刺激。在对CD8T细胞的第三轮肽刺激后6天实施INF-γELISPOT、CD107a动员
51
(mobilization)和 Cr释放测定法。

[0082] [图3]图3由一系列柱状图，A至C构成，描绘了健康供体中对CDC45L衍生肽的CTL应答。A，B，C部分：自HLA-A24阳性健康供体的PBMC生成的CDC45L肽反应性CTL的+ELISPOT测定法(A，C，健康供体-1；B，健康供体-4)。用自体单核细胞衍生DC刺激CD8T细胞(第0天)并用16种候选肽(SEQ IDNO：1至16)中4种的混合物冲激自体PHA胚细
胞(第7天和第14天)。在第20天收集CTL，并通过ELISPOT测定法来检测I生成FN-γ的CTL。柱形指示当用经CDC45L衍生肽(空心柱)或无关HIV-A24肽(实心柱)冲激的
C1R-A2402细胞再刺激CTL系时IFN-γ点的数目。效应细胞对靶细胞比为10∶1。数据表示为一式三份测定法的均值+/-SD。为每位供体显示了代表性具有相似结果的两次独立实验中的一个代表。

[0083] [图4]图4由一系列小图构成，描绘了抗原刺激后CD8+T细胞的细胞表面上暴露+的CD107a的水平。所有肽以1μ/ml的终浓度使用。显示的事件是对CD8T细胞设门的。
上部和中间小图：用关联CDC45L衍生肽刺激。下部小图：用无关HIV-A24肽刺激。图内部+ +
的数值指示具有象限特征的细胞群(CD8CD107aT淋巴细胞)的百分比。每条道是具有相似结果的两次独立实验中的一个代表。

[0084] [图5a-c]图5由一系列图，A至D构成，描绘了自HLA-A24阳性肺癌患者的PBMC诱导CDC45L特异性人CTL。A部分：自肺癌患者诱导的、与经CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)、CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)、CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO：7)或CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO：12)肽冲激的靶细胞一起共培养的CTL的ELISPOT测定法。用经肽冲激的C1R-A*2402细胞刺激的IFN-γ生成显著大于用经HIV肽冲激C1R-A*2402细胞刺激的IFN-γ生成。柱形指示当用经CDC45L衍生肽(空心柱)或无关HIV-A24肽(实心柱)冲激的C1R-A2402细
胞再刺激生成的CTL系时IFN-γ点的数目。效应细胞对靶细胞比为10∶1。数据呈现
51
为一式三份测定法的均值+/-SD。B部分：Cr释放测定法中CTL针对经关联CDC45L衍生肽(白色三角形；CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)、CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)、CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO：7) 或CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO：12))冲激的C1R-A2402细胞和经无关HIV-A24肽(黑色三角形)冲激的C1R-A2402细胞的细胞毒性。每个值代表基于一式三份测定法的均值计算的特异性溶解百分比。C部分：使用抗CDC45L抗体对源自下述细胞的全细胞溶胞物的Western印迹分析：Lu99细胞(左边小图，第1道)、经CDC45L siRNA转染的Lu99细胞(左边小图，第2道)或经对照GFP siRNA转染的Lu99细胞(左边小图，第3道)、EBC-1细胞(右边小图，第1道、经CDC45L siRNA转染的EBC-1细胞(右边小图，第2道)或经对照GFP siRNA转染的EBC-1细胞(右边小图，第3道)。β-肌动蛋白充当内部对照。

[0085] [图5d]D部分：通过下调Lu99和EBC-1靶细胞(CDC45L+，HLA-A*2402+)中的51
CDC45L蛋白消除CTL的CDC45L特异性细胞毒性活性。通过 Cr释放测定法来分析CTL针对Lu99、EBC-1、CDC45L siRNA Lu99、CDC45L siRNAEBC-1、GFP siRNALu99、GFP siRNAEBC-1、或A549的细胞毒性活性。每个值代表基于一式三份测定法的均值计算的特异性溶解百分比。

[0086] [图6]图6由一系列图构成，描绘了抗HLA I类单抗对CDC45L反应性CTL应答的抑制。将Lu99靶细胞与抗HLA I类单抗(W6/32，IgG2a)或对照抗HLA II类单
抗(IgG2a)一起温育1小时后，将Lu99细胞与通过用CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID
NO：2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)、CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4) 或+
CDC45L-A24-9-370-7(SEQ IDNO：7)肽刺激自健康供体或肺癌患者的CD8T细胞生成的CTL一起共温育。标示了由CTL介导的IFN-γ生成(A部分)和细胞毒性(B部分)。白色圆圈，Lu99；黑色圆圈，Lu99+W6/32；白色方框，Lu99+对照单抗。数据呈现为一式三份测定法的均值+/-SD。统计学显著差异以星号指示(*P＜0.05)。

[0087] [图7]图7由一系列图，A至C构成，描绘了使用CDC45L-A2-9-556-4(SEQID NO：4，在本文中也称为CDC45L-A24-9-556-4)，556KFLDALISL564，肽进行的刺激对HLA-A24(A*2402)和HLA-A2(A*0201)限制性CTL二者的诱导。A部分：与经
CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽冲激的T2细胞一起共培养的、自HLA-A*0201阳性健康供体诱导的CTL的IFN-γ ELISPOT测定法。数据表示为一式三份测定法的均值+/-SD。
51
B部分：通过 Cr释放测定法分析的，CTL针对经CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽冲激的T2细胞(白色三角形)、经对照HIV-A2肽冲激的T2细胞(黑色三角形)、和经
CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽冲激的C1R-A2402细胞(黑色方框)的细胞毒性活
51
性。C部分：通过 Cr释放测定法分析的抗HLA I类单抗对CDC45L反应性CTL应答的抑制。
+ + -
将Panc1靶细胞(CDC45L，HLA-A2，HLA-A24)与抗HLA I类单抗(W6/32，IgG2a)或对照抗HLA II类单抗(IgG2a)一起温育1小时后，将Panc1细胞与通过用CDC45L-A2-9-556-4(SEQ +
ID NO：4)肽刺激自HLA-A*0201阳性健康供体的CD8T细胞生成的CTL一起共温育。白色圆圈，Panc1细胞；黑色圆圈，Panc1+W6/32；白色方框，Panc1+对照单抗。每个值代表基于一式三份测定法的均值计算的特异性溶解百分比。显示了来自具有相似结果的三个独立实验的代表性数据。

[0088] [图8a-b]图8由一系列图，A至D构成，描绘了NOD/SCID小鼠中CDC45L反应性人CTL的体内抗肿瘤活性。A，B，C部分：通过用三种CDC45L衍生肽的混合物刺激自两名健康供体生成的人CTL的肽特异性细胞毒性活性。A部分：与经CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)或CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽中任一者冲激的C1R-A2402细胞一起共培养后的CTL的IFN-γELISPOT测定法。B部分：51
通过 Cr释放测定法分析的，在不存在(白色圆圈)或存在抗HLA I类单抗(W6/32，黑色+ +
圆圈)或对照抗HLA II类单抗(白色方框)的条件下，CTL针对Lu99(CDC45L，HLA-A24)的CDC45L特异性细胞毒性。

[0089] [图8c-d]C部分：通过51Cr释放测定法分析的，CTL针对经三种CDC45L衍生肽之一(白色圆圈，CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)；白色方框，CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)；白色三角形，CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4))或无关HIV-A24肽(黑色圆圈)冲激的C1R-A2402细胞的细胞毒性活性。D部分：静脉内接种经CDC45L诱导的CTL(黑+色方框，n＝5)、对照CD8T细胞(白色菱形，n＝5)、或单独的PBS(白色圆圈，n＝5)的
2
NOD/SCID小鼠中的肿瘤。当肿瘤大小在皮下肿瘤植入后第7天达到大约25mm 时，静脉内接
6
种对三种CDC45L肽的混合物有反应性的人CTL(4X 10 个)。在第14天重复CTL诱导。也+
将经无关HLA-A24限制性HIV肽刺激的对照CD8T细胞接种入小鼠作为对照。肿瘤大小以平方毫米表示。每个符号代表每组小鼠的均值肿瘤大小；短棒指示SD。使用双尾Student氏t检验来确定第42天时两组之间的差异的显著性。

[0090] 实施方案的描述

[0091] 现在描述优选的方法、装置、和材料，不过在实施或检验本发明的实施方案时可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本发明材料和方法之前，要理解本发明不限于本文中描述的特定大小、形状、尺度、材料、方法、方案等，因为它们可依照例行实验和/或优化而变化。还要理解，所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。

[0092] 通过提述明确地将本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开文本完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开文本。

[0093] I.定义

[0094] 如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非另有明确说明。

[0095] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基可以是经过修饰的残基或非天然存在的残基(诸如相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

[0096] 如本文中使用的，术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。天然存在的氨基酸指由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构(α 碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有一个或多个经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。

[0097] 氨基酸在本文中可以通过它们公知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号来指称。

[0098] 术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，用它们普遍接受的单字母符号来指称。

[0099] 如本文中使用的，术语“组合物”意图涵盖包括规定量的规定组分的产物，以及任何直接或间接作为规定量的规定组分的组合的结果的产物。该术语在涉及“药物组合物”时意图涵盖包括活性组分和构成载体的任何惰性组分的产物，以及任何直接或间接作为任何两种或更多种组分的组合、复合或聚集的结果、或作为一种或多种组分的解离的结果、或作为一种或多种组分的其它类型反应或相互作用的结果的产物。因而，在本发明的语境中，短语“药物组合物”涵盖任何通过混合本发明的化合物和药学或生理学可接受载体而制备的组合物。如本文中使用的，短语“药学可接受载体”或“生理学可接受载体”表示药学或生理学可接受的材料、组合物、物质或媒介，包括但不限于自一个器官或身体部分至另一个器官或身体部分携带或运输活性组分涉及的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。

[0100] 除非另有定义，术语“癌症”指过表达CDC45L基因的癌症或肿瘤，它的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。

[0101] 除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，指能够识别非自身细胞(例如肿瘤/癌细胞、病毒感染的细胞)并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。

[0102] 除非另有定义，术语“HLA-A24”指包含诸如HLA-A*2402等亚型的HLA-A24类型。

[0103] 除非另有定义，如本文中使用的，术语“HLA-A2”代表性地指诸如HLA-A*0201和HLA-A*0206等亚型。

[0104] 除非另有定义，如本文中使用的，术语“试剂盒”用于指试剂和其它材料的组合。考虑试剂盒可包括微阵列、芯片、标志物、等等。术语“试剂盒”并非意图限于试剂和/或材料的特定组合。

[0105] 以本发明的方法和组合物在癌症“治疗”的语境中有用为限，当治疗导致临床效益，诸如受试者中CDC45L基因表达的减少、或癌症的尺寸、患病率(prevalence)、或转移潜力的降低，认为该治疗是“有效”的。当预防性地应用治疗时，“有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。有效性结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来加以确定。

[0106] 以本发明的方法和组合物可用于癌症“预防”和“防范”的语境为限，所述术语在本文中可互换使用，指降低来自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病进展和症状出现以及降低已建立的疾病的负面影响的活动，这通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来实现。或者，预防和防范可包括广泛的预防疗法，它们旨在减轻特定病症的严重性，例如降低肿瘤的增殖和转移。

[0107] 在本发明的语境中，治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术清除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防降低患癌个体的死亡率并改善其预后，降低血液中肿瘤标志物的水平，及减轻伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防包括10％、20％、30％或更多降低，或病情稳定。

[0108] 在本发明的语境中，术语“抗体”指能与指定的蛋白或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长源化(primatized)抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、与其它蛋白或放射性标记物融合的抗体、和抗体片段。另外，在本文中，抗体以最广义使用，而且具体涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。“抗体”指示所有类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。

[0109] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。

[0110] II.肽

[0111] 为了证明CDC45L衍生的肽发挥被CTL所识别的抗原的功能，对CDC45L(SEQ ID NO：18)衍生的肽进行分析以确定它们是否为HLA-A24或A2(它们是常见的HLA等位基因)限制性的抗原表位(Date Y et al.，Tissue Antigens 47：93-101，1996；Kondo A et al.，J Immunol 155：4307-12，1995；Kubo RT et al.，JImmunol 152：3913-24，1994)。

[0112] 基于它们对HLA-A24的结合亲和力来鉴定CDC45L衍生的HLA-A24结合肽的候选者。考虑下述肽作为用于免疫疗法的候选肽：

[0113] CDC45L-A24-9-237-1(SEQ ID NO：1)，

[0114] CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)，

[0115] CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)，

[0116] CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)，

[0117] CDC45L-A24-9-328-5(SEQ ID NO：5)，

[0118] CDC45L-A24-9-396-6(SEQ ID NO：6)，

[0119] CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO：7)，

[0120] CDC45L-A24-9-192-8(SEQ ID NO：8)，

[0121] CDC45L-A24-9-541-9(SEQ ID NO：9)，

[0122] CDC45L-A24-9-364-10(SEQ ID NO：10)，

[0123] CDC45L-A24-10-109-11(SEQ ID NO：11)，

[0124] CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO：12)，

[0125] CDC45L-A24-10-271-13(SEQ ID NO：13)，

[0126] CDC45L-A24-10-313-14(SEQ ID NO：14)，

[0127] CDC45L-A24-10-21-15(SEQ ID NO：15)，和

[0128] CDC45L-A24-10-459-16(SEQ ID NO：16)。

[0129] 此外，用经这些肽冲激(加载)的树突细胞(DC)体外刺激T细胞后，使用下述每种肽，成功地建立了CTL：

[0130] CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)，

[0131] CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)，

[0132] CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)，

[0133] CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO：7)，和

[0134] CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO：12)。

[0135] 这些建立的CTL针对经相应肽冲激的靶细胞显示强且特异性的CTL活性。本文中的结果证明CDC45L是被CTL识别的抗原，而且被测试的肽是CDC45L的受HLA-A24限制的表位肽。

[0136] 在这些肽中，CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)还被鉴定为候选HLA-A2结合肽。在本文中，CDC45L-A24-556-4(SEQ ID NO：4)在HLA-A2限制肽的语境中也称作CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)。使用该肽，成功建立了针对表达CDC45L和HLA-A2的靶细胞的CTL。因此，CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)不仅是由HLA-A24限制的表位肽，而且还是由HLA-A24限制的表位肽。

[0137] 由于CDC45L基因在包括例如睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌的癌细胞和组织中过表达且在大多数正常器官中不表达，它是良好的癌症免疫治疗靶标。因此，本发明提供对应于CDC45L的被CTL识别的表位的九肽(由九个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由十个氨基酸残基组成的肽)。或者，本发明提供了分离的能结合HLA抗原并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的肽，其中该肽具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成或是它的免疫学活性片段。本发明的特别优选的例子包括那些具有SEQ ID NO：2，3，4，7和12的肽。

[0138] 一般而言，目前可以通过例如互联网访问的软件程序，诸如Parker KC et al.，J Immunol 1994 Jan 1，152(1)：163-75 and Nielsen M et al.，Protein Sci 2003；12：1007-17中描述的那些，可以用来在计算机上(in silico)计算不同肽与HLA抗原之间的结合亲和力。与HLA抗原的结合亲和力可以按照例如Parker KC et al.，J Immunol 1994 Jan 1，152(1)：163-75，Kuzushima K et al.，Blood 2001，98(6)：1872-81，Larsen MV et al.BMC Bioinformatics.2007 Oct 31；8：424，Buus S et al.Tissue Antigens.，62：
378-84，2003，Nielsen M et al.，Protein Sci2003；12：1007-17，及Nielsen M et al.PLoS ONE 2007；2：e796，它们汇总于例如Lafuente EM et al.，Current Pharmaceutical Design，2009，15，3209-3220中描述的那样进行测定。用于测定结合亲和力的方法在例如Journal of Immunological Methods，1995，185：181-190 及 Protein Science，2000，9：
1838-1846中有描述。因此，可使用此类软件程序来选择与HLA抗原具有高结合亲和力的自CDC45L衍生的片段。因此，本发明涵盖由任何根据这些已知程序，可与HLA抗原结合的CDC45L衍生的片段构成的肽。另外，此类肽可以包括由全长CDC45L组成的肽。

[0139] 本发明的九肽和十肽的侧翼可以具有额外的氨基酸残基，只要所得的肽保持其CTL诱导能力即可。额外的氨基酸序列可以由任何种类的氨基酸构成，只要它们不损害原来的肽的CTL诱导能力。因此，本发明涵盖具有对HLA抗原的结合亲和力的肽，包括自CDC45L衍生的肽。这样的肽例如少于约40个氨基酸，经常少于约20个氨基酸，且通常少于约15个氨基酸。

[0140] 一般而言，肽中一个或多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能，而且在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知有经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中修饰(即替换、添加、删除和/或插入)一个、两个或数个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984，81：5662-6；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 1982，10：6487-500；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1982，79：6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽既具有CTL诱导能力，又具有选自SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列中添加、删除和/或替换一个、两个或甚至更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。

[0141] 本领域技术人员会认可，改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别添加、删除或替换往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此，它们经常称作“保守替换”或“保守修饰”，其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似的功能的修饰蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如：疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳香基团侧链(H，F，Y，W)。另外，下面的八组各自含有本领域公认互为保守替换的氨基酸：

[0142] 1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

[0143] 2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

[0144] 3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

[0145] 4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

[0146] 5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

[0147] 6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

[0148] 7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和

[0149] 8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins 1984)。

[0150] 此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要该修饰的肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不应排除CDC45L的多态变体、种间同源物、和等位基因中的可诱导CTL的肽。

[0151] 为了保持所需的CTL诱导能力，可以修饰(即插入、删除、添加和/或替换)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个或更少的氨基酸，如4个或3个或更少。要被修饰的氨基酸的百分比优选为20％或更少，更优选15％或更少，和甚至更优选10％或更少或1-5％。

[0152] 当在癌症免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选选择不仅诱导CTL而且还拥有对HLA抗原的高结合亲和力的肽。为此，可对本发明的肽通过替换、插入、和/或添加氨基酸残基进行修饰以产生具有改良结合亲和力的修饰肽。除了天然被展示的肽之外，由于通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律是已知的(J Immunol 1994，152：3913；Immunogenetics1995，41：178；JImmunol 1994，155：4307)，可将基于该规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。

[0153] 例如，可能希望进行替换，将自N端起的第二个氨基酸替换为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸，和/或将位于C端的氨基酸替换为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸，以提高HLA-A24结合亲和力。因此，具有选自SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列，其中自N端起第二个氨基酸被替换为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸和/或其中位于C端的氨基酸被替换为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸的肽涵盖在本发明之内。

[0154] 或者，可能希望进行替换，将自N端起的第二个氨基酸替换为亮氨酸或甲硫氨酸，和/或将位于C端的氨基酸替换为缬氨酸或亮氨酸，以提高HLA-A2结合亲和力。因此，具有选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其中自N端起第二个氨基酸被替换为亮氨酸或甲硫氨酸和/或其中位于C端的氨基酸被替换为缬氨酸或亮氨酸的肽涵盖在本发明之内。

[0155] 不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替换，而且可以在潜在的T细胞受体(TCR)识别位置处引入替换。数项研究证明了具有氨基酸替换的肽可具有等同于或好于原来功能的功能，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57，4570-4577，1997，T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)Feb 1；168(3)：1338-47.，S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52：199-206 及S.O.Dionne et al.Cancer Immunology，Immunotherapy(2004)53，307-314)。

[0156] 本发明还考虑向本发明肽的N和/或C端添加一个、两个或数个氨基酸。此类具有高HLA抗原结合亲和力且保留CTL诱导能力的修饰肽也包含在本发明之内。

[0157] 然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能诱导副作用，诸如自身免疫性病症和/或针对特定物质的变应性症状。因此，优选的是，首先利用可得的数据库实施同源性搜索，以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比差1个或2个氨基酸的肽亦不存在时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何发生此类副作用的危险。

[0158] 虽然预期如上所述的对HLA抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的，但还是对根据高结合亲和力的存在为指标选出的候选肽检查了CTL诱导能力的存在。这里，短语“CTL诱导能力”指肽被呈递到抗原呈递细胞(APC)上时诱导细胞毒性淋巴细胞(CTL)的能力。另外，“CTL诱导能力”包括肽诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL溶解靶细胞、和提高CTL IFN-γ生成的能力。

[0159] CTL诱导能力的确认如下来实现，诱导携带人MHC抗原的APC(例如B-淋巴细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC))，或者更具体地说，衍生自人外周血单核白细胞的DC，并且在用肽诱导后，与CD8阳性细胞混合，然后测量由CTL针对靶细胞生成和释放的IFN-γ。作为反应系统，可使用已经制成的表达人HLA抗原的转基因动物(例如BenMohamed L，Krishnan R，Longmate J，Auge C，Low L，Primus J，Diamond DJ，Hum Immunol 2000 Aug，61(8)：764-79，Related Articles，Books，Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice：dependent on MHC(HLA)class
51
II restricted T(H)response中描述的那些)。例如，可以用 Cr等放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者，CTL诱导能力可以如下评估：测量在携带固定化肽的APC存在下由CTL生成和释放的IFN-γ，并使用抗IFN-γ单克隆抗体显现培养基上的抑制区。

[0160] 作为如上所述检查肽的CTL诱导能力的结果，发现选自SEQ ID NO：2、3、4、7和12的九肽或十肽显示特别高的CTL诱导能力以及对HLA抗原的高亲和力。因此，例举这些肽作为本发明优选的实施方案。

[0161] 另外，同源性分析的结果显示了那些肽与自任何其它已知人基因产物衍生的肽没有显著的同源性。因而，用于免疫疗法时未知的或不想要的免疫应答的可能性降低了。因此，也是根据这个方面，这些肽可用于在癌症患者中引发针对CDC45L的免疫力。因此，本发明的肽，优选具有选自SEQ ID NO：2、3、4、7和12的氨基酸序列的肽。

[0162] 除了上文所述修饰之外，也可将本发明的肽连接至其它肽，只要使得连接肽保留初始肽的所需CTL诱导能力。合适肽的例子包括：本发明的肽或自其它TAA衍生的CTL诱导性(CTL inducible)肽。合适的肽间接头是本领域公知的，而且包括例如AAY(P.M.Daftarian et al.，J Trans Med 2007，5：26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.，J Immunol.2000，165：7308-7315)或K(S.Ota et al.，Can Res.62，1471-1476，K.S.Kawamura et al.，J Immunol.2002，168：5709-5715)。

[0163] 例如，还可基本上同时使用非CDC45L肿瘤相关抗原肽以提高经I类和/II类HLA的免疫应答。已经公认，癌细胞能表达超过一种肿瘤相关基因。因此，依照本发明确定特定受试者是否表达其他肿瘤相关基因，然后在CDC45L组合物或疫苗中包括自此类基因的表达产物衍生的I类HLA和/或II类HLA结合肽，这是在本领域普通技术人员的例行实验的范围内的。

[0164] I类HLAI和II类HLA结合肽是本领域普通技术人员知道的(例如参见Coulie，Stem Cells 13：393-403，1995)，而且可以以与本文公开类似的方式用于本发明。因此，本领域普通技术人员能容易地使用分子生物学的标准规程来制备包括一种或多种CDC45L肽和一种或多种非CDC45L肽的多肽或编码此类多肽的核酸。

[0165] 上文所述连接肽在本文中称作“多表位”(polytope)，即两种或更多种可以以各种排列(例如串联、交叠)连接在一起的潜在免疫原性或免疫应答刺激性肽的组。该多表位(或编码该多表位的核酸)可以以标准免疫方案来施用(例如给动物)以测试该多表位在刺激、增强和/或引起免疫应答的有效性。

[0166] 该等肽可直接地或经使用侧翼序列连接在一起以形成多表位，而且多表位作为疫苗的用途是本领域公知的(参见例如Thomson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 92(13)：5845-5849，1995；Gilbert et al.，Nature Biotechnol.15(12)：1280-1284，1997；Thomson et al.，J Immunol.157(2)：822-826，1996；Tarn et al.，J Exp.Med.171(1)：299-306，
1990)。可制备含有不同表位数目和组合的多表位并测试CTL识别和提高免疫应答的功效。

[0167] 也可将本发明的肽连接至其它物质，只要所得连接肽保留初始肽的所需CTL诱导能力。合适的例子包括例如：肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然的和合成的聚合物等。本发明肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，只要该修饰不破坏初始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋予额外的功能(例如靶向功能和投递功能)或使多肽稳定。

[0168] 例如，为了提高多肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明多肽。可以以多种方式评估多肽的稳定性。例如，可使用肽酶和各种生物学介质(诸如人血浆和血清)来测试稳定性(参见例如Verhoef et al.，Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986，11：291-302)。

[0169] 此外，如上所述，在替代、删除和/或添加1个、2个或数个氨基酸残基的经修饰肽中，可筛选或选择具有与原始肽相比相同或更高活性的修饰肽。因此，本发明还提供了用于筛选或选择具有与原始肽相比相同或更高活性的修饰肽的方法。一种例示性方法可包括下述步骤：

[0170] a：替代、删除或添加本发明肽中的至少一个氨基酸残基，

[0171] b：测定步骤(a)中产生的肽的活性，和

[0172] c：选择具有与原始肽相比相同或更高活性的肽。

[0173] 在本文中，要测定的活性可包括MHC结合活性、APC或CTL诱导能力和细胞毒性活性。优选地，要评估的活性是CTL诱导能力，而且此类活性可使用“实施例”中描述的方法来评估。

[0174] 在本文中，本发明的肽也可以记为“CDC45L肽”或“CDC45L多肽”。

[0175] III.CDC45L肽的制备

[0176] 本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，肽可以通过合成、使用重组DNA技术或化学合成来制备。本发明的肽可个别地合成，或合成为包括两个或更多个肽的较长多肽。然后可以分离，即纯化或分离所述肽，使得所述肽基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段或任何其它化学物质。

[0177] 本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化；只要该修饰不破坏初始肽的生物学活性。其它修饰包括掺入D-氨基酸或其它氨基酸模拟物，其可用于例如延长肽的血清半衰期。

[0178] 可以根据选定的氨基酸序列，借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的常规肽合成法的例子包括：

[0179] (i)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；

[0180] (ii)The Proteins，Vol.2，Academic Press，New York，1976；

[0181] (iii)Peptide Synthesis(日文)，Maruzen Co.，1975；

[0182] (iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日文)，Maruzen Co.，1985；

[0183] (v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(in Japanese)，Vol.14(peptide synthesis)，Hirokawa，1991；

[0184] (vi)WO99/67288；和

[0185] (vii)Barany G.&Merrifield R.B.，Peptides Vol.2，″Solid Phase Peptide Synthesis″，Academic Press，New York，1980，100-118。

[0186] 或者，可应用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如Morrison J，J Bacteriology 1977，132：349-51；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983，101：347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转移入合适宿主细胞。本发明也提供此类载体和宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产肽。

[0187] IV.多核苷酸

[0188] 本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。这些包括由天然存在型CDC45L基因(GenBank登录号NM_003504(SEQ ID NO：17))衍生的多核苷酸及具有它们的经过保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短语“经过保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，对于任何给定蛋白质都有极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因而，每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。

[0189] 本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、或其衍生物构成。正如本领域公知的，DNA分子由碱基诸如天然存在的碱基A、T、C、和G构成，而T在RNA中被U替换。技术人员会认可，多核苷酸也可包括非天然存在的碱基。

[0190] 本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，有或无居间氨基酸序列存在。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。另外，多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。

[0191] 重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者，可借助PCR技术或通过在合适宿主中的表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP，Tetrahedron 1992，48：2223-311；Matthes et al.，EMBO J 1984，3：801-5中记载的。

[0192] V.外来体(exosomes)

[0193] 本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在日本专利申请公表公报平11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从治疗和/或预防所针对的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。

[0194] 复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的类型匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24和HLA-A2，特别是HLA-A*2402和HLA-A*0201还有HLA-A*0206，是最普遍的且因此会适合于治疗日本人患者。使用在日本人和白种人中高表达的A24和A2型有利于获得有效的结果，而且也可使用诸如A*2402、A*0201和A*0206等亚型。典型的，在临床上，预先考察需要治疗的患者的HLA抗原类型，这样就能够合适地选择对此抗原具有高水平的结合亲和力、或者具有藉由抗原呈递的CTL诱导能力的肽。此外，为了获得具有高结合亲和力和CTL诱导能力二者的肽，可以在天然存在的CDC45L部分肽的氨基酸序列的基础上进行1个、2个或几个氨基酸的替换、删除、插入和/或添加。

[0195] 在将A24型HLA抗原用于本发明的外来体时，可使用具有选自SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列的肽。

[0196] 或者在将A2型HLA抗原用于本发明的外来体时，可使用具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的肽。

[0197] VI.抗原呈递细胞(APC)

[0198] 本发明还提供在其表面上呈递HLA抗原与本发明肽形成的复合物的分离的抗原呈递细胞(APC)。APC可衍生自要进行治疗和/或预防的患者，而且可作为疫苗以它们自身或与其它药物(包括本发明的肽、外来体、或CTL)组合来施用。

[0199] APC不限于特定种类的细胞，包括树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导活性的代表性APC，DC可以用作本发明的APC。

[0200] 例如，可通过自外周血单核细胞诱导DC，然后在体外、离体或在体内用本发明的肽接触(刺激)它们来获得本发明的APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。短语“诱导APC”包括用本发明的肽或编码本发明肽的核苷酸接触(刺激)细胞，以在细胞的表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物。因此，本发明的APC可通过将本发明的肽施用于受试者后自受试者收集APC来获得。或者，本发明的APC可通过使自受试者收集的APC接触本发明的肽来获得。

[0201] 可以将本发明的APC施用于受试者以在受试者中以它们自身或与其它药物(包括本发明的肽、外来体或CTL)组合来诱导针对癌症的免疫应答。例如，离体施用可包括下述步骤：

[0202] a：自第一受试者收集APC；

[0203] b：使肽接触步骤a的APC；并

[0204] c：对第二受试者施用步骤b的APC。

[0205] 第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。通过步骤b获得的APC可作为疫苗用来治疗和/或预防癌症，癌症的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。

[0206] 本发明提供包括此类用本发明肽诱导的抗原呈递细胞的药物组合物的制造。

[0207] 依照本发明的一个方面，APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的CTL诱导能力”中，高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导CTL的肽接触的APC的该水平而言的。这样的具有高水平CTL诱导能力的APC不但可通过上文所述方法制备，还可通过包括在体外将编码本发明肽的多核苷酸转移至APC的步骤的方法来制备。所导入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实施的各种方法，诸如可使用脂质体转染、电穿孔、和磷酸钙法。更具体的说，可以如CancerRes1996，56：5672-7；J Immunol 1998，161：5607-13；J Exp Med 1996，184：465-72；国际公开文本No.2000-509281的已公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入APC，基因在细胞中经历转录、翻译、等等，然后得到的蛋白质被MHC I类或II类加工，并经由呈递途径呈递给本发明的部分肽。

[0208] 在优选的实施方案中，本发明的APC可以是在其表面上呈递在HLA-A24抗原诸如HLA-A*2402与本发明肽之间形成的复合物的APC。或者，本发明的APC可在其表面上呈递在HLA-A2抗原诸如HLA-A*0201与SEQ ID NO：4的肽或其修饰肽之间形成的复合物。

[0209] VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

[0210] 被诱导的针对任一本发明肽的CTL可在体内加强靶向癌细胞的免疫应答，并且因此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本发明提供由任一本发明肽特异性诱导或活化的、分离的CTL。

[0211] 此类CTL可通过下述步骤来获得：(1)对受试者施用本发明的肽；或(2)在体外用本发明的肽接触(刺激)源自受试者的的APC和CD8阳性细胞、或外周血单核白细胞；或(3)在体外使CD8-阳性细胞或外周血单个核白细胞接触在其表面上呈递HLA抗原与肽之间形成的复合物的APC或外来体；或(4)导入包括编码T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸的基因，所述TCR亚基能结合本发明的肽。上述APC或外来体可通过上文记载的方法来制备，而且(4)之方法的详情记载于下文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分。

[0212] 可以从要进行治疗和/或预防的患者获取本发明的CTL，而且可以将它们单独施用，或者与其它药物(包括本发明的肽或外来体)组合施用以调节效果。所得到的CTL特异性针对呈递本发明的肽例如与用于诱导的肽相同的肽的靶细胞起作用。靶细胞可以是内源表达CDC45L的细胞，诸如癌细胞，或被CDC45L基因转染的细胞；而且因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化CTL攻击的靶标。

[0213] VIII.T细胞受体(TCR)

[0214] 本发明还提供包含编码能够形成T细胞受体(TCR)亚基的多肽的核酸的多核苷酸，及使用该组合物的方法。本发明的TCR亚基具有形成赋予T细胞针对呈递CDC45L的肿瘤细胞的特异性的TCR的能力。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出编码构成用本发明的一种或多种肽诱导的CTL的TCR亚基α和β链的核酸(WO2007/032255及Morgan et al.，J Immunol，171，3288(2003))。例如，优选使用PCR方法来分析编码TCR亚基的核苷酸序列。用于分析的PCR引物可以是但不限于例如作为5′侧引物的5′-R引物(5′-gtctaccaggcattcgcttcat-3′)(SEQ ID NO：23)和作为3′侧引物的对TCR α链C区特异性的3-TRa-C引物(5′-tcagctggaccacagccgcagcgt-3′)(SEQ ID NO：24)、对TCR β链C1区特异性的3-TRb-C1引物(5′-tcagaaatcctttctcttgac-3′)(SEQ ID NO：25)或对TCR β链C2区特异性的3-TRβ-C2引物(5′-ctagcctctggaatcctttctctt-3′)(SEQ ID NO：26)。衍生的TCR能以高亲合力结合展示CDC45L肽的靶细胞，且任选在体内和在体外介导有效的对呈递CDC45L肽的靶细胞的杀伤。

[0215] 编码TCR亚单位的核酸可以掺入合适的载体，例如逆转录病毒载体。这些载体是本领域公知的。所述核酸或者包含它们的载体有用地可以转移到T细胞中，例如来自患者的T细胞中。有利的是，本发明提供了一种即用型(off-the-shelf)组合物，其容许快速修饰患者自身的T细胞(或另一种哺乳动物的)，以快速而容易地产生具有优秀的癌细胞杀伤性质的修饰T细胞。

[0216] 特异性TCR是一种能够特异性识别本发明肽和HLA分子形成的复合物的受体，当TCR在T细胞的表面上呈递时，给予T细胞针对靶细胞的特异性活性。对上述复合物的特异性识别可通过任何已知方法来确认，其优选例子包括但不限于使用HLA分子和本发明肽的HLA多聚体染色分析，及ELISPOT测定法。通过实施ELISPOT测定法，能确认经编码TCR亚基的核酸转导的T细胞是否识别表达HLA分子和CDC45L的细胞，并胞内传输信号。还能确认通过已知方法导入T细胞的TCR亚基是否能给予T细胞以细胞毒性活性。优选的方法包括例如使用HLA-A2阳性和CDC45L过表达细胞作为靶细胞的铬释放测定法。

[0217] 此外，本发明提供通过用编码结合在HLA-A2的背景下SEQ ID NO：4的CDC45L肽，以及在HLA-A24的背景下结合SEQ ID NO：2，3，4，7和12的肽的TCR亚基的核酸转导而制备的CTL。

[0218] 经过转导的CTL在体内能够归巢(homing)到癌细胞，并且可以利用公知的体外培养方法扩增(例如Kawakami et al.，J Immunol.，142，3452-3461(1989))。可以利用本发明的CTL来形成免疫原性组合物，所述组合物可以用来在需要治疗或保护的患者中治疗和/或预防癌症(参见WO2006/031221，通过述及而将其内容收入本文)。

[0219] IX.药物作用剂或组合物

[0220] 由于CDC45L表达在癌症(其例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌)中与正常组织相比特异性升高，本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可用于治疗和/或预防癌症，和/或预防它们的手术后复发。因此，本发明提供用于治疗和/或预防癌症，和/或预防它们的手术后复发的药物作用剂或组合物，所述药物作用剂或组合物包括一种或多种本发明的肽或多核苷酸作为活性组分。或者，可以在任何上述外来体或细胞(诸如APC)的表面上表达本发明的肽，以用作药物作用剂或组合物。另外，上述靶向任一本发明的肽的CTL也可用作本发明药物作用剂或组合物的活性组分。

[0221] 本发明的药物作用剂和组合物(即“药物作用剂”)也可用作疫苗。在本发明的语境中，短语“疫苗”(也称作“免疫原性组合物”)指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。

[0222] 本发明的药物作用剂或组合物可用于在受试者或患者(包括人和任何其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒、和黑猩猩，特别是商业上重要的动物或驯养的动物)中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发。

[0223] 在另一个实施方案中，本发明还提供选自下组的活性组分在制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物组合物或作用剂中的用途：

[0224] (a)本发明的肽，

[0225] (b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

[0226] (c)在其表面上呈递本发明肽的外来体或APC，和

[0227] (d)本发明的细胞毒性T细胞。

[0228] 或者，本发明进一步提供用于治疗或预防癌症或肿瘤的选自下组的活性组分：

[0229] (a)本发明的肽，

[0230] (b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

[0231] (c)在其表面上呈递本发明肽的外来体或APC，和

[0232] (d)本发明的细胞毒性T细胞。

[0233] 或者，本发明进一步提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物组合物或作用剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受载体与选自下组的活性组分作为活性组分的步骤：

[0234] (a)本发明的肽，

[0235] (b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

[0236] (c)在其表面上呈递本发明肽的外来体或APC，和

[0237] (d)本发明的细胞毒性T细胞。

[0238] 在另一个实施方案中，本发明还提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物组合物或作用剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性组分与药学或生理学可接受载体的步骤，其中所述活性组分选自下组：

[0239] (a)本发明的肽，

[0240] (b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，

[0241] (c)在其表面上呈递本发明肽的外来体或APC，和

[0242] (d)本发明的细胞毒性T细胞。

[0243] 依照本发明，已经发现具有SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列的肽是HLA-A24限制性表位肽或能诱导强且特异性的免疫应答的候选者。因此，包括任何这些具有SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列的肽的本发明药物作用剂或组合物特别适合于对其HLA抗原为HLA-A24的受试者施用。还已经发现具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的肽是HLA-A2限制性表位肽。因此，除了对其HLA抗原为HLA-A24的受试者之外，包括具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的肽的药物作用剂或组合物也适合于对其HLA抗原为HLA-A2的受试者施用。这同样适用于含有编码任何这些肽的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)的药物作用剂或组合物。

[0244] 要用本发明的药物作用剂或组合物治疗的癌症不受限制，而且包括其中涉及CDC45L(例如过表达)的任何癌症，包括例如睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。

[0245] 除上述活性组分之外，本发明的药物作用剂或组合物还可含有其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽、编码所述其它肽的其它多核苷酸、呈递所述其它肽的其它细胞等等。在本文中，其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽以癌症特异性抗原(例如已鉴定的TAA)为例，但是不限于此。

[0246] 如果需要，本发明的药物作用剂或组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性组分，只要该物质不抑制活性组分例如任何本发明肽的抗肿瘤效果。例如，配制剂可包括抗炎作用剂或组合物、镇痛剂、化疗剂、诸如此类。除了药物自身中的其它治疗性物质之外，本发明的药物还可以与一种或多种其它药理学作用剂或组合物顺序或同时施用。药物和药理学作用剂或组合物的量取决于例如所使用的药理学作用剂或组合物的类型、所治疗的疾病、及施用的时序安排和路径。

[0247] 应当理解，除在本文中具体提及的组分之外，本发明的药物作用剂或组合物可包括与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它作用剂或组合物。

[0248] 在本发明的一个实施方案中，本发明的药物作用剂或组合物可包括在制品和试剂盒中，该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病(例如癌症)的病理状况的材料。制品可包括任何本发明药物物质或组合物的容器及标签。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该物质或组合物用于治疗或预防一种或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。

[0249] 除上文描述的容器之外，包括本发明药物作用剂或组合物的试剂盒还可任选进一步包括第二容器，其中装有药学可接受稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和载有使用说明的包装插页。

[0250] 如果期望的话，药物组合物可存在于药包或分配器装置中，该药包或分配器装置可装有一个或多个含有活性组分的单位剂型。例如，药包可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。

[0251] (1)含有肽作为活性组分的药物作用剂或组合物

[0252] 本发明的肽可以作为药物作用剂或组合物直接施用，或者如果必要，通过常规配制方法来配制。在后一种情况中，除了本发明的肽之外，还可以视情况包括通常用于药物的载体、赋形剂、等等，没有特别限制。此类载体的例子有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、等等。另外，药物作用剂或组合物可在必要时含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等等。本发明的药物作用剂或组合物可用于抗癌目的。

[0253] 本发明的肽可作为组合来制备，其包括两种或更多种本发明的肽，以在体内诱导CTL。肽组合可采取鸡尾酒的形式，或者可使用标准技术彼此缀合。例如，可以将肽化学连接或表达成为单一融合多肽序列，其可具有一个或几个氨基酸作为接头(例如赖氨酸接头：K.S.Kawamura et al.J.Immunol.2002，168：5709-5715)。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度呈递在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，自受试者取出APC(例如DC)，然后用本发明的肽刺激以获得在其细胞表面上呈递本发明肽的APC。将这些APC再施用于受试者以在受试者中诱导CTL，结果能提高针对肿瘤相关内皮的攻击性。

[0254] 包括本发明肽作为活性组分、用于治疗和/或预防癌症的药物作用剂或组合物还可包括已知有效建立细胞免疫的佐剂。或者，药物物质或组合物可以与其它活性组分一起施用，而且它们可以通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起(或顺序)施用时增强针对蛋白质的免疫应答的任何化合物、物质或组合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中记载的那些(Clin Microbiol Rev 1994，7：277-89)。合适佐剂的例子包括但不限于磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素、不完全弗氏佐剂(IFA)、完全弗氏佐剂(CFA)、ISCO基质、GM-CSF、CpG、O/W乳液、诸如此类。

[0255] 另外，可方便地使用脂质体配制剂、其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制剂、和其中脂质结合至肽的配制剂。

[0256] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽也可以以药学可接受盐的形式施用。优选盐的例子包括与碱金属的盐、与金属的盐、与有机碱的盐、与有机酸的盐和与无机酸的盐。

[0257] 在一些实施方案中，本发明的药物作用剂或组合物可进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经将脂质鉴定为能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的作用剂或组合物。例如，可将棕榈酸残基附着至赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体施用，或在佐剂中乳化后施用。作为脂质引发CTL应答的另一个例子，大肠杆菌(E.coli)脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当共价附着至适宜的肽时，可用来引发CTL(参见例如Deres et al.，Nature 1989，342：561-4)。

[0258] 施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，及系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量可以依照要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整，而且通常是0.001mg至1,000mg，例如0.001mg至1,000mg，例如0.1mg至10mg，而且可以每少数天施用一次至每少数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。

[0259] (2)含有多核苷酸作为活性组分的药物作用剂或组合物

[0260] 本发明的药物作用剂或组合物也可包括处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中，短语“处于可表达形式的”意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成能诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中，感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的配置(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR&Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12)。还可参见例如Wolff et al.，Science 1990，247：1465-8；U.S.Patent Nos.5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；
和WO98/04720。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利No.5,922,687)。

[0261] 本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如痘苗病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利No.4,722,848。另一种载体是BCG(卡介苗)。
BCG载体记载于Stover et al.，Nature 1991，351：456-60。有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体、诸如此类。参见例如Shata et al.，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock et al.，J Leukoc Biol2000，68：793-806；
Hipp et al.，In Vivo 2000，14：571-85。

[0262] 将多核苷酸投递入患者可以是直接的，其中患者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者是间接的，其中首先在体外用感兴趣多核苷酸转化细胞，然后将细胞移植入患者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。

[0263] 关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy1993，12：488-505；Wu 和 Wu，Biotherapy 1991，3：87-95；Tolstoshev，Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993，33：573-96；Mulligan，Science 1993，260：926-32；Morgan&Anderson，Ann Rev Biochem 1993，62：191-217；Trends in Biotechnology 1993，
11(5)：155-215。重组DNA技术领域普遍知道的方法也可用于本发明。参见例如Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY，1993；和Krieger，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY，1990。

[0264] 施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，而且可使用系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。可以依照要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当调整合适载体或经编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量，而且通常是0.001mg至1000mg，例如0.001mg至1000mg，例如0.1mg至10mg，而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。

[0265] X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法

[0266] 本发明的肽和多核苷酸可用于制备或诱导APC和CTL。本发明的外来体和APC也可用于诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要该化合物不抑制它们的CTL诱导能力。因此，任何上述本发明药物作用剂或组合物均可用于诱导CTL，而且在它们之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导APC，如下文更详细讨论的。

[0267] (1)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法

[0268] 本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸来诱导具有高CTL诱导能力的APC的方法。本发明的方法包括在体外、离体或在体内用本发明的肽接触APC的步骤。例如，离体或在体外用肽接触APC的方法可包括下述步骤：

[0269] a：自受试者收集APC；并

[0270] b：使肽接触步骤a的APC。

[0271] APC不限于特定种类的细胞，包括DC、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识别。优选地，由于DC是APC中具有最强CTL诱导能力的，可使用DC。任何本发明肽可以以它们自身或与其它本发明肽一起使用。

[0272] 另一方面，在将本发明肽施用于受试者时，APC在体内接触肽，结果在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明包括将本发明的肽施用于受试者。类似地，在将可表达形式的本发明多核苷酸施用于受试者时，本发明的肽在体内表达并与APC接触，结果在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明还可涵盖将本发明的多核苷酸施用于受试者。“可表达形式”描述于上文“IX.药物作用剂或组合物(2)含有多核苷酸作为活性组分的药物作用剂或组合物”部分。

[0273] 本发明还可包括将本发明的多核苷酸导入APC以诱导具有CTL诱导能力的APC的步骤。此类方法的一个例示性例子可包括下述步骤：

[0274] a：自受试者收集APC；并

[0275] b：导入编码本发明肽的多核苷酸。

[0276] 步骤b可如上文“VI.抗原呈递细胞”部分中所述来实施。

[0277] 或者，本发明提供了用于制备特异性诱导针对CDC45L的CTL活性的抗原呈递细胞(APC)的方法，其中该方法可包括下述步骤之一：

[0278] (a)在体外、离体或在体内使APC接触本发明的肽；和

[0279] (b)将编码本发明肽的多核苷酸导入APC。

[0280] (2)诱导CTL的方法

[0281] 另外，本发明提供了使用本发明的肽、多核苷酸、外来体或APC来诱导CTL的方法。

[0282] 本发明还提供了使用编码能够形成T细胞受体(TCR)亚基(其识别本发明肽和HLA抗原的复合物)的多肽的多核苷酸来诱导CTL的方法。优选地，用于诱导CTL的方法可包括至少一个选自下组的步骤：

[0283] a)使CD8阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的抗原呈递细胞和/或外来体接触；和

[0284] b)将编码能够形成TCR亚基(其识别本发明肽和HLA抗原的复合物)的多肽的多核苷酸导入CD8阳性细胞。

[0285] 当本发明的肽、多核苷酸、APC、或外来体被施用给受试者后，在受试者的身体中诱导出CTL，并增强靶向癌细胞的免疫应答的强度。因此，本发明的方法包括将本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用于受试者的步骤。

[0286] 或者，也可通过离体或在体外使用来诱导CTL，并在诱导CTL后，可将活化的CTL返还受试者。例如，该方法可包括下述步骤：

[0287] a：自受试者收集APC；

[0288] b：用肽接触步骤a)的APC；并

[0289] c：将步骤b的APC与CD8阳性细胞共培养。

[0290] 上文步骤c中要与CD8阳性细胞共培养的APC也可通过将包括本发明多核苷酸的基因转移入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞”部分所述，但是本发明不限于此，而且因此可涵盖任何在其表面上有效呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的APC。

[0291] 作为此类APC的替代，也可使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体。即，本发明可包括共培养在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体的步骤。此类外来体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。

[0292] 另外，可通过将包括编码能与本发明的肽结合的TCR亚基的多核苷酸的基因导入CD8阳性细胞来诱导CTL。此类转导可如上文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中所述来实施。

[0293] 另外，本发明提供了一种制造用于诱导CTL的药用物质或组合物的方法或工艺，其中该方法包括混合或配制本发明的肽与药学可接受载体的步骤。

[0294] (3)诱导免疫应答的方法

[0295] 此外，本发明提供了诱导针对涉及CDC45L的疾病的免疫应答的方法。合适的疾病包括癌症，其例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。

[0296] 本发明的方法可包括施用含有任何本发明肽或其编码多核苷酸的作用剂或组合物的步骤。本发明的方法还涵盖施用呈递任何本发明肽的外来体或APC。关于详情参见“IX.药物作用剂或组合物”部分，特别是描述本发明的药物作用剂或组合物作为疫苗的用途的部分。另外，可用于诱导免疫应答的本发明方法的外来体和APC详细描述于上文“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC)”、和“X.使用肽、外来体、APC和CTL”的(1)和(2)部分。

[0297] 本发明还提供了一种制造用于诱导免疫应答的药物作用剂或组合物的方法或工艺，其中该方法可包括混合或配制本发明的肽与药学可接受载体的步骤。

[0298] 或者，本发明的方法可包括施用疫苗或药物作用剂或组合物的步骤，其包含：

[0299] (a)本发明的肽；

[0300] (b)处于可表达形式的编码本文中公开的此类肽的核酸；

[0301] (c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体；或

[0302] (d)本发明的细胞毒性T细胞。

[0303] 在本发明的语境中，过表达CDC45L的癌症可用这些活性组分来治疗。所述癌症的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。因而，在施用包括所述活性组分的疫苗或药物作用剂或组合物之前，优选确认要治疗的细胞或组织中的CDC45L表达水平与相同器官的正常细胞增强了。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗(过)表达CDC45L的癌症的方法，该方法可包括下述步骤：

[0304] i)测定自具有要治疗的癌症的受试者获得的细胞或组织中的CDC45L表达水平；

[0305] ii)比较CDC45L表达水平与正常对照水平；并

[0306] iii)对具有与正常对照相比过表达CDC45L的癌症的受试者施用至少一种选自上文所述(a)至(d)的成分。

[0307] 或者，本发明可提供包括至少一种选自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或药物作用剂或组合物，其用于对具有过表达CDC45L的癌症的受试者施用。换言之，本发明进一步提供了用于鉴定要用本发明CDC45L多肽来治疗的受试者的方法，所述方法包括测定源自受试者的细胞或组织中的CDC45L表达水平的步骤，其中该水平与该基因的正常对照水平相比的升高指示该受试者可具有可用本发明CDC45L多肽来治疗的癌症。本发明的治疗癌症的方法将在下面更加详细的加以叙述。

[0308] 任何源自受试者的细胞或组织可用于测定CDC45L表达，只要其包括目标的CDC45L转录或翻译产物。合适样品的例子包括但不限于身体组织与体液，例如血液、痰与尿液。优选地，源自受试者的细胞或组织样品含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，较优选癌性上皮细胞或源自怀疑为癌性的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，并将其用为源自受试者的样品。

[0309] 在本发明的语境中，从已知非癌性的生物学样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，若对照水平从癌性生物学样品确定，则它称作“癌性对照水平”。样品表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸(例如管家基因)的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，β-肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。

[0310] 要用本方法治疗的受试者优选为哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不仅限于例如人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛。

[0311] 根据本发明，可测定在自受试者获得的细胞或组织中CDC45L的表达水平。使用本领域已知方法，可在转录(核酸)产物水平上确定表达水平。举例而言，CDC45L的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。可在芯片、阵列等等上实施所述检测。对检测CDC45L的表达水平而言，可优选使用阵列。本领域技术人员可利用CDC45L的序列信息制备上述探针。举例而言，CDC45L的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生了杂交的标记物的强度检测。

[0312] 进一步，CDC45L的转录产物(例如SEQ ID NO：17)可通过基于扩增的检测方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制备。

[0313] 具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与CDC45L的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，而且在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下观察到。一般地，严格条件的温度选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件会是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，对于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。

[0314] 或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定CDC45L蛋白(SEQ ID NO：18)或其免疫学片段的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，其使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段或经修饰抗体保留对CDC45L蛋白的结合能力即可。本发明也提供针对本发明肽的此类抗体及其片段。制备这些种类的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。

[0315] 作为另一种基于CDC45L的翻译产物检测CDC45L基因表达水平的方法，可利用针对CDC45L蛋白的抗体通过免疫组织化学分析测量染色的强度。意即，在此测量中，强染色表明所述蛋白质的存在/水平增加，且同时表明CDC45L基因的高表达水平。

[0316] 对于靶基因(例如CDC45L基因)在癌细胞中的表达水平而言，如果该水平较之靶基因的对照水平(例如在正常细胞中的水平)增加了例如10％、25％或50％，或增加到超过1.1倍、超过1.5倍、超过2.0倍、超过5.0倍、超过10.0倍或者更多的话，可以确定该水平是增加的。

[0317] 对照水平可以与癌细胞同时确定，使用先前从疾病状态(癌性或非癌性)已知的受试者收集和保存的样品。另外，自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞可用作正常对照。或者，对照水平可以借助统计方法，基于通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的CDC45L基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达样式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中CDC45L基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的生物样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中CDC45L基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2S.D.或平均值±3S.D.的范围可以用作标准值。

[0318] 若CDC45L基因的表达水平相比于正常对照水平提高了或与癌性对照水平相似/等同，则可诊断受试者为具有要治疗的癌症。本发明还提供了一种(i)诊断受试者是否具有要治疗的癌症，和/或(ii)选择受试者进行癌症治疗的方法，该方法可包括下述步骤：

[0319] a)测定CDC45L在自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的细胞或组织中的表达水平；

[0320] b)将CDC45L的表达水平与正常对照水平比较；

[0321] c)若CDC45L的表达水平与正常对照水平相比升高的话，将受试者诊断为具有要治疗的癌症；并

[0322] d)若在步骤c)中受试者被诊断为具有要治疗的癌症的话，选择受试者进行癌症治疗。

[0323] 或者，此类方法可包括下述步骤：

[0324] a)测定CDC45L在自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的细胞或组织中的表达水平；

[0325] b)将CDC45L的表达水平与癌性对照水平比较；

[0326] c)若CDC45L的表达水平与癌性对照水平相似或等同的话，将受试者诊断为具有要治疗的癌症；并

[0327] d)若在步骤c)中受试者被诊断为具有要治疗的癌症的话，选择受试者进行癌症治疗。

[0328] 本发明还提供了用于诊断或确定患有或怀疑患有能用本发明CDC45L多肽来治疗的癌症的受试者的诊断试剂盒，其亦可用于评价癌症预后和/或监测特定癌症疗法(更特别地，癌症免疫疗法)的功效或适用性。合适的癌症的例示性例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。更特别地，所述试剂盒优选可包含至少一种检测源自受试者的细胞中的CDC45L基因表达的试剂，所述试剂可选自下组：

[0329] (a)检测CDC45L基因的mRNA的试剂；

[0330] (b)检测CDC45L蛋白质或其免疫学片段的试剂；和

[0331] (c)检测CDC45L蛋白质的生物学活性的试剂。

[0332] 适于检测CDC45L基因mRNA的试剂的例子包括特异性结合或鉴定CDC45L mRNA的核酸，诸如具有与CDC45L mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这些种类的寡核苷酸以对CDC45L mRNA特异性的引物和探针为例。可基于本领域众所周知的方法制备这些种类的寡核苷酸。如果需要，检测CDC45L mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测CDC45L mRNA的试剂。

[0333] 另一方面，适于检测CDC45L蛋白质或其免疫学片段的试剂的例子可包括针对CDC45L蛋白质或其免疫学片段的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，所述抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述试剂，只要所述片段或经修饰抗体保留与CDC45L蛋白或其免疫学片段的结合能力。为检测蛋白制备这些种类的抗体的方法在本领域是众所周知的，且可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测CDC45L蛋白质的试剂。

[0334] 所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。所述试剂盒可进一步包括用于结合针对CDC45L基因的探针或针对CDC45L肽的抗体的固体基质和试剂，用于培养细胞的培养基和容器，阳性和阴性对照试剂，及用于检测针对CDC45L肽的抗体的二抗。举例而言，从没有癌症或患有癌症的受试者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤纸、针头、注射器、和带有使用说明的包装插页(例如，书面的、磁带、CD-ROM等等)。这些试剂之类的可与标签一起保留在容器中。合适的容器可包括瓶、管形瓶和试管。所述容器可从多种材料制得，例如玻璃或塑料。

[0335] 作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对CDC45L mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质例如多孔条上，以形成至少一个检测位点。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位置，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位点可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位点上量较大而在接下来的位点上量较小。在添加测试样品之后，展示可检测信号位点的数目提供了在样品中存在的CDC45L mRNA量的定量指征。所述检测位点可配置成任何合适可检测的形状，并通常是横跨测试条宽度的条状或点状。

[0336] 本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照样品或CDC45L标准样品。本发明的所述阳性对照样品可通过收集CDC45L阳性样品，随后测定其CDC45L水平来制备。或者，可将纯化的CDC45L蛋白或多核苷酸添加到不表达CDC45L的细胞中以形成所述阳性样品或CDC45L标准样品。在本发明中，纯化的CDC45L可以是重组蛋白。例如，阳性对照样品的CDC45L水平大于截留值。

[0337] 在一个实施方案中，本发明进一步提供了一种诊断试剂盒，其包括能够特异性识别本发明抗体的蛋白或其部分蛋白或其免疫原性片段。

[0338] 本文中涵盖的本发明的蛋白的部分肽和免疫原性片段的例子包括由本发明蛋白的氨基酸序列中的至少8个、优选15个、和更优选20个连续氨基酸构成的多肽。癌症可通过使用本发明的蛋白或肽(多肽)检测样品(例如血液、组织)中的抗体来诊断。上文描述了用于制备本发明肽或蛋白质的方法。

[0339] 本发明用于诊断癌症的方法可通过如上所述测定抗CDC45L抗体量和相应对照样品中的量之间的差异来进行。若受试者的细胞或组织含有针对该基因的表达产物(CDC45L)的抗体和抗CDC45L抗体的数量测定为大于截留值(与正常对照中的水平相比)的话，则怀疑该受试者患有癌症。

[0340] 在另一个实施方案中，本发明的诊断试剂盒可包括本发明的肽及与它结合的HLA分子。使用抗原性肽和HLA分子检测抗原特异性CTL的合适方法早已确立(例如Altman JD et al.，Science.1996，274(5284)：94-6)。因此，本发明肽和HLA分子形成的复合物可用于检测方法来检测肿瘤抗原特异性CTL，由此能够较早检测癌症的复发和/或转移。进一步，它可用于选择包含本发明肽作为活性组分的药物的合适受试者或评估该药物的治疗效果。

[0341] 特别地，依照已知方法(参见例如Altman JD et al.，Science.1996，274(5284)：94-6)，可制备放射性标记的HLA分子与本发明肽的寡聚物复合物，诸如四聚体。可使用该复合物来对源自怀疑患有癌症的受试者的外周血淋巴细胞中的抗原-肽特异性CTL定量。

[0342] 本发明进一步提供了如本文所述使用肽表位来评估受试者的免疫学应答的方法和诊断剂。在本发明的一个实施方案中，本文所述的HLA限制肽可作为试剂用于评估或预测受试者的免疫应答。要评估的免疫应答可通过在体外或在体内使免疫原接触有免疫能力的细胞来诱导。在某些实施方案中，作为试剂采用的物质或组合物可以是任何能导致识别和结合肽表位的抗原特异性CTL的生成的物质或组合物。肽试剂无需用作免疫原。用于此类分析的测定系统包括相对较新的技术发展，诸如四聚体、胞内淋巴因子染色和干扰素释放测定法、或ELISPOT测定法。在一个优选的实施方案中，要用肽试剂接触的有免疫能力的细胞可以是抗原呈递细胞，包括树突细胞。

[0343] 例如，本发明的肽可用于四聚体染色测定法，在暴露于肿瘤细胞抗原或免疫原后，对外周血单个核细胞评估抗原特异性CTL的存在。HLA四聚体复合物可用于直接显现抗原特异性CTL(参见例如Ogg et al.，Science 279：2103-2106，1998；和Altman et al，Science 174：94-96，1996)和测定抗原特异性CTL群体在外周血单个核细胞样品中的频率。使用本发明肽的四聚体试剂可如下所述来生成。

[0344] 与HLA分子结合的肽在相应HLA重链和β2-微球蛋白存在下重折叠以生成三分子复合物。在该复合物中，重链的羧基末端在先前工程化到蛋白质中的位点处被生物素化。然后，将链霉亲合素添加至复合物以形成由所述三分子复合物与链霉亲合素组成的四聚体。借助荧光标记的链霉亲合素，四聚体能用于对抗原特异性细胞染色。然后可鉴定细胞，例如通过流式细胞术。此类分析可用于诊断或预后目的。通过该规程鉴定的细胞也可用于治疗目的。

[0345] 本发明还提供了包括本发明肽的用于免疫回忆应答的试剂(参见例如Bertoni et al，J.Clin.Invest.100：503-513，1997和Penna et al.，J Exp.Med.174：1565-1570，1991)。例如，可使用特定肽对来自具有要治疗的癌症的个体的患者PBMC样品分析抗原特异性CTL的存在。含有单个核细胞的血液样品可通过培养PBMC并用本发明的肽刺激该细胞来加以评估。经过适宜的培养期后，可对扩增的细胞群体分析例如CTL活性。

[0346] 所述肽还可作为试剂用于评估疫苗的功效。例如可使用上文所述的方法来分析自接种过免疫原的患者获得的PBMC。测定患者的HLA型，并选择识别患者中存在的等位基因特异性分子的肽表位试剂进行分析。疫苗的免疫原性可通过PBMC样品中表位特异性CTL的存在来指示。本发明的肽还可用于制备抗体，使用本领域公知技术(参见例如 CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY；和 Antibodies A Laboratory Manual，Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，其可作为试剂用于诊断、检测或监测癌症。此类抗体可包括识别HLA分子背景下的肽的抗体，即结合肽-MHC复合物的抗体。

[0347] 本发明的肽和组合物还具有多种别的用途，本文中描述了其中一些。例如，本发明提供了一种用于诊断或检测以CDC45L免疫原性多肽表达为特征的病症的方法。这些方法涉及测定CDC45L HLA结合肽、或CDC45L HLA结合肽和I类HLA分子形成的复合物在生物学样品中的表达。肽或肽和I类HLA分子形成的复合物的表达可通过用针对肽或复合物的结合配偶测定来测定或检测。在一个优选的实施方案中，针对肽或复合物的结合配偶可以是识别和特异性结合肽的抗体。CDC45L在生物学样品诸如肿瘤活检中的表达也可使用CDC45L引物通过标准PCR扩增方案来测试。本文中呈现了肿瘤表达的一个例子，而且用于CDC45L扩增的例示性条件和引物的进一步公开内容可见于WO2003/27322。

[0348] 优选的诊断方法涉及使自受试者分离的生物学样品接触对CDC45LHLA结合肽特异性的作用剂以检测CDC45L HLA结合肽在生物学样品中的存在。如本文中使用的，“接触”意味着放置生物学样品使其在适宜条件(例如浓度、温度、时间、离子强度)下足够接近试剂以容许试剂和生物学样品中存在的CDC45L HLA结合肽之间的特异性相互作用。一般地，试剂接触生物学样品的条件是本领域普通技术人员知道的促进生物学样品中分子与其关联物(例如蛋白质与其受体关联物、抗体与其蛋白质抗原关联物、核酸与其互补序列关联物)之间的特异性相互作用的条件。用于促进分子与其关联物之间的特异性相互作用的例示性条件记载于授权给Low等人的美国专利No.5,108,921。

[0349] 本发明的诊断方法可以在体外和/或在体外实施。因而，生物学样品在本发明中可位于体内或体外。例如，生物学样品可以是体内组织，而且可使用对CDC45L免疫原性多肽特异性的试剂来检测此类分子在组织中的存在。或者，可在体外收集或分离生物学样品(例如血液样品、肿瘤活检、组织提取物)。在一个特别优选的实施方案中，生物学样品可以是含有细胞的样品，更优选含有肿瘤细胞的样品，其是自要诊断或治疗的受试者收集的。

[0350] 或者，诊断可使用容许通过对荧光素标记的HLA多聚体复合物染色而直接定量抗原特异性T细胞的方法来进行(例如Altman，J.D.et al.，1996，Science 274：94；Altman，J.D.et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10330)。还提供了对胞内淋巴因子的染色和干扰素-γ释放测定法或ELISPOT测定法。多聚体染色、胞内淋巴因子染色和ELISPOT测定法表观上均比更常规的测定法灵敏至少10倍(Murali-Krishna，K.et al.，1998，Immunity 8：177；Lalvani，A.et al.，1997，J.Exp.Med.186：859；Dunbar，P.R.et al.，1998，Curr.Biol.8：413)。也可使用五聚体(例如US 2004-209295A)、Dextramers(e.g.，WO 02/072631)、和Streptamers(例如Nature medicine 6.631-637(2002))。

[0351] XI.抗体

[0352] 本发明进一步提供了与本发明的肽结合的抗体。优选的抗体能特异性结合本发明的肽且不会结合(或会微弱结合)非本发明肽。或者，抗体能结合本发明的肽及其同系物。针对本发明肽的抗体可用于癌症诊断和预后测定法、及成像方法。类似地，此类抗体可用于其它癌症的治疗、诊断、和/或预后，只要癌症患者中也表达或过表达CDC45L。此外，胞内表达的抗体(例如单链抗体)在治疗上可用于治疗涉及CDC45L表达的癌症，例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。

[0353] 本发明还提供了多种免疫学测定法，用于检测和/或量化CDC45L蛋白(SEQ ID NO：18)或其片段，包括由选自SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列组成的多肽。此类测定法可根据需要包括一种或多种能够识别和结合CDC45L蛋白或其片段的抗CDC45L抗体。在本发明的语境中，能与CDC45L多肽结合的抗CDC45L抗体优选识别由选自SEQ ID NO：2，
3，4，7和12的氨基酸序列组成的多肽。抗体的结合特异性可用抑制测试来确认。即，当抗体与所分析的全长CDC45L多肽之间的结合在任何由选自SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列组成的片段多肽存在下受到抑制时，证明此抗体特异性结合该片段。在本发明的语境中，此类免疫学测定法按照本领域公知的各种免疫学测定模式实施，包括但不限于各种类型的放射免疫测定法、免疫层析技术、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶联免疫荧光测定法(ELIFA)、等等。

[0354] 本发明的有关的免疫学的但非抗体的测定法也可包括T细胞免疫原性测定法(抑制性的或刺激性的)以及MHC结合测定法。另外，本发明涵盖能够检测表达CDC45L的癌症的免疫学成像方法，例子包括但不限于使用经标记本发明抗体的放射闪烁成像方法。此类测定法在临床上可用于表达CDC45L的癌症的检测、监测、和预后，例子包括但不限于诸如睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。

[0355] 本发明还提供了能与本发明的肽结合的抗体。本发明的抗体可以以任何形式使用，例如单克隆或多克隆抗体，而且可进一步包括通过用本发明的肽免疫动物诸如家兔而获得的抗血清、所有种类的多克隆和单克隆抗体、及通过遗传重组生成的人抗体和人源化抗体。

[0356] 作为抗原用于获得抗体的本发明肽可衍生自任何动物物种，但优选衍生自哺乳动物，诸如人、小鼠或大鼠，更优选衍生自人。人衍生的肽可以由本文所公开的核苷酸或氨基酸序列获得。

[0357] 根据本发明，用作免疫抗原的肽可以是完整的蛋白质或蛋白质的部分肽。部分肽可以包含例如本发明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。

[0358] 在本文中，抗体定义为与CDC45L肽的全长或片段起反应的蛋白质。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体能识别由选自SEQ ID NO：2，3，4，7和12的氨基酸序列组成的C DC45L的片段肽。用于合成寡肽的方法是本领域公知的。合成后，可任选在作为免疫原使用之前纯化肽。在本发明的语境中，寡肽(例如9或10聚物)可缀合或连接于载体以增强免疫原性。匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体是公知的。用于缀合KLH和肽的方法也是本领域公知的。

[0359] 或者，可以将编码本发明肽或其片段的基因插入已知的表达载体，然后用该载体转化本文所述宿主细胞。可以通过任何标准方法从宿主细胞外部或内部回收所需肽或其片段，然后可将其用作抗原。或者，表达肽的完整细胞或其溶胞物或者化学合成的肽也可用作抗原。

[0360] 可以用抗原免疫任何哺乳动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，可使用啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿科动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形科动物包括例如家兔。灵长科动物包括例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。

[0361] 用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。优选的是，其后每4-21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。还可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，可通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。

[0362] 可以如下制备针对本发明肽的多克隆抗体：从经过免疫的哺乳动物(该哺乳动物经检验其血清中所需抗体增加)收集血液，并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体可包括含有多克隆抗体的血清，以及可以从所述血清中分离的含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有本发明肽的亲和柱从仅识别本发明肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。

[0363] 为了制备单克隆抗体，从经过抗原免疫并如上所述检查出血清中所需抗体水平升高的哺乳动物收集免疫细胞，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞可优选获自脾。其它要与上述免疫细胞融合的优选亲本细胞包括例如哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选具有为了用药物选择融合细胞而获得的特性的骨髓瘤细胞。

[0364] 根据已知的方法，例如Milstein等(Galfre和Milstein，Methods Enzymol 73：3-46(1981))的方法，可与将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。

[0365] 通过在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中进行培养，可以选择出由细胞融合得到的杂交瘤。通常，细胞培养在HAT培养基中连续进行数天至数周，这段时间足以使除了所需杂交瘤之外的所有其它细胞(非融合的细胞)死亡。然后，可进行标准有限稀释(standard limiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。

[0366] 除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用肽、表达肽的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了EB病毒的人淋巴细胞。然后，使经过免疫的淋巴细胞与能够无限分裂的人衍生骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生生成所需人抗体(它能够与所述肽结合)的杂交瘤(已公开但未审查的日本专利申请No.Sho63-17688)。

[0367] 随后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明肽的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可用于纯化和检测本发明的肽，还可以用作本发明肽的激动剂和拮抗剂的候选物。

[0368] 或者，可以通过癌基因使生成抗体的免疫细胞，诸如经过免疫的淋巴细胞永生化，并用于制备单克隆抗体。

[0369] 如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可以从生成抗体的免疫细胞诸如杂交瘤或经免疫淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供了如上所述制备的重组抗体。

[0370] 此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它能结合一种或多种本发明的肽。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Huston et al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co et al.，J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al.，Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。

[0371] 抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。本发明提供了经过这样修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。

[0372] 或者，可以以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体或者包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依照已知技术来制备。人源化可通过用啮齿类的CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列来进行(参见例如Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中实质上小于全部的人可变域已被来自非人物种的相应序列所替换。

[0373] 也可以使用在人框架区和恒定区外还包含人可变区的完全人的抗体。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法牵涉使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom&Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991))。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成人抗体。该方法记载于例如美国专利Nos.6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。

[0374] 可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦来分出和分离抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow 和 David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如HyperD、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。

[0375] 除亲和层析外的例示性层析包括例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification和Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。可以通过液相层析来进行层析规程，诸如HPLC和FPLC。

[0376] 例如，可使用吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光来测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的肽施加到该板上，再施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如磷酸对硝基苯酯，并测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。可以使用肽的片段，诸如C-末端或N-末端片段作为抗原来评估抗体的结合活性。可以使用BIAcore(Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。

[0377] 上述方法允许通过下述方式检测或测量本发明的肽：将本发明的抗体暴露于假定含有本发明肽的样品，并检测或测量由抗体与肽形成的免疫复合物。

[0378] 因为依照本发明的肽检测或测量方法可特异性的检测或测量肽，所以该方法可用于使用肽的各种实验。

[0379] XII.载体和宿主细胞

[0380] 本发明还提供了导入有编码本发明肽的核苷酸的载体和宿主细胞。本发明的载体可用于在宿主细胞中维持本发明的核苷酸、尤其是DNA，用于表达本发明的肽，或者用于施用本发明的核苷酸以用于基因疗法。

[0381] 当宿主细胞为大肠杆菌且在大肠杆菌(例如JM109、DH5α、HB101或XL1Blue)中大量扩增和生成载体时，载体应具有能在大肠杆菌中扩增的“(复制)起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，除了上述载体，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以用于亚克隆和提取cDNA。当使用载体来生成本发明的蛋白质时，可使用表达载体。例如，要在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5α、HB101或XL1Blue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward et al.，Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992))、araB启动子(Better et al.，Science 240：1041-3(1988))、T7启动子等。
在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况下，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)来替代上述载体。另外，载体还可以包含用于多肽分泌的信号序列。指导肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有pelB信号序列(Lei et al.，J Bacteriol 169：4379(1987))。用于将载体导入靶宿主细胞的手段包括例如氯化钙法和电穿孔法。

[0382] 在大肠杆菌外，可以使用例如衍生自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen) 和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990))、pEF、pCDM8)、衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、衍生自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。

[0383] 为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.，Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima et al.，Nucleic Acids Res 18：
5322(1990))、CMV启动子、等等，及优选用于选择转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。

[0384] 描述了合适的方法和材料，虽然与在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于实践或测试本发明。本文通过提述并入本文中提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献的全部内容。如果有冲突，当以本说明书包括定义在内为准。此外，所述材料、方法和实施例均只是例示的目的，而不意在构成限制。

[0385] 提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。实施例

[0386] 材料和方法

[0387] cDNA微阵列分析

[0388] 如前人所述(Nakamura T et al.，Oncogene 2004；23：2385-400，Taniwaki M et al.，Int J Oncol 2006；29：567-75)利用cDNA微阵列分析生成了基因表达谱。微阵列分析的原始数据可从Y.Nakamura教授(东京大学医学研究所)处索取。从手术标本获取了来自肺癌和邻近非癌性正常肺组织的组织样品，且所有的患者均提供了参与该项研究的知情同意书。

[0389] 小鼠

[0390] 六周龄雌性不肥胖糖尿病(NOD)/重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠购自Charles River Laboratories Japan。该小鼠在熊本大学动物资源与开发中心饲养，其操作符合熊本大学的动物照看规范。

[0391] 细胞系和HLA表达

[0392] CDC45L和HLA-A*2402阳性人肺癌细胞系EBC-1和Lu99由Health ScienceResearch Resources Bank(Tsukuba，Japan)惠赠。C1R-A2402细胞，即表达痕量内在HLA I类分子的类人B淋巴细胞母细胞系C1R的HLA-A*2402转染子(Karaki S，Kariyone A，Kato N，Kano K，Iwakura Y，Takiguchi M.HLA-B51transgenic mice as recipients for production of polymorphic HLA-A，B-specific antibodies.Immunogenetics 1993；37：
139-42)26由Masafumi Takiguchi博士(Kumamoto University，Kumamoto，Japan)惠赠。
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CDC45L阳性人胰腺癌细胞系PANC1(HLA-A*0201，HLA-A*2402)和TAP缺陷且HLA-A*0201阳性细胞系T2购自Riken Cell Bank。分别使用抗HLA-A2单克隆抗体(单抗)，BB7.2(One Lambda，Inc.，Canoga Park，CA)和抗HLA-A24单抗(One Lambda，Inc.)进行流式细胞术来检查HLA-A2和HLA-A24的表达，以选择HLA-A24和HLA-A2阳性的供血者用于测定。将这些细胞在添加了10％FCS的RPMI 1640培养基中，37℃、5％CO2气氛中体外保持。

[0393] 患者、血液样品和肿瘤组织

[0394] 用于收集和使用来自供体的PBMC的研究方案得到了熊本大学机构评审委员会(Institutional Review B oard of Kumamoto University)的批准。在熊本大学医院，在获得了知情同意书后，在常规诊断程序中自患者获取了血液样品或癌性组织以及邻近的非癌性组织。还在获得了知情同意书后从健康供体获取了血液样品。所有样品随机编号以掩饰其身份，并将血液样品储存于-80℃直到使用。

[0395] 逆转录-PCR和Northern印迹分析

[0396] 如前人所述 (Nakatsura T et al.，Biochem Biophys Res Commun2001；281：936-44)对细胞系和正常或癌性组织进行了逆转录-PCR(RT-PCR)分析。CDC45L引物序列为5 ′ -CTGGTGTTGCACAGGCTGTCATGG-3 ′(SEQ ID NO：19)(有义 ) 和
5′-CGCACACGGTTAGAAGAGGAG-3′(SEQ ID NO：20)(反义)。利用β-肌动蛋白mRNA作为对照进行标准化后，我们对组织和细胞系中的CDC45L mRNA的表达进行了比较。如前人所述(Nakatsura T et al.，Biochem Biophys Res Commun 2003；306：16-25)使用CDC45L基因特异性cDNA探针(对应于1245至1867bp)进行了Northern印迹分析。

[0397] 免疫组织化学染色

[0398] 人CDC45L的免疫组织化学检查如前人所述(Nakatsura T et al.，Biochem Biophys Res Commun 2001；281：936-44)加一些更改进行。简言之，在组织切片脱石蜡和脱水后，将内源过氧化物用含0.3％过氧化氢的甲醇淬灭15分钟，并通过与蛋白质封闭无血清试剂(Dako)一起温育10分钟来降低非特异性结合。用缓冲溶液(含0.1％Tween 20和0.5M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液)清洗后，将在Can Get Signal(R)免疫染色溶液A(Toyobo Co.，Osaka，Japan)中稀释的一抗(在家兔中生成的抗人CDC45L抗体，1∶100稀释，HPA000614，亲和纯化的，Sigma-Aldrich)与样品一起于4℃温育过夜。此后，将切片用缓冲溶液仔细漂洗，并与二抗(LABLED-POLYMER-HRP，抗小鼠和抗家兔抗体，Dako)一起于室温温育。用缓冲溶液清洗三次后，通过与3，3′-二氨基联苯胺溶液(液体DAB+底物色原体系统，Dako)一起温育来进行染色反应。然后将载玻片用苏木精轻度复染色，在乙醇中脱水，并在二甲苯中透明。使用已知表达CDC45L的睾丸的切片作为抗人CDC45L抗体的阳性对照。对于阴性对照，我们用普通家兔IgG替换一抗。

[0399] 肽

[0400] 利用BIMAS软件程序(Bioinformatics and Molecular Analysis Section，Center for Information Technology，NIH，Bethesda，MD)选出携带针对HLA-A*2402编码的分子的结合基序的人CDC45L衍生肽，并合成(AnyGen，Gwangju，Korea)了16种肽(10种九聚物和6种十聚物，纯度＞95％)(表1)。将肽以20μg/mL的浓度溶解在二甲亚砜中并保存于-80℃。使用两种HIV肽，即HLA-A24限制性RYLRDQQLL(SEQ ID NO：21)肽(HIV-A24)和HLA-A2限制性SLYNTYATL(SEQ ID NO：22)肽(HIV-A2)，作为阴性对照(Komori H et al.，Clin Cancer Res 2006；12：2689-97)。

[0401] 表1：自人CDC45L衍生的预测结合HLA-A24(A*2402)的候选肽

[0402]

[0403] *结合得分使用BIMAS软件计算

[0404] (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken__parker__comboform)[0405] CDC45L反应性人CTL的生成和CTL应答的测定

[0406] 如前人所述(Harao M et al.，Int J Cancer 2008；123：2616-25，Naito K et al.，Int J Oncol 2006；28：1481-9)自HLA-A24或HLA-A2阳性日本人健康供体和肺癌患者分离PBMC，并生成外周单核细胞衍生树突细胞(DC)。在补充有2％热灭活的自体血浆的AIM-V(Invitrogen)中，在4μg/mL β2-微球蛋白(Sigma-Aldrich)存在下将DC用20μg/mL候选肽于37℃冲激2小时。然后如前人所述(Imai K et al.，Clin Cancer Res 2008；14：6487-95，Harao M et al.，Int JCancer 2008；123：2616-25)将细胞辐照(40Gy)并与+
分离的CD8T细胞一起温育。在第7天和第14天用经肽加载的自体PHA-胚细胞再进行两次刺激。如前人所述(Inoue M et al.，Immunol Lett 2009；126：67-72)生成PHA-胚细
5
胞，并将这些PHA-胚细胞(5X 10)用20μg/mL肽冲激3小时，辐照(100Gy)并在10ng/mL
6 +
人重组IL-7(Wako，Osaka，Japan)存在下与2X 10 个CD8T细胞一起培养。2天后，向培养物补充20IU/mL人重组IL-2(PeproTec Inc.)。

[0407] 最后一次刺激后6天，调查所诱导的CTL的抗原特异性应答。在第7天和第14天+用经肽加载的自体PHA-胚细胞再进行两次每周一次的刺激。将富集了CD4T细胞的自体- -
CD14CD8 细胞用PHA(2μg/mL)和人重组IL-2(100IU/mL)培养2天，并将细胞用PBS清洗
5
并用人重组IL-2(100IU/mL)再培养3天。将这些PHA-胚细胞(5X 10)在补充有2％热灭活的自体血浆的AIM-V(Invitrogen)中用50μg/mL肽于37℃冲激2小时。然后将细胞辐
6 +
照(100Gy)并与2X 10 个CD8T细胞一起温育。在24孔板中使用补充有5ng/mL人重组IL-7、IL-2、和IL-15的培养基建立这些培养物。最后一次刺激后6天，如前人(Komori H et al.Clin Cancer Res 2006；12：2689-97)和下文所述通过IFN-γELISPOT测定法、CD107a
51
动员测定法和 Cr释放测定法来调查所诱导的CTL的抗原特异性应答。

[0408] CD107a动员测定法

[0409] 为了鉴定经表位肽刺激的脱颗粒CD8+T淋巴细胞，通过流式细胞术(Rubio V et al.，Nat Med 2003；9：1377-82，Betts MR et al.，J Immunol Methods2003；281：65-78)来分析在细胞表面上暴露的CD107a。使用免疫细胞CD107a检测试剂盒(MBL，Nagoya，Japan)6
依照制造商的说明书实施CD107a动员测定法。将诱导的CTL以2X10 个细胞/mL的终浓度悬浮在补充有2％热灭活的自体血浆的AIM-V中，并将150μL细胞悬浮液添加至96孔圆底微量板的每个孔中。添加CDC45L衍生肽或对照HIV肽(1μg/ml)作为刺激物，并将FITC标记的抗人CD107a单抗或FITC标记的同种型对照小鼠IgG1以及莫能菌素添加至每个孔中。将细胞于37℃培养5小时。培养后，将细胞用PE缀合的抗人CD8a(Biolegend)染色，并通过流式细胞术(FACScan；BD Biosciences)来分析。

[0410] CDC45L敲低细胞的生成

[0411] 为了敲低肺癌细胞中的CDC45L表达，以150nM的终浓度将CDC45L小干扰(si)RNA(人Cdc45 siRNA，sc-35044：三种靶标特异性20-25nt siRNA的集合；Santa Cruz)添加至40-60％汇合的细胞。使用Lipofectamine(TM)2000(Invitrogen)依照制造商的说明书将siRNA转染入细胞。使用GFP siRNA作为无关对照。用PBS清洗经处理的细胞一次，并于51
转染后72小时收集贴壁细胞，用作 Cr释放测定法的靶细胞。为了调查siRNA阻抑CDC45L表达的能力，如前人所述(Nakatsura T et al.，Biochem Biophys Res Commun 2003；306：
16-25)进行Western印迹分析。转染后48小时用PBS清洗癌细胞一次，收集贴壁细胞并裂解以分析CDC45L表达水平，与阴性对照细胞的CDC45L表达水平比较。β-肌动蛋白用作内部对照。使用能与CDC45L反应的家兔多克隆抗体(sc-20685，Santa Cruz Biotechnology)作为一抗。

[0412] 针对癌细胞系的人CTL应答

[0413] 如前人所述(Komori H et al.，Clin Cancer Res 2006；12：2689-97，Bourgault VI et al.，Cancer Res 2004；64：8761-6)通过ELISPOT测定法(人IFN-γELISPOT试剂4
盒，BD Biosciences)分析用Lu99细胞(1X10/孔)或经肽冲激的C1R-A2402和T2细胞
4 5
(1X10/孔)刺激后每1X10 个CTL中生成干扰素(IFN)-γ的细胞的频率。以所示的效应
3
细胞对靶细胞比将CTL与癌细胞或经肽冲激的C1R-A2402和T2细胞(作为靶细胞)(5X10/孔)一起共培养，并如前人所述(Yokomine K et al.，Int J Cancer 2009；126：2153-63，
51
Monji M et al.，Clin Cancer Res2004；10：6047-57)进行标准 Cr释放测定法。如前人所述(Komori H et al.，Clin Cancer Res 2006；12：2689-97，Makita M et al.，Clin Cancer Res 2002；8：2626-31)进行抗人HLA I类单抗W6/32(IgG2a，Santa Cruz Biotechnology)对HLA I类的阻断或抗人HLA-DR单抗(IgG2a，BD Biosciences)对HLAII类的阻断。

[0414] 过继免疫治疗模型

[0415] 如前人所述(Imai K et al.，Clin Cancer Res 2008；14：6487-95，Komori H et al.，Clin Cancer Res 2006；12：2689-97)进行实验性过继免疫治疗。简言之，将内源6
CDC45L和HLA-A24二者呈阳性的Lu99细胞(3X10 个细胞/小鼠)皮下接种入NOD/SCID
2
小鼠的右胁。当第7天肿瘤大小达到大约25mm 时，将CDC45L特异性CTL系或通过用无关
6
HLA-A24限制性HIV肽刺激诱导的CTL细胞在100μL PBS中悬浮并静脉内注射(4X10 个细胞/小鼠)；其中所述的CDC45L特异性CTL系是通过用CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：
2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)和CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽的混合物体外刺激自两名健康供体诱导的。在第14天重复进行CTL静脉内注射。每周两次评估肿瘤大小，使用测径器测量两个垂直直径。

[0416] 统计分析

[0417] 利用双尾Stundent氏t检验来评估处理组之间ELISPOT数据和肿瘤大小的差异的统计学显著性。p值小于0.05认为是统计学显著的。统计学分析使用商品化的统计软件包(StatView 5.0，Abacus Concepts，Calabasas，CA)来进行。

[0418] 结果

[0419] 基于cDNA微阵列分析对肺癌中CDC45L基因过表达的鉴定

[0420] 使用含有27,648种基因的基因组范围cDNA微阵列来检查18份肺癌组织及其邻近正常对应物的基因表达谱。cDNA微阵列分析揭示了在全部12名小细胞肺癌患者(平均相对表达比：163,087；范围：81,204-369,309)及6名非小细胞肺癌患者中的4名(平均相对表达比：15,170；范围：0.08-40,131)中，CDC45L基因在肺癌组织中显著增强的表达(表2)。因此，选择CDC45L作为新肺癌TAA来表征。根据cDNA微阵列分析，几种其它恶性肿瘤，包括前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的CDC45L基因的表达水平大多数也增强(表2)。

[0421] 表2：通过cDNA微阵列分析调查的，CDC45L基因在肺癌和多种恶性肿瘤中的过表达

[0422]

[0423] *相对表达比(癌/正常组织)＞5认定为阳性。 CDC45L mRNA在正常组织、癌细胞系、和肺癌组织中的表达

[0424] 使用RT-PCR和Northern印迹分析在mRNA水平分析正常组织中的CDC45L基因表达。对正常组织中CDC45L的半定量RT-PCR分析揭示了它只在睾丸和乳房中微弱表达(图1A)。正常组织中使用CDC45L cDNA作为探针进行的Northern印迹分析揭示了它在除睾丸外的22种生命器官中不表达(图1B)，与RT-PCR分析的结果一致。相反，使用RT-PCR分析在所有9种肺癌细胞系中都检测到CDC45L基因表达(图1C)。随后，使用RT-PCR分析分析了肺癌组织中的CDC45L基因表达。在8名NSCLC患者中的7名中，CDC45L mRNA在癌组织中强烈表达(图1D上部)。另外，使用RT-PCR分析了手术切除的癌组织及其邻近正常对应物中的CDC45L基因表达。在所有4份肺癌组织中都检测到CDC45L基因表达，但是在其正常对应物中几乎未检测到表达(图1D下部)。另外，对自胃癌、肝胆管癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌衍生的多种癌细胞系的RT-PCR分析揭示了CDC45L基因在许多这些癌细胞中也表达(图1E)。

[0425] 为了在蛋白质水平调查CDC45L表达，对肺癌组织和正常组织进行了免疫组织化学分析。研究了26份肺癌组织样品，包括12份腺癌(12份中的7份是支气管肺泡癌)、8份鳞状细胞癌、和6份小细胞癌。所有26份样品都展现出强烈的CDC45L核染色和微弱的细胞质染色(图1F)。在正常邻近肺组织中观察到没有染色或很弱的染色(图1F)。CDC45L在睾丸中表达，但是在其它类型的正常成人组织中，包括乳房、心、肝、肾、胃、小肠、结肠、胰腺、皮肤、脾、和胸腺，观察到没有染色或很弱的染色(图1F及未显示的数据)。总之，人肺癌中的CDC45L蛋白质表达水平明显比正常成人组织(睾丸除外)中的高得多。这些结果与来自RT-PCR和Northern印迹分析的结果一致(图1A，B和D)。

[0426] 健康供体中CDC45L衍生的且HLA-A24限制性的CTL表位的鉴定

[0427] 为了鉴定HLA-A24限制性的且自CDC45L衍生的CTL表位，依照NIHBIMAS提供的HLA-肽结合预测软件选择预测对HLA-A24具有高结合亲和力的16种候选肽(表1)。为了+测试哪种肽能诱导肽反应性CTL，将自健康供体的PBMC分选的CD8T细胞与经从这16种CDC45L肽中选出的四种肽的混合物冲激的自体单核细胞衍生DC一起培养。用加载了肽的自体PHA-胚细胞再进行两次每周一次的刺激后，通过IFN-γELISPOT测定法检查针对经肽冲激的C1R-A*2402细胞的细胞毒性活性(图2)。用经16种CDC45L肽中4种的混合物冲+
激的自体单核细胞衍生DC刺激自两名HLA-A24阳性健康供体的PBMC分选的CD8T细胞。
+
通过IFN-γELISPOT测定法检查所得的CTL系中对CDC45L衍生肽特异性的CD8T细胞的频率(图3)。背景对照用经无关HIV-A24肽冲激的C1R-A2402细胞进行刺激。所生成的CTL
109 117
系在用经CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)，VYNDTQIKL 、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ
294 302 556 564
ID NO：3)， SYTAARFKL 、CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)， KFLDALISL 、
370 378
CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO：7)， KFLASDVVF 或CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO：
556 565
12)，KFLDALISLL 肽冲激的C1R-A2402细胞刺激后可再现地生成大量IFN-γ。这些结果提示这5种CDC45L衍生肽具有免疫原性。

[0428] 为了进一步分析这5种免疫原性肽的CTL刺激能力，进行了CD107a动员测定法来评估CTL对溶胞性颗粒内含物的抗原特异性分泌(Rubio V et al.，Nat Med 2003；9：1377-82，Betts MR et al.J Immunol Methods 2003；281：65-78)。当通过用这5种免疫原性肽之一刺激而生成的CTL系用其关联肽再刺激时，与用无关HIV-A24肽再刺激相比，被+
抗CD107a单抗染色的CD8T细胞的比例显著更高(图4)。

[0429] 肺癌患者中对CDC45L衍生肽特异性的CTL系的建立

[0430] 通过用 CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)、CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)、CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO：7) 或CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO：12)肽刺激，自HLA-A24阳性肺癌患者的PBMC生成了CDC45L特异性CTL。这些CTL系在IFN-γELISPOT测定法中应答于CDC45L衍生肽而生成显51
著大量的IFN-γ(图5A)。另外，这些CTL系在 Cr释放测定法中展现出针对经5种CDC45L衍生肽冲激的C1R-A2402细胞的细胞毒性活性，但是未展现针对经无关HIV-A24肽冲激的C1R-A2402细胞的细胞毒性活性(图5B)。这些结果指示这些CTL具有肽特异性细胞毒性活性。

[0431] 癌细胞中对CDC45L CTL表位的天然加工

[0432] 检查了这些CTL杀死天然表达CDC45L和HLA-A24二者的人肺癌细胞系的能+ +
力。Lu99和EBC-1细胞(CDC45L，HLA-A24)、经CDC45L特异性siRNA转染的Lu99和
- + +
EBC-1细胞(CDC45L，HLA-A24)、经对照GFP siRNA转染的Lu99和EBC-1细胞(CDC45L，+ + -
HLA-A24)(图5C)及A549细胞(CDC45L，HLA-A24)用作靶细胞。如图5D所示，通过分别用CDC45L-A24-9-109-2(SEQID NO：2)肽和CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽刺激而自健康供体-4(底部小图，左边)和肺癌患者-18(底部小图，右边)生成的CTL系展现出针对Lu99细胞和经对照GFP siRNA转染的Lu99细胞的细胞毒性，但是针对经CDC45L特异性siRNA转染的Lu99细胞(底部小图)及A549细胞(底部小图，左边)未展现细胞毒性。类似地，通过用CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)肽刺激而自肺癌患者-1生成的CTL展现出针对EBC-1和经GFP siRNA转染的EBC-1细胞的细胞毒性，但是针对经CDC45L特异性siRNA转染的EBC-1细胞及A549细胞(上部小图，左边)未展现细胞毒性。而且，用CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO：7)肽刺激而自肺癌患者3和8生成的CTL展现出针对EBC-1和经GFP siRNA转染的EBC-1细胞的细胞毒性，但是针对经CDC45L特异性siRNA转染的EBC-1细胞及A549细胞(上部小图，中部，右边)未展现细胞毒性。在5种免疫原性CDC45L衍生肽中，3种，即CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)和CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)激发出了能有效裂解天然表达CDC45L和HLA-A24二者的肺癌细胞的CDC45L特异性CTL。这些结果提示这3种CDC45L衍生肽在癌细胞中被天然加工并在HLA-A24分子的背景中被呈递。

[0433] 为了验证对所述3种CDC45L衍生肽特异性的CTL以HLA I类限制性方式识别靶细胞，使用对HLA I类特异性的单抗(W6/32)来阻断CTL识别。IFN-γ生成和细胞毒性受到针对HLA I类的阻断性单抗的显著抑制，但是不受对照抗HLA II类单抗的抑制(图6A和B)。这些结果清楚地指示这些所诱导的CTL识别以HLAI类限制性方式表达内源CDC45L的靶细胞。

[0434] CDC45L-9-556-4(SEQ ID NO：4)，556KFLDALISL564肽能诱导受HLA-A2(A*0201)和HLA-A24(A*2402)二者限制的CTL

[0435] 依照HLA-肽结合预测软件SYFPEITHI(Institute for Immunology，University of Tubingen，Tubingen，Germany，www.syfpeithi.de/)，CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID556 564
NO：4，在本文中也称作CDC45L-A24-9-556-4)， KFLDALISL 肽被预测为不仅针对HLA-A24(A*2402)具有高结合亲和力，而且针对HLA-A2(A*0201)也具有高结合亲和力。
HLA-A*2402是日本人群中最常见的HLA I类等位基因，而HLA-A*0201是多个民族(包括亚洲人、非洲人、非洲裔美国人、和高加索人)中最常见的HLA等位基因之一(Browning M et al.Immunol Today1996；17：165-70)。因此提出这样的假设，即CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽是受HLA-A2和HLA-A24二者限制的候选共同CTL表位。为了确定
CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽是否能结合HLA-A2分子，如前人所述(Yokomine K et al.，Int J Cancer 2009；126：2153-63)用T2细胞进行了HLA-A2稳定化测定法。与用作阳性对照的HIV-A2肽相比，CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽结合HLA-A2分子，其使HLA-A2稳定化的能力更强(数据未显示)。因此，确认了该肽对HLA-A2的实际结合。

[0436] 接着，通过用CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽刺激来自HLA-A2(A*0201)阳性的健康供体的PBMC而生成了CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)特异性CTL。自HLA-A2阳性健康供体生成的CTL系特异性地响应于经肽冲激T2细胞的再刺激而生成IFN-γ(图7A)。另外，所生成的CTL系展现出针对经CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽冲激的T2细胞的细胞毒性，但是未展现出针对经无关HIV-A2肽加载的T2细胞或经CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽加载的C1R-A2402细胞(图7B)的细胞毒性。这些结果指示这些CTL以HLA-A2限制性方式介导肽特异性细胞毒性。另外，所生成的CTL系能有效裂解表达内源CDC45L和HLA-A2(A*0201)分子而非HLA-A24的Panc1细胞，而且细胞毒性受到针对HLA I类的阻断性单抗(W6/32)的显著抑制，但是不受对照抗HLA II类单抗
51
抑制，如通过 Cr释放测定法测定的(图7C)。

[0437] 这些结果清楚地指示CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽是自CDC45L蛋白天然加工的，并且不仅在HLA-A24的背景中而且在HLA-A2的背景中呈递，从而受到CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽诱导的CTL的识别(图5D，6和图7)。因此，CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO：4)是一种受HLA-A2和HLA-A24二者限制的共同CTL表位，而且此肽将可适用于超过80％的具有表达CDC45L的癌症的日本患者的免疫治疗。

[0438] NOD/SCID小鼠中CDC45L反应性人CTL的体内抗肿瘤活性

[0439] 为了评估CDC45L反应性CTL接种到植入有CDC45L阳性人肺癌细胞的免疫受损小鼠体内后的治疗功效，将Lu99细胞皮下接种入NOD/SCID小鼠。7天后，当肿瘤直径达到大约5X 5mm时，给小鼠静脉内注射人CTL，该CTL是用经CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)和CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)肽的混合物或无关HIV-A24肽冲激的自体单核细胞衍生DC(第0天)和自体PHA-胚细胞(第7天和第+
14天)刺激CD8T细胞生成的。将CTL接种入小鼠之前，评估CTL的肽特异性细胞毒性活性(图8)。自HLA-A24阳性的两名健康供体生成的CTL系特异性地响应于经各个肽(健康供体-5中的CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)肽除外)冲激的C1R-A2402细胞的再刺激
51
而生成了IFN-γ(图8A)。另外，在 Cr释放测定法中，CDC45L肽的混合物激发出能有效裂解Lu99细胞的CTL，而且该细胞毒性受到对HLA I类特异性的阻断性单抗的显著抑制(图
8B)。另一方面，在健康供体-4和-5二者中，CTL系展现出针对经CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO：2)肽冲激的C1R-A2402的特异性裂解，但是不针对经CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO：3)、CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO：4)或无关HIV-A24肽冲激的C1R-A2402的特异性裂解(图8C)。

[0440] 接种Lu99细胞后第42天，接种有CDC45L刺激的CTL的小鼠中的肿瘤(n＝5；均2 +
值+/-标准偏差[SD]，108+/-65mm)显著小于接种有对照HIV肽诱导的CD8T细胞(n＝
2 2
5；均值+/-SD，271+/-94mm)或单独PBS(n＝5；均值+/-SD，297+/-44mm)的小鼠中的(双* **
尾Student氏t检验，P＜0.05，P＜0.01；图8D)。结果清楚地指示NOD/SCID小鼠中CDC45L特异性人CTL的过继转移治疗针对CDC45L阳性人肿瘤的功效。

[0441] 总之，提示CDC45L抗原具有高度免疫原性，而且是肺癌基于肽的免疫疗法的一种有希望的靶标，不引起自身免疫现象。

[0442] 讨论

[0443] 在当前的研究中，使用对肺癌的cDNA微阵列分析鉴定出新TAA，细胞分裂周期45样(CDC45L)。微阵列数据显示CDC45L在前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌中以及在肺癌中过表达。根据自肺癌组织中CDC45L基因表达的cDNA微阵列分析获得的数据，在所有4份肺癌组织中检测到CDC45L基因表达，但是在它们的正常对应物中没有检测到。另外，在RT-PCR和Northern印迹分析中在正常组织中几乎检测不到除睾丸外的许多生命器官中的CDC45L表达。这些结果提示靶向CDC45L会是这些癌症的新免疫治疗办法，而不引起自身免疫疾病。

[0444] 还发现CDC45L衍生免疫原性肽，即CDC45L-A24-9-109-2、CDC45L-A24-9-204-3和CDC45L-A24-9-556-4，能在经不完全弗氏佐剂中乳化的肽免疫的BALB/c小鼠中诱导表位特异性(数据未显示)。经CDC45L衍生且H2-Kd限制的肽CDC45L-A24-9-109-2和CDC45L-A24-9-204-3免疫的BALB/c小鼠在长期观察期期间不表现如淋巴细胞浸润或组织破坏等病理变化，而且没有自身免疫病的体征，诸如体重减轻、腹泻和皮肤异常(未发表的数据)。这些结果也指示CDC45L衍生肽能在小鼠中在体内诱导肽反应性CTL，而不引起自身免疫病。

[0445] 公知CDC45L在DNA复制的启动和延长步骤中具有至关重要的作用，因此癌细胞中难以发生CDC45L丧失。在一项先前的研究中，Pollok等人展示了人癌症衍生细胞中的CDC45L蛋白水平一致性地高于原代人细胞，而且CDC45L表达与增殖中的细胞群密切相关(Pollk S，et al.FEBS J 2007；274：3669-3684)。其他先前研究提示CDC45L上调依赖于发育异常等级和淋巴结状态(Li JN，et al.BMC Cancer 2008，395：1-8)。另外，Feng等人最近报告了特异性si-RNA对CDC45L基因表达的下调显著抑制癌细胞系诸如Hela和HepG2细胞的生长，提示CDC45L是抗癌治疗的有用靶标(Feng D，et al.Cancer Res2003；63：7356-7364)。最近一项报告总结出临床试验中的癌症疫苗的客观响应率较低(2.6％)(Rosenberg S A，et al.Nat Med 2004；10：909-15)。一个可能的原因是癌细胞因治疗驱动的免疫选择(therapeutically driven immune selection)而发生TAA删除、突变、或下调，由此导致的免疫逃避。从肿瘤细胞不能丧失肿瘤发生所需要的抗原这一点出发，CDC45L被认定为对于抗癌免疫疗法有用的可能候选TAA。在本发明中，鉴定出5种HLA-A24限制性CDC45L表位肽，即CDC45L-A24-9-109-2、CDC45L-A24-9-294-3、CDC45L-A24-9-556-4、CDC45L-A24-9-370-7和CDC45L-A24-10-556-12，通过用这些肽进行体外刺激，能从PBMC产生HLA-A24限制性人CTL。另外，发现通过用这5种肽刺激，从自肺癌患者分离的PBMC也能生成CDC45L反应性CTL。在4种CDC45L表位肽中，即CDC45L-A24-9-109-2、CDC45L-A24-9-294-3、CDC45L-A24-9-556-4和CDC45L-A24-9-370-7，肽诱导的CTL不仅能杀死经关联肽冲激的C1R-A*2402细胞，而且还能杀死以HLA-A24限制性方式表达CDC45L的癌细胞系。这些数据提示这些CDC45L肽是在癌细胞中自CDC45L蛋白天然加工出来的，而且在HLA-A24分子的背景中呈递到细胞表面上，以受到CTL识别。已知HLA-A24(A*2402)是日本人群中最常见的HLA等位基因之一，估计抗原频率为60％，而且也存在于高加索人中，估计抗原频率为10％。还提示HLA-A24限制性的CDC45L衍生的CTL表位的鉴定可用于全世界，尤其是亚洲许多肺癌患者的免疫治疗(Date，Y.，et al.Tissue Antigens，1996；
47：93-101)。

[0446] 总之，本文中公开的结果提示CDC45L是一种新TAA，它的表位肽能激发出能杀死表达CDC45L和HLA-A24二者的癌细胞的CTL。由于CDC45L在几类人恶性肿瘤中强烈表达，包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌，因此提示有望利用CDC45L作为靶标来进行针对上文所述的恶性肿瘤基于肽的免疫治疗，而不引起任何自身免疫现象。

[0447] 工业应用性

[0448] 本发明提供了新的TAA，尤其是源自CDC45L的，它们可诱导强而特异性的抗肿瘤免疫应答，并且可应用于广泛的癌症类型。这样的TAA可用作针对与CDC45L相关的疾病的肽疫苗，这样的疾病例如癌症，例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓细胞样白血病(CML)、软组织肿瘤、胃癌、肝胆管癌、和结肠直肠癌。

[0449] 通过述及完整收录本文中引用的所有专利、专利申请、和出版物。

[0450] 另外，虽然本文中参照具体实施方案详细地描述了本发明，但是要理解，上面的描述本质上是例示性的和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。

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CDC45L肽及包含它的疫苗

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