基因转移技术已成为令人十分感兴趣的一个领域。从基因调控和重 组蛋白质的生产到基因治疗，把一外源基因引入细胞中(即转染)可带 来许多重要的科学及医学上的应用。

病毒已进化而能越过基因转移的不同细胞屏障并已的确成为转染所 选择的载体。目前，许多病毒，包括反转录病毒、腺病毒或疱疹病毒， 已经遗传工程处理而携带治疗基因，用于人的临床基因治疗尝试。然而， 仍然存在着感染及免疫反应的危险，而大规模的病毒生产则耗时费力。

由于这许多原因，人们已开发出了非病毒性系统来把DNA携带入 细胞中，例如基于阳离子脂质，商业名称为LipofectinTM的二油酰氧基 丙基三甲基铵的转染技术(Felgner等人，Proc.Natl.，Acad.Sci.USA，84， 7413-7417，1987)。由于发现了这种转染技术，已经合成出了更多的阳 离子脂质，其中一些作为实验室使用的转染试剂是商业上可得到的： DOGS(TransfectamTM)、DOSPA(LipofectamineTM)、DOTAP (DOTAPTM)。

不过，显然在非病毒性基因传递系统的研制方面取得了重要进展， 但仍然存在着对更为有效技术的需求。因为合成系统的转染效率通常低 于病毒载体的效率。另外，在体内还存在着许多问题，而非病毒性系统 在生物液中的稳定性差，不能使体内有较高的转染再现水平。

用寡核苷酸如DNA转染细胞可用于，例如在宿主细胞或生物体中 表达通常不被该细胞或生物体表达的蛋白质。比如，可把称为质粒的自 主复制DNA分子引入通常并不含该质粒的细胞中，以期在该细胞中表达 标记基因产物，或者表达所感兴趣的蛋白质，如随后从该细胞中收获的 重组蛋白质(见Sambrook等人，分子克隆：实验手册，第2版(冷泉 港，1989)，第1章)。把寡核苷酸转染入细胞中也可以用于治疗方面。 例如，通过Watson-Crick碱基配对可把曾存在于细胞或细胞核中的反义 寡核苷酸结合到靶单股核酸分子上，或者可通过Hoogsteen碱基配对将 其结合在双股核酸上，这样做可通过下列机制之一破坏靶的功能：通过 阻止正常转录、剪接或翻译所需因子的结合；通过激发由RNA酶H所引 起的mRNA的酶解，或者是通过由直接与反义寡核苷酸连接的反应性基 团而引起的靶的破坏。(见Zamecnic等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1978)75：280-284)。基因治疗或基于DNA的接种为其它治疗应用。

把蛋白质及其它阴离子大分子转移入细胞中用于治疗及筛选用途。 例如，通过把致免疫蛋白质引入细胞中可提高免疫作用，这样其就可以 更为有效地加工并呈现在细胞表面，从而促进致免疫反应。使在细胞内 部发挥作用的负电荷阴离子大分子通过疏水细胞膜转移至其发挥效应的 细胞质中。提高或阻碍DNA转录的那些因子可用于筛选试验中，以证实 所感兴趣的基因的转录。对于在筛选化合物以确定其对特定的大分子如 细胞受体的效应方面，这些转录测定是人们极为熟悉的。

根据本发明我们发现，把脂质结合到碱性、膜扰乱性肽上可产生新 的化合物，该化合物可结合多核苷酸和阴离子大分子并可用于细胞的转 染。于是，一方面，本发明涉及新的化合物，该化合物为脂质与碱性、 膜扰乱性肽的轭合物，也是具转染力的分子。

术语“轭合物”意指由与肽化学结合的脂质所组成的化合物，比如， 通过出现或连接于脂质上的硫原子与出现或连接于肽上的硫原子二者之 间形成的二硫键；或者是通过出现或连接于脂质上的羧基与肽的氨基之 间形成的酰胺键。

此处使用的术语“脂质”包括直链、支链、饱和或不饱和脂族羧酸 及磷脂。脂族羧酸的实例为月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸以及 (CH3(CH2)n)2CHCOOH，其中n为从3-19的整数。磷脂的实例 有磷脂酰乙醇胺，如二油酰磷脂酰乙醇胺。

术语“碱性肽”意指至少含一个碱性氨基酸的肽。该碱性氨基酸的 实例是天然及非天然的二氨基单羧酸，如α，β-二氨基丙酸、α，γ -二氨基丁酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸和对-氨基苯丙氨酸。

术语“膜扰乱性肽”意指干扰膜屏障功能的胞溶性或抗菌肽 (G.Saberwal和R.Nagaraj BBA 1197：109-131，1994)。碱性、胞溶肽 的实例是蜂毒素、溶血素、mastoparan、bombolitin、erabrolin、及 其衍生物。碱性抗菌肽的实例有杀菌肽、爪蟾抗菌肽、短杆菌肽S和短 杆菌酪肽及其衍生物或类似物。术语“类似物”指其中有一个或多个氨 基酸残基缺失或者已被另一个氨基酸残基置换并基本上未改变所述原始 肽的生物活性的肽。术语“衍生物”指肽类，其中末端羧基已被酯化， 尤其是形成了低级烷基的酯，如甲基及乙基酯；或者转化为酰胺、低级 烷基酰胺或二-低级烷基酰胺或肼。术语“低级”意指含1-6个碳原 子的基团。

因此，一方面，本发明的新化合物为具下式的化合物

           (R-CONH)n-R3                   I

其中，R为直链或支链、饱和或不饱和脂族羧酸的烃基部分，或为 具自由价键的磷脂部分；R3为在一个或两个碳原子处具自由价键的碱性 膜扰乱性肽；n为1或2。

n优选为1。特别优选的化合物为具下式的化合物

其中，X为C2-10亚烷基，R1及R2分别为C12-20脂族羧酸的酰 基部分，而R3定义如上。

术语“C12-20”指一些从12-20的碳原子。酰基部分R1及R2 可以是直链或支链、饱和或不饱和部分。这种基团的实例为月桂酰、棕 榈酰、硬脂酰和油酰。在优选方面，R1及R2为油酰。X优选为亚乙基、 亚丙基或亚癸基(decamethylene)。

在另一个优选方面，本发明涉及具下式的新化合物

         (R-S-S)n-R3        II

其中，R、R3及n具上述含义。

在式II的化合物中，n优选为1。更优选的是下式的化合物

其中，R1、R2、R3及X定义如上。

最优选的R3为残基

-(CH2)-CH(NH2)-CO-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu- Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2.

另一方面，这项发明涉及制备如上定义的新化合物，即脂质与碱性、 膜扰乱性肽的轭合物的方法，以及组合物，该组合物含有至少一种这样 的化合物、多核苷酸或其它任何阴离子大分子、以及，可选择地，含有 辅助脂质和/或短链磷脂、和/或阳离子脂质或本发明轭合物(即式I或II 的化合物)之外的另一种已知的具转染力的分子。另一方面，本发明还 涉及含下列成分的组合物：脂质与碱性、膜扰乱性肽的轭合物，及辅助 脂质和/或短链磷脂、和/或阳离子脂质或除本发明轭合物，如式I或II 的化合物之外的另一种已知的具转染力的分子。本发明进一步涉及利用 该新化合物作为载体以多核苷酸或其它任何阴离子大分子来转染细胞。

由本发明提供的化合物的制备方法如下：使分子式为R3NH2的肽与 分子式为R-COOH的脂质反应；或者使分子式为R3SH的肽与分子式 为R-SY的脂质反应，其中Y为离去基团如2-吡啶硫。这些反应可 用原本已知的方式进行。

这样，在缩合剂如二环己基碳化二亚胺的存在下，用类似于产生肽 键的方法，通过在适宜的溶剂中使化合物进行反应来实现式R3NH2的肽 与式R-COOH的脂质之间的偶联。

式R3SH的肽与式R-SY的化合物之间的反应可在适宜的溶解这 两种反应物的溶剂或溶剂混合物中进行。可把式R-SY的化合物溶于 有机溶剂如氯仿中。把肽R3SH恰当地溶于含水缓冲液如磷酸盐缓冲液 中，其含有适量的水溶性有机溶剂如乙腈以完成单相反应系统的形成。

式为R-COOH及R-SY的化合物是已知的或可通过已知方法 制备，如Biochim.Biophys.Acta 862，435-439(1986)中所述。例如，下式 的化合物

其中，R1及R2为油酰，X为亚乙基、亚丙基或亚癸基；以及下式 的化合物

其中，R1及R2为油酰、X为亚乙基、Y为2-吡啶硫，商业来源 为来自美国阿拉巴马州Alabaster的Avanti Polar Lipids的N-琥珀酰 -PE、N-戊二酰-PE、N-十二烷基-PE和N-PDP-PE。

利用式I或式II的化合物可把任何阴离子大分子转染入细胞中。阴 离子大分子是每个分子至少含一个负电荷的大分子。可依据本发明进行 转染的阴离子大分子之实例包括多核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)及核 糖核酸(RNA)，以及蛋白质，如核糖核酸蛋白及用于免疫的蛋白质， 例如病毒蛋白质。用于本发明的DNA之实例为质粒和基因，特别是那些 可实施基因治疗方案的质粒及其因，例如囊性纤维变性跨膜调节物 (CFTR)、腺苷脱氨酶(ADA)、胸苷激酶(tk)和HLA B7；以 及报道基因，如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、氯霉素转移酶和α-1抗 胰蛋白酶。DNA的其它实例为寡脱氧核苷酸及其用作反义、aptamer 或“三股螺旋”试剂的类似物。RNA的实例为核糖酶或寡核苷酸反义分 子。

进行转染的细胞的性质并非极为严格。该细胞可以是原核或真核细 胞，哺乳动物或植物细胞。

在利用本发明轭合物如式I或II的化合物转染细胞的过程中，在存 在适量该化合物的条件下，将细胞与阴离子大分子接触。对于一定量的 阴离子大分子来说，轭合物(如式I或II的化合物)的适当量要依前者 各自的电荷量而定。轭合物与要进行转染的分子之间的+/-电荷比通常为 0.1-10不等，优选为0.5-5。用基团R3中氨基酸上正电荷基团数除以 要进行转染的分子之负电荷数，来计算“+/-电荷比”之值。比如，当要 进行转染的分子为多核苷酸时，负电荷数则意味着主链中带负电荷的磷 酸根的数量。这些范围之中的最佳比率因所要进行转染的细胞而定，可 很容易地由本发明所属领域的技术人员来确定。

对于一定量的细胞，阴离子大分子的数量为：用于转染104细胞的 阴离子大分子之数量为0.1ng-10μg，优选为0.2μg-2μg。当阴 离子大分子为DNA时，体外转染104细胞的DNA的优选量为0.1μg -10μg。当进行细胞体内转染时，DNA的优选量为0.1μg-1g。

在本发明的优选方面，可在辅助脂质和/或短链磷脂、和/或阳离子 脂质或除本发明共轭物之外的任何其它已知的具转染力的分子存在的条 件下进行转染反应。可以使用任何常用的辅助脂质。辅助脂质是磷脂， 当与已知的具转染力分子共同使用时，认为其可以增加大分子向细胞的 传递。辅助脂质的实例为磷脂、如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺或其混合 物。优选的辅助磷脂为磷脂酰乙醇胺，如二油酰磷脂酰乙醇胺。可以使 用任何常用的短链磷脂。短链磷脂为含有脂肪酸残基的磷脂，该脂肪酸 残基在其主链中含6-12个碳原子。短链磷脂的实例为携带有两个C6-12 脂肪酸残基的磷脂酰胆碱。优选的短链膦脂为二辛基及二辛酰基磷脂酰 胆碱。

具转染力的分子之实例包括阳离子脂质，如J.B.Behr在生物轭合物 化学5：382-389(1994)及X.Gao和L.Huang在基因治疗2：710-722(1995) 中所述；聚阳离子，如A.V.Kabanov及V.A.：Kabanov在生物轭合物化 学6：7-20(1995)中所述；肽及多聚体和其它非病毒性传递系统，如 F.D.Ledley在人类基因治疗6：1129-1144(1995)中所述。

辅助脂质和/或短链磷脂和/或阳离子脂质或除本发明共轭物之外的 另一种已知具转染力的分子，它们的适宜形式为脂质体、胶束、有机或 水溶性分散液，或有机或水溶液。式I化合物与辅助脂质之间的最佳摩尔 比为0.1-50，优选为1-10。辅助脂质与短链磷脂之间的最佳摩尔比 为2-20。式I或II化合物与添加的具转染力之分子之间的最佳摩尔比 为0.1-10。

对于转染反应来说，把适宜量的本发明轭合物，如式I或II的化合 物加入到要转染的分子(例如质粒DNA)中，以加入水溶液中为宜。可 选择地，随后加入辅助脂质和，如需要的话，短链磷脂和/或阳离子脂质 或除本发明轭合物之外的另一种已知的具转染力的分子，其形式既可以是 脂质体、混合性胶束，也可以是有机溶液或水溶性分散液。另外，可把 要转染的分子加入含有依据本发明的化合物，辅助脂质及，如需要的话， 短链膦脂和/或阳离子脂质或除本发明轭合物之外的另一种已知的具转染 力的分子的组合物之中。该组合物可以是固体、液体、半固体或气溶胶 形式，适宜的形式有脂质体、混和性胶束，或有机溶液或水溶性分散液。

对于患病动物和人中的转染细胞来说，该组合物可以下列途径给 药：口服、肠胃外用(静注、肌注、皮下、皮内、腹膜内)、脑内、肺 内、鼻部、直肠、眼部、心室、血管(导管)及肿瘤内途径。另外，该 组合物可经高速嵌塞法施用于皮肤表面。对于转染过程可以本领域技术 人员熟知的适宜测试方案加以测定。

肽Cys-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro- Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2是新颖的，也是 本发明的一部分。它可以通过本领域已知的方法进行制备，例如通过下 述的固相肽合成法。

下列非限制性实施例将进一步说明本发明。

              实施例1

a)肽R3SH的制备

在Milligen 9050合成仪器上进行续流固相合成，自Tental Gel S RAM树脂(0.22毫摩尔/克〔Rapp Polymere GmbH，Tubingen，德国〕 开始，依据如Atherton和Sheppard所述方法，固相肽合成：实用方法(牛 津IRL出版社，1989)。把碱不稳定性Fmoc基团用于α-氨基的保 护。用下列保护基团来保护侧链：Arg(Pmc)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、 Lys(Boc)、Ser(But)及Trp(Boc)。用等量的TPTU(Knorr等人， Tetrahedron Lett、1989，30，1927-1930)和DIPEA来活化Fmoc-氨基 酸(2.5当量)。用DMF中的20％哌啶来完成Fmoc的去保护。用86 ％TFE、10％EDT、4％H2O的混合物(20ml)来处理 Cys(Trt)-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr(But)-Thr(But)-Gly- Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser(But)-Trp(Boc)-Ile-Lys(Boc)Arg(Pmc)- Lys(Boc)-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-酰胺Tental Gel S-树脂 (1.1g)，时间为3小时。浓缩反应混合物、倾至乙醚中，过滤收集沉 淀物，并自水中冷冻干燥。经制备性HPLC来纯化粗肽。得到纯化的 Cys-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu- Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2·5TFA。

b)式II化合物的制备

将由以上段落a)得到的纯肽(34.6mg，10微摩尔)溶于1ml 100mM 磷酸盐缓冲液、pH6.5与1ml乙腈组成的混合液中。在该溶液中加入溶 于2.8ml氯仿的10.6mg 1，2-二油酰-Sn-甘油基-3-磷酸乙醇 胺-N-〔3-(2-吡啶硫)丙酸酯〕中。将混合物在室温下搁置1 小时，蒸发除去有机溶剂。将剩余溶液用水稀释至2.5ml，过Pharmacia Biotech PD-10柱。用3.5ml水洗脱产物并冷冻干燥。由此得到28.9mg 的式IIA化合物，其中R1及R2为油酰，R3为残基-(CH2)-CH (NH2)-CO-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly- Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2。ISP -MS：M＝3722。

              实施例2

a)将得自实施例1b)中的化合物1.1mg溶于三氟乙醇中，并与溶 于氯仿中的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)1.1mg混合。真空干燥混合 物，用1ml的30mM Tris Cl缓冲液(pH8.5)对剩余的薄膜进行再水 化。

b)将质粒DNA(10μg)稀释于400μl的30mM、pH8.5Tris Cl缓冲液中。而后加入由段落a)中得到的产物20μl，轻轻混合，然后 把混合物加入细胞中。

表1显示出依据实施例2配制而在实施例1b中得到的混合物的转染 效率，以及相同转染条件下两种市售转染载体DOTAP和Lipofectamine 在各种细胞系中的转染效率。

利用依据实施例2配制而在实施例1b中得到的混合物，DNA剂量 对各种细胞系的转染效率的作用如表2所示。数据表明，高剂量的DNA 和得自实施例1b的化合物可以用于细胞上而没有任何显著的毒性。

表1：用实施例1b的化合物与DOPE或阳离子脂质的混合物转染 各种细胞系。用编码如该实施例前面所述配制的质粒的β-半乳糖苷酶 对细胞进行转染。转染48小时后对β-半乳糖苷酶活性进行测定。结果 以每孔μ单位表示。   细胞系                      荧光素酶活性   实施例1b中的化合物   DOTAP2)  Lipofectamine2)   293-EBNA   C2E12   CHO K1   HeLa   LM   LM tk-   2343658   563827   1825019   33497   31685   1712739   706718   156947   814133   5409   68614   594518  99050  17655  48457  243  35066  45435

2)可依据生产商的说明书来制备DOTAP和Lipofectamine转染复合 体。

表2：利用增加DNA剂量，以实施例1b的化合物与DOPE的混合 物来进行各种细胞系的转染。用编码如本实施例前面所述配制的质粒的 β-半乳糖苷酶对细胞进行转染。转染48小时后对β-半乳糖苷酶活性 进行测定。结果以每孔μ单位表示。

               β-半乳糖苷酶活性   COS-1   HepG2   CV-1   3T3   0.2μg DNA   0.5μg DNA   1μg DNA   2μg DNA   16325   20545   16005   15740   2533   7944   8988   13816   2700   4440   9775   20434   318   451   1032   1301

              实施例3

a)将由实施例1b)中得到的化合物1.0mg溶于三氟乙醇中并真空干 燥。然后用1ml pH6的10mM Tris马来酸缓冲液对薄膜进行再水化。

b)用190μl的纯无菌水稀释10μl的质粒DNA溶液(1mg/ml)。 加入由段落a)中得到的产物100μl并轻轻混合。将混合液而后加入至细 胞中。

表3显示出如上所述配制的实施例1b化合物的转染效率，以及相同 转染条件下两种市售阳离子脂质转染试剂DOTAP及DOSPER在各种细 胞系中的转染效率。数据表明，与DOSPER和DOTAP相比，实施例1b 的化合物介导的荧光素酶活性分别提高了3-40及25-500倍。另外， 只有实施例1b中的化合物能够转染悬浮细胞系WEHI 231.7，虽然其尚 处于低水平。

表3：用实施例1b的化合物或阳离子脂质转染各种细胞系。用编码 如本实施例前述配制的质粒(每孔2μg DNA)的荧光素酶对生长在6 孔平板上的细胞进行转染。48小时后对荧光素酶活性进行测定。结果以 每g细胞蛋白质的光单位来表示。从每一次测量值中减去本底值。   细胞系                      荧光素酶活性   DOTAP*   DOSPER*   实施例1b的化合物   CHO-K1   CV-1   293   VEHI 231.7   2.69 106   1.14 105   7.31 106   0   2.50 107   1.31 106   5.70 107   0   5.19 108   5.54 107   1.71 108   1.85 102

*)依据厂商说明来制备DOTAP(Avanti Polar Lipid公司)或 DOSPER(Boehringer-Mannheim)转染复合体。并按5/1重量/重量 的阳离子脂质/DNA比率加以使用。

              实施例4

a)把由实施例1b中得到的化合物1.0mg溶于三氟乙醇并真空干 燥。而后用1ml的10mM，pH6 Tris马来酸缓冲液对薄膜进行再水化。

b)用200μl纯无菌水稀释10μl的质粒DNA溶液(1mg/ml)。 加入段落a)中得到的产物39μl和聚乙烯亚胺水溶液(0.45mg/ml)14 μl。用水把混合液调至300μl，轻轻混合，而后加入至292EBNA细 胞中。

c)用200μl纯无菌水稀释10μl的质粒DNA溶液(1mg/ml)。 加入由段落a)中得到的产物52μl，用水调至300μl，轻轻混合该混 合物，而后加至292EBNA细胞中。

d)用200μl纯无菌水稀释10μl的质粒DNA溶液(1mg/ml)。 加入56μl的聚乙烯亚胺水溶液(0.45mg/ml)，用水调至300μl， 轻轻混合该混合液，而后加入至292EBNA细胞中。

表4显示实施例1b化合物、聚乙烯亚胺及其按本实施例前述所配制 的混合物的转染效率。数据表明，与实施例1b化合物及聚乙烯亚胺相比， 该混合物介导的荧光素酶活性分别提高了250和25倍。

表4：用实施例1b的化合物、聚乙烯亚胺及其混合物转染292EBNA 细胞。用编码按本实施例前述配制的质粒(每孔1μg DNA)的荧光素 酶转染生长于6cm平皿中的细胞。48小时后对荧光素酶活性进行测定。 结果以每平皿相对光单位来表示。   转染试剂   荧光素酶活性   实施例1b的化合物   聚乙烯亚胺   实施例1b化合物/聚乙烯亚胺   3.9×105   3.8×104   9.8×106