本发明涉及使用重组DNA载体和同源原位重组技术生产嵌合抗体的方法。可用本发明的重组DNA构建物转染抗体生成细胞，从而在被转染细胞内发生预期的同源重组，致使转染的细胞能够产生嵌合抗体分子。

本申请是1987年10月27日提交的，编号为113，800的共同未决申请的部分继续申请，113，800列为本文参考文献。

本发明借助所描述的实施例证明小鼠免疫球蛋白重链的恒定区被人IgG1恒定区所置换，而且嵌合的重链是由小鼠细胞系产生的。

自从建立了生产单克隆抗体的细胞融合技术（Kohler和Milstein，1975，Nature（London）256∶495）以来，众多的研究人员已生产出了大量的单克隆抗体，且其中有许多是限定于迄今未知的抗原。不幸的是，迄今所生产的大多数单克隆抗体都是在小鼠系统中产生的，因此在作为人类治疗剂使用时便受到很多限制，而必须以某种方法进行修饰，以使小鼠单克隆抗体不能作为外来抗原决定基被“识别”，和被人的免疫系统所“中和”。为此，有许多研究人员都在试图开发不易作为外来抗原决定基被“识别”并且可能克服与在人体内使用单克隆抗体有关之问题的人类单克隆抗体。很显然，由Kohler和Milstein建立的、包括处死免疫的小鼠并使用其脾脏作继后与持续传代之抗体生成 细胞系进行融合的淋巴细胞来源的杂交瘤技术，在人体是不可能实践的。因此，许多研究人员已将研究重点转向分子生物学领域的某些最新进展，即将DNA分子引入哺乳动物细胞内以获得免疫球蛋白基因的表达（Oi等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    80∶825;Potter等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    81∶7161），并且已经使用这些技术生产出了嵌合抗体（Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    81∶6581;Sahagan等，1986，J.Immunol.137∶1066;Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84∶214）。

嵌合抗体是包含人和非人部分的免疫球蛋白分子。更具体地说，即嵌合抗体的抗原结合区（或可变区）是得自于非人类来源（如小鼠），而嵌合抗体的恒定区（其为免疫球蛋白提供生物学效应物功能）是由人类来源得到的。嵌合抗体应具有非人抗体分子的抗原结合特异性以及由人抗体分子提供的效应物功能。

概括说来，用以生产这些嵌合抗体的方法包括下述步骤（某些步骤的次序是可以互换的）：

（a）鉴定并克隆编码抗体分子之抗原结合部分的正确的基因片段;该基因片段（即所谓重链的可变的、多样的和连接的区域（VDJ）或轻链的可变的，连接的区域（VJ），或可简单地称为V或可变区）可以是CDNA或基因组形式的;

（b）克隆编码恒定区或其所需部分的基因片段;

（c）连接可变区与恒定区，从而以可转录和可转译的形式编码完整的嵌合抗体;

（d）将该构建物连接到含有可选择标志和基因调控区如启动子、促进子（enhancers）及Poly（A）附加信号的载体中;

（e）在细菌中扩增该构建物;

（f）将DNA引入真核细胞内（转染），最常用的是哺乳动物淋巴细胞;

（g）选择出表达可选择标志物的细胞;

（h）筛选可表达所需嵌合抗体的细胞;以及

（i）检测抗体的适当结合特异性及效应物功能。

已使用这些生产嵌合蛋白的程序处理了几种有不同抗原结合特异性的抗体（如抗TNP：Boulianne等，1984，Nature    Vol.312，P643;抗肿瘤抗原：Sahagan等，1986，J.Immunol.Vol.137∶1066）。另外，也已通过将新的顺序与编码其抗原结合区的顺序相连接而获得了几种不同的效应物功能。其中包括酶（Neuberger等，1984，Nature    312∶604）、来自另一个种的免疫球蛋白恒定区以及另一免疫球蛋白链的恒定区（Sharon等，1984，Nature    309∶364;Tan等，1985，J.Immunol.Vol.135∶3365-3567）。

分子生物学领域里的另一项进展是发现培养的哺乳动物细胞中，可使外源质粒DNA在含有与质粒顺序同源之顺序的染色体区定位处整合到染色体DNA中。这一过程称为同源重组（Folger等，1982，Mol.Cell.Biol.2，1372-1387;Folger等，1984，Symp.Quant.Biol.49，123-138;Kucherlapati等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    81，3153 -3157;Liu等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    82，1391-1395;Robert    de    Saint    Vincent等，1983，Proc.Natl.Acad，Sci.USA    80，2002-2006;Shaul等，1985，Proc.Natl.Acad，Sci.USA    82，3781-3784）。哺乳动物细胞还含有在随机的染色体位点整合质粒DNA的酶催机制，此即所谓非同源重组。据报导，同源重组的频率高达重组过程的1/100至1/1000，而大多数重组来自于非同源相互作用（Thomas等，1986，Cell    44∶419-428;Smithies等，1985，Nature    317∶230-234;Shaul等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    82∶3781-3784;Smith等，1984，Symp.Quant，Biol.49∶171-181;Subramani等，1983，Mol.Cell    Biol.3∶1040-1052）。细胞同源重组机制的存在使得在原位修饰内源性基因成为可能。已发现在某些条件下，可通过向细胞内引入含有同靶位点同源之DNA片段及带有预期修饰之新顺序的片段的质粒DNA，而修饰染色体顺序（Thomas等，1986，Cell    44∶419-428;Smithies等，1985，Nature    317∶230-234;Smith等，1984，Symp.Quant.Biol.49∶171-181）。哺乳动物细胞染色体DNA和外源性质粒DNA之间的同源重组可导致质粒的整合或某些染色体顺序被同源质粒顺序所置换。置换同源DNA顺序的过程称为基因转化。整合和转化过程均会致使预期的新顺序在内源性靶位 点上定位。

然而，有关同源重组过程的研究，大多是使用赋予优势选择如NEO和HPRT的基因，并且只在很少几种类型的细胞进行（Song等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    84∶6820-6824;Rubinitz和Subramani，1986，Mol.Cell    Biol.6∶1608-1614;Liskay，1983，Cell    35∶157-164）。尚未确定淋巴细胞或骨髓瘤细胞能否介导这些过程或是否能通过这一过程对免疫球蛋白基因进行修饰或重新构建。

本发明涉及修饰抗体分子及创造和生产嵌合抗体分子的方法，在这些分子中抗原结合区被连接到（a）免疫球蛋白恒定区或其某个部位上，从而提供如效应物功能、类别（如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE）、来源（如人或其他种动物）等预期特性;或连接到（b）可为嵌合抗原分子贡献某种某他功能的另一类型的分子上（如酶、毒素、生物活性肽、生长因子、抑制剂、或有利于连接药物、毒素或其他分子的衔接肽等）。

本发明使用新的重组DNA载体，通过同源重组对目的基因进行工程修饰，该修饰作用可在（a）产生具有预期抗原特异性之抗体的细胞系中进行，从而使抗体分子的抗原结合位点保持不变，但抗体分子的恒定区或其部分被置换或改变，或（b）在产生证明有预期效应物功能之所需类别抗体的细胞系中进行，从而使抗体分子的恒定区保持不变，而使抗体分子的可变区或其部分被置换或改变。

根据本发明的实施方案，本发明使用了一个新的重组DNA载体，用以转染可产生具有预期抗原特异性之抗体的细胞系。此新的重组 DNA载体含有一个用以置换编码细胞系中全部或部分免疫球蛋白恒定区之基因的“置换基因”（即置换基因可编码人免疫球蛋白的全部或部分恒定区、特定类别的免疫球蛋白、或一种酶、毒素、生物活性肽、生长因子、抑制剂、或有利于与药物、毒素或其他分子结合的衔接肽等）、以及一个得以在抗体生成细胞内进行同源重组和针对性基因转化的“靶顺序”。在本发明的另一实施方案中，使用一新的DNA载体转染可产生具有预期效应物功能之抗体的细胞系，在这种情况下，该新的重组载体中所含有的置换基因可编码具有预期抗原特异性之抗体分子的全部或部分区域，并可利用重组载体中含有的靶顺序在抗体生成细胞内进行同源重组和有针对性的基因修饰。在另一实施方案中，当只有一部分可变或恒定区被置换时，所得到的嵌合抗体可能限定同样抗原和/或具有已被改变或改善了的同样效应物功能，从而嵌合抗体可显示出更好的抗原特异性、更大的亲和结合常数、提高了的效应物功能，或增加了由被转染之抗体生成细胞系分泌和产生的量等。不管实施何种方案，均可使用选择已整合之DNA（通过可选择标志）、筛选嵌合抗体以及细胞克隆的方法获得产生嵌合抗体之细胞的克隆。

因此，编码单克隆抗体之修饰作用的DNA片段可直接以B细胞或杂交瘤细胞系内被表达之免疫球蛋白基因的位点为置换目标。可以使用适于进行任何特定修饰作用的DNA构建物去改变任何单克隆细胞系或杂交瘤的蛋白质产物。这一方法免除了花费很多财力和时间去从表达有用抗原特异性的B细胞克隆中克隆重链和轻链可变区基因的工作。除了可避开克隆可变区基因的方法外，当基因处于其天然染色体定位时，嵌合抗体的表达水平还将比在随机位置时要高。

本文所使用的术语，不管是一次或多次使用，均具有下述的意义：

嵌合抗体：为一抗体分子，其中（a）恒定区或其部分被改变、置换或交换，从而使抗原结合位点（可变区）连接到一不同或改变了类型、效应物功能和/或种属来源之抗体恒定区上，或连到为嵌合抗体提供新性质的完全不同的分子（如酶、毒素、激素、生长因子、药物等）上;或者（b）用一具有不同的或改变了抗原特异性的可变区来改变、置换或交换可变区或其部分。

置换基因：为一编码某种产物的基因，其置换抗体分子的全部或部分恒定区或可变区以形成嵌合抗体分子。置换基因被构建成本发明的新的重组DNA靶载体，用以转染抗体生成细胞系。为了修饰全部或部分恒定区，本发明的置换基因可包括但不只限于具有特定效应物功能、类型和/或来源的免疫球蛋白恒定区（如人免疫球蛋白或任何其他种免疫球蛋白的IgG、IgA、IgM、IgD或IgE恒定区）或其修饰免疫球蛋白恒定区之活性或性质的恒定区的部分;以及编码其他可赋予嵌合抗体分子以某些新功能的分子（如酶、毒素、激素、生长因子、可连接的衔接子等）的基因。为了修饰全部或部分可变区，本发明的置换基因可包括但不只限于编码具有不同抗原亲和力或特异性之不同可变区的免疫球蛋白可变区，或可修饰免疫球蛋白可变区之活性或性质的可变区的一部分，从而使所得到的嵌合抗体对抗原有更大的亲和力或更高的特异性。

靶顺序：为抗体生成细胞之染色体中的一个顺序，它与抗体分子将被转化的区域相邻接的DNA顺序同源。靶顺序被构建到本发明的新的重组DNA载体中，然后用于转染抗体生成细胞系。

直接置换或插入全部或部分恒定区内的、用于重链重组的靶顺序可包括但不只限于全部或部分V、D、J及开关区（包括称为内含子的干扰顺序），以及与将被转染的抗体生成细胞系表达的特定重链恒 定区基因相关联或相邻接的侧翼顺序，而且还可包括定位于恒定区之内或其下游的区域（包括内含子）。直接置换或插入全部或部分恒定区内以进行轻链重组的靶顺序可包括但不只限于V和J区，它们的上游侧接顺序以及干扰顺序（内含子），可与将被转染之抗体生成细胞系表达的轻链恒定区基因相关联或邻接，并可包括位于恒定区（包括内含子）之内或其下游的区域。

经直接置换或插入全部或部分可变区内以进行重链重组的靶顺序可包括但不只限于全部或部分V、D和J区（包括内含子），以及与将被转染之抗体生成细胞系所表达的特定可变区基因相关联或相邻接的侧翼顺序。经直接置换或插入全部或部分可变区内用以进行轻链重组的靶顺序可包括但不只限于V和J区（包括内含子），以及与将被转染之抗体生成细胞所表达的轻链可变区基因相关联或相邻接的侧翼顺序。

靶载体：为一包括靶顺序和置换基因的重组核苷酸载体，其可用于通过基因工程由被靶载体转化的抗体生成细胞来生产嵌合抗体。用于转染细胞的靶载体包含与载体的靶顺序同源并可产生具有（1）预期抗原特异性、（2）预期恒定区，或（3）另一预期性质如高分泌水平、大规模培养适用性等性质之抗体的顺序。

本文所用缩写字的意义列示如下：

FITC：异硫氰酸荧光素

HRP：辣根过氧化物酶

hu：人类

huCr1：人γ免疫球蛋白1的愣ㄇ庀宰?

huIgG：人γ免疫球蛋白

m：小鼠

mAB：单克隆抗体

mIgG：小鼠γ免疫球蛋白

图1中图解显示了使用本发明的靶载体，通过同源重组进行基因置换的总的流程。图中标示出了可变区（V）、多样性区（D）、连接区（J）、开关区（S）和恒定区（C）。A中图解显示使用与围绕V、D、J、S和C区之任何部分同源的靶顺序置换重链基因的全部或部分恒定或可变区。B中图解显示使用与V、J和C区附近任何部分同源的靶顺序置换轻链基因的全部或部分恒定或可变区。C中则图解显示使用与将被置换的基因相侧接的顺序置换轻链或重链基因中的全部或部分恒定或可变区。

图2中图解显示靶（目的）质粒pRSV-140-neo/Huc-γ    1/MuT    4/e的构建。该靶顺序包括得自小鼠免疫球蛋白重链（IgH）座位的2.2Kb    HindⅢ片段，其含有第四连接区（J4）、IgH促进子（IgH    enhancer）（e）以及5′至开关区的内含子顺序。定位于5′至置换基因的靶顺序包括一含有人γ1恒定区之人IgG1重链座位的7.0Kb    HindⅢ-BamHI片段。

图3为人IgG1重组载体的构建图。该载体是由一个含有已被修饰而除去XbaⅠ位点之小鼠重链促进子的2.2Kb    HindⅢ片段、一个含有人γ1（huCγ1）之恒定区外显子的3.0Kb    HindⅢ/PvuⅡ片段、得自编码neo的pSV2/neo的2.0Kb    BglⅡ/BamHI片段、一个携带人CMV促进子及启动子的667bp    BalⅠ/SstⅠ片段，以及一个由包括复制原点及氨苄青霉素抗性基因之pBR322得到的2.3Kb    PvuⅡ/HindⅢ片段所组成。将含有CMV的BalⅠ/ SstⅠ片段转移到pEMBL18的SstⅠ/HincⅢ位点中，作为-HindⅢ/SstⅠ片段除去之并克隆到Ric19R的相同位点之间，然后作为SmaⅠ/BglⅡ片段分离以加到构建物的PvuⅡ和BglⅡ位点之间。相似地，将携带人Cγ1外显子的HindⅢ/PvuⅡ片段克隆到Puc9的到HindⅢ和HincⅢ位点中，然后作为HindⅢ/BamHI片段转移之。

图4显示用于针对人Cγ1顺序的另一附加质粒。图4A和4B中所示的质粒与图3中所示者大致相同，所不同的是：图4A和4B中所示的两个质粒具有一包含来自pSV2neo（T.Molec.Appl.Genet.1∶327-341，1982）之SV40促进子和启动子的500bp    BglⅡ/PvuⅡ，以取代CMV启动子和促进子，而且质粒4B具有编码人Cγ1的7Kb    HindⅢ/BamHI片段，并恒定区外显子下游有更长的顺序。

本发明涉及通过体内同源重组，使用新的重组DNA载体致使所需顺序改变到基因组内一特殊定位上，以生产嵌合抗体的方法。使用本发明的方法，可用一适当“靶载体”转染抗体生成细胞系，对抗体分子的蛋白质顺序进行修饰。在本发明的一个实施方案中，用本发明的包含编码“置换基因”及“靶顺序”之重组DNA分子的靶载体转染可产生具有预期抗原特异性之抗体分子的细胞系。用编码所需分子的置换基因去取代由细胞系表达的抗体分子的全部或部分恒定区。例如，置换基因可编码具有特定效应物功能、类型和/或来源之全部或部分的免疫球蛋白恒定区，其包括但不只限于人或其他种动物的IgG、IgA、IgM、IgD和IgE恒定区;另外，置换基因可编码能赋予所得嵌合抗体以某种其他功能的另一类型的分子，如酶、毒素、生物活性肽、生长因子、抑制剂、可连接的肽衔接子等。靶载 体的靶顺序与见于染色体内的DNA顺序同源，后者则处于由被转染之细胞系产生的免疫球蛋白的恒定区的成熟基因编码顺序或恒定区成熟编码顺序的适当部分之内或与之相邻接。转染后，将在抗体生成细胞系内产生同源重组;某些重组过程将导致免疫球蛋白之全部或部分恒定区被置换基因所取代，并因此而导致由被转染的细胞表达嵌合抗体分子。

在本发明的另一实施方案中，用含有置换基因的靶载体来转染可产生具有预期恒定区之抗体分子的细胞系，所说的置换基因可编码具有预期之抗原特异性的全部或部分可变区，且所说的靶载体还含有指导宿主细胞染色体中全部或部分可变编码区之基因修饰的靶顺序。转染后，在抗体生成细胞系内将发生同源重组;其中某些重组过程将导致免疫球蛋白基因的全部或部分可变区被置换蛉〈佣靡栽诒蛔鞠赴斜泶锴逗峡固宸肿印?

在鉴定出表达嵌合抗体的转染体后，本发明的实践即包括培养转染体并使用已知的分离单克隆抗体的技术由细胞培养物上清中分离出嵌合抗体分子。此外，亦可在动物的腹水液中培养已转化的细胞并使用已知的分离单克隆抗体技术收获之。

下面将更详细地描述并用实施例来证明本发明的各个方面，实施例中涉及生产小鼠/人嵌合免疫球蛋白重链。为了讨论得更清楚，将依下列次序描述：（a）靶载体;（b）转染以及（c）产生嵌合抗体分子之转染体的筛选和选择。

靶载体：

如前面已解释过的，本发明的靶载体为包括但不只限于质粒、噬菌体、噬菌体质粒（Phagemids）、装配型质粒和病毒等重组DNA载体，其包含有置换基因和靶顺序。如下面将详细述及的， 置换基因可包括任何编码预期结构产物的基因，而靶顺序则可依据被转化之抗体分子类型及被转染之动物细胞类型而有所不同。靶顺序和置换基因定位于靶载体中，使适当的抗体生成细胞系被靶载体转染而产生有针对性的同源重组，致使因置换基因位点特异性地插入抗体基因中而完成基因转化。

本发明的靶载体可包含一编码可选择标志（如药物抗性、酶）的附加基因，以有助于筛选或选择转染体或可被这样的标志共转染。另外还可包括有利于提高重组过程发生的其他顺序。这样的基因可包括但不只限于原核或真核生物重组酶如RECA、拓扑异构酶、REC1或其他可提高重组频率的DNA顺序如CHI。各种蛋白质，如由前述基因编码的蛋白质也可被转染，以提高重组频率。下面将描述可用于本发明之方法的各种靶顺序、置换基因及可选择标志。

靶顺序：靶顺序的组分可依据于是否靶质粒被用于取代轻链或重链的全部或部分可变或恒定区基因而定，另外还取决于抗体生成宿主细胞的动物种属。更具体地说，靶顺序应与相邻或侧接于将被置换或改变之恒定或可变区的编码区或其部分的顺序同源。

例如在染色体内，在成熟重链基因的5′未端可包括VDJ区，即可变区（V）、多样区（D）和连接区（J），之后是不被表达的余留J区（J区的数目随动物种而异）以及内含子顺序。基因的中心和3′部分由恒定区外显子（与内含子及非翻译顺序侧接的和分散的）所组成，其可为任何类型（如mu、δ、γ、ε、α）的并各与其自身相邻的开关区相关联。因此，用于抗体生成宿主细胞之重链基因中目的同源重组的靶顺序可包括一与抗体基因之任何部分（取决于预期的改变）同源的区域。例如，涉及重链恒定区置换的靶顺序可包括与跨越任何区域并包含或不包含从V、D或J区开始之开关区的顺序同 源的顺序，并应适当地定位于靶载体的结构中;即定位于5′端至置换基因的编码区。实际使用的靶顺序可随着目的宿主细胞的动物种属及被目的宿主细胞表达的抗体类别而异。

与重链基因在染色体内的排布相反，成熟的轻链基因则包含位于其5′端的VJ区、内含子顺序及单一的恒定区外显子。因此，用于抗体生成宿主细胞内轻链基因中目的同源重组的靶顺序可包括与基因的任何部分同源的区域（依据预期的改变而有所不同）。例如，用于置换轻链恒定区的靶顺序可与通过内含子顺序跨越全部或部分适当V和J导向轻链恒定区之编码区域的顺序同源。这样的靶顺序应适当地定位于靶质粒中;如5′端至置换基因的编码顺序处。同样地，靶顺序的实用核苷酸顺序可随着目的宿主抗体生成细胞的动物种属而异。

除了上述的顺序外，靶顺序还可包括与恒定的重或轻链编码区之5′和/或3′末端相邻的区域同源的顺序，并因而应定位于靶载体的结构中，即分别定位于5′和/或3′端至置换基因的编码区。相似地，用于置换重或轻链可变区的靶顺序可包括与侧接于可变区之全部或部分适当区域同源的顺序。在任何情况下，靶顺序还可包括侧接于外显子内之区域的编码区顺序，在这里（外显子内）只有可变或恒定区的一部分将被置换，从而使被表达的蛋白质以一种预期的方式得以改变。

置换基因：如前面已解释过的，用于转化抗体恒定区的置换基因可包括人或动物不同类型免疫球蛋白之全部或部分恒定区的编码顺序。因此，在表达重链时，置换基因可包括编码人IgG、IgD、IgM、IgE和IgA或其任何亚类之恒定区的全部或部分基因。另外，置换基因可编码能为被表达的嵌合分子提供某些不同的效应物功能的产物，例如酶、毒素、生长因子、生物活性肽、衔接子等。置 换基因亦可由任何结合方式的上述顺序组成，如连接到新的蛋白质顺序上的全部或部分抗体恒定区。

对置换基因的选择，部分取决于被表达的嵌合抗体分子的使用目的。例如，如果准备用于人体治疗目的，则置换基因可编码人免疫球蛋白恒定区，最好是一类有意欲用于人体治疗目的之预期效应物功能的蛋白产物。如果想要改善或改变抗体已有的效应物功能，则可用能赋予所得嵌合抗体分子以这种改善或改变了的效应物功能的顺序置换一部分恒定区。如果希望在体内有针对性地释放一种酶、毒素、药物、激素或生长因子，则应使用编码该酶、毒素、药物，激素或生长因子或进行这种连接所需之衔连子的置换基因。如果是将嵌合抗体用于诊断检测，例如利用标记的抗体时，即可使用编码一种酶或其底物的置换基因。这种酶/底物系统包括但不只限于当反应时可产生呈色产物的物质。例如，β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。所得到的嵌合抗体可在有或没有进一步修饰的、意欲与酶、药物、毒素、激素、生长因子等进行化学连接的方法中用作标记抗体。

用以转化抗体可变区的置换基因可包括限定预期抗原之抗体分子可变区的全部或部分编码顺序。它们可编码限定相关或完全无关抗原的抗原结合区。如果希望改善或改变抗原结合或特异性，可用赋予所得嵌合抗体分子以这种改善或改变了的结合或特异性的顺序置换一部分可变区。

选择标志和其他构件：除了靶顺序和置换基因外，本发明的靶载体可编码一有助于筛选或选择已被成功地转化之抗体生成细胞的可选择标志。这样的标志包括药物抗性基因如gpt、neo、his等及其类似物。

靶载体中还可包括提高重组机会（数目）的附加构件，例如构建 物中可包括温度敏感性复制原点（ori）（如多瘤tsA    ori系统），以使转染体能在导致载体复制的允许温度下生长，从而增加靶顺序和置换基因的拷贝数，并可继而增加重组的数目。亦可利用其他ori系统来增加拷贝数（如EBV    ori递增因子、BPV    ori递增因子或SV40    ori及T抗原）。

用靶载体转染抗体生成细胞系

根据本发明的方法，用适宜的靶载体转染可产生预期抗体（即具有预期抗原特异性或预期恒定区的抗体）的细胞系，以产生能够进行位点针对性同源重组的转染体。可用轻链和重链靶载体转染适当的抗体生成细胞系;然而在许多情况下，用重链靶载体进行转染可能不足以获得嵌合抗体分子的表达。

可用本技术领域内已知的方法完成转染，包括但不只限于磷酸钙沉淀法、电击法、微量注射法、脂质体融合法、RBC影细胞融合法及原生质体融合法等。在转染之前可用限制性酶在靶顺序内将靶载体切成线形，以增加已转染细胞内同源重组的可能性。

重组体的筛选和选择

进行成功地转化、同源重组及针对靶基因的修饰的最终试验即是由抗体生成细胞系生产嵌合抗体。可根据置换基因产物的性质，用多种方法来检测产生嵌合抗体的转染体。

如果靶载体含有一可选择标志，对已转染之细胞最初的筛选应是选择表达该标志的细胞。例如，当使用药物抗性基因时，可在初步筛选过程中鉴定出能生长在含有其致死性药物之选择培养基中的那些转染体。第二次筛选就需要鉴定那些能表达嵌合抗体的转染体。

第二次筛选的操作方法取决于置换基因的性质。例如，可使用对特殊类型和/或种属来源的免疫球蛋白特异的抗体，以免疫检测法检 测编码不同类型或来源之抗体恒定区的置换基因的表达;另外，可用生物分析法检验由置换基因赋予的特定效应物功能。可通过分析特定的生物学活性来检测编码酶、毒素、生长因子或其他肽等生物活性分子之置换基因的表达;例如，可使用适当的酶底物、或毒素、生长因子、激素等的靶材料来检测已转染细胞的产物;另外亦可使用对置换基因产物特异的抗体对这些置换基因产物进行免疫学检验。

还应检测表达置换基因的转染体的适当抗原识别能力。为此可使用原始和嵌合抗体以适当的免疫分析法（包括竞争性免疫分析）来完成这一检测。这些筛选试验不需要相继进行，而事实上可使用“夹心法”同时进行，其中使用限定置换基因产物（即恒定区或可变区）的俘获抗体来固定嵌合抗体并检测（即分别使用标记的抗原或标记的抗体）是否存在未改变的部分（即分别检测未改变的可变区或未改变的恒定区）。例如，可使用抗原俘获嵌合抗体并可使用限定置换基因产物的标记抗体来检测恒定区置换基因产物，或通过分析被俘获的嵌合抗体来检测置换基因产物（如酶、毒素、激素、生长因子等）的生物学活性。另外，可将嵌合抗体固定于恒定区（如使用对该区域特异的抗体或葡萄球菌A蛋白等）并可使用标记的抗原或抗个体基因型抗体检测可变区基因产物。

实施例Ⅰ.用人γ1免疫球蛋白的恒定区置换小鼠免疫球蛋白重链的恒定区

下述实施例涉及含有小鼠靶顺序（编码第4连接区和重链基因的促进子）之靶质粒的构造，其中所说的靶顺序与编码人γ1免疫球蛋白（hulgG1）恒定区的置换基因相连。该靶质粒与含有编码小鼠重链之整个成熟基因（整个可变区和恒定区）的噬菌体一起使用，以共转染为重链突变体（原来只表达轻链）的小鼠骨髓瘤细胞。筛选已转染的细胞并 定表达人IgG1重链的克隆。这些实验证明了成功的同源重组过程、在宿主细胞染色体内的整合、以及人γ1基因在小鼠细胞系统中的表达。

1.材料和方法：除特别指出者外，下述实施例中均使用下列材料和方法。

（1）转染：用2mMMgCl2和2mMCaCl2于4℃洗涤并重悬在PBS（磷酸盐缓冲盐水）中的约107个细胞，并将细胞转移到一个用铝箔衬里的无菌塑料试管（Bio Rad，CA）中。加入线形化的DNA并混合之，达到终浓度10-100μg/ml，然后用适当电源提供电荷（如用Gene Pulsar，Bio Rad，CA）。轻轻敲打试管以确保充分混合。室温处理2分钟后，将细胞移入37℃含10%FBS的9ml RPMI培养基（GIBCO）中。保温48小时后，离心收集存活的细胞，计数并以每小井103个细胞的密度在96井平板中铺敷，或者以每小井104细胞在含有10%FBS、青霉素（60mg/ml）/链霉素（100mg/ml）、丙酮酸钠（1mM）、L-谷氨酰胺（292mg/ml）和0.1-2μg/ml霉酚酸或1-2mg/mlG418的RPMI培养基内加于24小井平板中。每2至3天补充或 更换一次同样培养基。2-3周后计数各小井内细胞生长数。然后用ELISA法检测培养物上清中是否存在人γ1，并克隆和再次筛选阳性小井内的细胞。

（2）筛选成功地形成重组体的转染体

使用以100μl羊抗人IgG（Antibodies Inc，Davis，CA）（在包被缓冲液（0.1M NaHCO3，pH9.6）中以1∶1000稀释）或羊抗小鼠IgA（Cappel）（在上述包被缓冲液中以1∶5000稀释）于4℃过夜包被的immulon2平板（Dynatec Labs，Chantilly，VA）进行ELISA检测。然后用样品稀释液（Genetic Systems）充满平板于室温下阻断1小时，然后取出，封口并于4℃储存不超过3周。将平板用洗涤缓冲液（0.15M NaCl、0.05%V/V Tween20）洗三次，然后加入100μl标准样品（在适当培养基中稀释的）或培养物上清液并于37℃保温1小时，准备进行检测分析。将平板用洗涤缓冲液洗3次后即用100μl辣根过氧化物酶（HRP）结合的羊抗人IgG（American Qualex）（1∶6000稀释）、HRP-羊抗小鼠IgA（Cappel）（1∶5000稀释）或HRP-羊抗小鼠λ（Southern Biotech.Ass.Inc.，Birmingham，AL）（1∶3000稀释）于37℃保温1小时以检测结合的抗体。然后用洗涤缓冲液将平板洗3次并在室温下与在缓冲之底物中以1∶100稀释的TMB铬精（Genetic Systems）保温15分钟，用100μl/小井的3MH2SO4终止反应，直接在微滴定平板读数器（Genetic Systems）上于450/630nm处得到读数。同样可使用HRP-羊抗小鼠卡 巴试剂（Southern Biotech.Ass.Inc）筛选卡巴生成细胞系。经有限稀释或在软琼脂糖胶中分离表达克隆以再克隆人IgG和/或小鼠IgA阳性的细胞系。为了在软琼脂糖中克隆，将得自阳性小井的大约1000个细胞重新悬浮于0.4%琼脂糖中并在小鼠腹腔渗出液饲养细胞的琼脂层上铺层。使含有对人IgG1特异之抗血清的第三层附盖1-2天，然后根据有无免疫沉淀来 定阳性克隆。

（3）Southern和Vwestern吸印分析

基本上按照最初由Blin和Stafford（Blin，N.和Stafford，D.W.，1976，Nucleic    Acids    Res.3∶2303）描述并且继后由Maniatis、Fritsch和Sambrook（Maniatis等，1982，Molecular    Cloning-A    Laboratory    Manual，Cold    Spring    Harbor，NY，P.280）述及的方法由细胞中分离高分子量DNA，所不同的是首先用标准磷酸盐缓冲盐水（相对于使用Tris）洗细胞，并在用蛋白酶K处理（55℃）的同时进行RNA酶处理。

按照原来由Southern（Southern，1975，J.Mol.Biol.98∶503）描述及最近由Maniatis、Fritsch和Sambrook（Maniatis等，1982，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，P.383-389）详细讨论的方法进行Southern吸印和杂交分析。用于杂交的探针是含有人IgG1基因之第一恒定区的1.0Kb HindⅢ-PstⅠ片段，或编码小鼠JH2和JH3基因片段的 0.7kb    HindⅢ-HindⅢ片段。按生产厂商推荐的方法使用切口转译试剂盒（Bethesda    Research    Laboratories）标记探针。限制性内切酶购自Boehringer    Mannheim    Biochemicals公司。

按照Towbin等人（Towbin等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76∶4350）所述的方法进行Western印迹分析，所用显色剂与用于ELISA法检测者相同。

2.编码人免疫球蛋白恒定区之靶质粒的构建

构建包含细菌质粒载体pRSV-140-neo的靶质粒，向其中克隆一作为置换基因的含人r1恒定区基因的8.0kb    HindⅢ-BamHI片段（图2）。将靶基因，一个得自小鼠免疫球蛋白重链（IgH）座位的2.2kb    HindⅢ片段（其含有第四连接区（J4）、IgH促进子（e）和5′至开关区的内含子顺序），插入至定位于5′至人γ1基因的HindⅢ位点中（图2）。然后在小鼠靶顺序内的唯一XhaⅠ位点将该构建物切成线形并用以前描述过的电击方法转染到下述小鼠骨髓瘤细胞系中。

3.转染和同源重组

下述的实验和结果证明，在靶质粒和用于共转染小鼠骨髓瘤宿主细胞的噬菌体内含有的小鼠重链基因之间成功地进行了同源重组。同源重组和向小鼠骨髓瘤宿主细胞染色体内的整合，导致了人免疫球蛋白重链（IgG1）的表达。

（1）共转染小鼠骨髓瘤细胞

在靶顺序的区域中将含有（a）编码第四连接区（J4）、IgH 促进子和5′至开关区内含子顺序之小鼠靶顺序，以及（b）编码人IgG1恒定区之置换基因的靶质粒切成线形，并与等摩尔比例的含功能性J558小鼠重链基因的噬菌体DNA克隆一起共转染到重链突变的小鼠骨髓瘤细胞系（即J558L，其只表达轻链）中。然后根据人IgG蛋白的存在筛选已转染的抗G418（由靶质粒构建物编码的可选择标志）细胞系。因为上述已构建的靶质粒中所含有的人γ1恒定区缺乏免疫球蛋白启动子顺序，所以检测到由转染的小鼠细胞系表达的人IgG蛋白即应是转染的DNA分子和宿主细胞染色体内整合作用之间同源重组的结果。

（2）鉴定分泌嵌合免疫球蛋白的细胞

再克隆分泌人IgG和/或小鼠IgA蛋白的转染体。通过DNA印迹转移分析进一步肯定同源重组过程的存在，其中鉴定了一个新的重排限制性片段;该片段具有预期大小（10.5kb BamHI片段）并含有人γ1和小鼠JH2-JH3顺序。另外可通过上清液蛋白质的Western印迹分析获得进一步的证据，其证明了转染瘤细胞（transfectoma）培养物上清液中存在有携带人IgG血清学决定基的约50千道尔顿（50kd）的蛋白链。还可根据较慢的电泳迁移率证明抗人IgG试剂并不与小鼠IgA反应。

ELISA试验结果还显示许多转染瘤细胞上清液中存在小鼠IgA。这是由于功能性J558重链基因整合未被破坏的结果（即没有经受同源重组）。基于实验，比较表达和产生人IgG及小鼠IgA的水平，估计同源对非同源重组的频率之比为30-80%。

根据上述结果可以肯定地证明：（a）靶质粒是如预想地那样工作的;（b）骨髓瘤细胞介导同源重组的能力是很强的。

可使用与可变区基因片段之上游和/或下游区同源的顺序，结合可 变区基因片段或其部分以改变抗原亲和力和/或特异性。再者，可使用本文所述的J558系统作为一筛选程序来鉴定重组促进蛋白。

实施例Ⅱ：生产对L20人肿瘤相关抗原有特异性的嵌合免疫球蛋白重链

下述实验证明小鼠杂交瘤细胞可有效地介导同源重组，而且这种能力可以解释为指导内源性免疫球蛋白重链座位的主要重组。构建一含有人IgG1恒定区外显子而且外显子还侧接有小鼠重链促进子和抗新霉素基因的质粒。通过对杂交瘤细胞系L20（其可产生对人肿瘤相关抗原特异的单克隆抗体，见1986年2月26日提交的专利申请834，172号，其列为本文参考文献）的内源性重链座位的位点特异性修变，而将该构建物用于指导抗原特异性嵌合重链Ig的产生。在已整合了该质粒的杂交瘤细胞中，可见这种针对性修变的发生频率为0.5%（200个中有1个）。

1.构建靶载体并转染杂交瘤L20

构建一含有人IgG1之恒定区外显子（Cg1）且该外显子侧接有小鼠重链促进子（MHE）及新霉素抗性基因（NEO）的质粒载体（图3）。在位于与小鼠IgH座位共有之序列的2.2kb区内的唯一XbaⅠ位点处将质粒切成线形，按下述方法将该质粒DNA转移到杂交瘤细胞L20中（该细胞系产生对主要在人瘤细胞上表达之抗原特异的小鼠IgG1抗体）：在唯一的XhaⅠ位点处将图3所示的载体切成线形，并以电击法用50μg转染8×106个L20杂交瘤细胞（如材料和方法中所述）。将活细胞在含有2.5mg/ml G418之IMDM 10% FBS培养基中，以每小井1×104个（或用1×103个作频率计算）细胞的密度在98小井平板中铺板。每2-3天换一次培养基，2周后用标准的ELISA技术检测各小井内 有无人IgG1产生。用以1∶10，000稀释的羊抗人IgG（Cat.＃    4132    Antibodies    Inc.，Davis    CA）作为俘获试剂，并用以1∶6000稀释的羊抗人IgG/HRP（Cat.＃HAP009    American    Qualex，La    Mirada，CA）进行检测。还经继后的ELISA试验验证了所有阳性上清液。

因为人IgG1外显子与可变区基因片段无关，所以只能依靠质粒与功能性启动子、起始密码子和裂接顺序的重组来生产人IgG1重链蛋白。为此可通过在含有G418之培养基中的细胞存活选择（即选择所有满意地整合了质粒的细胞），而以ELISA法检测人IgG1的产生（表1）

表1

导致人IgG1产生之整合的频率

每小井整合    检测的小井数    总发生数    小井W/HU    IgG1    频率

2.2    480    1056    8    0.75%

通过以低密度铺板来检测转染的频率，从而观察到导致人IgG1产生之整合作用的频率为132个中有1个即0.75%;最近用同样细胞及导致产生人IgG之质粒所作实验表明整合频率为512个中有2个，即0.39%，这些结果均提示平均频率可能接近0.5%。引人注意的是，即使在克隆以后，仍发现大多数细胞系可产生小鼠和人IgG1，虽然偶然也分离到只产生一种或另一种蛋白的克隆（表Ⅱ）。将得自产生人IgG1之亲代小井的细胞以有限稀释度铺板，并分析得自各亲代的12个克隆是否产生人IgG1（huIgG1）（如表1所示）及小鼠IgG。 使用羊抗小鼠IgG（Cat＃1070    Southern    Biotech，Birmingham    AL）和羊抗小鼠卡巴/HRP（Cat＃OB1141-85    FisherBiotech，Orangeburg    NY）分别作俘获和检测试剂来检测小鼠IgG（mIgG）。结果示于表Ⅱ中。所给数据为产生人抗体、小鼠抗体或两者之克隆的数目。

表2

来自产生人IgG1之L20转染体的克隆中小鼠与人IgG1的产生

亲代    huIgG1    mIgG    huIgG1/mIgG

7C5    0    0    12

7E6    1    0    11

8D6    0    0    12

8F8    2    2    8

8H12    1    0    11

10G3    0    2    10

9F11    0    1    11

9F12    1    0    11

2.表达的嵌合L20重链的特征

（1）Western印迹分析

按下述方法对得自选择之克隆的上清液作Western印迹分析，显示人重链在血清学上是与其他不同的，并证明其有预期的大小范围：洗涤生长水平接近于平台部分的培养物并重新悬浮于无血清培养基中。 24小时后收获上清，对0.1M NH4OAc透析、冻干并重新悬浮于5mM Tris（pH6.8）中。这些样品和亲代细胞系L20的等分样品加上纯化的抗体2H9（一种人IgG1蛋白），以及纯化的小鼠L20IgG1，在β-巯基乙醇存在下经加热煮沸而变性，然后通过一浓度范围为10-20%的丙烯酰胺梯度凝胶进行电泳。将凝胶电泳转移到硝化纤维素滤膜上。用含2%无脂肪干乳粉的PBS封闭所得滤膜，用羊抗人IgG/HRP（＃10501 CALTAG，San Francisco CA）着染并用溶于Tris缓冲盐水的30mg 4-氯-1-萘酚（Sigma，St.Louis MO）显色。

（2）流动细胞计数分析

通过下述的流动细胞计数法（表Ⅲ）证明人和小鼠IgG1是抗原特异的：以ELISA法检测用于Western吸印分析的样品，以确定小鼠和人IgG1的浓度。稀释这些样品以调整到适于进行流动细胞计数分析的浓度（μg/ml）。在所指出的L20抗体（或培养基）存在下将得自人肿瘤细胞系2981或3347（Hellstrom等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83∶7059-7063）的5×105个细胞于4℃保温30分钟，洗两次并用1∶50稀释（在培养基中）的羊抗人IgG/FITC（异硫氰酸荧光素）（CALTAG，San Francisco CA）或羊抗小鼠IgG/FITC（TAGO，Burlingame CA-重链和轻链特异的）于4℃染色30分钟。然后将这些制备物洗两次、再悬浮、并用流动细胞计数法分析相对荧光强度。结果示于表Ⅲ中。数值是作为各制备物的线性荧光当量（LFE）给出的。

表Ⅲ

小鼠和人重链嵌合L20抗体的抗原特异性

克隆    抗体浓度    LFE

2981靶细胞

huIgG    mIgG    α-hu    α-m

7E6-10    1.0    0    35    6

8H12-8    1.0    0    38    7

8F8-8    1.0    0.5    39    11

9H12-1    1.0    0.1    42    7

8F8-10    0    0.4    2    10

10G3-5    0    1.0    2    31

mL20    0    1.0    2    18

培养基    0    0    2    2

3347靶细胞

α-hu    α-m

7E6-10    0.4    0    7    3

mL20    0    0.4    2    3

培养基    0    0    2    2

可见，亲本L20细胞系很可能保留生产性重链等位基因的两个拷贝，而其中只有一个在已知细胞内经历了特异性重组。在10ml处于生长平台期的培养物上清液中，发现只表达嵌合抗体之克隆的生产水平为5-10μg/ml。

（3）Southern印迹分析

使用对人Cγ1特异的探针进行Southern印迹分析，用三 种不同的酶证明在所有产生人IgG1的细胞系间均有特异片段的整合。L20亲代细胞系中-BamHI位点在限制性酶切图中显示位于靶顺序的1.4kb上游，因此，预期在靶位点插入重组载体可产生一能够与huCγ探针杂交的5.5kb    BamHI片段。每个产生人IgG1的克隆中均可观察到这样一个片段。

（4）ADCC分析

以ADCC检测法比较小鼠L20    IgG1抗体与携带嵌合重链之蛋白质的活性（Hellstrom等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶1499-1502）。由表Ⅳ所示的结果可以看出，将重链恒定区改变为人IgG1的重链恒定区即为这一特异性提供了一种新的效应物功能。

表Ⅳ

小鼠MAb    L20和嵌合重链L20介导的2981靶细胞的ADCC

免疫球蛋白    浓度（μg/ml）    2981靶细胞的ADCC

L208F8-8    4    58%

L20    7E6-10    8    53%

MAb    L20    10    31%

无＊0 31%

＊只有效应细胞（淋巴细胞）

3.使用不同靶载体产生的嵌合L20重链

在进一步的实施例中，我们使用了图4A中所示的另一质粒将人Cγ1外显子引入小鼠杂交瘤细胞L20中，导致了人IgG1嵌合重 链蛋白质的产生。将质粒4A转染到杂交瘤细胞系L20中，在对大约700个整合过程的ELISA试验中可见4个小井产生huIgG。

嵌合的G28.1重链的构建

在另一实施例中，我们使用图3中所示的质粒转化小鼠杂交瘤细胞系G28.1（Ledbetter等，Leukocyte    typing    Ⅲ，A.J.Mc    Michael    ed.，Oxford    Univ.Press    P.339-340，1987）以用同样方法生产抗原特异性人IgG1重链。一次实验导致864个整合过程中产生出4个huIgG1产生者细胞。按下述程序用ELISA法鉴定、证实这些细胞系、然后试验它们的结合扁桃体B细胞的能力：将人扁桃体B细胞与得自所指出的细胞系（或培养基）的上清液一起保温，洗涤并按前述方法用羊抗人IgG（αhu）或羊抗小鼠IgG（αm）反向染色，然后用流动细胞计数法进行分析。结果示于表Ⅴ中。用ELISA法定量上清液中的小鼠和人IgG并以ng/ml为单位给出检测数值。荧光数据以线性荧光当量（Iinear    fluorescence    equivalents）表示。

表Ⅴ

重链嵌合G28.1上清液的抗原特异性

细胞系    huIgG    mIgG    LFE

α-hu

11F10    0    87    9

1F11    97    89    93

4F5    86    91    38

3D2    90    86    77

3D11    56    85    16

培养基    0    0    9

α-m

G28.1    0    83    53

培养基    0    0    3

这些结果再次表明携带人IgG1嵌合重链的抗体分子保留了抗原特异性。

嵌合的L6重链的构建

将图4B中所示的重组的靶质粒转染到形成单一细胞系的小鼠杂交瘤细胞系L6中，后者则形成能稳定地产生嵌合重链的克隆（在没有小鼠重链的情况下）。实验结果显示该抗体可结合人肿瘤细胞并通过ADCC（用人效应细胞）介导瘤细胞破坏，其效力比小鼠L6更强（表Ⅵ），而与用常规重组技术产生的重链和轻链嵌合L6的作用差不多（见1984年12月21日提交的684，759号专利申请和1985年10月18日提交的776，321号专利申请，两者均列为本文参考文献）。

表Ⅵ

由小鼠MAb    L6和嵌合重链L6介导的2981靶细胞的ADCC

免疫球蛋白    浓度（μg/ml）    3347靶细胞的ADCC

L6    7B7.16    0.01    83%

L6    7B7.7    0.01    82.5%

MAb    L6    0.01    58%

无＊0.01 53%

＊只加效应细胞（淋巴细胞）

Southern印迹进一步肯定了10kb    Ava片段及8kb    BglⅡ片段的存在，此两者均与huCg1探针杂交。基于以前对已克隆的基因组L6重链可变区基因片段的限制性酶切图分析，表明这些片段与载体质粒在靶位点处的插入相符。

本发明并不只限于实施例中所公开的范围，这些实施例旨在举例阐明本发明的不同方面，而且功能上等同的各种方法亦属于本发明之范围内的。除了本文所给出和描述的内容外，对于本领域内的技术人员来说，根据前面描述所作的种种改动应是显而易见的。这些改动将落入待批权利要求的范围之内。