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一种环境中雌激素的检测方法

阅读：1033发布：2020-08-10

专利汇可以提供一种环境中雌激素的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种环境中雌激素的检测方法，是用石斑鱼脑芳香化酶基因启动子连接荧光素酶报告基因，构建报告质粒，将报告质粒、金鱼雌激素受体表达质粒以及内参质粒共转染 U251-MG细胞，将待测样品刺激转染后的U251-MG细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中雌激素。本发明的检测方法重复性好、灵敏度高，检测结果可靠，且操作简单方便，可广泛应用于环境中的雌激素检测。，下面是一种环境中雌激素的检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种环境中雌激素的检测方法，是用石斑鱼脑芳香化酶基因启动子连接荧光素酶报告基因载体，构建报告质粒，将报告质粒、金鱼雌激素受体表达质粒以及内参质粒共转染U251-MG细胞，用待测样品刺激转染后的U251-MG细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中雌激素，其中，所述石斑鱼脑芳香化酶基因启动子序列如SEQ ID NO:1所示，所述荧光素酶报告基因载体为pGL3-Basic，所述内参质粒为pRL-TK，所述雌激素为雌二醇。
2.根据权利要求1所述的检测环境中雌激素的方法，其特征在于所述共转染U251-MG细胞所用试剂为Lipofectamine 2000，且转染后在无酚红高糖 DMEM培养基中培养4-6小时后，更换新的培养基再培养22-26小时。
3.根据权利要求1所述的检测环境中雌激素的方法，其特征在于所述用待测样品刺激转染后的U251-MG细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中雌激素，是在样品刺激后
22-26小时再检测荧光素酶活性。

说明书全文

一种环境中雌激素的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及环境生物技术领域，具体涉及一种环境中雌激素的检测方法。

背景技术

[0002] 环境激素是环境中存在的能够像激素一样影响人体内分泌功能的化学物质的总称。环境激素，特别是环境性类固醇激素，由于在自然界食物链中可富集，难以降解和失活，能严重破坏生物体正常的激素生理活动。已知的环境性类固醇激素主要有：环境雌激素和环境雄激素。

[0003] 环境性类固醇激素是内分泌干扰物中的一大类，其中环境雌激素可与雌激素受体（ER）结合，从而模拟雌激素活性，发挥雌激素作用。环境性类固醇激素对人类生殖健康的影响已引起人们广泛的关注，因此建立一套快速、有效、准确的筛检测试环境性类固醇激素的方法已成为当务之急。

[0004] 目前有关环境雌激素的监测研究已有报道。测评环境雌激素的方法有：动物子宫促生长试验、细胞增殖试验、竞争性配体结合试验、雌激素调控基因的表达产物、基因重组测评系统等（如何世华，梁增辉，晁福寰，环境雌激素测评方法研究进展，中国公共卫生2002年第18卷第10期）,其中较好的方法是利用双杂交酵母建立的基因重组测评方法（专利编号 200710308509.2）。以上这些方法都比较繁琐，且难以可靠地对环境雌激素进行检测。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简便、快速、可靠的雌激素检测方法。

[0006] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：

[0007] 本发明的技术方案是利用石斑鱼脑芳香化酶基因启动子受雌激素上调的特点，建立一种通过检测雌激素对该启动子的激活情况来实现对性激素进行检测的方法，具体方案如下：

[0008] 一种环境中雌激素检测方法，是用石斑鱼脑芳香化酶基因启动子连接荧光素酶报告基因载体，构建报告质粒，将报告质粒、金鱼雌激素受体表达质粒以及内参质粒共转染U251-MG细胞（神经胶质瘤细胞），用待测样品刺激转染后的U251-MG细胞，通过检测荧光素酶的活性来检测样品中雌激素。

[0009] 所述石斑鱼脑芳香化酶基因启动子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0010] 所述荧光素酶报告基因载体为pGL3-Basic。

[0011] 所述内参质粒为pRL-TK（海肾荧光素酶对照报告质粒），作为转染实验的内参照，可以避免因转染效率的差异对结果的影响。

[0012] pGL3-Basic萤火虫荧光素酶报告基因载体是本领域技术人员经常使用的一种荧光酶检测系统，pGL3-Basic载体不含启动子及增强子，将可能的启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游，就可以测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性。

[0013] 金鱼雌激素受体表达质粒是鱼类的受体，适合用于鱼类启动子的活性分析。U251-MG细胞为启动子的转录活性提供较好的环境，有助于高效转录。

[0014] 本发明将上述石斑鱼脑芳香化酶基因启动子序列亚克隆至pGL3-Basic载体萤火虫荧光素酶基因上游，从而构建一个报告质粒。因为本发明的石斑鱼脑芳香化酶基因启动子序列上含雌激素反应元件（ERE，雌激素反应元件序列如SEQ ID NO:2所示），因此能特异地对雌激素刺激产生反应。

[0015] 将上述构建好的报告质粒、金鱼雌激素受体表达质粒以及内参质粒pRL-TK共转染U251-MG细胞，用试剂为Lipofectamine 2000（该试剂的转染效率较高）在无酚红高糖 DMEM (Gibco，含10%无激素胎牛血清) 培养基中培养4-6小时后，更换新的培养基再培养22-26小时后，用待测样品对转染细胞进行刺激，刺激后22-26小时检测荧光素酶活性。根据荧光素酶活性是否明显升高可以检测待测环境样品的雌激素活性物质的存在。

[0016] 雌二醇是一种主要的雌激素活性物质，在环境中存在。其它雌激素作用机制与雌二醇一样，用本发明的方案同样可以检测。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0018] 本发明利用石斑鱼脑芳香化酶基因启动子受雌激素上调的特性，通过检测雌激素对这种启动子的激活情况而检测样品雌激素的存在，该技术方案基于雌激素的生物学活性，检测结果可靠、重复性好、灵敏度高，且操作简单方便。附图说明

[0019] 图1：实施例1中石斑鱼脑芳香化酶启动子活性对雌激素E2的剂量反应曲线，Eccyp19a1b为石斑鱼脑芳香化酶启动子报告质粒，3xEREtk为本领域常用来检测雌激素反应性的阳性对照质粒。

具体实施方式

[0020] 下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

[0021] 实施例1

[0022] 石斑鱼脑芳香化酶基因启动子序列，如SEQ ID NO：1所示，为申请人自己克隆，已经在网上公布。

[0023] 本实施例采用Promega公司的pGL3-Basic萤火虫荧光素酶报告基因载体。

[0024] 本发明将上述石斑鱼脑芳香化酶基因启动子序列亚克隆至pGL3-Basic载体萤火虫荧光素酶基因上游，从而构建一个报告质粒，命名为Eccyp19a1b。

[0025] 本实施例的石斑鱼脑芳香化酶基因启动子序列上含雌激素反应元件（ERE）及其它天然辅助元件，因此能特异地对雌激素刺激产生反应。

[0026] 将U251-MG细胞（购自中国典型培养物保藏中心）转移至24孔板（每孔105细胞），然后采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000（1µL/孔）把报告质粒 (380 ng)、金鱼雌激素受体表达质粒(50 ng，自己构建，将金鱼雌激素受体cDNA编码区克隆到Invitrogen公司的pcDNA3.0表达载体中)、以及Promega公司的内参质粒（pRL-TK，20 ng）共转染到U251-MG细胞中，在无酚红高糖 DMEM (Gibco，含10% 无激素胎牛血清) 培养基中培养4小时后，更换新的培养基再培养24小时，之后用待测样品（本实施例为环境水样经过除菌处理）对转染细胞进行刺激，刺激后培养24小时裂解细胞，采用双萤光素酶报告基因检测系统（Promega公司产品）测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性是否升高就可以检测待测环境样品的雌激素活性物质的存在。

[0027] 根据检测的荧光素酶活性绘图，如图1示。

[0028] 从图1可以看出，雌二醇对石斑鱼脑芳香化酶启动子活性具有剂量依赖上调作用，而且半有效剂量稍低于阳性对照报告质粒3xEREtk，表明石斑鱼脑芳香化酶启动子比阳性对照报告质粒对雌激素更敏感。

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