重组禽流感病毒毒株、其制备方法及由其制得的疫苗
阅读：994发布：2023-03-06
专利汇可以提供重组禽流感病毒毒株、其制备方法及由其制得的疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种新的重组禽流感病毒毒株，命名为rgH5N3，该毒株的保藏号为CGMCC No.1339。该重组禽流感病毒毒株含有经分子修饰的H5亚型血凝素基因、N3亚型神经 氨 酸酶基因和具有高产性状禽流感病毒的6个内部基因。将该毒株接种SPF鸡胚或者MDCK细胞，收取鸡胚尿囊液或收集细胞培养物上清，即得禽流感病毒 疫苗 ，实验证实，该疫苗具有良好的免疫原性和保护效 力 。，下面是重组禽流感病毒毒株、其制备方法及由其制得的疫苗专利的具体信息内容。
1.一种重组禽流感病毒毒株(Influenza A Virus)，命名为rgH5N3，该毒 株的微生物保藏号为CGMCC No.1339。
2.一种制备权利要求1所述的重组禽流感病毒毒株的方法，包括以下 步骤：
1)将SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示的6个核苷酸序列分别克隆于 流感病毒基因转录/表达双向载体中，分别获得6个核苷酸序列的重组质粒；
2)分别扩增H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA1和HA2基因片段， 将编码HA1和HA2蛋白分子间连接肽处的4个碱性氨基酸-R-R-K-K所对 应的核苷酸缺失掉，将H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA基因的第343 位的精氨酸突变为苏氨酸，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，用连接 酶连接后克隆到流感病毒基因转录/表达双向载体上，获得HA基因修饰过 的重组质粒；
3)将N3亚型神经氨酸酶基因克隆于流感病毒基因转录/表达双向载 体后，获得重组质粒；其中所述的N3亚型神经氨酸酶基因具有Genbank No.AY586422所示的核苷酸序列；
4)将上述8个质粒共转染293T/MDCK细胞单层，经过培养，取细 胞培养物上清即得。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征是所述的流感病毒基因转录/表 达双向载体为pHW2000。
4.一种禽流感灭活疫苗，其特征是由下述方法得到的产品：用权利要 求1所述的重组禽流感病毒毒株接种SPF鸡胚或者MDCK细胞，收取鸡胚 尿囊液或收集细胞培养物上清，即得。
5.一种疫苗组合物，其特征是包含权利要求4所述的疫苗，以及药物 学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
6.权利要求1所述的重组禽流感病毒毒株在制备防治禽流感药物中的 用途。
技术领域
本发明涉及一种病毒毒株，尤其涉及一种重组禽流感病毒毒株及其制 备方法及由其制得的疫苗，属于基因工程领域。
背景技术
高致病性禽流感(HPAI)是由正黏病毒科A型流感病毒中的H5或 H7亚型引起的一种禽类的急性、高度接触性烈性传染病。鸡、火鸡、鸭、 鹅、鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等野禽均可感染。禽流感1878年首 次发现于意大利。近年来世界许多国家和地区都先后暴发过HPAI，每一 次暴发都给养禽业造成了巨大的经济损失。2003年以来H5N1亚型高致 病性禽流感在包括中国在内的东南亚地区12个国家大范围流行，导致数 亿美元的直接经济损失。自从1996年我国广东省发病鹅群中首次分离到 H5N1亚型高致病性禽流感病毒以来，国内数十个省市先后暴发过本病， HPAI严重威胁着我国养禽业健康发展。
流感病毒粒子呈球形，病毒囊膜表面的血凝素蛋白(HA)和神经氨 酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA是诱导体液免疫 的主要保护性抗原，大量的研究表明HA蛋白在病毒入侵宿主细胞的过程 中起着重要作用。由HA蛋白裂解而成的两个片断HA1和HA2连接肽处 的氨基酸组成决定着HPAI的致病性和组织嗜性。抗HA的抗体能抑制病 毒的血凝活性并能中和病毒，是主要的保护性抗体。病毒的HA基因和 NA基因均易发生变异，引起HA蛋白、NA蛋白的抗原漂移现象，从而 造成免疫失败和病毒的流行。目前，广泛用于HPAI禽流感预防的疫苗主 要为全病毒油乳剂灭活苗。
禽流感全病毒油乳剂灭活疫苗一般是用经甲醛灭活禽流感病毒鸡胚 尿囊液，辅以矿物油佐剂，经过乳化而制成的。HPAI防治实践证明灭活 疫苗对禽流感有良好的免疫保护作用。灭活疫苗不仅安全，不会出现毒力 返强和抗原变异，而且便于储存和运输。此外，还可方便地制备多价疫苗， 病毒亚型之间不会产生免疫干扰。
除了采取严格的生物安全防护和隔离消毒之外，科学合理的使用疫苗 是控制高致病性禽流感有效措施。采用鸡胚培养流感病毒是目前制备人和 禽流感灭活疫苗经典方法。该技术的核心是必须有良好生长性状的疫苗株。 理想的疫苗株至少应具备三个条件：1、良好的抗原针对性；2、高度鸡胚 适应性；3、对鸡胚无致病性。
传统禽流感疫苗株的获取有两个来源：家禽中分离的弱毒株或者 HPAI暴发时的现地分离株。由于流感病毒存在着广泛的抗原变异，有时现 地根本分离不到弱毒株，或者由于已往的弱毒株与流行株抗原匹配性差而 不适用于疫苗生产。而HPAI现地分离株往往缺乏鸡胚适应性，鸡胚生产 滴度低，对鸡胚有致死性，存在着感染生产人员的危险，因此HPAI毒株 不能直接用于疫苗生产。
为了保证禽流感疫苗的免疫效果，必须进行广泛的流行病学检测，根 据病毒的流行情况，更新筛选疫苗株，以确保制备的疫苗能够有效预防新 出现的变异株。但是，20世纪70年代建立的筛选人流感疫苗株的“6+2” 基因重配方法，不适用于高致病性禽流感疫苗株的构建。此外，以高度适 应鸡胚的人流感病毒疫苗株PR8为骨架，采用反向遗传学技术构建人—禽 重组流感病毒能够感染哺乳动物，容易产生可以感染人的新毒株的危险。
流感病毒粒子呈球形，病毒囊膜表面的血凝素蛋白(HA)和神经氨 酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA是诱导体液免疫 的主要保护性抗原，大量的研究表明HA蛋白在病毒入侵宿主细胞的过程 中起着重要作用。由HA蛋白裂解而成的两个片断HA1和HA2连接肽处 的氨基酸组成决定着HPAI的致病性和组织嗜性。抗HA的抗体能抑制病 毒的血凝活性并能中和病毒，是主要的保护性抗体。病毒的HA基因和 NA基因均易发生变异，引起HA蛋白、NA蛋白的抗原漂移现象，从而 造成免疫失败和病毒的流行。目前，广泛用于HPAI禽流感预防的疫苗主 要为全病毒油乳剂灭活苗。
禽流感全病毒油乳剂灭活疫苗一般是用经甲醛灭活禽流感病毒鸡胚 尿囊液，辅以矿物油佐剂，经过乳化而制成的。HPAI防治实践证明灭活 疫苗对禽流感有良好的免疫保护作用。灭活疫苗不仅安全，不会出现毒力 返强和抗原变异，而且便于储存和运输。此外，还可方便地制备多价疫苗， 病毒亚型之间不会产生免疫干扰。
除了采取严格的生物安全防护和隔离消毒之外，科学合理的使用疫苗 是控制高致病性禽流感有效措施。采用鸡胚培养流感病毒是目前制备人和 禽流感灭活疫苗经典方法。该技术的核心是必须有良好生长性状的疫苗株。 理想的疫苗株至少应具备三个条件：1、良好的抗原针对性；2、高度鸡胚 适应性；3、对鸡胚无致病性。
传统禽流感疫苗株的获取有两个来源：家禽中分离的弱毒株或者 HPAI暴发时的现地分离株。由于流感病毒存在着广泛的抗原变异，有时现 地根本分离不到弱毒株，或者由于已往的弱毒株与流行株抗原匹配性差而 不适用于疫苗生产。而HPAI现地分离株往往缺乏鸡胚适应性，鸡胚生产 滴度低，对鸡胚有致死性，存在着感染生产人员的危险，因此HPAI毒株 不能直接用于疫苗生产。
为了保证禽流感疫苗的免疫效果，必须进行广泛的流行病学检测，根 据病毒的流行情况，更新筛选疫苗株，以确保制备的疫苗能够有效预防新 出现的变异株。但是，20世纪70年代建立的筛选人流感疫苗株的“6+2” 基因重配方法，不适用于高致病性禽流感疫苗株的构建。此外，以高度适 应鸡胚的人流感病毒疫苗株PR8为骨架，采用反向遗传学技术构建人—禽 重组流感病毒能够感染哺乳动物，容易产生可以感染人的新毒株的危险。
发明内容
本发明目的之一是克服现有技术的不足，提供一种重组禽流感病毒毒 株，由该毒株制备的灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种重组禽流感病毒毒株，命名为：正黏病毒科A型流感病毒 (AIV)rgH5N3，该毒株的保藏号为CGMCC No.1339，保藏地点：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关 村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2005年3月28号。
本发明巧妙地利用了禽流感病毒的毒力大小和保护抗原主要由其HA 基因决定，而鸡胚生长滴度主要由其内部基因决定的特性，针对流感病毒 容易变异的特点，利用反向遗传学技术构建一种重组禽流感病毒毒株，该 重组禽流感病毒毒株含有经分子修饰的H5亚型血凝素基因、N3亚型神经 氨酸酶基因和具有高产性状的禽流感病毒的6个内部基因片段。
本发明重组病毒的基本特性：a：透射电镜观察到所得的重组禽流感病 毒直径约为80-120nm，具有囊膜的较为典型的流感病毒形态；b：基因序 列分析表明在连续传代培养过程中，重组流感病毒基因组稳定；c：重组病 毒在MDCK细胞中滴度大于108TCID50/mL，鸡胚的半数感染量大于109 EID50/mL。d：HI实验表明重组病毒的HA抗原可被鸡抗H5亚型禽流感病 毒高免血清特异性识别；e：rgH5N3活病毒经自然途径感染SPF鸡后，感 染鸡无任何发病和死亡；f：由rgH5N3病毒制备的灭活疫苗免疫鸡血清能 够抑制H5N1亚型流感病毒的血凝活性。
本发明目的之二是是提供一种制备重组禽流感病毒毒株的方法。
一种制备重组禽流感病毒毒株的方法，包括以下步骤：
1)将高产禽流感病毒的6个内部基因即序列表SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示的6个核苷酸序列分别克隆于流感病毒基因转录/表达双向载体 中，分别获得6个内部基因的重组质粒；
2)分别扩增H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA1和HA2基因片断(中 国兽医科技，2004，35(1)：5—9)，将编码HA1和HA2蛋白分子间连接 肽处的4个碱性氨基酸-R-R-K-K的核苷酸缺失掉，将第343位的精氨基酸 (R)突变为苏氨酸(T)，用连接酶连接后克隆到流感病毒基因转录/表达 双向载体上，获得HA基因修饰过的重组质粒；
3)将N3亚型神经氨酸酶基因(该基因的具体序列见Genbank No.AY586422所示的核苷酸序列)克隆于流感病毒基因转录/表达双向载体 后，获得重组质粒；
4)将上述8个质粒共转染293T/MDCK细胞单层，经过培养，取细胞 培养物上清即得。
所述的禽流感病毒HA基因来源于目前流行的H5N1亚型HPAI病毒 HA基因全长cDNA(杨涛等，中国兽医科技2004，35(1)：5—9)，通过 分子生物学操作缺失掉HA1和HA2蛋白分子间连接肽处的4个碱性氨基 酸，第343位的精氨基酸(R)突变为苏氨酸(T)，修饰后的HA基因具 有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密 码简并性的核苷酸序列，或者它们的片段。
为保证病毒HA基因在真核细胞内的高效表达，还克隆了H9N2亚型 禽流感高产毒株的高产性状决定基因片断。流感病毒有H1—H15、N1—N9 个多个不同组合的血清学亚型，但是本发明采用的是家禽中比较常见的 H9N2亚型具有高产性状的禽流感病毒。通过RT—PCR分别扩增其6个内 部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS，该6个内部基因的详细序列请 见SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示的6个核苷酸序列)，然后分别克隆到 流感病毒转录/表达双向载体中。
所述的N3亚型神经氨酸酶基因可来自H2N3亚型禽流感参考株。
所述的流感病毒基因转录/表达双向载体为pHW2000。
本发明目的之三是提供一种制备禽流感灭活疫苗的方法，包括以下步 骤：用所述的重组禽流感病毒毒株接种SPF鸡胚或者MDCK细胞，收取鸡 胚尿囊液或收集细胞培养物上清，即得。
如上文所述，重组病毒HA基因缺失了部分与毒力密切相关的核苷酸 序列后已经变成弱毒株，在易感细胞或者鸡胚产生高滴度的流感病毒。重 组病毒疫苗株在MDCK细胞和9—11龄鸡胚中都能够复制，产生高滴度的 流感病毒，其病毒基因组在连续传代过程中保持稳定。以rgH5N3为抗原 制备的禽流感灭活疫苗有很好的免疫保护作用：由病毒感染MDCK细胞培 养物上清或者感染鸡胚尿囊液制备的油乳剂灭活苗，以0.3ml剂量颈部皮 下免疫接种SPF鸡后，在102CLD50(50％鸡半数致死量)滴鼻、点眼途径感 染的致死性攻击实验中，免疫鸡存活率为100％。rgH5N3活毒106EID50(50 ％鸡半数感染量)两次滴鼻、点眼免疫接种SPF鸡后，可保护受试鸡在 102CLD50的攻击下全部存活。实验表明：rgH5N3疫苗免疫接种后对H5亚 型高致病性禽流感的致死性攻击具有很好的免疫保护效果。本发明的疫苗 加入药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂后可按常规制备方法制备成疫 苗组合物。
接种rgH5N3能够诱导SPF鸡和鸭子产生高滴度的HI抗体。SPF鸡 颈皮下接种0.5ml油乳剂灭活疫苗，以血凝抑制试验检测HI抗体滴度。接 种后一周即可诱导产生具有保护作用的H5亚型特异的HI抗体，抗体滴度 在4-5周可达1：256左右；疫苗免疫鸡20周后的HI抗体水平保持1：16。
本发明的疫苗具有以下优点：1、该疫苗采用了目前流行的H5N1亚型 高致病性毒株的HA基因作为保护性抗原的基因供体，克服了由其它地区 引进的弱毒疫苗株与流行株的抗原匹配性差，保护效果不确实的缺点。2、 疫苗的所有高产性状基因全部来自禽流感病毒，克服了采用人源流感病毒 PR8所构建的人禽重组病毒容易突破物种间屏障的缺点，减小了人类感染 的危险。3、N3亚型神经氨酸酶蛋白作为疫苗的分子标记，克服了已往的 灭活疫苗无法进行病毒感染动物与疫苗免疫动物鉴别诊断的缺点。4、疫苗 株对鸡、鸭、鸡胚无致病性，鸡胚尿囊液的HA效价可达1：1024，比常 规疫苗株提高4倍以上。5、疫苗免疫后能够诱导产生高水平的HI抗体， 抗体效价是已往疫苗诱导抗体的2—4倍。疫苗可在2周内快速诱导出保护 性抗体，保护性抗体持续期可持续4个月以上。6、根据禽流感病毒的抗原 变异情况，采用反向遗传学技术可以在1—2周内构建出相应抗原类型的禽 流感疫苗株，不需进行长时间的疫苗株筛选。该技术将对高致病性禽流感 的预防产生重大影响，将使禽流感疫苗制备技术发生深刻变化，并将带来 巨大的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为6个内部基因的重组质粒的构建：高产禽流感病毒的6个内部 基因分别克隆于流感病毒基因转录/表达双向载体pHW2000，分别获得6 个内部基因的重组质粒(pPB2、pPB1、pPA、pNP、pM、pNS)。
图2为基因修饰的HA基因和NA基因表达质粒的构建：分别PCR扩 增H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA1和HA2基因片断，T4DNA连接酶 连接后克隆到流感病毒基因转录/表达双向载体上，获得HA基因修饰过的 重组质粒pHA；N3亚型神经氨酸酶基因克隆于流感病毒基因转录/表达双 向载体后，获得重组质粒pNA。
图3为8个质粒pPB2、pPB1、pPA、pNP、pM、pNS、pHA和pNA 共转染293T/MDCK细胞单层，经过72小时培养，细胞培养物上清中即可 得到带分子标记的rgH5N3病毒。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种重组禽流感病毒毒株，命名为：正黏病毒科A型流感病毒 (AIV)rgH5N3，该毒株的保藏号为CGMCC No.1339，保藏地点：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关 村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2005年3月28号。
本发明巧妙地利用了禽流感病毒的毒力大小和保护抗原主要由其HA 基因决定，而鸡胚生长滴度主要由其内部基因决定的特性，针对流感病毒 容易变异的特点，利用反向遗传学技术构建一种重组禽流感病毒毒株，该 重组禽流感病毒毒株含有经分子修饰的H5亚型血凝素基因、N3亚型神经 氨酸酶基因和具有高产性状的禽流感病毒的6个内部基因片段。
本发明重组病毒的基本特性：a：透射电镜观察到所得的重组禽流感病 毒直径约为80-120nm，具有囊膜的较为典型的流感病毒形态；b：基因序 列分析表明在连续传代培养过程中，重组流感病毒基因组稳定；c：重组病 毒在MDCK细胞中滴度大于108TCID50/mL，鸡胚的半数感染量大于109 EID50/mL。d：HI实验表明重组病毒的HA抗原可被鸡抗H5亚型禽流感病 毒高免血清特异性识别；e：rgH5N3活病毒经自然途径感染SPF鸡后，感 染鸡无任何发病和死亡；f：由rgH5N3病毒制备的灭活疫苗免疫鸡血清能 够抑制H5N1亚型流感病毒的血凝活性。
本发明目的之二是是提供一种制备重组禽流感病毒毒株的方法。
一种制备重组禽流感病毒毒株的方法，包括以下步骤：
1)将高产禽流感病毒的6个内部基因即序列表SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示的6个核苷酸序列分别克隆于流感病毒基因转录/表达双向载体 中，分别获得6个内部基因的重组质粒；
2)分别扩增H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA1和HA2基因片断(中 国兽医科技，2004，35(1)：5—9)，将编码HA1和HA2蛋白分子间连接 肽处的4个碱性氨基酸-R-R-K-K的核苷酸缺失掉，将第343位的精氨基酸 (R)突变为苏氨酸(T)，用连接酶连接后克隆到流感病毒基因转录/表达 双向载体上，获得HA基因修饰过的重组质粒；
3)将N3亚型神经氨酸酶基因(该基因的具体序列见Genbank No.AY586422所示的核苷酸序列)克隆于流感病毒基因转录/表达双向载体 后，获得重组质粒；
4)将上述8个质粒共转染293T/MDCK细胞单层，经过培养，取细胞 培养物上清即得。
所述的禽流感病毒HA基因来源于目前流行的H5N1亚型HPAI病毒 HA基因全长cDNA(杨涛等，中国兽医科技2004，35(1)：5—9)，通过 分子生物学操作缺失掉HA1和HA2蛋白分子间连接肽处的4个碱性氨基 酸，第343位的精氨基酸(R)突变为苏氨酸(T)，修饰后的HA基因具 有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密 码简并性的核苷酸序列，或者它们的片段。
为保证病毒HA基因在真核细胞内的高效表达，还克隆了H9N2亚型 禽流感高产毒株的高产性状决定基因片断。流感病毒有H1—H15、N1—N9 个多个不同组合的血清学亚型，但是本发明采用的是家禽中比较常见的 H9N2亚型具有高产性状的禽流感病毒。通过RT—PCR分别扩增其6个内 部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS，该6个内部基因的详细序列请 见SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示的6个核苷酸序列)，然后分别克隆到 流感病毒转录/表达双向载体中。
所述的N3亚型神经氨酸酶基因可来自H2N3亚型禽流感参考株。
所述的流感病毒基因转录/表达双向载体为pHW2000。
本发明目的之三是提供一种制备禽流感灭活疫苗的方法，包括以下步 骤：用所述的重组禽流感病毒毒株接种SPF鸡胚或者MDCK细胞，收取鸡 胚尿囊液或收集细胞培养物上清，即得。
如上文所述，重组病毒HA基因缺失了部分与毒力密切相关的核苷酸 序列后已经变成弱毒株，在易感细胞或者鸡胚产生高滴度的流感病毒。重 组病毒疫苗株在MDCK细胞和9—11龄鸡胚中都能够复制，产生高滴度的 流感病毒，其病毒基因组在连续传代过程中保持稳定。以rgH5N3为抗原 制备的禽流感灭活疫苗有很好的免疫保护作用：由病毒感染MDCK细胞培 养物上清或者感染鸡胚尿囊液制备的油乳剂灭活苗，以0.3ml剂量颈部皮 下免疫接种SPF鸡后，在102CLD50(50％鸡半数致死量)滴鼻、点眼途径感 染的致死性攻击实验中，免疫鸡存活率为100％。rgH5N3活毒106EID50(50 ％鸡半数感染量)两次滴鼻、点眼免疫接种SPF鸡后，可保护受试鸡在 102CLD50的攻击下全部存活。实验表明：rgH5N3疫苗免疫接种后对H5亚 型高致病性禽流感的致死性攻击具有很好的免疫保护效果。本发明的疫苗 加入药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂后可按常规制备方法制备成疫 苗组合物。
接种rgH5N3能够诱导SPF鸡和鸭子产生高滴度的HI抗体。SPF鸡 颈皮下接种0.5ml油乳剂灭活疫苗，以血凝抑制试验检测HI抗体滴度。接 种后一周即可诱导产生具有保护作用的H5亚型特异的HI抗体，抗体滴度 在4-5周可达1：256左右；疫苗免疫鸡20周后的HI抗体水平保持1：16。
本发明的疫苗具有以下优点：1、该疫苗采用了目前流行的H5N1亚型 高致病性毒株的HA基因作为保护性抗原的基因供体，克服了由其它地区 引进的弱毒疫苗株与流行株的抗原匹配性差，保护效果不确实的缺点。2、 疫苗的所有高产性状基因全部来自禽流感病毒，克服了采用人源流感病毒 PR8所构建的人禽重组病毒容易突破物种间屏障的缺点，减小了人类感染 的危险。3、N3亚型神经氨酸酶蛋白作为疫苗的分子标记，克服了已往的 灭活疫苗无法进行病毒感染动物与疫苗免疫动物鉴别诊断的缺点。4、疫苗 株对鸡、鸭、鸡胚无致病性，鸡胚尿囊液的HA效价可达1：1024，比常 规疫苗株提高4倍以上。5、疫苗免疫后能够诱导产生高水平的HI抗体， 抗体效价是已往疫苗诱导抗体的2—4倍。疫苗可在2周内快速诱导出保护 性抗体，保护性抗体持续期可持续4个月以上。6、根据禽流感病毒的抗原 变异情况，采用反向遗传学技术可以在1—2周内构建出相应抗原类型的禽 流感疫苗株，不需进行长时间的疫苗株筛选。该技术将对高致病性禽流感 的预防产生重大影响，将使禽流感疫苗制备技术发生深刻变化，并将带来 巨大的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为6个内部基因的重组质粒的构建：高产禽流感病毒的6个内部 基因分别克隆于流感病毒基因转录/表达双向载体pHW2000，分别获得6 个内部基因的重组质粒(pPB2、pPB1、pPA、pNP、pM、pNS)。
图2为基因修饰的HA基因和NA基因表达质粒的构建：分别PCR扩 增H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA1和HA2基因片断，T4DNA连接酶 连接后克隆到流感病毒基因转录/表达双向载体上，获得HA基因修饰过的 重组质粒pHA；N3亚型神经氨酸酶基因克隆于流感病毒基因转录/表达双 向载体后，获得重组质粒pNA。
图3为8个质粒pPB2、pPB1、pPA、pNP、pM、pNS、pHA和pNA 共转染293T/MDCK细胞单层，经过72小时培养，细胞培养物上清中即可 得到带分子标记的rgH5N3病毒。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明方法，应该理解的是，这些实施 例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
[实施例1]本发明分子标记重组禽流感病毒的构建
A.高产毒株内部基因的克隆
取含鸡胚高产禽流感病毒的鸡胚尿囊液(购自中国农业科学院哈尔滨 兽医研究所兽医微生物菌种保藏中心)，加入Trizol试剂(Invitrogen)提取 总RNA，采用流感病毒基因3’端特异引物(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)反 转录合成病毒的cDNA，分别采用各基因片段特异引物(Hoffmann et al， Arch Virol 2001；146:2275-89)，PCR反应扩增获得流感病毒6条内部基因片 断(SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列)，然后分别将其克隆 入载体pHW2000(Hoffmann et al，PNAS 2000；97:6108-6113)，经酶切鉴定 和序列测定，获得的重组质粒分别命名为：pPB2、pPB1、pPA、pNP、pM、 pNS。
B.分子修饰的HA基因的克隆和N3亚型神经氨酸酶基因的克隆
取H5N1亚型禽流感病毒(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽 医微生物菌种保藏中心)的鸡胚尿囊液，加入Trizol试剂(Invitrogen)提 取总RNA，采用流感病毒基因3’端特异引物(5’-AGCAAAAGCAGG-3’) 逆转录合成cDNA，用分别带有BsmBI限制性内切酶位点的HA1基因特 异引物和HA2基因特异引物扩增HA1基因和HA2基因；HA1基因特异 引物序列如下：
H5-F1:5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’
H5-R1:
5’-TTACGTCTCTCCCTTGTCTCAATTTGAGGGGTATTTCTGAGT-3’
HA2基因特异引物序列如下：
H5-F2:5’-ATTACGTCTCAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGG-3’
H5-R2:5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’
PCR扩增获得的HA1基因片段缺失了编码连接肽处的4个碱性氨基酸 的12个核苷酸。具体扩增条件如下：两个200μl PCR反应管分别加入HA1 和HA2基因片段特异引物各1μl，病毒cDNA模板2μl，10mM的dNTPs2 μl，10×PCR缓冲液10μl，灭菌水81μl，Ex Taq DNA聚合酶1μl，混匀后 进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃ 4min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 2-3 min，30个循环，72℃ 10min。扩增结束后取PCR产物5μl，在1％琼脂凝胶上 电泳检查扩增结果，然后将上述HA1和HA2分别用BsmBI酶切、纯化、 克隆入载体pHW2000，经酶切鉴定和序列测定，获得的重组质粒命名为： pHA。
取H2N3亚型禽流感病毒的鸡胚尿囊液，加入Trizol试剂(Invitrogen 公司)提取总RNA，采用流感病毒基因3’端特异引物 (5’-AGCAAAAGCAGG-3’)逆转录合成cDNA，采用NA基因特异引物 (NA-1:5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTGC-3’；NA-1413R: 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTGCTTTTT-3’)聚合酶链反 应扩增获得流感病毒NA基因片断经BsmBI酶切后，将其克隆入载体 pHW2000，经酶切鉴定和序列测定，获得的重组质粒命名为：pNA。
C.rgH5N3重组病毒的拯救
将上述经过序列分析鉴定的8个重组质粒各1μg，用OPTI-MEM (Invitrogen)液体培养基调整其体积为100μl；8μl脂质体试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)用OPTI-MEM液体培养基调整其体积为100μl，室温反 应5min；然后，将二者混合，室温反应20-30min；将脂质体/质粒混合物 转染6孔板中的293T/MDCK细胞单层，细胞转染6-8小时后，弃掉脂质 体混合物，换成含有0.5μg/ml TPCK-trypsin的OPTI-MEM培养液继续72 小时，收取细胞培养上清，将其作为本发明分子标记rgH5N3重组流感病 毒的第一代种毒，—70℃保存。然后，将第一代种毒分别接种SPF鸡胚或 者MDCK细胞培养用来扩增繁殖病毒，用0.5％的鸡红细胞分别测定鸡胚 尿囊液或者细胞培养上清的血凝效价。
D：本发明rgH5N3重组病毒HA基因序列测定：
病毒RNA的提取：第5代的rgH5N3重组病毒感染的SPF鸡胚尿囊液 或MDCK细胞上清500μl，加入500μl Trizol试剂，混匀，室温放置15min， 加入200μl氯仿，振荡混匀，4℃ 12,000rpm离心15min，取上清500μl加入 等体积的异丙醇，室温放置10min后12,000rpm离心10min，然后弃上清，500 μl的75％乙醇洗涤沉淀，自然干燥，溶于50μl经DEPC处理的去离子水 中，即为病毒基因组RNA。
病毒cDNA的制备：取5μl提取的病毒RNA，加入1μl通用3’末端 特异的反转录引物(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)，70℃预变性5min后冰浴 5min，然后加入5×反转录缓冲液4μl，0.1M的DTT 2μl，10mM dNTPs 2μ l，M-MLV 1μl，RNasin 1μl，DEPC处理水4μl，37℃作用1h，—20℃保存备 用。
病毒基因的PCR扩增：PCR反应管分别加入HA基因片段特异的上、 下游引物(H5-F1:5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’和 H5-R2:5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’)各1μ l，病毒cDNA模板2μl，10mM的dNTPs 2μl，10×PCR缓冲液10μl，灭菌 水81μl，Ex Taq DNA聚合酶1μl，混匀后进行PCR扩增。PCR扩增条件 为：94℃ 4min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 3min，30个循环，72℃ 10min。扩 增结束后取PCR产物5μl，在1％琼脂凝胶上电泳检查扩增结果。胶回收扩 增的HA基因片段，采用片断特异的引物进行DNA序列测定，DNA序列 分析软件进行序列比较分析，HA基因片段测序结果见序列表SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列。
[实施例2]本发明重组病毒rgH5N3在MDCK细胞上的增殖
含5％胎牛血清的MEM培养液，5％CO2，37℃条件下培养MDCK细 胞生长至90％饱和时，以感染复数m.o.i＝10分别接种不同代次的rgH5N3 重组病毒，同时培养液中加入1μg/ml TPCK-Trypsin(购自SIGMA— ALDRICH)。培养3-4d后，当细胞病变达到70-90％时，将细胞培养瓶反 复冻融裂解3次，5,000rpm离心10min，收集上清，测定其HA效价，结 果见表1。
表1 各代次rgH5N3感染MDCK细胞后的血凝价
[实施例3]本发明重组病毒rgH5N3在普通鸡胚上的增殖
9—11日龄普通鸡胚，产卵母鸡未进行过禽流感疫苗免疫接种，鸡胚 尿囊腔途径接种不同剂量的第5代rgH5N3病毒，接毒后鸡胚在37℃条件 下，孵化48小时，置4℃冷藏过夜，收取鸡胚尿囊液，5,000rpm离心10 min，去掉组织碎片等杂质，收集上清，测定其HA效价，结果见表2。
表2 不同剂量的rgH5N3病毒接种鸡胚后的血凝价
[实施例4]本发明疫苗免疫原性试验
2周龄SPF鸡分别颈部皮下接种rgH5N3感染鸡胚尿囊液或MDCK细 胞培养上清制备的油乳剂灭活疫苗。以血凝抑制(HI)试验检测血清中的 HI抗体滴度。接种后一周即可诱导产生特异性的HI抗体，抗体滴度在4 —5周左右达到最高峰，平均滴度可达1：224；保护性抗体水平维持至少20 周，结果见表3。
表3 rgH5N3免疫后不同时间的HI抗体水平
[实施例5]本发明疫苗保护效力试验
4—6周龄SPF鸡分别颈皮下免疫接种rgH5N3感染鸡胚尿囊液或 MDCK细胞培养上清制备的油乳剂灭活苗。单次免疫方案仅在第0天一次 接种疫苗。实验组接种鸡与对照组鸡均在接种后以102CLD50剂量H5N1亚 型高致病性禽流感病毒进行攻击，在14天的观察期后计算其死亡/存活 率，结果见表4。
表4 rgH5N3疫苗免疫接种鸡攻击强毒的免疫保护性
试验结果说明，本发明疫苗具有良好的保护效力。
序列表.txt
<110>中国农科院哈尔滨兽医研究所
<120>重组禽流感病毒毒株及其制备方法和用途
<130>
<160>7
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>1767
<212>DNA
<213>Influenza A virus
<400>1
<210>2
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<210>7
<211>890
<212>DNA
<213>Influenza A virus
<400>7
[实施例1]本发明分子标记重组禽流感病毒的构建
A.高产毒株内部基因的克隆
取含鸡胚高产禽流感病毒的鸡胚尿囊液(购自中国农业科学院哈尔滨 兽医研究所兽医微生物菌种保藏中心)，加入Trizol试剂(Invitrogen)提取 总RNA，采用流感病毒基因3’端特异引物(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)反 转录合成病毒的cDNA，分别采用各基因片段特异引物(Hoffmann et al， Arch Virol 2001；146:2275-89)，PCR反应扩增获得流感病毒6条内部基因片 断(SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列)，然后分别将其克隆 入载体pHW2000(Hoffmann et al，PNAS 2000；97:6108-6113)，经酶切鉴定 和序列测定，获得的重组质粒分别命名为：pPB2、pPB1、pPA、pNP、pM、 pNS。
B.分子修饰的HA基因的克隆和N3亚型神经氨酸酶基因的克隆
取H5N1亚型禽流感病毒(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽 医微生物菌种保藏中心)的鸡胚尿囊液，加入Trizol试剂(Invitrogen)提 取总RNA，采用流感病毒基因3’端特异引物(5’-AGCAAAAGCAGG-3’) 逆转录合成cDNA，用分别带有BsmBI限制性内切酶位点的HA1基因特 异引物和HA2基因特异引物扩增HA1基因和HA2基因；HA1基因特异 引物序列如下：
H5-F1:5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’
H5-R1:
5’-TTACGTCTCTCCCTTGTCTCAATTTGAGGGGTATTTCTGAGT-3’
HA2基因特异引物序列如下：
H5-F2:5’-ATTACGTCTCAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGG-3’
H5-R2:5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’
PCR扩增获得的HA1基因片段缺失了编码连接肽处的4个碱性氨基酸 的12个核苷酸。具体扩增条件如下：两个200μl PCR反应管分别加入HA1 和HA2基因片段特异引物各1μl，病毒cDNA模板2μl，10mM的dNTPs2 μl，10×PCR缓冲液10μl，灭菌水81μl，Ex Taq DNA聚合酶1μl，混匀后 进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃ 4min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 2-3 min，30个循环，72℃ 10min。扩增结束后取PCR产物5μl，在1％琼脂凝胶上 电泳检查扩增结果，然后将上述HA1和HA2分别用BsmBI酶切、纯化、 克隆入载体pHW2000，经酶切鉴定和序列测定，获得的重组质粒命名为： pHA。
取H2N3亚型禽流感病毒的鸡胚尿囊液，加入Trizol试剂(Invitrogen 公司)提取总RNA，采用流感病毒基因3’端特异引物 (5’-AGCAAAAGCAGG-3’)逆转录合成cDNA，采用NA基因特异引物 (NA-1:5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTGC-3’；NA-1413R: 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTGCTTTTT-3’)聚合酶链反 应扩增获得流感病毒NA基因片断经BsmBI酶切后，将其克隆入载体 pHW2000，经酶切鉴定和序列测定，获得的重组质粒命名为：pNA。
C.rgH5N3重组病毒的拯救
将上述经过序列分析鉴定的8个重组质粒各1μg，用OPTI-MEM (Invitrogen)液体培养基调整其体积为100μl；8μl脂质体试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)用OPTI-MEM液体培养基调整其体积为100μl，室温反 应5min；然后，将二者混合，室温反应20-30min；将脂质体/质粒混合物 转染6孔板中的293T/MDCK细胞单层，细胞转染6-8小时后，弃掉脂质 体混合物，换成含有0.5μg/ml TPCK-trypsin的OPTI-MEM培养液继续72 小时，收取细胞培养上清，将其作为本发明分子标记rgH5N3重组流感病 毒的第一代种毒，—70℃保存。然后，将第一代种毒分别接种SPF鸡胚或 者MDCK细胞培养用来扩增繁殖病毒，用0.5％的鸡红细胞分别测定鸡胚 尿囊液或者细胞培养上清的血凝效价。
D：本发明rgH5N3重组病毒HA基因序列测定：
病毒RNA的提取：第5代的rgH5N3重组病毒感染的SPF鸡胚尿囊液 或MDCK细胞上清500μl，加入500μl Trizol试剂，混匀，室温放置15min， 加入200μl氯仿，振荡混匀，4℃ 12,000rpm离心15min，取上清500μl加入 等体积的异丙醇，室温放置10min后12,000rpm离心10min，然后弃上清，500 μl的75％乙醇洗涤沉淀，自然干燥，溶于50μl经DEPC处理的去离子水 中，即为病毒基因组RNA。
病毒cDNA的制备：取5μl提取的病毒RNA，加入1μl通用3’末端 特异的反转录引物(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)，70℃预变性5min后冰浴 5min，然后加入5×反转录缓冲液4μl，0.1M的DTT 2μl，10mM dNTPs 2μ l，M-MLV 1μl，RNasin 1μl，DEPC处理水4μl，37℃作用1h，—20℃保存备 用。
病毒基因的PCR扩增：PCR反应管分别加入HA基因片段特异的上、 下游引物(H5-F1:5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’和 H5-R2:5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’)各1μ l，病毒cDNA模板2μl，10mM的dNTPs 2μl，10×PCR缓冲液10μl，灭菌 水81μl，Ex Taq DNA聚合酶1μl，混匀后进行PCR扩增。PCR扩增条件 为：94℃ 4min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 3min，30个循环，72℃ 10min。扩 增结束后取PCR产物5μl，在1％琼脂凝胶上电泳检查扩增结果。胶回收扩 增的HA基因片段，采用片断特异的引物进行DNA序列测定，DNA序列 分析软件进行序列比较分析，HA基因片段测序结果见序列表SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列。
[实施例2]本发明重组病毒rgH5N3在MDCK细胞上的增殖
含5％胎牛血清的MEM培养液，5％CO2，37℃条件下培养MDCK细 胞生长至90％饱和时，以感染复数m.o.i＝10分别接种不同代次的rgH5N3 重组病毒，同时培养液中加入1μg/ml TPCK-Trypsin(购自SIGMA— ALDRICH)。培养3-4d后，当细胞病变达到70-90％时，将细胞培养瓶反 复冻融裂解3次，5,000rpm离心10min，收集上清，测定其HA效价，结 果见表1。
表1 各代次rgH5N3感染MDCK细胞后的血凝价
[实施例3]本发明重组病毒rgH5N3在普通鸡胚上的增殖
9—11日龄普通鸡胚，产卵母鸡未进行过禽流感疫苗免疫接种，鸡胚 尿囊腔途径接种不同剂量的第5代rgH5N3病毒，接毒后鸡胚在37℃条件 下，孵化48小时，置4℃冷藏过夜，收取鸡胚尿囊液，5,000rpm离心10 min，去掉组织碎片等杂质，收集上清，测定其HA效价，结果见表2。
表2 不同剂量的rgH5N3病毒接种鸡胚后的血凝价
[实施例4]本发明疫苗免疫原性试验
2周龄SPF鸡分别颈部皮下接种rgH5N3感染鸡胚尿囊液或MDCK细 胞培养上清制备的油乳剂灭活疫苗。以血凝抑制(HI)试验检测血清中的 HI抗体滴度。接种后一周即可诱导产生特异性的HI抗体，抗体滴度在4 —5周左右达到最高峰，平均滴度可达1：224；保护性抗体水平维持至少20 周，结果见表3。
表3 rgH5N3免疫后不同时间的HI抗体水平
[实施例5]本发明疫苗保护效力试验
4—6周龄SPF鸡分别颈皮下免疫接种rgH5N3感染鸡胚尿囊液或 MDCK细胞培养上清制备的油乳剂灭活苗。单次免疫方案仅在第0天一次 接种疫苗。实验组接种鸡与对照组鸡均在接种后以102CLD50剂量H5N1亚 型高致病性禽流感病毒进行攻击，在14天的观察期后计算其死亡/存活 率，结果见表4。
表4 rgH5N3疫苗免疫接种鸡攻击强毒的免疫保护性
试验结果说明，本发明疫苗具有良好的保护效力。
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