N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物用于促进胚胎植入机制的应用、以及相关组合物和培养基
阅读：743发布：2020-05-29
专利汇可以提供N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物用于促进胚胎植入机制的应用、以及相关组合物和培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及N-乙酰基-5-甲 氧 基色胺(褪黑 激素 )和/或其类似物的应用，以及相关的组合物、培养基和医疗器械，所述N-乙酰基-5-甲氧基色胺(褪黑激素)和/或其类似物通过给需要 治疗 的雌性 哺乳动物 受试者进行有效量的局部 给药 而用于在医疗或兽医领域的辅助生殖中促进胚胎植入机制，特别是用于防止植入子宫失败。，下面是N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物用于促进胚胎植入机制的应用、以及相关组合物和培养基专利的具体信息内容。
1.N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其通过给需要治疗的雌性哺乳动物受试者进行有效量的局部给药而用于在医疗或兽医领域的辅助生殖中防止植入子宫失败。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其中所述类似物选自阿戈美拉汀、6-羟基-褪黑激素、5-羟色胺、5-羟色氨酸或它们的衍生物。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其中所述雌性哺乳动物受试者为患有不孕或频繁流产的女性。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其中所述局部给药通过子宫内膜灌洗、或子宫清洗或子宫内膜清洗进行。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其中所述局部给药在取卵时通过单次给药进行。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其中所-9 -9
述N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物的存在浓度为4×10 g/ml至25×10 g/ml，优选-9
大于或等于10×10 g/ml。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其用于从取卵之日起将N-乙酰基-5-甲氧基色胺、HCG或孕酮、或它们的组合进行同步系统给药。
8.根据前述权利要求中任意一项所述的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其中所述辅助生殖技术选自由计划性交、宫腔内人工授精(IUI)、体外受精与胚胎移植(FIVET)、体外受精(IVF)、卵胞浆内单精子注射(ICSI)、卵胞浆内形态选择单精子注射(IMSI)技术和Tesa-Tese(睾丸精子抽吸术)组成的组中。
9.一种适合局部给药的组合物，所述组合物包含对需要治疗的雌性哺乳动物受试者有效量的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物、或者它们的组合作为活性成分，优选包含N-乙酰基-5-甲氧基色胺作为活性成分，以及一种或多种生理学可接受的赋形剂或佐剂，所述组合物用于在医疗或兽医领域的辅助生殖中防止植入子宫失败。
-9
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述活性成分的存在浓度为4×10 g/ml至-9 -9
25×10 g/ml，优选大于或等于10×10 g/ml。
11.根据权利要求9-10中任意一项所述的组合物，其中所述活性成分以在细胞培养基中的子宫内膜灌洗剂、或子宫清洗剂或子宫内膜清洗剂的形式配制，并且终浓度为-9 -9 -9
4×10 g/ml至25×10 g/ml，优选大于或等于10×10 g/ml。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中用于胚泡的培养基包含以下成分：
-D-葡萄糖源；
-抗生素，优选庆大霉素；
-人血清白蛋白；
-必需氨基酸和非必须氨基酸，优选L-牛磺酸；
-缓冲盐，优选选自以下物质中：
-钙盐：乳酸钙，泛酸钙；
-钠盐：氯化钠，碳酸氢钠和丙酮酸钠；
-钾盐：氯化钾，磷酸钾；
-镁盐：氯化镁，硫酸镁；
-水：并且
pH在7.5和7.8之间。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述培养基为 胚泡培养基。
14.根据权利要求9-10中任意一项所述的组合物，其中上述组合物中的所述活性成分以在生理溶液中的子宫内膜灌洗剂、或子宫清洗剂或子宫内膜清洗剂的形式配制。
15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，还包含必需氨基酸、非必需氨基酸和缓冲盐以将pH保持在7-8之间，优选7.5-7.8。
16.一种用于子宫清洗的医疗器械，包括预装填或待装填根据权利要求9-15中任意一项所述的组合物的无菌容器。
17.根据权利要求16所述的医疗器械，其中所述无菌容器是一次性的。
18.根据权利要求16或17所述的医疗器械，其中所述无菌容器为用于自注射器械的注射器、配送器或药盒。
19.根据前述权利要求中任意一项所述的医疗器械，还包括无菌的子宫内导管。
20.根据权利要求16-19中任意一项所述的医疗器械，包括预装填有基于生理溶液的配制物的一次性无菌容器，所述生理溶液补充有褪黑激素、氨基酸和缓冲盐以将pH保持在
7-8之间，优选7.5-7.8。
21.根据权利要求20所述的医疗器械，其中所述配制物包含必需氨基酸、非必需氨基酸和优选选自钙、钾、镁盐及其混合物的缓冲盐。
22.根据权利要求16-21中任意一项所述的医疗器械，其中所包含的褪黑激素的浓度-9 -9 -9
介于4×10 g/ml和25×10 g/ml之间，优选大于或等于10×10 g/ml。
23.根据权利要求16-22中任意一项所述的医疗器械，其中所述一次性无菌容器预装填有1.5ml体积的生理溶液，该生理溶液包含：
-9
-10×10 g/ml的褪黑激素；
-必需和非必需氨基酸；
-钙盐；
-钾盐；
-镁盐。
24.根据权利要求16-23中任意一项所述的医疗器械，其用于在医疗或兽医领域的辅助生殖中防止植入子宫失败。
25.一种体外或体内细胞培养基，包含：
-D-葡萄糖源；
-抗生素，优选庆大霉素；
-人血清白蛋白；
-必需氨基酸和非必须氨基酸，优选L-牛磺酸；
-选自以下的缓冲盐：
-钙盐：乳酸钙，泛酸钙；
-钠盐：氯化钠，碳酸氢钠和丙酮酸钠；
-钾盐：氯化钾，磷酸钾；
-镁盐：氯化镁，硫酸镁；
及其混合物；
-水：
其特征在于，所述细胞培养基还包含N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，或者-9 -9
它们的组合，其中活性成分的存在浓度为4×10 g/ml至25×10 g/ml，优选大于或等于-9
10×10 g/ml。
26.根据权利要求25所述的细胞培养基的应用，其用于胞饮突的生长和获得体外模型研究。
N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物用于促进胚胎植入机
制的应用、以及相关组合物和培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及N-乙酰基-5-甲氧基色胺(褪黑激素)和/或其类似物的应用，以及相关的组合物、培养基和医疗器械，所述N-乙酰基-5-甲氧基色胺(褪黑激素)和/或其类似物通过给需要治疗的雌性哺乳动物受试者进行有效量的局部给药而用于在医疗或兽医领域的辅助生殖中促进胚胎植入机制，特别是用于防止植入子宫失败。
背景技术
[0002] 人类胚胎植入子宫是一个复杂的机制，同时既涉及到胚胎，又涉及到子宫内膜上皮细胞。添附(apposition)、粘附和侵入这些阶段涉及到多种分子(其在此过程中发挥了独特的作用)，怀孕和子宫内膜之间的分子对话暗示着细胞之间以及细胞和生物化学因子之间的相互作用。
[0003] 如果合适地表达或抑制，这些机制有助于确定子宫内膜对胚胎的容受性或非容受性状态。
[0004] 子宫内膜容受性或非容受性的状态尽管是众所周知的概念，但是在临床上难以确定：子宫内膜组织学正常并不一定意味着其功能正常；另一方面，特定的子宫内膜结构(称为胞饮突)的时间和空间表达明确地指示了其本身的容受状态。
[0005] 植入是一个复杂的信号级联过程，它对于产生怀孕至关重要。据推测，在卵巢信号的作用下有大量的分子介体参与了胚胎-子宫内膜之间的相互作用。这些介体包括各种分子，例如激素、细胞因子、生长因子、脂质，粘附分子及其它(1)。
[0006] 医学辅助生殖(MAR)技术中的植入失败仍然是一个悬而未决的问题，它通常被认为是健康女性不孕的主要原因之一。考虑到MAR技术植入胚胎成功率在25％左右，认为2/3的失败是由于子宫容受性不足而造成(认为1/3由胚胎造成)(2)。
[0007] 子宫内膜接受胚泡侵入的时间是有限的，其被定义为“植入窗”。使“排卵-胚胎生长的第一阶段-用于植入的子宫内膜上皮细胞的细胞修饰”之间同步化的“对话”受到一系列激素和生化信使的控制。
[0009] 认为胞饮突的形成是子宫内膜容受性的特异性标记，它们约在排卵一周后出现(但是它们的完全表达在不同病人之间有所改变)并且似乎只保持一天(4)。
[0011] 被科学团体一致接受的与胞饮突的表达相关的子宫内膜容受性或“植入窗”的观点几十年来都是致力于解决辅助生殖相关的难题的科学家的研究主题。
[0012] 总结：孕前期激素孕酮是主要介体，并且围绕其作用还有很多其它介体可促进植入的发生。
[0013] 根据上文所述可知，通过辅助生殖技术受孕的困难主要归因于我们对植入现象认识的不足。
[0014] 由此明显可知，也鉴于在辅助生殖领域中的许多立法限制，优化植入阶段是非常必要的。
[0015] 本发明的作者发现N-乙酰基-5-甲氧基色胺(褪黑激素)是与黄体酮一起能够在胞饮突的表达中具有关键作用的介体之一，其对胚胎着床具有非常积极的作用。
[0016] 褪黑激素由松果体(一种被光控制的神经内分泌腺)合成；黑暗的环境会促进其合成和分泌。
[0017] 褪黑激素的使用不存在副作用或剂量过量的问题，并且也没有文献报道禁忌症(6)。
[0019] 一些研究人员已经证明(7)，褪黑激素能抑制子宫内膜非典型细胞的增值，该细胞被称为Ishikawa，可引起子宫内膜癌。研究小组通过褪黑激素的放射性配体和拮抗剂(例如2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole))的实验证明，褪黑激素的抑制作用是通过存在于Ishikawa增殖细胞的细胞膜中的MT2受体产生的。
[0020] 另一个需要考虑的决定因素是绝经期，在这个时期褪黑激素的产生减少，并且的确，此时患子宫内膜癌的风险较高。
[0021] 例如，体外和体内实验(6，8)研究表明，褪黑激素具有很强的抗氧化作用，所述作用在保护细胞免受由于羟基自由基的毒性以及其它代谢细胞产物(来源于退化或增殖代谢中的改变、以及来源于或为了脂质氧化)而导致的氧化损伤方面比甘露醇、谷胱甘肽和维生素E更高。
[0022] 此外，褪黑激素(9-10)具有更重要的抗雌激素性质，并且刺激与雌激素本身的作用相反的孕酮的产生(高水平的雌激素与辅助生殖技术最差的结果相关)(11)。
[0023] 在这方面，指出在MAR周期中通过促性腺激素诱导的超排卵使得高雌激素化并造成子宫内膜增生增加，这是上述提到的子宫内膜癌的重要风险因素。
[0024] 一些研究者(12)认为，在人绒毛膜促性腺激素(HCG)和褪黑激素之间存在协同作用，的确，在人绒毛膜促性腺激素的排卵高峰后6-7天，通过特别是增加孕酮的产生(体内和体外)会提高褪黑激素的水平。
[0025] 在这方面，强调了褪黑激素的排卵后高峰是如何与子宫内膜植入窗以及胚泡的形成(胚胎生长的阶段，其中发生着床入子宫)保持完全同步的。褪黑激素与孕酮之间的正相关性以及褪黑激素与雌二醇之间的负相关性会被hCG加强。的确，在后者缺乏的情况下，褪黑激素对孕酮产生的影响非常弱。
发明内容
[0026] 本发明的一个目的是提供N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，其通过给需要治疗的雌性哺乳动物受试者进行有效量的局部给药而用于在医疗或兽医领域的辅助生殖中防止植入子宫失败。
[0027] 优选地，所述N-乙酰基-5-甲氧基色胺的类似物选自阿戈美拉汀、6-羟基-褪黑激素、5-羟色胺、5-羟色氨酸或它们的衍生物。
[0028] 在本发明的一个优选的实施方案中，所述雌性哺乳动物受试者为患有不孕或频繁流产的女性。
[0029] 根据另一个优选的实施方案，N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物(优选N-乙酰基-5-甲氧基色胺)的局部给药通过子宫内膜灌洗、或子宫清洗或子宫内膜清洗进行。
[0030] 根据本发明的另一个优选的实施方案，所述局部给药在取卵时通过单次给药进行。
[0031] 优选地，所述活性成分的存在浓度为4×10-9g/ml至25×10-9g/ml，优选大于或等-9于10×10 g/ml。
[0032] 在可供选择的实施方案中，可以从取卵之日起基于N-乙酰基-5-甲氧基色胺、HCG或孕酮、或它们的组合进行同步系统治疗。
[0033] 在本发明的可供选择的优选实施方案中，辅助生殖技术选自基本由或由以下技术组成的组中：I级技术，其简单并且不如目标性交或宫腔内人工授精那么具有侵入性；以及更为复杂和侵入性的II或III级技术，选自体外受精(IVF)、体外受精与胚胎移植(FIVET)、卵胞浆内单精子注射(ICSI)、卵胞浆内形态选择精子注射(IMSI)和Tesa-Tese技术(睾丸精子抽吸术)。
[0034] 人工授精主要是指宫腔内人工授精(IUI)技术，这是一种医学辅助生育技术，其中精液被引入子宫腔内。它可以在宫颈粘液和精液之间不相容的所有情况中建议使用，在这个过程中其允许超过宫颈长度，并将精子直接植入子宫。此外，其用于不明原因的不育、轻度和中度的男性不育症、通过刺激排卵和目标性交诱导怀孕反复失败、以及不能完成性交的性障碍的情况中。
[0035] 体外受精与胚胎移植(FIVET)是一种MAR技术，其中，提取人的配子，进行培养，在完成受精并产生一个或多个胚胎后，这些胚胎被转移到子宫中。这种技术建议用于以下情况中：
[0036] -获得性或先天性输卵管病变；
[0037] -中度男性不育症；
[0038] -Ⅲ或Ⅳ级子宫内膜异位症；
[0039] -不明原因不孕；
[0040] -解冻后而与精液质量有关的冷藏精液；
[0041] -I级技术治疗失败；
[0042] 刺激排卵后，在局部麻醉和/或深度镇静的状态下，经回声探测控制通过经阴道手术提取(拾取)卵母细胞，进行精子的准备，然后选择受精的卵母细胞。接下来，准备配子的体外培养，验证受精成功后，将一定数量的胚胎转移到子宫中。
[0043] 卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)要经过FIVET的各个步骤。此情况也是体外受精，但其是通过对卵母细胞胞浆内进行单精子注射来实现的。然后，受精发生后，将胚胎转移到子宫中。
[0044] 这项技术建议用于以下情况：
[0045] -重度男性不育；
[0046] -阻塞性和分泌性无精子症(睾丸精子或附睾)；
[0047] -在之前的体外受精(IVF)周期中失败或受精几率低；
[0048] -解冻的卵母细胞；
[0049] -卵母细胞数量降低；
[0050] -解冻后而与精液质量有关的冷藏精液。
[0051] 这项技术还可以在自发周期下进行，或者通过诱导多个卵泡生长而进行，在刺激卵巢产生更多的卵泡并由此得到更多的卵母细胞之后，通过阴道手术进行卵母细胞的提取(拾取)。拾取和精子的准备同步进行是非常有效的。在无精子症的情况中，用于提取精子的技术有：睾丸精子经皮抽吸术(TESA)，睾丸取精术(TESE)，显微外科附睾精子抽吸术(MESA)、经皮附睾精子抽吸术(PESA)。
[0052] 随后，准备卵母细胞，通过卵胞浆内单精子显微注射的方法使卵母细胞受精。验证每个卵母细胞受精后，将胚胎转移到子宫中。
[0053] 本发明的另一个目的涉及一种适合局部给药的组合物，所述组合物包含对需要治疗的雌性哺乳动物受试者有效量的N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物、或者它们的组合作为活性成分、以及一种或多种生理学可接受的赋形剂或佐剂，所述组合物用于在医疗或兽医领域的辅助生殖中防止植入子宫失败。
[0054] 优选地，所述组合物中的所述活性成分的存在浓度为4×10-9g/mL至25×10-9g/ml-9之间，优选大于或等于10×10 g/ml。
[0055] 根据优选的实施方案，上述组合物中的所述活性成分以在细胞培养基中的子宫内-9 -9膜/子宫灌洗剂/清洗剂的形式配制，并且终浓度为4×10 g/ml至25×10 g/ml之间,优-9
选大于或等于10×10 g/ml。
选大于或等于10×10 g/ml。
[0056] 这种用于胚泡的培养基可以优选包含以下成分：
[0057] -D-葡萄糖源；
[0058] -抗生素，优选庆大霉素；
[0059] -人血清白蛋白；
[0060] -必需氨基酸或非必须氨基酸，优选L-牛磺酸；
[0061] -缓冲盐，优选选自以下物质中：
[0062] -钙盐：乳酸钙，泛酸钙；
[0065] -镁盐：氯化镁，硫酸镁
[0066] -水：
[0067] pH在7.5和7.8之间
[0068] 根据优选的实施方案，所述培养基可以为Sydney 胚泡培养基。
[0069] 根据本发明可供选择的实施方案，上述组合物中的所述活性成分以在生理溶液中-9的子宫内膜灌洗剂、子宫内膜清洗剂或子宫清洗剂的形式配制，并且终浓度为4×10 g/ml-9 -9
至25×10 g/ml，优选大于或等于10×10 g/ml。
至25×10 g/ml，优选大于或等于10×10 g/ml。
[0070] 在女性中，已经普遍使用了清洗宫腔的方法，其主要目的是进行非侵入性产前诊断，其相对于羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样等传统侵入性方法是革新性的[(13)(14)]。近几年，这种技术已经应用于在辅助生殖的周期中将胚胎转移之前评价宫腔的条件。这种方法的应用在于将缓冲液注入子宫中以达到收集子宫分泌物并评价它们的有机和无机生物成分的目的。其具有确定可能预测植入成功的标记物的目的[(15)(16)(17)(18)]。
[0071] 还优选的是，适合通过子宫冲洗而局部给药的所述组合物还包含必需和非必需氨基酸、以及缓冲盐。优选地，所述缓冲盐为钙、钠、钾、和镁的盐，以及它们的混合物。使用缓冲盐和氨基酸是为了使配制物的pH在7和8之间(优选在7.5-7.8之间)，从而复制适合胚胎的微环境(并且与被转移到子宫之前胚胎生长的培养基的微环境相似)。
[0072] 根据可供选择的实施方案，本发明的组合物可配制成适用于子宫给药的凝胶，更准确地说为适合宫腔原位给药的凝胶，并且优选用为子宫内“T”形器械的医疗器械进行。还可以预见用于粘膜给药的缓释型凝胶制剂。
[0073] 考虑到上述提到的子宫清洗技术是一种无创的操作，并且通过机械地去除分泌物(可能会改变植入环境)可以恢复子宫的生理条件，本发明的另一个目的还涉及用于子宫清洗的医疗器械，包括预装填或待装填上述组合物的无菌容器。
[0074] 更确切地说，本发明所用的器械可以在使用时装填适用于子宫或子宫内膜清洗的含有本发明所涉及的褪黑激素或其类似物等活性成分的无菌溶液，或者可以装填在使用时再添加活性成分的无菌溶液。
[0075] 根据优选的实施方案，所述无菌容器是一次性的。更优选地，所述无菌容器(优-9选为一次性无菌容器)预装填有生理溶液，其中添加有褪黑激素(浓度为4×10 g/mL至-9 -9
25×10 g/mL，优选大于或等于10×10 g/mL)、缓冲盐和氨基酸以使配制物的pH值介于7-8之间，优选介于7.5-7.8之间。
25×10 g/mL，优选大于或等于10×10 g/mL)、缓冲盐和氨基酸以使配制物的pH值介于7-8之间，优选介于7.5-7.8之间。
[0076] 在用回声引导进行拾取之后，子宫清洗应当借助于导管进行。接下来的胚胎转移或植入应当平均在子宫清洗后三天进行(2-5天)
[0077] 因此，根据本发明的优选实施方案，本发明的医疗器械还可以包括无菌柔性导管，该导管优选具有一个末端孔。
[0079] 另外，所述医疗器械可以附有用于在各种MAR技术中使用的说明。
[0080] 所述医疗器械的目的是移除相应MAR技术过程中的刺激而产生的氧化剂物质和可能的分泌产物，从而恢复子宫内膜渗出物的生理组成。其目的在于避免这些氧化剂物质和分泌产物降低接受MAR的患者的植入百分比。如上文所述，使用缓冲盐和氨基酸是为了使pH介于7-8之间，优选介于7.5-7.8之间，从而复制适合胚胎的微环境。除了在本发明中示出的效果之外，添加褪黑激素还发挥很强的抗氧化作用，以及使子宫内膜细胞免受由于毒性自由基和其它分解代谢产物所引起的氧化损伤的保护作用。
[0081] 优选地，所述一次性无菌容器选自用于自注射器械/笔的注射器、配送器、药盒(cartridge)。
[0082] 根据本发明特别优选的实施方案，注射器为由聚碳酸酯或硼硅酸盐玻璃制成的3ml luer锁紧套口(luer-lock)型注射器。当使用luer锁紧套口型注射器时，与本发明所提供的医疗器械连接的子宫内导管可以具有用于与所述注射器相配合的luer锁紧套口接头。
[0083] 可供选择地，如果使用自注射系统或笔型注射器(胰岛素型)，可以使用硼硅酸盐玻璃制成的3ml玻璃药盒。
[0084] 还优选地，所述一次性无菌容器预装填有1.5ml体积的清洗溶液，其包含：
[0085] -10×10-9g/ml(10ng/ml)褪黑激素；
[0086] -必需和非必需氨基酸；
[0087] -钙盐；
[0088] -钾盐；
[0089] -镁盐；
[0090] pH介于7.5-7.8之间，同渗浓度介于280-290mOsm/kg之间。
[0091] 本发明的另一个目的涉及上文所示例的医疗器械用于在医学辅助生殖流程中的取卵时以子宫内膜清洗的形式单次给药。
[0092] 本发明还涉及用于体外或体内的细胞培养基，包含以下成分：
[0093] -D-葡萄糖源；
[0094] -抗生素，优选庆大霉素；
[0095] -人血清白蛋白；
[0096] -必需或非必需氨基酸，优选L-牛磺酸；
[0097] -钙盐：乳酸钙，泛酸钙；
[0099] -钾盐：氯化钾，磷酸钾；
[0100] -镁盐：氯化镁，硫酸镁；
[0101] -水；
[0102] 其特征在于还包含N-乙酰基-5-甲氧基色胺或其类似物，或者它们的组合，其中-9 -9 -9所述活性成分的存在浓度为4×10 g/ml至25×10 g/ml，优选大于或等于10×10 g/ml。
[0103] 本发明的另一个目的涉及一种用于胞饮突生长和实现体外模型研究的细胞培养基。
[0104] 通过获得(例如)用于将胚胎转移至子宫的培养基，所述细胞培养基还可以用于胚胎培养，由此所述培养基被注入子宫中。
[0105] 本发明的应用的特别有益的方面涉及所提出的局部给药途径(其不抵触MAR治疗周期)，所述途径的侵入性比已经应用于接受MAR周期的女性的子宫内膜活组织检查(13)小的多。
[0107] 以下特别参照附图和两个优选的实施方案对本发明进行示例性的而非限制性的描述，其中：
[0108] 图1示出使用本发明的组合物处理之前的子宫内膜，因此其没有胞饮突；
[0109] 图2示出使用本发明的组合物处理后1/2天的子宫内膜：开始观察到胞饮突的形成；
[0110] 图3示出使用本发明的组合物处理后3/4天的子宫内膜：胞饮突最大生长；
[0111] 图4示出使用本发明的组合物处理后5/6天的子宫内膜：胞饮突开始分裂，看起来不规则(细胞凋亡)；
[0112] 图5示出在H2O2浓度为20μM和200μM条件下，褪黑激素、阿戈美拉汀和6-羟基-9褪黑激素(170nM，对应40×10 g/ml)的抗氧化活性的FACS分析(荧光强度检测)结果；
[0113] 图6示出在不同浓度的褪黑激素、阿戈美拉汀和6-羟基褪黑激素(80nM，170nM，-9 -9 -9340nM，分别对应于18×10 g/ml，40×10 g/ml，80×10 g/ml)下进行的细胞凋亡分析(％细胞死亡)的结果。
具体实施方式
[0114] 以下仅仅是示例而非限制本发明地描述本发明的作者所进行的比较研究(体外和体内)，以评价在MAR技术中使用褪黑激素的不同溶液进行人胚胎植入的百分比增长情况。
[0115] 实施例1：体内实验
[0116] 材料和方法：
[0117] 用于子宫内膜清洗的褪黑激素溶液
[0118] 所用的褪黑激素(或N-乙酰基-5-甲氧基色胺；CAS编号73-31-4)得自Farmalabor，产品呈粉末状，标明≥99％。
[0119] 进行了两个临床试验，其中通过子宫内膜清洗施用了在以下物质中的褪黑激素-9(浓度10×10 g/ml)：
[0120] 1)培养基Sydney 胚泡培养基，由Cook Ireland公司提供(货号G20722和G20929)(临床试验1)。此培养基通常用于体外改善胚泡的分裂、分化和生长。培养基中含有D-葡萄糖、所有20种必需L-氨基酸、L-牛磺酸、庆大霉素、人血清白蛋白、乳酸钙、泛酸钙；氯化钠、碳酸氢钠和丙酮酸钠；氯化钾、磷酸钾；氯化镁、硫酸镁；纯水。培养基的其它特征：
[0121] pH值：7.5-8.0(使用碳酸氢盐缓冲液)
[0122] 同渗浓度：280-290mOsm/kg
[0123] 内毒素：＜0.4EU/ml
[0124] MEA：≥80％
[0125] (2)生理溶液(临床试验2)
[0126] 统计分析
[0127] 进行了多变量线性回归统计学分析(IMPRUN.TXT)。
[0128] 统计方法
[0129] 通过非条件Logistic回归并根据母体的年龄进行校正来计算所植入的胚胎的数目、质量和该胚胎用包含褪黑激素的溶液进行清洗的过程对怀孕机率增加的影响。
[0130] 和各程序(胚胎的数量、质量和使用含有褪黑激素的生理盐水或胚泡培养基的洗涤过程)相关的怀孕机率与分别参照较低的胚胎数目(一个)、低于最佳胚胎质量的植入胚胎、或未进行清洗过程相关的怀孕几率之间的比值被定义为优势比(OR)，其是通过非条件Logistic回归并根据母体的年龄进行校正来计算的。
[0131] 在logistic回归中，OR对应于在与回归模型中的各共变量相关的回归系数β的自然基础上的反对数。
[0132] 因此，由此计算的值表示通过各程序所获得的有益效果，而不考虑其它条件。
[0133] 通过公式Wald(eβ±(zα/2*seβ))计算OR的95％双尾置信区间。
[0134] 无菌控制(培养基)
[0135] 为了对添加有褪黑激素的培养基进行无菌控制，使用BACT/ALERT 3D-60设备(BIOMERIEUX)。将BACT/ALERT培养的瓶子用于定性回收和检测血液和其它体液(在本实验中常规灭菌并用作胚泡培养基)中的任选厌氧和好氧(细菌)的微生物检测系统。
[0136] 微生物检测的BACT/ALERT系统用于检测怀疑菌血症的血液样品或其它液体样品(在本发明中常规灭菌并用作胚泡培养基)中是否存在微生物。BACT/ALERT系统和培养瓶提供了微生物检测系统以及具有适合于普遍存在于常规灭菌的血液感染和其它液体中的微生物的环境和营养条件的培养基。
[0137] 接种瓶(最小5ml到最大10ml)在所述设备中孵育，并且进行连续监测以检测BACT/ALERT瓶中微生物可能生长的情况。
[0139] 可能存在于样品中的微生物代谢培养基中的底物而产生二氧化碳。微生物的生长所产生的CO2导致位于各培养瓶底之上的气体渗透性蓝绿色传感器变为黄色。
[0140] 较浅的颜色表示系统的监测反射率的单位增加。
[0141] 所述设备每十分钟监测并追踪瓶子的反射率。
[0143] 直到Bact/ALER设备报告培养瓶为阳性或阴性，否则不需要进行干涉。
[0144] 在进行任何子宫内膜灌洗液之前，都进行了2-4-6天的培养测试以检测无菌状态，一旦发现阴性培养物，则将其用于子宫。
[0145] 内容标准
[0146] 使用严格的内容标准选择参与研究的患者人群：
[0147] 3)年龄≥20且＜44岁
[0148] 4)体质指数(BMI)≥20且≤28kg/m2
[0149] 5)基础FSH≤19UI/L
[0150] 6)男性和女性因素
[0151] 患者
[0152] 在知情同意之后，对参与所有两个临床研究的患者进行辅助生殖。
[0153] 在该第一两组随机多中心临床研究(对照组和研究组)中，每组包括约430个患者。
[0154] 接受辅助受精的患者在取卵时被随机分成三组：
[0155] A组：430例患者进行1.5ml生理溶液的子宫内膜灌洗(对照组)。
[0156] B组：436例患者进行1.5ml添加有终浓度为10x10-9g/ml的褪黑激素的培养基溶液的子宫内膜灌洗。
[0157] C组：患者不进行子宫内膜灌洗。
[0158] 患者参与的该项研究在几个专攻MAR的私人中心进行，例如BRA中心、都灵和卡利亚里的Promea中心、佩鲁贾的Genera中心和巴里的综合公共中心。已经把经过无菌测试的含有褪黑激素的培养基送到了这些中心以用于以后的治疗流程。
[0159] 在通过在取卵时使用已知浓度的褪黑激素(终浓度为10x10-9g/mL)进行子宫内膜灌洗液以进行辅助受精的体内准备之后，对患者进行相关的超声引导以使其子宫底部形成的液体层的直径可视化。
[0160] 涉及单预期中心的第二临床研究包括对照组的64例患者和实验组的92例患者。
[0161] 在所述研究中，在取卵之后，通过在患者的子宫腔内进行子宫内膜清洗而施用褪黑激素的无菌生理溶液。
[0162] 子宫内膜清洗
[0163] 简单来讲，这种处理涉及使用混有终浓度为10x10-9g/ml的褪黑激素的生理溶液或培养基在宫腔内进行无细胞共培养的子宫内膜灌洗(之前的研究以1/3和1/2的终浓度进行，但没有给出相同的结果-数据中未显示)。
[0164] 取卵之后(时间对应于MAR流程中HCG处理后的排卵期)，在阴道止血后，将2.5ml的无菌注射器连接到具有顶端开口的单腔宫内导管，并且吸入培养基(胚泡培养基)或生理溶液，通过调节褪黑激素的添加使体积达到1.5ml。
[0165] 在生理溶液的情况中，导管可以预先装填添加有褪黑激素的生理溶液。
[0166] 按照常规的胚胎转移(ET)操作的相同步骤将导管引入子宫口内。
[0167] 然后，将添加有褪黑激素的盐溶液或改良的培养基缓慢注入，在灌洗结束时，宫腔内液体层的厚度通过经腹部回声测量(清洗和超声检测必须同步进行，液体层到达约10毫米，然后又很快消失)
[0168] 结果
[0169] 临床研究1
[0170] 多中心体内研究涉及863例患者，她们接受辅助受精和褪黑激素子宫内膜灌洗液(回声测量液体层)，在3-4天后，进行胚胎转移。
[0171] 随后，通过95％多变量线性回归统计分析(IMPRUN.TXT)计算CI(置信区间或信任区间)。
[0172] 单变量分析显示，植入3个胚胎暗示显著增加，等于大约3倍的怀孕几率(OR＝2.8，IF 95％1.7-4.4)。
[0173] 2个胚胎的数目似乎不足以提高怀孕的几率(OR＝1.0，IF 95％1.7-4.4)。
[0174] 另一方面，植入胚胎的最佳质量似乎也是一个增加怀孕几率的重要因素(OR＝2.9，IF 95％1.8-4.7)。在单变量分析中，相同的关联率似乎与所使用灌洗程序相关(OR＝
2.2，IF 95％1.6-2.9)。
2.2，IF 95％1.6-2.9)。
[0175] 多变量分析可以控制每个变量的独立影响，因此完全排除其它所用程序的影响和母亲年龄的影响。在这种情况下，使用清洗程序可以使怀孕成功率变为2倍(OR＝2.2，IF95％1.6-3.0)。
[0176] 类似的改善似乎与植入3个胚胎相关，而不是植入单一的胚胎(OR＝2.1，IF 95％1.2-3.7)，还与使用质量最优的胚胎相关(OR＝1.9,IF95％1.1-3.3)。
[0177] 因此，使用上文所述的所有三个程序似乎是辅助受精过程的最佳选择。
[0178] 总之，体内研究已经证明了，与没有显著差异的其它两组相比，使用褪黑激素进行子宫内膜细胞的灌洗或清洗可以使怀孕的数目加倍。
[0179] 临床研究2
[0180] 单中心研究包括对照组64例患者和实验组92例患者。
[0181] 患者接受辅助生殖，并且用褪黑激素的无菌盐溶液进行子宫内膜清洗(回声检测液体层)，3-4天之后进行胚胎转移。
[0182] 该研究的主要目的是由于胚胎转移(ET)的临床妊娠率(胎心)；次要目的是继续妊娠率和流产率。
[0183] 实验组的临床妊娠率等于37％而对照组的是17.2％；实验组继续妊娠率是32.6％，对照组的是14.1％。
[0184] 实验结果如下表所示：
[0185] 表1：
[0186]
[0187] 用含有褪黑激素的不同溶液进行子宫内膜清洗使得实验组不孕女性群体的临床妊娠率和继续妊娠率为对照组的两倍。
[0188] 数据似乎证实，使用含有褪黑激素的生理溶液清除子宫内膜渗出物可以建立子宫内膜生理环境，并改善植入的成功率。
[0189] 这使得可以得到用于提高辅助生殖技术(ART)的植入率的全新有效的方法。
[0190] 实施例2：体外研究
[0191] 材料和方法
[0192] 所用褪黑激素和培养基与体内研究所使用的相同。
[0193] 电子显微镜(SEM)
[0194] 使用场发射高分辨率电子显微镜，FE HITACHI S 4000model，在15-20KW下运行。
[0195] 样品准备
[0196] 在从患者取出之后，立即将大小约为1mm的小片子宫内膜组织放到含有1％多聚甲醛和0.5％戊二醛的用0.1M二甲胂酸盐缓冲的固定液中，pH为7.2，放置3小时。
[0198] 将准备的样品避光放置3小时，然后在PBS中仔细旋转清洗，每20分钟换一次溶液，换4次。
[0199] 随 后，用 浓 度 连 续 递 增 的 丙 酮 对 组 织 样 品 进 行 脱 水，对 于50％-70％-80％-90％-95％每个梯度，1小时换3次，最后用纯丙酮换2次。
[0202] 生物样品
[0203] 经知情同意后，将取自接受诊断性宫腔镜的患者的子宫内膜碎片进行培养。
[0204] 对每一例患者，组织分为两部分：一部分组织放到无褪黑激素的常规胚泡培养基中进行培养；另一部分组织放到添加褪黑激素的常规胚泡培养基中进行培养。
[0205] 培养设置
[0206] 子宫内膜与褪黑激素一起进行体外培养(通过宫腔镜取自接受预辅助受精控制的患者)3-6天，通过电子显微镜(SEM)对胞饮突进行相关的可视化。
[0207] 结果
[0208] 体外研究表明，与对照培养相比，在试管中对子宫内膜组织和永久添加的褪黑激素共培养3-5天，胞饮突有明显的增加(在电子显微镜(SEM)下)，不论病人的年龄、自然月经周期或由超排卵药物刺激控制的月经周期均是如此。这些胞饮突是被认为是最重要的植入标记的结构，对每个女性来说，其存在48小时(有5天的变化，即，女性可以有26天后月经的短周期或33天后月经)。事实上，怀孕成功有2/3取决于正确的植入时刻，另外1/3取决于胚胎的质量。
[0209] 电子显微镜SEM下检测显示，添加褪黑激素会导致胞饮突的完整形态表达，如图1-4所示。
[0210] 本文概述了胞饮突在植入窗过程中的重要性，以及在培养基中添加褪黑激素会导致它们的表达增加。
[0211] 实施例3：褪黑激素及其类似物对子宫内膜细胞系HEC-1-A的氧化和凋亡的影响的研究
[0212] 测试的成分
[0213] 用于与褪黑激素(M5250)比较的褪黑激素类似物为阿戈美拉汀(A1362)和6-羟基褪黑激素(H0627)，均购自Sigma Aldrich公司。
[0214] 它们以不同的浓度使用(即，40nM、80nM、170nM和340nM，分别对应于9.4x10-9g/-9 -9 -9ml,18x10 g/ml,40x10 g/ml和80x10 g/ml)。
[0215] 细胞系
[0216] HEC-1A细胞通过ATCC获得，其培养参照提供者的说明。
[0217] HEC-1-A是H.Kuramoto从腺癌患者中分离到的一种稳定的上皮细胞系(21)，其为体外研究子宫内膜上皮细胞提供了一个非常有价值的模型(22)。
[0218] 抗氧化活性分析
[0219] 用170nM(40ng/ml)褪黑激素，6-羟基褪黑激素和阿戈美拉汀以及两种不同浓度的H2O2(20和200mcg/ml)培养HEC-1-A细胞系。
[0220] 按照之前Italiano等(23)所述，反应性氧化剂物质(ROS)通过FACS进行检测，进行两个独立的重复测量。
[0221] 结果
[0222] 在20mcg/ml H2O2浓度下，褪黑激素及它的两种类似物对体外细胞系模型表现出相同的抗氧化作用。
[0223] 当H2O2的浓度升高到200mcg/ml时，褪黑激素和阿戈美拉汀持续保护细胞系免受氧化，但是6-羟基褪黑激素却不能。然而，当6-羟基褪黑激素的剂量增加至340nM时，这种类似物实现了抗氧化效果(数据未显示)。
[0224] 结果如图5所示。
[0225] 这些结果与Duan等(24)发表的褪黑激素在不同的细胞模型中的抗氧化作用的数据一致，并且表明所分析的褪黑激素和其类似物至少在20mcg/ml H2O2用于子宫内膜细胞系时有类似的效果。
[0226] 细胞凋亡检验
[0227] 子宫内膜细胞的凋亡(％细胞死亡)是在细胞培养过程中普遍观察到的一种生理现象，比率为10-20％。
[0228] 为了确定褪黑激素及其类似物在此特定的实验条件下是否会导致细胞死亡，我们分别用340nM(80ng/ml)褪黑激素，170nM(40ng/ml)6-羟基褪黑激素和80nM(18.8ng/ml)阿戈美拉汀对HEC-1-A细胞系处理24小时。
[0229] 凋亡水平利用碘化丙啶染色和FACS分析进行检验。所进行的两个实验中的一个示出了sub-G1事件的百分比。
[0230] 结果
[0231] 在所有检测浓度下，褪黑激素均表现出对凋亡的保护作用。阿戈美拉汀在170nM和340nM下具有保护作用，而6-羟基-褪黑激素在浓度高达170nM时没有显示出对细胞凋亡有影响。结果在图6中示出。
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