技术领域
[0001] 本
发明涉及医学
图像处理及应用技术领域，尤其是指一种在光学显微注射过程中人类卵母细胞分割实现方法。
背景技术
[0002] 细胞显微注射是
生物基因工程中的重要技术手段。本发明主要研究在ICSI(Intra Cytoplasmic Sperm Injection)即卵胞浆内单精子显微注射过程中，人类卵细胞的
细胞质、极体和注射针的分割问题。从卵母细胞中分割出细胞质和极体，不但能够帮助专家分析卵母细胞成熟度(如直径、颗粒度、透明带的厚度、极体直径、卵周隙尺寸等)，而且有助于ICSI自动化实现和成功率的提高，并减少对人工操作的高难度要求和依赖。
[0003] ICSI注射的情景如图6所示。主要分为卵细胞、注射针和
吸附针三个对象。其中，卵细胞周边模糊区域为放射冠，放射冠内侧黑色曲线带为透明带，透明带所包围的物质为细胞质，细胞质的上方圆形颗粒状物质为细胞的极体；左侧的吸附针用来吸附和固定卵细胞；右边长细条状的注射针实现精子的运输和注射。在ICSI过程中需要确保注射针正确刺入细胞的
位置，同时不损害细胞的极体，并判断是否真正刺穿细胞质。所以，实现上述分割至为重要。
[0004] 经对
现有技术的文献检索发现，近年来实现细胞显微注射的自动化是当前的重点研究方向。在实验装置的研发上，国内外已有学者展开
基础研究工作Ladjal H等人在论文《Micro-to-Nano biomechanical modeling for assisted biological cell injection》(IEEE Transactions on Biomedical Engineering,2013,(60)9:2461-2471)，以及田桂中等人在论文《显微注射中细胞
位姿调节技术及实验研究》(中国机械工程,2009,20(4):500-503)中，分别介绍了所搭建的基于光学显微的注射平台。
[0005] 而在卵母细胞的选择方面，Manna等人在论文《Artificial intelligence techniques for embryo and oocyte classification》(Reproductive biomedicine online,2013,26(1):42-49)中，使用纹理特征实现对卵母细胞的分类和选择，为下一步ICSI提高成功率做准备。Basile等人在论文《Atexture-based image processing approach for the description of human oocyte cytoplasm》(Instrumentation and Measurement,IEEE Transactions on,2010,59(10):2591-2601)中，通过图像预处理从细胞质中心开辟出一
块矩形区域，经Har
小波变换后提取卵母细胞的多个统计纹理特征，再用FCM(Fuzzy C-Means)聚类实现不同程度颗粒度的卵母细胞分类。Caponetti等人分别在论文《Multiresolution texture analysis for human oocyte cytoplasm description》(Medical Measurements and Applications,2009.MeMeA2009.IEEE International Workshop on.IEEE,2009:150-155)和论文《Fuzzy mathematical morphology for biological image segmentation》(Applied Intelligence.2014:1-11)中，先用模糊数学方法实现分割，并结合纹理特征实现卵母细胞分类。但Basile和Caponetti的预处理均运用Hough变换实现圆形细胞质的预分割，无法应用到细胞形变的情况，并且没有分割出细胞的极体。 等人在论文《Elevated active contour with global image energy based on electrostatic force》(Zeszyty Naukowe PolitechnikiInformatyka,2010:5-21)中提出了一种基本外部静电
力驱动的全局活动轮廓蛇模型，虽然分割出了细胞质的轮廓，但要手动初始化演化轮廓，且没有实现细胞极体的分割。
[0006] 对于注射针的运动控制，Zhang等人在论文《Controlled aspiration and positioning of biological cells in a micropipette》(IEEE Transactions on Biomedical Engineering,2012,59(4):1032-1040)中，基于显微视觉研究了对注射针移动的闭环控制方法，同时实现注射针内的精子运动的
定位和
跟踪。
[0007] 综上所述，ICSI的各种实验装置和卵母细胞的特征分析吸引了学者的关注，但是对于细胞显微注射过程中卵母细胞的分割和定位问题却少有研究，而这又是细胞显微注射自动化关键所在。故本文重点研究ICSI过程中细胞质、注射针和卵细胞极体分割。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的不足与
缺陷，提供一种有效、可靠的在光学显微注射过程中人类卵母细胞分割实现方法，能在普通
硬件条件下实现人类卵母细胞分割。
[0009] 为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种在光学显微注射过程中人类卵母细胞分割实现方法，包括以下步骤：
[0010] 1)根据人类卵母细胞形状差异性，采用骨架形态学算子提取感兴趣目标ROI；
[0011] 2)采用改进的模糊聚类方法，依据局部灰度和局部方差特征对边界模糊和噪声较大的预处理图像进行粗分类；
[0012] 3)在模糊聚类的基础上设定
水平集初始化位置和演化控制参数，实现细胞质、极体和注射针的分割；
[0013] 4)针对细胞质内的部分注射针图像，采用直线拟合，标记出完整注射针图像。
[0014] 在步骤1)中，根据人类卵母细胞形状差异性，采用骨架形态学算子提取感兴趣目标ROI，其过程为：首先，用OTSU方法得到完整二值图像，而后做膨胀运算，再经二值骨架化，完整地提取细胞质、卵母细胞的极体和吸附针的轮廓，其轮廓宽度为一个
像素，同时将吸附针骨架化为单像素直线，骨架化的图像只有细胞质是连通的，易于填充和标记；其次，通过区域填充和标记，而后使用规则
滤波器，把卵母细胞的细胞质从周边的对象背景中分开出来；最后，提取出感兴趣目标ROI。
[0015] 在步骤2)中，所述改进的模糊聚类方法是加入局部灰度和局部方差特征，使得当前中心点像素的分类由其近邻域内的像素的分类标记共同决定，从而实现细胞质、极体和细胞内注射针的粗分类，其过程如下：
[0016] 假设采集到的实际图像y由真实图像x和偏置域b组成，且b在局部范围内是缓慢变化的，图像y共计有N个像素，则有：
[0017]
[0018] 那么，对标准的FCM目标代价函数整改如下：
[0019]
[0020] 其中，p是模糊隶属度加权指数，影响最终分类的模糊程度；Nk表示以xk为中心的近邻域；NR表示Nk中像素的个数；α是近邻域的控制参数，取值反比于图像的
信噪比，将上式(1)代入有：
[0021]
[0022] 使用Lagrange乘子求上式的最优问题：
[0023]
[0024] 其中，Dik＝||yk-bk-vi||2，
[0025] 分别对uik、vik求一阶偏导数并令结果为0，可得隶属度 和聚类中心 同理，对偏置域bk估计，求一阶偏导数并令其结果为0，可以求得：
[0026]
[0027]
[0028]
[0029] 在步骤3)中，结合模糊聚类结果，实现水平集位置的初始化和设置水平集演化参数，将模糊聚类的结果用作无需初始化的变分水平集演化的方向和速度参数，使得在轮廓边界可以自动决定演化方向，准确跟踪边界位置，从而实现目标的正确分割；变分方程如下：
[0030]
[0031] 其中，φ为水平集函数，右边三项分别为惩罚项、零水平集曲线长度正则项和
加速曲线演化的面积项；系数分别为μ、λ和ν；g是边缘指示函数，δ(φ)是单变量Dirac函数，H是奇对称Heaviside函数；通过Euler-Lagrange变分法，使用标准的
梯度下降法求解模型中
能量函数最小化；获取水平集的演变方程为：
[0032]
[0033] 其中，系数ν取值的正负决定初始轮廓相对于待分割目标做收缩或膨胀演化，以及演化的速度，对于实际分割问题，期望远离目标边界时，演化速度快，反之，演化慢；当轮廓跨过目标边界时，可以自动改变演化方向，而非一成不变；因此，自适应的改变系数ν取值更适合实际分割需求，令模糊聚类隶属度的图像为R那么有：
[0034] νk＝G(Rk)＝1-2Rk,Rk∈(0,1) (10)
[0035] 水平集的演变方程更新为：
[0036]
[0037] 其它参数的选取：
[0038]
[0039] 水平集初始化及其演化如下：
[0040] 假定
选定模糊聚类隶属度的图像为R，设定一个可调整的
阈值b0∈(0,1)，得到一个二值图像Bk：
[0041]
[0042] 那么，水平集初始化函数达为：
[0043] φ0＝-4ε(0.5-Bk),ε＝1.5 (13)。
[0044] 本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
[0045] 1、在ICSI即卵胞浆内单精子显微注射过程中，用本发明方法能有效实现人类卵母细胞的细胞质、极体和注射针的分割问题，有助于自动化实现和成功率的提高，并减少对人工操作的高难度要求和依赖；
[0046] 2、采用改进的模糊聚类
算法改进传统FCM对噪声敏感的问题，加入局部灰度和局部方差特征，使得当前中心点像素的分类由其近邻域内的像素的分类标记共同决定，从而实现细胞质、极体和细胞内注射针的粗分类，内部基本平滑，很少的颗粒和虚泡，边界相对清晰；
[0047] 3、模糊聚类得到的结果可用于导出水平集演化的初始位置，减少曲线深化运算量，提高分割
精度，将聚类的结果用作无需初始化的变分水平集演化的方向和速度参数，使得在轮廓边界可以自动决定演化方向，准确跟踪边界位置。
附图说明
[0048] 图1为本发明所述人类卵母细胞分割实现方法的
流程图。
[0049] 图2a为图像预处理前的原图像。
[0050] 图2b为图像预处理时的骨架提取图。
[0051] 图2c为图像预处理后的预分割结果图。
[0052] 图3a为ROI图像采用改进的模糊聚类方法前的预分割图像。
[0053] 图3b为卵母细胞质和极体的聚类结果图。
[0054] 图3c为ROI图像中部分注射针的图像。
[0055] 图4a为水平集分割时的细胞质与极体的分割图像。
[0056] 图4b为水平集演化三维效果图。
[0057] 图4c为卵母细胞质内部一段注射针的分割结果图。
[0058] 图5a为注射针拟合时的注射针分割图。
[0059] 图5b为注射针拟合时的细胞内直线图。
[0060] 图5c为注射针拟合后的完整针图像。
[0061] 图6为背景技术中的ICSI注射情景图；
[0062] 图中：1为吸附针，2为细胞质，3为极体，4为细胞周隙，5为透明带，6为注射针。
具体实施方式
[0063] 下面结合具体
实施例对本发明作进一步说明。
[0064] 如图1所示，本实施例所述的在光学显微注射过程中人类卵母细胞分割实现方法，包括以下步骤：
[0065] 1)根据人类卵母细胞形状差异性，采用骨架形态学算子提取感兴趣目标ROI，具体为提取包含极体、一段注射针和细胞质的预处理图像；
[0066] 2)考虑到预处理图像强度不均和受噪声污染，采用改进的模糊聚类方法，依据局部灰度和局部方差特征对边界模糊和噪声较大的预处理图像进行粗分类，即实现细胞质、极体和细胞内注射针的粗分类；
[0067] 3)在模糊聚类的基础上设定水平集初始化位置和演化控制参数，实现细胞质、极体和注射针的正确分割；
[0068] 4)针对细胞质内的部分注射针图像，采用直线拟合，拟合出注射针的位置，标记出完整注射针图像。
[0069] 在步骤1)中，根据人类卵母细胞形状差异性，采用骨架形态学算子提取感兴趣目标ROI，考虑到细胞质透明带有两个像素宽度，本发明结合形态学算子和骨架提取的知识，实现目标的粗分割。二值图像骨架化可以将对象简化为线条，但不
修改图像的基本结构，同时良好地保留图像的基本轮廓。
[0070] 首先，用OTSU方法得到完整二值图像，而后做膨胀运算，再经二值骨架化，完整地提取细胞质、卵母细胞的极体和吸附针的轮廓，其轮廓宽度为一个像素，同时将吸附针骨架化为单像素直线，骨架化的图像只有细胞质是连通的，易于填充和标记；其次，通过区域填充和标记，而后使用规则滤波器，把卵母细胞的细胞质从周边的对象背景中分开出来；最后，提取出感兴趣目标ROI。
[0071] 在步骤2)中，采用改进的模糊聚类方法是加入局部灰度和局部方差特征，使得当前中心点像素的分类由其近邻域内的像素的分类标记共同决定，从而实现细胞质、极体和细胞内注射针的粗分类。
[0072] 对于图像预处理所提取的ROI图像，有三个分割对象：细胞质、极体和细胞质内一段注射针。由于ICSI图像数据是从光学
显微镜下采集到的，存在光照不均和噪声污染，而传统的FCM是一种全局均方差最小的代价函数，当出现异常点时，有较差的聚类结果。而噪声在现实生物医学图像中不可避免出现。通常解决思路是考虑加入局部特性，使得当前中心点像素的分类由其近邻域内的像素的分类标记共同决定，进而改进传统FCM对噪声敏感的问题。
[0073] 假设采集到的实际图像y由真实图像x和偏置域b组成，且b在局部范围内是缓慢变化的，图像y共计有N个像素，则有：
[0074]
[0075] 那么，对标准的FCM目标代价函数整改如下：
[0076]
[0077] 其中，p是模糊隶属度加权指数，影响最终分类的模糊程度；Nk表示以xk为中心的近邻域；NR表示Nk中像素的个数；α是近邻域的控制参数，取值反比于图像的信噪比，将上式(1)代入有：
[0078]
[0079] 使用Lagrange乘子求上式的最优问题：
[0080]
[0081] 其中，Dik＝||yk-bk-vi||2，
[0082] 分别对uik、vik求一阶偏导数并令结果为0，可得隶属度 和聚类中心 同理，对偏置域bk估计，求一阶偏导数并令其结果为0，可以求得：
[0083]
[0084]
[0085]
[0086] 在步骤3)中，结合模糊聚类结果，实现水平集位置的初始化和设置水平集演化参数，将模糊聚类的结果用作无需初始化的变分水平集演化的方向和速度参数，使得在轮廓边界可以自动决定演化方向，准确跟踪边界位置，从而实现目标的正确分割。
[0087] 模糊聚类得到的结果是一个粗略的理想分类，可用聚类结果导出水平集演化的初始位置，从而减少曲线深化运算量，提高分割精度。水平集方法易于结合先验知识来引导或
驱动轮廓的演化。Li等先验提出的无需初始化的变分水平集方法，变分方程如下：
[0088]
[0089] 其中，φ为水平集函数，右边三项分别为惩罚项、零水平集曲线长度正则项和加速曲线演化的面积项；系数分别为μ、λ和ν；g是边缘指示函数，δ(φ)是单变量Dirac函数，H是奇对称Heaviside函数；通过Euler-Lagrange变分法，使用标准的梯度下降法求解模型中能量函数最小化；获取水平集的演变方程为：
[0090]
[0091] 其中，系数ν取值的正负决定初始轮廓相对于待分割目标做收缩或膨胀演化，以及演化的速度，对于实际分割问题，期望远离目标边界时，演化速度快，反之，演化慢；当轮廓跨过目标边界时，可以自动改变演化方向，而非一成不变；因此，自适应的改变系数ν取值更适合实际分割需求，令模糊聚类隶属度的图像为R那么有：
[0092] νk＝G(Rk)＝1-2Rk,Rk∈(0,1) (10)
[0093] 水平集的演变方程更新为：
[0094]
[0095] 其它参数的选取：
[0096]
[0097] 水平集初始化及其演化如下：
[0098] 模糊聚类得到一个粗糙的分类结果，可从聚类结果导出水平集演化的初始位置，从而减少运算量。假定选定模糊聚类隶属度的图像为R，设定一个可调整的阈值b0∈(0,1)，得到一个二值图像Bk：
[0099]
[0100] 那么，水平集初始化函数达为：
[0101] φ0＝-4ε(0.5-Bk),ε＝1.5 (13)。
[0102] 下面结合图2a至图5c，对本发明所述人类卵细胞分割实现方法进行具体说明，其情况如下：
[0103] 实验平台为PentiumIV 3.0G,1G RAM，显卡为NVIDIA Quadro FX 1400。
[0104] 原图像如图2a所示，用OTSU方法得到完整二值图像，经膨胀操作后提取骨架，如图2b所示。骨架化完整地保留了细胞质、极体、吸附针和注射针的轮廓，宽度为单个像素，注射针骨架化为单像素直线，骨架化的图像中细胞质是连通的；其次，通过区域填充和标记，而后使用规则滤波器，把卵母细胞的细胞质从周边的对象背景中分开出来；最后，提取出感兴趣目标ROI，如图2c所示。
[0105] 聚类特征选取每个像素点局部均值和局部方差，依据FCM聚类步骤，模糊聚类结果如图3a至图3c所示，图3a为预处理得到位ROI图像，用改进的模糊
聚类算法分成两类，图3b是卵细胞质和极体的聚类结果，细胞质内部基本平滑，边界相对清晰，极体的主要边界区域得以和细胞质分离；图3c为ROI图像中部分注射针的图像，周边的细胞轮廓可以在后续操作中去除。
[0106] 利用有限差分法实现数值化求解，时间偏导数值化采用前向差分，空间偏导的数值化则采用中心差分。在聚类图像的基础上，分别基于卵母细胞质的聚类结果和注射针的聚类结果，
结合水平集方程实现分割。
[0107] 图4a为细胞质与极体的分割图像，比较光滑和准确地演化出边界轮廓；图4b为水平集演化三维效果图，中间空的区域为注射针的位置，右下独立的一个小区为极体；图4c为卵母细胞质内部一段注射针的分割结果。考虑到注射针的线性特点，在二值化的基础上，并结合图4c，实现直线检测。图5a至图5c展示了注射针完整分割过程。
[0108] 以上所述实施例子只为本发明较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。
