一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂及其应用
阅读：301发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 阐述了一种用于细胞冷冻保存的新型 冷冻保护剂 及其应用。该冷冻保护液由氢键供体和氢键受体构成，所述氢键供体和所述氢键受体通过氢键缔合形成低共熔共晶混合物，所述氢键供体和所述氢键受体的摩尔比为1.3:1～15:1。该冷冻保护剂在细胞冷冻保存中可降低 冰 晶形成对细胞的损伤，并且这种新型冷冻保存剂制备简单，具备 生物 相容性 ，易降解等优点。，下面是一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂及其应用专利的具体信息内容。
1.一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂，由氢键供体和氢键受体构成，其特征在于，所述氢键供体和所述氢键受体通过氢键缔合形成冷冻保护剂，所述冷冻保护剂为低共熔共晶混合物，所述氢键供体和所述氢键受体的摩尔比为1.3:1～15:1。
2.根据权利要求1所述的新型冷冻保护剂，其特征在于，所述氢键供体包括氯化胆碱和甜菜碱中的一种或两种；所述氢键供体包括尿素、乙二醇、甘油、葡萄糖、果糖和柠檬酸中的一种或一种以上。
3.根据权利要求1所述的新型冷冻保护剂，其特征在于，所述冷冻保护剂在冷冻保存过程中的使用浓度介于0.5M～7M。
4.根据权利要求1所述的新型冷冻保护剂，其特征在于，所述冷冻保护剂在冷冻保存过程中的使用浓度介于1M～6M。
5.一种应用如权利要求1～4所述的新型冷冻保护剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得细胞悬液；
步骤2：配制冷冻保护剂和细胞悬液的混合物；
步骤3：冷冻保存；
步骤4：解冻细胞悬液；
步骤5：鉴定细胞存活率。
6.根据权利要求5所述的应用新型冷冻保护剂的方法，其特征在于，所述步骤1为：培养软骨细胞后去除培养液，加消化液消化3min～5min，将所述软骨细胞从培养皿底部吹起并吸入离心管中，重选为浓度介于1x107/ml～1x108/ml的细胞悬液。
7.根据权利要求5所述的应用新型冷冻保护剂的方法，其特征在于，所述步骤2为：将冷冻保护液与细胞培养液混合至浓度为2M～3M的混合物。
8.根据权利要求5所述的应用新型冷冻保护剂的方法，其特征在于，所述步骤3为：将所述冷冻保护剂和细胞悬液的混合物缓慢装入细胞冷冻管，标记细胞和日期，-80℃～-60℃保存。
9.根据权利要求5所述的应用新型冷冻保护剂的方法，其特征在于，所述步骤4为：取出所述细胞冷冻管并立即放入37℃的水浴中解冻，10min～15min后，取出所述细胞冷冻管并消毒并打开，吸出所述细胞悬液，注入离心管并洗涤，离心弃上清液。
10.根据权利要求5所述的应用新型冷冻保护剂的方法，其特征在于，所述步骤5为：在所述细胞悬液中加入台盼蓝溶液染色，所述台盼蓝溶液的加入体积和所述细胞悬液的体积比为1:1～1:2，在显微镜下观察所述细胞悬液并计算细胞活率。
一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞冷冻保护领域，尤其涉及一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂及应用。
背景技术
[0002] 为了满足基础研究和临床应用，需要对细胞进行大量扩增。但如何延长细胞的货架期，是细胞研究和临床应用中面临的巨瓶颈价。冷冻保存是延长其货架期，实现细胞的长期稳定保存的有效方法。细胞冷冻方法主要有程序化冷冻和玻璃化冷冻。近些年，玻璃化冷冻由于在保存过程中不产生冰晶，受到了越来越多的关注。它是一种利用高浓度冷冻保护剂溶液的超速冻存生物体的方法，实施冷冻保存过程中快速降温及升温，才有可能实现成功的玻璃化冷冻。但过程难于规模化。而程序化冷冻可以克服这一难题，但冷冻过程的冰晶及溶质效应会对细胞产生不可逆转的伤害。同时由于冷冻保护剂的毒性，也限制了其在细胞治疗中的临床应用。
[0003] 低共熔溶剂通常由两个或三个易得且安全的组分通过氢键相互作用而相互缔合，形成共晶混合物。得到的低共熔溶剂的特征在于熔点低于各个组分的熔点。一般来说，低共熔溶剂是有非常大的冰点下降，这种低共熔溶剂具有一些对生物过程非常有用的特殊物理性状，且具有良好的生物相容性和降解性能。
[0004] 国内外许多研究人员试图通过改进低温冷冻方法，筛选新的冷冻保护剂，来寻找稳定可靠的细胞冷冻保存技术。尽管在这些方面取得了一些进展，但仍然没有简单，可靠和廉价的方法来冷冻细胞。本发明提供了一种新型用于细胞冷冻保存的冷冻保护剂，具有无毒安全或易生物降解，操作简便，并且价格低廉、效果明显，应用前景广阔。
发明内容
[0005] 根据现有技术的局限性，本发明的目的为提供一类细胞新型冷冻保存剂，本发明提供一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂，由氢键供体和氢键受体构成，所述氢键供体和所述氢键受体通过氢键缔合形成冷冻保护剂，所述冷冻保护剂为低共熔共晶混合物，所述氢键供体和所述氢键受体的摩尔比为1.3:1～15:1。
[0007] 作为改进的技术方案，所述冷冻保护剂在冷冻保存过程中的使用浓度介于0.5M～7M。
[0008] 作为改进的技术方案，所述冷冻保护剂在冷冻保存过程中的使用浓度介于1M～6M。
[0009] 本发明还提供一种应用上述冷冻保护剂的方法，包括如下步骤：
[0010] 步骤1：获得细胞悬液；
[0011] 步骤2：配制冷冻保护剂和细胞悬液的混合物；
[0012] 步骤3：冷冻保存；
[0013] 步骤4：解冻细胞悬液；
[0014] 步骤5：鉴定细胞存活率。
[0015] 作为改进的技术方案，所述步骤1为：培养软骨细胞后去除培养液，加消化液消化3min～5min，将所述软骨细胞从培养皿底部吹起并吸入离心管中，重选为浓度介于1x107/ml～1x108/ml的细胞悬液。
[0016] 作为改进的技术方案，所述步骤2为：将冷冻保护液与细胞培养液混合至浓度为2M～3M的混合物。
[0017] 作为改进的技术方案，所述步骤3为：将所述冷冻保护剂和细胞悬液的混合物缓慢装入细胞冷冻管，标记细胞和日期，-80℃～-60℃保存。
[0018] 作为改进的技术方案，所述步骤4为：取出所述细胞冷冻管并立即放入37℃的水浴中解冻，10min～15min后，取出所述细胞冷冻管并消毒并打开，吸出所述细胞悬液，注入离心管并洗涤，离心弃上清液。
[0020] 有益效果
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
[0022] 1、本发明提供的新型冷冻保护剂在细胞冷冻保存中可降低冰晶形成对细胞的损伤，并且这种新型冷冻保存剂制备简单，具备生物相容性，凝固点低、易降解等优点；
[0023] 2、本发明提供的新型冷冻保护剂无毒可以避免对细胞产生毒害作用；
[0024] 3、本发明提供的新型冷冻保护剂可快速降解，不会长期存在于细胞液中，可避免对细胞活性产生影响。
具体实施方式
[0025] 为使本发明实施例的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026] 本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
[0027] 对比例1
[0028] ①软骨细胞培养后去除培养液，加消化液1mL，消化3min；加培养基约2mL，中和消化液，并把细胞从培养皿底部吹起，把细胞吸入离心管中，800r/min，5min离心弃上层清液；7
重选为1x10/ml的细胞悬液；
重选为1x10/ml的细胞悬液；
[0029] ②制备冷冻保护液：将普通细胞冷冻保护剂(DMSO)与细胞培养液混合至浓度为3M；
[0031] ④用长镊从冰箱中取出细胞冷冻管，立即投入到盛有37℃温水的不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，尽快解冻。10min后从37℃水浴中取出冷冻管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加洗涤液至10mL,混合后，2000r/min,离心5min,弃上清液；
[0032] ⑤取微量细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞存活率。台盼蓝溶液的添加量和细胞悬液为100μL/100μL。将两者混合均匀，静置3min，吸取混合液，显微镜下观察计数，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞，细胞活率为60％。
[0033] 实施例1
[0034] ①软骨细胞培养后去除培养液，加消化液1mL，消化3min；加培养基约2mL，中和消化液，并把细胞从培养皿底部吹起，把细胞吸入离心管中，800r/min，5min离心弃上层清液，重选为1x107/ml的细胞悬液；
[0035] ②制备冷冻保护液：以氯化胆碱和尿素(1:1.3)共熔物为基础配置冷冻保护液，共熔物与细胞培养液混合至浓度为3M，冷冻保护剂的浓度为0.5M；
[0036] ③缓慢添加相同体积冷冻保护液至细胞悬液，装入冷冻管，标记细胞和日期，用棉花包裹冷冻管，放入纱袋，放置-80℃冰箱中；
[0037] ④用长镊从冰箱中取出细胞冷冻管，立即投入到盛有37℃温水的不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，10min后从37℃水浴中取出冷冻管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加洗涤液至10mL，混合后，2000r/min，离心5min，弃上清液；
[0038] ⑤取微量细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞存活率。台盼蓝溶液的添加量和细胞悬液为100μL/100μL。将两者混合均匀，静置2min～3min，吸取混合液，显微镜下观察计数，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞，细胞活率达到92％。
[0039] 实施例2
[0040] ①骨细胞培养后去除培养液，加消化液1mL,消化5min；加培养基约2mL，中和消化液，并把细胞从培养皿底部吹起，把细胞吸入离心管中，800r/min，5min离心弃上层清液，重选为1x108/ml的细胞悬液；
[0041] ②制备冷冻保护液：以甜菜碱和乙二醇、甘油、葡萄糖(1:2:2:2)共熔物为基础配置冷冻保护液，共熔物与细胞培养液混合至浓度为3M，冷冻保护液的浓度为7M；
[0042] ③缓慢添加相同体积冷冻保护液至细胞悬液，装入冷冻管，标记细胞和日期，用棉花包裹冷冻管，放入纱袋，放置-60℃冰箱中；
[0043] ④用长镊从冰箱中取出细胞冷冻管，立即投入到盛有37℃温水的不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，尽快解冻，15min后从37℃水浴中取出冷冻管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加洗涤液至10mL，混合后，2000r/min,离心5min,弃上清液；
[0044] ⑤取微量细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞存活率。台盼蓝溶液的添加量和细胞悬液为100μL/200μL。将两者混合均匀，静置3min，吸取混合液，显微镜下观察计数，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞，细胞活率达到93％。。
[0045] 实施例3
[0046] ①人多能干细胞培养后去除培养液，加消化液1mL,消化4min；加培养基约2mL,中和消化液，并把细胞从培养皿底部吹起，把细胞吸入离心管中，800r/min,5min离心弃上层清液；
[0047] ②制备冷冻保护液：以氯化胆碱和果糖和柠檬酸(1:7:8)共熔物为基础配置冷冻保护液，共熔物与细胞培养液混合至浓度为2.5M，冷冻保护剂的浓度为1M；
[0048] ③缓慢添加冷冻保护液至细胞，装入冷冻管，放置于液氮中。
[0049] ④从液氮罐中取出细胞冷冻管，立即投入到盛有37℃温水的不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，尽快解冻。12min后，从37℃水浴中取出冷冻管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加洗涤液至10mL,混合后，2000r/min,离心5min,弃上清液。
[0050] ⑤取微量细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞存活率。台盼蓝溶液的添加量和细胞悬液为100μL/150μL。将两者混合均匀，静置3min，吸取混合液，显微镜下观察计数，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞，细胞活率达到95％。
[0051] 实施例4
[0052] ①软骨细胞培养后去除培养液，加消化液1mL，消化5min；加培养基约2mL,中和消化液，并把细胞从培养皿底部吹起，把细胞吸入离心管中，800r/min,5min离心弃上层清液，重选为1x108/ml的细胞悬液；
[0053] ②制备冷冻保护液：以甜菜碱和乙二醇(1:8)共熔物为基础配置冷冻保护液，共熔物与细胞培养液混合至浓度为3M，冷冻保护液的浓度为6M；
[0054] ③缓慢添加相同体积冷冻保护液至细胞悬液，装入冷冻管，标记细胞和日期，用棉花包裹冷冻管，放入纱袋，放置-70℃冰箱中；
[0055] ④用长镊从冰箱中取出细胞冷冻管，立即投入到盛有37℃温水的不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，10min后，从37℃水浴中取出冷冻管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加洗涤液至10mL，混合后，2000r/min,离心5min,弃上清液；
[0056] ⑤取微量细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞存活率。台盼蓝溶液的添加量和细胞悬液为100μL/100μL。将两者混合均匀，静置3min，吸取混合液，显微镜下观察计数，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞，细胞活率达到90％。
[0057] 实施例5
[0058] ①细胞培养后去除培养液，加消化液1mL，消化3min；加培养基2mL，中和消化液，并把细胞从培养皿底部吹起，把细胞吸入离心管中，800r/min，5min离心弃上层清液，重选为7
1x10/ml的细胞悬液；
1x10/ml的细胞悬液；
[0059] ②制备冷冻保护液：以甜菜碱和果糖(1:7)共熔物为基础配置冷冻保护液，共熔物与细胞培养液混合至浓度为3M，冷冻保护剂的浓度为3M；
[0060] ③缓慢添加相同体积冷冻保护液至细胞悬液，装入冷冻管，标记细胞和日期，用棉花包裹冷冻管，放入纱袋，放置-80℃冰箱中；
[0061] ④用长镊从冰箱中取出细胞冷冻管，立即投入到盛有37℃温水的不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，12min后从37℃水浴中取出冷冻管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加洗涤液至10mL，混合后，2000r/min,离心5min,弃上清液；
[0062] ⑤取微量细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞存活率。台盼蓝溶液的添加量和细胞悬液为100μL/200μL。将两者混合均匀，静置3min，吸取混合液，显微镜下观察计数，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞，细胞活率达到93％。
[0063] 实施例6
[0064] ①细胞培养后去除培养液，加消化液1mL,消化4min；加培养基约2mL,中和消化液，并把细胞从培养皿底部吹起，把细胞吸入离心管中，800r/min,5min离心弃上层清液；重选为1x107/ml的细胞悬液；
[0065] ②制备冷冻保护液：以甜菜碱和尿素(7:1)共熔物为基础配置冷冻保护液，共熔物与细胞培养液混合至浓度为3M，冷冻保护剂的浓度为4M；
[0066] ③缓慢添加相同体积冷冻保护液至细胞悬液，装入冷冻管，标记细胞和日期，用棉花包裹冷冻管，放入纱袋，放置-80℃冰箱中；
[0067] ④用长镊从冰箱中取出细胞冷冻管，立即投入到盛有37℃温水的不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，15min后，从37℃水浴中取出冷冻管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加洗涤液至10mL，混合后，2000r/min,离心5min,弃上清液；
[0068] ⑤取微量细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞存活率。台盼蓝溶液的添加量和细胞悬液为100μL/150μL。将两者混合均匀，静置5min，吸取混合液，显微镜下观察计数，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞，细胞活率达到95％。
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